ES2604491T3 - Proceso para producir una composición de glucosil estevia - Google Patents
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Abstract
Un proceso para producir una composición de glucosil estevia altamente purificada, que comprende los pasos de: añadir almidón a agua para formar una suspensión de almidón; añadir una mezcla de α-amilasa y CGTasa a la suspensión de almidón e incubar durante aproximadamente de 0,5 a 2 horas a aproximadamente 75-80ºC, lo que produce una suspensión de almidón licuado; inactivar la α-amilasa por tratamiento a bajo pH con calor; enfriar la suspensión de almidón licuado y ajustar el pH a aproximadamente 5,5 a 7,0; añadir glucósidos de esteviol a la suspensión de almidón licuado, lo que produce una mezcla de reacción; añadir un segundo lote de CGTasa a la mezcla de reacción e incubar durante aproximadamente 12 a 48 horas a aproximadamente 55-75ºC. añadir ß-amilasa a la mezcla de reacción e incubar durante aproximadamente 12-24 horas a aproximadamente 35-55ºC; inactivar las enzimas en la mezcla de reacción por tratamiento con calor; decolorar la mezcla de reacción; eliminar los compuestos no diterpénicos poniendo en contacto la mezcla de reacción decolorada con resina adsorbente macroporosa y posteriormente eluir los glucósidos diterpénicos adsorbidos con etanol acuoso para producir un eluato de etanol acuoso que contiene glucósidos; desalar el eluato de etanol acuoso que contiene glucósidos con resinas de intercambio iónico; eliminar el etanol del eluato de etanol acuoso, lo que produce un eluato acuoso; concentrar y secar el eluato acuoso para obtener la composición de glucosil estevia seca; resuspender la composición de glucosil estevia seca en etanol acuoso para formar una suspensión, eliminar los glucósidos de esteviol sin modificar de la suspensión, y separar y secar la composición de glucosil estevia altamente purificada; en donde la composición de glucosil estevia altamente purificada comprende derivados de glucósido de esteviol de cadena corta que tienen dos o menos residuos de α-1,4-glucosilo, y menos de aproximadamente el 15% de glucósidos de esteviol no modificados.
Description
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DESCRIPCION
Proceso para producir una composicion de glucosil estevia Solicitudes relacionadas
Esta solicitud es una solicitud de continuacion en parte de y reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente en EE UU con No. de serie 13/029.263, presentada el 17 de febrero, 2011.
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La invencion se refiere a un proceso para producir un ingrediente alimenticio muy purificado del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni y su uso en varios productos alimenticios y bebidas.
Descripcion de la tecnica relacionada
Actualmente las alternativas al azucar estan recibiendo atencion creciente debido a la conciencia de muchas enfermedades en combinacion con el consumo de alimentos y bebidas de alto contenido en azucar. Sin embargo, muchos edulcorantes artificiales, tales como dulcina, ciclamato sodico y sacarina se han prohibido o restringido en algunos pafses debido a preocupaciones sobre su seguridad. Por tanto, los edulcorantes no caloricos de origen natural se estan volviendo crecientemente populares. La hierba dulce Stevia rebaudiana Bertoni produce un numero de glucosidos diterpenicos que presentan dulzor de alta intensidad y propiedades sensoriales superiores a las de muchos otros edulcorantes de alta potencia.
Los glucosidos dulces mencionados anteriormente, tienen una aglucona comun, esteviol, y se diferencian por el numero y tipo de residuos gluddicos en las posiciones C13 y C19. Las hojas de Stevia son capaces de acumular hasta el 10-20% (en base de peso seco) de glucosidos de esteviol. Los principales glucosidos entrados en las hojas de Stevia son rebaudiosido A (2-10%), esteviosido (2-10%) y rebaudiosido C (1-2%). Otros glucosidos tal como rebaudiosido B, D, E y F, esteviolbiosido y rubusosido se encuentran a niveles muchos menores (aprox. 0-0,2%).
Dos glucosidos principales - esteviosido y rebaudiosido A, se estudiaron extensamente y caracterizaron en terminos de su idoneidad como edulcorantes comerciales de alta intensidad. Los estudios de estabilidad en bebidas carbonatadas confirmaron su estabilidad al calor y pH (Chang S.S., Cook, J.M. (1983) Stability studies of stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31: 409-412).
Los glucosidos de esteviol se diferencian entre sf no solo por la estructura molecular, sino tambien por sus propiedades de sabor. Habitualmente se encuentra que el esteviosido es 110-270 veces mas dulce que la sacarosa, el rebaudiosido A entre 150 y 320 veces, y el rebaudiosido C entre 40-60 veces mas dulce que la glucosa. El dulcosido A es 30 veces mas dulce que la sacarosa. El rebaudiosido tiene el regusto menos astringente, menos amargo y menos persistente poseyendo de esta manera los atributos sensoriales mas favorables en los principales glucosidos de esteviol (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweetners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips K.C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. En: Grenby T.H. ed. Developments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, Londres. 1-43).
Los metodos para la extraccion y purificacion de glucosidos dulces de la planta Stevia rebaudiana usando agua o solventes organicos se describen en, por ejemplo, las patentes en EE UU numeros 4.361.697, 4.082.585, 4.892.938, 5.972.120, 5.962.678, 7.838.044 y 7.862.845.
Sin embargo, incluso en un estado muy purificado, los glucosidos de esteviol aun poseen atributos de sabor indeseables tal como amargor, regusto dulce, sabor a regaliz, etc. Uno de los principales obstaculos para la comercializacion exitosa de edulcorantes de estevia son estos atributos de sabor indeseables. Se mostro que estas notas de sabor se vuelven mas prominentes segun aumenta la concentracion de glucosidos de esteviol (Prakash I., DuBois G.E., Clos J.F., Wilkens K.L., Fosdick L.E. (2008) Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82).
Algunas de estas propiedades indeseables se pueden reducir o eliminar sometiendo los glucosidos de esteviol a la reaccion de transglucosilacion intermolecular, cuando nuevos residuos gluddicos se unen a la molecula inicial en las posiciones C13 y C19. Dependiendo del numero de residuos gluddicos en estas posiciones la calidad y potencia del sabor de los compuestos variara.
Se han usado pululanasa, isomaltasa (Lobov S.V., Jasai R., Ohtani K., Tanaka O. Yamasaki K. (1991) Enzymatic production of sweet stevioside derivatives: transglycosylation by glucosidases. Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965), p- galactosidasa (Kitahata S., Ishikawa S., Miyata T., Tanaka O. (1989) Production of rubusoside derivatives by transglycosylation of various p-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 2923-2928), y dextrano sacarasa (Yamamoto
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K., Yoshikawa K., Okada S. (1994) Effective production of glucosyl-stevioside by a-1,6-transglucosylation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) como enzimas de transglucosilacion, junto con pululano, maltosa, lactosa y almidon parcialmente hidrolizado, respectivamente, como donantes de residuos glucosfdicos.
La transglucosilacion de glucosidos de esteviol tambien se realizo por accion de ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasa) producidas por Bacillus stearothermophilus (patentes en EE UU numeros 4.219.571 y 7.807.206) como resultado se formaron derivados a-1,4-glucosilo con un grado de polimerizacion de hasta 10.
Se mostro que el perfil de sabor y poder de dulzor de los derivados glucosilo dependen mucho del numero de derivados glucosilo adicionales, es decir, el grado de polimerizacion de la cadena de a-1,4-glucosilo. El aumento en el numero de residuos a-1,4-glucosilo mejoro la calidad de sabor, pero al mismo tiempo redujo el nivel de dulzor. El tratamiento del esteviosido transglucosilado con p-amilasa produjo un producto que consiste en derivados mono- o di-a-1,4-glucosilo con mejor perfil de sabor y nivel de dulzor optimo (Tanaka, 1987). Sin embargo, en tal proceso el producto resultante contiene un nivel alto de glucosidos iniciales sin reaccionar (sin modificar) (generalmente >20%) que lo hace no conforme con requisitos reguladores de menos el 15% de glucosidos sin reaccionar (a- Glucosyltransferase Treated Stevia, Japan's Specifications and Standards for Food Additives, VIII edicion, 2009, p.257). Por tanto, se usan pasos adicionales para la separacion cromatografica de glucosidos de esteviol sin reaccionar para reducir el contenido inicial en glucosidos sin reaccionar (sin modificar). Sin embargo, las tecnicas de separacion cromatografica generalmente implican alto coste y no son adecuadas para la produccion a gran escala.
Se debe indicar tambien que muchos productos de glucosil estevia contienen hasta el 20% de dextrinas residuales que no poseen propiedades funcionales significativas y reducen el contenido de los glucosidos de esteviol en el producto.
Por tanto, es necesario desarrollar un proceso sencillo de preparacion de productos de glucosil estevia de alta pureza con longitud de cadena a-1,4-glucosilo optima y bajo nivel de glucosidos sin reaccionar.
El documento US 2007/082102 describe un proceso que hace uso de la enzima CGTasa, sin la adicion de amilasas, para obtener una suspension de almidon licuado, que despues se combina con esteviosidos para preparar esteviosidos a-glucosilados.
El documento US 4 917 916 describe un metodo para obtener cristales no higroscopicos del compuesto maltitol altamente higroscopico. El documento US 4 219 571 describe la produccion de un edulcorante haciendo uso de o bien CGTasa o a-amilasa, pero no de ambas juntas.
Compendio de la invencion
La presente invencion se dirige a superar las desventajas de edulcorantes de estevia existentes. La invencion describe un proceso para producir un ingrediente alimenticio de alta pureza a partir del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
La invencion se refiere a un proceso para producir un ingrediente que contiene formas glucosiladas de esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F, dulcosido A, esteviolbiosido, rubusosido, asf como otros glucosidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni. El proceso es un proceso de transglucosilacion enzimatica usando CGTasas producidas por cultivos de Bacillus stearothermophilus. El proceso incluye ademas el paso de acortar las cadenas de glucosilo por p-amilasa. El proceso tambien tiene los pasos de decolorar, desalar y eliminar maltooligosacaridos y glucosidos de esteviol sin modificar (sin reaccionar). La decoloracion se puede realizar usando carbon activo. El desalado se realiza pasando a traves de resinas de intercambio ionico. La eliminacion de maltooligosacaridos se realiza pasando por resina polimerica macroporosa. La eliminacion de glucosidos de esteviol sin modificar (sin reaccionar) se realiza resuspendiendo el producto en alcohol acuoso.
En la invencion, se uso el extracto de estevia comercializado por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido (28-30%), rebaudiosido A (50-55%), rebaudiosido C (9-12%), rebaudiosido F (1-3%) y otros glucosidos que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de al menos el 95%, como material de partida. Alternativamente, extractos de estevia con diferente proporcion de glucosidos de esteviol, asf como glucosidos de esteviol muy purificados tal como rebaudiosido A, esteviosido, rebaudiosido D, rubusosido, etc., se pueden usar como materiales de partida.
El material de partida se sometio a la transglucosilacion enzimatica por accion de ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa) en presencia de almidon como donante de glucosa. Como resultado se formaron derivados a-1,4-glucosilo con un grado de polimerizacion de hasta 10. A continuacion, los derivados formados se sometieron a tratamiento con p-amilasa para producir derivados a-1,4-glucosilo que poseen un grado de polimerizacion de hasta 2.
Los oligosacaridos de la mezcla de reaccion obtenida se eliminaron por resina Amberlite XAD7 HP, y despues se decoloraron, desionizaron, concentraron y secaron por rociado.
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Los glucosidos de esteviol sin reaccionar se eliminaron posteriormente resuspendiendo el producto seco en solvente organico y separando los solidos suspendidos que contienen nivel disminuido de glucosidos de esteviol, sin reaccionar.
Los productos obtenidos se aplicaron en varios alimentos y bebidas como edulcorantes, potenciadores de edulcorante y modificadores de sabor, incluyendo helado, galletas, pan, zumos de frutas, productos lacteos, productos horneados y productos de confitena.
Breve descripcion de las figuras
Las figuras acompanantes se incluyen para proporcionar un entendimiento adicional de la invencion. Las figuras ilustran formas de realizacion de la invencion y junto con la descripcion sirven para explicar los principios de las formas de realizacion de la invencion.
La figura 1 muestra un cromatograma de cromatograffa lfquida de alta resolucion de extracto de Stevia transglucosilado purificado sin tratamiento con p-amilasa que contiene derivados a-1,4-glucosilo de cadena larga con hasta nueve residuos de a-1,4-glucosilo;
La figura 2 muestra un grafico de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) del producto tratado con p-amilasa que contiene derivados mono- y di-a-1,4-glucosilo de glucosidos de esteviol, asf como nivel alto de glucosido de esteviol sin reaccionar;
La figura 3 muestra un grafico de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) del producto tratado con p-amilasa que contiene derivados mono- y di-a-1,4-glucosilo de glucosidos de esteviol, asf como nivel bajo de glucosidos de esteviol sin reaccionar.
Descripcion detallada de la invencion
Las ventajas de la presente invencion seran mas aparentes de la descripcion detallada dada de aqrn en adelante.
Se uso el extracto de estevia comercializado por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido (2830%), rebaudiosido A (50-55%), rebaudiosido C (9-12%), rebaudiosido F (1-3%) y otros glucosidos (de aqrn en adelante colectivamente, “glucosidos de esteviol”) que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de al menos el 95%, como material de partida. Alternativamente, se pueden usar extractos de estevia con diferente proporcion de glucosidos de esteviol, asf como glucosidos de esteviol muy purificados tal como rebaudiosido A, esteviosido, rebaudiosido D, rubusosido, etc., como materiales de partida.
El analisis por HPLC de las materias primas y productos se realizo en un cromatografo lfquido Agilent Technologies 1200 Series (EE UU), equipado con columna Zorbax-NH2 (4,6 x 250 mm). La fase movil era un gradiente de acetonitrilo-agua de 80:20, v/v (0-2 min) a 50:50, v/v (2-70 min). Se uso un detector de haz de diodo ajustado a 210 nm como el detector.
La transglucosilacion se logro por ciclodextrina glucosiltransferasas (CGTasas; EC 2.4.1.19) producidas por Bacillus stearothermophilus St-100 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malasia). Sin embargo, cualquier otra CGTasa o enzima que posea actividad de transglucosilacion intermolecular se puede aplicar tambien. La enzima puede estar en forma de un caldo de cultivo sin celulas, caldo de cultivo sin celulas lfquido concentrado, caldo de cultivo sin celulas secado por rociado o liofilizado, o protema de alta pureza. Se pueden usar preparaciones de enzima libre e inmovilizada.
La actividad de las preparaciones de CGTasa se determino segun el procedimiento descrito en Hale W.S., Rawlins L.C. (1951) Amylase of Bacillus macerans. Cereal Chem. 28, 49-58.
Se pueden usar almidones de diferente origen como donantes de unidades de glucosilo tal como, derivado de trigo, mafz, patata, tapioca y sagu.
El almidon se sometio a hidrolisis parcial (licuacion) antes de la reaccion de transglucosilacion. El equivalente de dextrosa del almidon parcialmente hidrolizado puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-25, preferiblemente aproximadamente 12-16. Segun la invencion, se usan mezclas de CGTasa y a-amilasa como enzimas licuantes.
La actividad a-amilasa se expresa en unidades kilo novo de a-amilasa (KNU). Una KNU es la cantidad de a-amilasa que, en condiciones estandar (pH 7,1; 37°C), dextriniza 5,26 g de sustancia seca de almidon por hora.
La mezcla de licuacion contiene aproximadamente 0,001-0,2 KNU, preferiblemente aproximadamente 0,05-0,1 KNU de a-amilasa por una unidad de CGTasa.
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El uso de a-amilasa en la licuacion permite alcanzar mayores rendimientos en filtracion de carbono activo adicional. Cuando se usa la CGTasa como la unica enzima licuante la velocidad de filtracion es aproximadamente 10-15 l/h por 1 m2 de superficie de filtro. En el caso de mezcla de enzimas de licuacion (que comprende a-amilasa y CGTasa) la velocidad de filtracion es dos veces mas rapida - aproximadamente 20-30 l/h por 1 m2 de superficie de filtro.
La proporcion de almidon y CGTasa en la mezcla de licuacion es aproximadamente 0,1-0,5 unidades por un gramo de almidon, preferiblemente aproximadamente 0,2-0,4 unidades por gramo.
La concentracion de almidon en la mezcla de licuacion es aproximadamente el 15-40% (p/p), preferiblemente aproximadamente 20-30%.
La licuacion se realiza a aproximadamente 70-90°C durante aproximadamente 0,5-5 horas, preferiblemente aproximadamente 1-2 horas.
Despues de la licuacion, la mezcla de reaccion se somete a inactivacion termica de a-amilasa en condiciones de bajo pH. El intervalo de pH preferido para la inactivacion es de aproximadamente pH 2,5 a pH 3,0 y la temperatura preferida es aproximadamente 95-105°C. La duracion de la inactivacion termica es aproximadamente 5-10 minutos.
Despues de la inactivacion, el pH de la mezcla de reaccion se ajusta a aproximadamente pH 5,5-6,5 y se anaden los glucosidos de esteviol a la mezcla y se disuelven. La proporcion preferida de glucosidos de esteviol respecto a almidon (kg de glucosidos de esteviol por 1 kg de almidon) es aproximadamente 0,5-1,5, preferiblemente aproximadamente 0,8-1,2.
Se anade una segunda porcion de preparacion de CGTasa y la reaccion de transglucosilacion se realiza a aproximadamente 65°C durante aproximadamente 24-48 horas. La cantidad de la segunda porcion de CGTasa es aproximadamente 0,2-4 unidades de CGTasa por gramo de solidos, preferiblemente aproximadamente 0,5-1,2 unidades por gramo de solidos.
Tras completar la reaccion de transglucosilacion, se anadieron aproximadamente 30-50 unidades por gramo de solidos de p-amilasa y la reaccion siguio durante aproximadamente 12-16 horas a aproximadamente 35-55°C, preferiblemente aproximadamente 45°C. Se uso p-amilasa producida por Bacillus polymyxa St-3504 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Micoorganisms - Malasia) en esta fase. Sin embargo, tambien se pueden usar p- amilasas, y otras enzimas que hidrolizan almidon derivadas de cualquier otra fuente incluyendo soja, cebada, bacteriana, fungica y otras.
Se define la unidad de actividad p-amilasa (1 AUN) como la actividad que libera 100 |jg de azucar reductor (expresado por equivalente de dextrosa) por minuto en las siguientes condiciones: 1 ml de solucion de enzima se mezcla con 5 ml de solucion de almidon al 1,2% (pH 5,5, M/20 tampon acetato) y se mantiene durante 20 min a 40°C.
La reaccion se paro calentando a aproximadamente 95°C durante aproximadamente 15 minutos para inactivar las enzimas, y la solucion se trato con carbon activo, para obtener una mezcla de reaccion decolorada. La cantidad de carbon activo fue aproximadamente 0,02-0,4 gramos por gramo de solidos, preferiblemente aproximadamente 0,050,2 gramos por gramo de solidos.
La mezcla de reaccion decolorada se desalo pasando a traves de resinas de intercambio ionico, tal como Amberlite FPC23 (tipo H+) y Amberlite FPA51 (tipo OH-). Se pueden usar otros metodos apropiados de decolorar y desalar, tal como filtracion en membrana, u otros metodos conocidos en la tecnica.
La mezcla de reaccion desalada se concentro adicionalmente por evaporador al vacfo y se seco por medio de un secador por rociado. Se pueden usar otros metodos de concentracion y secado apropiados, tal como filtracion en membrana, liofilizacion, u otros metodos conocidos en la tecnica.
El polvo seco se resuspendio en alcohol acuoso. La proporcion de polvo respecto a alcohol acuoso (p/vol) fue de 1:1 a 1:20, preferiblemente de 1:3 a 1:10. El alcohol acuoso contema el 0-50% (vol), preferiblemente el 1-10% de agua. La suspension se agita a 30-100°C, preferiblemente 50-85°C durante 1-24 horas, preferiblemente 2-15 horas. Despues los solidos suspendidos se separan por medio de filtracion. Se puede usar cualquier otro metodo conocido en la tecnica adecuado para separar solidos suspendidos de lfquido tal como centrifugacion, decantacion, etc. Los solidos obtenidos se secan en un secador al vacfo de tambor giratorio. Tambien se puede usar cualquier otro secador conocido en la tecnica. Alternativamente, los solidos separados se pueden disolver en agua, evaporar de vestigios de alcohol y secar por rociado.
Los alcoholes empleados en la invencion se pueden seleccionar del grupo que consiste en alcanoles, y se seleccionan preferiblemente del grupo que incluye metanol, etanol, n-propanol, 2-propanol, 1-butanol y 2-butanol.
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El producto resultante contiene nivel bajo de glucosidos sin modificar, derivados de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) y una mezcla de maltooligosacaridos (muestra 1). Como se usa en el presente documento, las expresiones “nivel bajo de glucosidos sin modificar” o “nivel bajo de glucosidos sin reaccionar” se refiere a niveles de glucosidos de menos de aproximadamente el 20%, y preferiblemente menos de aproximadamente el 15%, en una base anhndrida. En algunas formas de realizacion, se puede alcanzar un nivel de glucosido sin reaccionar de aproximadamente el 12%, aproximadamente el 10% o incluso menor usando este metodo.
Para preparar un producto con mayor contenido de glucosidos dulces totales (la suma de glucosidos glucosilados y no glucosilados), los maltooligosacaridos se eliminaron usando Amberlite XAD7 HP antes del tratamiento de desalado. Los glucosidos de esteviol y sus derivados glucosilados se adsorbieron en la resina y posteriormente se eluyeron por etanol acuoso. El eluato en etanol acuoso resultante, que contiene glucosidos de glucosil esteviol, se decoloro y desalo posteriormente como se ha descrito anteriormente y la solucion de glucosidos, despues de la evaporacion del solvente de elucion, se pulverizo por secado por rociado. El polvo seco se resuspendio en alcohol acuoso y se proceso como se ha descrito anteriormente para eliminar glucosidos de esteviol sin modificar (sin reaccionar). El producto resultante contiene bajo nivel de glucosidos sin modificar, y derivados de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) (muestra 2).
Las formas de realizacion de la invencion ejemplificadas por las muestras 1 y 2 estan libres o sustancialmente libres de derivados glucosilados superiores que tienen mas de 2 residuos de glucosilo. Segun esta invencion, la composicion de glucosil estevia muy purificada preferiblemente contiene mas de aproximadamente el 50% en peso de glucosidos esteviol mono- y diglucosilo.
Usando un proceso similar como para la muestra 2, con la exclusion de las fases de tratamiento con p-amilasa y alcohol acuoso, se preparo un producto que contema glucosidos no modificados y derivados de a-1,4-glucosilo de cadena larga (con hasta nueve residuos de a-1,4-glucosilo) (muestra 3).
Usando un proceso similar como para la muestra 2, con la exclusion de la fase de tratamiento con alcohol acuoso, se preparo un producto que contema un alto nivel de glucosidos no modificados y derivados de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) (muestra 4). La composicion de las muestras se resume en la tabla 1.
Tabla 1
Composicion de muestras de glucosidos de glucosil esteviol
- Compuestos
- Contenido, %
- Muestra 1
- Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4
- Esteviosido
- 2,4 3,2 3,1 13,2
- Rebaudiosido C
- 0,7 1,0 1,0 3,0
- Rebaudiosido A
- 5,6 7,5 6,1 12,3
- Monoglucosil-esteviosido (EstevG1)
- 16,2 21,9 7,5 22,2
- Monoglucosil-rebaudiosido A (RebAG1)
- 20,9 28,1 11,2 22,4
- Diglucosil-esteviosido (EstevG2)
- 10,1 13,6 8,5 8,9
- Diglucosil-rebaudiosido A (RebAG2)
- 13,8 18,6 9,7 11,4
- Derivados glucosilados superiores
- 1,3 1,7 48,8 1,8
- Contenido total de glucosidos sin reaccionar
- 8,7 11,7 10,2 28,5
- Contenido total de glucosidos
- 71,0 95,5 95,8 95,3
La evaluacion sensorial de las muestras se llevo a cabo usando soluciones acuosas, con 20 panelistas. Basado en la aceptacion global se eligieron las muestras mas deseable y mas indeseable. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Evaluacion sensorial de muestras en sistema acuoso
- Juicio
- Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4
- La mas deseable
- 6 10 1 3
- La mas indeseable
- 1 0 12 7
- Poder de dulzor
- 150 160 110 160
- Comentarios
- Dulce, ligero, suave, redondo, placentero, casi similar a sacarosa, sin regusto persistente, el inicio del dulzor es rapido Dulce, ligero, suave, redondo, placentero, casi similar a sacarosa, sin regusto persistente, el inicio del dulzor es rapido Dulce, ligeramente amargo, astringente, regusto ligeramente persistente, el inicio del dulzor es moderado Dulce, ligeramente amargo, astringente, regusto ligeramente persistente, el inicio del dulzor es lento
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Como es aparente de los resultados en la tabla 2, la calidad de dulzor de las muestras 1 y 2 se valoro como la mas superior. En conjunto las muestras con derivados de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4- glucosilo) y bajo nivel de glucosidos sin reaccionar (muestras 1 y 2) posefan mejores perfiles de sabor comparadas con muestras con derivados de glucosilo de cadena larga (muestra 3) y derivados de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) y alto nivel de glucosidos sin reaccionar (muestra 4).
Las muestras 1 y 2 muestran poder de dulzor comparable (150-160 veces mas dulce comparado con una solucion de sacarosa al 5%) con la muestra 4 control (160 veces); sin embargo, su perfil de sabor era claramente superior a la muestra 4 control.
Las composiciones se pueden usar como potenciadores del dulzor, potenciadores de sabor y edulcorantes en varios productos alimenticios y de bebida. Los ejemplos no limitantes de productos alimenticios y bebidas incluyen refrescos carbonatados, bebidas listas para beber, bebidas energeticas, bebidas isotonicas, bebidas bajas en calonas, bebidas con cero calonas, bebidas deportivas, tes, zumos de fruta y hortalizas, bebidas de zumos, bebidas lacteas, bebidas de yogur, bebidas alcoholicas, bebidas en polvo, productos de panadena, galletas, bizcochos, mezclas para hornear, cereales, pasteles, caramelos, tofes, chicle, productos lacteos, leche con sabores, yogures, yogures de sabores, productos lacteos fermentados, salsa de soja y otros productos basados en soja, alinos de ensaladas, mayonesa, vinagre, postres helados, productos carnicos, productos de pescado-carne, alimentos embotellados y enlatados, edulcorantes de mesa, frutas y hortalizas.
Las composiciones ademas se pueden usar en farmacos o preparaciones farmaceuticas y cosmeticos, incluyendo, pero no limitado a dentifrico, colutorio, jarabe para la tos, comprimidos masticables, pastillas, preparaciones de vitaminas, y similares.
Las composiciones se pueden usar “como esta” o en combinacion con otros edulcorantes, saborizantes e ingredientes alimenticios.
Los ejemplos no limitantes de edulcorantes incluyen glucosidos de esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F, dulcosido A, esteviolbiosido, rubusosido, asf como otros glucosidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni y mezclas de los mismos, extracto de estevia, extracto de Luo Han Guo, mogrosidos, jarabe de mafz de alta fructosa, jarabe de mafz, azucar invertido, fructooligosacaridos, inulina, inulinooligosacaridos, azucar acoplante, maltooligosacaridos, maltodextrinas, solidos de jarabe de mafz, glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa, aspartamo, sacarina, sucralosa y polialcoholes.
Los ejemplos no limitantes de sabores incluyen sabores de limon, naranja, a fruta, platano, uva, pera, pina, almendra amarga, cola, canela, azucar, algodon dulce, vainilla.
Los ejemplos no limitantes de otros ingredientes alimenticios incluyen sabores, acidulantes, acidos organicos y aminoacidos, agentes colorantes, agentes de carga, almidones modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsionantes, estabilizantes, espesantes, agentes de gelificacion.
Los siguientes ejemplos ilustran varias formas de realizacion de la invencion.
Ejemplo 1
Preparacion de CGTasa
Se inoculo una cepa de Bacillus stearothermophilus St-100 en 2.000 litros de medio de cultivo esterilizado que contema almidon al 1,0%, extracto de mafz al 0,25%, (NH^SO4 al 0,5%, y CaCO3 al 0,2% (pH 7,0-7,5) a 56°C durante 24 horas con aeracion continua (2.000 l/min) y agitacion (150 rpm). El caldo de cultivo obtenido se filtro usando membrana ceramica Kerasep 0,1 pm (Novasep, Francia) para separar las celulas. El permeado sin celulas se concentro adicionalmente 2 veces en ultrafiltros Persep 10 kDa (Orelis, Francia). La actividad de la enzima se determino segun Hale, Rawlins (1951). Se obtuvo una preparacion de enzima cruda con actividad de aproximadamente 2 unidades/ml.
Ejemplo 2
Preparacion de p-amilasa
Se inoculo una cepa de Bacillus polymyxa St-3504 en 2.000 litros de medio de cultivo esterilizado que contema almidon al 1,0%, peptona al 0,5%, extracto de mafz al 0,5%, NaCl al 0,5%, MnSO4 al 0,02% y CaCO3 al 0,1% (pH 7,0-7,5) a 32°C durante 24 h con aeracion continua (2.000 l/min) y agitacion (150 rpm). El caldo de cultivo obtenido se filtro usando membrana ceramica Kerasep 0,1 pm (Novasep, Francia) para separar las celulas. Se anadio el 10% de glucosa al permeado sin celulas que se concentro adicionalmente en ultrafiltros Persep 10 kDa (Orelis, Francia) y se seco usando una unidad liofilizadora Alpha 1-4 LSC (Christ, Alemania) para obtener un polvo con actividad de
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20.000 AUN/g. Se definio la unidad de actividad p-amilasa (1 AUN) como la actividad que libera 100 pg de azucar reductor (expresado por equivalente de dextrosa) por minuto en las siguientes condiciones: 1 ml de solucion de enzima se mezcla con 5 ml de solucion de almidon al 1,2% (pH 5,5, M/20 tampon acetato) y se mantiene durante 20 min a 40°C.
Ejemplo 3
Preparacion de composicion de estevia con glucosilo de cadena corta
Se resuspendieron 100 g de almidon de tapioca en 300 ml de agua (pH 6,5). Se anadieron 2 KNU de a-amilasa (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) y 30 unidades de CGTasa obtenida segun el ejemplo 1, y la licuacion del almidon se llevo a cabo a 80°C durante aproximadamente una hora hasta un equivalente de dextrosa de aproximadamente 15. El pH de la mezcla de reaccion se ajusto a pH 2,8 por acido clortudrico y la mezcla se hirvio a 100°C durante 5 minutos para inactivar las enzimas. Despues de enfriar a 65°C, el pH se ajusto a pH 6,0 con solucion de hidroxido de sodio. Se anadieron 100 g de extracto de estevia producido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido al 29,2%, rebaudiosido A al 54,3%%, rebaudiosido C al 9,0%, rebaudiosido F (1,7%) y otros glucosidos que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de aproximadamente el 96,4% al almidon licuado y se agito hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Se anadieron 200 unidades de CGTasa a la solucion y la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65°C durante 24 horas con agitacion continua. Despues la temperatura se redujo a 45°C, y se anadieron 8.000 unidades de p-amilasa obtenida segun el ejemplo 2 a la mezcla de reaccion. La reaccion siguio durante otras 12 horas. La mezcla de reaccion obtenida se calento a 95°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Se anadieron 20 gramos de carbon activo y la mezcla se calento a 75°C y se mantuvo durante 30 minutos. La mezcla se filtro y el filtrado se diluyo con agua hasta un contenido en solidos del 5% y se paso a traves de columnas empaquetadas con resinas de intercambio ionico Amberlite FPC23 (H+) y Amberlite FPA51 (OH-). La solucion desalada se concentro a 60°C al vado, y se seco a una forma en polvo usando un secador por rociado de laboratorio. El polvo seco se resuspendio en 5 volumenes de etanol acuoso al 95%. La suspension se agito a 80°C durante 12 horas. Despues los solidos suspendidos se separaron por filtracion. Los solidos obtenidos se secaron en un secador de vado a 90°C durante 5 horas. Se obtuvieron 170 gramos del producto (muestra 1).
Ejemplo 4
Preparacion de composicion de estevia con glucosilo de cadena corta altamente purificada
Se resuspendieron 100 g de almidon de tapioca en 300 ml de agua (pH 6,5). Se anadieron 2 KNU de a-amilasa (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) y 30 unidades de CGTasa obtenida segun el ejemplo 1, y la licuacion del almidon se llevo a cabo a 80°C durante aproximadamente una hora hasta un equivalente de dextrosa de aproximadamente 15. El pH de la mezcla de reaccion se ajusto a pH 2,8 por acido clortudrico y la mezcla se hirvio a 100°C durante 5 minutos para inactivar las enzimas. Despues de enfriar a 65°C, el pH se ajusto a pH 6,0 con solucion de hidroxido de sodio. Se anadieron 100 g de extracto de estevia producido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido al 29,2%, rebaudiosido A al 54,3%%, rebaudiosido C al 9,0%, rebaudiosido F (1,7%) y otros glucosidos que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de aproximadamente el 96,4% al almidon licuado y se agito hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Se anadieron 200 unidades de CGTasa a la solucion y la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65°C durante 24 horas con agitacion continua. Despues la temperatura se redujo a 45°C, y se anadieron 8.000 unidades de p-amilasa obtenida segun el ejemplo 2 a la mezcla de reaccion. La reaccion siguio durante otras 12 horas. La mezcla de reaccion obtenida se calento a 95°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Se anadieron 20 gramos de carbon activo y la mezcla se calento a 75°C y se mantuvo durante 30 minutos. La mezcla se filtro y el filtrado se diluyo con agua hasta un contenido en solidos del 5% y se paso a traves de columnas cada una empaquetadas con 400 ml de resina adsorbente macroporosa Amberlite XAD 7 HPD. Las columnas se lavaron con 5 volumenes de agua y 2 volumenes de etanol al 20% (v/v). Los glucosidos adsorbidos se eluyeron con etanol al 50%. El eluato obtenido se paso por columnas empaquetadas con resinas de intercambio ionico Amberlite FPC23 (H+) y Amberlite FPA51 (OH-). El etanol se evaporo y la solucion acuosa desalada y decolorada se concentro a 60°C al vado, despues se seco a una forma en polvo usando un secador por rociado de laboratorio. El polvo seco se resuspendio en 5 volumenes de etanol acuoso al 95%. La suspension se agito a 80°C durante 12 horas. Despues los solidos suspendidos se separaron por filtracion. Los solidos obtenidos se secaron en un secador de vado a 90°C durante 5 horas. Se obtuvieron 121 gramos del producto (muestra 2).
Ejemplo 5
Preparacion de composicion de estevia con glucosilo de cadena larga altamente purificada
Se resuspendieron 100 g de almidon de tapioca en 300 ml de agua (pH 6,5). Se anadieron 2 KNU de a-amilasa (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) y 30 unidades de CGTasa obtenida segun el ejemplo 1, y la licuacion del almidon se llevo a cabo a 80°C durante aproximadamente una hora hasta un equivalente de dextrosa de aproximadamente 15. El pH de la mezcla de reaccion se ajusto a pH 2,8 por acido clorlddrico y la mezcla se hirvio a 100°C durante 5 minutos para inactivar las enzimas. Despues de enfriar a 65°C, el pH se ajusto a pH 6,0 con
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solucion de hidroxido de sodio. Se anadieron 100 g de extracto de estevia producido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido al 29,2%, rebaudiosido A al 54,3%%, rebaudiosido C al 9,0%, rebaudiosido F (1,7%) y otros glucosidos que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de aproximadamente el 96,4% al almidon licuado y se agito hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Se anadieron 200 unidades de CGTasa a la solucion y la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65°C durante 24 horas con agitacion continua. La mezcla de reaccion obtenida se calento a 95°C durante 15 minutos para inactivar la enzima. Se anadieron 20 gramos de carbon activo y la mezcla se calento a 75°C y se mantuvo durante 30 minutos. La mezcla se filtro y el filtrado se diluyo con agua hasta un contenido en solidos del 5% y se paso a traves de columnas cada una empaquetada con 400 ml de resina adsorbente macroporosa Amberlite XAD 7 HPD. Las columnas se lavaron con 5 volumenes de agua y 2 volumenes de etanol al 20% (v/v). Los glucosidos adsorbidos se eluyeron con etanol al 50%. El eluato obtenido se paso por columnas empaquetadas con resinas de intercambio ionico Amberlite FPC23 (H+) y Amberlite FPA51 (OH-). El etanol se evaporo y la solucion acuosa desalada y decolorada se concentro a 60°C al vado, despues se seco a una forma en polvo usando un secador por rociado de laboratorio. Se obtuvieron 165 gramos del producto (muestra 3).
Ejemplo 6
Preparacion de composicion de estevia con glucosilo de cadena corta altamente purificada
Se resuspendieron 100 g de almidon de tapioca en 300 ml de agua (pH 6,5). Se anadieron 2 KNU de a-amilasa (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) y 30 unidades de CGTasa obtenida segun el ejemplo 1, y la licuacion del almidon se llevo a cabo a 80°C durante aproximadamente una hora hasta un equivalente de dextrosa de aproximadamente 15. El pH de la mezcla de reaccion se ajusto a pH 2,8 por acido clortudrico y la mezcla se hirvio a 100°C durante 5 minutos para inactivar las enzimas. Despues de enfriar a 65°C, el pH se ajusto a pH 6,0 con solucion de hidroxido de sodio. Se anadieron 100 g de extracto de estevia producido por PureCircle (JiangXi) Co., Ltd. (China), que contiene esteviosido al 29,2%, rebaudiosido A al 54,3%%, rebaudiosido C al 9,0%, rebaudiosido F (1,7%) y otros glucosidos que suman un contenido total en glucosidos de esteviol de aproximadamente el 96,4% al almidon licuado y se agito hasta que se obtuvo una solucion homogenea. Se anadieron 200 unidades de CGTasa a la solucion y la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65°C durante 24 horas con agitacion continua. Despues la temperatura se redujo a 45°C, y se anadieron 8.000 unidades de p-amilasa obtenida segun el ejemplo 2 a la mezcla de reaccion. La reaccion siguio durante otras 12 horas. La mezcla de reaccion obtenida se calento a 95°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Se anadieron 20 gramos de carbon activo y la mezcla se calento a 75°C y se mantuvo durante 30 minutos. La mezcla se filtro y el filtrado se diluyo con agua hasta un contenido en solidos del 5% y se paso a traves de columnas cada una empaquetada con 400 ml de resina adsorbente macroporosa Amberlite XAD 7 HPD. Las columnas se lavaron con 5 volumenes de agua y 2 volumenes de etanol al 20% (v/v). Los glucosidos adsorbidos se eluyeron con etanol al 50%. El eluato obtenido se paso por columnas empaquetadas con resinas de intercambio ionico Amberlite FPC23 (H+) y Amberlite FPA51 (OH-). El etanol se evaporo y la solucion acuosa desalada y decolorada se concentro a 60°C al vado, despues se seco a una forma de polvo usando un secador por rociado de laboratorio. Se obtuvieron 154 gramos del producto (muestra 4).
Ejemplo 7
Bebida de zumo de naranja baja en calonas
Se mezclaron concentrado de naranja (35%), acido dtrico (0,35%), acido ascorbico (0,05%), color rojo naranja (0,01%), sabor de naranja (0,20%), rebaudiosido A (0,003%) y diferentes composiciones de glucosil estevia (0,03%) y se disolvieron por completo en agua (hasta el 100%) y se pasteurizaron. Las composiciones de glucosil estevia estaban representadas por las muestras 1,2, 3 y 4, obtenidas segun los ejemplos 3, 4, 5 y 6, respectivamente.
Las evaluaciones sensoriales de las muestras se resumen en la tabla 3. Los datos muestran que los mejores resultados se pueden obtener usando las composiciones de estevia con glucosilo de cadena corta (que contienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo y glucosidos de esteviol sin reaccionar bajos) de alta pureza (muestras 1 y 2). Particularmente las bebidas preparadas con las muestras 1 y 2 mostraron un perfil de sabor y textura en boca redondo y completo.
Tabla 3
Evaluacion de muestras de bebida de zumo de naranja
- Muestra
- Comentarios
- Sabor
- Regusto Textura en boca
- No. 1
- Dulzor de alta calidad, gusto agradable similar a sacarosa, sabor redondo y equilibrado Limpio, casi sin amargor, sin regusto Completa
- No. 2
- Dulzor de alta calidad, gusto agradable similar a sacarosa, sabor redondo y equilibrado Limpio, sin amargor y sin regusto Completa
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- No. 3
- Dulzor de alta calidad, gusto agradable casi similar a sacarosa, sabor redondo y equilibrado Limpio, casi sin amargor, sin regusto Casi aceptable
- No. 4
- Dulce, notas de regaliz Ligeramente amargo y regusto No aceptable
El mismo metodo se puede usar para preparar zumos y bebidas de zumos de otras frutas, tal como manzanas, limones, albaricoques, pinas, mangos, etc.
Ejemplo 8
Bebida carbonada baja en calonas
Se preparo una bebida carbonada segun la formula presentada a continuacion
- Ingredientes
- Cantidad, %
- Sacarosa
- 5,5
- Sabor a cola
- 0,340
- Acido orto-fosforico
- 0,100
- Citrato de sodio
- 0,310
- Benzoato de sodio
- 0,018
- Acido cftrico
- 0,018
- Rebaudiosido A
- 0,003
- Composicion de glucosil estevia
- 0,05
- Agua con gas
- hasta 100
Las propiedades sensoriales las evaluaron 20 panelistas. Los resultados se resumen en la tabla 4.
Tabla 4
Evaluacion de muestras de bebida carbonada baja en calonas
- Atributo de sabor
- Numero de panelistas que detectaron el atributo
- Muestra No. 1
- Muestra No. 2 Muestra No. 3 Muestra No. 4
- Sabor amargo
- 0 0 10 12
- Sabor astringente
- 1 0 15 15
- Regusto
- 1 0 13 18
- Comentarios
- Calidad del sabor dulce
- Limpio (18 de 20) Limpio (20 de 20) Limpio (14 de 20) Regusto amargo (10 de 20)
- Evaluacion global
- Satisfactorio (19 de 20) Satisfactorio (20 de 20) Satisfactorio (11 de 20) Satisfactorio (9 de 20)
Los resultados anteriores muestran que las bebidas preparadas usando las muestras 1 y 2 posefan las mejores caractensticas organolepticas.
Ejemplo 9
Galletas dieteticas
Se amasaron bien harina (50,0%), margarina (30,0%), fructosa (10,0%), maltitol (8,0%), leche entera (1,0%), sal (0,2%), levadura en polvo (0,15%), vainillina (0,1%) y diferentes composiciones de glucosil estevia (0,03%) en una maquina mezcladora de masa. La masa obtenida se moldeo y horneo en el horno a 200°C durante 15 minutos. Las composiciones de glucosil estevia estaban representadas por las muestras 1, 2, 3 y 4 obtenidas segun los ejemplos 3, 4, 5 y 6, respectivamente.
Las propiedades sensoriales las evaluaron 20 panelistas. Los mejores resultados se obtuvieron en muestras preparadas por derivados de composiciones de estevia con glucosilo de cadena corta (que conteman dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) de alta pureza (muestras 1 y 2). Los panelistas notaron perfil de sabor y textura en boca redondo y completo en galletas preparadas con las muestras 1 y 2.
Ejemplo 10
Yogur
Se disolvieron diferentes composiciones de glucosil estevia (0,03%) y sacarosa (4%) en leche desnatada. Las composiciones de glucosil estevia estaban representadas por las muestras 1,2, 3 y 4 obtenidas segun los ejemplos
3, 4, 5 y 6, respectivamente. Despues de pasteurizar a 82°C durante 20 minutes, la leche se enfrio a 37°C. Se anadio un cultivo iniciador (3%) y la mezcla se incubo a 37°C durante 6 horas despues a 5°C durante 12 horas.
Las propiedades sensoriales las evaluaron 20 panelistas. Los mejores resultados se obtuvieron en muestras 5 preparadas por derivados de composiciones de estevia con glucosilo de cadena corta (que conteman dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo) de alta pureza (muestras 1 y 2). Los panelistas notaron perfil de sabor y textura en boca redondo y complete en las muestras preparadas con las muestras 1 y 2.
Claims (14)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un proceso para producir una composicion de glucosil estevia altamente purificada, que comprende los pasos de:anadir almidon a agua para formar una suspension de almidon;anadir una mezcla de a-amilasa y CGTasa a la suspension de almidon e incubar durante aproximadamente de 0,5 a 2 horas a aproximadamente 75-80°C, lo que produce una suspension de almidon licuado; inactivar la a-amilasa por tratamiento a bajo pH con calor;enfriar la suspension de almidon licuado y ajustar el pH a aproximadamente 5,5 a 7,0; anadir glucosidos de esteviol a la suspension de almidon licuado, lo que produce una mezcla de reaccion; anadir un segundo lote de CGTasa a la mezcla de reaccion e incubar durante aproximadamente 12 a 48 horas a aproximadamente 55-75°C.anadir p-amilasa a la mezcla de reaccion e incubar durante aproximadamente 12-24 horas a aproximadamente 35-55°C;inactivar las enzimas en la mezcla de reaccion por tratamiento con calor; decolorar la mezcla de reaccion;eliminar los compuestos no diterpenicos poniendo en contacto la mezcla de reaccion decolorada con resina adsorbente macroporosa y posteriormente eluir los glucosidos diterpenicos adsorbidos con etanol acuoso para producir un eluato de etanol acuoso que contiene glucosidos;desalar el eluato de etanol acuoso que contiene glucosidos con resinas de intercambio ionico;eliminar el etanol del eluato de etanol acuoso, lo que produce un eluato acuoso;concentrar y secar el eluato acuoso para obtener la composicion de glucosil estevia seca;resuspender la composicion de glucosil estevia seca en etanol acuoso para formar una suspension,eliminar los glucosidos de esteviol sin modificar de la suspension, y separar y secar la composicion de glucosilestevia altamente purificada;en donde la composicion de glucosil estevia altamente purificada comprende derivados de glucosido de esteviol de cadena corta que tienen dos o menos residuos de a-1,4-glucosilo, y menos de aproximadamente el 15% de glucosidos de esteviol no modificados.
- 2. El proceso segun la reivindicacion 1, en donde la mezcla de a-amilasa y CGTasa contiene aproximadamente 0,001-0,2 KUN de a-amilasa por una unidad de CGTasa.
- 3. El proceso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el peso de glucosidos de esteviol anadido es aproximadamente igual al del almidon.
- 4. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los glucosidos de esteviol anadidos se seleccionan del grupo que consiste en esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F, dulcosido A, esteviolbiosido, rubusosido, asf como otros glucosidos de esteviol encontrados en plantas de Stevia rebaudiana Bertoni, y mezclas de los mismos.
- 5. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la CGTasa esta producida por cultivos de Bacillus stearothermophilus.
- 6. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el segundo lote de CGTasa tiene aproximadamente 0,2-4 unidades de CGTasa por gramo de solidos.
- 7. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la p-amilasa deriva de una o mas fuentes seleccionadas del grupo que consiste en fuentes animales, vegetales, bacterianas y fungicas.
- 8. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la p-amilasa esta producida por cultivos de Bacillus polymyxa.
- 9. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la p-amilasa se anade a aproximadamente 30-50 unidades por gramo de solidos totales, y el tratamiento se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 40-60°C, durante una duracion de aproximadamente 3-16 horas.
- 10. El proceso segun la reivindicacion 1, en donde en lugar de anadir p-amilasa a la mezcla de reaccion, una enzima hidrolizante de oligo- o polisacaridos, derivada de una o mas fuentes seleccionadas del grupo que consiste en fuentes animales, vegetales, bacterianas y fungicas, se anade a la mezcla de reaccion.
- 11. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la decoloracion se realiza usando carbon activo, o usando resinas de intercambio ionico o membranas, dichas membranas se seleccionan del grupo que consiste en membranas de ultrafiltracion, nanofiltracion y osmosis inversa.
-
- 12.
- El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde eliminar los compuestos no diterpenicos se realiza con una pluralidad de columnas secuencialmente conectadas empaquetadas con una resina adsorbente macroporosa, seguido por lavar las columnas con agua, despues lavar con etanol aproximadamente al 10-50% (v/v), desconectar las columnas, y despues eluir cada columna individualmente
- 5
- con etanol al 30-100%.
-
- 13.
- El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el desalado se realiza pasando el eluato a traves de columnas empaquetadas con resinas de intercambio ionico o membranas, dichas membranas se seleccionan del grupo que consiste en membranas de ultrafiltracion, nanofiltracion y osmosis inversa.
-
- 10 14.
- El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el alcohol acuoso comprende desde aproximadamente el 0-50% (vol), agua, y que comprende ademas los pasos de agitar la suspension a aproximadamente 30-100°C, durante un periodo de aproximadamente 1-24 horas antes de separar la composicion de glucosil estevia altamente purificada.
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