ES2604502T3 - Péptidos derivados del alérgeno principal de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos derivados del alérgeno principal de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Péptido derivado del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 y que consiste en la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 115.

Description

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fuerte con nAmb a 1.
La figura 3 muestra TCL estimuladas con Amb a 1 natural purificado o rAmb a 1.3 a diferentes concentraciones. Se muestran los valores de las concentraciones óptimas. N=13; coeficiente de correlación de Pearson: 0,979 ** (p<0,01)
o rho de Spearman: 0,912**.
La figura 4 muestra ejemplos de titulaciones de alérgenos en ensayos de proliferación de TCL -alérgenos naturales frente a recombinantes (lotes diferentes de rAmb a 1.3, lotes L1-L4). STA y OPO son TCL de 2 pacientes alérgicos a ambrosía diferentes, respectivamente.
La figura 5 muestra una producción de citocina similar inducida por extracto de ambrosía y rAmb a 1.3 en TCL.
La figura 6 muestra una producción de citocina comparable inducida por Amb a 1.3 natural y rAmb a 1.3 en TCL y TCC.
La figura 7 muestra que TCL inducidas con Amb a 1.3 natural o rAmb a 1.3 reconocen epítopos de células T similares.
La figura 8 muestra regiones de activación de células T relevantes de Amb a 1.3. Se analizó por separado el porcentaje de pacientes que reconocen cada epítopo para índices de estimulación superiores a 3 (SI>3) y 5 (SI>5), respectivamente.
La figura 9 muestra una inmunotransferencia de IgE de nAmb a 1 purificado. Se separó nAmb a 1 mediante SDS-PAGE, y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Se incubaron tiras de la membrana con sueros de pacientes alérgicos al polen de ambrosía (carriles 1-29) o con suero de un donante no alérgico (carril C). Se detectó la IgE unida con anticuerpo de cabra anti-IgE humana marcado con 125I. Se reclutaron pacientes sensibilizados al polen de ambrosía en Austria (carriles 1-13) o en Italia (carriles 14-29).
La figura 10 muestra una tinción de Coomassie de Amb a 1 natural purificado tras SDS-PAGE y electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Las bandas correspondientes a nAmb a 1 no procesado, cadenas alfa y beta se sometieron a degradación de Edman para obtener las secuencias N-terminales.
La figura 11 muestra la secuencia N-terminal de Amb a 1 natural no procesado (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.
La figura 12 muestra la secuencia N-terminal de la cadena alfa de Amb a 1 natural (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.
La figura 13 muestra la secuencia N-terminal de la cadena beta de Amb a 1 natural (nAmb a 1, véase la figura 10) y su alineación con secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1.
La figura 14 muestra secuencias de aminoácidos deducidas de isoformas de Amb a 1 y sus cadenas alfa y beta supuestas. Las isoformas Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3, Amb a 1.4 y Amb a 2 se publicaron (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991) y patentaron (patente estadounidense 5.776.761). El clon R2 se aisló en el laboratorio mediante examen inmunológico de un ADNc de polen de ambrosía con anticuerpos de conejo anti-Amb a 1 purificados por afinidad y es idéntico a Amb a 1.3 al nivel proteico. Letras subrayadas, el péptido señal predicho usando el algoritmo SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). En cursiva, la secuencia de cadena beta supuesta basada en secuenciación N-terminal y medición de masa de Amb a 1 natural. En cursiva y subrayada, la secuencia de cadena alfa supuesta basada en secuenciación N-terminal y medición de masa de Amb a 1 natural (figuras 10-13; tabla 4). El análisis de la secuencia N-terminal mostró que las secuencias en negrita se eliminaron proteolíticamente en la preparación de Amb a 1 natural purificado.
La figura 15 muestra una alineación de secuencia de isoformas de Amb a 1. Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3 y Amb a 2 se clonaron, se secuenciaron y se publicaron previamente (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991). Se generó la alineación de secuencia usando el software Clustalw (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=npsa clustalw.html). Para la alineación se usaron las secuencias de aminoácidos deducidas completas (incluyendo el péptido señal) proporcionadas en la figura 14.
La figura 16 muestra la secuencia de aminoácido deducida de Amb a 1.3 (clon R2) y las cadenas. (a) Cadenas alfa y beta supuestas basadas en la información de la secuenciación N-terminal y la espectrometría de masas de Amb a 1 natural purificado (véanse las figuras 10-13; tabla 4). (b) El primer constructo preparado en el laboratorio para producir las cadenas alfa y beta recombinantes de Amb a 1.3. La expresión de las cadenas fue mejor que Amb a 1.3 de longitud completa pero se obtuvieron bajos rendimientos. Además, la cadena alfa excluía un dominio reactivo con células T importante (en recuadro, aa 178-189). (c) Cadenas alfa y beta modificadas (versión 1) de Amb a 1.3 diseñadas para incluir en la cadena alfa el epítopo de células T correspondiente a los aminoácidos 178-189. (d) Cadenas alfa y beta modificadas (versión 2) de Amb a 1.3 diseñadas para incluir en la cadena alfa el epítopo de
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Diversos cambios en el protocolo de purificación y la adición de diferentes agentes estabilizantes no dieron como resultado una proteína soluble y correctamente plegada. En ensayos no desnaturalizantes (por ejemplo, transferencia puntual, ELISA) rAmb a 1.3 no pudo unirse a IgE humana (figura 2). Sólo tras reducción y tratamiento térmico (procedimiento convencional para SDS-PAGE/inmunotransferencia) rAmb a 1.3 reaccionó con IgE de pacientes. Estos resultados demuestran claramente que rAmb a 1.3 producido tal como se describió anteriormente no es un reactivo adecuado para el diagnóstico y la terapia de la alergia. Por tanto, se buscó otro enfoque para producir reactivos recombinantes con actividad de unión a IgE completa, tal como se describe en la sección 4. A pesar de su baja actividad de unión a IgE, rAmb a 1.3 se usó satisfactoriamente in vitro para los ensayos de proliferación y mapeo de epítopos de células T, ya que no es esencial un plegamiento correcto para el reconocimiento de células T (véase el ejemplo 2).
Ejemplo 2: Reconocimiento de células T de Amb a 1
Ejemplo 2.1: Pacientes
Se caracterizó en detalle la respuesta de células T a Amb a 1 usando el sistema de cultivo in vitro establecido (Jahn-Schmid et al., J. Inmunol. 169: 6005-11, 2002; Jahn-Schmid et al., J. Allergy Clin. Inmunol., 115: 399-404, 2005). En total, se incluyeron 85 pacientes bien definidos clínicamente (75 de Viena / 10 de Milán) con una historia clínica típica, prueba de punción cutánea positiva y pruebas de CAP/RAST para extracto de ambrosía.
Ejemplo 2.2: PBMC, líneas de células T (TCL) y clones de células T (TCC) específicos de Amb a 1
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre heparinizada de pacientes alérgicos mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Para generar líneas de células T (TCL) y clones de células T (TCC) específicos de alérgeno, se estimularon 1,5 x 106 PBMC con doses óptimas de extracto de ambrosía
o artemisa (4 µg/ml) o rAmb a 1.3 (10 µg/ml) en placas de cultivo celular de fondo plano de 24 pocillos (Costar, EE.UU.). Tras 5 días, se añadió rIL-2 humana (10 U/ml, Boehringer, Mannheim, Alemania) se continuaron los cultivos durante 7 días adicionales. Entonces, se aislaron los blastos de células T mediante centrifugación en densidad. La mayoría de los blastos de células T se expandieron adicionalmente con IL-2 y PBMC irradiadas. Se usó un pequeño número de blastos de células T para establecer cultivos de células T monoclonales mediante dilución limitante: se sembraron 0,3 células T/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Nunclone) en presencia de 2 x 105 PBMC irradiadas (60 Gy), PHA al 0,25% v/v (Gibco, EE.UU.) y rIL-2 (4 U/pocillo) en el medio mencionado anteriormente. Tras 14-21 días, se expandieron microcultivos en crecimiento a intervalos semanales con PBMC irradiadas y rIL-2. Se evaluó la especificidad de TCC en ensayos de proliferación usando PBMC de HLA coincidiente o alogénicas irradiadas o células B alogénicas transformadas con VEB irradiadas y 5 µg/ml de Amb a
1.3. Tras 48 horas, se realizó la captación celular de (3H)-timidina tritiada para medir la proliferación en cuentas por minuto (cpm). Cuando el índice de estimulación (SI; razón entre las cpm obtenidas en cultivos que contenían TCC más APC autólogas más antígeno, y las cpm obtenidas en cultivos que contenían TCC y APC solos) era >10, se consideró que las respuestas eran positivas. Se expandieron TCC específicos de alérgeno alternando turnos de estimulación con APC irradiadas autólogas y alérgeno o con células alimentadoras alogénicas y rIL-2. Para PBMC y TCL, que mostraron diferentes grados de proliferación de fondo debido a autorreactividad, un SI de >3 o respectivamente 10.000 dpm se consideraron como un punto de corte para la especificidad de antígeno.
Se usaron TCL y TCC específicos de Amb a 1 para identificar epítopos de células T de Amb a 1.3. Se estimularon cultivos de células T con un panel de 121 péptidos de 12 meros sintéticos y un péptido de 13 meros que representa el péptido C-terminal de Amb a 1.3 (Pepset, Biotrend, Alemania). Los péptidos se habían sintetizado según la secuencia de aminoácidos de Amb a 1.3 y se solapaban en 9 residuos de aminoácido con los péptidos vecinos (tabla 1). Se usaron los péptidos a una concentración de 5 µg/ml para la estimulación y se determinó la proliferación de cultivos de células T tras 48 h mediante la captación de 3H-timidina. Debido al alto fondo frecuentemente observado provocado por la autorreactividad en TCL, se usó la media de las cpm observadas con los diez péptidos menos estimulantes (ninguno de los péptidos era tóxico) como control negativo en los cálculos de SI. A lo largo de todo este documento, un péptido comprendía un epítopo de células T cuando el índice de estimulación era de al menos 3,0. También se indican en las tablas 2 y 3 péptidos estimulantes más fuertes con SI ≥ 5,0.
Tabla 1. Péptidos sintéticos usados para el mapeo de epítopos de células T de Amb a 1.3. Se usó la secuencia de aminoácidos deducida de Amb a 1.3 maduro (sin péptido señal) como molde para diseñar 120 péptidos de 12 meros más 1 péptido de 13 meros (correspondiente al extremo C-terminal de Amb a 1.3).
Pos. de aa
Pept. n.º (= SEQ ID No.) Secuencia Pos. de aa Pept. n.º (= SEQ ID No.) Secuencia
25-36
1 SAEGVGEILPSV 205-216 61 QIWIDHCSLSKS
28-39
2 GVGEILPSVNET 208-219 62 IDHCSLSKSFDG
31-42
3 EILPSVNETRSL 211-222 63 CSLSKSFDGLVD
34-45
4 PSVNETRSLQAC 214-225 64 SKSFDGLVDVTL
37-48
NETRSLQACEAY 217-228 65 FDGLVDVTLGST
40-51
6 RSLQACEAYNII 220-231 66 LVDVTLGSTHVT
43-54
7 QACEAYNIIDKC 223-234 67 VTLGSTHVTISN
46-57
8 EAYNIIDKCWRG 226-237 68 GSTHVTISNCKF
49-60
9 NIIDKCWRGKAD 229-240 69 HVTISNCKFTQQ
52-63
DKCWRGKADWEN 232-243 70 ISNCKFTQQSKA
55-66
11 WRGKADWENNRQ 235-246 71 CKFTQQSKAILL
58-69
12 KADWENNRQALA 238-249 72 TQQSKAILLGAD
61-72
13 WENNRQALADCA 241-252 73 SKAILLGADDTH
64-75
14 NRQALADCAQGF 244-255 74 ILLGADDTHVQD
67-78
ALADCAQGFAKG 247-258 75 GADDTHVQDKGM
70-81
16 DCAQGFAKGTYG 250-261 76 DTHVQDKGMLAT
73-84
17 QGFAKGTYGGKW 253-264 77 VQDKGMLATVAF
76-87
18 AKGTYGGKWGDV 256-267 78 KGMLATVAFNMF
79-90
19 TYGGKWGDVYTV 259-270 79 LATVAFNMFTDN
82-93
GKWGDVYTVTSN 262-273 80 VAFNMFTDNVDQ
85-96
21 GDVYTVTSNLDD 265-276 81 NMFTDNVDQRMP
88-99
22 YTVTSNLDDDVA 268-279 82 TDNVDQRMPRCR
91-102
23 TSNLDDDVANPK 271-282 83 VDQRMPRCRFGF
94-105
24 LDDDVANPKEGT 274-285 84 RMPRCRFGFFQV
97-108
DVANPKEGTLRF 277-288 85 RCRFGFFQWNN
100-111
26 NPKEGTLRFAAA 280-291 86 FGFFQVVNNNYD
103-114
27 EGTLRFAAAQNR 283-294 87 FQWNNNYDRWG
106-117
28 LRFAAAQNRPLW 286-297 88 VNNNYDRWGTYA
109-120
29 AAAQNRPLWIIF 289-300 89 NYDRWGTYAIGG
112-123
QNRPLWIIFKND 292-303 90 RWGTYAIGGSSA
115-126
31 PLWIIFKNDMVI 295-306 91 TYAIGGSSAPTI
118-129
32 IIFKNDMVINLN 298-309 92 IGGSSAPTILCQ
121-132
33 KNDMVINLNQEL 301-312 93 SSAPTILCQGNR
124-135
34 MVINLNQELWN 304-315 94 PTILCQGNRFLA
127-138
NLNQELVVNSDK 307-318 95 LCQGNRFLAPDD
130-141
36 QELWNSDKTID 310-321 96 GNRFLAPDDQIK
133-144
37 VVNSDKTIDGRG 313-324 97 FLAPDDQIKKNV
136-147
38 SDKTIDGRGVKV 316-327 98 PDDQIKKNVLAR
139-150
39 TIDGRGVKVEII 319-330 99 QIKKNVLARTGT
142-153
GRGVKVEIINGG 322-333 100 KNVLARTGTGAA
145-156
41 VKVEIINGGLTL 325-336 101 LARTGTGAAESM
148-159
42 EIINGGLTLMNV 328-339 102 TGTGAAESMAWN
151-162
43 NGGLTLMNVKNI 331-342 103 GAAESMAWNWRS
154-165
44 LTLMNVKNIIIH 334-345 104 ESMAWNWRSDKD
157-168
MNVKNIIIHNIN 337-348 105 AWNWRSDKDLLE
160-171
46 KNIIIHNINIHD 340-351 106 WRSDKDLLENGA
163-174
47 IIHNINIHDVKV 343-354 107 DKDLLENGAIFV
166-177
48 NINIHDVKVLPG 346-357 108 LLENGAIFVTSG
169-180
49 IHDVKVLPGGMI 349-360 109 NGAIFVTSGSDP
172-183
VKVLPGGMIKSN 352-363 110 IFVTSGSDPVLT
175-186
51 LPGGMIKSNDGP 355-366 111 TSGSDPVLTPVQ
178-189
52 GMIKSNDGPPIL 358-369 112 SDPVLTPVQSAG
181-192
53 KSNDGPPILRQA 361-372 113 VLTPVQSAGMIP
184-195
54 DGPPILRQASDG 364-375 114 PVQSAGMIPAEP
187-198
PILRQASDGDTI 367-378 115 SAGMIPAEPGEA
190-201
56 RQASDGDTINVA 370-381 116 MIPAEPGEAAIK
193-204
57 SDGDTINVAGSS 373-384 117 AEPGEAAIKLTS
196-207
58 DTINVAGSSQIW 376-387 118 GEAAIKLTSSAG
199-210
59 NVAGSSQIWIDH 379-390 119 AIKLTSSAGVLS
202-213
GSSQIWIDHCSL 382-393 120 LTSSAGVLSCRP
385-397
121 SAGVLSCRPGAPC

Ejemplo 2.3: Medición de citocinas
Se lavaron células T y se incubaron APC autólogas irradiadas en presencia del estimulante (5 µg/ml) durante 48 horas. Se midieron los niveles de citocina en los sobrenadantes resultantes en ELISA usando pares de anticuerpos emparejados (Endogen, EE.UU.) (límites de sensibilidad: IL-4: 9 pg/ml, IFN-γ: 9 pg/ml). Cultivos que contenían TCC
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imagen14
enumeran los péptidos que proporcionan índices de estimulación (SI) mayores de 3 y 5.
Paciente n.º
Péptido n.º (SI > 3) Péptido n.º (SI > 5)
1
112, 114 8, 31, 33, 36, 44, 52, 59, 60, 61, 68, 78, 102, 108, 109, 110, 111, 115, 116, 117, 118, 119, 120
2
29, 30, 42, 64, 67, 79, 88, 89, 93, 98, 101, 103 27, 28, 33, 52, 60, 61, 68, 94, 107, 108, 111, 114, 115, 116, 118, 119, 120
3
120 107
4
41, 42, 60, 90, 98 52, 83, 91, 107, 108
5
39, 78, 85, 99, 101, 102, 107, 108 28, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 86, 100, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 119, 120
6
34 83, 91, 107, 108, 115
7
11, 58, 68, 78, 82, 84, 86, 88, 89, 99, 108 33, 39, 47, 48, 51, 52, 59, 60, 61, 107
8
34, 44, 45, 72, 79, 80 33, 39, 40, 50, 71, 83, 107
9
50, 76, 83, 87, 101, 112, 113, 119, 121 39, 69, 91, 93, 107, 117
10
47, 96, 97, 110, 119 44, 46, 60, 61, 69, 89, 101, 107, 108, 115
11
110 33, 38, 39, 46, 52, 60, 69, 83, 90, 91, 107, 108, 115
12
59 36, 37, 52, 60, 61, 68, 86, 96, 97, 98
13
14, 37, 44, 61, 71, 77, 108, 111, 121 20, 28, 36, 47, 101, 109, 110, 118
14
30, 31, 111, 120 119
15
8, 20, 46, 47, 71, 77, 107, 108
16
87 21, 46, 47, 54, 55, 63, 86
17
14, 23, 29, 34, 53, 58, 69, 76, 80, 82, 85, 99, 102, 107, 115 20, 22, 28, 31, 33, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 68, 77, 81, 84, 88, 98, 108, 109, 110, 111, 118, 119, 120
18
33, 104 38, 39, 52, 60, 61, 68, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 112
19
20, 28, 36, 37, 44, 47, 48, 52, 59, 60, 67, 77, 78
20
60, 61
21
29, 34, 47, 61 30, 33, 38, 39, 42, 43, 46, 49, 52, 60, 91, 94, 107, 108, 114, 115
22
20, 39, 44, 52, 53, 64, 69, 85, 94 28, 37, 38, 40, 60, 61, 68, 86
23
23, 51, 53, 54, 55, 59, 116, 117, 120 9, 30, 31, 32, 33, 34, 38, 39, 46, 47, 48, 52, 60, 61, 68, 81, 88, 89, 98, 99, 107, 108, 111, 115, 118, 119
24
28, 114 11, 34, 37, 38, 52, 68, 83, 89, 91, 100, 101, 102, 107, 108, 109, 110, 115
25
44, 111, 119, 120 60, 61, 77, 92, 93, 94107, 108, 109, 110
26
28, 29, 30, 36, 44, 68, 83, 84, 118, 121 12, 15, 22, 23, 31, 33, 52, 60, 61, 73, 74, 78, 82, 86, 107, 108, 111, 113, 115, 119, 120
27
43, 107 10, 22, 28, 30, 33, 36, 37, 48, 52, 60, 61, 86, 87
28
33, 39, 61, 73, 93, 94, 99, 118 36, 52, 60, 77, 88, 102, 107, 108, 109, 110, 111, 119, 120
29
28, 81, 83, 86, 87, 91, 100 31, 39, 52, 59, 60, 61, 67, 68, 69, 80, 107, 108, 111, 115, 118, 119, 120
30
4, 78 20, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 44, 52, 60, 61, 68, 80, 93, 94, 108, 117
31
11, 32, 77 29, 30, 38, 39, 40, 42, 46, 47, 48, 61, 79, 89, 94, 108, 115
32
1, 77 4, 20, 22, 28, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 50, 52, 60, 61, 62, 66, 68, 78, 83, 86, 90, 91, 96, 97, 98, 105, 107, 108, 115
33
12, 61 52, 60, 68, 108
34
28, 30, 42, 91 24, 27, 29, 94, 108, 114
35
37, 38, 69, 72 20, 28, 33, 36, 39, 42, 44, 48, 52, 58, 60, 61, 68, 94, 114
36
7, 9, 12, 15, 16, 28, 33, 37, 39, 43, 47 30, 52, 60, 61, 68, 96, 97, 98, 107
37
5, 12, 29, 55, 59
38
19, 37, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 98, 107, 109, 113 20, 22, 28, 31, 36, 44, 52, 78, 82, 86, 89, 90, 101, 102, 110, 111, 118, 119, 120
39
4, 52 33, 42, 47, 48, 59, 60, 78, 98, 99, 107
40
24, 25, 33, 52, 73, 78, 98, 109, 111, 119 31, 66, 68, 71, 80, 81, 83, 102, 107, 108, 110, 112, 115, 120
41
2, 17, 20, 28, 30, 36, 37, 38, 44, 61, 92 27, 31, 39, 52, 83, 91, 94
42
67, 80 91, 93, 101
43
28, 62, 68, 76, 88, 89 38, 39, 51, 52, 59, 60, 61, 80, 81, 86, 92, 100, 101, 102, 109, 110
44
35, 80, 88, 90, 119 30, 31, 38, 39, 46, 47, 48, 51, 52, 59, 60, 94, 100, 107, 108, 111, 112, 115, 121
45
5, 39, 41, 42, 48, 51, 52, 53, 54, 65, 67, 68, 74, 78, 79, 84, 89, 106, 109, 112 47, 60, 61, 63, 64, 66, 72, 73, 75, 76, 80, 85, 86, 87, 88, 101, 107, 108, 115, 116
46
88 27, 91, 107
47
3, 4, 5, 6, 13, 14, 16, 23, 28, 41, 49, 61, 74, 89, 98, 102, 108, 112, 113, 114, 116, 119, 120, 121 2, 9, 15, 30, 50, 56, 62, 91, 99, 100, 103, 105, 107, 110, 111, 115, 117
48
1, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 32, 36, 42, 53, 65, 67, 69, 88, 97, 105, 106, 111 10, 11, 18, 30, 31, 33, 38, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 59, 60, 61, 66, 68, 70, 72, 79, 80, 81, 89, 98, 99, 107, 108, 109, 114, 115, 116, 118, 121
Tabla 3. Epítopos de células T de líneas de células T (TCL) específicas para Amb a 1 de 48 pacientes alérgicos al polen de ambrosía diferentes (véase la tabla 2). Se usaron 121 péptidos sintéticos solapantes (12 meros) para el mapeo de epítopos. Se evaluó por separado la relevancia de cada epítopo para índices de estimulación mayores de 3 (SI>3) y mayores de 5 (SI>5).
Péptido (=SEQ ID No.)
Posición de AA Secuencia de AA N.º de pacientes positivos % N.º de pacientes positivos %
SI>3
SI>5
1
25-36 SAEGVGEILPSV 2 4,2 0 0,0
2
28-39 GVGEILPSVNET 2 4,2 1 2,1
3
31-42 EILPSVNETRSL 1 2,1 0 0,0
4
34-45 PSVNETRSLQAC 4 8,3 1 2,1
5
37-48 NETRSLQACEAY 4 8,3 0 0,0
6
40-51 RSLQACEAYNII 1 2,1 0 0,0
7
43-54 QACEAYNIIDKC 1 2,1 0 0,0
8
46-57 EAYNIIDKCWRG 3 6,3 1 2,1
9
49-60 NIIDKCWRGKAD 3 6,3 2 4,2
10
52-63 DKCWRGKADWEN 2 4,2 2 4,2
11
55-66 WRGKADWENNRQ 4 8,3 2 4,2
12
58-69 KADWENNRQALA 5 10,4 1 2,1
13
61-72 WENNRQALADCA 2 4,2 0 0,0
14
64-75 NRQALADCAQGF 4 8,3 0 0,0
15
67-78 ALADCAQGFAKG 4 8,3 2 4,2
16
70-81 DCAQGFAKGTYG 2 4,2 0 0,0
17
73-84 QGFAKGTYGGKW 2 4,2 1 2,1
18
76-87 AKGTYGGKWGDV 1 2,1 0 0,0
19
79-90 TYGGKWGDVYTV 2 4,2 0 0,0
20
82-93 GKWGDVYTVTSN 9 18,8 7 14,6
21
85-96 GDVYTVTSNLDD 2 4,2 1 2,1
22
88-99 YTVTSNLDDDVA 4 8,3 4 8,3
23
91-102 TSNLDDDVANPK 2 4,2 1 2,1
24
94-105 LDDDVANPKEGT 2 4,2 1 2,1
25
97-108 DVANPKEGTLRF 2 4,2 0 0,0
26
100-111 NPKEGTLRFAAA 0 0,0 0 0,0
27
103-114 EGTLRFAAAQNR 5 10,4 5 10,4
28
106-117 LRFAAAQNRPLW 15 31,3 11 22,9
29
109-120 AAAQNRPLWIIF 4 8,3 3 6,3
30
112-123 QNRPLWIIFKND 11 22,9 9 18,8
31
115-126 PLWIIFKNDMVI 11 22,9 10 20,8
32
118-129 IIFKNDMVINLN 2 4,2 1 2,1
33
121-132 KNDMVINLNQEL 15 31,3 13 27,1
34
124-135 MVINLNQELVVN 2 4,2 2 4,2
35
127-138 NLNQELVVNSDK 1 2,1 1 2,1
36
130-141 QELVVNSDKTID 14 29,2 12 25,0
37
133-144 VVNSDKTIDGRG 14 29,2 9 18,8
38
136-147 SDKTIDGRGVKV 13 27,1 11 22,9
39
139-150 TIDGRGVKVEII 19 39,6 16 33,3
40
142-153 GRGVKVEIINGG 3 6,3 4 8,3
41
145-156 VKVEIINGGLTL 5 10,4 1 2,1
42
148-159 EIINGGLTLMNV 11 22,9 5 10,4
43
151-162 NGGLTLMNVKNI 4 8,3 1 2,1
44
154-165 LTLMNVKNIIIH 15 31,3 9 18,8
45
157-168 MNVKNIIIHNIN 2 4,2 0 0,0
46
160-171 KNIIIHNINIHD 10 20,8 8 16,7
47
163-174 IIHNINIHDVKV 14 29,2 10 20,8
48
166-177 NINIHDVKVLPG 10 20,8 9 18,8
49
169-180 IHDVKVLPGGMI 3 6,3 2 4,2
50
172-183 VKVLPGGMIKSN 5 10,4 4 8,3
51
175-186 LPGGMIKSNDGP 6 12,5 3 6,3
52
178-189 GMIKSNDGPPIL 31 64,6 27 56,3
53
181-192 KSNDGPPILRQA 5 10,4 0 0,0
54
184-195 DGPPILRQASDG 4 8,3 2 4,2
55
187-198 PILRQASDGDTI 3 6,3 1 2,1
56
190-201 RQASDGDTINVA 1 2,1 1 2,1
57
193-204 SDGDTINVAGSS 0 0,0 0 0,0
58
196-207 DTINVAGSSQIW 3 6,3 1 2,1
59
199-210 NVAGSSQIWIDH 11 22,9 8 16,7
60
202-213 GSSQIWIDHCSL 30 62,5 28 58,3
61
205-216 QIWIDHCSLSKS 29 60,4 24 50,0
62
208-219 IDHCSLSKSFDG 3 6,3 2 4,2
63
211-222 CSLSKSFDGLVD 2 4,2 2 4,2
64
214-225 SKSFDGLVDVTL 3 6,3 1 2,1
65
217-228 FDGLVDVTLGST 2 4,2 1 2,1
66
220-231 LVDVTLGSTHVT 4 8,3 4 8,3
67
223-234 VTLGSTHVTISN 6 12,5 2 4,2
68
226-237 GSTHVTISNCKF 20 41,7 16 33,3
69
229-240 HVTISNCKFTQQ 8 16,7 4 8,3
70
232-243 ISNCKFTQQSKA 1 2,1 1 2,1
71
235-246 CKFTQQSKAILL 4 8,3 2 4,2
72
238-249 TQQSKAILLGAD 4 8,3 2 4,2
73
241-252 SKAILLGADDTH 4 8,3 2 4,2
74
244-255 ILLGADDTHVQD 3 6,3 1 2,1
75
247-258 GADDTHVQDKGM 1 2,1 1 2,1
76
250-261 DTHVQDKGMLAT 4 8,3 1 2,1
77
253-264 VQDKGMLATVAF 7 14,6 4 8,3
78
256-267 KGMLATVAFNMF 11 22,9 6 12,5
79
259-270 LATVAFNMFTDN 5 10,4 2 4,2
80
262-273 VAFNMFTDNVDQ 10 20,8 6 12,5
81
265-276 NMFTDNVDQRMP 7 14,6 6 12,5
82
268-279 TDNVDQRMPRCR 3 6,3 2 4,2
83
271-282 VDQRMPRCRFGF 10 20,8 8 16,7
84
274-285 RMPRCRFGFFQV 3 6,3 1 2,1
85
277-288 RCRFGFFQWNN 4 8,3 1 2,1
86
280-291 FGFFQVVNNNYD 12 25,0 10 20,8
87
283-294 FQVVNNNYDRWG 5 10,4 2 4,2
88
286-297 VNNNYDRWGTYA 10 20,8 4 8,3
89
289-300 NYDRWGTYAIGG 11 22,9 6 12,5
90
292-303 RWGTYAIGGSSA 5 10,4 3 6,3
91
295-306 TYAIGGSSAPTI 13 27,1 11 22,9
92
298-309 IGGSSAPTILCQ 3 6,3 2 4,2
93
301-312 SSAPTILCQGNR 6 12,5 4 8,3
94
304-315 PTILCQGNRFLA 11 22,9 9 18,8
95
307-318 LCQGNRFLAPDD 0 0,0 0 0,0
96
310-321 GNRFLAPDDQIK 5 10,4 4 8,3
97
313-324 FLAPDDQIKKNV 6 12,5 4 8,3
98
316-327 PDDQIKKNVLAR 13 27,1 8 16,7
99
319-330 QIKKNVLARTGT 8 16,7 4 8,3
100
322-333 KNVLARTGTGAA 6 12,5 5 10,4
101
325-336 LARTGTGAAESM 10 20,8 7 14,6
102
328-339 TGTGAAESMAWN 9 18,8 6 12,5
103
331-342 GAAESMAWNWRS 2 4,2 1 2,1
104
334-345 ESMAWNWRSDKD 2 4,2 1 2,1
105
337-348 AWNWRSDKDLLE 4 8,3 3 6,3
106
340-351 WRSDKDLLENGA 3 6,3 1 2,1
107
343-354 DKDLLENGAIFV 30 62,5 27 56,3
108
346-357 LLENGAIFVTSG 27 56,3 24 50,0
109
349-360 NGAIFVTSGSDP 12 25,0 9 18,8
110
352-363 IFVTSGSDPVLT 13 27,1 11 22,9
111
355-366 TSGSDPVLTPVQ 16 33,3 11 22,9
112
358-369 SDPVLTPVQSAG 7 14,6 3 6,3
113
361-372 VLTPVQSAGMIP 4 8,3 1 2,1
114
364-375 PVQSAGMIPAEP 8 16,7 5 10,4
115
367-378 SAGMIPAEPGEA 18 37,5 17 35,4
116
370-381 MIPAEPGEAAIK 6 12,5 4 8,3
117
373-384 AEPGEAAIKLTS 4 8,3 3 6,3
118
376-387 GEAAIKLTSSAG 10 20,8 8 16,7
119
379-390 AIKLTSSAGVLS 16 33,3 10 20,8
120
382-393 LTSSAGVLSCRP 14 29,2 9 18,8
121
385-397 SAGVLSCRPGAPC 6 12,5 2 4,2
Ejemplo 3: Caracterización de las cadenas alfa y beta de Amb a 1
nAmb a 1 experimenta proteólisis espontáneamente durante la purificación y se escinde en dos cadenas, cadena
5 alfa y beta, respectivamente. Los datos usando sueros recogidos de pacientes en diversos países (Italia, Canadá y Austria) mostraron que la mayoría de los pacientes (90%) reconocían fuertemente la cadena beta de 12 kDa. En cambio, la cadena alfa se unía débilmente a anticuerpos IgE de sólo el 65% de los pacientes sometidos a prueba (figura 9).
10 En experimentos dirigidos a la identificación de epítopos de células T (descritos en el ejemplo 2) se encontró que las tres regiones de activación de células T inducían respuestas proliferativas en más del 45% de los pacientes alérgicos y se definieron por tanto como epítopos inmunodominantes (tabla 3, figura 8). De manera interesante, estas y otras regiones de activación de células T están agrupadas en la región C-terminal de Amb a 1, que corresponde a la cadena alfa. Por tanto, al contrario que la investigación publicada anteriormente (King et al. Arch.
15 Biochem. Biophys. 212: 127-135, 1981), los presentes datos en conjunto muestran que las propiedades inmunológicas de las dos cadenas de Amb a 1 difieren. Estos hallazgos incitaron a investigar la posibilidad de producir por separado las cadenas en E. coli y usarlas como vacuna candidata para el diagnóstico y la inmunoterapia de la alergia. La cadena alfa con la capacidad de unión a IgE inferior pero con alta inmunogenicidad (activación de células T) es una herramienta perfecta para la inmunoterapia específica mientras que la cadena beta
20 altamente reactiva con IgE es un candidato para el diagnóstico de la alergia al polen de ambrosía.
Para este fin, se realizaron experimentos para determinar el sitio de escisión exacto para la generación de las cadenas alfa y beta, lo que se describió para Amb a 1 durante su extracción y purificación a partir de polen de ambrosía (King et al. Inmunochem. 11: 83-92, 1974). Además de la estimación de su peso molecular mediante SDS
25 PAGE, no se han publicado datos estructurales referentes a las cadenas de Amb a 1. Se analizó Amb a 1 natural purificado (véase King et al. Inmunochem. 11: 83-92, 1974) mediante espectrometría de masas Maldi-TOF y se sometieron las bandas correspondientes a Amb a 1 intacto y cadenas alfa y beta de Amb a 1 a degradación de Edman tras SDS-PAGE/electrotransferencia/tinción de Coomassie. De este modo, fue posible determinar las masas exactas y las secuencias N-terminales de Amb a 1 natural procesado y no procesado (figuras 10-13; tabla 4).
30
Ejemplo 3.1: Análisis de la secuencia N-terminal
Se separó Amb a 1 natural mediante SDS-PAGE al 15% y se sometió a electrotransferencia sobre membranas de poli(difluoruro de vinilo) (PVDF) (Millipore). Se escindieron las bandas correspondientes a Amb a 1 y sus fragmentos,
35 y se eluyeron las proteínas mediante incubación en ácido trifluoroacético al 30% (v/v) y acetonitrilo al 40% (v/v) acuoso durante 1 hora a temperatura ambiente. Se secaron las muestras a vacío, se resuspendieron en agua y se secuenciaron con el sistema de secuenciación de proteínas HP G1005A (Agilent Technologies).
Ejemplo 3.2: Espectrometría de masas por desorción/ionización por láser asistida por matriz y tiempo de vuelo 40 (MALDI-TOF)
imagen15
imagen16

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  1. imagen1
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