ES2605954T3 - Atributos mejorados de endófitos de plantas herbáceas - Google Patents

Atributos mejorados de endófitos de plantas herbáceas Download PDF

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ES2605954T3 ES06784009.0T ES06784009T ES2605954T3 ES 2605954 T3 ES2605954 T3 ES 2605954T3 ES 06784009 T ES06784009 T ES 06784009T ES 2605954 T3 ES2605954 T3 ES 2605954T3
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Abstract

Un método de conservación de la viabilidad de endófitos en una planta o en una parte de la misma producida por una combinación de un cultivar de planta herbácea y una combinación de endófito, en la que el endófito es el endófito AR584 (depósito AGAL Nº NM98/04676 con fecha del 12 de mayo de 1998), que comprende el tratamiento de la combinación con un fungicida.

Description

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DESCRIPCION
Atributos mejorados de endofitos de plantas herbaceas Campo tecnico
La invencion se refiere a atributos mejorados de endofitos de plantas herbaceas. Mas especlficamente, la invencion se refiere a un endofito con estabilidad y resistencia a fungicida mejoradas cuando esta en combinacion con una planta cultivada o parte de la misma.
Antecedentes de la tecnica
Se sabe a partir de la memoria de patente nueva zelandesa 233.083 que se puede hacer que las combinaciones sinteticas de endofito/cultivares de herbaje sean resistentes a plagas y pueden ser menos toxicas a animales que pastan que las combinaciones que se dan de manera natural. Estas propiedades seleccionadas se pueden alcanzar seleccionando combinaciones sinteticas que producen niveles relativamente altos de peramina y niveles relativamente bajos o no lolitrem B en raigras.
El documento US 6.111.170 (la patente '170), describe descubrimientos de que endofitos seleccionados del genero Neotyphodium forman combinaciones sinteticas estables con hospedadores de festuca alta (Festuca arundinacea). Las combinaciones descritas tienen resistencia mejorada a plagas de invertebrados en comparacion con cultivares de festuca alta que no contiene tales endofitos. Las cepas particulares de endofito descritas en la patente '170 incluyen AR501, Ar502, AR510, AR542, AR572, AR577 y Ar584. Sin embargo, esta patente no describe, ni sugiere otros atributos de estos endofitos y sus combinaciones mas alla de resistencia mejorada a plaga y toxicidad reducida.
El resumen de la patente rusa, RU2201678C2 describe un biopreparado para proteger las plantas frente a hongos y enfermedades bacterianas. El biopreparado se basa en celulas vivas y esporas de la bacteria endofltica Bacillus subtilis. La bacteria tiene una alta actividad antagonista a agentes de enfermedades fungicas y bacterianas en cultivos de verduras, grano y fruta. No se hace descripcion con respecto al uso de la bacteria en plantas herbaceas. Tampoco es obvio a partir de este resumen que la bacteria descrita sea resistente a fungicidas. La descripcion meramente hace referencia a que la bacteria previene la infeccion fungica de la planta a todos los efectos actuando como un fungicida de por si.
Meriaux y col. describe la viabilidad de la semilla de raigras (Lolium perenne) infectada con endofito de Neotyphodium despues del tratamiento con fungicidas. Los fungicidas usados eran procloraze (procloraz), triticonazol, bitertanol y fluquinconazol administrados a dos dosis o tratados por calor (tratamiento por horno a 60 o 80 °C). Se describe que la germinacion de la semilla se efectua por el tratamiento con procloraz (1 g/kg), triticonazol (5 y 10 g/kg) y tratamiento por calor a 80 °C. No se hace referencia ni se sugiere para la viabilidad del endofito o viabilidad (semilla o endofito) cuando se combina con plantas herbaceas cultivadas. Segun la experiencia del inventor la viabilidad de la semilla y la viabilidad del endofito son dos cuestiones muy diferentes con semillas que conservan con frecuencia la viabilidad durante mas tiempo que los endofitos.
Rolston y col. describen los efectos del tratamiento con fungicida sobre combinaciones de endofito AR1 y raigras. AR1 es un endofito de una especie de Neotyphodium que tiene un perfil alcaloide diferente a AR584 en que AR1 no produce alcaloides lolina y puede producir terpendoles de manera de diferente a AR584. La publicacion indica que la viabilidad del endofito aR1 no estaba afectada por los tratamientos con fungicida incluyendo fungicidas triazol y estrobilurina. Segun la experiencia del inventor no es obvio que una propiedad indicada para un endofito en un tipo de planta tambien presentara las mismas propiedades con otro endofito o planta. La evidencia anecdotica existe mostrando que la cepa de endofito y la especie vegetal pueden dar como resultado muy diferentes resultados. Una razon para la variacion es que los diferentes endofitos dan diferentes atributos a combinaciones de planta herbacea endofito. Una razon para la variacion es que diferentes endofitos tienen diferentes niveles y tipos de perfil de alcaloide. Como resultado diferentes endofitos en combinacion con diferentes plantas herbaceas tienen propiedades variables. Ademas, diferentes especies de planta herbacea tambien influyen en las propiedades de las combinaciones con endofitos.
Saiga y col. describen los efectos de endofitos de Neotyphodium sobre las caracterlsticas de la planta incluyendo tratamientos de empapar con fungicida. El fungicida, benomil (grupo benzimidazol) se describe como eficaz en matar el endofito en tanto raigras perenne como festuca alta. El fungicida triforina (grupo amida) era eficaz en festuca alta y eficaz en algunas plantas de raigras perenne. Triofanato-metilo (fungicida precursor del benzilmidazol) tenia poco efecto sobre el endofito en raigras perenne y no tenia efecto sobre el endofito en festuca alta. El objetivo del metodo de la publicacion es eliminar los endofitos juntos de la planta herbacea. Como resultado, se usan dosis particularmente fuertes de fungicidas y la planta herbacea se empapa en fungicida. No se realiza descripcion para la identificacion de endofitos con resistencia mayor a fungicidas, o descripcion con respecto a la estabilidad.
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Hill y col. describe cultivares de festuca alta que contienen endofitos que incluyen Neotyphodium coenophialum. El resumen discute como mantener el endofito viable en las plantulas al aplicar fungicidas cloroneb (fungicida aromatico) y terrazole (grupo tiazol) durante los 7 a 21 primeros dlas despues de la germinacion. Hill y col. no identifica endofitos con resistencia a fungicidas ni identifica AR584 como que presenta cualquier resistencia particular. Ademas, el periodo de tiempo del analisis descrito es unicamente despues de la germinacion y unicamente en plantulas.
Park y col. describe el desarrollo de un fungicida microbiano que utiliza bacterias endoflticas para el control de antracnosis de pepino y pimienta roja causada por Colletotrichum orbiculare y C. coccodes y C. acutatum. Entre 18 cepas aisladas, una cepa bacteriana EB215 aislada de ralces de pepino manifesto la actividad antifungica mas potente frente a especies de Colletotrichum. No se hace mencion con respecto a la resistencia fungicida mejorada debido al endofito, ni se usa en terminos de plantas herbaceas tales como festuca alta.
Bluett y col. describe una prueba que compara diversas propiedades entre raigras (Lolium perenne) infectado con endofito tipo silvestre, endofito AR1 o no endofito. Se encontro que el raigras infectado con AR1 produce rendimientos de pasto similares que el raigras infectado con endofito silvestre, mientras que ofrece pequenos mejoramientos en la produccion de leche sin incidencia de modorra indicada en los animales que pastan. No se hace ninguna discusion sobre el efecto del endofito con respecto al tratamiento con fungicida, la estabilidad del endofito ni al endofito AR584 ni cultivares de planta herbacea festuca alta.
Timer, P.; Gates, R.N.; Bouton J.H - “Response of Pratylenchus spp. In tall fescue infected with different strains of the fungal endophyte Neotyphodium coenophialum” Nematology, Vol. 7 No 1, Paginas 105-110 (2005) describen que una cepa de endofito no productora de cornezuelo de Neotyphodium AR584 mantiene alguna resistencia a plagas de nematodo. Timper y col. no dicen nada de ninguna relacion entre la viabilidad del endofito y la resistencia fungicida de planta/endofito.
El documento US200515002 esta en la entrada de la fase nacional US del documento WO2002013616. Este documento describe planta herbacea que tiene mejorada tolerancia al estres y menor toxicidad animal cuando esta infectada con ciertos aislados de hongos de Neotyphodium.
El documento WO2004106487 describe un endofito o cultivo de endofito de Neotyphodium lolii que en combinacion con raigras no causa slntomas tlpicos de toxicosis de raigras en animales que pastan y que produce compuestos de epoxido jantitrem.
Un experto en la tecnica deberla apreciar que una combinacion de endofito planta que ha incrementado la resistencia fungicida serla de beneficio para mejorar las practicas de gestion del cultivo de semilla de pasto y forraje existentes. Ademas, la estabilidad incrementada durante el transporte tambien serla una ventaja.
Es un objetivo de la presente invencion abordar los precedentes problemas o al menos proporcionar al publico una opcion util.
Es conocido que el termino “comprender” puede, bajo jurisdicciones variantes, ser atribuido con o bien un significado exclusivo o uno inclusivo. Para el fin de esta memoria, y si no se indica lo contrario, el termino “comprender” tendra un significado inclusivo - es decir, que se tomara que significa una inclusion de no solamente los componentes enumerados directamente citados, sino tambien otros componentes o elementos no especificados. Este fundamento tambien se usara cuando los terminos “comprendido” o “que comprende” se usen en relacion con una o mas etapas en un metodo o proceso.
Aspectos y ventajas adicionales de la presente invencion llegaran a ser aparentes a partir de la consiguiente descripcion que unicamente se da a modo de ejemplo.
Descripcion de la Invencion
Para los fines de esta memoria, el termino “endofito” o variaciones gramaticales del mismo se refiere a hongos de Neotyphodium spp. que viven dentro de plantas herbaceas cultivadas o medio de cultivo axenico.
El termino “plantas herbaceas cultivadas” o variaciones gramaticales del mismo, se refieren a variedades de plantas herbaceas que se han creado o seleccionado intencionadamente y se han mantenido mediante cultivo.
El termino “cultivar de planta herbacea sintetica” se refiere al cultivar de planta herbacea que se produce a traves de tecnicas de reproduccion selectiva que incluyen la seleccion y el desarrollo a partir de una poblacion no cultivada. Por ejemplo, un cultivar de planta herbacea sintetico se refiere a donde:
• las unidades reproducibles son de un cultivo polinizado de forma cruzada. Esto podrla incluir, por ejemplo, clones o plantas herbaceas endogamicas;
• los materiales usados se seleccionan entre su comportamiento en ensayos de aptitud combinatoria o progenie;
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• el cultivar esta constituido por intercruzamiento de las unidades;
• las unidades se mantienen de manera que se puede reconstituir el sintetico.
El termino “combination”, o sus variaciones gramaticales, se refieren a la combination de un endofito y de variedades de plantas herbaceas mejoradas desde un punto de vista cultural, cada uno de los cuales se ha aislado de la naturaleza, pero cuya combinacion no existe en la naturaleza.
El termino “planta o parte de la misma” se refiere a toda la planta o a partes seleccionadas de la planta durante el ciclo vital de la planta, tal como las semillas, los brotes, las ralces, las flores, los tallos de la planta y similares.
El termino “conservar” o variaciones gramaticales del mismo en relation a endofitos, se refiere a la capacidad del endofito de mantener un nivel de viabilidad en combinacion con una planta hospedadora, o parte de la misma, a un nivel aceptable para una circunstancia dada o conjunto de circunstancias durante un periodo dado de tiempo y bajo un conjunto dado de condiciones. Los expertos en la tecnica deberlan apreciar que los porcentajes aceptables para la viabilidad pueden variar dependiendo de la generation o clase de semilla a la que se refiere, as! como al variar los estandares industriales.
El termino “viable” o variaciones gramaticales del mismo, se refiere al endofito que es capaz de vivir, desarrollarse o multiplicarse en condiciones favorables en relacion simbiotica con una planta hospedadora o en cultivo axenico.
El termino “tratamiento con fungicida” se refiere a la combinacion que se rocla, se pulveriza, se infunde, o se administra por otros medios, con una composition que contiene fungicida.
El termino “fungicida” se refiere a sustancias que destruyen o inhiben el crecimiento de los hongos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invention se ha proporcionado un metodo de conservation de la viabilidad de endofito en una planta o una parte de la misma despues del tratamiento con fungicida, producida por una combinacion una combinacion de un cultivar de planta herbacea y endofito, en la que el endofito es endofito AR584 (deposito AGAL N° NM98/04676 con fecha del 12 de mayo de 1998).
Los autores de la invencion han encontrado inesperadamente que el endofito AR584 presenta una capacidad mejorada para resistir los tratamientos con fungicida. Se preve que este atributo tendra beneficio comercial significativo en la agricultura. A modo de ejemplo, la gestion de pasto de granja estandar o cultivo de semilla requiere de rociado de tratamientos con fungicida al pasto o cultivo de semilla para evitar las enfermedades fungicas trasmitidas por suelo y foliares. Un problema con las combinaciones existentes de plantas herbaceas y endofito de planta herbacea es que, los fungicidas comunmente usados en la gestion del pasto y cultivo de semilla y el control de patogenos fungicos indeseados tambien tienden a reducir significativamente la viabilidad del endofito. Como resultado, las propiedades favorables indicadas para las combinaciones de endofito y planta herbacea se pueden reducir o anular todas juntas. Sin embargo, los autores de la invencion han indicado que AR584 tiene una resistencia a los fungicidas comerciales estandar hasta cierto punto que significa que un granjero puede rociar para evitar las enfermedades foliares y los patogenos fungicos trasmitidos por el suelo indeseados y aun conservar la viabilidad adecuada del endofito.
Preferiblemente, despues del tratamiento con fungicida se conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito.
Preferiblemente, los fungicidas usados en el tratamiento tienen caracterlsticas sistemicas.
Preferiblemente, los fungicidas usados en el tratamiento tienen caracterlsticas de control de enfermedad foliar.
Preferiblemente, el fungicida usado en el tratamiento tiene actividad frente a patogenos fungicos trasmitidos por el suelo.
Preferiblemente, los fungicidas usados en el tratamiento se seleccionan entre el grupo de triazoles, grupo de estrobilurinas o combinaciones de estos dos grupos de fungicidas.
Preferiblemente, despues de someterse a tratamiento con fungicida basado en triazol, se conserva al menos el 60 % o mas de la viabilidad del endofito.
Preferiblemente, la combinacion conserva al menos el 65 % o mas de la viabilidad del endofito, mas preferiblemente, mas del 80 % de viabilidad, cuando se somete a una combinacion 50:50 p/p de fungicida basado en triazol y fungicida basado en estrobilurina.
Preferiblemente, el tratamiento con fungicida se aplica a la combinacion de cultivar de planta herbacea y endofito a las tasas estandares que se usan en el control de enfermedades foliares.
Preferiblemente, el tratamiento con fungicida basado en triazol se aplica como un rociado a una tasa de 1.000 ml/ha. Se supone que esto equivale a 250 g de epoxiconazol/ha.
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Preferiblemente, el tratamiento con fungicida basado en estrobilurina se aplica como un rociado a una tasa de 1.000 ml/ha. Se supone que esto equivale a 250 g de azoxistrobina/ha.
Preferiblemente, el tratamiento con fungicida se aplica en la floracion temprana de la combinacion del cultivar de planta herbacea y endofito.
Preferiblemente, el tratamiento con fungicida se aplica a la combinacion en la floracion temprana y se vuelve a aplicar de nuevo en la floracion tardla de la combinacion.
En realizaciones preferidas, el fungicida se aplica como un rociado aunque esto no deberla ser visto como limitante ya que el fungicida se puede aplicar por otros metodos tales como inmersion, pulverizado, espolvoreado, geles o combinaciones de los mismos. Se preve que esto se podrla aplicar a la planta o a parte de la misma.
De acuerdo con un aspecto de la presente invencion se ha proporcionado un metodo de conservacion de la viabilidad del endofito en una plata o una parte de la misma despues del tratamiento con fungicida, producida por una combinacion de una combinacion de cultivar de planta herbacea y endofito, en la que el endofito es endofito AR584 (deposito AGAL N° NM98/04676 con fecha del 12 de mayo de 1998) en el que la combinacion conserva el endofito AR584 viable en la misma despues de que la combinacion se someta a temperaturas de entre 15 °C y 55 °C durante un periodo de tiempo de al menos 3 dlas.
Preferiblemente la combinacion conserva al menos 60 % o mas de la viabilidad del endofito cuando la combinacion se somete a una temperatura de hasta 40 °C y una humedad relativa de hasta el 100 % durante al menos un periodo de tiempo de 3 dlas.
Preferiblemente, la planta o una parte de la misma producida por la combinacion de la combinacion de endofito y cultivar de planta herbacea como se describio anteriormente se caracteriza mas conservando la viabilidad del endofito cuando la combinacion de planta herbacea y endofito se somete a temperaturas por encima de 20 °C.
Preferiblemente, el endofito AR584 en la combinacion conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito.
Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion de endofito y planta o parte de la misma se somete a temperaturas de 35 °C a 45 °C.
Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion de endofito y planta o parte de la misma se somete a temperaturas de 40 °C.
Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion de endofito y planta o parte de la misma se somete a un incremento de temperatura como se describe sobre una base continua. Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la temperatura se incrementa durante periodos de tiempo de al menos 3 dlas.
Preferiblemente, la planta o una parte de la misma producida por la combinacion de endofito y cultivar de planta herbacea se caracteriza mas conservando la viabilidad del endofito cuando la combinacion de planta herbacea y endofito se somete a una humedad relativa del 70 % o superior.
Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion se somete a una humedad relativa del 70 % o mas durante al menos 3 dlas.
Preferiblemente, la planta o una parte de la misma producida por la combinacion de endofito y cultivar de planta herbacea es capaz de mantener la viabilidad cuando se somete a humedad relativa de hasta el 100 %. Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion de endofito y planta o parte de la misma se somete a un incremento de humedad como se describe sobre una base continua. Preferiblemente, la viabilidad del endofito se conserva cuando la humedad se incrementa durante periodos de tiempo de al menos 3 dlas.
Preferiblemente, se conserva al menos el 75 % o mas de la viabilidad del endofito.
Preferiblemente, la combinacion:
(a) conserva al menos el 60 % o mas de la viabilidad del endofito cuando la combinacion se somete a una temperatura de hasta 40 °C y una humedad relativa de hasta el 100 % durante al menos un periodo de tiempo de 3 dlas; y
(b) conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito despues del tratamiento con fungicida.
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Los autores de la invencion tambien han encontrado inesperadamente que el endofito AR584 tiene una tolerancia sorprendentemente alta a temperaturas y humedades elevadas permitiendole mantenerse viable dentro de una planta o parte de la misma durante periodos prolongados de tiempo en tales condiciones. Este atributo es de beneficio comercial cuando las plantas o partes de las mismas se transportan ya que se requieren pocos tratamientos especiales tales como refrigeracion, por lo tanto, reduciendo tambien el coste del transporte.
Preferiblemente, la planta o parte de la misma es la planta entera o partes seleccionadas de la planta. Se preve que esto puede incluir semilla(s), brote(s), hojas, tallo(s), flore(s), ralz(ralces) de la planta y combinaciones de los mismos.
Preferiblemente, la planta o parte de la misma es una semilla o semillas.
Preferiblemente, el cultivar de planta herbacea se selecciona entre una o mas variedades vegetales de festuca alta.
Preferiblemente, esto se puede seleccionar entre el grupo que incluye: Grasslands Flecha, Grasslands Advance, Kentucky 31, Georgia 5, Jesup. Jackal, Quantum y combinaciones de las mismas.
Preferiblemente, la combinacion se produce por inoculacion del cultivar de planta herbacea con un cultivo axenico del endofito.
Preferiblemente, la combinacion se produce por cruzamiento de la combinacion endofito/cultivar de planta herbacea con un cultivar de planta herbacea libre de endofito para formar un cultivar de planta herbacea infectado con endofito. Preferiblemente, el cultivar de planta herbacea es un cultivar de planta herbacea sintetico.
Se deberla apreciar a partir de la anterior descripcion que se han proporcionado nuevos metodos para el endofito de cepa AR584. En particular, la planta o parte de la misma producida por la combinacion de endofito AR584 y un cultivar de planta herbacea tiene ventajas nuevas e inesperadas significativas que incluyen un nivel aumentado de resistencia a fungicidas comunmente usados para prevenir las enfermedades foliares en planta herbacea. Este atributo significa que un agricultor puede aplicar fungicidas estandares sin necesidad de manejo especial.
La planta o parte de la misma tambien tiene una estabilidad significativamente mejorada en comparacion con otras combinaciones de endofito/cultivar de planta herbacea existentes con respecto a la conservacion de la viabilidad del endofito cuando la planta o parte de la misma se somete a extremos de temperatura y humedad. Un beneficio importante de este atributo esta en el transporte, por ejemplo, de semillas, donde la viabilidad se puede reducir usando combinaciones de endofito/planta herbacea existentes debido a las malas practicas de manejo o extremos en la temperatura y humedad experimentados en ciertos climas y palses. Uno de tal ejemplo puede ser cuando las cantidades de semilla se transportan en las bodegas de barcos a traves de zonas climaticas variantes en ambientes de almacenamiento no controlados.
Breve descripcion de los dibujos
Los aspectos adicionales de la presente invencion llegaran a ser aparentes a partir de la siguiente descripcion que se da unicamente a modo de ejemplo y en referencia a los dibujos adjuntos en los que:
la Figura 1 es una grafica que compara los niveles de viabilidad de endofito de AR584, AR542 y AR505 en
combinacion con dos cultivares de planta herbacea diferentes con cinco tratamientos con fungicida diferentes;
la Figura 2 es una grafica que compara los niveles de viabilidad de endofito de AR584, AR542 y AR505 en
combinacion con dos cultivares de planta herbacea diferentes con o bien 0 dlas o 3 dlas de envejecimiento acelerado (EA); y
la Figura 3 es una grafica que compara los niveles de endofito viable para AR542 y AR584 en dos
cultivares de planta herbacea diferentes tratados con tres tratamientos con fungicidas diferentes.
Mejores maneras para llevar a cabo la invencion
Ahora se describen los metodos de la invencion en referencia a pruebas llevadas a cabo por los autores de la invencion.
Prueba 1
Introduccion
La prueba se emprendio para determinar la tolerancia de tres endofitos (AR502, AR542 and AR584) a fungicidas comunmente usados en la produccion de semilla de planta herbacea para el control de enfermedades foliares.
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Los fungicidas evaluados pertenecen a dos grupos qulmicos diferentes. El primer grupo se refiere a fungicidas triazol que incluyen:
• Opus® con ingrediente activo epoxiconazol y
• Folicur® con ingrediente activo tebuconazol.
El segundo grupo se refiere a los fungicidas de estrobilurina que incluyen Amistar® con agente activo azoxistrobina.
Segun la experiencia del inventor los grupos qulmicos anteriores representan mas del 90 % de los fungicidas usados en la produccion y gestion de planta herbacea de festuca alta.
El proceso de envejecimiento acelerado (EA) es un tratamiento de alta temperatura (40 °C) y alta humedad relativa (HR) (HR al 100 %) de semilla para estimular los efectos de almacenamiento a largo plazo. En base a las pruebas anteriores, el envejecimiento acelerado es un indicador util y exacto de la estabilidad del almacenamiento natural a largo plazo.
Metodos
Prueba de campo
Plantas de dos cultivares de festuca alta “Jesup” y “Georgia 5” se inocularon con endofito y se trasplantaron a parcelas de ensayo. Cada parcela consistla en 4 plantas de cada cultivar, en hileras de 1,0 de separacion. Los tratamientos se reprodujeron exactamente tres veces en un diseno en bloque aleatorizado.
Fungicidas
Se evaluaron cinco tratamientos fungicidas como sigue:
1. Control
• nada de fungicida;
2. Opus®
• 250 g de ingrediente activo Epoxiconazol por litro, grupo triazol rociado a la tasa de etiqueta de 1.000 ml/ha;
3. Amistar®
• 250 g de ingrediente activo Azoxistrobina por hectarea, grupo de estrobilurina
4. Opus® y Amistar®
• Opus® a 500 ml/ha (mitad la tasa de etiqueta) y Amistar® a 500 ml/ha y se aplica como una mezcla de tanque;
5. Folicur®
1. 430 g de ingrediente activo Tebuconazol por litro; grupo de triazol a la tasa de etiqueta de 440 ml/ha.
Las dosis usadas eran aproximadamente las tasas de etiqueta recomendadas para el uso de los productos anteriores. Se deberla indicar que los productores habitualmente usan menos tasa de etiqueta, particularmente si la intencion es aplicar el fungicida mas de una vez. Como resultado, las tasas de dosificacion usadas en esta prueba presentan un reto significativo para la viabilidad del endofito.
Los fungicidas se aplicaron dos veces durante la prueba para reproducir exactamente la practica de pasto normal. Las aplicaciones se realizaron en la puntuacion de crecimiento de Zadocks (GS) 69 (floracion temprana/antesis) y en la puntuacion de crecimiento de Zadocks (GS) 71 (maduro por agua de cariopside). Este ritmo de aplicacion era de acuerdo con lo recomendado a los productores y coincide con el periodo de mayor presion de enfermedad en los cultivos.
Envejecimiento acelerado
Las semillas se suspendieron sobre una malla fina por encima del agua metida en recipientes sellados de plastico y colocados en una incubadora fijada para mantener una temperatura de aproximadamente 40 °C y con la camara de semilla controlada a una humedad relativa del 100 %.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Valoracion del endofito por el ensayo de crecimiento (grow-out)
Se cultivaron seis replicas (cada una de 48 plantulas) que consistlan en duplicados de cada tratamiento, en bandejas de turba y se dejaron crecer en un invernadero durante al menos 6 semanas antes de la transferencia.
Deteccion del endofito
Se sometieron a transferencia brotes cortados de las plantulas despues de 6 semanas de crecimiento sobre papel de nitrocelulosa y se desarrollo usando una reaccion anticuerpo/antlgeno.
El proceso de desarrollo se completa por inmersion de las laminas de membrana de nitrocelulosa en solucion de bloqueo durante al menos dos horas a temperatura ambiente. La solucion de bloqueo esta compuesta de 2,42 g de Tris (hidroximetil) metilamina, 2,92 g de NaCl, 5 g de polvo de leche sin grasa y 10 ml de HCl (1 M) en 1 l de agua que se ha pasado a traves de un sistema de osmosis inversa (OI). El pH de la solucion es de 7,5. Durante la inmersion, se bloquea cualquier sitio no unido antes de la aplicacion del anticuerpo primario.
Despues de la eliminacion de la solucion de bloqueo, se anade 25 ml de solucion de bloqueo fresca por lamina junto con 25 pl de anticuerpo primario por lamina. Las laminas se sumergen durante la noche a 4 °C y se agitan para mantener la solucion en movimiento sobre las laminas. Al dla siguiente, la solucion de bloqueo y el anticuerpo primario se eliminan y las laminas se enjuagan varias veces con solucion de bloqueo fresca. Mas tarde, las laminas se sumergen y se agitan durante dos horas a temperatura ambiente en 25 ml de solucion de bloqueo fresca con 12,5 pl de anticuerpo secundario anadido. Se conjuga una enzima a este anticuerpo secundario. Posteriormente, la solucion de bloqueo y el anticuerpo secundario se decantan fuera y las laminas se enjuagan con solucion de bloqueo fresca.
Para desarrollar el color que permite la identificacion del endofito, las membranas de nitrocelulosa se sumergen en cromogeno. Este producto se prepara disolviendo 75 mg de Rojo Rapido en 12,5 ml de tampon Tris (para un litro de agua de OI, el tampon Tris esta compuesto de 24,2 g de Tris (hidroximetil) metilamina (pH: 8,2)) por lamina y disolviendo por separado 12,5 mg de naftol fosfato as-mx en 12,5 ml de tampon Tris por lamina y estas soluciones se combinan. Las laminas se incuban sobre el agitador durante 15 minutos. Al final de los 15 minutos, el cromogeno se elimina y las laminas se enjuagan en agua que se ha pasado a traves de un sistema de osmosis inversa. Entonces, estas laminas estan listas para ser leldas.
Analisis estadfstico
El analisis de los datos se emprende usando un paquete estadlstico - GenStat Version 7.
Resultados
Efecto del endofito
El nivel de endofito viable promedio del endofito AR584 era significativamente mayor (P<0,001) que AR542 y AR502 durante tanto el tratamiento con fungicida como los experimentos de envejecimiento acelerado. El promedio para AR584 era de 81 % de endofito viable despues de todos los tratamientos, mientras que el promedio para AR542 y AR502 era de 60 y 56 % respectivamente (Tabla 1).
Tambien se indico que los tres endofitos se comportan de manera diferente entre las principales variables del tratamiento: endofito x cultivar; endofito x envejecimiento acelerado (EA) y endofito x fungicida (Tabla 1).
Tabla 1. Comparacion de endofito viable de tres cepas de endofito (AR584; AR542 y AR502). Se hace el promedio de cada valor de dos cultivares, dos tratamientos de envejecimiento acelerado, cinco fungicidas y seis repeticiones).
Endofito_________________________________________E+ %

AR584 81

AR542 60

AR502 56

LSD 5% 5,1
Probabilidad F_________________________________________
Endofito <0,001

Endofito x cultivar 0,005
Endofito x envejecimiento acelerado <0,001
Endofito x fungicida_______________________________<0,001
Efecto del fungicida
Los dos fungicidas redujeron significativamente el nivel de endofito viable (medias de todos los otros tratamientos) dese el 92 % en el tratamiento sin nada de fungicida al 61 % para la mezcla de Opus® y Amistar®; y 38 % para el
tratamiento con solamente Opus® (Tabla 2).
Los datos apuntan a que epoxiconazol es el componente mas significativamente reductor de los niveles de endofito viable.
Tabla 2. Efecto de fungicidas sobre endofitos viables (promedio de las medias de datos de dos endofitos, dos ______________________cultivares y seis repeticiones).______________________
Fungicida
E+ %
nada
81
Amistar®
76
Folicur®
70
Opus® + Amistar®
61
Opus®
45
LSD 5%
6,6
Probabilidad F
Fungicida
<0,001
Fungicida x endofito
<0,001
Interaction endofito y fungicida
10
La interaccion endofito y fungicida, como se muestra en la Tabla 1, se analiza mas en la Tabla 3 indicada mas adelante.
Segun los descubrimientos inesperados de los autores de la invencion, la interaccion parece que se surge porque 15 AR584 es significativamente el mas tolerante de los dos fungicidas en comparacion con el control y con otras
combinaciones de endofito ensayadas.
Con el tratamiento con la mezcla Opus® y Amistar®, AR584 tenia al menos un 50 % de mayor viabilidad de endofito en comparacion con otros endofitos (73 % de endofito viable en comparacion con el 49 % en AR542). Para los 20 tratamientos solamente con Opus®, AR584 tenia mas de tres veces el nivel de endofito viable en comparacion con AR542. La interaccion se muestra a mas detalles en la Figura 1.
Tabla 3. Endofito viable AR584 y AR542 para los tratamientos con fungicida (medias de dos tratamientos de _________________envejecimiento acelerado de cultivares y seis repeticiones)._________________
Endofito
AR584 AR542 AR502
Fungicida
Viabilidad del endofito [%1
nada
93 91 58
Amistar
93 73 63
Folicur
89 70 51
Opus + Amistar
73 49 46
Opus
60 17 61
LSD 5%
11,3
25
Efecto del cultivar
Habia un pequeno efecto del cultivar, con el cultivar Georgia 5 que tenia mayores niveles de endofito que el cultivar Jesup despues de los tratamientos con fungicida (Tabla 4). La interaccion de cultivar y endofito era estadisticamente 30 significativa.
Tabla 4. Endofito viable para dos cultivares (promedio de medias para tres endofitos, cinco fungicidas y seis _____________________________repeticiones)._____________________________
Cultivar Georgia 5 Jesup LSD 5%
Viabilidad de endofito [%1 68 63 5
Probabilidad F
Cultivar 0,02
Cultivar x endofito____________________________________0,005
35 Envejecimiento acelerado
Se ensayaron tres dias de envejecimiento acelerado para determinar los niveles de viabilidad de endofito para AR584, AR542 y AR502 (Tabla 5).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Los resultados encontrados muestran que AR502 parece ser muy sensible al tratamiento de envejecimiento acelerado (Tabla 5 y Figura 2) y AR584 tiene una resistencia significativamente mejorada a la temperatura y humedad elevada.
Tabla 5. Efecto de 0 o 3 dlas de envejecimiento acelerado (EA) sobre endofito viable (medias de dos cultivares,
__________________cinco fungicidas y 6 repeticiones).__________________
Dias envejecimiento acelerado
Endofito
0 EA 3 EA
AR584
89 74
AR542
61 60
AR502 LSD 5%
79 10 33
Tambien se ensayaron periodos de tiempo de mas de 3 dlas y dieron resultados proporcionalmente similares como los anteriores, sin embargo, con tasas reducidas de viabilidad de endofito.
Conclusion
Los datos fuertemente soportan el argumento de que AR584 tiene propiedades unicas en comparacion con otros endofitos en la conservacion de caracterlsticas de viabilidad de semilla cuando las plantas se tratan con fungicidas durante el desarrollo de la semilla. Se encontro que AR584 es mas resistente a fungicidas de diferentes actividades qulmicas, especialmente al fungicida “Opus®”.
Tambien se encontro que AR584 habla incrementado la resistencia a extremos en calor y humedad cuando se comparaba con otros endofitos.
Prueba 2
Introduccion
Esta prueba se hizo para complementar los resultados mostrados en la prueba uno. Se ensayo la tolerancia de dos endofitos, AR584 y AR542 en dos cultivares de festuca alta, “Jesup” y “Georgia” cuando se trataban con tres tratamientos con fungicida diferentes.
Los tratamientos con fungicida ensayados inclulan:
1. tratamiento sin nada;
2. solamente Opus aplicado a 1,0 l/ha; y
3. una mezcla de Opus® y Amistar® aplicada a 0,5 + 0,5 l/ha.
Tambien se adapto el proceso de envejecimiento acelerado (EA). Tal como se discutio anteriormente en la prueba 1, el EA se emprendio incubando semillas a una temperatura alta de 40 °C y Humedad Relativa (HR) del 100 %.
Metodo
Prueba de campo
Se condujo una prueba de campo sobre dos cultivares de festuca alta, “Jesup” y “Georgia 5” que se inocularon con dos endofitos AR584 y AR542. La prueba de campo se llevo a cabo como se describio anteriormente en la Prueba uno, en la que las plantas se inoculaban con endofito y, a continuacion, se trasplantaban en parcelas de ensayo. Cada parcela consistla en 4 plantas de cada cultivar, en hileras de 1,0 m de separacion. Los tratamientos se reprodujeron exactamente tres veces en un diseno en bloque aleatorizado.
Fungicidas
Tres tratamientos fungicidas que se pusieron a prueba como se resumen a continuacion:
1. tratamiento sin nada;
2. solamente Opus® (O), aplicado a 1,0 l/ha; y
3. una mezcla de Opus® aplicada a 0,5 l/ha y Amistar® (O+A) aplicada a 0,5 l/ha.
De nuevo, las dosis usadas eran aproximadamente las tasas de etiqueta recomendadas para el uso de los productos anteriores. El ritmo de aplicacion del fungicida era de acuerdo con lo recomendado a los productores y coincide con el periodo de mas presion de enfermedad en los cultivos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El envejecimiento acelerado, la valoracion del endofito por el ensayo de crecimiento (grow-out), la deteccion del endofito y el analisis estadlstico tambien se llevaron a cabo como se resumio anteriormente en la Prueba 1.
Resultados
Efecto del Endofito y del fungicida
La Figura 3 y la Tabla 6 muestran la viabilidad de cada endofito cuando se trata con los diversos tratamientos con fungicida. Tal como se muestra, AR584 tenia el 81 % de viabilidad cuando se trato con una mezcla de Opus® y Amistar® (O+A) y 64 % de viabilidad cuando se trato con Opus® (O) solamente en el cultivar Georgia 5. La viabilidad del endofito para el cultivar Jesup era del 70 % y 69 % para los respectivos tratamientos. En comparacion, AR542 tenia 63 % y 24 % de viabilidad en el cultivar de Georgia 5 y 35 % y 11 % de viabilidad en el cultivar de Jesup.
Estos resultados muestran que habia una clara diferencia en la viabilidad de endofito de ambos endofitos despues del tratamiento de los diversos fungicidas.
Tabla 6. El porcentaje de endofito viable para AR542 y AR584 en dos cultivares (Georgia 5 y Jesup) cuando se ________trataron con: no fungicida, fungicida Opus® + Amistar® (O+A) o fungicida Opus® (O) solo.________
Tratamiento con fungicida
Cultivar
Endofito nada O+A Opus
Georgia 5
AR542 91 63 24
Georgia 5
AR584 92 81 64
Jesup
AR542 90 35 11
Jesup
AR584 93 70 69
LSD 5% 11,6
Cuando los promedios de la viabilidad de porcentaje de los diferentes endofitos se compararon a traves de los tratamientos y cultivares, la diferencia entre AR584 y AR542 como se muestra en la Tabla 7, es altamente significativa. Los datos muestran que el endofito AR584 tiene una viabilidad mayor del 76 % en comparacion con AR542, el cual tenia 54 % de viabilidad a traves de los diferentes tratamientos de cultivar y fungicida.
Tabla 7. Endofito para los promedios de los datos de diferente cultivar, fungicida y envejecimiento acelerado. Endofito E+ %
AR584
76
AR542
54
LSD 5%
13
Prob F
<0,001
No habia diferencia en el nivel de endofito viable para tanto los endofitos AR548 como AR542 para el tratamiento sin nada de fungicida. Sin embargo, cuando se aplico el fungicida Opus®, habia una interaccion significativa de P<0,001. Tal como se muestra en la Tabla 8 de a continuacion, cuando plantas inoculadas con endofito AR584 se trataban con Opus®, el nivel de endofito viable (promedio de cero y 3 dias de EA) cayo a 60 %. Por el contrario, AR542 para el mismo tratamiento era del 17 %.
Tabla 8. Viabilidad en porcentaje del endofito para endofito AR584 y AR542 y tratamiento de fungicida Opus®.
nada Opus
AR584
93 60
AR542
91 17
LSD 5%
9,2
Prob F
<0,001
Efecto del cultivar
La Tabla 9 de a continuacion muestra que tambien habia una interaccion significativa (P=0,045) entre el endofito, cultivar y fungicida. Esta interaccion es el resultado del tratamiento con fungicida Opus®, el cual considerablemente hizo caer el nivel de endofito viable. El resultado en porcentaje de esto era menor en el cultivar Georgia en comparacion con el cultivar Jesup.
Sin embargo, esta diferencia entre el endofito AR584 y el endofito AR542 en comparacion con el tipo de cultivar era comparable durante ambos tratamientos.
5
10
15
20
25
30
Tabla 9. Muestra la interaccion entre los diversos Endofitos, Cultivares y Fungicidas.
Fungicida AR584 nada Opus AR542 nada Opus
Cultivar
Georgia5 93 64 91 24
Jesup 93 55 91 11
LSD 5% 18,4
Prob F 0,045
Conclusion
Esta prueba mostro que el endofito AR584 era mas resistente que el endofito AR542 cuando se trataba con diversos tratamientos con fungicida. Tal como se muestra, el endofito AR584 tenia una tolerancia mejorada a los diversos tratamientos con fungicida, cuando se compara con el endofito AR542. Esta relacion era la misma en ambos cultivares de festuca alta ensayados.
Esta resistencia es particularmente evidente cuando la festuca alta combinada con el endofito AR584 se expuso a Opus®, un fungicida control de roya de triazol.
PRUEBA3
Para ensayar si los endofitos se pueden transferir o no a otras especies de planta herbacea ademas de Jesup y Georgia 5, los resultados ahora se incluyen para un endofito diferente, AR1 que muestra que este endofito se puede inocular en cultivares de planta herbacea tipo “Grasslands Advance” y festuca alta Kentucky 31.
Los datos de inoculacion para la inoculacion interespecies de AR1 (Neotyphodium lolii) en festuca alta *(Schedonorus phoenix) y hospedadores de festuca de prado (Festuca pratensis). (*anteriormente Festuca arundinacea)
Festuca alta:
Planta
Hongo Pos Neg Muerte % positiva viva
949
AR1 19 24 20 44
K31
AR1 26 53 37 33
949 = cuatro replicas de 10 a 18 plantas K31 = siete replicas de 10 a 19 plantas
Festuca de prado:
Planta
Hongo Pos Neg Muerte % positiva viva
J103
AR1 2 5 13 29
J110
AR1 3 27 37 10
J103 = una replica de 20 plantas J110 = seis replicas de 4 a 2 plantas
Se deberla apreciar a partir de lo anterior que se ha proporcionado un endofito mejorado que, en combination con un cultivar vegetal, aborda los problemas asociados con la practica actual de gestion de pasto y cuestiones de transporte.
Se han descrito aspectos de la presente invention solo como ejemplo y deberla apreciarse que se pueden realizar a la misma, modificaciones y adiciones sin apartarse de su alcance.

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de conservacion de la viabilidad de endofitos en una planta o en una parte de la misma producida por una combinacion de un cultivar de planta herbacea y una combinacion de endofito, en la que el endofito es el endofito AR584 (deposito AGAL N° NM98/04676 con fecha del 12 de mayo de 1998), que comprende el tratamiento de la combinacion con un fungicida.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1 en el que el endofito AR584 en la combinacion conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito despues del tratamiento con un fungicida.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en el que el fungicida usado en el tratamiento tiene caracterlsticas sistemicas, caracterlsticas de control de enfermedades foliares, o actividad frente a patogenos fungicos trasmitidos por el suelo.
  4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el fungicida usado en el tratamiento se selecciona entre: el grupo de triazoles, el grupo de estrobilurinas o combinaciones de estos dos grupos fungicidas.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que al menos se conserva el 65 % o mas de la viabilidad del endofito cuando la combinacion se trata con una combinacion de 50:50 p/p de fungicida basado en triazol y fungicida basado en estrobilurina.
  6. 6. El metodo segun las reivindicaciones 1 a 5 en el que el fungicida usado en el tratamiento esta basado en triazol y se aplica a la combinacion como un rociado a una tasa de 1.000 ml/ha.
  7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el fungicida usado en el tratamiento esta basado en estrobilurina y se aplica como un rociado a una tasa de 1.000 ml/ha.
  8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el fungicida usado en el tratamiento se aplica a la combinacion en la floracion temprana de la combinacion, o se aplica en la floracion temprana y se vuelve a aplicar de nuevo en la floracion tardla a la combinacion.
  9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que el fungicida se aplica a la combinacion en la forma seleccionada entre: un rociado, una inmersion, un polvo, un gel y combinaciones de los mismos.
  10. 10. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende someter la combinacion a temperaturas de entre 15 °C y 55 °C durante un periodo de tiempo de al menos 3 dlas.
  11. 11. Un metodo segun la reivindicacion 10, en el que la combinacion se produce inoculando el cultivar de planta herbacea con un cultivo axenico del endofito.
  12. 12. El metodo segun la reivindicacion 10 u 11 en el que el endofito AR584 en la combinacion conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito.
  13. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion del endofito y la planta o parte de la misma se somete a temperaturas de 35 °C a 45 °C.
  14. 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el que la viabilidad del endofito se conserva cuando la combinacion se somete a una humedad relativa de 70 % o mas durante al menos 3 dlas.
  15. 15. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la combinacion conserva al menos el 60 % o mas de la viabilidad del endofito cuando la combinacion se somete a una temperatura de hasta 40 °C y una humedad relativa de hasta 100 % durante al menos un periodo de tiempo de 3 dlas.
  16. 16. El metodo segun la reivindicacion 15 en el que se conserva al menos el 75 % o mas de la viabilidad del endofito.
  17. 17. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende someter la combinacion a una temperatura de hasta 40 °C y a una humedad relativa de hasta 100 % durante al menos un periodo de tiempo de 3 dlas, en el que la combinacion conserva al menos el 60 % o mas de la viabilidad del endofito, cuando la combinacion se somete a la temperatura de hasta 40 °C y a la humedad relativa de hasta 100 % durante al menos un periodo de tiempo de 3 dlas, en el que la combinacion conserva al menos un 50 % o mas de la viabilidad del endofito despues del tratamiento con un fungicida.
  18. 18. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en el que la planta o parte de la misma se selecciona entre: semilla(s), brote(s), tallo(s), flore(s) o ralz(ralces) y combinaciones de los mismos.
  19. 19. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en el que el cultivar de planta herbacea es una variedad vegetal de festuca alta.
  20. 20. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que el cultivar de planta herbacea es un 5 cultivar de planta herbacea sintetico.
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