ES2606858T3

ES2606858T3 - Composiciones adecuadas para el tratamiento de la enfermedad, trastorno o condición espinal

Info

Publication number: ES2606858T3
Application number: ES13157678.7T
Authority: ES
Inventors: Edna Bechor; Liliana Bar; Israel Nur
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2017-03-28
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: EP2034010A1; CN101827617B; EP2195038A1; EP2602316B1; US8968724B2; AU2008291817A1; EP2602316A1; CN101827617A; US9326998B2; WO2009027814A1; EP2195038B1; BRPI0816175A2; US20150196596A1; ES2672151T3; JP2010537968A; IL232619A0; IL204109A; US20100310524A1

Abstract

Un kit que comprende: un primer recipiente que comprende concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una fibronectina: concentración relativa de fibrinógeno de 1:10 a aproximadamente 1:5, un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno, y un tercer recipiente que comprende una enzima proteolítica seleccionada de entre el grupo que consiste en peptidasas de serina, peptidasas de cisteína, peptidasas de aspártico, peptidasas de metalo, hialuronidasa y combinaciones de los mismos.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Composiciones adecuadas para el tratamiento de la enfermedad, trastorno o condicion espinal

Descripcion

Campo de la invencion

[0001] La invencion se refiere al uso de un concentrado de plasma crioprecipitado inactivado viral que comprende una concentracion relativa inicial de fibrinogeno y fibronectina adecuada para el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion como la degeneracion de un tejido de la medula, como disco intervertebral.

Antecedentes de la invencion

[0002] Los discos intervertebrales se encuentran entre los cuerpos vertebrales adyacentes de la columna vertebral. Cada disco forma una articulacion cartilaginosa que permite ligeros movimientos de las vertebras, actua como un ligamento que sostiene las vertebras juntas y soporta cargas de compresion que surgen del peso corporal y la tension muscular.

[0003] El cartflago es un tejido firme y elastico conjuntivo compuesto por celulas especializadas llamadas condrocitos que producen una gran cantidad de matriz extracelular (ECM). Proporciona amortiguacion protectora y permite que las articulaciones soporten cargas derivadas del movimiento necesario para realizar actividades diarias. El cuerpo contiene tres tipos diferentes de cartflago: articular, que cubre las superficies de las articulaciones; fibro cartflago, que se encuentra en el menisco de la rodilla y el disco intervertebral; y cartflago elastico, que se encuentra en el ofdo externo. Los diferentes cartflagos se distinguen por su estructura, elasticidad y fuerza.

[0004] Aota et al ("Efectos diferenciales de fragmento de fibronectina en el metabolismo de proteoglicanos por las celulas del disco intervertebral: una comparacion con los condrocitos articulares" Spine 2005; 30: 722-728) informaron sobre los diferentes efectos del fragmento de fibronectina en la proliferacion y el metabolismo de proteoglicanos en diferentes poblaciones de discos intervertebrales y condrocitos articulares. Estos resultados sugieren que los condrocitos de diferentes tejidos del cartflago requieren diferentes condiciones para proliferar y para mantener la funcion del tejido.

[0005] El disco intervertebral se compone de tres estructuras basicas: una sustancia similar al gel interno llamado nucleo pulposo (NP), una banda fibrosa exterior resistente llamada anillo fibroso (AF), y placas terminales cartilaginosas superior e inferior, que marcan transicion entre el disco intervertebral y la vertebra. Estas estructuras difieren en la disposicion de proteoglicano y colageno en el tejido, asf como la concentracion relativa de cada uno.

[0006] Durante el desarrollo embrionario tres capas germinales se pueden diferenciar: el endodermo, mesodermo y ectodermo. Estas tres capas finalmente dan origen a organos internos; tejidos musculoesqueleticos; y tejidos epidermicos y nerviosos, respectivamente. Una cuarta region, conocida como notocorda, grna el desarrollo embrionario del tubo neural; y la columna vertebral, incluyendo los discos intervertebrales. Las celulas mesenquimales comienzan a emigrar y condensarse alrededor de la notocorda para formar los cuerpos vertebrales oseos y el anillo fibroso. Las celulas de notocordioles atrapadas juegan un papel cntico en la iniciacion del desarrollo del nucleo pulposo (Walmsley R. "El desarrollo y crecimiento del disco intervertebral", Edinburgh Med J. 1953; 60: 341-364). Asf, estas dos estructuras basicas del disco intervertebral, el anillo fibroso y el nucleo pulposo, se originan de diferentes ongenes embrionarios, a saber, el mesenquima y el notocordio, respectivamente.

[0007] El anillo fibroso esta compuesto principalmente de fibrillas de colageno de tipo I que forman laminillas concentricas que rodean el nucleo pulposo y se insertan en las placas terminales de los cuerpos vertebrales adyacentes para formar una estructura reforzada.

[0008] El nucleo pulposo consiste en su mayona de pequenas celulas similares a condrocitos y una segunda poblacion de celulas grandes vacuoladas. Estas son las celulas notocordio que se presumen restos del tejido embrionario que guio la formacion de la columna vertebral y los nucleos pulposos (Hunter et al , "La celula notocordio en el nucleo pulposo: una revision en el contexto de la ingeniena de tejidos", Tissue Eng. 2003; 9: 667677). Debido al hecho de que estas celulas de notocordioles parecen desempenar un papel crucial en la formacion de la columna vertebral y el nucleo pulposo, se presume que podnan promover la reparacion del disco danado y la columna vertebral. Las celulas similares a los condrocitos expresan colageno de tipo II, agrecanos de proteoglicanos y cadenas largas de hialuronano, que tienen moleculas con cadenas laterales altamente ramificadas y altamente hidrofilas. Estas regiones cargadas negativamente tienen una fuerte avidez para las moleculas de agua e hidratan el nucleo o centro del disco mediante una presion osmotica de hinchamiento. El efecto hidraulico del nucleo hidratado contenido dentro del anillo actua como un amortiguador para amortiguar la columna vertebral de las fuerzas que se aplican al sistema musculoesqueletico. Las placas terminales vertebrales estan unidas tanto al disco como al cuerpo vertebral adyacente. La estructura qmmica de estas placas consiste en proteoglicano y fibras de colageno.

[0009] Degeneracion humana del disco intervertebral es un problema clmico, y la principal causa del dolor de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

medula y la discapacidad. Mas de 15 millones de personas en todo el mundo sufren de degeneracion de disco, que se caracteriza por tener una composicion de matriz alterada y un numero de celulas reducido.

[0010] La enfermedad degenerativa del disco (DDD) es un proceso no deseado en el que los discos intervertebrales pierden su flexibilidad, elasticidad, y el choque caractensticas de absorcion. En este proceso, la estructura de colageno del anillo fibroso se debilita y se vuelve quebradiza. La presion excesiva sobre un disco debilitado puede causar desgarros en el anillo fibroso, lo que permite al nucleo pulposo herniarse o extruirse a traves de los desgarros. A esta condicion se le llama hernia de disco. El material herniado puede comprimir los nervios alrededor del disco y crear dolor. Una hernia discal puede interferir con la funcion nerviosa, lo que lleva a debilidad, entumecimiento, inflamacion y dolor. Ademas, el contenido de proteoglicano se disminuye, reduciendo asf las capacidades de retencion de agua del nucleo pulposo. Estos cambios reducen la capacidad de los discos para actuar como amortiguadores y los hacen menos flexibles. La perdida de lfquido tambien hace que el disco sea mas pequeno y reduce la distancia entre las vertebras y el disco. Dado que los discos intervertebrales se encuentran en un medio no vascular, el uso de ingeniena de tejidos de un disco para retardar o revertir el proceso degenerativo representa un desaffo biologico importante ya que tienen una capacidad limitada para la reparacion. La actividad celular requiere glucosa, oxfgeno y otros nutrientes necesarios para el soporte del tejido. Sin embargo, el disco es el tejido avascular mas grande del cuerpo. Las celulas dentro del disco son sostenidas por la difusion de nutrientes en el disco a traves de la concavidad central porosa de la placa terminal vertebral (Rudert M y Tillmann B. "Lymph and blood supply of the human intervertebral disc. Cadaver study of correlations to diLMEtis". Acta Orthop Scand. 1993; 64: 37 - 40).

[0011] La degeneracion de los discos intervertebrales o un hematoma puede causar compresion de la medula espinal y lesion de la medula. La lesion de la medula espinal (LME) por lo general comienza con un traumatismo en la columna vertebral que dana los nervios dentro del canal espinal. Las causas frecuentes de dano son los traumatismos (accidentes de coche, disparos, cafdas, etc.) o enfermedades (p. ej. polio, espina bffida, Ataxia de Friedreich, etc.) y la compresion de la columna vertebral por hernia de disco intervertebral. Una lesion en los nervios de la medula espinal produce perdida o deficit en la funcion motora, sensorial y autonomica. La lesion secundaria tras el impacto primario incluye una serie de alteraciones bioqmmicas y celulares que conducen a la necrosis tisular y la muerte celular. Se estima que la incidencia anual de LME es de aproximadamente 40 casos por millon en los EE.UU., y que el costo de la gestion de la atencion de los pacientes de LME se aproxima a $ 4 mil millones cada ano. Hasta la fecha, se han realizado relativamente pocos progresos en el tratamiento de la LME y los trastornos neurologicos relacionados. Actualmente solo hay una terapia aceptada, aunque no aprobada, la metilprednisolona. Si se usa en dosis muy altas no mas tarde de 8 horas despues de la lesion, la metildrednisolona ha demostrado una modesta capacidad para mejorar el resultado neurologico despues de la LME.

[0012] En el sistema nervioso de los vertebrados en desarrollo, el tubo neural es el precursor del sistema nervioso central (SNC), que comprende el cerebro y la medula espinal. La medula espinal contiene fibras de comunicacion llamadas axones que transfieren informacion sensorial y motriz entre el cerebro y la periferia. En la seccion transversal la medula espinal se divide en mitades simetricas por una mediana dorsal y una mediana ventral. La parte dorsal del tubo neural se asocia principalmente con la sensacion, mientras que la parte ventral esta asociada principalmente con el control motor (por ejemplo, el musculo). El termino neurona motora se aplica clasicamente a las neuronas ubicadas en el SNC que proyectan sus axones fuera del SNC y controlan directa o indirectamente los musculos. El termino es sinonimo de neuronas eferentes. Una lesion de la medula espinal tiene implicaciones devastadoras que producen una perdida de sensibilidad o una funcion motora por debajo del nivel de lesion. Despues de una lesion del SNC, las neuronas motoras son incapaces de volver a crecer sus axones y mueren por necrosis o apoptosis. La investigacion publicada muestra que al trasplantar y expresar una segunda notocorda cerca del tubo neural dorsal, 180 grados opuestos a la localizacion normal del notocordio, se puede inducir la formacion de neuronas motoras en el tubo dorsal, que generalmente forma celulas sensoriales. Un SNC lesionado es un ambiente altamente inhibitorio para la regeneracion del axon, limitando severamente la recuperacion funcional despues de la lesion.

[0013] El pegamento de fibrina es tfpicamente un producto de la sangre obtenida ya sea de fuentes comerciales o algunos centros de transfusion sangumea regionales. Los componentes que se usan comunmente en la preparacion de cola de fibrina son fibrinogenos, trombina, factor VIII, factor XIII, fibronectina, vitronectina y factor de von Willebrand (vWF). Las formulaciones de cola de fibrina se usan en cirugfa, tanto como una adicion util a suturas y para proporcionar una integridad de herida optima, para hemostasia, y para prevenir o tratar adherencias. Algunos fabricantes anaden agentes anti-proteolfticos a la formulacion de cola de fibrina (como se describe en el documento WO-A-93/05822) o retiran espedficamente el plasminogeno con el fin de retrasar o detener la fibrinolisis (como se describe en los documentos Us-B-5.792.835 y US-B-7.125.569).

[0014] Normalmente, la preparacion de crioprecipitacion de plasma es el primer paso en la fabricacion de fibrinogeno de adhesivo a base de fibrina. Bar et al ("La union del sellador de fibrina al colageno esta influenciada por el metodo de purificacion y el contenido de fibrinogeno-fibronectina (heteronectina) entrecruzada del componente fibrinogeno".) Informaron que las formulaciones de gel de fibrina preparadas a partir de crioprecipitado difieren en su contenido de fibronectina y heteronectina (complejos de fibrinogeno-fibronectina unidos covalentemente). El informe indico que el contenido de heteronectina en la formulacion influye en la adherencia basada en fibrina al colageno.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por un lado, el procedimiento de purificacion de Schwartz et al. (US-B-4,377,572) da como resultado la eliminacion de la mayona de las moleculas de fibrinogeno-fibronectina reticuladas, resultando posteriormente en una baja relacion de fibronectina: fibrinogeno de 1:14,7 en la formulacion y colageno bajo y propiedades de union a la gelatina de la fibrina formada. Por otra parte, la preparacion de crioprecipitado descrita por Martinowitz y Bal (EP-B-691,858) conserva estas moleculas de fibrinogeno-fibronectina reticuladas y, por consiguiente, tiene una relacion aumentada de fibronectina: fibrinogeno de 1:7 que se correlaciona con una mayor adherencia de la fibrina producida a colageno en comparacion con la adherencia al colageno de la fibrina formada con la preparacion obtenida mediante la purificacion de Schwartz.

[0015] Las siguientes publicaciones describen el uso de diferentes preparaciones de cola de fibrina en la enfermedad de la columna vertebral. Se han descrito matrices tridimensionales de fibrina como sustratos celulares in vitro y como materiales puente para la reparacion del sistema nervioso central. Ju et al. ("Enhanced neurite growth from mammalian neurons in tridimensional salmon fibrin gels., 2007: 28: 2097-2108) informo que los geles de fibrina de salmon fueron andamio superior para el re-crecimiento neuronal despues de lesion SNC en comparacion a fibrina preparada a partir de protemas de la sangre humana o bovina. Cheng et al ("Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function", Science, 1996, 273: 510-513) describe la reparacion de las aberturas de la medula espinal en ratas adultas utilizando injertos de nervios perifericos. La zona injertada se estabilizo con pegamento de fibrina que contema factor de crecimiento fibroblastico acido.

[0016] La solicitud de patente de Estados Unidos US-A-2004/0121011 describe un metodo para promover la reparacion, regeneracion y re-crecimiento de las celulas neuronales lesionadas. La aplicacion indico que el sitio de lesion del nervio puede estar en el central o en el sistema nervioso periferico. La formulacion combina un antagonista Rho y un componente portador fluido capaz de formar una matriz aceptable in vivo tal como adhesivos tisulares. El documento US-A-2004/0121011 describe diferentes aditivos de tejidos basados en protemas que incluyen geles de colageno, adhesivos de tejido de fibrina, matrigel, redes de laminina y adhesivos basados en una composicion de protemas de membrana basal que contienen colageno. Se describen diversas preparaciones comerciales tales como Tissucol®/TISSEEL®, Beriplast® P y Hemaseel®.

[0017] Las siguientes publicaciones describen el uso de composiciones de cola de fibrina en disco intervertebral.

[0018] El documento US-A-2005/0148512 se refiere a la inyeccion de un agente fibrosante o una composicion que comprende un agente fibrosante en los discos intervertebrales danados para mejorar la cicatrizacion y apoyar el anillo anular del disco. Las formulaciones que contienen fibrinogeno, tales como TISSEAL®, se mencionan entre numerosas composiciones que pueden suministrarse en el disco intervertebral.

[0019] US-B-6.428.576 describe un metodo para la reparacion de defectos en el anillo fibroso utilizando un sellador de curado in situ. La patente describe una formulacion que cura a un material viscoelastico que simula la estructura, propiedades ffsicas y funciones biomecanicas del anillo fibroso. El polfmero curado puede ser sintetico o natural. La patente describe que los polfmeros sinteticos son mas fiables. La patente describe varias protemas naturales que ocurren, tales como albumina, colageno, fibrinogeno, fibrina y elastina. Estas protemas pueden ser de cualquier fuente tal como la protema fraccionada de sangre o protemas recombinantes, incluyendo las procesadas, desnaturalizadas o modificadas de otro modo.

[0020] WO-A-07/089942 da a conocer un metodo de tratamiento de un disco, que comprende la inyeccion de un sellador de fibrina en un disco para sellar al menos un defecto de un anillo fibroso, mientras que se controla la presion del sellante de fibrina que se inyecta. El sellador de fibrina comprende fibrinogeno y un compuesto activador tal como trombina. De acuerdo con la descripcion, el defecto puede ser un desgarro o una fisura en el anillo fibroso o una capsula fibrosa de una articulacion espinal. La descripcion describe el uso de cualquier fibrinogeno que formara fibrina en un cuerpo humano. La fibronectina se menciona como uno de los numerosos aditivos posibles a la composicion de fibrinogeno.

[0021] WO-A-06/050268 da a conocer una inyeccion de sellante de fibrina en un desgarro o una fisura en el anillo fibroso. El sellador comprende fibrinogeno y compuesto activador tal como trombina. De acuerdo con la solicitud, el componente de fibrinogeno puede ser autologo, humano incluyendo el fibrinogeno humano combinado, recombinante y bovino u otra fuente no humana. La fibronectina se menciona entre muchos componentes como un aditivo adicional que puede emplearse en el sellante de fibrina.

[0022] Tambien el documento WO-A-06/050267 da a conocer la inyeccion de sellador de fibrina y el anestesico en el area de la columna para sellar defectos en el anillo fibroso, tales como desgarros o fisuras. De acuerdo con la descripcion, el componente de fibrinogeno incluye cualquier fibrinogeno que formara fibrina en el cuerpo humano. La solicitud menciona kits comerciales de fabricantes como Baxter tales como TISSEEL®. La descripcion de WO-A- 06/050267 describe que se pueden usar cantidades alternativas de fibrinogeno para cambiar la densidad de los componentes combinados.

[0023] WO-A-07/089948 se refiere a un metodo de tratamiento de un disco que tiene una fuga de nucleo pulposo en y/o a fondo al menos un defecto en el anillo fibroso. El metodo comprende inyectar un sellador biologico, tal como

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

solucion de fibrinogeno y solucion de activacion a la zona espinal utilizando un cateter de multiples lumenes. La descripcion tambien se refiere a un kit que comprende un sellador biologico y un aparato de sellado biologico para inyectar sellador de fibrina en un disco humano.

[0024] US-B-6.468.527 describe un sellador de fibrina de dos componentes que incluye un agente biologico o no biologico. La composicion proporciona un medio para suministrar un agente particular a un sitio crftico espedfico dentro del cuerpo y proporcionar un valor terapeutico prolongado, de liberacion temporal. Se describen espedficamente inyecciones de cola de fibrina infundida con corticosteroides en el espacio epidural lumbar y en el espacio intra-discal. El sellante de fibrina actua para mantener una respuesta antiinflamatoria prolongada del corticosteroide y sellar las fisuras anulares, que de otro modo permiten que los productos qrnmicos daninos escapen del espacio discal y banen la rafz nerviosa dando como resultado radiculitis qrnmica. Ademas, el documento US-B- 7.235.255 describe un sistema para suministrar un adhesivo de tejido biologico que comprende un componente de fibrinogeno, un componente de trombina y una solucion que contiene corticosteroides. De acuerdo con la descripcion, el sellador de fibrina puede usarse para tratar el disco degenerativo y la enfermedad del disco incompetente. Se ejemplifica una inyeccion intra-discal. El sistema de administracion sella, protege las rafces nerviosas expuestas de danos qrnmicos adicionales y actua como un vehmulo para mantener los corticosteroides en una deposicion duradera en la rafz nerviosa.

[0025] Las siguientes solicitudes informan de ingeriena de tejidos como un posible enfoque biologico, que pretende sustituir, reparar, mantener y/o mejorar la funcion de los tejidos por la combinacion de celulas, factores bioqmmicos y fisicoqmmicos adecuados y opcionalmente una estructura porosa para emplearse como andamio. El documento WO-A-04/093934 describe un metodo para aumentar y/o reparar un disco intervertebral administrando material de celulas madre en el disco. El material de celulas madre se proporciona en un material reticular biologicamente compatible. El material de reticulacion preferido es el reticulado derivado de liposomas, tal como proteoglicanos, glicoprotemas, hialuroninas, fibronectinas, colagenos (tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI, etc.) y similares. Conforme a la descripcion del documento WO-A-04/093934, los retmulos derivados de lipos sirven como excelentes sustratos para el crecimiento celular. Ejemplificados son materiales basados solo en colageno.

[0026] El documento WO-A-00/47621 da a conocer un metodo para producir un crioprecipitado inactivado viral que tiene un fibrinogeno preferido y la relacion de fibronectina de 0,02-0,5 que por ejemplo se puede utilizar para producir una biomatriz basada en fibrina adecuada para el cultivo de las celulas humanas y queratinocitos, fibroblastos y condrocitos. En una realizacion preferida, se utiliza el agente antifibrinolttico t-AMCHA (es decir, acido tranexamico) que se indica para reducir ventajosamente la viscosidad de la composicion.

[0027] La solicitud de patente de Estados Unidos US-A-06/0275273, describe un metodo para la implantacion o la inyeccion de condrocitos en un disco intervertebral degenerativo. La patente describe los condrocitos obtenidos de un cadaver. Segun la descripcion, los condrocitos pueden obtenerse a partir de tejido de cartflago, incluyendo cartflago de disco intervertebral, o cartflago procedente de tejidos cartilaginosos distintos del tejido de disco intervertebral. La descripcion describe varias moleculas biocompatibles a anadir a la composicion celular tales como laminina, quitosano, hidrogel, hidrogel pegilado, colageno tipo I, II, III, fibrinogeno, fibrina, trombina, fibronectina y acido hialuronico. Se describe el uso de la formulacion comercial de pegamento de fibrina TISSEEL® con las celulas. Los ejemplos tambien describen el uso de fibrinogeno de porcino crioprecipitado y una solucion de condrocito-trombina.

[0028] La solicitud de patente de Estados Unidos US-A-07/0093905 describe una mezcla para la reparacion y regeneracion de los discos intervertebrales que comprenden glicina, monocitos concentrados y cola de fibrina. La patente tambien describe el nucleo o tejido anular elminado y tratado para su reinsercion en el disco. Las celulas de disco reinsertadas pueden combinarse opcionalmente con soportes tales como un soporte similar a un gel o un adhesivo. El soporte de gel puede ser un hidrogel biologico o sintetico, acido hialuronico, gel de colageno, adhesivo a base de mejillon, pegamento de fibrina, coagulo de fibrina, sangre, coagulo sangumeo, componente sangumeo, coagulo de componente sangumeo, etc. La solitud de patente no menciona la composicion espedfica de vehmulos descritos, y es silencioso en un concentrado de crioprecipitado.

[0029] El documento EP-A-1894581 da a conocer un gel de matriz que comprende condrocitos o celulas progenitoras como un implante de reparacion de cartflago. De acuerdo con la descripcion, la matriz de gel proporciona una dilucion simple de condrocitos primarios dando como resultado una produccion aumentada de material de matriz extracelular. En una realizacion preferida, los condrocitos se afslan del cartflago articular. El pegamento de fibrina se menciona entre el material de gel de matriz numeroso que se puede usar. La solicitud no menciona una composicion espedfica del material de gel matricial y es silenciosa sobre una concentracion relativa particular entre los componentes del gel.

[0030] Celulas de disco cultivadas en monocapa asumen un fenotipo similar a fibroblastos. En un entorno tridimensional, sin embargo, las celulas de disco se redondean, forman colonias y exhiben mayor proliferacion y smtesis de proteoglicanos. Se han desarrollado varias tecnicas de cultivo in vitro, incluyendo geles tridimensionales complejos y andamios polimericos degradables con el objetivo de proporcionar un bastidor sostenible en el que las celulas del disco pueden proliferar. Se han utilizado acido hialuronico, colageno, quitosano y gel de fibrina en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

preparacion polimerica reticulable para atrapar celulas.

[0031] A pesar de todas las tecnicas informadas sobre el uso de cola de fibrina en IVD, Gruber et al ("Cell-based tissue engineering for the intervertebral disc: in vitro studies of human disc cell gene expression and matrix production within selected cell carriers". Spine J. 2004;4:44-55) informaron que las formulaciones de gel de fibrina eran microambientes inferiores para la proliferacion, produccion de ECM y expresion genica de celulas de anillo fibroso. El termino "matriz extracelular", abreviado "ECM", se refiere al material estructural complejo que es producido por celulas en tejidos de mairnferos. La matriz extracelular es tfpicamente la caractenstica que define un tejido conectivo, por ejemplo, celulas de condrocitos. El ECM in vivo suele proporcionar soporte estructural a las celulas.

[0032] Hay una necesidad de una composicion de fibrina optima adecuada para el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion tales como la degeneracion del disco intervertebral.

Resumen de la invencion

[0033] Los pegamentos de fibrina son bien conocidos y se utilizan ampliamente en diversos entornos clmicos. Tales colas se usan en la cirugfa, tanto como una adicion util a las suturas y para proporcionar una integridad de herida optima, para la hemostasia, y para prevenir o tratar adherencias. Recientemente, se ha publicado literatura sobre el uso de cola de fibrina para reconstruir el disco intervertebral espinal, sellando fisuras en el anillo fibroso y en la restauracion del sistema nervioso central.

[0034] Se encontro de acuerdo con la presente invencion que un aumento en la concentracion de fibrinogeno en placas recubiertas disminuyo significativamente la union de las celulas de nucleo pulposo de disco intervertebral a las placas mientras que un aumento en la proporcion de fibronectina: concentracion de fibrinogeno llevan al resultado opuesto. Por otra parte, una composicion de cola de fibrina tal como un crioprecipitado que se agota selectivamente de fibrinogeno y comprende altos niveles de fibronectina no curana y por lo tanto no formara un armazon tridimensional de soporte para las celulas. La presente invencion resuelve este problema tecnico y proporciona kits que comprenden crioprecipitado con concentraciones optimas de fibronectina y fibrinogeno para uso en discos intervertebrales.

[0035] Se encontro de acuerdo con la presente invencion que la fibronectina: la relacion de fibrinogeno juega un papel crucial en la union de las celulas del nucleo pulposo, la proliferacion y la migracion y absolutamente depende de un alto contenido de fibronectina en relacion con fibrinogeno. Por ejemplo, se encontro segun la invencion que las celulas de nucleo pulposo cultivadas en una mezcla que comprende una proporcion aumentada de fibronectina: fibrinogeno de aproximadamente 1:10-1:5 muestran un aumento de la union celular y la proliferacion en comparacion con las celulas cultivadas en una mezcla que comprende una proporcion menor de fibronectina:fibrinogeno. Tambien, se mostro en la presente invencion que un crioprecipitado con la relacion incrementada de fibronectina:fibrinogeno era capaz de restaurar la altura del disco cuando se inyectaba en el area del nucleo pulposo. Por lo tanto, se puede usar un crioprecipitado que comprende una relacion de fibronectina:fibrinogeno mayor que 1:12 y en el intervalo de 1:10-1:5, tal como 1:7 se puede usar como un componente superior de una matriz para restaurar la altura del disco mientras que sirve como un andamio optimo para las celulas del nucleo pulposo.

[0036] Los estudios indican que las celulas de notocorda pueden guiar la formacion de celulas de nucleo pulposo y SNC y/o se pueden utilizar como progenitores de tales celulas. Por lo tanto, el crioprecipitado de acuerdo con la invencion se puede utilizar para ayudar en la reconstruccion del disco intervertebral y el sistema nervioso central (SNC).

[0037] El acido tranexamico es un inhibidor de la fibrinolisis sintetica, que se ha demostrado que afecta el sistema nervioso central (SNC) que causa hiperexcitabilidad y convulsiones probablemente como resultado de que sea un antagonista de acido gamm-aminobutmco (GABA) (Furtmuller et al. "Tranexamic acid, a widely used antifibrinolytic agent, causes convulsions by a gamma- aminobutyric acid(A) receptor antagonistic effect". J Pharmacol Exp Ther. 2002; 301:168-173, Roger et al. Evaluating the differences between fibrin sealants: recommendations from an international advisory panel of hospital pharmacists" The European Journal of Hospital Pharmacy Science Volumen 12, 2006, Numero 1, P. 3-9). Ademas, se ha demostrado que la aprotinina bovina es un inhibidor altamente inmunogenico de serina proteasa que puede causar un trastorno neurologico degenerativo muy raro e incurable llamado enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que provoca una degeneracion esponjosa en el cerebro y la medula espinal. Por tanto, de acuerdo con el metodo descrito en la presente memoria, las sustancias como acido tranexamico y aprotinina bovina pueden excluirse del concentrado de crioprecipitado que se va a usar en la columna vertebral.

[0038] Por lo tanto, La tecnica descrita no describe ni sugiere la cola de fibrina optima para uso en la columna preparada con una formulacion que tiene un crioprecipitado fibrinogeno adecuado y la relacion de la fibronectina y carece de acido tranexamico y/o aprotinina bovina derivada.

[0039] La invencion proporciona un kit que comprende: un primer recipiente que comprende un concentrado viral

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

crioprecipitado-plasma inactivado (VIPCC) que tiene una relacion de fibronectina:fibrinogeno de 1:10 a aproximadamente 1:5, que comprende un segundo recipiente de una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinogeno, y un tercer recipiente que comprende una enzima proteolttica seleccionada del grupo que consiste en peptidasas de serina, peptidasas de cistema, peptidasas asparticas, peptidasas de metalo, hialuronidasas y combinaciones de las mismas.

[0040] Todavfa en otra realizacion de la invencion, la enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste en tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica, quimopapama papama, pepsina, colagenasa, gelatinasa, condroitinasa de pronasa, hialuronidasa y combinaciones de los mismos. El kit puede ademas comprender un agente de contraste tal como yodo.

[0041] El kit de la invencion puede ser utilizado para el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion como la degeneracion de un tejido de la medula, como disco intervertebral.

Breve descripcion de los dibujos

[0042] Las caractensticas, aspectos y ventajas de la presente invencion se entenderan mejor con respecto a la siguiente descripcion, ejemplos, reivindicaciones y las siguientes figuras.

Fig. 1 : muestra el efecto de la trombina, el concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) y sus componentes sobre la union y proliferacion de celulas de anillo fibroso. Se recubrio una placa de cultivo de plastico de 97 mm en la circunferencia con VIPCC, trombina, albumina y fibrinogeno. Posteriormente, se sembro la suspension de celulas anulares fibrosas en el centro del plato (Origen). La fijacion de celulas a VIPCC, trombina, albumina y fibrinogeno se determino despues de 14 dfas mediante tincion con hematoxilina y eosina.

Fig. 2 : muestra los efectos del procedimiento de tripsinizacion y/o el paso sobre la union celular y la proliferacion de celulas de anillo fibroso. Se colocaron celulas anulares fibrosas disociadas en el centro de un plato de cultivo de plastico de 97 mm recubierto en la circunferencia con VIPCC, fibrinogeno, fibronectina y mezcla purificada de fibronectina:fibrinogeno (1:10). La fijacion celular se evaluo despues de 9 dfas mediante tincion con hematoxilina y eosina.

Figs. 3A-3B: muestran enlace de celulas de nucleo pulposo (A) y anillo fibroso (B) en diferentes recubrimientos. Los resultados obtenidos se expresan como una union de celulas de pliegue a recubrimientos de fibronectina en el mismo experimento (100%). Fn-fibronecetina; Fgn-fibrinogeno.

Fig. 4 : muestra niveles de celulas activas de nucleo pulposo metabolicas en los dfas 1 y 5 en cultivo en diferentes recubrimientos. Los resultados se presentan como porcentaje de la intensidad de absorbancia en el revestimiento de fibronectina (100%). Concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral VIPCC; Fn- fibronectina; Fgn-fibrinogeno.

Fig. 5 : muestra los niveles del cultivo metabolico de nucleo pulposo activo en cantidad constante de fibronectina y aumento de la cantidad de fibrinogeno en la matriz de revestimiento (A) y en cantidad constante de fibrinogeno y aumento de la cantidad de fibronectina en la matriz de revestimiento (B).

Figs. 6A-6D: muestran la morfologfa y la funcion del anillo fibroso (panel superior) y los condrocitos de nucleo pulposo (panel inferior) en andamiaje adjunto (A, C) y distante (B, D) tridimensional preparado con VIPCC.

Fig. 7 : muestra la migracion de las celulas de nucleo pulposo en VIPCC activado.

Fig. 8 : muestra una imagen fluorografia de control (A, solucion salina) y activado por VIPCC (B; preparado con VIPCC y trombina) inyecciones en el disco intervertebral.

Fig. 9 : muestra la columna vertebral lumbar aislada 14 dfas despues del procedimiento de inyeccion descrito en la Fig. 8

Fig. 10: muestra los discos intervertebrales (DIV) de solucion salina (A) y inyecciones activadas por VIPCC (B) como se describe en la Fig. 8

Fig. 11: muestra los estudios histologicos de la region de nucleo pulposo de solucion salina (A) e inyecciones IVDs activadas por VIPCC (B) descritas en la Fig. 8

Fig. 12: muestra la region central del nucleo pulposo de control (A) e inyecciones IVDs activadas por VIPCC (B) descritas en la Fig. 8

Fig. 13: muestra los racimos de nucleo pulposo de la region periferica de control (A) e inyecciones IVDs activadas por VIPCC (B).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Fig. 14: muestra la morfologfa y la produccion de sulfato de condroitina de celulas de condrocitos de nucleo pulposo dispuestos en tres andamios dimensionales formados de la mezcel VIPCC de 20 veces y trombina diluida dentro de los discos intervertebrales aislados. La evaluacion histologica se realizo usando un microscopio de fluorescencia invertido 1 hora y 3 d^as (A y B, respectivamente) siguiendo el procedimiento de inyeccion. N- nucleo; CS-sulfato de condroitina. La produccion de sulfato de condroitina es aparente en la membrana celular (flecha).

Fig. 15: muestra el porcentaje de compresion de disco bajo carga de fuerza creciente del disco no tratado, disco vacfo y vuelva a discos rellenados (PBS o VIPCC y trombina).

Fig. 16: muestra la recuperacion de altura de los discos inyectados ya sea con VIPCC activado o PBS. Los resultados se basan en las mediciones mostradas en la Fig. 15 (compresion bajo 500 N). Los resultados se presentan como porcentaje de la compresion maxima posible de disco sin tratar bajo 500 N de carga en el mismo experimento (100%).

Descripcion detallada

[0043] La invencion se refiere a kits que comprenden el concentrado crioprecipitado de plasma viral inactivado (VIPCC) que comprende un fibronectina adecuado: relacion de fibrinogeno para el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion tales como la degeneracion del disco intervertebral (DIV).

[0044] Sorprendentemente, se encontro de acuerdo con la presente invencion que la relacion fibronectina: fibrinogeno juega un papel crucial en la fijacion de las celulas del nucleo pulposo, la proliferacion y la migracion. Se ha demostrado segun la invencion que las propiedades de conductividad de crioprecipitado en el nucleo pulposo (NP) absolutamente dependen de una relacion optima de la fibronectina con relacion al fibrinogeno.

[0045] El termino "crioprecipitado" se refiere a un componente de la sangre que se obtiene a partir de plasma congelado preparado a partir de sangre entera. Un crioprecipitado se puede obtener cuando el plasma congelado se descongela en el fno, por lo general a una temperatura de 0-4°C, y recoge el precipitado, por ejemplo por centrifugacion. Por lo general, se forma un crioprecipitado que es rico en fibrinogeno, factor VIII, factor de von Willebrand, factor XIII y fibronectina. El componente de crioprecipitado se puede preparar a partir de plasma autologo, humano, incluyendo plasma de mezcla, o de plasma de fuente no humana.

[0046] Los resultados obtenidos de acuerdo con la invencion muestran que un aumento en la concentracion de fibrinogeno en placas recubiertas disminuyo significativamente la union de celulas de nucleo pulposo a las placas. Mientras que un aumento de la concentracion de fibronectina en las placas provoco el resultado opuesto. Sin embargo, crioprecipitado se agota selectivamente de fibrinogeno y compone altos niveles de fibronectina no curana, y por tanto sin fibrinogeno no se formara un andamiaje que soporte una formacion de tejido tridimensional.

[0047] Mas espedficamente, se comprobo segun la invencion que una mezcla purificada de la fibronectina: fibrinogeno en una relacion de 1:10 y 1:5 es mas adecuada para la fijacion y proliferacion de celulas de nucleo pulposo que mezclas que comprenden una fibronectina inferior: relacion de fibrinogeno. Sorprendentemente, en contraste con anillo fibroso, se encontro que la union de celulas de nucleo pulposo se afectana por un aumento en la concentracion de fibrinogeno en placas recubiertas de fibrinogeno. De hecho, la union de celulas de nucleo pulposo disminuyo significativamente con el aumento de concentraciones de fibrinogeno en una manera que dependfa de la dosis. Por el contrario, el aumento de la relacion fibronectina: fibrinogeno da lugar al resultado opuesto. Estos resultados indican el papel clave de relacion de fibronectina: fibrinogeno en la union de celulas de nucleo pulposo y demuestran la ventaja de usar una relacion de alto nivel de fibronectina: fibrinogeno para las celulas de nucleo pulposo. Los resultados obtenidos indican que la union de las celulas del nucleo pulposo es mejor en VIPCC que en una mezcla purificada de la fibronectina: fibrinogeno que tiene una relacion de altura y similar de fibronectina: fibrinogeno. Es de destacar que la union celular de los condrocitos de anillo fibroso fue similar en ambos recubrimientos.

[0048] La proliferacion celular de las celulas de nucleo pulposo y anillo fibroso era mayor en el recubrimiento VIPCC que en el revestimiento compuesto de la fibronectina purificada y la mezcla de fibrinogeno. Sin embargo, la proliferacion de los condrocitos de nucleo pulposo fue mas afectada que la de condrocitos de anillo fibroso por los diferentes revestimientos. La viabilidad de las celulas de nucleo pulposo de un revestimiento VIPCC con alta fibronectina: relacion de fibrinogeno y fibronectina purificada de: la mezcla de fibrinogeno tambien se controlo. Los resultados muestran que la alta fibronectina: relacion de fibrinogeno era capaz de mitigar la disminucion de la viabilidad celular observada en el recubrimiento de fibrinogeno. Este efecto positivo en celulas de nucleo pulposo era particularmente pronunciado con el revestimiento VIPCC. Estos resultados muestran las ventajas de utilizar el VIPCC con alta fibronectina: relacion de fibrinogeno como un revestimiento para las celulas de nucleo pulposo en lugar de la fibronectina pura: mezcla de fibrinogeno. Se encontro que los condrocitos de nucleo pulposo detectan un gradiente quimiotactico de diversas diluciones de VIPCC y se produce transmigracion en presencia de tal gradiente VIPCC. Por lo tanto, una formulacion VIPCC con alta relacion de fibronectina:fibrinogeno puede tener caractensticas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

condroconductoras.

[0049] En total, los resultados segun la invencion muestran que VIPCC como se describe aqm tiene una relacion de fibronectina:fibrinogeno de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 o de alrededor de 1:7 adecuada para su uso con celulas de nucleo pulposo. Por lo tanto, VIPCC activado como se describe aqm puede utilizarse como un andamio para el cultivo de celulas de nucleo pulposo ex-vivo o puede ser inyectado en el espacio discal intervertebral para ser utilizado como un andamio para las celulas de nucleo pulposo in vivo.

[0050] Se comprobo segun la invencion que la inyeccion de VIPCC y trombina en el disco intervertebral de un modelo animal no cambiaron la estructura del IVD y que la estructura tfpica de los tejidos de los condrocitos en el IVD se conservo. Ademas, se demostro que VIPCC activado puede funcionar para restaurar sustancialmente la altura del disco normal y tal disco restaurado es capaz de resistir cargas de compresion como el tejido del nucleo pulposo natural.

[0051] Ademas, el mantenimiento de la morfologfa y la funcionalidad de IVD inyectaron condrocitos de nucleo pulposo se demostro cuando se inyecta junto con VIPCC activado como se describe aqm.

[0052] Asf, un crioprecipitado de plasma viral inactivado concentrado (VIPCC) teniendo una fibronectina: relacion de fibrinogeno de 1:10 a 1:5 de 1:10 a 1:7 o de alrededor de 1:7 se puede utilizar ventajosamente para permitir la union, proliferacion y migracion de celulas de tejido del nucleo pulposo. Los resultados tambien muestran que las celulas de nucleo pulposo cultivadas en VIPCC activado como se describe en el presente documento mantienen la morfologfa y la smtesis de sulfato de condroitina. Dado que las celulas de nucleo pulposo se originan desde y/o se gman por la region notocorda, estos resultados abren el camino a nuevos enfoques para el tratamiento de la columna lesionada, cuya formacion se gma por las celulas de notocordio como nucleo pulposo y neuronas motoras a partir del sistema nervioso central. Por lo tanto crioprecipitados que contienen relacion optima de fibronectina: fibrinogeno son superiores en un crioprecipitado que no contiene fibronectina o que comprende una baja relacion de fibronectina: fibrinogeno para su uso en la columna vertebral.

[0053] Las celulas de tejido de nucleo pulposo humano de la IVD son celulas de tipo condrocito principalmente pequenas, pero hay una segunda poblacion de celulas grandes, celulas de notocordio, que se presumen restos del tejido embrionario que guio la formacion del desarrollo embrionario del tubo neural y el nucleo pulposo (Hunter et al, 2003). Algunos estudios indican que las celulas de notocordio que se encuentran en el tejido del nucleo pulposo pueden guiar la formacion de nucleo pulposo y celulas del SNC. Por lo tanto, el tejido de nucleo pulposo puede ser utilizado para ayudar en la reconstruccion del disco intervertebral y el SNC.

[0054] Se describe aqm un metodo para facilitar el crecimiento, la proliferacion, la diferenciacion, el mantenimiento, la reparacion y/o restauracion de las celulas derivadas de notocordio tales como las celulas de nucleo pulposo, el metodo de las cuales comprende la puesta en contacto de la poblacion de dichas celulas con concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentracion relativa inicial de fibronectina:fibrinogeno de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 o de alrededor de 1:7.

[0055] El termino "celulas derivadas de notocordio" se refiere a la formacion de celulas que se guio por la region notocorda. En otras palabras, las celulas derivadas de notocordio se refieren a las celulas de nucleo pulposo de la columna vertebral y las celulas neurales de la columna vertebral (es decir, celulas del SNC).

[0056] El acido tranexamico es un inhibidor de la fibrinolisis sintetica, que se ha demostrado que afecta el sistema nervioso central (SNC) que causa hiperexcitabilidad y convulsiones probablemente como resultado de que sea un antagonista de acido Gamm-aminobutmco (GABA) (Furtmuller et al., "Tranexamic acid, a widely used antifibrinolytic agent, causes convulsions by a gamma- aminobutyric acid(A) receptor antagonistic effect". J Pharmacol Exp Ther 2002; 301:168-173; Roger et al "Evaluating the differences between fibrin sealants: recommendations from an international advisory panel of hospital pharmacists". The European Journal of Hospital Pharmacy Science, Volumen 12, 2006, Numero 1, P. 3-9). Ademas, se ha demostrado que la aprotinina bovina es una serina inhibidora de proteasa altamente inmunogenica que puede causar un trastorno neurologico degenerativo muy raro y incurable llamado enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que provoca una degeneracion esponjosa en el cerebro y la medula espinal.

[0057] De este modo, las sustancias como el acido tranexamico y/o aprotinina bovina pueden ser excluidas del concentrado crioprecipitado que se utilizaran en la columna vertebral. VIPCC en el que se redujeron los niveles de plasminogeno y plasmina hace que el uso de estas sustancias sea innecesario. En una realizacion de la invencion, en VIPCC el plasminogeno y la plasmina se han reducido a igual o menor que 15 pg/ml como por ejemplo 5 pg/ml.

[0058] El crioprecipitado de plasma como se describe en el presente documento puede ser activado o no activado. El termino "VIPCC activado" se refiere a la composicion de crioprecipitado despues de la combinacion con un componente activador que es capaz de formar fibrina a partir de fibrinogeno. La mezcla combinada resulta en una estructura tridimensional. El componente activador puede ser la trombina y/o una solucion obtenible a partir de veneno de serpiente. La puesta en contacto de VIPCC como se describe en el presente documento con las celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se puede llevar ex-vivo, incluyendo en cultivo celular in vitro con o sin otros tipos de celulas o in vivo en el sitio de la lesion.

[0059] La tecnica descrita ni sugiere ni describe el uso de una formulacion que tiene un crioprecipitado fibrinogeno preferido y la relacion de la fibronectina, que carecen de acido tranexamico y aprotinina bovina derivados para su uso en la columna vertebral.

[0060] Se describe aqrn un metodo para tratar y/o prevenir una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion tales como la degeneracion del disco intervertebral que comprende la administracion en la columna vertebral de un sujeto en necesidad de un concentrado de crioprecipitado de plasma viral inactivado (VIPCC) que tiene una relacion inicial de fibronectina:fibrinogeno de 1:10 a 1:5, con la condicion de que el acido tranexamico y aprotinina bovina estan ausentes del concentrado de crioprecipitado. La composicion VIPCC como se divulga aqrn se puede administrar en combinacion con una composicion de celulas que comprende celulas derivadas de notocordio tales como las celulas de nucleo pulposo.

[0061] Dicho VIPCC puede ser activado o no activado.

[0062] Tal como se utiliza aqrn, el termino "inicial" se refiere a la relacion de las variables en el extremo de la preparacion de concentrado de crioprecipitado.

[0063] Tambien se describe aqrn un metodo util para el tratamiento de la enfermedad de sistema nervioso central (SNC), trastorno o afeccion que comprende la administracion al sitio de la lesion o dano de un sujeto en necesidad de un concentrado de crioprecipitado de plasma viral inactivado (VIPCC) que tiene una relacion de fibronectina:fibrinogeno de 1:10 a 1:5. La divulgacion es util para tratar lesiones del SNC o la medula espinal, y mejora la restauracion del SNC y el crecimiento axonal en un sujeto.

[0064] El termino "enfermedad de la columna, trastorno o afeccion" se refiere al disco intervertebral y/o hasta el centro de enfermedades del sistema nervioso, trastorno o afeccion.

[0065] El termino "enfermedad del disco intervertebral, trastorno o afeccion" se refiere a un trastorno multiple, enfermedad o condiciones que implican la degeneracion del disco intervertebral y/o lesiones tales como hernia de disco, disco fisurado, estenosis espinal, disco negro, dolor de disco, etc.

[0066] A menudo, el termino "enfermedad del disco intervertebral, trastorno o afeccion" se usa como sinonimo del termino "enfermedad degenerativa del disco (DDD)".

[0067] De acuerdo con el sistema de denominacion "Dallas Discograma modificado" hay seis posibles categonas que describen la gravedad del desgarro anular radial (grado 0-5) (Sachs et al. "Dallas discogram description. A new classification of CT/discography in low-back disorders" Spine 1987; 12: 287-294). Mientras que el grado 0 describe un disco normal; donde no haya fugas de material de contratacion del nucleo y el desgarro de grado 5 describe un desgarro que ha roto por completo las capas exteriores del disco y tiene una fuga de material fuera del disco.

[0068] Nutricion inadecuada de disco por ejemplo, cuando se altera el suministro de sangre a partir de las vertebras adyacentes, la degeneracion del disco puede ser acelerada. Esto puede ser causado por la deshidratacion del nucleo pulposo que conduce a la degradacion de las fibras de colageno. Tales discos deshidratados se pueden ver en una resonancia magnetica y tambien se conocen como "discos negros" debido al cambio de color en la IRM. En ultima instancia, el disco puede perder su capacidad de absorcion de impactos. El espacio de disco se hara estrecho, perdera su capacidad de absorcion de impactos y el movimiento en ese nivel sera anormal. Esto aplica tension excesiva en las estructuras adyacentes en la columna vertebral que conduce a la compresion de la rafz nerviosa, una condicion dolorosa llamada estenosis espinal (
http://www.saspine.org/conditions/ddd_disease.htm).

[0069] Las pruebas de diagnostico para una enfermedad de la medula, trastorno o afeccion incluyen, pero no se limitan a, la radiograffa, la mielograffa, tomograffa computarizada, resonancia magnetica, tomograffa de emision de positrones, y otras pruebas de diagnostico conocidas en la tecnica.

[0070] Tal como se utiliza aqrn, el termino "enfermedad del sistema nervioso central, trastorno o afeccion" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno, o trauma que interrumpe la funcion normal o la comunicacion del cerebro o la medula espinal. Las lesiones del SNC que pueden tratarse utilizando los kits de la invencion son diversas y se comprenderan facilmente por la persona experta. Sin limitacion, se pueden mencionar las lesiones cerebrales y de la medula espinal debido a la neurocirugfa, trauma, isquemia, hipoxia, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad metabolica, enfermedad infecciosa, la compresion del disco inervertebral, tumores y enfermedad autoinmune.

[0071] La administracion de la composicion VIPCC en el disco intervertebral se puede llevar a cabo mediante inyeccion. En tal realizacion, el procedimiento de inyeccion se puede realizar como sigue. El sujeto en necesidad se puede colocar lateralmente y doblarse hacia delante. La aguja o canula pueden insertarse en el nucleo pulposo del disco a tratar. En el tratamiento de un defecto del sistema nervioso central, la aguja o canula se pueden colocar adyacente a la duramadre. La aguja o canula se pueden insertar bajo la grna de un trazador. El termino "trazador" es

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

intercambiable con el termino "agente contractual", como se define a continuacion. La tecnica que se puede usar en el metodo descrito en este documento incluye fluorograffa, escaneado, imagenes por resonancia magnetica, la tomograffa, la nanotecnologfa, v^deo digital, rayos X o cualquier otra tecnica conocida en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de marcadores son colorantes organicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste se puede seleccionar de diversos agentes no toxicos, tales como yodo. Si el espectro del trazador no es visible para el ojo humano del trazador puede ser detectado por un equipo apropiado. Una vez en la posicion correcta, la aguja o canula pueden ser insertadas en el nucleo pulposo por ejemplo, despues de atravesar el anillo fibroso. A continuacion, el agente de contraste se inyecta a fin de verificar el sitio de aplicacion exacto. El agente de contraste puede estar presente en el extremo de la punta de la aguja o canula. Una vez que la ubicacion se verifica el VIPCC y, por ejemplo un volumen igual de un componente activador se inyecta en el espacio intradiscal. El procedimiento de inyeccion puede ser en cualquier orden, por ejemplo, los componentes se aplican al mismo tiempo o uno despues del otro y se forma un andamio cuando se mezclan los componentes.

[0072] El termino "componente activador" se refiere a un compuesto que es capaz de formar fibrina a partir de fibrinogeno incluyendo la trombina y/o una solucion obtenible a partir de veneno de serpiente. En una realizacion de la invencion, la trombina se aislo a partir de plasma de los seres humanos o mairnferos. Tambien es posible que la enzima que es capaz de formar fibrina se prepara por metodos recombinantes.

[0073] El VIPCC activado se puede inyectar en combinacion con una composicion de celulas que comprende celulas derivadas de notocordio tales como las celulas de nucleo pulposo.

[0074] El VIPCC activado se puede utilizar en una cantidad adecuada para la reconstruccion de la zona danada y depende de la extension de la lesion.

[0075] Los componentes se pueden inyectar en la base del defecto y la aguja o canula pueden ser retiradas del anillo fibroso cuando se encuentra resistencia. Soluciones de exceso pueden ser derramadas de la zona de inyeccion, formando un gel solido y un cierre de la abertura o incision despues de la inyeccion.

[0076] El VIPCC comprende una relacion de fibronectina:fibrinogeno de aproximadamente 1:7. El termino "concentrado de crioprecipitado de plasma viral inactivado" se refiere a un crioprecipitado de sangre total que tiene una relacion de fibronectina:fibrinogeno mayor que 1:12, por ejemplo como se describe en el documento EP-B- 534178 y WO-A-9305822, y obtenible por

- descongelacion de un criopasta;

- disolver en un tampon a pH 7,0 a 7,2;

- precalentamiento de 30 a 35°C;

- ajustar el pH a 7,0-7,2;

- la adicion de hidroxido de aluminio bajo agitacion;

- centrifugar y desechar el precipitado;

- la adicion de CaCh ;

- inactivacion de los virus;

- concentrar por ultrafiltracion a una concentracion de protema de 60 a 100 mg/ml.

[0077] Actualmente, pegamento de fibrina o formulaciones fibrina se han descrito para su uso en el disco intervertebral y la regeneracion del sistema nervioso central, sin embargo, hemos encontrado de acuerdo con la presente invencion que crioprecipitado, tal como el preparado segun el metodo Martinowitz y Bal, que contiene una alta relacion de fibronectina:fibrinogeno, cerca de la relacion del crioprecipitado original y en el que la composicion de crioprecipitado no incluye el acido tranexamico y/o aprotinina bovina es mas adecuado para la mejora de la adhesion, proliferacion, crecimiento, diferenciacion y/o mantenimiento de las celulas en el tejido del nucleo pulposo que las composiciones que comprenden una relacion de fibronectina:fibrinogeno menor y contienen acido tranexamico y/o aprotinina bovina. La tecnica descrita ni sugiere ni describe el uso de una formulacion que tiene un crioprecipitado de fibrinogeno preferido y la relacion de la fibronectina, que carecen de acido tranexamico y aprotinina bovina derivados para su uso en el nucleo pulposo anormal.

[0078] Otras formulaciones comerciales tales como TISSEEL®, Tissucol® tienen una relacion de fibronectina:fibrinogeno inferior que el crioprecipitado original y contienen acido tranexamico y/o la aprotinina bovina, asf el crioprecipitado como se describe en el presente documento que comprende una relacion de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 y de aproximadamente 1:7, por ejemplo BAC; Omrix, IL preparados como se describe en el documento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

EP-B-534178, en el que la plasmina y plasminogeno se eliminan como se describe en el documento EP-B-1390485 y WO-A-02095019, es mas adecuado para el tratamiento del disco intervertebral y el sistema nervioso central que cualquier otro crioprecipitado comercialmente disponible, por ejemplo, crioprecipitado que se basa en la metodologfa de Schwartz et al, y que no retienen la relacion de fibronectinafibrinogeno presente en el crioprecipitado original o tener una relacion igual o inferior a 1:12 (Bar et al, 2005) y que comprende el acido tranexamico y/o aprotinina bovina.

[0079] El crioprecipitado como se describe en este documento contiene ciertas sustancias y relacion espedfica de fibronectinafibrinogeno que estimulan la union, la migracion y la proliferacion de las celulas derivadas de notocordio, un fenomeno que puede facilitarse en tratamiento de las enfermedades de la columna vertebral, trastornos o condiciones tales como disco intervertebral degenerativo y la enfermedad del sistema central nervioso, trastorno o afeccion.

[0080] El crioprecipitado como se describe en el presente documento puede comprender un agente estabilizante, por ejemplo, arginina o lisina, o mezclas de arginina y lisina, o sus sales farmaceuticamente aceptables. La solucion de crioprecipitado comprende una mezcla de protemas, tales como fibrinogeno, factor VIII, factor XIII, fibronectina, factor de von Willebrand (vWF), la vitronectina y similares. La solucion de crioprecipitado puede comprender un inhibidor de la proteasa que no sea la aprotinina bovina y/o acido tranexamico. Tal crioprecipitado se describe en el documento WO-A-9833533 y US-B-6121232, en el que la plasmina y de plasminogeno se eliminan como se describe en el documento EP-B-1390485 y WO-A-02095019. El procedimiento de inactivacion de virus se puede llevar a cabo por nanofiltracion, tratamiento con disolvente/detergente, tratamiento termico, tal como, pero no limitado a pasteurizacion, irradiacion gamma o UVC (<280 nm) o por cualquier otro metodo conocido en la tecnica. El termino "parffcula infecciosa" se refiere a una parffcula microscopica, como microorganismo o prion, que puede infectar o propagarse en celulas de un organismo biologico. Las parffculas infecciosas pueden ser parffculas virales.

[0081] El procedimiento de inactivacion viral puede llevarse a cabo mediante la adicion de una molecula a la composicion antes y/o durante el procedimiento de purificacion. Las moleculas anadidas y sus productos pueden ser removidos por la gravitacion, cromatograffa en columna o cualquier otro metodo conocido en la tecnica.

[0082] La eliminacion de parffculas infectivas puede llevarse a cabo mediante nanofiltracion o por metodos de absorcion selectiva, tales como afinidad, intercambio ionico o cromatograffa hidrofoba. Procedimiento de inactivacion de virus se puede utilizar como el procedimiento descrito en el documento WO-A-9114439. Un principio basico es el tratamiento del crioprecipitado con detergentes especiales y eliminar el detergente despues del crioprecipitado. Un procedimiento de inactivacion viral multi-etapa se puede llevar a cabo. Por ejemplo, la composicion se puede someter al disolvente/detergente de tratamiento, tratamiento termico, cromatograffa selectiva y nanofiltracion. En una realizacion de la invencion, el crioprecipitado es doble viral inactivado. Segun la invencion, el crioprecipitado es un concentrado de crioprecipitado. El crioprecipitado se concentra en el intervalo de aproximadamente un factor de 2 a alrededor de un factor de 5. En una realizacion de la invencion, el factor de concentracion es de aproximadamente 3. En una realizacion de la invencion, el crioprecipitado se concentra por ultrafiltracion a una concentracion de protema de 60 a 100 mg/ml. La concentracion de fibrinogeno en el VIPCC puede ser muy alta y puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 mg/ml, de 40 a aproximadamente 100 mg/ml, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mg/ml.

[0083] Como se muestra en los ejemplos, el aumento de los niveles de fibrinogeno interfiere con la union, el crecimiento y la proliferacion de nucleo pulposo. Sin embargo, la alta proporcion de fibronectina:fibrinogeno en el VIPCC parece mitigar el efecto indeseable de fibrinogeno presente en altos niveles en VIPCC.

[0084] En una realizacion de la invencion, se activa el crioprecipitado de plasma. En otra realizacion adicional de la invencion, el crioprecipitado es no activado. El procedimiento de activacion se puede lograr mediante la mezcla de dicho crioprecipitado con un volumen equivalente de una enzima que es capaz de reaccionar con el fibrinogeno para formar fibrina. En una realizacion de la invencion, la enzima es la trombina y/o una solucion obtenible a partir de veneno de serpiente. La trombina es ffpicamente aislada de seres humanos. Tambien es posible que la enzima que es capaz de formar fibrina se prepara por metodos recombinantes. El crioprecipitado como se describe en el presente documento y/o el compuesto de la activacion puede ser suministrado como una solucion o en una forma solida, por ejemplo como un polvo liofilizado. La solucion puede estar en estado de congelacion.

[0085] VIPCC activado que tiene propiedades bio-mecanicas y fisiologicas del nucleo pulposo puede ser ventajosamente utilizado para reemplazar el tejido danado natural del nucleo pulposo.

[0086] El crioprecipitado puede comprender un agente de contraste. Un "agente de contraste" se refiere a un trazador que es capaz de hacer posible la visualizacion de la anatoirffa de la columna vertebral. La tecnica que se puede usar en el metodo descrito en este documento incluye la exploracion, imagenes de resonancia magnetica, tomograffa, la nanotecnologfa, video digital, de rayos X o cualquier otra tecnica conocida en la tecnica.

[0087] Los ejemplos no limitantes de agentes de contraste son los colorantes organicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste se puede seleccionar de diversos agentes no toxicos, tales como

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

yodo. Si el espectro del agente de contraste no es visible para el ojo humano el agente puede ser detectado por un equipo apropiado.

[0088] Se describe en el presente documento la formacion de una matriz de dos dimensiones adecuada para el crecimiento de celulas derivadas de notocordio. Ademas, se describe un andamiaje tridimensional para in vivo y/o in vitro, incluyendo aplicaciones de un implante biocompatible para la ingeniena de tejidos in vivo, asf como para el cultivo in vitro de celulas. El termino "ingeniena de tejidos" se refiere tfpicamente a la utilizacion de una combinacion de factores bioqmmicos y ffsico-qmmicos adecuados para restaurar, reemplazar, mantener y/o mejorar la funcion del tejido o un organo completo. El termino ingeniena de tejidos a veces es sinonimo del termino medicina regenerativa.

[0089] El termino "andamio" se refiere en general a una matriz tridimensional que es capaz de proporcionar integridad estructural y soporta una formacion de tejido en tres dimensiones, lo que permite la reconstruccion de tejidos.

[0090] El andamio posee las siguientes propiedades: no toxico, biocompatible, biodegradable, permite la adhesion y migracion de celulas derivadas de notocordio, y permite la difusion de la celula vital.

[0091] El andamio tambien se puede utilizar para la entrega y la retencion de una composicion de celulas que comprenden celulas derivadas de notocordio tales como las celulas de nucleo pulposo.

[0092] En una realizacion, dicho crioprecipitado activado que es capaz de formar un andamio tridimensional in vivo puede administrarse por inyeccion en una columna lesionada, por ejemplo, en el nucleo pulposo de un disco degenerativo o lesion de SNC de un sujeto en necesidad. El crioprecipitado activado in vivo se puede utilizar para proporcionar soporte mecanico, la restauracion de la altura y/o la fuente de anclaje de celulas a un sitio defectuoso o danado in situ y/o para proporcionar una matriz en la que las celulas de la zona lesionada pueden migrar, invadir, crecer, proliferar, y/o diferenciarse.

[0093] El andamio que forman in vivo puede ser un material inyectable que puede ser entregado en la columna lesionada como un lfquido a traves de una canula o aguja y se endurecen en el cuerpo. En una realizacion, el andamio que se forma in vivo puede adaptarse a la forma de la cavidad y llenar completamente el espacio de disco permitiendo asf una mejor estabilidad del segmento vertebral.

[0094] El crioprecipitado se puede inyectar de forma simultanea con un compuesto de activacion y endurecimiento in vivo. En una realizacion, el componente activador y VIPCC se administran a lo largo de la medula espinal lesionada y el VIPCC activada sirve como un andamio para la reconstruccion de heridos y/o rotura de la medula espinal causada, por ejemplo, por la compresion del disco inervertebral.

[0095] La composicion de VIPCC se puede usar para la reconstitucion del disco intervertebral degenerado en la enfermedad, trastorno o afeccion en diferentes etapas de desarrollo. En una realizacion de la descripcion, se utiliza el metodo de acuerdo con la la divulgacion para la prevencion de la hernia de disco intervertebral. En otra realizacion de la descripcion, el metodo de acuerdo con la revelacion es para administrarse a un sujeto en una etapa temprana de la enfermedad del disco intervertebral antes de que la hernia se lleve a cabo. En una realizacion adicional, el crioprecipitado activado sirve como un andamio para la reconstruccion de nucleo pulposo en un sujeto en estado avanzado de la enfermedad del disco intervertebral y/o lesion de la medula espinal causada, por ejemplo, por compresion o herniacion del disco intervertebral.

[0096] El VIPCC se puede utilizar para restaurar la altura y/o para reducir o aliviar el dolor discogenico. Los individuos con alto riesgo de tener la enfermedad degenerativa del disco, como el paciente que sufre de osteoporosis, se puede monitorizar por cambios en la altura del disco y cuando se detecta una disminucion, VIPCC se puede administrar para restaurar o elevar la altura del disco.

[0097] Alternativamente, el metodo descrito en este documento comprende la etapa de ejercer la totalidad o una parte del nucleo pulposo antes de administrar dicho crioprecipitado. El procedimiento de extraccion puede llevarse a cabo enzimaticamente mediante la interrupcion de la matriz extracelular, mecanicamente, mediante el uso de una sonda de nucleotoma y/o por cualquier otro metodo conocido en la tecnica.

[0098] Por ejemplo, la cirugfa puede llevarse a cabo mientras el paciente se encuentre profundamente dormido o anestesia libre por, por ejemplo, dolor, general o local, respectivamente. Una incision se puede llevar a cabo sobre el sitio de la degeneracion, por lo general la region lumbar, en la lmea media. El hueso que se curva alrededor y cubre la medula espinal (lamina) se puede eliminar (laminectoirna) y el tejido que esta causando presion sobre el nervio o la medula espinal puede ser eliminado. El agujero a traves del cual pasa el nervio se pueden ampliar para evitar una mayor presion sobre el nervio. En ocasiones, un trozo de hueso (injerto de hueso), jaulas intersomaticas, o tornillos de pedfculo puede ser utilizados para fortalecer el area de la cirugfa. El crioprecipitado puede ser introducido a traves del orificio y/o se puede utilizar para los medios de la capa utilizados para reforzar el area de la cirugfa.

[0099] En una realizacion de la exposicion, el paciente recibe anestesia local y el procedimiento es un procedimiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mmimamente invasivo (MIS).

[0100] Los ejemplos no limitantes de las tecnicas de separacion mecanica incluyen picar, cortar, fresar, pulverizar, pulir, extraer, desollar. El aislamiento de celulas del disco se puede facilitar aun mas con el uso de otras tecnicas de separacion conocidas, tales como filtros, centnfugas, columnas de separacion, columnas de afinidad, o por cualquier otra tecnica conocida en la tecnica.

[0101] Las enzimas proteolfticas capaces de degradar el tejido del cartftago incluyen, pero no se limitan a peptidasas de serina, por ejemplo, tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica; peptidasas de cistema, por ejemplo, la quimopapama de paparna; peptidasas de aspartico, por ejemplo, pepsina, peptidasas de metalo, por ejemplo, colagenasa, gelatinasa, pronasa, condroitinasa; hialuronidasa y/o materiales qmmicos alternativos que degradanan el material del disco de la misma manera o similar, y combinaciones de los mismos.

[0102] Debe entenderse que la cantidad de la solucion farmacologicamente adecuada de enzimas necesarias para la degradacion de tejido del disco de mamftero puede variar.

[0103] El termino "solucion farmacologicamente adecuado" se refiere a la disolucion de una cantidad eficaz de las enzimas proteolfticas en una solucion. El pH de la solucion se puede ajustar a un pH fisiologicamente compatible de aproximadamente 7,40 para la activacion maxima de las enzimas proteolfticas. Para obtener mejores resultados, la solucion puede contener todos los componentes necesarios para activar las enzimas proteolfticas.

[0104] Las enzimas proteolfticas capaces de tejido de cartftago degradantes se pueden suministrar como una solucion y/o una forma solida tal como polvo liofilizado. La solucion y/o el polvo son esteriles, libres de pirogenos en un estado secado por congelacion hasta inmediatamente antes de su uso. El vial, que contiene el polvo liofilizado, tfpicamente se dejo calentar a temperatura ambiente y se reconstituye en una solucion acuosa esteril.

[0105] Tal como se utiliza aqrn, el termino "pirogenos" se refiere a partroulas infecciosas, tal como un virus, un prion, una endotoxina y/o una exotoxina, que puede infectar o propagar en celulas de un organismo biologico.

[0106] El paciente puede estar situado lateralmente y doblado hacia adelante y la aguja o canula se puede colocar selectivamente en el nucleo pulposo bajo la grna, por ejemplo, la exploracion, la resonancia magnetica, la tomograffa, la nanotecnologfa, video digital y/o rayos X, o por cualquier otra tecnica conocida en la tecnica.

[0107] Los ejemplos no limitativos de agentes de grna son colorantes no toxicos organicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. Si el espectro del agente de guiado no es visible para el ojo humano el agente puede ser detectado por un equipo apropiado.

[0108] Una vez que se verifica la ubicacion, la solucion de enzimas proteolfticas se pueden aplicar por ejemplo por inyeccion en el area lesionada con el fin de degradar la totalidad o una parte del tejido de nucleo pulposo. El tejido digerido se puede aspirar y se coloca en un tubo. El medio de crecimiento tal como el medio F 12 DMEM/Ham se puede anadir a la suspension.

[0109] En otra realizacion, el tejido de nucleo pulposo se elimina usando una sonda de nucleotoma. El paciente puede ser posicionado lateralmente y doblado hacia adelante y la canula que contiene la sonda de nucleotoma se puede insertar bajo la grna como se especifica anteriormente. La sonda de nucleotoma tiene una punta redondeada que puede resecar y tejido del nucleo pulposo aspirado desde el disco lumbar. El tejido de nucleo pulposo recogido puede ser parcial o completamente digerido a 37°C con una solucion de enzima proteolftica capaz de tejido de cartftago degradante como se especifica anteriormente.

[0110] El VIPCC activado como se describe en el presente documento que puede curar in vivo puede administrarse con las celulas de nucleo pulposo cosechadas, proporcionando de este modo una construccion eficaz en la que las celulas inyectadas pueden crecer en un modo tridimensional.

[0111] En el caso de que celulas de nucleo pulposo se tratan con la enzima proteolftica, antes del procedimiento de administracion, la solucion de enzima proteolftica puede ser vaciada de celulas y/o tejidos de nucleo pulposo disociados mediante la adicion de una cantidad eficaz de inactivadores y/o la eliminacion de las enzimas proteolfticas por centrifugacion y descartando la fase sobrenadante, o por cualquier otro metodo conocido en la tecnica.

[0112] Las celulas de nucleo pulposo cosechadas desasociadas pueden ser congeladas en nitrogeno ftquido y se almacenan a -80°C hasta su uso.

[0113] Por otra parte, el metodo de la descripcion puede incluir, sin excluir otras posibilidades, autologas, alogenicas, xenogenicas y/o celulas portadoras de ADN recombinante. El termino "celulas autologas" se refiere a celulas derivadas originalmente de la misma persona a la que van a ser reimplantadas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0114] El termino "celulas alogenicas" se refieren a celulas obtenidas a partir del cuerpo de un donante de la misma especie.

[0115] Celulas "xenogenicas" son las aisladas de individuos de otra especie.

[0116] Las celulas inyectadas pueden comprender una composicion de celulas que comprende celulas seleccionadas a partir de celulas derivadas de notocorda.

[0117] Por lo tanto, el crioprecipitado, como se describe en el presente documento se pueden administrar en el disco, opcionalmente con celulas derivadas de notocorda, tales como celulas de nucleo pulposo.

[0118] La poblacion de celulas puede comprender ademas celulas de anillo fibroso (por ejemplo, de cadaver).

[0119] En una realizacion de la divulgacion, las celulas inyectadas son celulas de nucleo pulposo. En una realizacion adicional de la divulgacion, las celulas son de origen autologo. En otra realizacion adicional de la descripcion, la eliminacion de nucleo pulposo autologo, y los pasos de suministro de celulas o re-implantacion se realizan dentro del mismo procedimiento quirurgico.

[0120] Las celulas que se entregaran en la columna vertebral lesionada pueden ser incluidas en el componente activador por ejemplo, trombina, en el componente de crioprecipitado, y/o pueden estar en un componente separado.

[0121] De acuerdo con una realizacion de la descripcion, las celulas a administrarse en la columna vertebral lesionada puede ser cultivada ex vivo antes del procedimiento de administracion en un crioprecipitado que comprende una fibronectina: relacion de fibrinogeno de 1:10 a 1:5. Sin embargo, en otra realizacion de la invencion, el crioprecipitado contiene una fibronectina: concentracion relativa de fibrinogeno de 1:10 a 1:7. Sin embargo, en otra forma de realizacion adicional de la invencion, la relacion de fibronectina:fibrinogeno es de aproximadamente 1:7.

[0122] Las celulas cultivadas ex-vivo se pueden cultivar en crioprecipitado activado y/o no activado. El procedimiento de activacion se puede lograr mediante la mezcla de dicho crioprecipitado con una enzima que es capaz de reaccionar con el fibrinogeno para formar fibrina. En una realizacion de la invencion, la enzima es la trombina y se anade en un volumen equivalente al crioprecipitado. En otra realizacion de la invencion, la enzima es una solucion obtenible a partir de veneno de serpiente. La trombina se puede aislar a partir de plasma de los seres humanos o de mairnferos y/o preparado por metodos recombinantes. El crioprecipitado de la invencion y/o de la enzima capaz de formar fibrina puede ser suministrado como una solucion o en una forma solida, por ejemplo como un polvo liofilizado. La solucion puede estar en estado de congelacion.

[0123] Como se usa en el presente documento, cultivo de celulas "ex-vivo" se refiere al cultivo de celulas fuera del cuerpo. El cultivo de celulas ex vivo incluye el cultivo de celulas in vitro, por ejemplo, en suspension, o en placas individuales o de multiples pocillos. Cultivo ex-vivo tambien incluye celulas co-cultivo con diferentes tipos de celulas, y se cultiva en o sobre matrices de dos o tres dimensiones.

[0124] Tambien se describe en el presente documento un kit para uso en el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion tal como, por un disco intervertebral degenerativo. El kit comprende un primer recipiente que comprende un VIPCC como se describe aqrn, y un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinogeno. De acuerdo con la invencion el acido tranexamico y aprotinina bovina pueden estar ausentes del kit.

[0125] En una realizacion, VIPCC en el que plasminogeno y plasmina se han reducido a igual o menor que 15 pg/ml como por ejemplo 5 pg/ml o menos se utiliza.

[0126] En otra realizacion, el kit esta dirigido para administrar soluciones terapeuticas en el tratamiento de emergencia de la lesion de la columna y el cable u otro mitigacion de los axones lesionados en un sistema nervioso central lesionado.

[0127] El kit puede comprender tambien un agente de contraste, por ejemplo, con el fin de localizar el sitio de la administracion y para mejorar la formacion de imagenes. El agente de contraste puede ser incluido en el envase que comprende el componente de crioprecipitado, en el recipiente que comprende el componente de enzima y/o en un recipiente separado. En una realizacion de la invencion, el agente de contraste se formula con el crioprecipitado. En otra realizacion de la invencion, el agente de contraste se formula con la enzima capaz de formar fibrina. Ejemplos de agentes de contraste incluyen, pero no se limitan a, colorantes organicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste se puede seleccionar de diversos agentes no toxicos, tales como yodo. Las tecnicas que pueden usarse para detectar el agente de contraste incluyen la exploracion, imagenes de resonancia magnetica, tomograffa, la nanotecnologfa, video digital, de rayos X o cualquier otra tecnica conocida en la tecnica. Si el espectro del agente de visualizacion no es visible para el ojo humano el agente puede ser detectado por un equipo apropiado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0128] La invencion se refiere a un kit que comprende: un primer recipiente que comprende un VIPCC como se describe aqrn, un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinogeno, y un tercer recipiente que comprende una enzima proteolftica capaz de degradar extracelular matriz tales como enzimas proteolfticas capaces de tejido de cartftago degradantes seleccionado del grupo que consiste en serina peptidasas, peptidasas de cistema, peptidasas asparticas, peptidasas de metalo, hialuronidasa y combinaciones de los mismos

[0129] En una realizacion de la invencion, la enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste en tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica, quimopapama papama, pepsina; colagenasa, gelatinasa, condroitinasa pronasa, hialuronidase y/o materiales qrnmicos alternativos que degradanan el material del disco de la misma manera o similar, y combinaciones de los mismos. El kit tambien puede comprender un agente de contraste, por ejemplo, yodo, como se describe anteriormente.

[0130] El crioprecipitado y/o la enzima capaz de formar fibrina y/o la enzima proteolftica y/o el agente de contraste se pueden proporcionar en la vertebra espinal y los kits de reconstruccion del sistema nervioso central como una solucion y/o en una forma solida, por ejemplo, como polvo liofilizado. La solucion puede estar en estado de congelacion. Los kits pueden comprender instrucciones para su uso. Los kits tambien pueden comprender una aguja tal como una aguja espinal incluyendo por ejemplo una aguja espinal curvada. Una canula espinal puede ser usada alternativamente. Una jeringa de doble o una de varios barriles u otro dispositivo de suministro de selladores de fibrina se puede incluir en el kit.

[0131] Tambien se describe aqrn un andamio adecuado para uso en el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion tal como para la regeneracion del disco intervertebral espinal y el sistema nervioso central. El andamio se prepara utilizando un crioprecipitado como se describe en este documento y un compuesto activador. La composicion VlPCC puede no contener acido tranexamico y/o aprotinina bovina.

[0132] Los componentes de los kits de reconstruccion columna vertebral, o formulaciones, pueden ser en receptores separados tales como jeringas que se pueden aplicar en cualquier orden, por ejemplo, los componentes se pueden aplicar simultaneamente o uno despues del otro y un andamio se forma cuando se mezclan los componentes.

[0133] En una realizacion de la invencion, los receptores separados se pueden configurar para la aplicacion de dicho crioprecipitado, una enzima capaz de formar fibrina y celulas derivadas de notocordiol. En otra realizacion de la invencion, las celulas derivadas de notocordiol se pueden combinar con dicho crioprecipitado y/o con la enzima capaz de formar fibrina antes de mezclarse los componentes.

[0134] Segun la invencion, los componentes del kit se pueden proporcionar como una solucion y/o en una forma solida. La solucion puede estar en estado de congelacion.

[0135] Otro objeto de la invencion es el establecimiento de un banco de tejidos o de celulas de las celulas derivadas de notocordio cultivadas en un andamio como se especifica anteriormente.

[0136] En una realizacion, el banco de tejidos o de celulas se pueden utilizar en la reparacion y/o regeneracion del disco intravertebral y la reconstruccion del sistema nervioso central. En una realizacion, las celulas derivadas de notocordio son celulas de nucleo pulposo.

[0137] El tejido o el banco de celulas puede comprender autologo, alogenico, xenogenico y/o celulas que albergan el ADN recombinante.

[0138] Como se usa en este documento, "tejido o banco de celulas" se refiere a un banco de tejidos o de celulas desarrollado por un metodo que permita el establecimiento de celulas derivadas de notocordiol adecuadas para la reparacion, regeneracion y/o sustitucion de la columna vertebral danada, por ejemplo, tejido del disco intravertebral y tejido del sistema nervioso central, tales como axones y neuronas motoras. Las celulas en dicho banco de tejidos o de celulas puede mantener sus caractensticas, por ejemplo, propiedades bioqmmicas, morfologicas y/o ffsicas, necesarias para realizar la funcion especializada. Ventajosamente, las celulas tienen la capacidad de proliferar y/o diferenciarse en celulas de nucleo pulposo en dos construcciones de dos o tres dimensiones.

[0139] Tambien se describe aqrn un vetftculo que puede usarse ventajosamente para la entrega de una composicion de celulas que comprenden celulas derivadas de notocordiol en una columna vertebral danada como disco intervertebral danado y el tejido del sistema nervioso central porque el crioprecipitado, como se describe en el presente documento proporciona un andamio adecuado sobre el cual las celulas derivadas de notocordial pueden adjuntar, migrar, crecen, dividir, mantener su funcion, morfologfa y/o diferenciarse. El vetftculo o construccion comprende crioprecipitado como se describe en este documento y las celulas derivadas de notocordiol. El acido tranexamico y aprotinina bovina pueden ser excluidos de la composicion de crioprecipitado. En una realizacion de la invencion, las celulas derivadas de notocordiol son celulas de nucleo pulposo. El vetftculo de suministro celular puede comprender ademas celulas de anillo fibroso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0140] El termino "vefuculo" se refiere a un medio para la entrega de las celulas en un tejido espedfico in vivo. Las celulas viables se incorporan en el vedculo de suministro de celulas y se administran en la columna vertebral danada como disco intervertebral o del sistema nervioso central que permite la reconstitucion, reparacion o restauracion del sitio danado. El dispositivo de administracion de celulas puede estar en un estado lfquido o como un constructo de curado.

[0141] Las celulas pueden ser autologas, alogenicas, xenogenicas y/o celulas que albergan ADN recombinante. Las celulas cultivadas en monocapa de disco tienden a des-diferenciar y perder su fenotipo celular tipico (Benya y Shaffer "Dedifferentiated condrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels" Cell 1982; 30: 215-224. De acuerdo con la invencion se ha encontrado que las celulas de anillo fibroso y las celulas derivadas de notocordiol, por ejemplo, nucleo pulposo cultivadas en crioprecipitado descritas aqrn mantienen su fenotipo y proporcionan una matriz que puede ser utilizada en una expansion in vitro y in vivo para la cirugfa reconstructiva del cartflago intervertebral y sistema nervioso central. Se encontro de acuerdo con la presente invencion que VIPCC tiene componentes celulas conductoras de condro que estimulan la fijacion y proliferacion del anillo fibroso y las celulas de nucleo pulposo sembradas en placa de cultivo recubierta con VIPCC. Los resultados segun la invencion muestran que cambios no morfologicos detectables o danos se hicieron durante sub-cultivo o tripsinizacion. Por otra parte, a pesar de que las celulas migraron a traves de la placa de cultivo, se observo una fijacion diferencial a VIPCC y se observo la fibronectina. Los resultados demuestran que la fibronectina, reconocida como un agente que promueve la adhesion celular, es un componente fundamental en el VIPCC y tiene que estar en una relacion espedfica con el fibrinogeno para facilitar la fijacion y proliferacion de condrocitos de nucleo pulposo.

[0142] Por lo tanto, tambien se describe aqrn un metodo para facilitar el crecimiento, la proliferacion, diferenciacion y/o mantenimiento de las celulas derivadas de notocordio que comprende la puesta en contacto de la poblacion de celulas de las celulas derivadas de notocordio con el VIPCC descrita en este documento. Sin embargo, en otra realizacion de la invencion, las celulas derivadas de la notocorda son celulas de nucleo pulposo. La puesta en contacto del nucleo pulposo con el crioprecipitado se puede llevar ex vivo y/o in vivo.

[0143] El VIPCC puede ser activado o no activado. Las celulas puestas en contacto pueden ser autologas, alogenicas, xenogenicas y/o celulas que albergan el ADN recombinante.

[0144] El crioprecipitado descrito en este documento puede tener capacidades conductoras e inductivas.

[0145] La capacidad conductiva o inductiva de dicho crioprecipitado descrito en este documento puede ser determinado despues del uso del crioprecipitado y por consiguiente evaluar la mejora de la adherencia, la migracion, la proliferacion y/o diferenciacion del anillo fibroso y las celulas derivadas de notocordio se cultivaron, por ejemplo, celulas de nucleo pulposo. Las evaluaciones de estas propiedades se llevan a cabo por cualquier tecnica conocida en la tecnica, por ejemplo, la proliferacion mediante el uso de un haemocitometro o por tincion con hematoxilina y eosina, la diferenciacion, mediante la medicion de la expresion de sulfato de condroitina, la migracion mediante el uso de prueba de migracion como se ejemplifica a continuacion.

[0146] Tal como se utiliza aqrn, el termino "conductor" se refiere a la capacidad del crioprecipitado activado para servir como un andamio en el que las celulas espedficas se pueden unir, crecer, migrar, proliferar y/o diferenciar, incluyendo "condro-conductor" o " neuro-conductor ", etc.

[0147] Tal como se utiliza aqrn, el termino "inductivo" se refiere a la capacidad del crioprecipitado para estimular las celulas espedficas para unir, crecer, migrar, proliferar y/o diferenciar, incluyendo "condro-inductivo", o "neuro- inductivo", etc.

[0148] Otro termino usado para "conductor" es "quimiotactica". El termino "quimiotactica" se refiere a las respuestas fisiologicas que resultan en un movimiento caractenstico o la orientacion de las celulas hacia un estfmulo qrnmico.

[0149] Una inyeccion intradiscal o intratecal puede resultar en un cambio en la estructura tfpica de la poblacion de nucleo pulposo por ejemplo dano necrotico, nucleos picnoticos y cariolisis. Se encontro segun la invencion, que este problema puede ser resuelto o disminuido mediante la inclusion del crioprecipitado descrito aqrn en la formulacion para administrarse a la columna lesionada, por ejemplo, degenerativa del disco y el sistema nervioso central lesionado.

[0150] El kit, la formulacion, el andamio, el banco de tejidos o de celulas y/o el vedculo, puede comprender uno o mas aditivos tales como, pero no limitado a: factores bioqdmicos que soportan la expansion de las celulas mientras se mantiene su compromiso de diferenciar los agentes terapeuticos (tales como antibioticos, antiinflamatorios), analgesicos, farmacos anti-tumorales, factores de crecimiento, protemas, hormonas, factores inductores de cartflago, proteoglicanos tales como agrecano, colageno de tipo I y II, los componentes que contienen oxfgeno, enzimas y similares.

[0151] Uno o mas de estos componentes pueden estar incluidos en el componente de crioprecipitado, en el componente activador por ejemplo, la trombina, y/o puede estar en un componente separado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0152] El kit, la formulacion, el andamio, el banco de tejidos o de celulas y/o el vetuculo para administrate a un sujeto en necesidad de la reconstitucion del sistema nervioso central puede comprender inhibidores de Rho quinasa tales como, por ejemplo, Cethrin®, Y-27632, C3, etc.

[0153] Tambien se describe aqm un metodo para tratar una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion como disco intervertebral y enfermedad del sistema nervioso central que comprende la administracion a un sujeto en necesidad de un kit, un VIPCC, las celulas de un banco de tejidos o de celulas y/o un vetuculo.

[0154] Tambien se describe aqm un concentrado de crioprecipitado inactivado de plasma viral activo para su uso en el tratamiento de una enfermedad de la columna, trastorno o afeccion. Aprotinina bovina esta ausente de la composicion de crioprecipitado. En una realizacion, dicho crioprecipitado comprende una fibronectina inicial: concentracion relativa de fibrinogeno de 1:10 a 1:5, o de 1:10 a 1:7.

[0155] El crioprecipitado puede ser utilizado para el tratamiento de una enfermedad del disco intervertebral, trastorno o afeccion, o un SNC lesionado.

[0156] Se constato de acuerdo con la invencion que VIPCC activado restauro sustancialmente la altura IVD en comparacion con discos inyectados PBS. Por lo tanto, el VIPCC activado descrito en este documento puede funcionar como matriz o dispositivo con propiedades mecanicas adecuadas que puede servir ventajosamente para restaurar sustancialmente la estructura normal del disco, la altura y permitir retencion de espacio de disco bajo carga.

[0157] Por lo tanto, tambien se describe aqm VIPCC como se describe aqm para su uso en la elevacion o la restauracion de la altura del disco intervertebral. Por ejemplo, VIPCC activado como se describe en el presente documento se puede inyectar en disco negro para restablecer la altura del disco. En las primeras etapas de la degeneracion del disco, cuando las celulas de nucleo pulposo estan todavfa presentes en el disco, como se describe aqm VIPCC elevara ventajosamente la altura del disco y servir como andamiaje para las celulas de nucleo pulposo. En este caso el acido tranexamico y aprotinina bovina estan ausentes del concentrado de crioprecipitado.

[0158] En una realizacion, dicho crioprecipitado comprende una fibronectina inicial: concentracion relativa de fibrinogeno de 1:10 a 1:5, o de 1:10 a 1:7 tal como en la relacion de aproximadamente 1:7.

[0159] El kit, formulacion, banco de tejidos o de celulas y/o vehfculo para prevenir y/o tratar la columna lesionada puede incluir opcionalmente celulas autologas, alogenicas, xenogenicas de anillo fibroso y/o celulas de anillo fibroso que albergan ADN recombinante.

[0160] La revelacion de rangos en la descripcion de la invencion se entiende facilmente por el experto en la materia. Esto significa que la divulgacion de valores continuos y figuras entre los lfmites de los intervalos, incluyendo las figuras y valores lfmite. Por ejemplo, si una gama se da desde 1:11 a 1:5, se quiere decir al menos 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6 y/o 1:5 con todas las combinaciones de intervalos de sub intermedios como 1:11 y 1:10, 1:11 a 1:9, 1:11 a 1:8, 1:11 a 1:7, 1:11 a 1:6 , 1:11 a 1:5 o 1:10 a 1:9, 1:10 a 1:8, 1:10 a 1:7, 1:10 a 1:6, 1:10 a 1:5, etc.

[0161] Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Preparacion de anillo fibroso y condrocitos de nucleo pulposo.

[0162] Este ejemplo ilustra la preparacion de un cultivo celular de condrocitos. La columna lumbar de cerdo (L1-L6) se aislo 12 horas despues de masacre (transportado a 4°C), se esterilizo con scrab septal durante 10 minutos y se empapo en 70% de etanol durante 5 minutos. El musculo y otros tejidos conectivos se retiraron y cada cuerpo vertebral se disecciono en el medio de manera que se pudieron obtener los discos intervertebrales (DIV) aislados. Los IVDs aislados se sumergieron en el cilindro graduado que contiene PBS con 200 |jg de azida de sodio/ml durante unos segundos. Seguido por inmersion en PBS esteril que contiene 10 U/ml penecillin, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2,5 jg/ml anfotericina, 50 jg/ml de gentamicina, 10 jg/ml de vancomicina, 65,6 jg/ml de cefalosporina y 10% de suero bovino fetal (FBS). Las muestras se transfirieron entonces a un flujo laminar esteril y el procedimiento restante se realizo en condiciones esteriles.

[0163] Cada IVD se corto por la mitad usando un escalpelo y el tejido del nucleo pulposo se separo cuidadosamente y se coloco en una placa de cultivo celular 97 mm. El tejido de nucleo pulposo se enjuago tres veces en PBS suplementado con los antibioticos y FBS mencionados anteriormente para eliminar los residuos. A continuacion, el tejido de nucleo pulposo se sometio a digestion suave (durante 3 horas) mediante una solucion de colagenasa (Sigma cat n° C-6885; 3 mg/ml en mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 de Ham (Industrias Biologicas) suplementado

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

con 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 0,25 pg/ml anfotericina, 100 mg/pl de gentamicina, 1 0 |jg/ml de vancomicina y 6,56 pg/ml de cefalosporina) durante 3 horas a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2

[0164] Antes del procedimiento de digestion la solucion de colagenasa se transfiere a traves de filtro de 0,45 pm (Millipore SLHV033RS).

[0165] El tejido digerido se filtra a traves de gasa esteril y se centrifugo a 800g durante 5 minutos. Despues de la centrifugacion, la fase sobrenadante se descarto y las celulas se resuspendieron en 2 ml de DMEM/F12 de Ham suplementado con 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 0,25 pg/ml anfotericina, 100 mg/pl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina y 6,56 pg/ml de cefalosporina.

[0166] El tejido del anillo fibroso se elimino de las IVDs abiertas, colocadas en una placa de cultivo celular 97 mm y se lavo dos veces en PBS que contema 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2,5 pg/ml de anfotericina, 50 pg/gl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina, 65,6 pg/ml de cefalosporina y 10% de FBS. El tejido del anillo fibroso se desmenuzo en pedazos pequenos (3-5 mm) utilizando un bistun. El tejido picado se incubo durante la noche a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2. Despues de la incubacion, el tejido fue digerido con una solucion de colagenasa (preparada como se ha mencionado anteriormente) en 5% de CO2 a 37°C durante 5 horas. Despues de completarse la digestion, la suspension celular se transfiere a traves de una gasa esteril. Despues, la suspension se centrifugo a 800g durante 5 minutos y el sedimento que contiene los condrocitos de anillo fibroso se resuspendieron en 2 ml de medio fresco DMEM/F12 de Ham (complementado como se menciono anteriormente).

Ejemplo 2

Efecto de la trombina, concentrado de crioprecipitado viral en plasma inactivado (VIPCC) y componentes de los mismos sobre la union celular de anillo fibroso y la proliferacion.

[0167] El siguiente ejemplo se llevo a cabo con el fin de investigar el efecto de la trombina, VIPCC, y componentes de los mismos en el anillo fibroso de celulas de union, la proliferacion y la quimiotaxis. Para este proposito, una placa de cultivo de plastico 97 mm se revistio a la circunferencia con 80 pl de las siguientes soluciones: VIPCC (BAC; Omrix, IL; preparado como se describe en el documento EP-B-534178, en el que la plasmina (plasminogeno) como se describe en el documento EP-B-1390485); fibrinogeno humano purificado (Enzyme Research; n° de cat FIB1 2800L); trombina (Omrix, IL; preparado como se describe en el documento US-B-5.143.838 y en el documento EP- B-378.798); y albumina de suero humano (Sigma; n° de cat A7030) vease fig. 1. Cada solucion contema 5-20 pg/ml de protema total. Las diluciones se realizaron en solucion salina. El contenido de fibrinogeno en el revestimiento de

fibrinogeno purificado y en el revestimiento VIPCC era de aproximadamente 8 pg. Las soluciones se dejaron secar

6

en un flujo laminar en condiciones esteriles. Posteriormente, 150 pl de celulas de anillo fibroso (5x10 se colocaron) suspendidas en medio de crecimiento (DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibioticos mencionados anteriormente y 10% de FBS) en el centro del plato (Fig. 1 Origen), el plato se cubrio y se incubo durante la noche a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2. Despues de la incubacion, el medio se desecha y se reemplaza por 10 ml de medio de crecimiento (DMEM/medio F12 de Ham suplementado con antibioticos y 10% de FBS), y la placa de cultivo se incubo durante 14 dfas adicionales.

[0168] Evaluaciones histologicas de los dos cultivos dimensionales anteriores se llevaron a cabo mediante el metodo de tincion con hematoxilina y eosina. Brevemente, los cultivos de condrocitos se fijaron con 95% de etanol durante 15 minutos, se lavaron en H2O y se expusieron a solucion de hematoxilina Gill NR1 (Sigma; n° de cat GHS116) durante 3 minutos. A continuacion, los cultivos se lavaron en H2O, contrarrestar en tenido con eosina Y (Sigma; n° de cat E4382) durante 30 segundos y se enjuago en 95% de etanol y H2O. Despues, las celulas se lavaron en H2O tres veces y se analizaron macroscopicamente y microscopicamente. Como se ve en la Fig. 1, las celulas de anillo fibroso sembradas en el centro de una placa de cultivo migraron de manera uniforme a traves de todo el campo, pero mostraron mejor fijacion y proliferacion en los puntos revestidos que comprenden VIPCC en comparacion con placas sin recubrir o fibrinogeno humano, trombina, o puntos recubiertos de albumina de suero humano. Los resultados indican que VIPCC tiene componentes condro-conductores que estimula la union celular de anillo fibroso y la proliferacion y puede facilitarse en la reconstruccion de disco intervertebral degenerativo.

Ejemplo 3:

Efecto del procedimiento de tratamiento con tripsina y/o pasaje en VIPCC mediada por la union de celulas de anillo fibroso y la proliferacion.

[0169] El numero de pasaje se refiere a la "edad" de una lmea celular o el numero de veces que las celulas han sido subcultivadas. Algunas lmeas de celulas pueden presentar cambios morfologicos despues de pasajes. Ademas, los procedimientos de cultivo celular utilizados para el subcultivo, tales como tripsinizacion, pueden danar las membranas celulares que resultan en mal agarre, la formacion de grumos o de las membranas de aspecto "irregular". El presente estudio tuvo como objetivo determinar los efectos del tratamiento con tripsina y/o pasaje en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

union de celulas de condrocitos de anillo fibroso mediadas por VIPCC y proliferacion. Para este proposito, los condrocitos derivados del anillo fibroso (como se describe en el Ejemplo 1) fueron aislados y 500 jl que contiene 0,625 X 105 celulas se colocaron en un pocillo de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento. El cultivo se incubo durante 11 dfas en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37°C. Despues de la incubacion, las celulas se disociaron enzimaticamente mediante la adicion de 100 jl de tripsina (tripsina-EDTA Biological Industries, 03-050- 1A) a cada pocillo a 37°C durante 5 minutos. Los condrocitos disociados se obtuvieron de tres pozos en un vial y la suspension celular se centrifugo a 800g durante 5 minutos. La fase sobrenadante se descarto, las celulas se resuspendieron en 200 jl DMEM/medio F12 de Ham (suplementado con antibioticos y 10% de FBS) y se colocan en el centro de una placa de cultivo de plastico de 97 mm recubierta en la circunferencia con gotas de 80 jl de las siguientes soluciones: VIPCC que contienen 6,4 jg de protema total (de la que 4,7 jg es fibrinogeno), 3 jg de fibrinogeno humano purificado, 0,18 jg fibronectina (producido de acuerdo con Miekka et al "Rapid methods for isolation of human plasma fibronectin". Thromb Res 1982; 27: 1-14.), y una mezcla de fibronectina purificada/fibrinogeno humano en una concentracion de 0,3:2,7 jg, respectivamente (relacion aproximada de 1:10). El cultivo se incubo en 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas, se lavaron dos veces en un medio de crecimiento para eliminar las celulas no unidas, y se anadio 10 ml de DMEM/ medio de F12 de Ham (suplementado con antibioticos y 10% de FBS). Los cultivos se incubaron durante 9 dfas adicionales. La evaluacion morfologica se realizo mediante tincion de las celulas con las soluciones de hematoxilina y eosina, seguidas por observacion macroscopica y microscopica.

[0170] Los resultados muestran que el sub-cultivo o procedimiento de tripsinizacion no da lugar a ningun cambio morfologico de las celulas de anillo fibroso. Por otra parte, es evidente que las celulas migran a traves de la placa de cultivo, pero se observo una union diferencial a la capa VIPCC y fibronectina (Fig. 2). Los resultados demuestran que la fibronectina, reconocida como agente que promueve la adhesion celular, es un componente fundamental en el VIPCC que estimula la fijacion y proliferacion de celulas de condrocitos.

Ejemplo 4:

Efecto de fibrinogeno: relacion de fibronectina en anillo fibroso y union celular de nucleo pulposo y proliferacion.

[0171] El ejemplo anterior ilustra el papel de la fibronectina presente en el componente VIPCC en la estimulacion de la migracion, la proliferacion y la fijacion de los condrocitos de anillo fibroso. El presente experimento se diseno para investigar el efecto de diferentes relaciones de fibronectina: las mezclas de fibrinogeno en fijacion y proliferacion de celulas de nucleo pulposo y condrocitos de anillo fibroso. Para este proposito, un pocillo de una placa de veinticuatro pocillos se recubrio con 200 jl de uno de los siguientes componentes: 0,626 jg de fibronectina purificada; 10 jg de fibrinogeno humano purificado (FGN); o con una mezcla de fibrinogeno y fibronectina en la siguiente concentracion: 0,626 jg: 3,13 jg, 0,626 jg: 6,26 jg, o 0,626 jg: 12,52 jg (proporciones de 1:5, 1:10 y 1:20, respectivamente). Por lo tanto, en los componentes la cantidad de fibronectina se mantuvo constante, mientras que se incrementa la cantidad de fibronectina.

[0172] Las soluciones se dejaron adherir a los pocillos en un flujo laminar en condiciones esteriles. Despues de 3 horas, el exceso de solucion se elimino y la placa se volvio del reves durante 2 horas adicionales de incubacion para permitir el secado. 500 jl de celulas de nucleo pulposo o anillo fibroso recien aisladas se suspendieron en medio DMEM/F12 de Ham (suplementado con los antibioticos mencionados anteriormente y 10% de FBS) y se sembraron en los pocillos recubiertos de arriba a una concentracion de 6 X 104 celulas por pocillo. Los cultivos se incubaron en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37°C durante 5 y 12 dfas.

[0173] Evaluaciones histologicas de los cultivos de dos dimensiones anteriores se llevaron a cabo despues de 5 y 12 dfas in vitro. Los condrocitos cultivados se fijaron y se expusieron a soluciones de hematoxilina y eosina Y, como se ha especificado anteriormente. Despues, el cultivo se tino con violeta cristal (1 g en 100 ml de acido acetico) durante 10 minutos y se lavo en H2O.

[0174] Con el fin de cuantificar el nivel de fijacion de las celulas, el color se extrajo de las celulas con 100 jl 70% de etanol durante 10 minutos. 75 jl de alfcuotas se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se midio la absorbancia en un espectrofotometro a una longitud de onda de 590 nm. La absorbancia de las celulas cultivadas en pocillos recubiertos de fibronectina se considero como la union de celulas de 100%.

[0175] Los resultados de nucleo pulposo y la fijacion de celulas de anillo fibroso despues de 5 dfas en cultivo sobre los diferentes revestimientos son presentados en las Figuras 3A y B, respectivamente. Sorprendentemente, se encontro que en contraste con la union de celulas de anillo fibroso, la union de celulas del nucleo pulposo se vio afectada por los diferentes revestimientos. Los resultados muestran que un aumento en la concentracion de fibrinogeno redujo significativamente la union de celulas de nucleo pulposo de una manera dependiente de dosis. Mientras que un aumento de la relacion de fibronectina:fibrinogeno llevan al resultado opuesto (Fig 3A), por ejemplo, una mezcla purificada de la fibronectina:fibrinogeno en una relacion de 1:5 mostro una mayor tasa de fijacion de las celulas del nucleo pulposo, en comparacion con mezclas purificadas en proporciones de 1:10 y 1:20 (Fig 3A). Estos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

resultados demuestran que fibronectina:fibrinogeno en una relacion de 1:5 es mas adecuada para la union por celulas y la proliferacion de celulas de nucleo pulposo de mezclas que comprenden una relacion inferior de fibronectina:fibrinogeno.

[0176] Estos resultados indican el papel clave de la relacion de fibronectina:fibrinogeno en la union de las celulas del nucleo pulposo y demostrar la ventaja de utilizar una relacion de alto nivel de fibronectina:fibrinogeno para las celulas de nucleo pulposo.

[0177] El efecto de VIPCC que contiene una fibronectina: se evaluo el fibrinogeno en una proporcion de 1:10 en el nucleo pulposo y la proliferacion celular de anillo fibroso: relacion de fibrinogeno en el intervalo de 1:10 a 1:5 y una mezcla purificada de la fibronectina . La proliferacion celular se calculo restando el porcentaje de celulas vinculado en dfa 5 a partir del porcentaje de celulas vinculado en dfa 12. Los resultados se basan en las mediciones llevadas a cabo en el experimento anterior. Los resultados se resumen en la Tabla 1 que muestra el porcentaje de celulas unido despues de 5 y 12 dfas de cultivo.

Tabla 1: El porcentaje de celulas vinculadas a nucleo pulposo y anillo fibroso en VIPCC y revestimientos de

mezcla de fibronectina/fibrinogeno (1/10).


: Una mezcla purificada de fn/fgn (1/10) VIPCC

: Dia del cultivo Celulas unidas (%)

Nucleo pulposo: 5 22 56

12: 14 77

Anillo fibroso: 5 65 62

12: 71 88

[0178] Los resultados de la Tabla 1 se presentan como porcentajes de celulas unidas en relacion con celulas unidas en el recubrimiento de la fibronectina en el mismo experimento (considerada como 100%).

[0179] Los resultados obtenidos indican que en el dfa 5 union de celulas del nucleo pulposo fue significativamente mas alta en recubrimiento de VIPCC en comparacion con una mezcla purificada de fibronectina:fibrinogeno en una relacion de 1:10 (union de las celulas 56% y 22% para VIPCC y la mezcla purificada, respectivamente) (Figura 3A y Tabla 1). Por el contrario, la union celular de los condrocitos de anillo fibroso era similar en ambos recubrimientos (union de celulas 62% y 65% para VIPCC y la mezcla purificada, respectivamente) (Fig. 3B y la Tabla 1).

[0180] Ademas de los resultados obtenidos en el dfa 12 se muestra que el cultivo de celulas de anillo fibroso sembro en recubrimiento VIPCC exhibio un aumento significativo en el numero de celulas (62 y 88% en el dfa 5 y 12, respectivamente; A = 26%) en comparacion con un revestimiento de mezcla purificada fibronectina:fibrinogeno (65 y 71% en el dfa 5 y 12, respectivamente; A = 6%). El cultivo de celulas de nucleo pulposo mostraba un efecto similar, aunque pronunciado. El recubrimiento VIPCC resulto en un incremento de 21% en numero celular (56 y 77% en el dfa 5 y 12, respectivamente), mientras que el revestimiento de mezcla de fibronectina:fibrinogeno resulto en una disminucion de celulas unidas (22 y 14% en el dfa 5 y 12, respectivamente; A = -8%). Estos resultados demuestran que la proliferacion de celulas de celulas de nucleo pulposo y anillo fibroso era mayor en un revestimiento VIPCC que en un revestimiento compuesto de la fibronectina purificada y la mezcla de fibrinogeno y que los condrocitos de nucleo pulposo fueron mas afectados por los diferentes revestimientos.

Ejemplo 5:

El efecto de VIPCC y mezclas de fibronectinafibrinogeno purificado en nucleo pulposo cultivado.

[0181] El efecto sobre la union de las celulas del nucleo pulposo y la viabilidad de las diferentes concentraciones de fibronectina y la mezcla de fibrinogeno se evaluo adicionalmente usando el ensayo de XTT. El ensayo se basa en la capacidad de celulas viables para reducir 2,3-Bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenilo)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT) a partir de una sal de tetrazolio amarilla a un compuesto de formazano de naranja soluble.

[0182] Se prepararon las celulas de nucleo pulposo usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Una parte inferior y placa plana 96 se recubrio con 30 jl de una de las siguientes soluciones: 0,626 |jg fibronectina purificada, 10 jg de fibrinogeno purificado humano, VIPCC diluida (contiene aproximadamente 1,57 jg fibronectina y 10 jg fibrinogeno), y la fibronectina/mezcla de fibrinogeno (0,626 jg: 6,26 jg; 1/10). Las soluciones se dejaron secar en un flujo laminar en condiciones esteriles y despues la suspension celular de 100 jl se dispenso en los pocillos

pre-recubiertos a una densidad de 1 X 104 celulas por pocillo. Pocillos no recubiertos sirvieron como grupo de control. Despues de un penodo de incubacion de 4 h, el medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibioticos mencionados anteriormente y 10% de FBS) se reemplazaron con medio fresco

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

para eliminar las celulas no unidas. Los cultivos se incubaron en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37°C durante 24 horas. Al final del periodo de incubacion, 50 pl del reactivo XTT (Kit de proliferacion de celulas XTT; Biological Industries; n° de cat 20-300-1000) se anadio a cada pocillo, y los cultivos se colocaron en una incubadora a 37°C durante 4 horas. El color desarrollado se leyo por un lector de espectrometna ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se desecho el sobrenadante y se anadio medio de crecimiento fresco. El ensayo se repitio 5 dfas mas tarde. La intensidad de la absorbancia es proporcional a la cantidad de celulas activas metabolicas. Los resultados se presentan como porcentaje de celulas activas metabolicas relativas a las celulas activas metabolicas en recubrimiento de fibronectina (100%).

[0183] Como se ve en la Fig. 4, el recubrimiento de fibrinogeno resulto en una disminucion significativa en el nivel de celulas activas metabolicas de nucleo pulposo en comparacion con recubrimiento de fibronectina (86,4 y 19,6% en el dfa 1 y 5, respectivamente; A = -66,8%). Un revestimiento VIPCC, que comprende el mismo contenido de fibrinogeno y una relacion de fibronectina:fibrinogeno en el intervalo de 1:5-1:10 y una mezcla purificada de fibronectina:fibrinogeno en una proporcion de 1:10 fueron capaces de mitigar la disminucion de celulas activas metabolicas observadas en el revestimiento de fibrinogeno. Este efecto fue especialmente pronunciado en el recubrimiento VIPCC. Estos resultados confirman los resultados anteriores y muestran las ventajas de utilizar VIPCC como un revestimiento para las celulas de nucleo pulposo en lugar de una mezcla pura de fibronectina/fibrinogeno. Por lo tanto, un andamio para la ingeniena de tejidos de nucleo pulposo preparado con VIPCC activado puede ser superior a los preparados con fibronectina/fibrinogeno activado puro.

Ejemplo 6:

Efecto de los niveles de fibronectina y fibrinogeno en el porcentaje de celulas de nucleo pulposo y anillo fibroso metabolicamente activas.

[0184] El presente estudio tuvo como objetivo determinar el efecto de los niveles de fibrinogeno y fibronectina en el porcentaje de celulas de nucleo pulposo y anillo fibroso cultivadas metabolicamente activas. Para este proposito, se prepararon celulas derivadas del nucleo pulposo y anillo fibroso como se describe en el Ejemplo 1. Una placa de fondo plano de 96 pocillos se recubrio con 30 pl de fibronectina/fibrinogeno-recubrimiento. El revestimiento se compone de una cantidad constante de fibronectina (0,626 pg) y cantidades crecientes de fibrinogeno purificado como sigue: 0,3.13 (una proporcion de 1:5), 6,26 (una proporcion de 1:10), 12,5 (una proporcion de 1:20) y 146 pg (una proporcion de 1:233). Otro conjunto de experimentos se realizaron en fibronectina/fibrinogeno de recubrimiento compuesto de una cantidad constante y alta de fibrinogeno (9,125 pg) y cantidades crecientes de fibronectina purificada como sigue: 0,0313 (una proporcion de 1:291), 0,042 (una proporcion de 1: 217), 0,0626 (una proporcion de 1:145) y 0,125 pg (una proporcion de 1:73).

[0185] Las soluciones se dejaron secar en un flujo laminar en condiciones esteriles y suspension celular de 100 pl (que contiene 1 X 104 celulas por pocillo para ambas preparaciones de celulas) se coloco en los pocillos.

[0186] El cultivo se incubo durante 4 h y el medio de crecimiento (DMEM/ medio F12 de Ham suplementado con los antibioticos mencionados anteriormente y 10% FBS) fue sustituido para eliminar las celulas no unidas. Los cultivos se incubaron durante 24 horas adicionales en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37°C. El efecto de fibrinogeno en la union celular se evaluo en los dfas 7, 10-13 y 16 mediante el ensayo XTT como se describe anteriormente. La intensidad de la absorbancia es proporcional a la cantidad de celulas activas metabolicas. Los resultados se presentan como porcentaje de la intensidad de absorbancia de fibronectina (100%). Los datos se presentan como media + S.D. de al menos tres experimentos separados (en cada experimento las celulas fueron cosechadas a partir de tres vertebras de cerdos diferentes).

[0187] La figura 5 muestra el porcentaje de celulas de nucleo pulposo metabolicas activas en una cantidad constante de fibronectina y el aumento de cantidades de fibrinogeno en la matriz de revestimiento (A) y en una cantidad constante y alta de fibrinogeno y el aumento de cantidades de fibronectina en la matriz de revestimiento (B). Los resultados en la Fig. 5A muestran que a una cantidad constante de la fibronectina, el aumento de las cantidades de fibrinogeno a la cabeza de revestimiento a una disminucion en el porcentaje de celulas activas de nucleo pulposo metabolicas. Celulas de anillo fibroso se vieron menos afectadas por la adicion de fibrinogeno (resultados de cultivos de condrocitos de anillo fibroso no se muestran). Cantidades aumentadas de fibronectina en presencia de una concentracion de fibrinogeno fija no mejoraron el porcentaje de las celulas de nucleo pulposo activas metabolicas. Ademas, los resultados estan en lmea con los resultados anteriores que indican que la relacion de fibronectina:fibrinogeno de aproximadamente 1:5 es mas adecuada para la union de las celulas de condrocitos de nucleo pulposo en comparacion con otras proporciones de fibronectina:fibrinogeno.

Ejemplo 7:

Efecto de una construccion tridimensional preparada con VIPCC activado en la morfologia y la funcion de los condrocitos cultivados en la construccion.

[0188] Los estudios (Haudenschild et al "Differential expression of multiple genes during articular condrocyte

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

redifferentiation" Anat Rec 2001; 263: 91-98; Li et al. "Condrocyte phenotype in engineered fibrous matrix is regulated by fiber size". Tissue Eng 2006; 12: 1775-1785; Peretti et al. "A biomechanical analysis of an engineered cell-scaffold implant for cartilage repair". Ann Plast Surg 2001; 46: 533-537) indican que la expansion de resultados de condrocitos in vitro en los cambios de fenotipo, y en una disminucion de la smtesis de proteoglicanos. Los ejemplos anteriores muestran que VIPCC tiene una relacion de fibronectina:fibrinogeno de aproximadamente 1:5 es mas adecuado para celulas de nucleo pulposo en crecimiento. Por lo tanto, el presente experimento fue dirigido para determinar la morfologfa de las celulas de condrocitos cultivados en una matriz tridimensional compuesta de VIPCC activado. Para este proposito, 750 pl de anillo fibroso o suspension de celulas de nucleo pulposo se preparo usando un VIPCC diluido en 5 veces, que contiene 14 mg/ml de fibrinogeno coagulable. Para activar el componente VIPCC y formar un coagulo, la suspension mencionada anteriormente se coloco de forma simultanea con un volumen equivalente de solucion de trombina (2 IU, Omrix biopharmaceuticals LTD, IL) en una placa de cultivo de placa de 6 pocillos. Una construccion de condrocitos tridimensional se formo, conteniendo 6 X 105 celulas por pocillo.

[0189] Despues de la formacion del coagulo del constructo celular se complemento con 0,5 ml de medio DMEM/F12 de Ham que contiene los antibioticos mencionados anteriormente y 10% de FBS. La placa se cultivo a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2. Despues de 12 horas, se retiro el medio y algunas de las construcciones se separan de la pared lateral usando un bistun con el fin de disminuir las condiciones de tension. Construcciones adjuntas, las cuales fueron consideradas como cultivadas bajo condiciones de alta tension, sirvieron como grupo de control. Los constructos se cultivaron en medio DMEM/F12 de Ham que contiene los antibioticos mencionados anteriormente y 10% de FBS y se incubaron durante otros 8 o 14 dfas, para anillo fibroso o nucleo pulposo, respectivamente. El medio se desecho y los cultivos se fijaron con solucion de paraformaldetudo al 3,7% durante 10 minutos, y se tineron con azul alciano (Sigma; n° de cat A5268) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tincion con azul alciano esta disenada para mostrar mucopolisacaridos o glicosaminoglicanos (GAG) producen caractensticamente por los condrocitos. El sulfato de condroitina, que pertenece a la familia de los GAG, se encuentra generalmente en forma de proteoglicanos, que comprende la sustancia fundamental en la matriz extracelular del tejido de cartflago.

[0190] Los resultados se resumen en la Fig. 6 y muestran la tincion con azul alciano tanto en el anillo fibroso (Fig. 6, panel superior) y condrocitos de nucleo pulposo (Fig. 6, panel inferior). Los resultados demuestran que tanto condrocitos de anillo fibroso como de nucleo pulposo son funcionales y capaces de fabricar el sulfato de condroitina. Los andamios independientes (Fig. 6B y D) exhiben fenotipo filamentoso y ramificado similar mientras que andamios adjuntos y mas tensos (Fig. 6A y C) asumen un fenotipo de esfera. Por lo tanto, los resultados demuestran que los condrocitos cultivados en un andamio tridimensional de VIPCC activado son funcionales y que la tension del andamio formada influye en la diferenciacion fenotfpica.

Ejemplo 8:

El efecto de diferentes formulaciones tridimensionales preparados con VIPCC activado en la capacidad condro-conductora del VIPCC.

[0191] El objetivo del presente experimento fue investigar el efecto de la formulacion sobre la caractenstica condro- conductora del VIPCC. La suspension de condrocitos de nucleo pulposo aislada se preparo usando tres soluciones de VIPCC diluido (1:2,5, 1:5, 1:10, que contema una concentracion final de 28, 14 y 7 mg/ml de fibrinogeno coagulable, respectivamente) en medio DMEM/F12 de ham que contema los antibioticos mencionados anteriormente. Despues, las suspensiones mencionadas anteriormente se mezclaron con un volumen equivalente de componente de trombina (1 UI/ml, se describe en US-B-6121232). El volumen final de las construcciones fueron 30, 60 o 90 pl con una dilucion VIPCC final de 1:5, 1:10 o 1:20 y de 0,5 UI de trombina/ml. Todas las diluciones conteman 1,6x105 celulas de nucleo pulposo. Cada mezcla se coloco en el centro de un pocillo de una placa de cultivo de placa de 24 pocillos. Despues se formo un coagulo, 200 pl de una mezcla compuesta de 0,5 trombina UI/ml y 20 veces VIPCC diluido, se anadio a la circunferencia. Despues de la formacion del coagulo (aproximadamente 30 minutos), 0,5 ml de medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con antibioticos y 10% de FBS) se anadio y la placa se incubo a 37°C en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 durante 22 dfas. La caractenstica condro-conductora del VIPCC se evaluo mediante la evaluacion de la capacidad de los condrocitos de nucleo pulposo para transmigrar a partir del constructo [(compuesto de diferentes diluciones de VIPCC y diferentes volumenes (30, 60 o 90 pl)] para el andamio periferico de VIPCc. Despues de 22 dfas de cultivo el medio se desecho y los cultivos se fijaron con solucion de paraformaldetudo al 3,7% durante 10 minutos, y se tineron con azul alciano durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mediante el control de la localizacion de las celulas en la placa se encontro que la transmigracion se produjo exclusivamente en los volumenes 60 pl de 10 veces VIPCC diluido activado (que contiene 7 mg/ml fibrinogeno coagulable) Fig. 7 muestra la transmigracion de los condrocitos de nucleo pulposo como se observa bajo el microscopio con una ampliacion de X100 en el volumen de 60 pl de 10 veces de VIPCc diluido activo (panel izquierdo; las celulas alinearon y formaron una estructura en forma de cinta) en comparacion con los condrocitos de nucleo pulposo en volumen de 30 pl de 20 veces de VIPCC activado diluido que no pudieron transmigrar (derecha). Ademas, los condrocitos en todos los grupos experimentales fueron capaces de proliferar en el constructo central y eran capaces de producir sulfato de condroitina (resultados no mostrados). Estos resultados muestran que los condrocitos de nucleo pulposo detectan un gradiente quimiotactico y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

transmigracion se produce solo en presencia de un gradiente qmmico.

Ejemplo 9:

Biocompatibilidad del VIPCC en la inyeccion de disco intervertebral.

[0192] El ejemplo anterior muestra que VIPCC es adecuado para su uso con celulas de nucleo pulposo. Por lo tanto, VIPCC se puede utilizar para el cultivo de celulas de nucleo pulposo ex-vivo o puede ser inyectado en el espacio de disco intervertebral para promover el crecimiento de las celulas de nucleo pulposo in vivo. El siguiente experimental fue disenado para investigar la biocompatibilidad de VIPCC de Omrix comercial activado por inyeccion en el espacio del disco intervertebral. Para este proposito, VIPCC y trombina se inyectaron en el disco intervertebral de un cerdo.

[0193] La cerda femenina (n = 1) con un peso de 74 kg y en la edad de 6 meses fue alojada en una instalacion autorizada de acuerdo con los requisitos eticos actuales. La anestesia fue inducida con una mezcla de ketamina intramuscular de (10 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg).

[0194] Una exploracion ffsica se llevo a cabo antes del procedimiento quirurgico (peso corporal, temperatura, frecuencia cardfaca y respiratoria). ECG, pulso y presion arterial se monitorizaron durante el procedimiento.

[0195] El procedimiento quirurgico: El animal fue colocado lateralmente y doblado hacia adelante. Un agente de contraste se utilizo y se sirve como una grna visual para localizar la cavidad IVD utilizando fluorograffa. El agente de contraste utilizado fue de yodo (0,37 g/ml de yodo; Tel Hashomer, IL). Las inyecciones se preformaron usando una jeringa conectada a aguja espinal 23G de 90 mm ("phoenix" Kobayashi Shoji K.K Tokio, Japon).

[0196] Con el fin de practicar el procedimiento de inyeccion, vertebrados toracicos IVDs 10-11 (T10 -T11) se llenaron con yodo diluido (1:1 con solucion salina).

[0197] Una vez que el procedimiento de inyeccion era satisfactorio, la secuencia de inyecciones IVD era la siguiente:

1. IVD L1-L2 y L3-L4 se inyecto a ~ 200-300 pl de solucion salina.

2. IVDs L2-L3 y L4-L5 fueron inyectados con VIPCC y trombina (descritos en US-B-7125569) aplicada

3. simultaneamente (cantidad similar en el volumen total de ~ 200-300 pl) utilizando un dispositivo de inyeccion Omrix para formar un gel solido.

[0198] Antes de cada inyeccion, una cantidad muy pequena (presente en la punta de la aguja) de agente de contraste diluido 1:10 se inyecto en el espacio IVD con el fin de verificar el sitio de aplicacion exacta (una pequena cantidad se inyecto de manera que suficiente espacio intradiscal se dejo por inyeccion activada por VIPCC).

[0199] La Fig. 8 muestra una imagen de control de fluorografia (A; solucion salina) y discos intervertebrales inyectados por VIPCC activado (B). El agente de contraste se volvio invisible en IVD inyectado por VIPCC activado.

[0200] Las fotograffas y grabaciones de video digitales fueron tomadas despues del procedimiento de inyeccion.

[0201] El cuidado post-operatorio: El animal recibio analgesicos no esteroides (30 mg/kg dipiron) y antibioticos (0,02 ml/kg marbocilo) durante los primeros 2 dfas despues de la operacion. El animal fue hospitalizado durante 14 dfas y una observacion de actividades ambulatorias (por ejemplo, de pie, caminando), patrones de beber y comer y caractensticas de comportamiento fueron monitoreadas. Durante el periodo de observacion los animales bebieron y comieron normalmente. En los primeros seis dfas, se mejoro la capacidad del animal para despertarse. El animal mostro la debilidad de las patas traseras y cruzo las piernas al caminar. Para el sexto dfa, el animal era capaz de caminar de manera constante. No se detecto la fiebre durante el pertado de observacion. En el dfa 13 el peso del animal fue de 77,5 kg (gano 4,5 kg).

[0202] La recogida de muestras: El animal fue sacrificado 14 dfas despues de la cirugfa y la columna lumbar se retiro para el analisis histologico.

[0203] La columna vertebral de madera aislada inyectada no mostro ningun signo de dano o inflamacion en el tejido circundante (Fig. 9).

[0204] Las muestras IVDs inyectadas fueron aisladas, de acuerdo con el procedimiento anterior (Ejemplo 1), y descalcificadas en 8% de acido formico hasta que el tejido era lo suficientemente suave para la evaluacion histologica.

[0205] Fig. 10 muestra control de solucion salina inyectado (A) y muestras IVDs descalcificadas (B) de VIPCC activado inyectado. Evaluaciones histologicas fueron hechas por tincion con hematoxilina y eosina de la region del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

nucleo pulposo. Control de solucion de salina inyectada IVD mostraron grupos de condrocitos con un dano necrotico tfpico, nucleos picnoticos y cariolisis (Fig. 11A, 13A). IVDs inyectados de VIPCC activado mostraron grupos de condrocitos viables en la region periferica con una estructura de citoplasma tfpicamente vacuolado (Fig. 11B, 13B). La region central del nucleo pulposo mostraba una coloracion intensa en comparacion con la region periferica en ambos grupos experimentales (Fig. 12A-control y inyecciones de VIPCC activado por B). En el grupo de control, las diferencias fueron mas pronunciadas. El color de baja intensidad en la region periferica indica una estructura normal con los racimos celulares dispersos, mientras que el color intenso presenta celulas necroticas. Los resultados arriba mostrados indican que la inyeccion con VIPCC activado no da ningun cambio estructural como resultado y conserva la estructura tfpica de los tejidos de los condrocitos.

Ejemplo 10:

Efecto de un andamio tridimensional preparado con VIPCC activado en la morfologia y la funcion de los condrocitos de nucleo pulposo en un iVd cultivo de organos ex-vivo.

[0206] El objetivo del experimento era el de determinar la morfologia y la funcionalidad de los condrocitos de nucleo pulposo cuando esta dispuesto en Omrix comercial de constructo de VIPCC activado dentro de una IVD aislada.

[0207] Dos espinas lumbares de cerdo (L1-L6) se utilizaron en este experimento, una para recoger celulas y la otra para la obtencion de los DIV separadas que carecen de tejido del nucleo pulposo.

[0208] La primera columna se esterilizo como se describe en el Ejemplo 1 y los cuerpos vertebrales fueron disecados en el medio de modo que se podfan obtener los discos intervertebrales aislados. A continuacion, las celulas se recogieron como sigue: 250 pl de solucion de digestion que contiene 6 mg/ml de colagenasa y 2 mg/ml de hialuronidasa en PBS (Sigma n° de cat C-6885 y H-2126, respectivamente) se inyecto en el tejido de nucleo pulposo usando una jeringa de 1 ml conectada a la aguja 16G. Los discos intravertebrales que contienen la solucion de digestion se incubaron a 37°durante 1 h. Despues del penodo de incubacion, se extrae el tejido del nucleo pulposo digerido y la viabilidad se evaluo usando el metodo de exclusion con colorante azul Trypan como sigue: 80 pl de solucion de azul de tripano (Sigma n° de cat T8154; 0,15% diluido en PBS) se mezclo con 20 pl de suspension de celulas y la viabilidad celular se midio usando un hemocitometro. La viabilidad celular se define por la relacion entre el numero de celulas viables para el numero total de celulas. En todos los experimentos la viabilidad es superior al 80%.

[0209] La segunda columna se corto en los organos mediados vertebrales con una sierra electrica para huesos y el tejido de nucleo pulposo se aspiro con fuerza (0,2 - 0,5 ml) a traves de una aguja 16G (sin el uso de enzimas proteolfticas) para obtener IVDs separadas que carecen de tejido del nucleo pulposo. Las celulas cosechadas anteriormente mencionadas (extrafdas por una solucion de digestion) se suspendieron en 20 veces VIPCC diluido

5

(en DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibioticos anteriormente mencionados) componente (5 x 10 celulas por ml) y se inyectaron simultaneamente con 1000 UI/ml solucion de trombina (igual cantidad en el volumen total de ~ 200-500 pl) en los IVDs que carecen de tejido del nucleo pulposo a traves de una aguja 16G unida a un dispositivo de inyeccion (Omrix, IL). Despues se formo un coagulo, los IVDs inyectados se colocaron en una plataforma de plastico dentro de una caja plastica prellenada de con 1 cm PBS que contiene antibioticos (0,2% PenStrep). De esta manera se proporciona un ambiente humedo (los IVD no teman contacto directo con el PBS).

[0210] Los IVDs inyectados por celulas se incubaron a 37°C durante 2, 3 o 6 dfas. IVDs incubados durante 1 hora sirvieron como grupo de control. Despues de la incubacion, los discos se partieron en dos usando un escalpelo y el contenido de area de nucleo pulposo se retiro y se fijo con solucion de formaldehudo al 3,7% durante al menos 24 horas. Este paso fue seguido por inmersion en PBS (10 minutos x 3 veces). Las muestras se deshidrataron en una serie ascendente de alcoholes, 70%, 85%, 95% y 3 veces con 100% de etanol (20 minutos cada lavado), seguido por lavado en histoclear (Gadot Biochemical Industries Ltd. n° de cat L80033240) tres veces durante 30 minutos cada uno. A continuacion, las muestras se colocaron en una mezcla 1:1 de histoclear y parafina y se calento en un horno a 60°C durante 1 hora x 2. Las muestras se sometieron entonces a las siguientes inmersiones de parafina: 2 horas a 60°C, durante la noche a 60°C y dos veces a 60°C durante 2 h. El tejido se incrusta en casetes de histologfa de plastico llenos de parafina caliente y se deja enfriar a 4°C.

[0211] Los tejidos integrados en parafina se seccionaron en serie a 8 pm de espesor y se tineron para el uso de sulfato de condroitina de azul alciano como se ha descrito anteriormente. Para la contratincion rojo rapido nuclear se utilizo (Sigma n° de cat 8002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0212] Fig. 14 muestra la morfologfa de las celulas de nucleo pulposo y la produccion de sulfato de condroitina de condrocitos dispuestos en tres andamios dimensionales formados de VIPCC diluido de 20 veces y mezcla de trombina dentro de los discos intervertebrales aislados. Una evaluacion histologica se realizo usando un microscopio de fluorescencia invertido 1 hora, 3 y 6 dfas despues del procedimiento de inyeccion.

[0213] El grupo de control no mostro ninguna expresion de sulfato de condroitina en las celulas que rodean el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ambiente (Fig. 14A). La expresion de sulfato de condroitina puede verse desde el tercer dla en adelante. En la tercer (Fig. 14 B) y sexto dla (no mostrado) despues de la inyeccion de una expresion significativa de sulfato de condroitina es evidente en todo el coagulo y alrededor de la celula. En el sexto dla un gran espacio se observo en la zona que rodea a la celula, al parecer como resultado de un aumento en el numero de celulas que conduce a la secrecion de enzimas proteollticas y, finalmente, a la lisis de la construction (no se muestra).

[0214] Ademas, los resultados demuestran que las celulas de condrocitos supone un fenotipo redondeado tlpico en el andamio 3D formado de VIPCC activado en todos los puntos de tiempo despues de la inyeccion (Fig. 14 B).

[0215] Estos resultados indican que el VIPCC activado apoya el crecimiento y la funcionalidad de la celula de nucleo pulposo que se inyecta dentro de los discos intervertebrales, permitiendo a las celulas mantener su ambito como la morfologla de tipo salvaje y para producir sulfato de condroitina.

Ejemplo 11:

Restauracion de la altura del disco intravertebral usando VIPCC activado inyectable.

[0216] El nucleo pulposo es capaz de resistir cargas de compresion y el anillo fibroso es resistente a la tension y da resistencia mecanica (Revell et al "Tissue engineered intervertebral disc repair in the pig using injectable polymers" J Mater LME Mater Med 2007; 18: 303-308). El siguiente ejemplo ilustra la capacidad de utilizar Omrix VIpCc activado comercial para resistir la carga de compresion y sustancialmente retener la altura original del disco. Con el fin de obtener discos intervertebrales aislados, cuerpos vertebrales lumbares de cerdo se cortaron en el medio utilizando una sierra electrica para huesos. Despues, los discos intravertebrales aislados se aplanan utilizando una lijadora electrica para producir superficies lisas y paralelas simetricas superior e inferior. Los discos intravertebrales aisladas se colocaron en maquinas de ensayo de tension y compresion (LF plus, LLOYD Instruments Ltd, Hampshire, Reino Unido) y se midio la compresion bajo cargas gradualmente crecientes (desde 25 hasta 500 N).

[0217] Cada disco intravertebral se midio a una carga de 10 N con el fin de determinar la altura de la muestra inicial, seguido de mediciones de compresion en 25 a 500 N. A continuation, los discos intravertebrales se vaciaron por inyeccion de una solution de digestion como se describe en el Ejemplo 10. A continuacion, dos jeringas conectadas a las agujas 16G se aplicaron en los extremos opuestos del IVD aislado y hasta 2 ml de PBS se inyecto en el IVD. El espacio de disco se vacio y se lleno varias veces y despues se desecho el contenido de IVD. Este ultimo procedimiento se llevo a cabo tres veces. Este procedimiento se repitio una vez utilizando aproximadamente 2 ml EDTA (10 mM; Riedel-de-Haen n° de cat 34549). Posteriormente, la compresion de los discos vaclos se midio bajo cargas cada vez mayores. La compresion en 500 N se considero como el posible valor de compresion maxima. Los discos vaciados se pincharon dos veces utilizando una aguja 16G que resulta en un total de 4 orificios 16G.

[0218] Los discos vaclos perforados fueron inyectados con PBS o VIPCC y trombina (aplicado simultaneamente en volumenes equivalentes; OMRIX biopharmaceuticals LTD IL) usando el dispositivo de inyeccion Omrix. Las soluciones se inyectaron en las perforaciones existentes hasta que el exceso de solucion se derrame fuera del sitio de la inyeccion. Los discos intravertebrales rellenados se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Tras el perlodo de incubation, las mediciones de compresion del disco lleno se llevaron a cabo en las diferentes cargas. Todas las mediciones se repitieron 5 veces.

[0219] La figura 15 demuestra el porcentaje de compresion de disco bajo carga de fuerza creciente del disco sin tratar, disco vacio, y discos rellenados (PBS o VIPCC y trombina). Los resultados se expresan como la delta en compresion a una carga especlfica (compresion de disco no tratado bajo carga 10 N - compresion de disco rellenado bajo carga XN) se dividen al valor posible de compresion maxima de acuerdo con la siguiente formula:

Compreaidn disco no tralada oa r,^o da 10 N) ■ (Ccmpnasidi cc disco rdlen&do Dajo carga c* X M) •

_______________________________________________________________!

{C&w&adA44d&cdvacb lj*ca'osde£00N)- Cwr**4Si<to<!4di&x vdtiotoledc lj*ca^a de 14 N)

(

X100

[0220] Fig 16 demuestra la recuperation de la altura de los discos inyectados con VIPCC o PBS activado. Los resultados se basan en mediciones mostradas en la Fig. 15 (compresion bajo 500 N). Los resultados se presentan como porcentaje de la compresion maxima posible de disco no tratado en 500 N de carga en el mismo experimento (100%) de acuerdo con la siguiente formula:

{Cornp'esidn de Cisco no tratado oa^o carga ce 500 N) - {Compre&idn de d eco rel enaco ba^o carga de 5-00 N) ^

■ X 100

(Compres on de disco vacio bajo carga de GOO N) - (Compresion de disco vacio bajo carga de GCC N)

[0221] Los resultados demuestran que en todos los grupos analizados un aumento en la fuerza aplicada al disco dio lugar a un aumento de la compresion del disco. El comportamiento de compresion de discos inyectados de VIPCC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

activado como una funcion del aumento de la fuerza es similar a los discos no tratados.

[0222] Los resultados tambien muestran que discos inyectados de VIPCC activado recuperaron su altura inicial en comparacion con discos inyectados de PBS.

[0223] Esto muestra claramente que VIPCC activado puede funcionar para preservar la altura del disco normal y es capaz de resistir cargas de compresion como nucleo pulposo natural.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Un kit que comprende: un primer recipiente que comprende concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una fibronectina: concentracion relativa de fibrinogeno de 1:10 a aproximadamente 1:5, un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinogeno, y un tercer recipiente que comprende una enzima proteolttica seleccionada de entre el grupo que consiste en peptidasas de serina, peptidasas de cistema, peptidasas de aspartico, peptidasas de metalo, hialuronidasa y combinaciones de los mismos.
2. El kit segun la reivindicacion 1, en el que la enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste en tripsina, quimotripsina, elastasa pancreatica, papama, quimopapama, pepsina, colagenasa, gelatinasa, pronasa condroitinasa, hialuronidasa y combinaciones de las mismas.
3. El kit segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el kit comprende ademas un agente de contraste.
4. El kit segun la reivindicacion 3, en el que el agente de contraste es el yodo.