ES2672151T3

ES2672151T3 - Composiciones adecuadas para el tratamiento de un enfermedad, trastorno o afección espinal

Info

Publication number: ES2672151T3
Application number: ES08806958.8T
Authority: ES
Inventors: Edna Bechor; Liliana Bar; Israel Nur
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2018-06-12
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: ES2606858T3; IL204109A; JP2010537968A; EP2195038B1; CN101827617A; IL232619A0; US8968724B2; EP2034010A1; WO2009027814A1; EP2195038A1; EP2602316A1; US20100310524A1; AU2008291817A1; CN101827617B; EP2602316B1; BRPI0816175A2; US9326998B2; US20150196596A1

Abstract

Un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC), opcionalmente en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda, en donde el crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección espinal que implica degeneración y/o lesión del disco intervertebral, con la condición de que estén ausentes del crioprecipitado aprotinina bovina y ácido tranexámico.

Description

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Composiciones adecuadas para el tratamiento de un enfermedad, trastorno o afección espinal

Descripción

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral que comprende una concentración relativa inicial de fibrinógeno y fibronectina adecuada para tratar una enfermedad, trastorno o afección espinal como la degeneración de un tejido espinal, como el disco intervertebral.

Antecedentes de la invención

Los discos intervertebrales se encuentran entre cuerpos de vértebras adyacentes en la espina dorsal. Cada disco forma una articulación cartilaginosa que permite movimientos ligeros de las vértebras, actúa como un ligamento que mantiene juntas las vértebras, y soporta cargas compresivas producidas por el peso corporal y la tensión muscular.

El cartílago es un tejido conectivo firme y elástico compuesto de células especializadas llamadas condrocitos que producen una gran cantidad de matriz extracelular (ECM). Proporciona amortiguación protectora y permite que las uniones soporten cargas producidas por el movimiento necesario para realizar actividades cotidianas. El cuerpo contiene tres tipos diferentes de cartílago: articular, que cubre las superficies articulares; fibrocartílago, que se encuentra en el menisco de la rodilla y el disco intervertebral; y el cartílago elástico que se encuentra en el oído externo. Los diferentes cartílagos se distinguen por su estructura, elasticidad y fuerza.

Aota et al ("Differential effects of fibronectin fragment on proteoglycan metabolism by intervertebral disc cells: a comparison with articular chondrocytes". Spine. 2005;30:722-728) informó de diferentes efectos del fragmento de fibronectina sobre la proliferación y metabolismo de proteoglicanos en diferentes poblaciones del disco intervertebral y condrocitos articulares. Estos resultados sugirieron que los condrocitos de diferentes tejidos de cartílago requieren diferentes condiciones para la proliferación y para mantener la función del tejido.

El disco intervertebral está compuesto de tres estructuras básicas: una sustancia similar a gel interna llamada núcleo pulposo (NP), una banda externa fibrosa dura llamada anillo fibroso (FA), y placas terminales cartilaginosas superior e inferior, que marcan la transición entre el disco intervertebral y la vértebra. Estas estructuras difieren en la disposición del proteoglicano y el colágeno en el tejido, así como en la concentración relativa de cada uno.

Durante el desarrollo embrionario se pueden diferenciar tres capas germinales: el endodermo, el mesodermo y el ectodermo. Estas tres capas dan lugar en última instancia a órganos internos; tejidos musculoesqueléticos; y tejidos epidérmicos y nerviosos, respectivamente. Una cuarta región, conocida como la notocorda, guía el desarrollo embrionario del tubo neural; y la columna vertebral, incluyendo los discos intervertebrales. Las células mesenquimales comienzan a migrar y condensarse alrededor de la notocorda para formar los cuerpos vertebrales óseos y el anillo fibroso. Las células de la notocorda atrapadas juegan un papel crítico en el inicio del desarrollo del núcleo pulposo Walmsley R. "The development and growth of the intervertebral disc". Edinburgh Med J. 1953;60:341-364) Por tanto, estas dos estructuras básicas del disco intervertebral, el anillo fibroso y el núcleo pulposo, se originan de origen embrionario diferente, concretamente, el mesénquima y la notocorda, respectivamente.

El anillo fibroso está compuesto principalmente de fibrillas de colágeno tipo I que forman lamelas concéntricas que rodean el núcleo pulposo y se insertan en las placas terminales de los cuerpos vertebrales adyacentes para formar una estructura reforzada.

El núcleo pulposo consiste en células predominantemente pequeñas similares a condrocitos y una segunda población de células altamente vacuoladas grandes estas son las células de la notocorda que se presumen son restos del tejido embrionario que guiaron la formación de la espina dorsal y los núcleos pulposos (Hunter et al, " The notochordal cell in the nucleus pulposus: a review in the context of tissue engineering". Tissue Eng. 2003;9:667- 677). Debido al hecho de que estas células de la notocorda parecen jugar un papel crucial en la formación de la espina dorsal y el núcleo pulposo, se presume que podrían promover la reparación del disco dañado y la espina dorsal. Las células similares a condrocitos expresan colágeno tipo II, agrecanos de proteoglicanos y cadenas largas de hialuronano, que tienen moléculas con cadenas laterales de ramificación altamente hidrófilas. Estas regiones cargadas negativamente tienen una fuerte avidez por las moléculas de agua e hidratan el núcleo o centro del disco mediante una presión de hinchamiento osmótico. El efecto hidráulico del núcleo hidratado contenido dentro del anillo actúa como un amortiguador para atenuar a la espina dorsal de las fuerzas que se aplican al sistema musculoesquelético. Las placas terminales vertebrales están unidas tanto al disco como al cuerpo vertebral adyacente. La estructura química de estas placas consiste de proteoglicano y fibras de colágeno.

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La degeneración del disco intervertebral humano es un problema clínico y la principal causa de dolor y discapacidad espinal. Más de 15 millones de personas en todo el mundo sufren de degeneración de disco, que se caracteriza típicamente por tener una composición de matriz alterada y número reducido de células.

La Enfermedad Degenerativa del Disco (DDD) es un proceso no deseado en el que los discos intervertebrales pierden su flexibilidad, elasticidad y características de amortiguación. En este proceso, la estructura de colágeno del anillo fibroso se debilita y se vuelve frágil. La presión excesiva sobre un disco debilitado puede provocar desgarros en el anillo fibroso, lo que permite al núcleo pulposo herniar o extrudir a través de los desgarros, esta condición se denomina disco herniado. El material herniado puede comprimir los nervios alrededor del disco y provocar dolor. Una hernia de disco puede interferir con la función nerviosa, produciendo debilidad, entumecimiento, inflamación y dolor. Adicionalmente, el contenido de proteoglicanos disminuye, lo que reduce la capacidad de retención de agua del núcleo pulposo. Estos cambios reducen la capacidad de los discos para actuar como amortiguadores y los hace menos flexibles. La pérdida de fluido también el disco más pequeño y reduce la distancia entre las vértebras y el disco. Como los discos intervertebrales están localizados en un entorno no vascular, el uso de la ingeniería tisular de un disco para ralentizar o revertir el proceso degenerativo representa un desafío biológico importante ya que tienen una capacidad de reparación limitada. La actividad celular requiere glucosa, oxígeno y otros nutrientes necesarios para el soporte del tejido. Sin embargo, el disco es el tejido avascular más grande del cuerpo. Las células dentro del disco se sustentan por la difusión de nutrientes en el disco a través de la concavidad central porosa de la placa terminal (Rudert M and Tillmann B. "Lymph and blood supply of the human intervertebral disc. Cadaver study of correlations to discitis". Acta Orthop Scand. 1993;64:37-40).

La degeneración de los discos intervertebrales o un hematoma pueden provocar compresión de la médula espinal y lesión espinal. La lesión de la médula espinal (SCI) comienza habitualmente con un trauma en la espina dorsal que daña los nervios dentro del canal espinal. Las causas frecuentes de daño son traumas (accidentes automovilísticos, disparos, caídas, etc.) o enfermedades (por ejemplo, polio, espina bífida, ataxia de Friedreich, etc.) y compresión de la espina dorsal por hernia discal intervertebral. Una lesión en los nervios de la médula espinal da como resultado pérdida o déficit en la función motora, sensorial y autonómica. La lesión secundaria después del impacto primario incluye una serie de alteraciones bioquímicas y celulares que llevan a necrosis tisular y muerte celular. Se estima que la incidencia anual de SCI es de aproximadamente 40 casos por millón en los Estados Unidos, y que el costo de gestionar la atención de pacientes con LME se aproxima a 4 mil millones de $ cada año. Hasta la fecha, se ha progresado relativamente poco en el tratamiento de SCI y las discapacidades neurológicas relacionadas. Actualmente solo hay una terapia aceptada, aunque no aprobada, metilprednisolona. Si se usa en dosis muy altas no más tarde de 8 horas después de la lesión, la metilprednisolona ha demostrado una capacidad modesta para mejorar el resultado neurológico después de la SCI.

En el sistema nervioso vertebrado en desarrollo, el tubo neural es el precursor del sistema nervioso central (SNC), que comprende el cerebro y la médula espinal. La médula espinal contiene fibras de comunicación llamadas axones que transfieren información sensorial y motora entre el cerebro y la periferia. En la sección transversal, la médula espinal se divide en mitades simétricas por una mediana dorsal y una mediana ventral. La parte dorsal del tubo neural se asocia principalmente con la sensación, mientras que la parte ventral se asocia principalmente con el control motor (por ejemplo, muscular). El término neurona motora se aplica clásicamente a las neuronas localizadas en el SNC que proyectan sus axones fuera del SNC y controlan los músculos directa o indirectamente. El término es sinónimo de neuronas eferentes. Una lesión en la médula espinal tiene implicaciones devastadoras que dan como resultado la pérdida de la sensibilidad o la función motora por debajo del nivel de la lesión. Después de una lesión en el SNC, las neuronas motoras son incapaces de hacer crecer de nuevo sus axones y mueren por necrosis o apoptosis. La investigación publicada muestra que trasplantando y expresando una segunda notocorda cerca del tubo neural dorsal, 180 grados opuesta a la localización normal de la notocorda, se puede inducir la formación de neuronas motoras en el tubo dorsal, que generalmente forma las células sensoriales. Un SNC lesionado es un entorno altamente inhibidor para la regeneración de axones, limitando severamente la recuperación funcional después de la lesión.

El pegamento de fibrina es típicamente un producto sanguíneo obtenido de o fuentes comerciales o de algunos centros regionales de transfusión de sangre. Los componentes que se usan comúnmente en la preparación de pegamento de fibrina son fibrinógeno, trombina, Factor VIII, Factor XIII, fibronectina, vitronectina y factor de von Willebrand (vWF). Las formulaciones de pegamento de fibrina se usan en cirugía, tanto como una adición útil a las suturas como para proporcionar una integridad de la herida óptima, para la hemostasia y para prevenir o tratar las adherencias. Algunos fabricantes añaden agentes anti-proteolíticos a la formulación de pegamento de fibrina (como se describe en la WO-A-93/05822) o eliminan específicamente el plasminógeno para retrasar o detener la fibrinólisis (como se describe en la US-B-5.792.835 y la US-B-7.125.569).

Típicamente, la preparación de crioprecipitación a partir de plasma es el primer paso en la fabricación de fibrinógeno de adhesivo a base de fibrina. Bar et al ("The binding of fibrin sealant to collagen is influenced by the method of purification and the cross-linked fibrinogen-fibronectin (heteronectin) content of the 'fibrinogen' component". Blood Coagul Fibrinolysis.2005;16:111-117) informó que las formulaciones de gel de fibrina preparadas a partir de crioprecipitado difieren en su contenido de fibronectina y heteronectina (complejos covalentemente

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enlazados de fibrinógeno-fibronectina). El informe indicaba que el contenido de heteronectina en la formulación influye en la adhesión basada en fibrina al colágeno. Por un lado, Schwartz et al (US-B-4.377.572) el procedimiento de purificación da como resultado la eliminación de la mayoría de las moléculas de fibronectina-fibronectina reticuladas, dando como resultado posteriormente una proporción de fibronectina:fibrinógeno baja de 1:14,7 en la formulación y bajas propiedades de unión del colágeno y la gelatina de la fibrina formada. Por otro lado, la preparación de crioprecipitado descrita por Martinowitz y Bal (EP-B-691.858) conserva estas moléculas de fibrinógeno-fibronectina reticuladas, y consecuentemente tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno aumentada de 1:7 que se correlaciona con una mayor adherencia de la fibrina producida al colágeno en comparación con la adherencia al colágeno de la fibrina formada con la preparación obtenida mediante la purificación de Schwartz.

Las siguientes publicaciones divulgan el uso de diferentes preparaciones de pegamento de fibrina en enfermedad espinal. Se han informado de matrices de fibrina tridimensionales como sustratos celulares in vitro y como materiales puente para la reparación del sistema nervioso central. Ju et al ("Enhanced neurite growth from mammalian neurons in three-dimensional salmon fibrin gels. Biomaterials". 2007;28:2097-2108) informaron de que los geles de fibrina de salmón eran andamiajes superiores para el recrecimiento neuronal después de lesión del SNC en comparación con fibrina preparada a partir de proteínas de sangre humana o bovina. Cheng et al ("Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function". Science. 1996;273:510-513 describen la reparación de espacios de la médula espinal en ratas adultas usando injertos de nervios periféricos. El área injertada se estabilizó con pegamento de fibrina que contiene factor de crecimiento de fibroblastos ácido.

La solicitud de patente US-A-2004/0121011 describe un método para promover la reparación, regeneración y recrecimiento de células neuronales lesionadas. La solicitud indicó que el sitio de lesión nerviosa puede estar en el sistema nervioso central o en el periférico. La formulación combina el antagonista de Rho y un componente portador fluido capaz de formar una matriz aceptable in vivo como adhesivos tisulares. La US-A-2004/0121011 describe diferentes adhesivos tisulares a base de proteínas incluyendo geles de colágeno, adhesivos de tejido de fibrina, matrigel, redes de laminina y adhesivos basados en una composición de proteínas de membrana basal que contienen colágeno. Se divulgan varias preparaciones comerciales como Tissucol®/TISSEEL®, Beriplast® P y Hemaseel®.

Las siguientes publicaciones divulgan el uso de composiciones de pegamento de fibrina en el disco intervertebral.

La US-A-2005/0148512 se refiere a la inyección de un agente fibrosante o una composición que comprende un agente fibrosante en discos intervertebrales dañados para mejorar la cicatrización y soportar el anillo anular del disco. Las formulaciones que contienen fibrinógeno como el TISSEAL® se mencionan entre numerosas composiciones que pueden administrarse al disco intervertebral.

La US-B-6.428.576 describe un método para reparar defectos en el anillo fibroso utilizando un sellador de curado in situ. La patente divulga una formulación que cura a un material viscoelástico que simula la estructura, propiedades físicas y funciones biomecánicas del anillo fibroso. El polímero curado puede ser sintético o de origen natural. La patente divulga que los polímeros sintéticos son más fiables. La patente divulga varias proteínas de origen natural, como albúmina, colágeno, fibrinógeno, fibrina y elastina. Estas proteínas pueden ser de cualquier fuente como proteína fraccionada de sangre o proteínas recombinantes, incluyendo procesadas, desnaturalizadas o modificadas de otra manera.

La WO-A-07/089942 divulga un método para tratar un disco, que comprende inyectar un sellador de fibrina en un disco para sellar por lo menos un defecto de un anillo fibroso a la vez que se monitoriza la presión del sellador de fibrina que se inyecta. El sellador de fibrina comprende fibrinógeno y un compuesto activador como trombina. De acuerdo con la descripción, el defecto puede ser un desgarro o una fisura en el anillo fibroso o una cápsula fibrosa de una articulación espinal. La descripción divulga el uso de cualquier fibrinógeno que forme fibrina en un cuerpo humano. La fibronectina se menciona como uno de los numerosos aditivos posibles para la composición de fibrinógeno.

La WO-A-06/050268 divulga una inyección de sellador de fibrina en un desgarro o una fisura en el anillo fibroso. El sellador comprende fibrinógeno y un compuesto activador como trombina. De acuerdo con la solicitud, el componente de fibrinógeno puede ser autólogo, humano incluyendo fibrinógeno humano agrupado, recombinante y bovino u otra fuente no humana. La fibronectina se menciona entre muchos componentes como un aditivo adicional que puede emplearse en el sellador de fibrina.

También la WO-A-06/050267 divulga la inyección de sellador de fibrina y anestésico en el área espinal para sellar defectos en el anillo fibroso, como desgarros o fisuras. De acuerdo con la descripción, el componente de fibrinógeno incluye cualquier fibrinógeno que forme fibrina en el cuerpo humano. La solicitud menciona kits comerciales de fabricantes como Baxter como el TISSEEL®. La descripción de la WO-A-06/050267 divulga que pueden usarse cantidades alternativas de fibrinógeno para cambiar la densidad de los componentes combinados.

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La WO-A-07/089948 se refiere a un método para tratar un disco que está filtrando núcleo pulposo en y/o a través de por lo menos un defecto en el anillo fibroso. El método comprende inyectar un sellador biológico, como solución de fibrinógeno y solución activadora en el área espinal usando un catéter multi-lumen. La descripción también se refiere a un kit que comprende un sellador biológico y un aparato de sellador biológico para inyectar sellador de fibrina en un disco humano.

La US-B-6.468.527 describe un sellador de fibrina de dos componentes que incluye un agente biológico o no biológico. La composición proporciona un medio para administrar un agente particular a un sitio crítico específico dentro del cuerpo y proporcionar un valor terapéutico de liberación en el tiempo prolongada. Se divulgan específicamente inyecciones de pegamento de fibrina infundidas con corticosteroides en el espacio epidural lumbar y en el espacio entre discos. El sellador de fibrina actúa para mantener la respuesta antiinflamatoria extendida del corticosteroide y para sellar las fisuras anulares, que de otro modo permitirían que productos químicos dañinos escapen del espacio discal y bañen la raíz del nervio dando como resultado una radiculitis química. También, la US- B-7.235.255 divulga un sistema para administrar un adhesivo de tejido biológico que comprende un componente de fibrinógeno, un componente de trombina y una solución que contiene corticosteroides. De acuerdo con la descripción el sellador de fibrina puede usarse para tratar disco degenerativo y enfermedad de disco incompetente.

Ejemplificado es una inyección intra-discal. El sistema de administración sella, protege las raíces nerviosas expuestas de daño químico adicional y actúa como un vehículo para mantener los corticosteroides en un depósito duradero en la raíz nerviosa.

Las siguientes publicaciones informan del diseño de tejidos como un posible enfoque biológico, que tiene como objetivo reemplazar, reparar, mantener y/o mejorar la función tisular mediante la combinación de células, factores bioquímicos y fisicoquímicos adecuados y, opcionalmente, una estructura porosa para ser empleada como andamiaje. La WO-A-04/093934 divulga un método para aumentar y/o reparar un disco intervertebral mediante la administración de material de células madre en el disco. El material de células madre se proporciona en un material entramado biológicamente compatible. El material entramado preferido es entramado lipo-derivado como proteoglicanos, glicoproteinas, hialuroninas, fibronectinas, colágenos (tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI, etc.) y similares. De acuerdo con la descripción de la WO-A-04/093934 los entramados lipo-derivados sirven como sustratos excelentes para el crecimiento celular. Se ejemplifican solo los materiales entramados a base de colágeno.

La WO-A-00/47621 divulga un método para producir un crioprecipitado inactivado viral que tiene una proporción de fibrinogeno y fibronectina preferida de 0,02 a 0,5 que, por ejemplo, puede usarse para producir una biomatriz a base de fibrina adecuada para cultivar cualquier célula humana y se mencionan queratinocitos, fibroblastos y condrocitos. En una realización preferida, se usa el agente antifibrinolítico t-AMCHA (es decir, ácido tranexámico) que está indicado para reducir ventajosamente la viscosidad de la composición.

La solicitud de patente US US-A-06/0275273 , describe un método para la implantación o inyección de condrocitos en un disco intervertebral degenerativo. La patente divulga condrocitos obtenidos de un cadáver. De acuerdo con la descripción, los condrocitos pueden obtenerse de tejido de cartílago, incluyendo cartílago de disco intervertebral, o cartílago que se origina en tejidos cartilaginosos distintos del tejido del disco intervertebral. La descripción divulga varias moléculas biocompatibles para ser añadidas a la composición celular como laminina, quitosano, hidrogel, hidrogel pegilado, colágeno tipo I, II, III, fibrinógeno, fibrina, trombina, fibronectina y ácido hialurónico. Se divulga el uso del pegamento de fibrina de formulación comercial TISSEEL® con las células. Los ejemplos también divulgan el uso de fibrinógeno porcino crioprecipitado y una solución de condrocito-trombina.

La solicitud de patente US US-A-07/0093905 divulga una mezcla para la reparación y regeneración de discos intervertebrales que comprende glicina, monocitos concentrados y pegamento de fibrina. La patente también divulga núcleos o tejido anular extirpados y tratados para su reinserción en el disco. Las celdas de disco reinsertadas pueden combinarse opcionalmente con portadores como un portador tipo gel o un adhesivo. El portador tipo gel puede ser un hidrogel biológico o sintético, ácido hialurónico, gel de colágeno, adhesivo a base de mejillón, pegamento de fibrina, coágulo de fibrina, sangre, coágulo de sangre, componente sanguíneo, coágulo de componente sanguíneo, etc. La solicitud de patente no menciona una composición específica de los portadores divulgados, y no dice nada sobre un concentrado de crioprecipitado.

La EP-A-1.894.581 divulga un gel de matriz que comprende condrocitos o células progenitoras como un implante de reparación de cartílago. De acuerdo con la descripción, la matriz de gel proporciona una dilución simple de condrocitos primarios que da como resultado una producción aumentada de material de la matriz extracelular. En una realización preferida, los condrocitos se aíslan de un cartílago articular. El pegamento de fibrina se menciona entre los numerosos materiales de gel de matriz que pueden usarse. La solicitud no menciona una composición específica del material de gel de matriz y no dice nada sobre una concentración relativa particular entre los componentes de gel.

Las células de disco cultivadas en monocapa suponen un fenotipo tipo fibroblastos. En un entorno tridimensional, sin embargo, las células de disco se redondean, forman colonias y muestran una mayor proliferación y síntesis de proteoglicanos. Se han desarrollado diversas técnicas de cultivo in vitro, incluyendo geles

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tridimensionales complejos y andamiajes de polímeros degradables, con el objetivo de proporcionar un marco sostenible en el que las células de disco puedan proliferar. Se han usado ácido hialurónico, colágeno, quitosano y gel de fibrina en la preparación polimérica reticulable para atrapar células.

A pesar de todas las técnicas informadas sobre el uso del pegamento de fibrina en IVD, Gruber et al ("Cell- based tissue engineering for the intervertebral disc: in vitro studies of human disc cell gene expression and matrix production within selected cell carriers". Spine J. 2004;4:44-55) informaron que las formulaciones de gel de fibrina eran microambientes inferiores para la proliferación, producción de ECM y expresión génica de las células del anillo fibroso. El término "matriz extracelular", abreviado "ECM", se refiere al material estructural complejo que es producido por las células en los tejidos de mamíferos. La matriz extracelular es típicamente la característica definitoria de un tejido conectivo, por ejemplo, células de condrocitos. La ECM in vivo proporciona habitualmente soporte estructural a las células.

Hay una necesidad de una composición de fibrina óptima adecuada para tratar una enfermedad, trastorno o afección espinal, como la degeneración de discos intervertebrales.

Sumario de la invención

Los pegamentos de fibrina son bien conocidos y se usan extensamente en varios entornos clínicos. Tales pegamentos se usan en cirugía, tanto como una adición útil a las suturas como para proporcionar una integridad de heridas óptima, para hemostasia y para prevenir o tratar las adherencias. Recientemente, se ha publicado bibliografía sobre el uso de pegamento de fibrina para reconstruir el disco intervertebral espinal, sellar fisuras en el anillo fibroso y en la restauración del sistema nervioso central.

Se descubrió de acuerdo con la presente invención que un aumento en la concentración de fibrinógeno en placas recubiertas disminuía significativamente la unión de las células del núcleo pulposo del disco intervertebral a las placas, mientras que un aumento en la proporción de la concentración de fibronectina:fibrinógeno lleva al resultado opuesto. Por otro lado, una composición de pegamento de fibrina como crioprecipitado que se vacía selectivamente de fibrinógeno y comprende altos niveles de fibronectina no se curaría y por lo tanto no formará un andamiaje tridimensional de soporte para las células. La presente invención resuelve este problema técnico y proporciona crioprecipitado con concentraciones óptimas de fibronectina y fibrinógeno para su uso en discos intervertebrales.

Se descubrió de acuerdo con la presente invención que la proporción de fibronectina:fibrinógeno desempeña un papel crucial en la unión, proliferación y migración de las células del núcleo pulposo y depende absolutamente de un alto contenido de fibronectina en relación al fibrinógeno. Por ejemplo, se descubrió de acuerdo con la invención que las células del núcleo pulposo cultivadas en una mezcla que comprende una proporción aumentada de fibronectina:fibrinógeno de aproximadamente 1:10-1:5 muestran una unión y proliferación celular aumentadas en comparación con las células cultivadas en una mezcla que comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno más baja. También, se mostró en la presente que un crioprecipitado con la proporción de fibronectina: fibrinógeno aumentada era capaz de restaurar la altura del disco cuando se inyectaba en el área del núcleo pulposo. Por tanto, un crioprecipitado que comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno superior a 1:12 y en el intervalo de 1:10-1:5, como 1:7 puede usarse como un componente superior de una matriz para restaurar la altura del disco a la vez que sirve como un andamiaje óptimo para las células del núcleo pulposo.

Los estudios indican que las células de la notocorda pueden guiar la formación de células del núcleo pulposo y del SNC y/o pueden usarse como progenitores de tales células. Por lo tanto, el crioprecipitado de acuerdo con la invención puede usarse para ayudar en la reconstrucción del disco intervertebral y el sistema nervioso central (SNC).

El ácido tranexámico es un inhibidor sintético de la fibrinólisis, que se ha demostrado que afecta al sistema nervioso central (SNC) y causa hiper-excitabilidad y convulsiones probablemente como resultado de ser un antagonista del Ácido Gamm-Aminobutírico (GABA) (Furtmüller et al. "Tranexamic acid, a widely used antifibrinolytic agent, causes convulsions by a gammaaminobutyric acid(A) receptor antagonistic effect". J Pharmacol Exp Ther. 2002;301:168-173; Roger et al. "Evaluating the differences between fibrin sealants: recommendations from an international advisory panel of hospital pharmacists". The European Journal of Hospital Pharmacy Science Volumen 12, 2006, Issue 1, P. 3-9). Además, se ha demostrado que la aprotinina bovina es un inhibidor de serina proteasa altamente inmunogénico que puede provocar un trastorno neurológico degenerativo muy raro e incurable llamado enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), que provoca una degeneración esponjosa en el cerebro y la médula espinal. Por tanto, de acuerdo con el método divulgado en la presente, las sustancias como el ácido tranexámico y la aprotinina bovina se excluyen del concentrado de crioprecipitado de la invención a ser usado en la espina dorsal.

Por lo tanto, la técnica divulgada ni divulga ni sugiere el pegamento de fibrina óptimo para usar en la espina dorsal preparado con una formulación de crioprecipitado que tiene una proporción de fibrinógeno y fibronectina adecuada y que carece de ácido tranexámico y/o aprotinina derivada de bovino.

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En un aspecto, la invención se refiere a un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC), opcionalmente en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda, en donde el crioprecipitado comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica degeneración y/o lesión de disco intervertebral, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado de crioprecipitado.

En otra realización de la presente invención, el VIPCC está activado.

En otra realización de la presente invención, el VIPCC comprende un agente de contraste. El agente de contraste puede ser yodo.

En otra realización adicional de la presente invención, el VIPCC se usa para tratar una enfermedad, trastorno o afección de disco intervertebral.

En una realización de la invención, el VIPCC se usa para restaurar, por lo menos parcialmente, la altura del disco intervertebral de un IVD dañado.

En otra realización más de la invención, el VIPCC se usa para prevenir la hernia de disco intervertebral.

En otra realización adicional más de la invención, la enfermedad es una etapa temprana de enfermedad degenerativa intervertebral.

En otra realización más de la invención, el VIPCC activado sirve como andamiaje para la reconstrucción de células del núcleo pulposo en etapa avanzada de enfermedad de disco degenerativo intervertebral.

En otra realización adicional más de la invención, el VIPCC activado sirve como un andamiaje para la reconstrucción de médula espinal lesionada o rota.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un primer recipiente que comprende un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5, y un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o trauma que altera la función o comunicación normal del cerebro o la médula espinal, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del kit, en donde el VIPCC en el kit se proporcione en un banco de tejidos o células que comprenda células derivadas de la notocorda.

En otra realización de la invención, el kit se usa para tratar una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral. El kit puede comprender adicionalmente un agente de contraste como yodo.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un andamiaje que comprende un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que involucra degeneración y/o lesión del disco intervertebral, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado crioprecipitado y del andamiaje.

En otra realización de la invención, el andamiaje se usa para tratar una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral.

También se divulga en la presente un kit que comprende: un primer recipiente que comprende un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5, un segundo recipiente que comprende una enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno, y un tercer recipiente que comprende un enzima proteolítico seleccionado del grupo que consiste de serina peptidasas, cisteína peptidasas, peptidasas aspárticas, metalo peptidasas, hialuronidasa y combinaciones de las mismas.

El enzima proteolítico se selecciona del grupo que consiste de tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática, papaína quimopapaína, pepsina, colagenasa, gelatinasa, pronasa condroitinasa, hialuronidasa y combinaciones de las mismas. El kit puede comprender adicionalmente un agente de contraste como yodo.

Otro objeto de la invención es proporcionar un vehículo adecuado para administrar una composición de células en un tejido espinal dañado que comprende concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 y células derivadas de la notocorda, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado crioprecipitado. En otra realización de la invención, el tejido espinal dañado es un disco intervertebral. En otra

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realización adicional de la invención, las células derivadas de la notocorda son células de núcleo pulposo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un banco de tejidos o células que comprende células derivadas de la notocorda en una composición que comprende concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5.

En otra realización de la invención, dichas células son células del núcleo pulposo.

Otro objeto más de la invención se refiere a un concentrado de crioprecipitado activado por plasma inactivado viral, en donde dicho crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica degeneración y/o lesión de disco intervertebral, con la condición de que la aprotinina bovina esté ausente del concentrado crioprecipitado.

En una realización de la invención, dicho crioprecipitado se usa para tratar una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral.

El kit, las células del banco de tejidos o células y/o el vehículo obtenible de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar una enfermedad, trastorno o afección que involucra degeneración y/o lesión del disco intervertebral como degeneración de un tejido espinal, como disco intervertebral.

En otro aspecto de la invención, el concentrado de crioprecipitado activado por plasma inactivado viral se usa para aumentar o restaurar por lo menos parcialmente la altura del disco intervertebral. El crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 y el ácido tranexámico y la aprotinina bovina están ausentes del concentrado de crioprecipitado.

También se divulga en la presente un método para facilitar el crecimiento, proliferación, diferenciación, mantenimiento, reparación y/o restauración de células derivadas de la notocorda que comprende poner en contacto la población de dichas células con concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado de crioprecipitado. Dichas células pueden ser células del núcleo pulposo. El VIPCC puede estar activado.

Dicho contacto puede llevarse a cabo ex vivo. Alternativamente, dicho contacto puede llevarse a cabo in

vivo.

También se divulga en la presente un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección espinal como degeneración de un tejido espinal, como disco intervertebral que comprende administrar en la espina dorsal de un sujeto que lo necesita un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC), opcionalmente en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda, en donde el crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado de crioprecipitado.

El VIPCC puede estar activado.

El VIPCC puede administrarse en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda. Dichas células pueden ser células del núcleo pulposo.

Todo o una parte del tejido del núcleo pulposo se puede extirpar antes de administrar el VIPCC y las

células.

Antes de la administración de las células, se pueden cultivar ex vivo en VIPCC que comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a aproximadamente 1:5.

También se divulga en la presente un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección espinal como degeneración de un tejido espinal, como disco intervertebral que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un kit, células de un banco de tejidos o células y/o un vehículo de acuerdo con la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor en referencia a la siguiente descripción, ejemplos, reivindicaciones y las figuras siguientes.

Fig. 1 : muestra el efecto de la trombina, el concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) y sus componentes sobre la unión y la proliferación de las células del anillo fibroso. Se recubrió una

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placa de cultivo de plástico de 97 mm en la circunferencia con VIPCC, trombina, albúmina y fibrinógeno. Posteriormente, la suspensión de células del anillo fibroso se sembró en el centro de la placa (Origen). Se determinó la unión celular a VIPCC, trombina, albúmina y fibrinógeno después de 14 días mediante tinción con Hematoxilina y Eosina.

Fig. 2 : muestra los efectos del procedimiento de tripsinización y/o pase sobre la unión celular y la proliferación de células del anillo fibroso. Las células del anillo fibroso disociadas se colocaron en el centro de una placa de cultivo de plástico de 97 mm recubierta en la circunferencia con VIPCC, fibrinógeno, fibronectina y mezcla de fibronectina:fibrinógeno purificada (1:10). Se evaluó la unión celular después de 9 días mediante tinción con Hematoxilina y Eosina.

Figs. 3A-3B: muestran la unión celular de núcleo pulposo (A) y anillo fibroso (B) en diferentes recubrimientos. Los resultados obtenidos se expresan como veces de unión celular a recubrimientos de fibronectina en el mismo experimento (100%). Fn-fibronectina; Fgn-fibrinógeno.

Fig. 4 : muestra los niveles de células del núcleo pulposo activas metabólicas en el día 1 y 5 en cultivo en diferentes recubrimientos. Los resultados se presentan como porcentaje de intensidad de absorbancia en el recubrimiento de fibronectina (100%). VIPCC- concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral; Fn- fibronectina; Fgn-fibrinógeno.

Fig. 5 : muestra los niveles de cultivo de núcleo pulposo activo metabólico en cantidad constante de fibronectina y cantidad aumentada de fibrinógeno en la matriz de recubrimiento (A) y en cantidad constante de fibrinógeno y cantidad aumentada de fibronectina en la matriz de recubrimiento (B).

Figs. 6A-6D : muestran la morfología y la función del anillo fibroso (panel superior) y los condrocitos del núcleo pulposo (panel inferior) en el andamiaje tridimensional unido (A, C) y separado (B, D) preparado con VIPCC.

Fig. 7 : muestra la migración de células del núcleo pulposo en el VIPCC activado.

Fig. 8 : muestra una imagen de fluorografía de inyecciones de control (A; solución salina) y VIPCC activado (B; preparada con VIPCC y trombina) en el disco intervertebral.

Fig. 9 : muestra la espina lumbar aislada 14 días después del procedimiento de inyección descrito en la Fig. 8.

Fig. 10 : muestra los discos intervertebrales descalcificados (IVD) de inyecciones de solución salina (A) y de VIPCC activado (B) como se describe en la Fig. 8.

Fig. 11 : muestra estudios histológicos de la región del núcleo pulposo de las inyecciones IVD de solución salina (A) y VIPCC activado (B) descritas en la Fig. 8.

Fig. 12 : muestra la región central del núcleo pulposo de inyecciones IVD de control (A) y de VIPCC activado (B) descritas en la Fig. 8.

Fig. 13 : muestra grupos de núcleo pulposo en la región periférica de inyecciones IVD de control (A) y VIPCC activado (B).

Fig. 14 : muestra la morfología y la producción de sulfato de condroitina de células de condrocitos del núcleo pulposo dispuestas en andamiajes tridimensionales formados de mezcla de VIPCC y trombina diluida 20 veces dentro de discos intervertebrales aislados. La evaluación histológica se realizó usando un microscopio de fluorescencia invertido 1 hora y 3 días (A y B, respectivamente) después del procedimiento de inyección. N-núcleo; CS- sulfato de condroitina. La producción de sulfato de condroitina es evidente en la membrana celular (flecha).

Fig. 15 : muestra el porcentaje de compresión del disco bajo carga de fuerza creciente de discos no tratados, discos vacíos y discos rellenados (PBS o VIPCC y trombina).

Fig. 16 : muestra la recuperación de altura de los discos inyectados con o VIPCC activado o PBS. Los resultados se basan en las mediciones mostradas en la Fig. 15(compresión bajo 500 N). Los resultados se presentan como el porcentaje de la compresión máxima posible del disco sin tratar bajo de 500 N de carga en el mismo experimento (100%).

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Descripción detallada

La invención se refiere a un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno adecuada para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica degeneración y/o lesión de disco intervertebral como degeneración de disco intervertebral (IVD).

Sorprendentemente se descubrió de acuerdo con la presente invención que la proporción fibronectina:fibrinógeno desempeña un papel crucial en la unión, proliferación y migración de células del núcleo pulposo. Se ha demostrado de acuerdo con la invención que las propiedades de conductividad del crioprecipitado en el núcleo pulposo (NP) dependen absolutamente de una proporción óptima de la fibronectina con respecto al fibrinógeno.

El término "crioprecipitado" se refiere a un componente sanguíneo que se obtiene a partir de plasma congelado preparado a partir de sangre completa. Un crioprecipitado puede obtenerse cuando el plasma congelado se descongela en frío, típicamente a una temperatura de 0-4° C, y recogiendo el precipitado, por ejemplo mediante centrifugación. Habitualmente se forma un crioprecipitado que es rico en fibrinógeno, factor VIII, factor de von Willebrand, factor XIII y fibronectina. El componente de crioprecipitado puede prepararse a partir de plasma autólogo, humano incluyendo plasma agrupado, o plasma de una fuente no humana.

Los resultados obtenidos de acuerdo con la invención muestran que un aumento en la concentración de fibrinógeno en las placas recubiertas disminuyó significativamente la unión de las células del núcleo pulposo a las placas. Mientras que un aumento en la concentración de fibronectina en las placas provocó el resultado opuesto. Sin embargo, el crioprecipitado que se vacía selectivamente de fibrinógeno y compone altos niveles de fibronectina no curaría, y por lo tanto sin fibrinógeno no se formará un andamiaje que soporte una formación de tejido tridimensional.

Más específicamente, se descubrió de acuerdo con la invención que una mezcla purificada de fibronectina:fibrinógeno en una proporción de 1:10 y 1:5 es más adecuada para la unión y proliferación de células del núcleo pulposo que las mezclas que comprenden una proporción de fibronectina:fibrinógeno más baja. Sorprendentemente, a diferencia del anillo fibroso, se descubrió que la unión de las células del núcleo pulposo se vio afectada por un aumento en la concentración de fibrinógeno en placas recubiertas con fibrinógeno. De hecho, la unión de las células del núcleo pulposo disminuyó significativamente con concentraciones de fibrinógeno aumentadas de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, el aumento en la proporción fibronectina:fibrinógeno lleva al resultado opuesto. Estos resultados indican el papel clave de la proporción fibronectina:fibrinógeno en la unión de células del núcleo pulposo y demuestran la ventaja de usar una proporción de nivel alto de fibronectina:fibrinógeno para las células del núcleo pulposo. Los resultados obtenidos indican que la unión de las células del núcleo pulposo es mejor en VIPCC que en una mezcla purificada de fibronectina:fibrinógeno que tiene una proporción alta y similar de fibronectina:fibrinógeno. Cabe destacar que la unión celular de los condrocitos del anillo fibroso fue similar en ambos recubrimientos.

La proliferación celular de las células del núcleo pulposo y del anillo fibroso fue más alta en el recubrimiento de VIPCC que en el recubrimiento compuesto de mezcla de fibronectina y fibrinógeno purificada. Sin embargo, la proliferación de condrocitos del núcleo pulposo se vio más afectada que la de los condrocitos del anillo fibroso por los diferentes recubrimientos. También se controló la viabilidad de las células del núcleo pulposo en un recubrimiento de VIPCC con una proporción alta de fibronectina:fibrinógeno y una mezcla de fibronectina:fibrinógeno purificada. Los resultados muestran que una proporción de fibronectina:fibrinógeno alta era capaz de mitigar la disminución de la viabilidad celular observada en el recubrimiento de fibrinógeno solo. Este efecto positivo sobre las células del núcleo pulposo era particularmente pronunciado con el recubrimiento de VIPCC. Estos resultados muestran las ventajas de usar el VIPCC con proporción de fibronectina:fibrinógeno alta como un recubrimiento para las células del núcleo pulposo en lugar de la mezcla de fibronectina:fibrinógeno pura. Se descubrió que los condrocitos del núcleo pulposo detectan un gradiente quimiotáctico de varias diluciones de VIPCC y la transmigración tuvo lugar en presencia de dicho gradiente de VIPCC. Por tanto, una formulación de VIPCC con proporción fibronectina:fibrinógeno alta puede tener características condro-conductoras.

En total, los resultados de acuerdo con la invención muestran que el VIPCC de acuerdo con la invención, que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 o de aproximadamente 1:7 es adecuado para su uso con células del núcleo pulposo. Por tanto, el VIPCC activado de la invención puede usarse como un andamiaje para cultivar células del núcleo pulposo ex vivo o puede inyectarse en el espacio del disco intervertebral para usarlo como andamiaje para células del núcleo pulposo in vivo.

Se descubrió de acuerdo con la invención que la inyección de VIPCC y trombina en el disco intervertebral de un modelo animal no modificó la estructura del IVD y que se conservó la estructura típica del tejido de condrocitos en el IVD. Además, se demostró que el VIPCC activado puede funcionar para restaurar sustancialmente la altura normal del disco y dicho disco restaurado es capaz de resistir cargas de compresión como el tejido del núcleo pulposo natural.

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Adicionalmente, se demostró el mantenimiento de la morfología y la funcionalidad de los condrocitos del núcleo pulposo inyectados IVD cuando se inyectaron junto con el VIPCC activado de acuerdo con la invención.

Por tanto, un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 o de aproximadamente 1:7 puede usarse ventajosamente para permitir la unión, proliferación y migración de células de tejido del núcleo pulposo. Los resultados también muestran que las células del núcleo pulposo cultivadas en VIPCC activado de acuerdo con la presente invención mantienen la morfología y la síntesis del sulfato de condroitina. Como las células del núcleo pulposo se originan y/o son guiadas por la región de la notocorda, estos resultados allanan el camino a nuevos enfoques para terapia de la espina dorsal lesionada cuya formación se guía por células de la notocorda como el núcleo pulposo y las neuronas motoras del sistema nervioso central. Por lo tanto, los crioprecipitados que contienen la proporción óptima de fibronectina:fibrinógeno son superiores sobre los crioprecipitados que no contienen fibronectina o que comprende una baja proporción de fibronectina:fibrinógeno para su uso en la espina dorsal.

Las célula del tejido del núcleo pulposo humano del IVD son principalmente células tipo condrocitos pequeñas, pero hay una segunda población de células grandes, las células de la notocorda, que se presumen restos del tejido embrionario que guiaron la formación del desarrollo embrionario del tubo neural y el núcleo pulposo (Hunter et al, 2003). Algunos estudios indican que las células de la notocorda encontradas en el tejido del núcleo pulposo pueden guiar la formación del núcleo pulposo y las células del SNC. Por lo tanto, el tejido del núcleo pulposo puede usarse para ayudar en la reconstrucción del disco intervertebral y el SNC.

En la presente se divulga un método para facilitar el crecimiento, proliferación, diferenciación, mantenimiento, reparación y/o restauración de células derivadas de la notocorda como células del núcleo pulposo, dicho método comprende poner en contacto la población de dichas células con concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 o de aproximadamente 1:7.

El término "células derivadas de la notocorda" se refiere a células cuya formación fue guiada por la región de la notocorda. En otras palabras, las células derivadas de la notocorda se refieren a células del núcleo pulposo espinal y a células neuronales espinales (a saber, células del SNC).

El ácido tranexámico es un inhibidor de la fibrinólisis sintético, que se ha demostrado afecta al sistema nervioso central (SNC) y provoca hiper-excitabilidad y convulsiones, probablemente como resultado de ser un antagonista del Ácido Gamm-Aminobutírico (GABA) (Furtmüller et al. " Furtmüller et al. "Tranexamic acid, a widely used antifibrinolytic agent, causes convulsions by a gammaaminobutyric acid(A) receptor antagonistic effect". J Pharmacol Exp Ther. 2002;301:168-173; Roger et al. "Evaluating the differences between fibrin sealants: recommendations from an international advisory panel of hospital pharmacists". The European Journal of Hospital Pharmacy Science Volumen 12, 2006, Número 1, P. 3-9). También, se ha demostrado que la aprotinina bovina es un inhibidor de serina proteasa altamente inmunogénico que puede provocar un trastorno neurológico degenerativo muy raro e incurable llamado enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), que provoca una degeneración esponjosa en el cerebro y la médula espinal.

Por tanto, de acuerdo con la invención, las sustancias como el ácido tranexámico y/o la aprotinina bovina están excluidas del concentrado de crioprecipitado que se usará en la espina dorsal. El VIPCC en el que se redujeron los niveles de plasminógeno y plasmina hace innecesario el uso de estas sustancias. En una realización de la invención, en el VIPCC el plasminógeno y la plasmina se han reducido a igual o menos de 15 pg/ml, como por ejemplo 5 pg/ml. El crioprecipitado de plasma de acuerdo con la presente invención puede estar activado o no activado. El término "VIPCC activado" se refiere a la composición de crioprecipitado después de la combinación con un componente activador que es capaz de formar fibrina a partir de fibrinógeno. La mezcla combinada da como resultado una estructura tridimensional. El componente activador puede ser trombina y/o una solución obtenible de veneno de serpiente. El contacto del VIPCC de la invención con las células puede llevarse a cabo ex-vivo, incluyendo cultivo celular in vitro con o sin otros tipos celulares o in vivo en el sitio lesionado.

La técnica divulgada no sugiere ni divulga el uso de una formulación de crioprecipitado que tiene una proporción de fibrinógeno y fibronectina preferida, que carece de ácido tranexámico y aprotinina derivada de bovino para su uso en la espina dorsal.

En la presente se divulga un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o afección espinal como degeneración del disco intervertebral que comprende administrar en la espina dorsal de un sujeto que lo necesita un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del concentrado de crioprecipitado. La composición de VIPCC de acuerdo con la invención puede administrarse en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda como células de núcleo pulposo.

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De acuerdo con la presente invención, dicho VIPCC puede estar activado o no activado.

Como se usa en la presente, el término "inicial" se refiere a la proporción de variables al final de la preparación del concentrado de crioprecipitado.

También se divulga en la presente un método útil para tratar una enfermedad, trastorno o afección del sistema nervioso central (SNC) que comprende administrar al sitio de la lesión o daño de un sujeto que lo necesita un crioprecipitado de concentrado de plasma inactivado viral (VIPCC) que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5. La divulgación es útil para tratar lesiones del SNC o la médula espinal, y mejora la restauración del SNC y el crecimiento axonal en un sujeto.

El término "enfermedad, trastorno o afección espinal" se refiere a una enfermedad, trastorno o afección de disco intervertebral y/o del sistema nervioso central.

El término "enfermedad, trastorno o enfermedad del disco intervertebral" se refiere a un trastorno múltiple, enfermedad o afección que involucra degeneración y/o lesión del disco intervertebral, como hernia discal, disco fisurado, estenosis espinal, disco negro, dolor discal, etc.

Frecuentemente, el término "enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral" se usa como sinónimo del término "Enfermedad Degenerativa del Disco (DDD)".

De acuerdo con el sistema de denominación "Discograma de Dallas modificado" hay seis posibles categorías que describen la gravedad del desgarro anular radial (grado 0-5) (Sachs et al. "Dallas discogram description. A new classification of CT/discography in low-back disorders". Spine. 1987;12:287-294). Mientras que el grado 0 describe un disco normal; donde ningún material sustancial se filtra del núcleo y el desgarro grado 5 describe un desgarro que ha roto completamente las capas exteriores del disco y está filtrando fuera material del disco.

La nutrición inadecuada del disco, por ejemplo, cuando el suministro sanguíneo de las vértebras adyacentes está dañado, puede acelerarse la degeneración del disco. Esto puede estar provocado por la deshidratación del núcleo pulposo que lleva a la degradación de las fibras de colágeno. Tales discos deshidratados se pueden ver en una exploración MRI y también se conocen como "discos negros" debido al cambio de color en la MRI. En última instancia, el disco puede perder su capacidad de amortiguación. El espacio del disco se estrechará, perderá su capacidad de amortiguación y el movimiento a ese nivel será anormal. Esto ejerce una tensión excesiva sobre las estructuras adyacentes en la espina dorsal que llevan a la compresión de la raíz nerviosa, una afección dolorosa llamada estenosis espinal (
http://www.saspine.org/conditions/ddd_disease.htm).

Las pruebas diagnósticas para una enfermedad, trastorno o afección espinal incluyen, pero no están limitadas a, radiografía, mielografía, tomografía computarizada, formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía por emisión de positrones y otras pruebas diagnósticas conocidas en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "enfermedad, trastorno o afección del sistema nervioso central" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o trauma que altera la función o comunicación normal del cerebro o la médula espinal. Las lesiones del SNC que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención son diversas y serán fácilmente comprendidas por los expertos en la técnica. Sin limitación, se pueden mencionar lesiones del cerebro y de la médula espinal debido a neurocirugía, trauma, isquemia, hipoxia, enfermedad neurodegenerativa, trastorno metabólico, enfermedad infecciosa, compresión del disco intervertebral, tumores y enfermedades autoinmunes.

La administración de la composición de VIPCC al disco intervertebral puede llevarse a cabo mediante inyección. En tal realización, el procedimiento de inyección puede llevarse a cabo como sigue. El sujeto que lo necesita puede colocarse lateralmente y doblarse hacia adelante. La aguja o la cánula puede insertarse en el núcleo pulposo del disco a tratar. Cuando se trata un defecto del sistema nervioso central, la aguja o la cánula pueden colocarse adyacentes a la duramadre. La aguja o la cánula puede insertarse bajo la guía de un trazador. El término "trazador" es intercambiable con el término "agente sustancial" como se define a continuación. La técnica que puede usarse en el método divulgado en la presente incluye fluorografía, escaneo, formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía, nanotecnología, video digital, rayos X o cualquier otra técnica conocida en la técnica. Ejemplos no limitativos de trazadores son colorantes orgánicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste puede elegirse entre diversos agentes no tóxicos, como yodo. Si el espectro del trazador no es visible para el ojo humano, el trazador puede detectarse con el equipo apropiado. Una vez en la posición apropiada, la aguja o la cánula puede insertarse en el núcleo pulposo, por ejemplo, después de atravesar el anillo fibroso. Luego se inyecta el agente de contraste para verificar el sitio exacto de la aplicación. El agente de contraste puede estar presente al final de la punta de la aguja o la cánula. Una vez que se verifica la localización, se inyectan el VIPCC y, por ejemplo, un volumen igual de un componente activador en el espacio entre discos. El procedimiento de inyección puede ser en cualquier orden, por ejemplo, los componentes se aplican simultáneamente

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o uno después del otro y se forma una matriz cuando se mezclas los componentes.

El término "componente activador" se refiere a un compuesto que es capaz de formar fibrina a partir de fibrinógeno que incluye trombina y/o una solución obtenible a partir del veneno de serpiente. En una realización de la invención, la trombina se aísla del plasma de seres humanos o mamíferos. También es posible que el enzima que es capaz de formar fibrina se prepare mediante métodos recombinantes.

El VIPCC activado puede inyectarse en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda como células de núcleo pulposo.

El VIPCC activado puede usarse en una cantidad adecuada para la reconstrucción del área dañada y depende de la extensión de la lesión.

Los componentes pueden inyectarse en la base del defecto y la aguja o la cánula se puede extraer del anillo fibroso cuando se encuentra resistencia. El exceso de soluciones se puede derramar fuera del sitio de la inyección, formando un gel sólido y un cierre de la abertura o incisión después de la inyección.

En una realización de la invención, el VIPCC comprende una proporción de fibronectina: fibrinógeno de aproximadamente 1:7. El término "crioprecipitado de concentrado de plasma inactivado viral" se refiere a un crioprecipitado de sangre completa que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno mayor de 1:12, por ejemplo como se describe en la EP-B-534.178 y la WO-A-9305822 y obtenible por

- descongelando una crioprotección;

- disolviendo en un tampón a pH 7.0 a 7.2;

- precalentando a de 30 a 35° C;

- ajustando el pH a 7.0 a 7.2;

- añadiendo hidróxido de aluminio bajo agitación;

- centrifugando y descartando el precipitado;

- añadiendo CaCh;

- inactivación de virus;

- concentrando por ultrafiltración a una concentración de proteína de 60 a 100 mg/ml.

Actualmente, se han descrito formulaciones de pegamento de fibrina o fibrina para su uso en discos intervertebrales y regeneración del sistema nervioso central, sin embargo, hemos descubierto de acuerdo con la presente invención que el crioprecipitado, tal como el preparado de acuerdo con el método de Martinowitz y Bal, que contiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno alta , cercana a la proporción del crioprecipitado original y en donde la composición de crioprecipitado no incluye ácido tranexámico y/o aprotinina bovina es más adecuada para mejorar la adhesión, proliferación, crecimiento, diferenciación y/o mantenimiento de las células en el tejido del núcleo pulposo que las composiciones que comprenden una proporción de fibronectina:fibrinógeno más baja y que contienen ácido tranexámico y/o aprotinina bovina. La técnica divulgada no sugiere ni divulga el uso de una formulación de crioprecipitado que tenga una relación de fibrinógeno y fibronectina preferida, que carezca de ácido tranexámico y aprotinina derivada de bovino para su uso en el núcleo pulposo anormal.

Otras formulaciones comerciales como TISSEEL®, Tissucol® tienen una proporción de fibronectina:fibrinógeno menor que el crioprecipitado original y contienen ácido tranexámico y/o aprotinina bovina, por tanto el crioprecipitado de la invención comprende una proporción de 1:10 a 1:5, de 1:10 a 1:7 y de aproximadamente 1:7, por ejemplo BAC; Omrix, IL preparado como se describe en la EP-B-534.178, en donde la plasmina y el plasminógeno se eliminan como se describe en la EP-B-1.390.485 y la WO-A-02095019, es más adecuado para tratar el disco intervertebral y el sistema nervioso central que cualquier otro crioprecipitado comercialmente disponible, por ejemplo el crioprecipitado que se basa en la metodología de Schwartz et al. y que no retiene la proporción fibronectina:fibrinógeno presente en el crioprecipitado original o tiene una proporción igual o inferior a 1:12 (Bar et al, 2005) y que comprende ácido tranexámico y/o aprotinina bovina.

El crioprecipitado de acuerdo con la presente invención contiene ciertas sustancias y una proporción fibronectina:fibrinógeno específica que estimulan la unión, migración y proliferación de células derivadas de la notocorda, un fenómeno que puede facilitar el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica la degeneración y/o lesión del disco intervertebral como disco intervertebral degenerativo y enfermedad, trastorno o

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condición del sistema nervioso central.

El crioprecipitado de acuerdo con la invención puede comprender un agente estabilizante, por ejemplo, arginina o lisina o mezclas de arginina y lisina, o sus sales farmacéuticamente aceptables. La solución de crioprecipitado comprende una mezcla de proteínas como fibrinógeno, Factor VIII, Factor XIII, fibronectina, factor de von Willebrand (vWF), vitronectina y similares. La solución de crioprecipitado puede comprender un inhibidor de proteasa distinto de aprotinina bovina y/o ácido tranexámico. Tal crioprecipitado se describe en la WO-A- 9833533 y la US-B-6.121.232, en donde la plasmina y el plasminógeno se eliminan como se describe en la EP-B- 1.390.485 y la WO-A-02095019. El procedimiento de inactivación del virus puede llevarse a cabo mediante nanofiltración, tratamiento con solvente/detergente, tratamiento térmico como, pero no limitado a, pasteurización, irradiación con rayos gamma o UVC (<280 nm), o mediante cualquier otro método conocido en la técnica. El término "partícula infecciosa" se refiere a una partícula microscópica, como un microorganismo o un prión, que puede infectar o propagarse en las células de un organismo biológico. Las partículas infecciosas pueden ser partículas virales.

El procedimiento de inactivación viral puede llevarse a cabo añadiendo una molécula a la composición antes y/o durante el procedimiento de purificación. Las moléculas añadidas y sus productos pueden eliminarse por gravitación, cromatografía en columna o cualquier otro método conocido en la técnica.

La eliminación de partículas infecciosas puede llevarse a cabo mediante nanofiltración o mediante métodos de absorción selectiva como afinidad, intercambio de iones o cromatografía hidrófoba. El procedimiento de inactivación de virus puede usarse como el procedimiento descrito en la WO-A-9114439. Un principio básico es el tratamiento del crioprecipitado con detergentes especiales y la eliminar después el detergente del

crioprecipitado. Puede llevarse a cabo un procedimiento de inactivación viral multi-pasos. Por ejemplo, la composición puede someterse a tratamiento con solvente/detergente, tratamiento térmico, cromatografía selectiva y nanofiltración. En una realización de la invención, el crioprecipitado es inactivado por doble viral. De acuerdo con la invención, el crioprecipitado es un crioprecipitado concentrado. El crioprecipitado se concentra en el intervalo de aproximadamente un factor de 2 a aproximadamente un factor de 5. En una realización de la invención, el factor de concentración es de aproximadamente 3. En una realización de la invención, el crioprecipitado se concentra por ultrafiltración a una concentración de proteínas de 60 a 100 mg/ml. La concentración de fibrinógeno en el VIPCC puede ser muy alta y puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 mg/ml, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mg/ml, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mg/ml.

Como se muestra en los ejemplos, los niveles de fibrinógeno aumentados interfieren con la unión, el crecimiento y la proliferación del núcleo pulposo. Sin embargo, la alta proporción de fibronectina:fibrinógeno en el VIPCC parece mitigar el efecto no deseable del fibrinógeno presente en niveles elevados en VIPCC.

En una realización de la invención, el crioprecipitado de plasma está activado. En otra realización adicional de la invención, el crioprecipitado no está activado. El procedimiento de activación puede lograrse mezclando dicho crioprecipitado con un volumen equivalente de un enzima que es capaz de reaccionar con el fibrinógeno para formar fibrina. En una realización de la invención, el enzima es trombina y/o una solución obtenible de veneno de serpiente. La trombina está típicamente aislada de los seres humanos. También es posible que el enzima que es capaz de formar fibrina se prepare por métodos recombinantes. El crioprecipitado de acuerdo con la invención y/o el compuesto activador se pueden suministrar como una solución o en una forma sólida, por ejemplo como un polvo liofilizado. La solución puede estar en estado congelado.

El VIPCC activado de la invención que tiene las propiedades biomecánicas y fisiológicas del núcleo pulposo puede usarse ventajosamente para reemplazar el tejido natural dañado del núcleo pulposo.

El crioprecipitado puede comprender un agente de contraste. Un "agente de contraste" se refiere a un trazador que puede hacer posible visualizar la anatomía de la espina dorsal. La técnica que puede usarse en el método divulgado en la presente incluye escaneo, formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía, nanotecnología, video digital, rayos X o cualquier otra técnica conocida en la técnica.

Los ejemplos no limitativos de agentes de contraste son colorantes orgánicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste puede elegirse entre varios agentes no tóxicos, como yodo. Si el espectro del agente de contraste no es visible para el ojo humano, el agente puede detectarse con el equipo apropiado.

En la presente se divulga la formación de una matriz bidimensional adecuada para el crecimiento de células derivadas de la notocorda. También, se describe un andamiaje tridimensional para aplicaciones in vivo y/o in vitro que incluye un implante biocompatible para diseño de tejidos in vivo, así como para el cultivo in vitro de células. El término "diseño de tejidos" se refiere típicamente al uso de una combinación de factores bioquímicos y fisicoquímicos adecuados para restaurar, reemplazar, mantener y/o mejorar la función del tejido o un órgano completo. El término diseño de tejidos a veces es sinónimo del término medicina regenerativa.

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El término "andamiaje" se refiere generalmente a una matriz tridimensional que es capaz de proporcionar integridad estructural y soporta una formación de tejido tridimensional, permitiendo de este modo la reconstrucción del tejido.

El andamiaje de la invención posee las siguientes propiedades: no tóxico, biocompatible, biodegradable, permite la unión y migración de células derivadas de la notocorda, y permite la difusión de células vitales.

El andamiaje de la invención también puede usarse para administrar y retener una composición de células que comprende células derivadas de la notocorda, como células de núcleo pulposo.

En una realización de la invención, dicho crioprecipitado activado que es capaz de formar un andamiaje tridimensional in vivo puede administrarse mediante inyección en una espina lesionada, por ejemplo, en el núcleo pulposo de un disco degenerativo o un SNC lesionado de un sujeto que lo necesita. El crioprecipitado activado in vivo puede utilizarse para proporcionar soporte mecánico, restablecer la altura y/o la fuente de anclaje celular a un sitio defectuoso o lesionado in situ y/o proporcionar una matriz en la que las células del sitio lesionado pueden migrar, invadir, crecer, proliferar, y/o diferenciarse.

El andamio de formación in vivo puede ser un material inyectable que puede administrarse en la espina dorsal lesionada como un líquido a través de una cánula o aguja y endurecerse en el cuerpo. En una realización de la invención, el andamiaje de formación in vivo puede adaptarse a la forma de la cavidad y rellenar completamente el espacio discal permitiendo de este modo una mejor estabilidad del segmento vertebral.

El crioprecipitado puede inyectarse simultáneamente con un compuesto activador y endurecerse in vivo. En una realización de la invención, el componente activador y el VIPCC se administran a lo largo de la médula espinal lesionada y el VIPCC activado sirve como andamiaje para la reconstrucción de la médula espinal lesionada y/o rota provocada, por ejemplo, por compresión del disco intervertebral.

La composición de VIPCC puede usarse para la reconstitución de disco intervertebral degenerado en una enfermedad, trastorno o afección en diferentes etapas de desarrollo. En una realización de la divulgación, el método de acuerdo con la divulgación se usa para prevenir la hernia de disco intervertebral. En otra realización de la divulgación, el método de acuerdo con la divulgación es para su administración a un sujeto en una etapa temprana de la enfermedad del disco intervertebral antes de que tenga lugar la hernia. En una realización adicional de la invención, el crioprecipitado activado sirve como un andamiaje para la reconstrucción del núcleo pulposo en un sujeto en etapa avanzada de enfermedad del disco intervertebral y/o lesión de la médula espinal provocada, por ejemplo, por compresión o hernia del disco intervertebral.

El VIPCC puede usarse para restaurar la altura y/o para reducir o aliviar el dolor discogénico. Los individuos con alto riesgo de tener enfermedad discal degenerativa como pacientes que padecen osteoporosis pueden monitorizarse para detectar cambios en la altura del disco y, cuando se detecta una disminución, puede administrarse el VIPCC de la invención para restaurar o elevar la altura del disco.

Alternativamente, el método divulgado en la presente comprende el paso de extirpar todo o una parte del núcleo pulposo antes de administrar dicho crioprecipitado. El procedimiento de eliminación puede llevarse a cabo enzimáticamente alterando la matriz extracelular, mecánicamente, usando una sonda Nucleotome y/o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Por ejemplo, puede llevarse a cabo cirugía mientras el paciente está profundamente dormido o sin dolor, por ejemplo, por anestesia general o local, respectivamente. Puede llevarse a cabo una incisión sobre el sitio de degeneración, generalmente la zona lumbar, en la línea media. El hueso que se curva alrededor y cubre la médula espinal (lámina) puede extraerse (laminectomía) y se puede retirar el tejido que está provocando presión sobre el nervio o la médula espinal. El orificio a través del cual pasa el nervio puede agrandarse para evitar presión adicional sobre el nervio.

Algunas veces, puede usarse un trozo de hueso (injerto óseo), jaulas intercorporales, o tornillos pediculares para fortalecer el área de la cirugía. El crioprecipitado de la invención puede introducirse a través del orificio y/o puede usarse para recubrir los medios usados para fortalecer el área de la cirugía.

En una realización de la divulgación, el paciente recibe anestesia local y el procedimiento es un procedimiento mínimamente invasivo (MIS).

Ejemplos no limitativos de técnicas de separación mecánica incluyen molido, corte en trozos, corte en rodajas, molienda, pulverización, cizallamiento, trituración, recorte, pelado, despellejado. El aislamiento de las células de disco puede facilitarse adicionalmente con el uso de otras técnicas de separación conocidas, como filtros, centrífugas, columnas de separación, columnas de afinidad, o mediante cualquier otra técnica conocida en la técnica.

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Los enzimas proteolíticos capaces de degradar el tejido del cartílago incluyen, pero no están limitados a, serina peptidasas, por ejemplo, tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática; cisteína peptidasas, por ejemplo, papaína quimopapaína; peptidasas aspárticas, por ejemplo, pepsina, metalo peptidasas, por ejemplo, colagenasa, gelatinasa, pronasa, condroitinasa; hialuronidasa y/o materiales químicos alternativos que degradarían el material del disco de la misma manera o similar, y combinaciones de los mismos.

Debe entenderse que la cantidad de la solución de enzimas farmacológicamente adecuada requerida para la degradación del tejido del disco de mamífero variará.

El término "solución farmacológicamente adecuada" se refiere a disolver una cantidad eficaz de enzimas proteolíticos en una solución. El pH de la solución puede ajustarse a un pH fisiológicamente compatible de aproximadamente 7.40 para la activación máxima de los enzimas proteolíticos. Para mejores resultados, la solución puede contener todos los componentes necesarios para activar los enzimas proteolíticos.

Los enzimas proteolíticos capaces de degradar el tejido del cartílago pueden suministrarse como una solución y/o en una forma sólida como polvo liofilizado. La solución y/o el polvo son estériles, libres de pirógenos en estado congelado en seco hasta inmediatamente antes de su uso. El vial, que contiene el polvo liofilizado, se deja típicamente calentar a temperatura ambiente y se reconstituye en una solución acuosa estéril.

Como se usa en la presente, el término "pirógeno" se refiere a partículas infecciosas, como un virus, un prión, una endotoxina y/o una exotoxina, que pueden infectar o propagarse en las células de un organismo biológico.

El paciente puede colocarse lateralmente y doblarse hacia adelante y la aguja o la cánula pueden colocarse selectivamente en el núcleo pulposo bajo guía, por ejemplo, escaneo, formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía, nanotecnología, video digital y/o rayos X, o por cualquier otra técnica conocida en la técnica.

Ejemplos no limitativos de agentes de guía son colorantes orgánicos no tóxicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. Si el espectro del agente guía no es visible para el ojo humano el agente puede detectarse con el equipo apropiado.

Una vez que se verifica la ubicación, la solución de enzimas proteolíticos puede aplicarse como mediante inyección en el área lesionada para degradar todo o una parte del tejido del núcleo pulposo. El tejido digerido puede aspirarse y colocarse en un tubo. Puede añadirse un medio de crecimiento como medio DMEM/F12 de Ham a la suspensión.

En otra realización de la invención, el tejido del núcleo pulposo se extirpa usando una sonda Nucleotome. El paciente puede colocarse lateralmente y doblarse hacia adelante y la cánula que contiene la sonda Nucleotome puede insertarse bajo guía como se ha especificado anteriormente. La sonda Nucleotome tiene una punta redondeada que puede resecar y aspirar tejido del núcleo pulposo del disco lumbar. El tejido del núcleo pulposo recogido puede digerirse parcial o completamente a 37° C con solución enzimática proteolítica capaz de degradar el tejido del cartílago como se ha especificado anteriormente.

El VIPCC activado de la invención que puede curarse in vivo puede administrarse con las células del núcleo pulposo recogidas, proporcionando de este modo una construcción eficaz en la que las células inyectadas pueden crecer en un modo tridimensional.

En el caso de que las células del núcleo pulposo se traten con enzima proteolítico, antes del procedimiento de administración, la solución de enzima proteolítico se puede enjuagar de las células y/o tejido del núcleo pulposo disociado añadiendo una cantidad eficaz de inactivadores y/o eliminando los enzimas proteolíticos mediante centrifugación y descartando la fase sobrenadante, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Las células del núcleo pulposo disociadas recogidas pueden congelarse en nitrógeno líquido y luego almacenarse a -80° C hasta su uso.

Alternativamente, el método de la divulgación puede incluir, sin excluir otras posibilidades, células autólogas, alogénicas, xenogénicas y/o que albergan ADN recombinante.

El término células "autólogas" se refiere a células derivadas originalmente del mismo individuo en el que se reimplantarán.

El término células "alogénicas" se refiere a células obtenidas del cuerpo de un donante de la misma

especie.

Las células "xenogénicas" son aquellas aisladas de individuos de otra especie.

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Las células inyectadas pueden comprender una composición de células que comprende células seleccionadas de células derivadas de la notocorda.

Por tanto, el crioprecipitado de la invención puede administrarse en el disco, opcionalmente con células derivadas de la notocorda, como células de núcleo pulposo.

La población de células puede comprender además células del anillo fibroso (por ejemplo, de cadáver).

En una realización de la divulgación, las células inyectadas son células del núcleo pulposo. En una realización adicional de la divulgación, las células son de origen autólogo. En otra realización adicional de la divulgación, la eliminación del núcleo pulposo autólogo y los pasos de suministro o reimplantación de células se realizan dentro del mismo procedimiento quirúrgico.

Las células a ser administradas en la espina dorsal lesionada pueden incluirse en el componente de activación, por ejemplo, trombina, en el componente de crioprecipitado, y/o pueden estar en un componente separado.

De acuerdo con una realización de la divulgación, las células a ser administradas en la espina lesionada pueden cultivarse ex vivo antes del procedimiento de administración en un crioprecipitado que comprende una proporción de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5. En otra realización más de la invención, el crioprecipitado contiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:7. En otra realización adicional más de la invención, la proporción de fibronectina: fibrinógeno es de aproximadamente 1:7.

Las células cultivadas ex vivo pueden cultivarse en crioprecipitado activado y/o no activado. El procedimiento de activación puede lograrse mezclando dicho crioprecipitado con un enzima que es capaz de reaccionar con el fibrinógeno para formar fibrina. En una realización de la invención, el enzima es trombina y se añade en un volumen equivalente al crioprecipitado. En otra realización de la invención, el enzima es una solución obtenible de veneno de serpiente. La trombina puede aislarse del plasma de seres humanos o mamíferos y/o prepararse por métodos recombinantes. El crioprecipitado de la invención y/o el enzima capaz de formar fibrina se puede suministrar como una solución o en forma sólida, por ejemplo como un polvo liofilizado. La solución puede estar en estado congelado. Como se usa en la presente, el cultivo celular "ex vivo" se refiere a cultivar células fuera del cuerpo. El cultivo celular ex vivo incluye cultivo celular in vitro, por ejemplo, en suspensión, o en placas de pocillos únicos o múltiples. El cultivo ex vivo también incluye el co-cultivar células con diferentes tipos de células y cultivar en matrices bi- o tridimensionales.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica una degeneración y/o lesión del disco intervertebral como para un disco intervertebral degenerativo. El kit comprende un primer recipiente que comprende un VIPCC de acuerdo con la invención, y un segundo recipiente que comprende un enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno. De acuerdo con la invención, el ácido tranexámico y la aprotinina bovina están ausentes del kit.

En una realización de la invención, se usa VIPCC en el que se han reducido el plasminógeno y la plasmina a igual o menos de 15 pg/ml como por ejemplo 5 pg/ml o menos.

En otra realización de la invención, el kit está dirigido a la administración de soluciones terapéuticas en el tratamiento de emergencia de la lesión de la médula espinal u otra mitigación de axones lesionados en un sistema nervioso central lesionado.

El kit también puede comprender un agente de contraste, por ejemplo, para localizar el sitio de administración y mejorar la formación de imágenes. El agente de contraste se puede incluir en el recipiente que comprende el componente de crioprecipitado, en el recipiente que comprende el componente de enzima y/o en un recipiente separado. En una realización de la invención, el agente de contraste se formula con el crioprecipitado. En otra realización de la invención, el agente de contraste se formula con el enzima capaz de formar fibrina. Los ejemplos de agentes de contraste incluyen, pero no están limitados a, colorantes orgánicos, colorantes alimentarios y/o colorantes fluorescentes. El agente de contraste puede elegirse entre varios agentes no tóxicos, como yodo. Las técnicas que pueden usarse para detectar el agente de contraste incluyen escaneo, formación de imágenes por resonancia magnética, tomografía, nanotecnología, video digital, Rayos X o cualquier otra técnica conocida en la técnica. Si el espectro del agente de visualización no es visible para el ojo humano, el agente puede detectarse con el equipo apropiado.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende: un primer recipiente que comprende un VIPCC de acuerdo con la invención, un segundo recipiente que comprende un enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno, y un tercer recipiente que comprende un enzima proteolítico capaz de degradar la matriz extracelular como enzimas proteolíticos capaces de degradar tejido de cartílago seleccionados del grupo que consiste de serina peptidasas, cisteína peptidasas, peptidasas aspárticas, metalo peptidasas, hialuronidasa y

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combinaciones de las mismas.

En una realización de la invención, el enzima proteolítico se selecciona del grupo que consiste de tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática, papaína, quimopapaína, pepsina; colagenasa, gelatinasa, pronasa condroitinasa, hialuronidasa y/o materiales químicos alternativos que degradarían el material del disco de la misma manera o similar, y combinaciones de los mismos. El kit también puede comprender un agente de contraste, por ejemplo, yodo, como se ha descrito anteriormente.

El crioprecipitado y/o el enzima capaz de formar fibrina y/o el enzima proteolítico y/o el agente de contraste pueden proporcionarse en los kits de reconstrucción intervertebral espinal y del sistema nervioso central como una solución y/o en forma sólida, por ejemplo, como polvo liofilizado. La solución puede estar en estado congelado. Los kits pueden comprender instrucciones de uso. Los kits también pueden comprender una aguja como una aguja espinal incluyendo, por ejemplo, una aguja espinal curva. Puede usarse alternativamente una cánula espinal. Puede incluirse en el kit una jeringuilla simple, doble o de barril múltiple u otro dispositivo de administración de sellador de fibrina.

La materia de la presente invención se refiere a un andamiaje adecuado para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica la degeneración y/o lesión del disco intervertebral como para la regeneración del disco intervertebral espinal y el sistema nervioso central. El andamiaje se prepara usando un crioprecipitado de acuerdo con la invención y un compuesto activador. De acuerdo con la invención, la composición de VIPCC no contiene ácido tranexámico y/o aprotinina bovina.

Los componentes de los kits de reconstrucción espinal, o formulaciones, pueden estar en recipientes separados como jeringuillas que pueden aplicarse en cualquier orden, por ejemplo, los componentes pueden aplicarse simultáneamente o uno después del otro y se forma un andamiaje cuando se mezclan los componentes.

En una realización de la invención, los recipientes separados pueden configurarse para aplicar dicho crioprecipitado, un enzima capaz de formar fibrina, y células derivadas de la notocorda. En otra realización de la invención, las células derivadas de la notocorda pueden combinarse con dicho crioprecipitado y/o con el enzima capaz de formar fibrina antes de mezclar los componentes.

De acuerdo con la invención, los componentes del kit pueden proporcionarse como una solución y/o en forma sólida. La solución puede estar en estado congelado.

Otro objeto de la invención es establecer un banco de tejidos o células de células derivadas de la notocorda cultivadas en un andamiaje como se ha especificado anteriormente.

En una realización de la invención, el tejido o banco de células puede usarse en la reparación y/o regeneración del disco intravertebral y la reconstrucción del sistema nervioso central. En una realización de la invención, las células derivadas de la notocorda son células de núcleo pulposo.

De acuerdo con la invención, el tejido o banco de células puede comprender células autólogas, alogénicas, xenogénicas y/o que albergan ADN recombinante.

Como se usa en la presente, "banco de tejidos o células" se refiere a un banco de tejidos o células desarrollado por un método que permite el establecimiento de células derivadas de la notocorda adecuadas para reparar, regenerar y/o reemplazar espina dorsal dañada, por ejemplo, tejido de disco intervertebral y tejido del sistema nervioso central como axones y neuronas motoras. Las células en dicho banco de tejidos o células pueden mantener sus características, por ejemplo, propiedades bioquímicas, morfológicas y/o físicas, necesarias para realizar una función especializada. Ventajosamente, las células tienen la capacidad de proliferar y/o diferenciarse en células del núcleo pulposo en modo bidimensional o construcciones tridimensionales.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vehículo que puede usarse ventajosamente para administrar una composición de células que comprenden células derivadas de la notocorda en una espina dorsal dañada como un disco intervertebral dañado y tejido del sistema nervioso central ya que el crioprecipitado de acuerdo con la invención proporciona un andamiaje adecuado en el que las células derivadas de la notocorda pueden unirse, migrar, crecer, dividir, mantener su función, morfología y/o diferenciarse. El vehículo o la construcción comprenden crioprecipitado de acuerdo con la invención y células derivadas de la notocorda. El ácido tranexámico y la aprotinina bovina se excluyen de la composición de crioprecipitado. En una realización de la invención, las células derivadas de la notocorda son células del núcleo pulposo. El vehículo de administración celular puede comprender además células del anillo fibroso.

El término "vehículo" se refiere a un medio para la administración de células en un tejido específico in vivo. Las células viables se incorporan en el vehículo de administración celular de acuerdo con la invención y se administran en la espina dorsal dañada, como el disco intervertebral o el sistema nervioso central, permitiendo la

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reconstitución, reparación o restauración del sitio dañado. El dispositivo de administración celular puede estar en un estado líquido o como una construcción curada.

Las células administradas pueden ser autólogas, alogénicas, xenogénicas y/o células que albergan ADN recombinante. Las células de disco cultivadas en monocapa tienden a des-diferenciarse y perder su fenotipo celular típico ((Benya y Shaffer. "Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels". Cell. 1982;30:215-224). De acuerdo con la invención se ha descubierto que las células del anillo fibroso y las células derivadas de la notocorda, por ejemplo, núcleo pulposo cultivado en crioprecipitado de la invención mantienen su fenotipo y proporcionan una matriz que puede usarse en una expansión in vitro e in vivo para cirugía reconstructiva del cartílago y sistema nervioso central. Se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que el VIPCC tiene componentes condro-conductores que estimulan la unión celular y la proliferación de las células del anillo fibroso y del núcleo pulposo sembradas en una placa de cultivo recubierta con VIPCC. Los descubrimientos de acuerdo con la invención muestran que no se realizaron cambios o daños morfológicos detectables durante el sub-cultivo o la tripsinización. Además, incluso aunque las células migraron a lo largo de la placa de cultivo, se observó una unión diferencial a VIPCC y fibronectina. Los resultados demuestran que la fibronectina, reconocida como un agente que promueve la adhesión celular, es un componente fundamental en el VIPCC y necesita estar en una proporción específica con el fibrinógeno para facilitar la unión y proliferación de condrocitos del núcleo pulposo.

Por tanto, también se divulga en la presente un método para facilitar el crecimiento, la proliferación, la diferenciación y/o el mantenimiento de las células derivadas de la notocorda, que comprende poner en contacto la población de células de las células derivadas de la notocorda con el VIPCC de acuerdo con la invención. En otra realización más de la invención, las células derivadas de la notocorda son células del núcleo pulposo. El contacto del núcleo pulposo con el crioprecipitado puede llevarse a cabo ex vivo y/o in vivo.

El VIPCC puede ser activado o desactivado. Las células contactadas pueden ser autólogas, alogénicas, xenogénicas y/o células que albergan ADN recombinante.

El crioprecipitado de la presente invención puede tener capacidades conductoras e inductivas.

La capacidad conductora o inductiva de dicho crioprecipitado de la presente invención puede determinarse después del uso del crioprecipitado y evaluar consecuentemente la potenciación de la adhesión, migración, proliferación y/o diferenciación de las células del anillo fibroso y la notocorda cultivadas, por ejemplo, células del núcleo pulposo. Las evaluaciones de estas propiedades se llevan a cabo mediante cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, proliferación usando un hemocitómetro o mediante tinción con Hematoxilina y Eosina, diferenciación, midiendo la expresión de sulfato de condroitina, migración usando la prueba de migración como se ejemplifica a continuación.

Como se usa en la presente, el término "conductor" se refiere a la capacidad del crioprecipitado activado para servir como andamiaje sobre el cual pueden unirse, crecer, migrar, proliferar y/o diferenciarse células específicas, incluyendo "condro-conductor" o "neuro-conductor", etc.

Como se usa en la presente, el término "inductivo" se refiere a la capacidad del crioprecipitado para estimular células específicas para unirse, crecer, migrar, proliferar y/o diferenciarse, incluyendo "condro-inductivo", o "neuro-inductivo", etc.

Otro término usado para "conductor" es "quimiotáctico". El término "quimiotáctico" se refiere a respuestas fisiológicas que dan como resultado un movimiento u orientación característicos de la célula hacia un estímulo químico.

Una inyección intradiscal o intratecal puede dar como resultado un cambio en la estructura típica de la población del núcleo pulposo, por ejemplo, daño necrótico, núcleos picnóticos y cariólisis. Se ha descubierto de acuerdo con la invención que este problema puede resolverse o disminuirse incluyendo el crioprecipitado de acuerdo con la invención en la formulación a ser administrada a la espina dorsal lesionada, por ejemplo, disco degenerativo y sistema nervioso central lesionado.

El kit, la formulación, el andamiaje, el banco de tejidos o células y/o el vehículo de acuerdo con la invención, pueden comprender uno o más aditivos como, pero no limitados a, factores bioquímicos que soportan la expansión de células mientras mantienen su cometido de diferenciarse, agentes terapéuticos (como antibióticos, antiinflamatorios), analgésicos, fármacos antitumorales, factores de crecimiento, proteínas, hormonas, factores inductores de cartílago, proteoglicanos como agrecano, colágeno tipo I y II, componentes que contienen oxígeno, enzimas y similares.

Uno o más de estos componentes pueden incluirse en el componente de crioprecipitado, en el componente de activación, por ejemplo, trombina, y/o pueden estar en un componente separado.

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El kit, la formulación, el andamiaje, el banco de tejidos o células y/o el vehículo que se van a administrar a un sujeto con necesidad de reconstitución del sistema nervioso central pueden comprender inhibidores de Rho Quinasa como, por ejemplo, Cethrin®, Y-27632, C3, etc.

También se divulga en la presente un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección de la espina dorsal como enfermedad del disco intervertebral y del sistema nervioso central que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un kit, un VIPCC, células de un banco de tejidos o células y/o un vehículo de acuerdo con la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a un concentrado de crioprecipitado activado de plasma inactivado viral de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección que implica degeneración y/o lesión del disco intervertebral. De acuerdo con la invención, la aprotinina bovina está ausente de la composición de crioprecipitado. En una realización de la invención, dicho crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, o de 1:10 a 1:7.

El crioprecipitado puede usarse para tratar una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral, o un SNC lesionado.

Se ha descubierto de acuerdo con la invención que el VIPCC activado restableció sustancialmente la altura del IVD en comparación con los discos inyectados con PBS. Por tanto, el VIPCC activado de la invención puede funcionar como una matriz o dispositivo con propiedades mecánicas adecuadas que pueden servir ventajosamente para restablecer sustancialmente la estructura, la altura normal del disco y permitir la retención del espacio del disco bajo carga.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al VIPCC de acuerdo con la invención para su uso en la elevación o restauración de la altura del disco intervertebral. Por ejemplo, el VIPCC activado de acuerdo con la invención puede inyectarse en un disco negro para restaurar la altura del disco. En las etapas más tempranas de la degeneración del disco, cuando todavía están presentes en el disco las células del núcleo pulposo, el VIPCC de la invención elevará ventajosamente la altura del disco y servirá como andamiaje para las células del núcleo pulposo restantes. En este caso, el ácido tranexámico y la aprotinina bovina están ausentes del concentrado de crioprecipitado.

En una realización de la invención, dicho crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5, o de 1:10 a 1:7, como en una proporción de aproximadamente 1:7.

El kit, la formulación, el banco de tejidos o células y/o el vehículo de acuerdo con la invención para prevenir y/o tratar la espina dorsal lesionada pueden incluir opcionalmente células del anillo fibroso autólogas, alogénicas, xenogénicas y/o células de anillo fibroso que albergan ADN recombinante.

La divulgación de los intervalos la descripción de la invención se entiende fácilmente por el experto en la técnica. Significa la divulgación de valores y cifras continuos entre los límites de los intervalos, incluyendo las cifras y los valores limitativos. Por ejemplo, si se da un intervalo de 1:11 a 1:5, se entiende por lo menos 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6 y/o 1:5 con todas las combinaciones de sub-intervalos intermedios, como 1:11-1:9, 1:11-1:8, 1:11-1:7, 1:11- 1:6, 1:11-1:5 o 1:10-1:9, 1:10-1:8, 1:10-1:7, 1:10-1:6, 1:10-1:5 y así sucesivamente.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1:

Preparación de condrocitos del anillo fibroso y del núcleo pulposo.

Este ejemplo ilustra la preparación del cultivo celular de condrocitos. Se aisló espina lumbar del cerdo (L1- L6) 12 horas después del sacrificio (transportada a 4° C), se esterilizó con scrab septal durante 10 min y se empapó en 70% de etanol durante 5 min. El músculo y otros tejidos conectivos se eliminaron y cada cuerpo vertebral se disecó en el medio para que se pudieran obtener discos intervertebrales aislados (IVD). Los iVd aislados se sumergieron luego en un cilindro graduado que contenía PBS con 200 pg/ml de azida sódica durante unos pocos segundos. Seguido por inmersión en PBS estéril que contiene 10 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina, 2.5 pg/ml de anfotericina, 50 pg/pl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina, 65,6 pg/ml de cefalosporina y 10% de suero bovino fetal (FBS). Los especímenes se transfirieron luego a un flujo laminar estéril y el procedimiento restante se hizo bajo condiciones estériles.

Cada IVD se cortó por la mitad usando un escalpelo y el tejido del núcleo pulposo se separó cuidadosamente y se colocó en una placa de cultivo celular de 97 mm. El tejido del núcleo pulposo se enjuagó tres

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veces en PBS suplementado con los antibióticos mencionados anteriormente y FBS para eliminar residuos residuales. Luego, el tejido del núcleo pulposo se sometió a digestión suave (durante 3 horas) con una solución de colagenasa (Sigma N° de catálogo C-6885; 3 mg/ml en una mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 de Ham ((Biological industries) suplementado con 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 0,25 pg/ml de anfotericina, 100 mg/pl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina y 6,56 pg/ml de cefalosporina) durante 3 h a 37° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.

Antes del procedimiento de digestión la solución de colagenasa se transfirió a través de un filtro de 0,45 pm (Millipore SLHV033RS).

El tejido digerido se filtró a través de una gasa estéril y se centrifugó a 800 g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, se descartó la fase de sobrenadante y las células se resuspendieron en 2 ml de DMEM/12F de Ham suplementado con 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 0,25 pg/ml de anfotericina, 100 mg/pl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina y 6,56 pg/ml de cefalosporina.

El tejido del anillo fibroso se eliminó de los IVD abiertos, se colocó en un plato de cultivo celular de 97 mm y se enjuagó dos veces en PBS que contenía 10 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2,5 pg/ml de anfotericina, 50 pg/pl de gentamicina, 10 pg/ml de vancomicina, 65,6 pg/ml de cefalosporina y 10% de FBS. El tejido del anillo fibroso se desmenuzó en trozos pequeños (3-5 mm) usando un escalpelo. El tejido desmenuzado se incubó durante la noche a 37° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Después de la incubación, el tejido se digirió con una solución de colagenasa (preparada como se ha mencionado anteriormente) en 5% de CO2a 37° C durante 5 horas. Después de que se hubo completado la digestión, la suspensión celular se transfirió a través de una gasa estéril. Posteriormente, la suspensión se centrifugó a 800 g durante 5 minutos y el sedimento que contenía condrocitos del anillo fibroso se resuspendió en 2 ml de medio DMEM/F12 de Ham recién preparado (complementado como se ha mencionado anteriormente).

Ejemplo 2:

Efecto de la trombina, el concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC) y los componentes del mismo en la unión y proliferación de células del anillo fibroso.

El siguiente ejemplo se llevó a cabo para investigar el efecto de la trombina, VIPCC y los componentes del mismo en la unión, proliferación y quimiotaxis de células del anillo fibroso. Con este propósito, se recubrió una placa de cultivo de plástico de 97 mm en la circunferencia con 80 pl de las siguientes soluciones: VIPCC (BAC; Omrix, IL; preparado como se describe en la EP-B-534.178 , en donde la plasmina (ogen) se eliminó como se describe en la EP-B-1.390.485); fibrinógeno humano purificado (Enzyme research; N° de catálogo FIB1 2800L); trombina (Omrix, IL, preparada como se describe en la US-B-5.143.838 y en la EP-B-378.798); y albúmina sérica humana (Sigma; N° de catálogo A7030) ver Fig. 1. Cada solución contenía 5-20 pg/ml de proteína total. Las diluciones se realizaron en solución salina. El contenido de fibrinógeno en el recubrimiento de fibrinógeno purificado y en el recubrimiento de VIPCC fue de aproximadamente 8 pg. Las soluciones se dejaron secar en un flujo laminar bajo condiciones estériles. Posteriormente, se colocaron 150 pl de células del anillo fibroso (5X106) suspendidas en medio de crecimiento (DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibióticos anteriormente mencionados y 10% de FBS) en el centro de la placa (Fig. 1 Origen), se cubrió el plato y se incubó durante la noche a 37° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Después de la incubación, se descartó el medio y se reemplazó por 10 ml de medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con antibióticos y 10% de FBS), y la placa de cultivo se incubó durante 14 días adicionales.

Las evaluaciones histológicas de los cultivos bidimensionales anteriores se realizaron mediante método de tinción con Hematoxilina y Eosina. Brevemente, los condrocitos cultivados fueron fijadas con 95% de etanol durante 15 min, se lavaron en H2O y se expusieron a solución de Hematoxilina Gill NR1 (Sigma; N° de catálogo GHS116) durante 3 min. Luego los cultivos se lavaron en H2O, se contra-tiñeron con Eosina Y (Sigma; N° de catálogo E4382) durante 30 segundos y se enjuagó en 95% de etanol y H2O. Posteriormente, las células se lavaron en H2O tres veces y se analizaron macroscópica y microscópicamente Como se ve en la Fig. 1, las células del anillo fibroso sembradas en el centro de una placa de cultivo migraron uniformemente por todo el campo, pero mostraron mejor unión y proliferación en los puntos recubiertos que comprendían VIPCC en comparación con las placas no recubiertas o puntos recubiertos con fibrinógeno humano, trombina o albúmina sérica humana. Los resultados indican que el VIPCC tiene componentes condro-conductores que estimulan la unión y proliferación de células del anillo fibroso y puede facilitar la reconstrucción del disco intervertebral degenerativo.

Ejemplo 3:

Efecto del procedimiento de tripsinización y/o pase sobre la unión y proliferación de células del anillo fibroso mediado por VIPCC.

El número de pase se refiere a la "edad" de una línea celular o al número de veces que las células han sido

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subcultivadas. Algunas líneas celulares pueden mostrar cambios morfológicos después de los pases. Adicionalmente, los procedimientos de cultivo celular usados para el subcultivo, como la tripsinización, pueden dañar las membranas celulares, lo que da como resultado una unión deficiente, aglutinación o membranas con apariencia "irregulares". El presente estudio estaba dirigido a determinar los efectos de la tripsinización y/o el pase sobre la unión y proliferación celular de los condrocitos del anillo fibroso mediado por VIPCC. Para este propósito, se aislaron condrocitos derivados del anillo fibroso (como se describe en el Ejemplo 1) y se colocaron 500 |jl que contenían 0,625 X 105 células en un pocillo de una placa de 24 pocillos sin recubrir. El cultivo se incubó durante 11 días en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37° C. Después de la incubación, las células se disociaron enzimáticamente mediante la adición de 100 jl de tripsina (Tripsina-EDTA Biological Industries, 03-050- 1A) a cada pocillo a 37° C durante 5 min. Los condrocitos disociados se recogieron de tres pocillos en un vial y la suspensión celular se centrifugó a 800 g durante 5 minutos. Se descartó la fase de sobrenadante, las células se resuspendieron en 200 jl de medio DMEM/F12 de Ham (suplementado con antibióticos y 10% de FBS) y se colocaron en el centro de una placa de cultivo plástico de 97 mm recubierta en la circunferencia con gotas de 80 jl de las siguientes soluciones: VIPCC que contenía 6,4 jg de proteína total (de la cual 4,7 jg era fibrinógeno), 3 jg de fibrinógeno humano purificado, 0,18 jg de fibronectina (producida de acuerdo con Miekka et al. "Rapid methods for isolation of human plasma fibronectin". Thromb Res. 1982;27:1-14), y una mezcla de fibronectina/fibrinógeno humano purificada en una concentración de 0,3: 2,7 jg, respectivamente (proporción aproximada de 1:10). El cultivo fue incubado en 5% de CO2 a 37° C durante 24 horas, se lavó dos veces en un medio de crecimiento para eliminar las células no unidas, y se añadieron 10 ml de medio DMEM/F12 de Ham (suplementado con antibióticos y 10% de FBS). Los cultivos se incubaron durante 9 días adicionales. La evaluación morfológica se realizó mediante tinción de las células con soluciones de Hematoxilina y Eosina, seguida de observación macroscópica y microscópica.

Los resultados muestran que el procedimiento de subcultivo o tripsinización no da como resultado ningún cambio morfológico de las células del anillo fibroso. Además, es evidente que las células migraron a lo largo de la placa de cultivo, pero se observó una unión diferencial al recubrimiento de VIPCC y fibronectina (Fig. 2). Los resultados demuestran que la fibronectina, reconocida como un agente que promueve la adhesión celular, es un componente fundamental en el VIPCC que estimula la unión y proliferación de células de condrocitos.

Ejemplo 4:

Efecto del fibrinógeno: proporción de fibronectina sobre la unión y proliferación de células del anillo fibroso y el núcleo pulposo.

El ejemplo anterior ilustra el papel de la fibronectina presente en el componente de VIPCC en la estimulación de la migración, proliferación y unión de los condrocitos del anillo fibroso. El presente experimento se diseñó para investigar el efecto de diferentes proporciones de mezclas de fibronectina:fibrinógeno sobre la unión y proliferación de células de condrocitos del núcleo pulposo y del anillo fibroso. Con este propósito, se recubrió un pocillo de una placa de veinticuatro pocillos con 200 jl de uno de los siguientes componentes: 0,626 jg de fibronectina purificada; 10 jg de fibrinógeno humano purificado (fgn); o con una mezcla de fibronectina y fibrinógeno en la siguiente concentración: 0,626 jg: 3,13 jg, 0,626 jg: 6,26 jg, o 0,626 jg: 12,52 jg (proporciones de 1:5, 1:10 y 1:20, respectivamente). Por tanto, en los componentes, la cantidad de fibronectina se mantuvo constante, mientras que la cantidad de fibronectina se aumentó.

Se dejó que las soluciones se adhiriesen a los pocillos en un flujo laminar bajo condiciones estériles. Después de 3 horas, se eliminó el exceso de solución y la placa se puso del revés durante 2 horas adicionales de incubación para permitir el secado. Se suspendieron 500 jl de células del núcleo pulposo o del anillo fibroso recién aisladas en medio DMEM/F12 de Ham (suplementado con los antibióticos mencionados anteriormente y 10% de FBS) y se sembraron en los pocillos recubiertos anteriores a una concentración de 6 X 104 células por pocillo. Los cultivos se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37° C durante 5 y 12 días.

Las evaluaciones histológicas de los cultivos bidimensionales anteriores se realizaron después de 5 y 12 días in vitro. Los condrocitos cultivados se fijaron y expusieron a soluciones de Hematoxilina y Eosina Y como se ha especificado anteriormente. Posteriormente, el cultivo se tiñó con Violeta Cristal (1 g en 100 ml de Ácido Acético) durante 10 minutos y se lavó en H2O.

Para cuantificar el nivel de unión celular, se extrajo el color de las células con 100 jl de 70% de etanol durante 10 min. Se transfirieron alícuotas de 75 jl a una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 590 nm. La absorbancia de las células cultivadas en pocillos recubiertos con fibronectina se consideró como un 100% de unión celular.

Los resultados de la unión de las células del núcleo pulposo y el anillo fibroso después de 5 días en cultivo en los diferentes recubrimientos se presentan en las Fig. 3A y B, respectivamente. Sorprendentemente, se descubrió que, al contrario que la unión de las células del anillo fibroso, la unión de las células del núcleo pulposo se vio afectada por los diferentes recubrimientos. Los resultados muestran que un aumento en la concentración de fibrinógeno disminuyó significativamente la unión de las células del núcleo pulposo de una manera dependiente de la

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dosis. Mientras que un aumento en la proporción fibronectina:fibrinógeno lleva al resultado opuesto (Fig. 3A), por ejemplo, una mezcla purificada de fibronectina:fibrinógeno en una proporción de 1:5 mostró una mayor tasa de unión de células del núcleo pulposo en comparación con las mezclas purificadas en proporciones de 1:10 y 1:20 (Fig. 3A) Estos resultados demuestran que la fibronectina:fibrinógeno en una proporción de 1:5 es más adecuada para la unión celular y la proliferación de células del núcleo pulposo que las mezclas que comprenden una proporción de fibronectina:fibrinógeno menor.

Estos resultados indican el papel clave de la proporción fibronectina:fibrinógeno en la unión de las células del núcleo pulposo y demuestran la ventaja de usar una proporción de nivel alto de fibronectina:fibrinógeno para las células del núcleo pulposo.

Se evaluó el efecto del VIPCC que contiene una proporción de fibronectina: fibrinógeno en el intervalo de 1:10-1:5 y una mezcla purificada de fibronectina:fibrinógeno en una proporción de 1:10 en la proliferación de células del núcleo pulposo y del anillo fibroso. La proliferación celular se calculó restando el porcentaje de células unidas en el día 5 del porcentaje de células unidas el día 12. Los resultados se basan en las mediciones llevadas a cabo en el experimento anterior. Los resultados se resumen en la Tabla 1 que muestra el porcentaje de células unidas después de 5 y 12 días de cultivo.

Tabla 1: El porcentaje de células unidas del núcleo pulposo y del anillo fibroso en los _______recubrimientos de VIPCC y mezcla de fibronectina/fibrinógeno (1/10).______


: Una mezcla purificada de fn/fgn (1/10) VIPCC

: Día de cultivo Células unidas (%)

Núcleo pulposo: 5 22 56

12: 14 77

Anillo fibroso: 5 65 62

12: 71 88

Los resultados en la Tabla 1 se presentan como porcentajes de células unidas en relación con las células unidas en el recubrimiento de fibronectina en el mismo experimento (considerado como 100%).

Los resultados obtenidos indican que en el día 5 la unión de las células del núcleo pulposo fue significativamente mayor en el recubrimiento de VIPCC en comparación con una mezcla purificada de fibronectina:fibrinógeno en una proporción de 1:10 (56% y 22% de unión celular para VIPCC y la mezcla purificada, respectivamente) (Fig. 3A y Tabla 1). Por el contrario, la unión celular de los condrocitos del anillo fibroso fue similar en ambos recubrimientos (62% y 65% de unión celular para VIPCC y la mezcla purificada, respectivamente) (Fig. 3B y Tabla 1).

Adicionalmente, los resultados obtenidos en el día 12 muestran que el cultivo de células del anillo fibroso sembrado sobre recubrimiento de VIPCC mostró un aumento significativo en el número de células (62 y 88% en el día 5 y 12, respectivamente; A=26%) en comparación con un recubrimiento de mezcla de fibronectina:fibrinógeno purificada (65 y 71% en el día 5 y 12, respectivamente, A=6%). El cultivo de células del núcleo pulposo mostró un efecto similar, aunque pronunciado. El recubrimiento de VIPCC dio como resultado un aumento del 21% en el número de células (56 y 77% en el día 5 y 12, respectivamente), mientras que el recubrimiento de mezcla de fibronectina:fibrinógeno dio como resultado una disminución de las células unidas (22 y 14% en el día 5 y 12; respectivamente; A=-8%). Estos resultados demuestran que la proliferación celular de las células del núcleo pulposo y el anillo fibroso era más alta en un recubrimiento de VIPCC que en un recubrimiento compuesto de mezcla de fibronectina y fibrinógeno purificada y los condrocitos del núcleo pulposo se vieron más afectados por los diferentes recubrimientos.

Ejemplo 5:

El efecto de VIPCC y mezclas de fibronectina:fibrinógeno purificadas en el núcleo pulposo cultivado.

El efecto sobre la unión y viabilidad de las células del núcleo pulposo por las diferentes concentraciones de mezcla de fibronectina y fibrinógeno se evaluó adicionalmente usando el ensayo XTT. El ensayo se basa en la capacidad de las células viables para reducir 2,3-Bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT) de una sal de tetrazolio amarilla a un compuesto de formazano naranja soluble.

Las células del núcleo pulposo se prepararon usando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Una

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placa de 96 pocilios de fondo plano se revistió con 30 |jl de una de las siguientes soluciones: 0,626 |jg de fibronectina purificada, 10 jg de fibrinógeno humano purificado, VIPCC diluido (contiene aproximadamente 1,57 jg de fibronectina y 10 jg de fibrinógeno), y mezcla de fibronectina/fibrinógeno (0,626 jg: 6,26 jg; 1/10). Las soluciones se dejaron secar en un flujo laminar bajo condiciones estériles y luego se dispensaron los 100 jl de suspensión celular en los pocillos pre-recubiertos a una densidad de 1*104 células por pocillo. Los pocillos no recubiertos sirvieron como grupo de control. Después de un período de incubación de 4 h, el medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibióticos mencionados anteriormente y 10% de FBS) se reemplazó por medio nuevo para eliminar las células no unidas. Los cultivos se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2y 95% de aire a 37° C durante 24 horas. Al final del período de incubación, se añadieron 50 jl de reactivo XTT (XTT-Cell Proliferation Kit; Biological industries; N° de catálogo 20-300-1000) a cada pocillo, y los cultivos se colocaron en una incubadora a 37° C durante 4 horas. El color desarrollado se leyó por un lector spectro-ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se descartó el sobrenadante y se añadió medio de crecimiento nuevo. El ensayo se repitió 5 días después. La intensidad de la absorbancia es proporcional a la cantidad de células activas metabólicas. Los resultados se presentan como porcentaje de células activas metabólicas en relación con las células activas metabólicas en el recubrimiento de fibronectina (100%).

Como se ve en la Fig. 4, el recubrimiento de fibrinógeno dio como resultado una disminución significativa en el nivel de células activas metabólicas del núcleo pulposo en comparación con el recubrimiento de fibronectina (86,4 y 19,6% en el día 1 y 5, respectivamente; A=-66.8%). Un recubrimiento VIPCC, que comprende el mismo contenido de fibrinógeno y una proporción de fibronectina:fibrinógeno en el intervalo de 1:5-1:10 y una mezcla de fibronectina:fibrinógeno purificada en una proporción de 1:10, fueron capaces de mitigar la disminución de células activas metabólicas observadas en el recubrimiento de fibrinógeno. Este efecto fue particularmente pronunciado en el recubrimiento de VIPCC. Estos resultados confirman los resultados anteriores y muestran las ventajas de usar VIPCC como recubrimiento para las células del núcleo pulposo en lugar de una mezcla pura de fibronectina/fibrinógeno. Por tanto, un andamiaje para diseño de tejidos de núcleo pulposo preparado con VIPCC activado puede ser superior a los preparador con fibronectina/fibrinógeno puro activado.

Ejemplo 6:

Efecto de los niveles de fibronectina y fibrinógeno sobre el porcentaje de células del núcleo pulposo y del anillo fibroso metabólicamente activas.

El presente estudio estaba dirigido a determinar el efecto de los niveles de fibrinogeno y fibronectina sobre el porcentaje de células del núcleo pulposo y del anillo fibroso cultivadas metabólicamente activas. Con este propósito, las células derivadas del núcleo pulposo y del anillo fibroso se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Una placa de 96 pocillos de fondo plano se revistió con 30 jl de recubrimiento de fibronectina/fibrinógeno. El recubrimiento estaba compuesto de una cantidad constante de fibronectina (0,626 jg) y cantidades crecientes de fibrinógeno purificado de la siguiente manera: 0, 3,13 (una proporción de 1:5), 6,26 (una proporción de 1:10), 12,5 (una proporción de 1:20) y 146 jg (una proporción de 1:233). Se realizó otro conjunto de experimentos sobre el recubrimiento de fibronectina/fibrinógeno compuesto de una cantidad constante y elevada de fibrinógeno (9,125 jg) y cantidades crecientes de fibronectina purificada de la siguiente manera: 0,0313 (una proporción de 1: 291), 0,042 (una proporción de 1:217), 0,0626 (una proporción de 1:145) y 0,125 jg (una proporción de 1:73).

Se dejaron secar las soluciones en un flujo laminar bajo condiciones estériles y se colocaron 100 jl de suspensión celular (que contiene 1*104 células por pocillo para ambas preparaciones celulares) en los pocillos.

El cultivo se incubó durante 4 horas y el medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibióticos anteriormente mencionados y 10% de FBS) se reemplazó para eliminar las células no unidas. Los cultivos se incubaron durante 24 horas adicionales en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37° C. El efecto del fibrinógeno en la unión celular se evaluó en los días 7, 10-13 y 16 mediante el ensayo XTT como se ha descrito anteriormente. La intensidad de absorbancia es proporcional a la cantidad de células activas metabólicas. Los resultados se presentan como porcentaje de la intensidad de absorbancia de fibronectina (100%). Los datos se presentan como media ± Desviación Estándar de por lo menos tres experimentos separados (en cada experimento las células se recogieron de tres vertebrados de cerdos diferentes).

La Fig. 5 muestra el porcentaje de células del núcleo pulposo activas metabólicas en una cantidad constante de fibronectina y cantidades aumentadas de fibrinógeno en la matriz de recubrimiento (A) y en una cantidad constante y alta de fibrinógeno y cantidades aumentadas de fibronectina en la matriz de recubrimiento (B). Los resultados en la Fig. 5A muestran que a una cantidad constante de fibronectina, el aumento de las cantidades de fibrinógeno en el recubrimiento lleva a una disminución en el porcentaje de células activas metabólicas del núcleo pulposo. Las células de anillo fibroso se vieron menos afectadas por la adición de fibrinógeno (no se muestran los resultados de los cultivos de condrocitos del anillo fibroso). Las cantidades aumentadas de fibronectina en presencia de una concentración de fibrinógeno fija no mejoró el porcentaje de células del núcleo pulposo activas metabólicas. Adicionalmente, los resultados están en línea con los resultados anteriores que indican que la fibronectina:fibrinógeno en una proporción de aproximadamente 1:5 es más adecuada para la unión de

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células de condrocitos del núcleo pulposo en comparación con otras proporciones de fibronectina:fibrinógeno.

Ejemplo 7: Efecto de una construcción tridimensional preparada con VIPCC activado sobre la morfología y función de condrocitos cultivados en la construcción.

Estudios (Haudenschild et al. "Differential expression of multiple genes during articular chondrocyte redifferentiation". Anat Rec. 2001;263:91-98; Li et al. "Chondrocyte phenotype in engineered fibrous matrix is regulated by fiber size". Tissue Eng. 2006;12:1775-1785; Peretti et al. "A biomechanical analysis of an engineered cell-scaffold implant for cartilage repair". Ann Plast Surg. 2001;46:533-537) indican que la expansión de condrocitos in vitro da como resultado cambios del fenotipo, y una síntesis de proteoglicanos disminuida. Los ejemplos anteriores muestran que el VIPCC que tiene una proporción de fibronectina:fibrinógeno de aproximadamente 1: 5 es más adecuado para el crecimiento de células del núcleo pulposo. Por lo tanto, el presente experimento estaba dirigido a determinar la morfología de las células de condrocitos cultivadas en una matriz tridimensional compuesta por VIPCC activado. Con este propósito, se prepararon 750 pl de suspensión de células del anillo fibroso o del núcleo pulposo usando un VIPCC diluido 5 veces, que contenía 14 mg/ml de fibrinógeno coagulable. Para activar el componente de VIPCC y formar un coágulo, la suspensión mencionada anteriormente se colocó simultáneamente con un volumen equivalente de solución de trombina (2 IU, Omrix Biopharmaceuticals LTD, IL) en una placa de cultivo de placas de 6 pocillos. Se formó una construcción de condrocitos tridimensional que contenía 6 X 105 células por pocillo.

Después de la formación del coágulo, la construcción celular se suplementó con 0,5 ml de medio DMEM/F12 de Ham que contenía los antibióticos mencionados anteriormente y 10% de FBS. La placa del pocillo se cultivó a 37° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Después de 12 horas, se eliminó el medio y algunas de las construcciones se separaron de la pared lateral usando un escalpelo para disminuir las condiciones de tensión. Las construcciones unidas, que se consideraron cultivadas bajo condiciones de tensión más alta, sirvieron como grupo de control. Las construcciones se hicieron crecer en medio DMEM/F12 de Ham que contenía los antibióticos anteriormente mencionados y 10% de FBS y se incubaron durante 8 ó 14 días adicionales, para anillo fibroso o núcleo pulposo, respectivamente. El medio se descartó y los cultivos se fijaron con una solución de 3,7% de paraformaldehido durante 10 minutos y se tiñeron con azul Alcian (Sigma; N° de catálogo A5268) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La tinción con azul Alcian está diseñada para mostrar Mucopolisacáridos o Glicosaminoglicanos (GAG) característicamente producidos por condrocitos. El sulfato de condroitina, que pertenece a la familia GAG, se encuentra habitualmente en la forma de proteoglicanos que comprende la sustancia fundamental en la matriz extra celular de tejido de cartílago.

Los resultados se resumen en la Fig. 6 y muestran tinción de azul Alcian en ambos condrocitos del anillo fibroso (Fig. 6, panel superior) y del núcleo pulposo (Fig. 6, panel inferior). Los resultados demuestran que los condrocitos de tanto el anillo fibroso como del núcleo pulposo son funcionales y capaces de producir sulfato de condroitina. Los andamiajes separados (Fig. 6B y D) muestran fenotipo filamentoso y de tipo ramificado mientras que los andamiajes unidos y más tensados (Fig. 6A y C) asumieron un fenotipo tipo esfera. Por tanto, los resultados demuestran que los condrocitos cultivados en un andamiaje tridimensional de VIPCC activado son funcionales y que la tensión del andamiaje formado influye en la diferenciación fenotípica.

Ejemplo 8:

El efecto de diferentes formulaciones tridimensionales preparadas con VIPCC activado sobre la capacidad condro-conductora del VIPCC.

El objetivo del presente experimento era investigar el efecto de la formulación sobre la característica condro-conductora del VIPCC. Se preparó una suspensión de condrocitos del núcleo pulposo aislada usando tres soluciones de VIPCC diluido (1:2,5, 1:5, 1:10, que contenían una concentración final de 28, 14 y 7 mg/ml de fibrinógeno coagulable, respectivamente) en medio DMEM/F12 de Ham que contenía los antibióticos anteriormente mencionados. Posteriormente, las suspensiones anteriormente mencionadas se mezclaron con un volumen equivalente de componente de trombina (1 UI/ml, descrito en la US-B-6.121.232). El volumen final de las construcciones fue de 30, 60 o 90 pl con una dilución de VIPCC final de 1:5, 1:10 o 1:20 y de 0,5 IU/ml de trombina. Todas las diluciones contenían 1,6X105 células del núcleo pulposo. Cada mezcla se colocó en el centro de un pocillo de una placa de cultivo de placas de 24 pocillos. Después de que se formase un coágulo, se añadieron en la circunferencia 200 pl de una mezcla compuesta por 0,5 trombina IU/ml y VIPCC diluido 20 veces. Después de la formación del coágulo (aproximadamente 30 min), se añadieron 0,5 ml de medio de crecimiento (medio DMEM/F12 de Ham suplementado con antibióticos y 10% de FBS) y la placa se incubó a 37° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 durante 22 días. La característica condro-conductora del VIPCC se evaluó evaluando la capacidad de los condrocitos del núcleo pulposo para transmigrar desde la construcción central [(compuesta por diferentes diluciones de VIPCC y diferentes volúmenes (30, 60 o 90 pl)] al andamiaje periférico de VIPCC. Después de 22 días de cultivo se descartó el medio y los cultivos se fijaron con solución de 3,7% de paraformaldehido durante 10 minutos, y se tiñeron con azul Alcian durante 10 minutos a temperatura ambiente. Monitorizando la localización de las células en la placa se descubrió que la transmigración tuvo lugar exclusivamente en los volúmenes de 60 pl de VIPCC activado diluido 10 veces (que contiene 7 mg/ml de fibrinógeno coagulable). La Fig. 7muestra la

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transmigración de condrocitos del núcleo pulposo visto bajo el microscopio con un aumento de X100 en el volumen de 60 |jl de VIPCC activado diluido 10 veces (panel izquierdo; las células alineadas y formaban una estructura tipo cinturón) en comparación con condrocitos del núcleo pulposo en el volumen de 30 jl de VIPCC activado diluido 10 veces que no pudieron transmigrar (derecha). Adicionalmente, los condrocitos en todos los grupos experimentales fueron capaces de proliferar en la construcción central y fueron capaces de producir sulfato de condroitina (resultados no mostrados). Estos resultados muestran que los condrocitos del núcleo pulposo detectan un gradiente quimiotáctico y la transmigración tiene lugar solo en presencia de un gradiente químico.

Ejemplo 9:

Biocompatibilidad del VIPCC en inyección de disco intervertebral.

El ejemplo anterior muestra que el VIPCC es adecuado para su uso con células del núcleo pulposo. Por tanto, el VIPCc puede usarse para cultivar células del núcleo pulposo ex vivo o se puede inyectar en el espacio del disco intervertebral para promover el crecimiento de células del núcleo pulposo in vivo. El siguiente experimento se diseñó para investigar la biocompatibilidad del VIPCC activado comercial Omrix inyectado en el espacio del disco intervertebral. Con este propósito, se inyectaron el VIPCC y trombina en el disco intervertebral de un cerdo.

Se alojaron cerdos hembra (n = 1) que pesaban 74 kg y 6 meses de edad en una instalación autorizada de acuerdo con los requisitos éticos actuales. La anestesia se indujo con una mezcla intramuscular de ketamina (10 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg).

El examen físico se realizó antes del procedimiento quirúrgico (peso corporal, temperatura, frecuencia cardiaca y respiratoria). El ECG, el pulso y la presión arterial se monitorizaron durante el procedimiento.

Procedimiento quirúrgico: el animal se colocó lateralmente y se dobló hacia delante. Se usó un agente de contraste y sirvió como guía visual para localizar la cavidad de los iVd usando fluorografía. El agente de contraste utilizado fue yodo (0,37 g/ml de yodo, Tel Hashomer, IL). Las inyecciones se preformaron usando una jeringuilla conectada a una aguja espinal 23G de 90 mm ("phoenix" Kobayashi Shoji K.K Tokio, Japón).

Para realizar el procedimiento de inyección, se llenaron IVD vertebrados torácicos 10-11 (T10-T11) s con yodo diluido (1:1 con solución salina).

Una vez que el procedimiento de inyección fue satisfactorio, la secuencia de inyecciones del IVD fue la siguiente:

1. Los IVD L1-L2 y L3-L4 se inyectaron con solución salina ~ 200-300 l.

2. Los IVD L2-L3y L4-L5 se inyectaron con VIPCC y trombina (descritos en la US-B-7.125.569) aplicados simultáneamente (cantidad similar en el volumen total de ~ 200-300 jl) usando el dispositivo de inyección Omrix para formar un gel sólido.

Antes de cada inyección, se inyectó una cantidad muy pequeña (presente en la punta de la aguja) de un agente de contraste diluido 1:10 en el espacio del IVD para verificar el sitio de aplicación exacto (se inyectó una cantidad pequeña de manera que hubiese suficiente espacio intradiscal para la inyección de VIPCC activado).

La Fig. 8 muestra una imagen fluorográfica de discos vertebrales inyectados con control (A; solución salina) y con VIPCC activado (B). El agente de contraste se volvió invisible en el IVD inyectado con VIPCC activado.

Las fotografías y las grabaciones de video digital se tomaron después del procedimiento de inyección.

Cuidados postoperatorios: el animal recibió analgésicos no esteroideos (30 mg/kg de dipyron) y antibióticos (0,02 ml/kg de marbocil) durante los primeros 2 días después de la operación. El animal fue hospitalizado durante 14 días y se monitorizó una observación de las actividades ambulatorias (por ejemplo, estar de pie, caminar), patrones de bebida y comida y las características de comportamiento. Durante el período de observación, los animales bebieron y comieron normalmente. En los primeros seis días, mejoró la capacidad del animal para despertarse. El animal mostró debilidad de las patas traseras y cruzaba las piernas al caminar. Para el sexto día, el animal era capaz de caminar de manera constante. No se detectó fiebre durante el período de observación. El día 13 el peso del animal era de 77.5 kg (ganado 4.5 kg).

Recogida de muestras: el animal se sacrificó 14 días después de la cirugía y se retiro la espina lumbar para el análisis histológico.

La espina lumbar aislada inyectada no mostró signos de daño o inflamación del tejido circundante (Fig. 9).

Los especímenes de IVD inyectados se aislaron, de acuerdo con el procedimiento anterior (Ejemplo 1), y se

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descalcificaron en 8% de ácido fórmico hasta que el tejido fue lo suficientemente blando para la evaluación histológica.

La Fig. 10 muestra los especímenes de IVD descalcificados inyectadas con solución salina de control (A) e inyectadas con VIPCC activado (B). Las evaluaciones histológicas se realizaron mediante tinción con Hematoxilina y Eosina de la región del núcleo pulposo. Los IVD inyectados con solución salina de control mostraron grupos de condrocitos con un daño típico necrótico, núcleos picnóticos y cariólisis (Fig. 11A, 13A)Los IVD inyectados con VIPCC activado mostraron grupos de condrocitos viables en la región periférica con una estructura de citoplasma típicamente vacuolada (Fig. 11B, 13B). La región central del núcleo pulposo mostró una coloración intensa en comparación con la región periférica en ambos grupos experimentales (Fig. 12A-control y B- inyecciones de VIPCC activado). En el grupo control las diferencias fueron más pronunciadas. El color de baja intensidad en la región periférica indica una estructura normal con grupos celulares dispersos, mientras que el color intensificado presenta células necróticas. Los resultados mostrados anteriormente indican que la inyección con VIPCC activado no da como resultado ningún cambio estructural y preserva la estructura típica del tejido de los condrocito.

Ejemplo 10:

Efecto de un andamiaje tridimensional preparado con VIPCC activado sobre la morfología y función de los condrocitos del núcleo pulposo en un Cultivo de Órgano de IVD ex vivo.

El objetivo del experimento era determinar la morfología y la funcionalidad de los condrocitos del núcleo pulposo cuando se dispusieron en la construcción de VIPCC activado comercial de Omrix dentro de un IVD aislado.

En este experimento se usaron dos espinas lumbares de cerdo (L1-L6), una para recoger células y la otra para obtener IVD separados que carecían de tejido de núcleo pulposo.

La primera espina se esterilizó como se describe en el Ejemplo 1 y los cuerpos vertebrales se diseccionaron por el medio para poder obtener discos intervertebrales aislados. Luego, las células se recogieron de la siguiente manera: se inyectaron 250 pl de solución de digestión que contenía 6 mg/ml de colagenasa y 2 mg/ml de hialuronidasa en PBS (Sigma N° de catálogo C-6885 y H-2126, respectivamente) en el tejido pulposo del núcleo usando un jeringuilla de 1 ml conectada a una aguja de 16G. Los discos intervertebrales que contenían la solución de digestión se incubaron a 37° durante 1 h. Después del período de incubación, se extrajo el tejido del núcleo pulposo digerido y se evaluó la viabilidad utilizando el método de exclusión con colorante azul de tripano de la siguiente manera: se mezclaron 80 pl de solución de azul de tripano (Sigma N° de catálogo T8154, 0,15% diluido en PBS) con 20 pl de suspensión celular y se midió la viabilidad celular usando un hemocitómetro. La viabilidad celular se definió por la proporción del número de células viables con respecto al número total de células. En todos los experimentos la viabilidad excedió el 80%.

La segunda espina se cortó en los cuerpos vertebrales medios con una sierra para hueso eléctrica y el núcleo pulposo se aspiró con fuerza (0,2 - 0,5 ml) a través de una aguja de 16G (sin el uso de enzimas proteolíticos) para separar los IVD que carecían de tejido del núcleo pulposo. Las células recogidas anteriormente mencionadas (extraídas mediante una solución de digestión) se suspendieron en componente de VIPCC diluido 20 veces (en DMEM/F12 de Ham suplementado con los antibióticos mencionados anteriormente) (5 X 105 células por ml) y se inyectaron simultáneamente con 1000 IU/ml de solución de trombina (cantidad igual en el volumen total de ~ 200500 pl) en los IVD que carecían de tejido del núcleo pulposo a través de una aguja de 16G unida a un dispositivo de inyección (Omrix, IL). Después de que se formase un coágulo, los IVD inyectados se colocaron en una plataforma de plástico dentro de una caja de plástico precargada con 1 cm de PBS que contenía antibióticos (0,2% de PenStrep). De esta forma se proporcionó un ambiente húmedo (los IVD no tenían contacto directo con el PBS).

Los IVD inyectados con células se incubaron a 37° C durante 2, 3 o 6 días. Los DIV incubados durante 1 hora sirvieron como grupo de control. Después de la incubación, los discos se cortaron por la mitad usando un escalpelo y el contenido del área del núcleo pulposo se eliminó y se fijó con 3,7% de solución de formaldehido durante por lo menos 24 horas. Este paso fue seguido por inmersión en PBS (10 minutos x 3 veces). Las muestras se deshidrataron en una serie ascendente de alcoholes, 70%, 85%, 95% y 3 veces con 100% de etanol (20 min cada lavado) seguido por lavado en histoclear (Gadot Biochemical Industries Ltd., N° de catálogo L80033240) tres veces para 30 minutos cada uno. Luego, las muestras se colocaron en una mezcla 1:1 de histoclear y parafina y se calentaron en un horno a 60° C durante 1 hora x 2. Los especímenes se sometieron luego a las siguientes inmersiones en parafina: 2 h a 60° C, durante la noche a 60° C y dos veces a 60° C durante 2h. El tejido se embebió en casetes de histología de plástico llenos de parafina caliente y se dejó enfriar a 4° C.

Los tejidos embebidos en parafina se seccionaron en serie a un espesor de 8 pm y se tiñeron para sulfato de condroitina usando azul Alcian como se ha descrito anteriormente. Para contra-tinción, se usó rojo rápido nuclear (Sigma N° de catálogo 8002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Fig. 14muestra la morfología de las células del núcleo pulposo y la producción de sulfato de condroitina

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de condrocitos dispuestos en andamiajes tridimensionales formados por mezcla de VIPCC diluido 20 veces y trombina dentro de discos intervertebrales aislados. La evaluación histológica se realizó usando un microscopio de fluorescencia invertida 1 hora, 3 y 6 días después del procedimiento de inyección.

El grupo de control no mostró expresión de sulfato de condroitina en el entorno colindante de las células (Fig. 14A). La expresión de sulfato de condroitina se puede ver a partir del tercer día en adelante. En el tercer (Fig. 14 B) y sexto día (no mostrado) después de la inyección, una expresión significativa de sulfato de condroitina es aparente a lo largo del coágulo completo y alrededor de la célula. El sexto día se observó un espacio grande en el área que rodea la célula, aparentemente como resultado de un aumento en el número de células que lleva a la secreción de enzimas proteolíticos y finalmente a la lisis de la construcción (no mostrada).

También, los resultados demuestran que las células de condrocitos asumieron un fenotipo redondeado típico en el andamiaje 3D formado por VIPCC activado en todos los puntos temporales después de la inyección (Fig. 14 B).

Estos resultados indican que el VIPCC activado soporta el crecimiento y la funcionalidad de la célula del núcleo pulposo inyectada dentro de los discos intervertebrales, permitiendo a las células mantener su morfología de de tipo salvaje tipo esfera y producir sulfato de condroitina.

Ejemplo 11:

Restauración de la altura del disco intravertebral usando VIPCC activado inyectable.

El núcleo pulposo es capaz de resistir cargas compresivas y el anillo fibroso soporta tensión y proporciona resistencia mecánica (Revell et al "Tissue engineered intervertebral disc repair in the pig using injectable polymers". J Mater Sci Mater Med. 2007;18:303-308). El siguiente ejemplo ilustra la capacidad de usar VIPcC activado comercial Omrix para resistir la carga de compresión y retener sustancialmente la altura original del disco. Para obtener discos intervertebrales aislados, se cortaron cuerpos vertebrales lumbares de cerdo por el medio usando una sierra para hueso eléctrica. Posteriormente, los discos intravertebrales aislados se aplanaron usando una lijadora eléctrica para producir superficies superiores e inferiores simétricas paralelas y lisas. Los discos intravertebrales aislados se colocaron en máquinas de ensayo de tensión y compresión (LF plus, LLOYD instruments Ltd, Hampshire, RU) y se midió la compresión bajo cargas gradualmente crecientes (25-500 N).

Cada disco intravertebral se midió a una carga de 10 N para determinar la altura de la muestra inicial seguido de mediciones de compresión a 25-500 N. Luego, los discos intravertebrales se vaciaron mediante la inyección de una solución de digestión como se describe en el Ejemplo 10. A continuación, se aplicaron dos jeringuillas conectadas a agujas de 16G en los extremos opuestos del IVD aislado y se inyectaron hasta 2 ml de PBS en el IVD. El espacio del disco se vació y se llenó varias veces y luego se descartó el contenido del IVD. El último procedimiento se llevó a cabo tres veces. Este procedimiento se repitió una vez usando aproximadamente 2 ml de EDTA (10 mM, Riedel-de-Haen N° de catálogo 34549). Posteriormente, la compresión de los discos vaciados se midió con cargas crecientes. La compresión a 500 N se consideró como el máximo valor posible de compresión. Los discos vaciados se puncionaron usando una aguja de 16G dando como resultado un total de 4 orificios de 16G.

Los discos vaciados perforados se inyectaron con PBS o VIPCC y trombina (aplicados simultáneamente a volúmenes equivalentes: Omrix biopharmaceuticals LTD IL) utilizando el dispositivo de inyección Omrix. Las soluciones se inyectaron en las perforaciones existentes hasta que se derramó el exceso de solución fuera del sitio de inyección. Los discos intravertebrales rellenados se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después del período de incubación, se llevaron a cabo las mediciones de compresión del disco lleno bajo diferentes cargas. Todas las mediciones se repitieron 5 veces.

La Fig. 15 demuestra el porcentaje de compresión del disco bajo una carga de fuerza creciente de discos no tratados, discos vacíos y discos rellenados (PBS o VIPCC y trombina). Los resultados se expresan como la delta en compresión a una carga específica (compresión del disco no tratado bajo una carga de 10 N - compresión del disco rellenado bajo carga X N) dividido por el máximo valor posible de compresión de acuerdo con la siguiente fórmula:

(Compresión del disco no tratado bajo carga ION)- (Compresión del disco rellenado bajo carga X NTu (Compresión del disco vacío bajo carga 500 N) - (Compresión del disco no tratado bajo carga 10 N)

La Fig. 16 demuestra la recuperación de altura de los discos inyectados con VIPCC o PBS activados. Los resultados se basan en las mediciones mostradas en la Fig. 15 (compresión bajo 500 N). Los resultados se presentan como el porcentaje de la compresión máxima posible del disco no tratado bajo una carga de 500 N en el mismo experimento (100%) de acuerdo con la fórmula siguiente:

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'Compresión de disco no tratado bajo carga 500 N) - (Compresión de disco rellenado bajo carga 500 Nk, (Compresión de disco no tratado bajo carga 500 N) - (Compresión de disco vaciado bajo carga 500 N)

disco lleva a un aumento en la compresión del disco. El comportamiento de compresión de los discos inyectados con VIPCC activado como una función del aumento de la fuerza es similar al de los discos no tratados.

Los resultados también muestran que los discos inyectados con VIPCC activado recuperaron su altura inicial en comparación con los discos inyectados con PBS.

Esto muestra claramente que el VIPCC activado puede funcionar para conservar la altura normal del disco y es capaz de resistir las cargas de compresión como el núcleo pulposo natural.

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Reivindicaciones

1. Un concentrado de crioprecipitado de plasma inactivado viral (VIPCC), opcionalmente en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda, en donde el crioprecipitado comprende una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno inicial de 1:10 a 1:5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección espinal que implica degeneración y/o lesión del disco intervertebral, con la condición de que estén ausentes del crioprecipitado aprotinina bovina y ácido tranexámico.
2. El VIPCC para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el VIPCC está activado.
3. El VIPCC para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el VIPCC comprende un agente de contraste, en donde preferiblemente el agente de contraste es yodo.
4. El VIPCC para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho uso es

a) tratar una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral, y/o

b) restaurar la altura del disco intervertebral, y/o

c) prevenir la hernia de disco intervertebral, y en donde opcionalmente la enfermedad es una etapa temprana de la enfermedad degenerativa intervertebral.
5. El VIPCC para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el VIPCC activado sirve como andamiaje para la reconstrucción de

a) células del núcleo pulposo en etapa avanzada de enfermedad de disco degenerativa intervertebral, o

b) una médula espinal lesionada o rota.
6. El VIPCC para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el VIPCC se proporciona como un andamiaje.
7. El VIPCC para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el VIPCC se proporciona

como un vehículo adecuado para administrar una composición de células en un tejido de médula espinal dañado.
8. El VIPCC para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el VIPCC se proporciona

en un banco de tejidos o células que comprende células derivadas de la notocorda.
9. El VIPCC para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho uso es

a) facilitar el crecimiento, proliferación, diferenciación, mantenimiento, reparación y/o restauración de células derivadas de la notocorda que comprende poner en contacto la población de dichas células con dicho VIPCC, o

b) tratar una enfermedad, trastorno o afección espinal que implica degeneración y/o lesión del disco intervertebral, que comprende administrar en la espina dorsal de un sujeto que lo necesita, dicho VIPCC, opcionalmente en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda.
10. El VIPCC para el uso de acuerdo con la reivindicación 9a), en donde opcionalmente

a) dichas células son células del núcleo pulposo, y/o

b) el VIPCC está activado, y/o

c) dicho contacto se

i) lleva a cabo ex vivo , o

ii) lleva a cabo in vivo.
11. El VIPCC para el uso de acuerdo con la reivindicación 9b) en donde opcionalmente,

a) el VIPCC está activado,

b) el VIPCC es para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección del disco intervertebral, y/o

c) el VIPCC se administra en combinación con una composición celular que comprende células derivadas de la notocorda, en donde opcionalmente

i) dichas células son células del núcleo pulposo, y/o

ii) todo o una parte del tejido del núcleo pulposo del disco intervertebral se extirpa antes de administrar el VIPCC y las células, y/o

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iii) antes de la administración las células se cultivan ex vivo en VIPCC que comprende una proporción de fibronectina/fibrinógeno de 1:10 a 1:5.
12. Un kit de componentes que comprende un primer recipiente que comprende VIPCC que tiene una concentración relativa de fibronectina:fibrinógeno de 1:10 a 1:5, y un segundo recipiente que comprende un enzima capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno, con la condición de que el ácido tranexámico y la aprotinina bovina estén ausentes del kit, en donde opcionalmente el kit comprende además un agente de contraste, y en donde opcionalmente el agente de contraste es yodo.
13. El kit de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además un tercer recipiente que comprende un enzima proteolítico seleccionado del grupo que consiste de serina peptidasas, cisteína peptidasas, peptidasas aspárticas, metalo peptidasas, hialuronidasa y combinaciones de las mismas, en donde opcionalmente el enzima proteolítico se selecciona del grupo que consiste de tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática, papaína, quimopapaína, pepsina, colagenasa, gelatinasa, pronasa condroitinasa, hialuronidasa y combinaciones de las mismas.