ES2607984T3 - Métodos y medios para producir plantas tolerantes a estrés abiótico - Google Patents

Abstract

Un método para producir una planta tolerante a estrés abiótico respecto a una planta de control, disminuyendo la ruta de transducción de señales de etileno en dicha planta durante el periodo of estrés abiótico impuesta sobre dichas plantas, que comprende introducir y expresar en dicha planta un gen quimérico que comprende un promotor de 4TM de plantas seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor de 4TM de plantas ortólogo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, en el que dicho promotor está unido de forma funcional a un gen o fragmento génico derivado de la ruta de transducción de señales de etileno.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y medios para producir plantas tolerantes a estres abiotico Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la biologfa molecular de plantas, mas particularmente al campo de la agricultura, y se refiere a metodos para potenciar la tolerancia a estres abiotico en plantas modulando la expresion de un gen implicado en la ruta de transduccion de senales de etileno durante el periodo de estres abiotico. La presente invencion tambien proporciona construcciones quimericas utiles en los metodos de la invencion. Ademas, la invencion proporciona plantas transgenicas que tienen una resistencia potenciada a estres abiotico.

Introduccion a la invencion

El estres abiotico se define como el impacto negativo de factores no biologicos sobre los organismos vivos en un entorno espedfico. La variable no biologica debe influenciar en el entorno mas alla de su intervalo normal de variacion para afectar de forma adversa al rendimiento de la poblacion o la fisiologfa individual del organismo de un modo significativo. El estres abiotico es esencialmente inevitable. El estres abiotico afecta a los animales, pero las plantas son especialmente dependientes de los factores ambientales, de modo que es particularmente restrictivo. El estres abiotico es el factor mas danino que afecta al crecimiento y productividad de los cultivos en el mundo. La seqrna, las temperaturas extremas y los suelos salinos son los estreses abioticos mas comunes que encuentran las plantas. Globalmente, aproximadamente el 22% de la tierra agncola es salina y las areas bajo seqrna ya se estan expandiendo y se espera que aumenten mas. Otros cultivos estan expuestos a multiples estreses, y la manera en que una planta detecta y responde a diferentes factores ambientales parece ser solapante. El dano mas obvio referente al estres abiotico implica la agricultura. Se ha calculado que el estres abiotico causa la mayona de perdidas de cultivo que cualquier otro factor y que la mayona de cultivos principales se reducen en su produccion en mas del 50% de su produccion potencial. Ademas, se ha especulado que esta reduccion de la produccion solamente empeorara con los drasticos cambios del clima esperados en el futuro. Como el estres abiotico esta ampliamente considerado como un efecto danino, la investigacion en esta area del problema es extensa. Cuando se someter a estres ambiental, las plantas reducen de forma activa su crecimiento vegetativo para ahorrar y redistribuir recursos y, por tanto, aumentar sus posibilidades de supervivencia cuando el estres se vuelve severo (Skirycz e Inze, 2010). Sin embargo, cuando el estres no amenaza la supervivencia, la inhibicion del crecimiento puede verse como contraproducente porque conduce a una bajada innecesaria en la productividad y penalizaciones sustanciales en la produccion. Las plantas "mas fuertes" que son capaces de crecer durante episodios de estres leve podnan demostrar un modo eficaz de reforzar la productividad en regiones que no experimentan condiciones meteorologicas severas (Tardieu, 2003). Por lo tanto, la compresion de los mecanismos subyacentes a la inhibicion del crecimiento en respuesta a estres puede conducir a los puntos de partida para interferir con las reducciones del crecimiento inducidas por estres. En plantas, el crecimiento de organos esta dirigido por dos procesos fuertemente controlados y dinamicos: la proliferacion celular y la posterior expansion celular. La coordinacion de estos dos procesos durante el crecimiento de las hojas determina finalmente el tamano y la forma de las hojas. En dicotiledoneas, tales como las especies modelo Arabidopsis thaliana, las hojas se inician el lateral del meristemo y, en la fase inicial, su crecimiento esta dirigido exclusivamente por la proliferacion celular (Donnelly et al., 1999). En hojas de un poco mas de edad, las celulas saldran del ciclo celular mitotico y empezaran a expandirse desde la punta en adelante. Esta transicion se manifiesta por la aparicion de endorreduplicacion, que es un ciclo celular modificado en que la replicacion prosigue sin mitosis con niveles de mayor ploidfa como consecuencia (Beemster et al., 2005). En entornos de agua limitada, las plantas responden por una reduccion de rapido crecimiento inicial seguida de adaptacion del crecimiento, produciendo hojas con menos celulas y mas pequenas (Schuppler et al., 1998; Granier y Tardieu, 1999; Aguirrezabal et al., 2006; Skirycz et al., 2010). Aunque previamente se investigaron los procesos implicados en la adaptacion del crecimiento a exposicion a largo plazo a estres (Skirycz et al., 2010), el objetivo de la investigacion fue aprender mas acerca de los mecanismos subyacentes a la inhibicion del crecimiento mediada por estres agudo. Aunque la reduccion de la proliferacion celular tras la aparicion de estres es un fenomeno bien conocido, el modo en los cambios en el entorno se traducen en tasas reducidas de proliferacion esta solamente mal comprendido. Al nivel de la maquinaria del ciclo celular, el escenario mas frecuentemente propuesto que media la inhibicion del ciclo celular inducida por estres asume la regulacion positiva de la transcripcion de inhibidores del ciclo celular que pertenecen a la familia del inhibido de quinasa dependiente de ciclina (CDK) (ICK)/protema relacionada con KlP (KRP) y/o la familia SIAMESE. Se cree que estos inhibidores detienen de forma transitoria la proliferacion celular inhibiendo los complejos CDKA/ciclina (De Veylder et al., 2001; Churchman et al., 2006; Peres et al., 2007; Rymen et al., 2007). La actividad de la quinasa A dependiente de ciclina (CDKA), que es un impulsor principal de la progresion del ciclo celular, tambien puede reducirse mediante degradacion dirigida de ciclinas y/o fosforilacion inhibidora, como se muestra para plantas de trigo (Triticum aestivum) sometidas a estres por seqrna (Schuppler et al., 1998). Corriente arriba de la maquinaria del ciclo celular, la hormona vegetal acido absdsico (ABA) ha demostrado afectar a la expresion de los genes ICK/KRP y/o SIAMESE (Wang et al., 1998; Pettko-Szandtner et al., 2006). Otra hormona clasica de estres es el etileno, que demostro acumularse tras seqrna (Kalantari et al., 2000; Sobeih et al., 2004) y de forma similar a ABA, se sabe que el precursor de etileno 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) se transporta de la rafz al brote (revisado por Sobeih et al., 2004). Por tanto, ABA y etileno se consideran buenos candidatos para comunicar los cambios en el estado acuoso del suelo a los meristemos. Ejemplos de

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efectos positivos, as^ como negativos del etileno y ABA sobre el crecimiento pueden encontrarse en la bibliograffa (revisado por Sharp y LeNoble, 2002; Pierik et al., 2006) pero su papel exacto en la regulacion del ciclo celular sigue siendo, en gran medida, desconocido.

En la presente invencion se examino el modo en que el estres por seqma leve afecta a la proliferacion celular durante el desarrollo prematuro de las hojas. En contraste con las hojas en expansion, las hojas en plena proliferacion de Arabidopsis son extremadamente pequenas (menos de 0,1 mm2 de tamano) y, por tanto, es un reto tecnico obtener una base molecular de detencion del ciclo celular inducida por estres con suficiente resolucion en el desarrollo y temporal. Con este fin, tuvo que establecerse un novedoso sistema experimental para posibilitar el analisis simultaneo de parametros relacionados con el crecimiento y mecanismos moleculares espedficamente en las hojas en proliferacion tras exposicion a corto plazo a estres. A diferencia de muchos estudios previos centrados en estres muy severo en hojas maduras o plantulas completas (por ejemplo, Fujita et al., 2007; Kant et al., 2007; Papdi et al., 2008), este mecanismo de estres leve ralentizaba el crecimiento sin afectar a la supervivencia de la planta. Los ejemplos de la invencion demuestran claramente que la detencion del ciclo celular es una respuesta muy rapida al estres mediado por mecanismos postranscripcionales en lugar de una cascada transcripcional, con la hormona vegetal etileno corriente arriba de la detencion reversible del ciclo celular. Aunque el etileno es una senal primera para la detencion del crecimiento, la posterior salida del ciclo celular independiente de etileno sucede de forma relativamente posterior y solamente cuando persiste el estres. Dicha regulacion altamente temporal permite a las plantas afinar su respuesta de crecimiento de acuerdo con la duracion del estres. Por tanto, la presente invencion muestra que el etileno es una senal principal responsables de la detencion del meristemo durante exposicion a estres y, por tanto, posteriormente contribuye a la penalizacion del crecimiento asociada a estres y las perdidas de produccion. Sin embargo, como el etileno tiene efectos pleiotropicos sobre el crecimiento y desarrollo de la planta, y la modificacion ectopica del metabolismo y/o senalizacion de etileno puede producir varios fenotipos indeseables, hubo la necesidad de reducir la produccion de etileno, durante el periodo de estres abiotico, en los meristemos crecidos de la planta. Se ha demostrado que disminuir los niveles de etileno en tejidos meristematicos puede aliviar, por lo tanto, la represion observada del crecimiento y, por tanto, limitar las perdidas de produccion. Esto se consiguio construyendo genes quimericos especializados para la regulacion negativa o regulacion positiva de genes en la ruta de transduccion de senales de etileno. Se demostro sorprendentemente que la detencion del crecimiento impuesta por el estres abiotico podna superarse con un grupo de promotores meristamaticos espedficos, aunque este efecto estaba ausente con otros promotores meristematicos o con promotores que dirigen una expresion constitutiva en plantas.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Sistema experimental.

(A) Representacion esquematica del desarrollo de la hoja 3 con celulas en proliferacion (P, rojo), expansion (E, verde) y maduras (M, blanco). A los 9 dfas despues de la estratificacion (DAS), las plantas se transfirieron a manitol y la hoja 3 se disecciono para el crecimiento, la ploidfa y el analisis molecular.

(B) Plantulas de nueve dfas de edad.

(C) Micrograffa electronica de la 3a y 4a hoja en 9 DAS.

Barras = 2 mm en (B) y 200 pm en (C).

Figura 2: Analisis cinematico de la hoja 3 diseccionada de plantas transferidas a medio de control, que contiene manitol o que contiene ACC en 9 DAS, cuando la 3a hoja esta en plena proliferacion.

(A) Area de la hoja, tasa relativa de crecimiento de la hoja y porcentaje de reduccion del area de la hoja causada por manitol o ACC.

(B) Cantidad de celulas, tasas relativas de division celular y porcentaje de reduccion de la cantidad de celulas causada por manitol o ACC.

(C) Plantas 6 dfas despues de la transferencia al medio de control, que contiene manitol o que contiene ACC. El drculo rojo marca la 3a hoja. Barra = 2 cm.

(D) Area celular.

(E) fndice estomatico.

(A-E) Los datos ± error tfpico (SE) son las medias de tres experimentos independientes. El area de la hoja se midio para 8-10 hojas en cada experimento. Los datos celulares son de cuatro hojas en cada experimento.

Figura 3: El estres osmotico detiene el ciclo celular y posteriormente desencadena la salida del ciclo celular.

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(A) Analisis de ploidfa de la hoja 3 diseccionada de plantas transferidas a medio de control, que contiene manitol o que contiene aCc en 9 DAS cuando la 3a hoja esta en plena proliferacion. Se presenta el porcentaje de nucleos 2C, 4C, y 8C. EI significa mdice de endorreduplicacion y representa la cantidad promedio de endociclos experimentados por un nucleo tipico (EI=1*4C+2*8C+3*16C). Los datos ± SE son las medias de tres experimentos independientes con multiples hojas combinadas en cada experimento.

(B) Hoja 3 de plantas CYCB1;1:DBox-GUS 48 h (11 DAS) despues de la transferencia a medio de control, que contiene manitol o que contiene ACC. La tincion azul indica la actividad mitotica. El punto naranja indica la punta de la hoja. Barra de escala = 0,5 mm.

Figura 4: Efectos de duracion variable del estres sobre las hojas en proliferacion.

Las plantas se transfirieron a placas que conteman manitol en 9 DAS y despues de ello se transfirieron de nuevo a placas de control despues de 10 h (l0M), 24 h (24M) o 48 h (48M) de tratamiento con manitol, o se mantuvieron en placas de manitol (M). La tercera hoja se disecciono para analisis adicional.

(A) Reduccion del area de la hoja en 10 DAS (24 h despues de la primera transferencia).

(B) Reduccion del area de la hoja y la cantidad de celulas en 14 DAS.

(C) Analisis de ploidfa. EI significa mdice de endorreduplicacion y representa la cantidad promedio de endociclos experimentados por un nucleo tfpico. Los datos ± SE son las medias de tres experimentos independientes con multiples hojas medidas en cada experimento.

Figura 5: Efectos del estres osmotico sobre la actividad de division meristemoide y la zona de proliferacion.

Las plantas se transfirieron a placas que conteman manitol en 9 DAS y despues de ello se transfirieron de nuevo a placas de control despues de 48 h de tratamiento con manitol (48M) o se mantuvieron en placas de manitol (M). La tercera hoja se disecciono para analisis adicional.

(A) Actividad de division meristemoide determinada por tincion CYCB1;1:DBox-GUS, expresada respecto al control. Los datos ± SE son las medias de tres experimentos independientes con 6-12 hojas medidas en cada experimento. Se representa un meristemoide activo representativo a la izquierda.

(B) Base de la hoja de la 3a hoja tenida para la expresion de CYCB1;1:DBox-GUS en 14 DAS. Aun puede observarse alguna actividad mitotica en la zona de proliferacion de las hojas tratadas con manitol. Barra = 0,5 mm.

Figura 6: Efectos del estres osmotico sobre el ciclo celular.

(A) Mapa termico de genes seleccionados del ciclo celular regulados de forma diferencial por estres osmotico en la 3a hoja en plena proliferacion 1,5, 3, 12 y 24 h despues de la imposicion del estres. Los datos son de series Affymetrix ATH1 y se expresan como el log2 del cambio factorial (manitol - control). El rojo y el verde indican regulacion positiva y regulacion negativa, respectivamente.

(B) Actividad CDKA relativa medida en la 3a hoja en proliferacion, microdiseccionada de plantas transferidas a medio de control, que contiene manitol o que contiene ACC 10 y 24 h despues de la transferencia. Los datos ± SE son las medias de dos (24 h) o tres experimentos independientes (10 h) con ± 50 hojas combinadas en cada experimento.

Figura 7: Aumento rapido en los niveles de ACC despues de la imposicion del estres.

(A) Mapa termico de genes seleccionados de senalizacion de etileno regulados de forma diferencial por estres osmotico en la 3a hoja en plena proliferacion 1,5, 3, 12 y 24 h despues de la imposicion del estres. Los datos son de series Affymetrix ATH1 y se expresan como el log2 del cambio factorial (manitol - control). El rojo y el verde indican regulacion positiva y regulacion negativa, respectivamente.

(B) Se determinaron los niveles de ACC en brotes de plantulas 9-DAS 1 h y 10 h despues de la transferencia a manitol. Los datos son la media ± SE de multiples plantas de tres experimentos independientes.

Figura 8: Implicacion de la senalizacion de etileno en la detencion del ciclo celular.

(D-F) Mutantes insensibles a etileno. Porcentaje de reduccion en el area foliar (C) y en la cantidad de celulas de la 3a hoja de mutantes insensibles a etileno tratados con manitol frente a plantas de tipo silvestre (WT) (D). Porcentaje de reduccion en el area foliar de la 3a hoja de mutantes insensibles a etileno tratados con ACC frente a plantas de tipo silvestre (WT) (E). Ejemplo de plantulas de tipo silvestre (WT), ein3, etrl y ein5 6 dfas despues de la transferencia a ACC (F).

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(C-E) Los datos ± SE son las medias de dos o tres experimentos independientes. El area foliar se midio para un mmimo de 8-10 hojas en cada experimento. Los datos celulares fueron de cuatro hojas en cada experimento. D, DAS.

Figura 9: Esquena simplificado que representa la regulacion de la inhibicion del ciclo celular y la diferenciacion celular en respuesta al estres osmotico.

Muy rapidamente (en horas) despues de la imposicion del estres, se desencadena la produccion de etileno, inhibiendo la actividad CDKA a traves de un mecanismo postranscripcional que inhibe de forma reversible el ciclo celular por detencion G1/S y G2/M. La detencion del ciclo celular es independiente del control transcripcional de EIN3 y posiblemente esta mediado por una ruta de senalizacion de MAPK o la ribonucleasa EIN5. En una fase posterior, una senal diferente conduce a inhibicion permanente y salida del ciclo celular mitotico en favor del endociclo y la diferenciacion celular. Posteriormente en el desarrollo de la hoja, la actividad de division meristemoide se hace mayor en hojas estresadas y la division meristemoide potenciada provoca una pequena recuperacion de las cantidades de celulas.

Figura 10: La expresion se midio en ARN aislado de brotes de 8 dfas de edad por PCR con cebadores espedficos para la ACC desaminasa bacteriana o la ACC desaminasa de Arabidopsis thaliana. Como control se uso el gen de referencia PP2AA3 (entrada a genbank AT1G13320).

Figura 11: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barra izquierda) = control, barras rojas (barra derecha) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM.

Figura 12: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barras izquierdas) = control, barras rojas (barras derechas) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM.

Figura 13: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barras izquierdas) = control, barras rojas (barras derechas) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM.

Figura 14: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barras izquierdas) = control, barras rojas (barras derechas) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM.

Figura 15: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barras izquierdas) = control, barras rojas (barras derechas) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM.

Figura 16: Area foliar en D11 (48 horas despues de la aparicion del estres); barras azules (barras izquierdas) = control, barras rojas (barras derechas) = manitol 25 mM; las barras de error indican SEM

Descripcion detallada de la invencion

Para facilitar la compresion de esta invencion, a continuacion se definen varios terminos. Los terminos definidos en este documento (salvo que se especifique de otro modo) tienen significados comprendidos habitualmente por los expertos en las areas relevantes a la presente invencion. Como se usa en esta memoria descriptiva y sus reivindicaciones adjuntas, terminos tales como "uno", "una" y "el", "la" no pretenden hacer referencia solamente a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual puede usarse un ejemplo espedfico para ilustracion, salvo que el contexto indique otra cosa. La terminologfa de este documento se usa para describir realizaciones espedficas de la invencion, pero su uso no determina la invencion, excepto lo perfilado en las reivindicaciones.

A pesar de su importancia para la agricultura, la inhibicion del crecimiento inducida por estres ambiental, que es responsable de reducciones significativas de la produccion, esta solamente mal comprendida. En la presente invencion, se desentranaron los mecanismos moleculares subyacentes a la inhibicion del ciclo celular en hojas jovenes en proliferacion de la planta modelo Arabidopsis thaliana cuando se sometfa a estres osmotico leve. Un analisis celular detallado demostro que en cuanto se detecta estres osmotico, la progresion del ciclo celular se detiene rapidamente, pero las celulas se mantienen en un estado ambivalente, permitiendo una rapida recuperacion ("pausa"). De forma destacable, se descubrio que la detencion del ciclo celular coincide con un aumento en los niveles de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) y la activacion de la senalizacion de etileno. Un estudio cuidadoso mostro que el etileno actua sobre la progresion del ciclo celular mediante la inhibicion de la actividad quinasa A dependiente de ciclina independientemente del control transcripcional de EIN3. Sin embargo, cuando persiste el estres, las celulas sales del ciclo celular mitotico e inician el proceso de diferenciacion ("parada"), reflejado por la prematura aparicion de endorreduplicacion, en un proceso independiente de etileno.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un metodo para producir una planta tolerante a estres abiotico respecto a una planta de control, disminuyendo la ruta de transduccion de senales de etileno en dicha planta durante el periodo de estres abiotico impuesto sobre dichas plantas, que comprende introducir y expresar en dicha planta un

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gen quimerico que comprende un promotor espedfico de meristemo unido de forma funcional a un gen gene o fragmento genico derivado de la ruta de transduccion de senales de etileno. En una realizacion particular, dicho estres abiotico (o estres ambiental que es equivalente) es estres leve. El significado de "estres leve" es evidente a partir del texto de la solicitud y los ejemplos adjuntos adicionales.

La expresion "disminuir la ruta de transduccion de senales de etileno" implica que la produccion de etileno se reduce (en un cierto punto en el tiempo, es decir, cuando la planta sufre estres abiotico) en la planta con respecto a una planta de control. Los genes implicados en la ruta de transduccion de senales de etileno son bien conocidos en la tecnica. Una lista de genes para los que tienen que regularse negativamente al menos un gen para que tenga el efecto de la produccion reducida de etileno consiste en la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ETR1, cTr1, MKK7, MKK9, EIN3, EIN5 o EIL1. A la inversa, una lista de genes para los que tiene que regularse positivamente al menos un gen para que tenga el efecto de la produccion reducida de etileno consiste en la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1. Se entiende en la presente invencion que la reduccion de etileno en la planta transgenica sucede preferentemente en los tejidos proliferativos de interes en la planta, mas particularmente en los tejidos meristematicos de las plantas transgenicas.

El concepto de un receptor de etileno negativo dominante es bien conocido en la tecnica. Un receptor que comprende una mutacion dominante altera la actividad de union a etileno y plantas transgenicas que comprenden un gen quimerico que codifica un receptor de etileno negativo dominante son insensibles a etileno. Un mutante del receptor dominante ETR1 habitualmente usado es la mutacion dominante etr1-1 como se describe en Bleecker et al. (1998) Science 241: 1086-9.

El concepto de un factor de transcripcion negativo dominante tambien esta bien descrito en la tecnica. Ejemplos no limitantes son factores de transcripcion con mutaciones en el dominio de union a ADN o factores de transcripcion que comprenden mutaciones en el dominio de transactivacion.

Un representante de la ACC desaminasa de Arabidopsis thaliana es AT1G48420 (es decir, el codigo AGI para el gen de Arabidopis). ACC es el precursor de etileno y las ACC desaminasas son un grupo de enzimas que escinden ACC en amoniaco y a-cetobutirato. Pueden identificarse varios genes ortologos para los genes de ACC desaminasa en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos estan entre parentesis: Arabidopsis lyrata (AL1G42050), Arabidopsis thaliana (AT1G48420), Brachypodium distachyon (BD3G57520), Brachypodium distachyon (BD4G03710), Carica papaya (CP00007G01400), Chlamydomonas reinhardtii (CR07G0l440), Glycine max (GM05G33540), Glycine max (GM08G06170), Lotus japonicas (LJ0G028460), Malus domestica (MD14G022550), Malus domestica (MD00G198360), Manihot esculenta (ME04612G00040), Micromonas sp. RCC299 (MRCC299_11G02790), Medicago truncatula (MT4G61890), Ostreococcus lucimarinus (OL17G01760), Oryza sativa ssp. japonica (OS02G53330), Oryza sativa ssp. indica (OSINDICA_02G51690), Ostreococcus tauri (OT09G01960), Physcomitrella patens (PP00224G00230), Populus trichocarpa (PT12G03410), Ricinus communis (RC29662G00090), Sorghum bicolor (SB04G034640), Selaginella moellendorffii (SM0000lG01880), Selaginella moellendorffii (SM00016G03880), Selaginella moellendorffii (SM00016G03890), Selaginella moellendorffii (SM00001G01870), Volvox carteri (VC00048G01110), Vitis vinifera (VV00G26680), Zea mays (ZM05G34830).

Un representante para el gen ACO2 (ACC oxidasa) de Arabidopsis thaliana es AT1 G62380 (es decir, el codigo AGI para el gen de Arabidopis). ACC se transporta a los meristemos desde las rafces donde se convierte en etileno por la actividad de ACC oxidasas. Pueden identificarse varios genes ortologos para los genes ACO2 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata aL2G03110, Arabidopsis lyrata AL1G12340, Arabidopsis thaliana AT1G62380, Arabidopsis thaliana AT1G12010, Carica papaya CP00132G00310, Carica papaya CP00152G00570, Glycine max GM07G39420, Glycine max GM17G01330, Glycine max GM15G11930, Glycine max GM09G01110, Malus domestica MD00G333820, Malus domestica MD00G333830, Malus domestica MD17G009150, Malus domestica MD05G001020, Malus domestica MD10G027080, Manihot esculenta ME08317G00820, Medicago truncatula MT3G41110, Medicago truncatula MT5G67830, Medicago truncatula MT8G56840, Medicago truncatula MT8G56830, Populus trichocarpa PT04G00270, Populus trichocarpa PT11G00780, Vitis vinifera VV12G11440, Brachypodium distachyon BD3G57620, Lotus japonicas LJ0G427530, Oryza sativa ssp. japonica OS09G27750, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_09G22130, Physcomitrella patens PP00287G00300, Ricinus communis RC49629G00010, Sorghum bicolor SB04G034520, Selaginella moellendorffii SM00010G00400, Selaginella moellendorffii SM00026G03400, Selaginella moellendorffii SM00006G03800, Selaginella moellendorffii SM00006G03820, Selaginella moellendorffii SM00006G03790, Selaginella moellendorffii SM00006G03780, Zea mays ZM07G12430.

Un representante para el gen ACO1 (ACC oxidasa) de Arabidopsis thaliana es AT2G19590 (es decir, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). ACC se transporta a los meristemos desde las rafces donde se convierte en etileno por la actividad de ACC oxidasas. Pueden identificarse varios genes ortologos para los genes ACO1 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata AL3G36600, Arabidopsis thaliana AT2G19590, Brachypodium distachyon

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BD1G37420, Glycine max GM07G15480, Glycine max GM05G36310, Glycine max GM08G03310, Glycine max GM01G01170, Lotus japonicas LJ2G008930, Malus domestica MD15G014610, Manihot esculenta ME01863G00320, Oryza sativa ssp. japonica OS06G37590, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_06G33260, Populus trichocarpa PT06G15230, Ricinus communis RC29912G00850, Sorghum bicolor SB10G022640, Vitis vinifera VV11G03750, Zea mays ZM06G11580, Carica papaya CP00132G00310, Medicago truncatula MT3G41110, Medicago truncatula MT5G67830, Physcomitrella patens PP00046G00760, Physcomitrella patens PP00283G00400, Selaginella moellendorffii SM00026G03400, Selaginella moellendorffii SM00098G00980.

Un representante para el gen EIN3 de Arabidopsis thaliana es AT3G20770 (es dedr, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). EIN3 es un factor de transcripcion central en la cascada de senalizacion de etileno. Pueden identificarse varios genes ortologos para los genes EIN3 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata AL3G22790, Arabidopsis lyrata AL4G10480, Arabidopsis thaliana AT3G20770, Arabidopsis thaliana aT2G27050, Brachypodium distachyon BD1G63780, Brachypodium distachyon BD3G46690, Brachypodium distachyon BD3G46680, Brachypodium distachyon BD4G33750, Brachypodium distachyon BD3G39970, Brachypodium distachyon BD5G12130, Carica papaya CP00103G00550, Carica papaya CP00054G00220, Glycine max GM20G12250, Glycine max GM13G03700, Glycine max GM13G03660, Glycine max GM14G04550, Glycine max GM02G44220, Lotus japonicas LJ2G036110, Malus domestica MD00G054980, Malus domestica MD02G025170, Malus domestica mD00G131400, Malus domestica MD00G407350, Malus domestica MD08G022690, Malus domestica MD07G004090, Malus domestica MD00G335120, Manihot esculenta ME04048G00040, Medicago truncatula MT5G69950, Medicago truncatula MT0G29830, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20790, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20780, Oryza sativa ssp. japonica OS08G39830, Oryza sativa ssp. japonica OS07G17160, Oryza sativa ssp. japonica OS02G36510, Oryza sativa ssp. japonica OS07G48630, Oryza sativa ssp. japonica OS09G31400, Oryza sativa ssp. japonica OS04G38400, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_03G198l0, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_04G29950, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_02G35300, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_07G14940, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_09G25260, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA_08G38220, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_07G40580, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA_05G02810, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_08G38160, Physcomitrella patens PP00087G00240, Populus trichocarpa PT09Gl5890, Populus trichocarpa PT04G19690, Populus trichocarpa PT08G01010, Populus trichocarpa PT10G24230, Populus trichocarpa PT01G05180, Populus trichocarpa PT01G05170 1, Ricinus communis RC29708G00010, Ricinus communis RC30169G01650, Sorghum bicolor SB01G036740, Sorghum bicolor SB07G027790, Sorghum bicolor SB04G023730, Sorghum bicolor SB06G018710, Sorghum bicolor SB02G043350, Sorghum bicolor SB02G028390, Selaginella moellendorffii SM00043G02600, Selaginella moellendorffii SM00144G00050, Selaginella moellendorffii SM00042G02400, Selaginella moellendorffii SM00088G00860, Zea mays ZM01G12220, Zea mays ZM09G17170, Zea mays ZM02G11960, Zea mays ZM05G25920, Zea mays ZM07G25000, Zea mays ZM02G33750, Zea mays ZM07G14110, Vitis vinifera VV06G06520, Vitis vinifera VV06G12160.

Los representantes para los genes EIL1 de Arabidopsis thaliana son AT2G27050, At5G21120 y At1G73730 (es decir, los codigos AGI para los genes de Arabidopsis). Los genes EIL1 codifican factores centrales de la transcripcion en la cascada de senalizacion de etileno. Pueden identificarse varios genes ortologos para los genes EIL1 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie:

I) genes ortologos para AT2G27050:

Arabidopsis lyrata AL4G10480, Arabidopsis lyrata AL3G22790, Arabidopsis thaliana AT2G27050, Arabidopsis thaliana AT3G20770, Brachypodium distachyon BD1G63780, Brachypodium distachyon BD3G46690, Brachypodium distachyon BD3G46680, Brachypodium distachyon BD4G33750, Brachypodium distachyon BD3G39970, Brachypodium distachyon BD5Gl2l30, Carica papaya CP00103G00550, Carica papaya CP00054G00220, Glycine max GM14G04550, Glycine max GM02G44220, Glycine max GM20G12250, Glycine max GM13G03700, Glycine max GM13G03660, Glycine max GM06G47160, Lotus japonicus LJ2G036110, Malus domestica MD00G054980, Malus domestica MD02G025170, Malus domestica MD00G131400, Malus domestica MD07G004090, Malus domestica MD00G407350, Malus domestica MD08G022690, Malus domestica MD00G335120, Manihot esculenta ME04048G00040, Medicago truncatula MT5G69950, Medicago truncatula MT0G29830, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20780, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20790, Oryza sativa ssp. japonica OS02G36510, Oryza sativa ssp. japonica OS07G17160, Oryza sativa ssp. japonica OS04G38400, Oryza sativa ssp. japonica OS08G39830, Oryza sativa ssp. japonica OS07G48630, Oryza sativa ssp. japonica OS09G31400 Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

03G19810, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 04G29950, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

02G35300, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 07G14940, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

09G25260, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 08G38220, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

07G40580, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 05G02810, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA_08G38160, Physcomitrella patens PP00087G00240, Populus trichocarpa PT09G15890, Populus trichocarpa PT04G19690, Populus trichocarpa PT10G24230, Populus trichocarpa PT08G01010, Ricinus communis RC29708G00010, Sorghum bicolor SB01G036740, Sorghum bicolor SB04G023730, Sorghum bicolor SB06G018710, Sorghum bicolor SB07G027790, Sorghum bicolor SB02G043350, Sorghum bicolor SB02G028390, Selaginella moellendorffii SM00043G02600, Selaginella moellendorffii SM00144G00050, Selaginella moellendorffii

5

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SM00042G02400, Selaginella moellendorffii SM00088G00860, Zea mays ZM09G17170, Zea mays ZM01G12220, Zea mays ZM02G33750, Zea mays ZM05G25920, Zea mays ZM02G11960, Zea mays ZM07G25000, Zea mays ZM07G14110, Vitis vinifera VV06G06520, Vitis vinifera VV06G12160.

II) genes ortologos para AT5G21120:

Arabidopsis lyrata AL6G21370, Arabidopsis lyrata AL4G10480, Arabidopsis thaliana AT5G21120, Carica papaya CP00103G00550, Carica papaya CP00020G02350, Glycine max GM02G44220, Glycine max GM13G03660, Glycine max GM13G03700, Glycine max GM14G04550, Glycine max GM20G12250, Glycine max GM05G31410, Glycine max GM08G14630, Glycine max GM18G02190, Glycine max GM13G41750, Glycine max GM15G03650, Glycine max GM06G47160, Glycine max GM04G14900, Lotus japonicus LJ2G036110, Lotus japonicus LJ3G015320, Medicago truncatula MT0G29830, Medicago truncatula MT3G36600, Medicago truncatula MT4G55800, Medicago truncatula MT6G16890, Medicago truncatula MT2G47310, Medicago truncatula MT5G69950, Populus trichocarpa PT04G19690, Populus trichocarpa PT09G15890 , Populus trichocarpa PT01G05170, Populus trichocarpa PT01G05180, Populus trichocarpa PT03G21140, Vitis vinifera VV06G06520, Vitis vinifera VV06G12160, Brachypodium distachyon BD1G63780, Brachypodium distachyon BD3G46690, Brachypodium distachyon BD3G46680, Brachypodium distachyon BD4G33750, Brachypodium distachyon BD3G39970, Brachypodium distachyon BD5G12130, Malus domestica MD00G054980, Malus domestica MD00G131400, Malus domestica MD00G407350, Malus domestica MD02G025170, Malus domestica MD00G437780, Malus domestica

MD00G437790, Malus domestica MD00G058260, Malus domestica MD00G436270, Malus domestica

MD00G436370, Malus domestica MD00G058250, Malus domestica MD11G001760, Manihot esculenta

ME04048G00040, Manihot esculenta ME10578G00030, Manihot esculenta ME04747G00240, Manihot esculenta ME02229G00960, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20780, Oryza sativa ssp. japonica OS03G20790, Oryza sativa ssp. japonica OS02G36510, Oryza sativa ssp. japonica OS07G17160, Oryza sativa ssp. japonica OS09G31400, Oryza sativa ssp. japonica OS08G39830, Oryza sativa ssp. japonica OS04G38400, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

03G19810, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 02G35300, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

07G14940, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 04G29950, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA

09G25260, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA 08G38160, Oryza sativa ssp. indica

OSINDICA_08G38220, Physcomitrella patens PP00087G00240, Physcomitrella patens PP00011G01730, Ricinus communis RC29708G00010, Ricinus communis RC29713G00060, Ricinus communis RC30169G01650, Ricinus communis RC29713G00070, Sorghum bicolor SB01G036740, Sorghum bicolor SB04G023730, Sorghum bicolor SB06G018710, Sorghum bicolor SB02G028390, Sorghum bicolor SB07G027790, Selaginella moellendorffii SM00144G00050, Selaginella moellendorffii SM00043G02600, Selaginella moellendorffii SM00042G02400, Selaginella moellendorffii SM00088G00860, Zea mays ZM01G12220, Zea mays ZM05G25920, Zea mays ZM07G14110, Zea mays ZM02G11960.

III) genes ortoloaos para AT1G73730:

Arabidopsis lyrata AL2G22590 4, Arabidopsis thaliana AT1G73730, Brachypodium distachyon BD4G33750, Brachypodium distachyon BD3G39970, Glycine max GM15G03650, Glycine max GM13G41750, Lotus japonicus LJ3G015320, Malus domestica MD11G001760, Malus domestica MD00G058250, Malus domestica MD00G436270, Malus domestica MD00G058260, Malus domestica MD00G436370, Manihot esculenta ME04747G00240, Manihot esculenta ME02229G00960, Medicago truncatula MT2G47310, Medicago truncatula MT6G16890, Oryza sativa ssp. japonica OS09G31400, Oryza sativa ssp. japonica OS08G39830, Oryza sativa ssp. indica OSINDiCa_09G25260, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_08G38220, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_08G38160, Populus trichocarpa PT01G05170, Populus trichocarpa PT03G21140, Populus trichocarpa PT01G05180, Ricinus communis RC30169G01650, Sorghum bicolor SB02G028390, Sorghum bicolor SB07G027790, Vitis vinifera VV06G06520, Zea mays ZM07G14110, Carica papaya CP00103G00550, Carica papaya CP00020G02350, Physcomitrella patens PP00087G00240, Physcomitrella patens PP00011G01730, Selaginella moellendorffii SM00144G00050, Selaginella moellendorffii SM00043G02600, Selaginella moellendorffii SM00042G02400, Selaginella moellendorffii SM00088G00860.

Un gen representante para el gen EBF1 de Arabidopsis thaliana es AT5G25350 (es dedr, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). El gen EBF1 codifica una protema que media la degradacion de los factores de transcripcion EIN3 y EIL1. Pueden identificarse varios genes ortologos para el gen EBF1 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata AL6G25490, Arabidopsis lyrata AL4G06680, Arabidopsis thaliana AT5G25350, Arabidopsis thaliana AT2G25490, Brachypodium distachyon BD3G07400, Brachypodium distachyon BD1G36530, Carica papaya CP00750G00010, Carica papaya CP00046G00080, Glycine max GM17G31940, Glycine max GM14G14410, Glycine max GM04G07110, Glycine max GM06G07200, Glycine max GM17G12270, Glycine max GM13G23510, Glycine max GM04G20330, Lotus japonicus LJ5G007560, Lotus japonicus LJ0G118050, Malus domestica MD15G006340, Malus domestica MD08G015310, Malus domestica MD00G485600, Malus domestica MD00G097680, Malus domestica MD15G010590, Malus domestica MD00G026250, Manihot esculenta ME10594G01970, Manihot esculenta ME09799G00070, Manihot esculenta ME02262G00040, Medicago truncatula MT1G06810, Medicago truncatula MT3G54680, Medicago truncatula MT8G41850, Medicago truncatula MT8G41910, Oryza sativa ssp. japonica OS02G10700, Oryza sativa ssp. japonica OS06G40360, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_02G10230, Oryza sativa ssp. indica OsINDICA_06g35900, Physcomitrella patens PP00352G00060, Physcomitrella patens PP00188G00250, Populus trichocarpa PT18G01520, Populus trichocarpa PT06G25310, Populus trichocarpa

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PT18G12120, Populus trichocarpa PT06G06580, Ricinus communis RC29848G01830, Ricinus communis RC28320G00720, Sorghum bicolor SB04G006870, Sorghum bicolor SB10G023670, Selaginella moellendorffii SM00051G01700, Selaginella moellendorffii SM00071G00630, Selaginella moellendorffii SM00003G03080, Selaginella moellendorffii SM00025G01420, Vitis vinifera VV04G12150, Vitis vinifera VV11G06560, Zea mays ZM05G19050, Zea mays ZM09G10590, Zea mays ZM06G11160, Chlamydomonas reinhardtii CR12G15690, Micromonas sp. RCC299 MRCC299_14G00750, Volvox carteri VC00010G02190.

Un gen representante para el gen EBF2 de Arabidopsis thaliana es AT2G25490 (es dedr, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). El gen EBF2 codifica una protema que media la degradacion de los factores de transcripcion EIN3 y EIL1. Pueden identificarse varios genes ortologos para el gen EBF2 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata AL4G06680, Arabidopsis lyrata AL6G25490, Arabidopsis thaliana AT2G25490, Arabidopsis thaliana AT5G25350, Brachypodium distachyon BD3G07400, Brachypodium distachyon BD1G36530, Carica papaya CP00750G00010, Carica papaya CP00046G00080, Glycine max GM14G14410, Glycine max GM17G31940, Glycine max GM04G07110, Glycine max GM06G07200, Glycine max GM17G12270, Glycine max GM13G23510, Glycine max GM04G20330, Lotus japonicus LJ5G007560, Lotus japonicus LJ0G118050, Malus domestica MD15G006340, Malus domestica MD08G015310, Malus domestica MD00G485600, Malus domestica MD00G097680, Malus domestica MD15G010590, Malus domestica MD00G026250, Manihot esculenta ME10594G01970, Manihot esculenta ME09799G00070, Manihot esculenta ME02262G00040, Medicago truncatula MT1G06810, Medicago truncatula MT3G54680, Medicago truncatula MT8G41850, Medicago truncatula MT8G41910, Oryza sativa ssp. japonica OS02G10700, Oryza sativa ssp. japonica OS06G40360, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_02G10230, Oryza sativa ssp. indica OsINDICA_06g35900, Physcomitrella patens PP00352G00060, Physcomitrella patens PP00188G00250, Populus trichocarpa PT18G01520, Populus trichocarpa PT06G25310, Populus trichocarpa PT18G12120, Populus trichocarpa PT06G06580, Ricinus communis RC29848G01830, Ricinus communis RC28320G00720, Sorghum bicolor SB04G006870, Sorghum bicolor SB10G023670, Selaginella moellendorffii SM00051G01700, Selaginella moellendorffii SM00071G00630, Selaginella moellendorffii SM00003G03080, Selaginella moellendorffii SM00025G01420, Vitis vinifera VV04G12150, Vitis vinifera VV11G06560, Zea mays ZM05G19050, Zea mays ZM09G10590, Zea mays ZM06G11160, Chlamydomonas reinhardtii CR28G00230, Micromonas sp. RCC299 MRCC299_14G00750, Volvox carteri VC00010G02190.

Un gen representante para el gen EIN5 de Arabidopsis thaliana es AT1G54490 (es decir, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). El gen EIN5 codifica una exorribonucleasa cadena arriba de los transcritos EBF1 y EBF2. Pueden identificarse varios genes ortologos para el gen EIN5 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis thaliana AT1G54490, Brachypodium distachyon BD1G05660, Brachypodium distachyon BD2G56440, Carica papaya CP00117G00640, Carica papaya Cp00076G00580, Chlamydomonas reinhardtii CR16G06690, Chlamydomonas reinhardtii CR06G06580, Chlamydomonas reinhardtii CR03G00960, Glycine max GM19G43160, Glycine max GM03G40500, Glycine max GM20G37260, Glycine max GM10G30150, Glycine max GM14G40510, Lotus japonicus LJ0G413420, Lotus japonicus LJ5G017580, Malus domestica MD12G023600, Malus domestica MD04G0l7840, Malus domestica MD00G306770, Malus domestica MD00G371520, Manihot esculenta ME10645G00090, Manihot esculenta ME07086G00150, Medicago truncatula MT7G55810, Medicago truncatula MT1G31820, Medicago truncatula MT7G60440, Medicago truncatula MT7G60430, Medicago truncatula MT0G01060, Ostreococcus lucimarinus OL06G03410, Ostreococcus lucimarinus OL06G03860, Oryza sativa ssp. japonica OS03G58060, Oryza sativa ssp. japonica OS01G65220, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_03G55400, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_0lG61870, Ostreococcus tauri OT06G036l0, Ostreococcus tauri OT06G04160, Populus trichocarpa PT00G17430, Populus trichocarpa PT05G04870, Populus trichocarpa PT05G04880, Ricinus communis RC30128G00400, Ricinus communis RC30073G00230, Sorghum bicolor SB01G005340, Sorghum bicolor SB07G005160, Sorghum bicolor SB03G010040, Volvox carteri VC00001G07190, Vitis vinifera VV16G06360, Vitis vinifera VV14G03630, Vitis vinifera VV06G09530, Zea mays ZM05G02360, Zea mays ZM03G07230, Arabidopsis lyrata AL8G08670, Micromonas sp. RCC299 MRCC299_02G03810, Physcomitrella patens PP00509G00ll0, Selaginella moellendorffii SM0009lG00690.

Un gen representante para el gen MKK9 de Arabidopsis thaliana es AT1G73500 (es decir, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). El gen MKK9 codifica una MAP quinasa quinasa quinasa que esta situada corriente abajo de los receptores de etileno. Pueden identificarse varios genes ortologos para el gen MKK9 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis lyrata AL2G22310, Arabidopsis lyrata AL1G19280, Arabidopsis thaliana AT1G73500, Arabidopsis thaliana AT1G18350, Brachypodium distachyon BD1G10800, Brachypodium distachyon BD1G69400, Carica papaya CP00003G03590, Carica papaya CP01155G00030, Glycine max GM09G30300, Glycine max GM07G11910, Lotus japonicus LJ0G032430, Malus domestica MD06G019470, Malus domestica MD00G332250, Manihot esculenta mE04612G00380, Medicago truncatula MT6G21840, Oryza sativa ssp. japonica OS06G09180, Oryza sativa ssp. japonica OS03G12390, Oryza sativa ssp. indica OSINDlCA_02G52870, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_03G10820, Physcomitrella patens PP00114G00510, Physcomitrella patens PP00016G01910, Populus trichocarpa PT15G04450, Populus trichocarpa PT12G03820, Sorghum bicolor SB04G035370, Sorghum bicolor SB01G042350, Selaginella moellendorffii SM00121G00650, Selaginella moellendorffii SM00017G02550, Vitis vinifera VV17G07540, Zea mays ZM05G04760, Zea mays ZM01G07530, Zea mays ZM01G41810, Zea mays

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ZM03G27150, Zea mays ZM03G27550, Chlamydomonas reinhardtii CR06G00150, Micromonas sp. RCC299 MRCC299_07G06300, Ostreococcus lucimarinus OL04G03760, Ostreococcus tauri OT04G04050, Ricinus communis RC29748G00070, Volvox carteri VC00006G02490.

Un gen representante para el gen MKK7 de Arabidopsis thaliana es AT1G18350 (es dedr, el codigo AGI para el gen de Arabidopsis). El gen MKK7 codifica una MAP quinasa quinasa quinasa que esta situada corriente abajo de los receptores de etileno. Pueden identificarse varios genes ortologos para el gen MKK7 en bases de datos de secuencias disponibles al publico (los numeros de acceso de la base de datos se describen despues del nombre de la especie): Arabidopsis thaliana AT1G18350, Arabidopsis thaliana AT1G73500, Brachypodium distachyon BD1G46880, Brachypodium distachyon BD1G10790, Brachypodium distachyon BD1G10770, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_02g52870, Oryza sativa ssp. indica OSINDICA_03G48910, Sorghum bicolor SB01G010180, Zea mays ZM01G07530, Zea mays ZM01G41830, Arabidopsis lyrata AL2G22310, Arabidopsis lyrata AL1G19280, Glycine max GM09G30300, Glycine max GM07G11910, Glycine max GM09G30310, Vitis vinifera VV17G07540, Carica papaya CP00003G03590, Chlamydomonas reinhardtii CR06G00150, Lotus japonicus LJ0G032430, Malus domestica MD06G019470, Malus domestica MD00G332250, Manihot esculenta ME04612G00380, Micromonas sp. RCC299 MRCC299_07G06300, Medicago truncatula MT6G21840, Ostreococcus lucimarinus OL04G03760, Oryza sativa ssp. japonica OS06G09180, Ostreococcus tauri OT04G04050, Physcomitrella patens PP00114G00510, Physcomitrella patens PP00016G01910, Populus trichocarpa PT15G04450, Populus trichocarpa PT12G03820 1, Ricinus communis RC29748G00070, Selaginella moellendorffii SM00110G00220, Selaginella moellendorffii SM00011G01810, Volvox carteri VC00006G02490.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un factor de transcripcion espedfico de meristemo, b) una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de ARN bicatenaria capaz de reducir la expresion de un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ESR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un factor de transcripcion espedfico de meristemo, b) una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de ARN antisentido capaz de reducir la expresion de un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ESR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un factor de transcripcion espedfico de meristemo, b) una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de microARN artificial capaz de reducir la expresion de un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ESR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un promotor espedfico de meristemo, b) una region de ADN que codifica un gen de la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un metodo para producir una planta tolerante a estres abiotico respecto a una planta de control, disminuyendo la ruta de transduccion de senales de etileno en dicha planta durante el periodo de estres abiotico impuesto en dichas plantas, que comprende introducir y expresar en dicha planta un gen quimerico que comprende un promotor con una especificidad para celulas foliares en proliferacion seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID nO: 4, donde dicho promotor esta unido de forma funcional a un gen o fragmento genico derivado de la ruta de transduccion de senales de etileno.

En otra realizacion mas, la expresion de dicho gen quimerico en dicha planta conduce a una regulacion negativa de al menos un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ETR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1.

En otra realizacion mas, la expresion de dicho gen quimerico en dicha planta conduce a una regulacion positiva de al menos un gen de la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un promotor con una especificidad para celulas foliares en proliferacion seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, b) una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de ARN bicatenaria capaz de reducir la

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expresion de un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ESR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona a gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un promotor con una especificidad para celulas foliares en proliferacion seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, b) una region de ADN que codifica un gen de la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona una planta transgenica o una semilla transgenica o una celula de planta transgenica que comprende un gen quimerico como se ha descrito en este documento anteriormente.

Plantas, semillas o celulas vegetales transgenicas de la invencion comprenden una planta de cultivo o una monocotiledonea o un cereal tal como arroz, trigo, mafz, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, farro, espelta, secale, escanda y avena.

Un "gen quimerico" o "construccion quimerica" es una secuencia de acido nucleico recombinante en que un promotor o secuencia de acido nucleico reguladora esta unida de forma funcional a, o asociada con, una secuencia de acido nucleico que codifica un ARNm, de modo que la secuencia de acido nucleico reguladora es capaz de regular la transcripcion o expresion de la secuencia codificante de acido nucleico asociada. La secuencia de acido nucleico reguladora del gen quimerico no esta normalmente unidad de forma funcional a la secuencia de acido nucleico asociada segun se encuentra en la naturaleza.

En la presente invencion, un "promotor de plantas" comprende elementos reguladores, que median la expresion de un segmento de secuencia codificante en celulas vegetales. Para la expresion en plantas, la molecula de acido nucleico debe estar unida de forma funcional a o comprenden un promotor adecuado que exprese el gen en el punto correcto en el tiempo y con el patron requerido de expresion espacial. En un aspecto preferido, el promotor de plantas de la invencion se induce cuando la planta se encuentra con el estres abiotico. Es particularmente preferido un promotor de plantas activo durante la fase de proliferacion celular de la planta. Un promotor preferido es un promotor espedfico de meristemo. Otro promotor preferido es un promotor inducible por estres. Lo mas preferido es un promotor inducible por estres que tambien es espedfico de meristemo.

La expresion "unido de forma funcional", como se usa en este documento, se refiere a una union funcional entre la secuencia promotora y el gen de interes, de modo que la secuencia promotora es capaz de inicial la transcripcion del gen de interes.

Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayona, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayona de condiciones ambientales, en al menos una celula, tejido u organo. En la presente invencion, no se prefiere un promotor constitutivo a causa de los efectos pleiotropicos del etileno sobre el crecimiento de la planta.

Ejemplos no limitantes de promotores espedficos de meristemo son el promotor p4TM1 de Arabidopsis thaliana (derivado del gen AT5G16250) y promotores homologos y ortologos del mismo, KNOLLE (derivado del gen AT1G08560) y otros promotores ortologos de plantas del mismo; dichos promotores se inducen fuertemente en celulas mitoticas. Otro promotor es el promotor GRF5 (derivado del gen AT3G13960) o un homologo del mismo, el ultimo promotor se expresa fuertemente en primordios foliares en proliferacion. La presente invencion muestra ventajosamente que el promotor pATM1, promotores homologos (como se resume adicionalmente en este documento posteriormente) y promotores ortologos (como se resume adicionalmente en este documento posteriormente) del mismo son particularmente preferidos y ventajosos en la presente invencion.

Promotores de 4TM de plantas

La presente invencion muestra (por ejemplo, resumido en ejemplo 8) que los promotores de Arabidopsis thaliana derivados de la familia genica que consiste en los genes de Arabidopsis thaliana At5 g16250 (promotor derivado de dicho gen y denominado como p4TM1 y representado en la SEQ ID NO: 1), At3G02640 (promotor derivado de dicho gen y denominado como p4TM2 y representado en la SEQ ID NO: 2), At5 g36710 (promotor derivado de dicho gen y denominado como p4TM3a y representado en la SEQ ID NO: 3) y At5 g36800 (promotor derivado de dicho gen y denominado como p4TM3b y representado en la SEQ ID NO: 4) son particularmente ventajosos para la construccion de genes quimericos que son capaces de modular la ruta de transduccion de senales de etileno cuando se transforman y expresan en plantas. Las SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 son promotores que son fuertemente activos en tejidos meristematicos de plantas, particularmente activos en celulas de hojas en proliferacion. La presente invencion muestra que los genes quimericos de la invencion que comprenden promotores del grupo (SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4) son mas ventajosos que genes quimericos de la invencion que comprenden otros promotores meristematicos (tales

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como el promotor de GRF5 (representado en la SEQ ID NO: 5) y tambien son mas ventajosos que genes quimericos de la invencion que comprenden promotores constitutivos (tales como el promotor de CaMV 35S) para superar el estres abiotico cuando estos genes quimericos se transforman y expresan en plantas.

Varios metodos estan disponibles para los expertos en la materia para aislar secuencias promotoras ortologas de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. Un metodo es un metodo in silico y se basa en herramientas bioinformaticas disponibles al publico para buscar genes ortologos (en las bases de datos de secuencias genomicas de plantas disponibles) de At5 g16250, At3 g02640, At5 g36710 y/o At5 g36800 (genes indicados de los que se obtuvieron las SEQ ID NO: 1,2, 3 y 4). Los genes ortologos de los ultimos genes de Arabidopis thaliana en otras plantas son: ZM02G11160, ZM03G24300, ZM06G28010, ZM08G30050 y ZM10G19490 derivados de Zea mays; OSINDICA_01G63710, OSINDICA_04G33930 y OSINDICA_05G38340 de Oryza sativa ssp. indica; OS01G67110, OS04G41900 y OS05G43140 de Oryza sativa ssp. japonica; PT05G25880, PT08G07570, PT10G17500, PT13G12590 y PT19G11530 derivados de Populus trichocarpa; SB03G042590, SB06G021400 y SB09G024920 derivados de Sorghum bicolor, BD2G57580 y BD5G14540 de Brachypodium distachyon. Los numeros de referencia anteriores para los genes ortologos se recuperaron del programa disponible al publico PLAZA (
http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza y el enlace para recuperar genes ortologos para At5 g16250, At3 g02640, At5 g36710 y/o At5 g36800 es:
http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/gene families/view/HOM002837. Los promotores ortologos anteriores pueden obtenerse de forma conveniente aislando 1000 bp, 1500 bp o 2000 bp cadena arriba del codon de inicio de las secuencias de los genes ortologos identificados, para los cuales esta disponible al publico la secuencia de nucleotidos.

Para la identificacion de promotores ortologos funcionalmente equivalentes, puede analizarse la fuerza del promotor y/o el patron de expresion de un promotor ortologo candidato, por ejemplo, uniendo de forma funcional dicho promotor (o fragmentos del mismo) a un gen indicador y ensayando el nivel y el patron de expresion del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se ensaya midiendo la actividad enzimatica de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. Despues puede compararse la fuerza del promotor y/o el patron de expresion en tejidos meristematicos con los de un promotor de referencia (tal como el usado en los ejemplos de la presente invencion). Como alternativa, la fuerza del promotor puede ensayarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del acido nucleico usado en los metodos de la presente invencion, con niveles de ARNm de genes constitutivos tales como ARNr 18S, usando metodos conocidos en la tecnica, tales como transferencia de Northern con analisis densitometrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa a tiempo real o RT- PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente, por "promotor debil" se entiende un promotor que dirige la expresion de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos, hasta aproximadamente 1/500.0000 transcritos por celula. A la inversa, un "promotor fuerte" dirige la expresion de una secuencia codificante a nivel alto, o a aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos, hasta aproximadamente 1/1000 transcritos por celula. Generalmente, por "promotor de fuerza media" se entiende un promotor que dirige la expresion de una secuencia codificante a un nivel inferior que un promotor fuerte, en particular a un nivel que esta, en todos los casos, por debajo del obtenido cuando esta bajo el control de un promotor de 35S CaMV.

Ademas, pueden aislarse promotores equivalentes (u ortologos) de las SEQ ID NO: 1,2, 3 y 4 de otras plantas por hibridacion. Con este fin, pueden aislarse fragmentos de promotores ortologos de otras plantas usando las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 o un fragmento funcional que tiene al menos 50 nucleotidos consecutivos de la misma como sonda e identificando secuencias de nucleotidos a partir de estas otras plantas que hibridan en las condiciones de hibridacion descritas en este documento. A modo de ejemplo, un promotor de la invencion puede usarse para explorar una genoteca de un cultivo o planta de interes para aislar secuencias promotoras correspondientes de acuerdo con tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por tanto, puede usarse una secuencia promotora de la invencion como sonda para hibridacion con una genoteca en condiciones de rigurosidad media a alta. Como pueden aislarse promotores equivalentes alternativos usando las secuencias codificantes de At5 g16250, At3 g02640, At5 g36710 y/o At5 g36800 para explorar una genoteca (por ejemplo, por hibridacion) de un cultivo de interes. Cuando se obtiene suficiente identidad entre las secuencias codificantes (como norma, mayor del 85% de identidad), entonces las regiones promotoras pueden aislarse cadena arriba de los genes ortologos At5 g16250, At3 g02640, At5 g36710 y/o At5 g36800. El termino "hibridacion" se refiere a la capacidad de una primera hebra de acido nucleico de unirse con una segunda hebra mediante apareamiento de bases por enlaces de hidrogeno cuando las dos hebras de acido nucleico tienen suficiente identidad de secuencia. La hibridacion sucede cuando las dos moleculas de acido nucleico hibridan entre sf en condiciones apropiadas. La hibridacion de acidos nucleicos es una tecnica bien conocida para los expertos en la tecnica de manipulacion de ADN. La propiedad de hibridacion de un par dado de acidos nucleicos es una indicacion de su similitud o identidad. Otra indicacion de que dos secuencias de acido nucleico son sustancialmente identicas es que las dos moleculas hibridan entre sf en condiciones rigurosas. La expresion "hibridar espedficamente con" se refiere a la union, formacion de duplex o formacion de tubridos de una molecula solamente con una secuencia particular de nucleotidos en condiciones rigurosas cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total). "Unir sustancialmente" se refiere a hibridacion complementaria entre un acido nucleico sonda y un acido nucleico diana y abarca desapareamientos minoritarios que pueden acomodarse reduciendo la rigurosidad del medio de hibridacion para conseguir la deteccion deseada de la secuencia de acido nucleico diana. Las "condiciones rigurosas de hibridacion" y "condiciones

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rigurosas de lavado de hibridacion" en el contexto de experimentos de hibridacion de acido nucleico, tales como hibridacion de Southern y Northern son dependientes de secuencia, y son diferentes en diferentes parametros ambientales. Un ejemplo de condiciones altamente rigurosas de lavado es NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones rigurosas de lavado es un lavado SSC 0,2 X a 65°C durante 15 minutos. A menudo, un lavado de alta rigurosidad va precedido de un lavado de baja rigurosidad para retirar la senal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un duplex de, por ejemplo, mas de 100 nucleotidos, es SSC 1 X a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un duplex de, por ejemplo, mas de 100 nucleotidos, es SSC 4 a 6 X a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleotidos), las condiciones rigurosas tfpicamente implican concentraciones salinas de menos de aproximadamente 1,5 M, mas preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M, de concentraciones de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es tfpicamente de al menos aproximadamente 30°C y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, >50 nucleotidos). Las condiciones rigurosas tambien pueden conseguirse con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relacion de senal a ruido de 2 X (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo particular de hibridacion indica deteccion de una hibridacion espedfica. Los acidos nucleicos que no hibridan entre sf en condiciones rigurosas aun son sustancialmente identicos si las protemas que codifican son sustancialmente identicas. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un acido nucleico usando la degeneracion maxima de codones permitida por el codigo genetico. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones rigurosas para hibridacion de acidos nucleicos complementarios que tienen mas de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es formamida al 50%, por ejemplo, hibridacion en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 X a 60 hasta 65°C. Las condiciones de baja rigurosidad ejemplares incluyen hibridacion con una solucion tamponante de formamida al 30 hasta el 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sodico) 1% a 37°C, y un lavado en SSC 1 X hasta 2 X (SSC 20 X = NaCl 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50 hasta 55°C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen hibridacion en formamida al 40 hasta el 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en SsC 0,5 X a 1 X a 55 hasta 60°C. Lo siguiente son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridacion/lavado que pueden usarse para clonar secuencias de nucleotidos ortologas que son sustancialmente identicas a secuencias de nucleotidos de referencia de la presente invencion: una secuencia de nucleotidos de referencia preferiblemente hibrida con la secuencia de nucleotidos de referencia en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 2 X, SDS al 0,1% a 50°C, de forma mas deseable en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 1 X, SDS al 0,1% a 50°C, de forma mas deseable aun en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0,5 X, SDS al 0, 1% a 50°C, incluso de forma mas deseable aun en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0,1 X, SDS al 0,1% a 50°C.

En otra realizacion de la presente invencion, se proporcionan promotores meristematicos que comprenden una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 40%, al menos un 50% o al menos un 60%, o al menos un 70%, o al menos un 80%, o al menos un 90%, o al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. El termino "variante" con respecto a las secuencias de nucleotidos reguladoras de la transcripcion SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 de la invencion pretende indicar secuencias sustancialmente similares. Variantes alelicas de origen naturales, tales como estas, pueden identificarse con el uso de tecnicas bien conocidas de biologfa molecular como, por ejemplo, con reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y tecnicas de hibridacion, como se resumen en este documento anteriormente. Las secuencias de nucleotidos variantes tambien incluyen secuencias de nucleotidos obtenidas de forma sintetica, tales como las generadas, por ejemplo, usando mutagenesis dirigida al sitio de la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. Generalmente, las variantes de secuencia de nucleotidos de la invencion tendran al menos un 40%, 50%, 60%, to 70%, por ejemplo, preferiblemente un 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, a un 79%, generalmente al menos un 80%, por ejemplo, de un 81% a un 84%, al menos un 85%, por ejemplo, un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a un 98% y 99% de identidad de secuencia de nucleotidos con la secuencia de nucleotidos nativa (de tipo silvestre o endogena). Los derivados de las moleculas de ADN descritas en este documento pueden incluir, aunque sin limitacion, deleciones de secuencia, mutaciones puntuales individuales o multiples, alteraciones en un sitio particular de enzima de restriccion, adicion de elementos funcionales, u otro medio de modificacion molecular que pueda potenciar, o alterar de otro modo, la expresion del promotor. Las tecnicas para obtener dichos derivados son bien conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, J. F. Sambrook, D. W. Russell y N. Irwin (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Volumenes 1, 2, y 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Por ejemplo, un experto en la materia puede delimitar los elementos funcionales dentro de los promotores descritos en este documento y delecionar cualquier elemento no esencial. Los elementos funcionales pueden modificarse o combinarse para aumentar la utilidad o expresion de las secuencias de la invencion para cualquier aplicacion particular. Los expertos en la materia estan familiarizados con los materiales didacticos convencionales que describen condiciones espedficas y procedimientos para la construccion, manipulacion y aislamiento de macromoleculas (por ejemplo, moleculas de ADN, plasmidos, etc.), asf como la generacion de organismos recombinantes y la exploracion y aislamiento de moleculas de ADN. Como se usa en este documento, la expresion "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleotidos identicos entre dos segmentos de una ventana de ADN alineado de forma optima. La alineacion optima de secuencias para alinear una ventana de comparacion es bien conocida para los expertos en la materia y puede realizarse por herramientas tales como el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (Waterman, M. S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. Londres (1995)), el algoritmo de

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alineacion de homolog^a de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970)), el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. ScL, 85:2444 (1988)) y, preferiblemente por implementaciones informaticas de estos algoritmos, tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA disponibles como parte de GCG (marca registrada), Wisconsin Package (marca registrada de Accelrys Inc., San Diego, Calif.). Una "fraccion de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de ensayo y una secuencia de referencia es la cantidad de componentes identicos que estan compartidos por las dos secuencias alineadas dividida por la cantidad total de componentes en el segmento de la secuencia de referencia, es decir, la secuencia de referencia completa o una parte definida mas pequena de la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad de secuencia se representa como la fraccion de identidad por 100. La comparacion de una o mas secuencias de ADN puede ser con una secuencia de ADN de longitud completa o una parte de la misma, o con una secuencia de ADN mas larga.

Los promotores de la presente invencion (SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4) pueden unirse de forma funcional a una secuencia de acido nucleico que es heterologa con respecto al promotor. La secuencia de acido nucleico puede ser, generalmente, cualquier secuencia de acido nucleico para la que se desea un nivel aumentado o nivel alterado (por ejemplo, en un organo diferente) de transcripcion en un tejido meristematico, en particular un tejido meristematico de las hojas. La secuencia de acido nucleico puede codificar, por ejemplo, un polipeptido que es adecuado para su incorporacion en la dieta de un ser humano o un animal o puede proporcionar alguna otra caractenstica agncola o industrial importante. Las secuencias de acido nucleico heterologas adecuadas incluyen, sin limitacion, aquellas que codifican enzimas de la ruta de acidos grasos, epoxidasas, hidroxilasas, citocromo P450 mono-oxigenasas, desaturasas, enzimas biosinteticas de tocoferol, enzimas biosinteticas de carotenoides, enzimas biosinteticas de aminoacidos, enzimas de la ruta de esteroides y enzimas de ramificacion del almidon.

Por tanto, en otra realizacion particular, la invencion proporciona un casete de expresion para regular la expresion espedfica del meristemo en plantas, que comprende un promotor unido de forma funcional a un acido nucleico que es heterologo en relacion a dicho promotor y donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SeQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, b) un fragmento funcional de al menos 50 pares de bases consecutivas de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que tiene actividad promotora y (c) una secuencia de nucleotidos que hibrida en condiciones equivalente a hibridacion en dodecil sulfato sodico al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 2 X, sDs al 0,1% a 50°C con una secuencia de nucleotidos representada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un fragmento de al menos 50 bases consecutivas de la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de la misma.

En una realizacion particular, el casete de expresion, cuando se transforma en una planta, expresa un acido nucleico que provoca la expresion de una protema, o la expresion de un ARN antisentido, aRn con sentido o bicatenario.

En otra realizacion, la invencion proporciona un vector recombinante que comprende un casete de expresion como se ha descrito en este documento anteriormente.

El termino "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que senaliza el procesamiento 3' y la poliadenilacion de un transcrito primario y la terminacion de la transcripcion. El terminador puede obtenerse del gen natural, de una diversidad de otros genes de plantas, o de ADN T. El terminador a anadirse puede obtenerse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa o la octopina sintasa o, como alternativa, de otro gen de plantas, o menos preferiblemente, de cualquier otro gen eucariota.

"Marcador de seleccion", "gen marcador de seleccion" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo en una celula en que se expresa para facilitar la identificacion y/o seleccion de celulas que se transfectan o transforman con una construccion de acido nucleico de la invencion. Estos genes marcadores posibilitan la identificacion de una transferencia satisfactoria de las moleculas de acido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia a antibioticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabolico o que permiten la seleccion visual. Ejemplos de genes marcadores de seleccion incluyen genes que confieren resistencia a antibioticos (tales como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabolico (tal como manA que permite que las plantas usen manosa como unica fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilizacion de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresion de genes marcadores visuales provoca la formacion de color (por ejemplo, p-glucuronidasa, GUS o p-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo, X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (protema fluorescente verde, GFP, y derivados de la misma). Esta lista representa solamente una pequena cantidad de posibles marcadores. Los expertos en la materia estan familiarizados con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores, dependiendo del organismo y el metodo de seleccion.

Se sabe que, tras la integracion estable o transitoria de acidos nucleicos en celulas vegetales, solamente una

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minona de las celulas capta el ADN foraneo y, si se desea, lo integran en su genoma, dependiendo del vector de expresion usado y la tecnica de transfeccion usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, habitualmente se introduce un gen que codifica un marcador de seleccion (tal como los descritos anteriormente) en las celulas hospedadoras junto con el gen de interes. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en que estos genes no son funcionales por, por ejemplo, delecion por metodos convencionales. Ademas, las moleculas de acido nucleico que codifican un marcador de seleccion pueden introducirse en una celula hospedadora en el mismo vector que comprende la secuencia codificante de los polipeptidos de la invencion o usarse en los metodos de la invencion, o tambien en un vector diferente. Las celulas que se han transfectado de forma estable con el acido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, por seleccion (por ejemplo, celulas que han integrado el marcador de seleccion sobreviven mientras que las otras celulas mueren).

Como los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibioticos y herbicidas, ya no son necesarios o son indeseados en la celula hospedadora transgenica una vez los acidos nucleicos se han introducido satisfactoriamente, el proceso de acuerdo con la invencion para introducir los acidos nucleicos emplea ventajosamente tecnicas que posibilitan la eliminacion o escision de estos genes marcadores. Uno de dichos metodos es el que se conoce como cotransformacion. El metodo de cotransformacion emplea dos vectores simultaneamente para la transformacion, un vector que alberga el acido nucleico de acuerdo con la invencion y un segundo que alberga el gen o genes marcadores. Una gran proporcion de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta un 40% o mas de los transformantes), ambos vectores. En caso de transformacion con Agrobacteria, los transformantes habitualmente reciben solamente una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN T, que habitualmente representa el casete de expresion. Los genes marcadores pueden eliminarse posteriormente de la planta transformada realizando cruces. En otro metodo, se usan genes marcadores integrados en un transposon para la transformacion junto con el acido nucleico deseado (conocido como la tecnologfa Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construccion de acido nucleico que confiere la expresion de una transposasa, de forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente el 10%), el transposon salta del genoma de la celula hospedadora una vez la transformacion ha tenido lugar de forma satisfactoria y se pierde. En una cantidad adicional de casos, el transposon salta a una localizacion diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruces. En microbiologfa, se desarrollaron tecnicas que hacen posible, o facilitan, la deteccion de dichos eventos. Un metodo ventajoso adicional depende de lo que se conoce como sistemas de recombinacion; cuya ventaja es que puede prescindirse de la eliminacion por cruce. El sistema mejor conocido de este topo es lo que se conoce como el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que elimina las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se elimina una vez la transformacion ha tenido lugar de forma satisfactoria, por expresion de la recombinasa. Sistemas adicionales de recombinacion son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integracion espedfica de sitio en el genoma de la planta de las secuencias de acidos nucleico de acuerdo con la invencion.

Para los propositos de la invencion, "transgenico", "transgen" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico, un casete de expresion, una construccion genica o un vector que comprende la secuencia de acido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de acido nucleico, casetes de expresion o vectores de acuerdo con la invencion.

Una planta transgenica, para los propositos de la invencion, se entiende, por tanto, que significa, como anteriormente, que los acidos nucleicos usados en el metodo de la invencion no estan presentes en, o se originan a partir de, el genoma de dicha planta, o estan presentes en el genoma de dicha planta, pero no en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los acidos nucleicos se expresen de forma homologa o heterologa. Sin embargo, como se ha mencionado, transgenico tambien significa que, aunque los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion o usados en el metodo de la invencion estan en su posicion natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Se entiende preferiblemente que transgenico significa la expresion de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion en un locus no natural en el genoma, es decir, tiene lugar expresion homologa o heterologa de los acidos nucleicos. Se mencionan en este documento plantas transgenicas preferidas.

Para el proposito de esta invencion, pueden aislarse genes relacionados u ortologos de la ruta de transduccion de senales de etileno como se ha descrito anteriormente en este documento de las bases de datos de secuencias disponibles (al publico). La "identidad de secuencia" de dos secuencias relacionadas de nucleotidos o aminoacidos, expresada como un porcentaje, se refiere a la cantidad de posiciones en las dos secuencias alineadas de forma optima que tienen restos identicos (x100), dividida por la cantidad de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posicion en una alineacion donde esta presente un resto en una secuencia, pero no en la otra, se considera como una posicion con restos no identicos. La alineacion de las dos secuencias se realiza por el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch (1970) J Mol Biol. 48: 443-453). La alineacion de secuencia asistida por ordenador anteriormente puede realizarse convenientemente usando un programa de software convencional, tal como GAP, que es parte del Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, EE. UU.) usando la matriz de valores por defecto con una penalizacion por creacion de hueco de 50 y una penalizacion por extension de hueco de 3. Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando dicha secuencia

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tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 75%, particularmente al menos aproximadamente un 80%, mas particularmente al menos aproximadamente un 85%, bastante particularmente aproximadamente un 90%, especialmente aproximadamente un 95%, mas especialmente aproximadamente un 100%, bastante especialmente son identicas. Esta claro que cuando las secuencias de ARN tienen que ser esencialmente similares o que tener un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN.

Como alternativa, los expertos en la materia pueden aislar genes ortologos de plantas implicados en la ruta de transduccion de senales de etileno a traves de metodos de hibridacion genetica. Dichos metodos son bien conocidos para biologos moleculares expertos (plantas).

El termino "modulacion" significa, en relacion a la expresion o expresion genica, un proceso en que el nivel de expresion se cambia por dicha expresion genica en comparacion con la planta de control, el nivel de expresion puede estar aumentado o disminuido. La expresion no modulada original puede ser de cualquier tipo de expresion de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con posterior traduccion. Para los propositos de esta invencion, la expresion no modulada original tambien puede ser la ausencia de cualquier expresion. La expresion "modulacion de la actividad" significara cualquier cambio de la expresion de las secuencias de acidos nucleicos de la invencion o protemas codificadas, que conduce a produccion aumentada y/o crecimiento aumentado de las plantas. La expresion puede aumentar desde cero (ausencia de, o expresion inapreciable) hasta una cierta cantidad, o puede disminuir desde una cierta cantidad hasta cantidades pequenas inapreciables o cero.

El termino "expresion" o "expresion genica" significa la transcripcion de un gen espedfico o genes espedficos o construccion genetica espedfica. El termino "expresion" o "expresion genica" en particular significa la transcripcion de un gen o genes o construccion genetica en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin posterior traduccion del ultimo en una protema. El proceso incluye transcripcion de ADN y procesamiento del producto resultante de ARNm.

La expresion "expresion aumentada" o "sobreexpresion", como se usa en este documento, significa cualquier forma de expresion que sea adicional al nivel de expresion original de tipo silvestre. Para los propositos de esta invencion, el nivel de expresion original de tipo silvestre podna ser tambien cero, es decir, ausencia de expresion o expresion inapreciable.

Los metodos para aumentar la expresion de genes o productos genicos estan bien documentados en la tecnica e incluyen, por ejemplo, sobreexpresion dirigida por promotores apropiados (como se ha descrito anteriormente en este documento), el uso de potenciadores de la transcripcion o potenciadores de la traduccion. Los acidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posicion apropiada (tfpicamente cadena arriba) de una forma no heterologa de un polinucleotido para regular positivamente la expresion de un acido nucleico que codifica el polipeptido de interes. Si se desea la expresion del polipeptido, generalmente es deseable incluir una region de poliadenilacion en el extremo 3' de una region codificante polinucleotfdica. La region de poliadenilacion puede obtenerse del gen natural, de una diversidad de otros genes de plantas, o de ADN T. La secuencia del extremo 3' a anadirse puede obtenerse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa u octopina sintasa o, como alternativa, de otro gen de plantas o, menos preferiblemente, de cualquier otro gen eucariota.

Tambien puede anadirse una secuencia intronica en la region no traducida (UTR) 5' o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusion de un intron que se puede cortar y empalmar en la unidad de transcripcion en construcciones de expresion tanto de plantas como de animales, ha demostrado aumentar la expresion genica a nivel tanto de ARNm como de protema hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1 183-1200). Dicha potenciacion intronica de la expresion genica es tfpicamente maxima cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripcion. El uso de los intrones de mafz Adh1-S intron 1, 2, y 6, el intron Bronze-1 es conocido en la tecnica. Para informacion general vease: The Maize Handbook, Capftulo 1 16, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Estrategias para la regulacion negativa (o expresion disminuida) de genes de la lista que consiste en ACO1, ACO2, ETR2, ETR1, CTR1, MKK7, MKK9, EIN3, EIN5 y EIL1

Se acepta que una referencia en este documento a "expresion disminuida" o "reduccion o eliminacion sustancial" de la expresion significa una disminucion en la expresion genica endogena y/o los niveles de polipeptido y/o la actividad del polipeptido respecto a plantas de control. La reduccion o eliminacion sustancial es, en orden creciente de preferencia, de al menos un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas reducida en comparacion con la de plantas de control.

Para la reduccion o eliminacion sustancial de la expresion de un gen endogeno en una planta, preferentemente en el tejido meristematico, mas preferentemente en un tejido meristematico durante el periodo de estres abiotico (leve), se requiere una longitud suficiente de nucleotidos sustancialmente contiguos de una secuencia de acido nucleico. Para realizar silenciamiento genico, esta puede ser tan pequena como de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o

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menos nucleotidos, como alternativa esta puede ser tan grande como el gen completo (incluyendo la UTR 5' y/o 3', en parte o en su totalidad). El tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos puede obtenerse del acido nucleico que codifica la protema de interes (gen diana), o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ortologo, paralogo u homologo de la protema de interes. Preferiblemente, el tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrogeno con el gen diana (hebra con sentido o antisentido), mas preferiblemente, el tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia con el gen diana (hebra con sentido o antisentido). Una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido (funcional) no es un requisito para los diversos metodos analizados en este documento para la reduccion o eliminacion sustancial de la expresion de un gen endogeno.

Esta reduccion o eliminacion sustancial de la expresion puede conseguirse usando herramientas y tecnicas rutinarias. Un metodo preferido para la reduccion o eliminacion sustancial de la expresion genica endogena es introduciendo y expresando en una planta una construccion genetica en que el acido nucleico (en este caso un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivado del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codifican un ortologo, paralogo u homologo de una cualquiera de las protemas de interes) se clona como una repeticion invertida (en parte o completamente), separado por un especiados (ADN no codificante).

En dicho metodo preferido, la expresion del gen endogeno se reduce o elimina sustancialmente a traves de silenciamiento mediado por ARN usando una repeticion invertida de un acido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivado del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ortologo, paralogo u homologo de la protema de interes), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repeticion invertida se clona en un vector de expresion que comprende secuencias de control. Una secuencia de acido nucleico de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo, un fragmento de la region de union a matriz (MAR), un intron, un polienlazador, etc.) se localiza entre los dos acidos nucleicos invertidos que forman la repeticion invertida. Despues de la transcripcion de la repeticion invertida, se forma un ARN quimerico con una estructura autocomplementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se menciona como el ARN horquilla (ARNhp). El ARNhp se procesa por la planta en ARNip que se incorporan en un complejo de corte y empalme inducido por ARN (RISC). El RISC escinde adicionalmente los transcritos de ARNm, reduciendo de ese modo sustancialmente la cantidad de transcritos de ARNm a traducirse en polipeptidos. Para detalles general adicionales, vease, por ejemplo, Grierson et al. (1998) documento WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) documento WO 99/53050).

El rendimiento de los metodos de la invencion no depende de la introduccion y expresion en una planta de una construccion genetica en que el acido nucleico se clona como una repeticion invertida, sino que puede usarse uno cualquiera o mas de varios metodos de "silenciamiento genico" bien conocidos para conseguir los mismos efectos.

Uno de dichos metodos para la reduccion de la expresion genica endogena es el silenciamiento mediado por ARN de la expresion genica (regulacion negativa). El silenciamiento, en este caso, se desencadena en una planta por una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endogeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta en aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleotidos llamados ARN interferentes cortos (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen diana endogeno, reduciendo de ese modo sustancialmente la cantidad de transcritos de ARNm a traducir en un polipeptido. Preferiblemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde con un gen diana.

Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento de ARN implica la introduccion de secuencias de acido nucleico o partes de las mismas (en este caso, un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivado del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codifican un ortologo, paralogo u homologo de la protema de interes) en una orientacion con sentido en una planta. La "orientacion con sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a un transcrito de ARNm de la misma. Introducida en la planta estana, por lo tanto, una copia de la secuencia de acido nucleico. La secuencia de acido nucleico adicional reducira la expresion del gen endogeno, dando lugar a un fenomeno conocido como cosupresion. La reduccion de la expresion genica sera mas pronunciada si se introducen varias copias adicionales de una secuencia de acido nucleico en la planta, ya que existe una correlacion positiva entre los altos niveles de transcrito y la activacion de la cosupresion.

Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de acidos nucleico antisentido. Una secuencia de acido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de acido nucleico "con sentido" que codifica una protema, es decir, complementaria a la hebra codificante de una molecula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de transcrito de ARNm. La secuencia de acido nucleico antisentido es preferiblemente complementaria al gen endogeno a silenciar. La complementariedad puede estar localizada en la "region codificante" y/o en la "region no codificante" de un gen. La expresion "region codificante" se refiere a una region de la secuencia de nucleotidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoacido. La expresion "region no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la region codificante que se transcriben, pero no se traducen en aminoacidos (tambien mencionadas como secuencias no traducidas 5' y 3').

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Pueden disenarse secuencias de acido nucleico antisentido de acuerdo con las normas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de acido nucleico antisentido puede ser completana a la secuencia de acido nucleico completa (en este caso un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivado del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ortologo, paralogo u homologo de la protema de interes), pero tambien puede ser un oligonucleotido que es antisentido a solamente una parte de la secuencia de acido nucleico (incluyendo la UTR 5' y 3' del ARNm). Por ejemplo, la secuencia oligonucleotfdica antisentido puede ser complementaria a la region que rodea el sitio de inicio de la traduccion de un transcrito de ARNm que codifica un polipeptido. La longitud de una secuencia oligonucleotidica antisentido adecuada es conocida en la tecnica y puede empezar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleotidos de longitud o menos. La secuencia de acido nucleico antisentido puede producirse en la celula vegetal usando un vector de expresion (que comprende un gen quimerico de la invencion) en que una secuencia de acido nucleico se ha subclonado en una orientacion antisentido (es decir, el ARN transcrito desde el acido nucleico insertado sera de una orientacion antisentido a un acido nucleico diana de interes). Preferiblemente, la produccion de secuencias de acido nucleico antisentido en plantas sucede mediante una construccion de acido nucleico integrada de forma estable que comprende un promotor, un oligonucleotido antisentido unido de forma funcional y un terminador.

Las moleculas de acido nucleico usadas para silenciamiento en los metodos de la invencion (se introduzcan en una planta o se generen in situ) hibridan con o se unen a transcritos de ARNm y/o ADN genomico que codifica un polipeptido para inhibir de ese modo la expresion de la protema, por ejemplo, inhibiendo la transcripcion y/o la traduccion. La hibridacion puede ser por complementariedad convencional de nucleotidos para formar un duplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de acido nucleico antisentido que se une a duplex de ADN, a traves de interacciones espedficas en el surco mayor de la doble helice. Las secuencias de acido nucleico antisentido pueden introducirse en una planta por transformacion o inyeccion directa en un sitio tisular espedfico.

La reduccion o eliminacion sustancial de la expresion genica endogena tambien puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moleculas de ARN catalftico con actividad ribonucleasa que son capaces de escindir una secuencia de acido nucleico monocatenaria, tal como un ARNm, para la que tienen una region complementaria. Por tanto, pueden usarse ribozimas (por ejemplo, ribozimas en cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) para escindir cataltticamente transcritos de ARNm que codifican un polipeptido, reduciendo de ese modo sustancialmente la cantidad de transcritos de ARNm a traducir en un polipeptido. Puede disenarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de acido nucleico (vease, por ejemplo: Cech et al. patente de Estados Unidos n.° 4.987.071; y Cech et al. patente de Estados Unidos n.° 5.116.742). Como alternativa, los transcritos de ARNm correspondientes a una secuencia de acido nucleico pueden usarse para seleccionar un ARN catalftico que tenga una actividad ribonucleasa espedfica a partir de una combinacion de moleculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 141 1 -1418). El uso de ribozimas para silenciamiento genico en plantas es conocido en la tecnica (por ejemplo, Atkins et al. (1994) documento WO 94/00012; Lenne et al. (1995) documento WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) documento WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) documento WO 97/13865 y Scott et al. (1997) documento WO 97/38116).

Un enfoque adicional al silenciamiento genico es dirigir secuencias de acido nucleico complementarias a la region reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras de triple helice que eviten la transcripcion del gen en celulas diana. Vease Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros metodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipeptido endogeno para inhibir su funcion en plantas, o la interferencia en la ruta de senalizacion en que esta implicado un polipeptido, seran bien conocidos para los expertos en la materia. En particular, puede preverse que moleculas artificiales pueden ser utiles para inhibir la funcion biologica de un polipeptido diana, o para interferir con la ruta de senalizacion en que esta implicado el polipeptido diana.

Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para anular la expresion genica y/o la traduccion de ARNm. Los miARN endogenos son ARN pequenos monocatenarios de tfpicamente 19-24 nucleotidos de longitud. Funcionan principalmente regulando la expresion genica y/o la traduccion de ARNm. La mayona de microARN (miARN) de plantas tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, existen dianas naturales con hasta cinco desapareamientos. Se procesan de ARN no codificantes mas largos con estructuras replegadas caractensticas por RNasas espedficas de doble hebra de la familia Dicer. Tras el procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) por union a su componente principal, una protema Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad de RISC, ya que forman pares de bases con acidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los posteriores eventos reguladores incluyen escision de ARNm diana y destruccion y/o inhibicion de la traduccion. Los efectos de la sobreexpresion de miARN a menudo se reflejan, por tanto, en niveles disminuidos de ARNm de genes diana.

Los microARN artificiales (amiARN), que son tfpicamente de 21 nucleotidos de longitud, pueden modificarse por ingeniena genetica espedficamente para regular negativamente la expresion genica de un unico gen o multiples genes de interes. Los determinantes de la seleccion de diana de microARN de plantas son bien conocidos en la

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tecnica. Se han definido parametros empmcos para el reconocimiento de la diana y pueden usarse para ayudar en el diseno de amiARN espedficos (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas convenientes para el diseno y la generacion de amiARN y sus precursores tambien estan disponibles al publico (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121 -1 133, 2006).

Para un rendimiento optimo, las tecnicas de silenciamiento genico usadas para reducir la expresion en una planta de un gen endogeno requieren el uso de secuencias de acido nucleico de plantas monocotiledoneas para la transformacion de plantas monocotiledoneas, y de plantas dicotiledoneas para la transformacion de plantas dicotiledoneas. Preferiblemente, se introducir una secuencia de acido nucleico de cualquier especie dada de planta en esa misma especie. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es una necesidad absoluta que la secuencia de acido nucleico a introducir sea originaria de la misma especie de planta que la planta en que se introducira. Es suficiente que haya homologfa sustancial entre el gen diana endogeno y el acido nucleico a introducir.

En otra realizacion mas, la interferencia de protemas, como se describe en la solicitud de patente WO2007071789 (medios y metodos para mediar la interferencia de protemas) puede usarse para regular negativamente un producto genico. La ultima tecnologfa es una tecnologfa knock-down que en contraste con iARN actua a nivel postraduccional (es decir, trabaja directamente sobre el nivel de protema induciendo una agregacion de protemas espedfica de una diana dada). La agregacion de protemas es esencialmente un evento de mal plegamiento que sucede a traves de la formacion de laminas beta intermoleculares produciendo una anulacion funcional de una diana seleccionada. A traves del uso de un algoritmo especializado, es posible predecir de forma precisa los tramos de aminoacidos en una secuencia elegida de protema diana que tendran la mayor tendencia de autoasociacion (Fernandez-Escamilla A. M. et al. (2004) Nat Biotechnol 22(10): 1302-6). Expresando estos peptidos espedficos en las celulas, la protema de interes puede dirigirse espedficamente induciendo su agregacion irreversible y por tanto su anulacion funcional.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos metodos para la reduccion o eliminacion sustancial de la expresion en una planta de un gen endogeno o un producto genico endogeno. Un experto en la materia sena muy capaz de adaptar los metodos mencionados anteriormente para el silenciamiento para conseguir la reduccion de la expresion del gen endogeno en una planta completa o en partes de la misma a traves del uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

El termino "introduccion" o "transformacion", como se menciona en este documento, abarca la transferencia de un polinucleotido exogeno en una celula hospedadora, independientemente del metodo usado para la transferencia. El tejido vegetal con capacidad de posterior propagacion clonal, sea por organogenesis o embriogenesis, puede transformarse con una construccion genetica de la presente invencion y un regenerarse una planta completa a partir de la misma. El tejido particular elegido variara dependiendo de los sistemas de propagacion clonal disponibles para, y mas adecuados para, la especie particular que se este transformando. Dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristematico existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares y meristemos de la rafz) y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledon y meristemo de hipocotilo). El polinucleotido puede introducirse de forma transitoria o estable en una celula hospedadora y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plasmido. Como alternativa, puede integrarse en el genoma hospedador. La celula vegetal transformada resultante despues puede usarse para regenerar una planta transformada de un modo conocido para los expertos en la materia.

La transferencia de genes foraneos en el genoma de una planta se llama transformacion. La transformacion de una especie de planta ahora es una tecnica casi rutinaria. De forma ventajosa, puede usarse cualquiera de varios metodos de transformacion para introducir el gen de interes en una celula progenitora adecuada. Los metodos descritos para la transformacion y regeneracion de plantas a partir de tejidos vegetales o celulas vegetales pueden utilizarse para transformacion transitoria o estable. Los metodos de transformacion incluyen el uso de liposomas, electroporacion, agentes qrnmicos que aumentan la captacion de ADN libre, inyeccion del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partmulas, transformacion usando virus o polen y microproyeccion. Los metodos pueden seleccionarse del metodo de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363- 373); electroporacion de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinyeccion en material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179185); bombardeo con partmulas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), infeccion con virus (no de integracion) y similares. Las plantas transgenicas, incluyendo plantas transgenicas de cultivo, se producen preferiblemente mediante transformacion mediada por Agrobacterium. Un metodo ventajoso de transformacion es la transformacion in planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las Agrobacteria actuen sobre semillas de plantas o inocular el meristemo de la planta con Agrobacteria. Se ha demostrado que es particularmente oportuno de acuerdo con la invencion permitir que una suspension de Agrobacteria transformadas actue sobre la planta intacta o al menos sobre los primordios de la flor. La planta se cultiva posteriormente hasta que se obtiene las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los metodos para la transformacion mediada por Agrobacterium del arroz incluyen metodos bien conocidos para la transformacion del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP1198985, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994). En el caso de transformacion de mafz, el metodo preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat.

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Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002). Dichos metodos se describen adicionalmente a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los acidos nucleicos o la construccion a expresarse se clonan preferiblemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). Las Agrobacteria transformadas por dicho vector despues pueden usarse de un modo conocido para la transformacion de plantas, tales como plantas usadas como modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana esta dentro del alcance de la presente invencion no considerada como una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, por inmersion de hojas mustias u hojas troceadas en una solucion agrobacteriana y despues cultivandolas en medio adecuado. La transformacion de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hofgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o es conoce inter alia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pag. 15-38.

Ademas de la transformacion de celulas somaticas, que despues tienen que regenerarse en plantas intactas, tambien es posible transformar las celulas de meristemos vegetales y, en particular, aquellas celulas que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgenicas. Por tanto, por ejemplo, se tratan semillas de Arabidopsis con Agrobacteria y se obtienen semillas de las plantas en desarrollo de la cuales se transforma una cierta proporcion y por tanto son transgenicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1 -9; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pag. 274-289]. Metodos alternativos se basan en la eliminacion repetida de las inflorescencias y la incubacion del sitio de escision en el centro de la roseta con Agrobacteria transformadas, por lo cual se pueden obtener, asimismo, semillas transformadas en un punto temporal posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un metodo especialmente eficaz es el metodo de infiltracion en vacfo con sus modificaciones, tales como el metodo de "inmersion floral". En el caso de infiltracion en vacfo de Arabidopsis, se tratan a presion reducida plantas intactas con una suspension agrobacteriana [Bechthold, N (1993). CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1 194-1 199], mientras que en el caso del metodo de "inmersion floral", el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspension agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Se recoge una cierta proporcion de semillas transgenicas en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de semillas no transgenicas cultivando en las condiciones selectivas descritas anteriormente. Ademas, la transformacion estable se plastidos es ventajosa porque los plastidos se heredan por via materna en la mayona de cultivos, reduciendo o eliminando el riesgo de que el transgen fluya a traves de polen. La transformacion del genoma del cloroplasto generalmente se consigue por un proceso que se ha presentado de forma esquematica en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias a transformar se clonan junto con un gen marcador de seleccion entre secuencias flanqueantes homologas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homologas dirigen integracion espedfica de sitio en el plastoma. La transformacion de plastidos se ha descrito para muchas especies diferentes de plantas y se da una vision global en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se ha informado de progreso biotecnologico adicional en forma de transformantes de plastidos sin marcador, que pueden producirse por un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las celulas vegetales modificadas geneticamente pueden regenerarse mediante todos los metodos con los que estan familiarizados los expertos en la materia. Pueden encontrarse metodos adecuados en las publicaciones mencionadas anteriormente por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitzer.

Generalmente despues de la transformacion, se seleccionan celulas vegetales o agrupaciones de celulas para la presencia de uno o mas marcadores que estan codificados por genes expresables en plantas cotransferidos con el gen de interes, despues de los cual se regenera el material transformado en una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformacion se somete, como norma, a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo descrito anteriormente pueden plantarse y, despues de un periodo de cultivo inicial, pueden someterse a una seleccion adecuada por pulverizacion. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si fuera apropiado despues de esterilizacion, en placas de agar usando un agente de seleccion adecuado de modo que solamente las semillas transformadas puedan crecer en plantas. Como alternativa, las plantas transformadas se exploran para la presencia de un marcador de seleccion, tales como los descritos anteriormente.

Despues de la transferencia de ADN y la regeneracion, tambien pueden evaluarse las plantas supuestamente transformadas, por ejemplo, usando analisis de Southern, para la presencia del gen de interes, el numero de copias y/o la organizacion genomica. Como alternativa o adicionalmente, pueden controlarse los niveles de expresion del ADN recien introducido usando analisis de Northern y/o Western, siendo ambas tecnicas bien conocidas para los expertos en la materia.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse por una diversidad de medios, tales como por

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propagacion clonal o tecnicas clasicas de reproduccion. Por ejemplo, una planta transformada de primera generacion (o T1) puede autocruzarse y seleccionarse los transformantes de segunda generacion (o T2) homocigoticos, y las plantas T2 pueden despues propagarse adicionalmente a traves de tecnicas clasicas de reproduccion. Los organismos transformados generados pueden adoptar una diversidad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de celulas transformadas y celulas no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las celulas transformadas que contienen el casete de expresion); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un retono no transformado).

Habitualmente, sucede un aumento en la produccion y/o la tasa de crecimiento si la planta esta en condiciones no de estres. Las plantas tipicamente responden a la exposicion a estres creciendo mas lentamente. En condiciones de estres severo, la planta puede incluso detener el crecimiento por completo. El estres leve, por otro lado, se define en este documento como cualquier estres al que se expone una planta, que provoca que la planta deje de crecer mas lento (o temporalmente) pero aun tiene la capacidad de reiniciar el crecimiento cuando desaparece el estres (leve). El estres leve, en el sentido de la invencion, conduce a una reduccion en el crecimiento de las plantas estresadas, de menos del 40%, 35%, 30% o 25%, mas preferiblemente menos del 20% o 15% en comparacion con la planta de control en condiciones no de estres. Debido a los avances en la practica agncola (riego, fertilizacion, tratamientos con pesticida) los estreses severos no se encuentran a menudo en plantas de cultivo cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estres leve a menudo es una caractenstica indeseable para la agricultura. Los "estreses leves" son los estreses bioticos y/o abioticos (ambientales) habituales a los que se expone una planta. Los estreses abioticos pueden deberse a seqrna o exceso de agua, estres anaerobico, estres salino, toxicidad qmmica, estres oxidativo y temperaturas calientes, fnas o de congelacion.

Los "estreses bioticos" son tipicamente aquellos estreses causados por patogenos, tales como bacterias, virus, hongos, nematodos e insectos.

El "estres abiotico" puede ser un estres osmotico causado por un estres de agua, por ejemplo, debido a seqrna, estres salino o estres por congelacion. El estres abiotico tambien puede ser un estres oxidativo o un estres por fno. El "estres por congelacion" pretende hacer referencia a estres debido a temperaturas de congelacion, es decir, temperaturas en que las moleculas disponibles de agua se congelan y se convierten en hielo. El "estres por fno", tambien llamado "estres por enfriamiento", pretende hacer referencia a temperaturas fnas, por ejemplo, temperaturas por debajo de 10°C o preferiblemente por debajo de 5°C, pero en las que las moleculas de agua no se congelan. Como se presenta en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estres abiotico conduce a una serie de cambios morfologicos, fisiologicos, bioqmmicos y moleculares que afectan de forma adversa al crecimiento y productividad de la planta. Se sabe que la seqrna, salinidad, temperaturas extremas y estres oxidativo estan interconectados y pueden inducir danos en el crecimiento y celulares a traves de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "interferencia" entre el estres por seqrna y el estres por alta salinidad. Por ejemplo, la seqrna y/o la salinizacion se manifiestan principalmente como estres osmotico, provocando la alteracion de la homeostasis y la distribucion de iones en la celula. El estres oxidativo, que frecuentemente acompana a una alta o baja temperatura, el estres por salinidad o seqrna, puede causar la desnaturalizacion de protemas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas similares de senalizacion celular y respuestas celulares, tales como la produccion de protemas de estres, regulacion positiva de antioxidantes, acumulacion de solutos compatibles y detencion del crecimiento. La expresion condiciones "no de estres", como se usa en este documento, es las aquellas condiciones ambientales que permiten el crecimiento optimo de las plantas. Los expertos en la materia son conscientes de las condiciones normales del suelo y las condiciones climaticas para una localizacion dada. Las plantas con condiciones optimas de crecimiento (crecimiento en condiciones no de estres) tipicamente producen, en orden creciente de preferencia, al menos un 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la produccion promedio de dicha planta en un entorno dado. La produccion promedio puede calcularse sobre una base de recoleccion y/o estacional. Los expertos en la materia son conscientes de las producciones promedio de rendimiento de un cultivo.

En particular, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones no de estres. En un ejemplo, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones no de estres tales como seqrna leve para dar plantas que tienen produccion aumentada respecto a plantas de control.

En otra realizacion, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones de estres.

En un ejemplo, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones de estres, tales como seqrna, para dar plantas que tienen produccion aumentada respecto a plantas de control. En otro ejemplo, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones de estres, tales como deficiencia de nutrientes, para dar plantas que tienen produccion aumentada respecto a plantas de control.

La deficiencia de nutrientes puede resultar de la ausencia de nutrientes, tales como nitrogeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fosforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

En otro ejemplo mas, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones de estres, tales como

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estres salino, para dar plantas que tienen produccion aumentada respecto a plantas de control. La expresion estres salino no esta restringida a la sal comun (NaCl), sino que puede ser una cualquiera o mas de: NaCl, KCl, LiCl, MgC, CaC, entre otras.

En otro ejemplo mas, los metodos de la presente invencion pueden realizarse en condiciones de estres, tales como estres por fno o estres por congelacion, para dar plantas que tienen produccion aumentada respecto a plantas de control.

Las expresiones "aumentar", "mejorar" o "potenciar" son intercambiables e indicaran, en el sentido de la solicitud, al menos un 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferiblemente al menos un 15% o 20%, mas preferiblemente un 25%, 30%, 35% o 40% mas de produccion y/o crecimiento en comparacion con plantas de control, como se define en este documento.

El termino "planta", como se usa en este documento, abarca plantas completas, progenitores y descendencia de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, rafces (incluyendo tuberculos), flores y tejidos y organos, donde cada uno de los mencionados anteriormente comprenden el gen/acido nucleico de interes. El termino "planta" tambien abarca celulas vegetales, cultivos en suspension, tejido calloso, embriones, regiones meristematicas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas, de nuevo donde cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/acido nucleico de interes.

Las plantas que son particularmente utiles en los metodos de la invencion incluyen, en particular, plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos comestibles, arboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropiron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza oleaginosa, nabo colza]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospiros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp. Lactuca sativa Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon piriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pirus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.

La eleccion de plantas adecuadas de control es una parte rutinaria de un sistema experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interes. La planta de control tipicamente es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta a evaluar. La planta de control tambien puede ser un cigoto nulo de la planta a evaluar. Los cigotos nulos son individuos a han perdido el transgen por segregacion. Una "planta de control", como se usa en este documento, se refiere no solamente a plantas completas, sino tambien a partes de plantas, incluyendo semillas y partes de semillas.

La invencion proporciona una planta modificada geneticamente, que puede ser una planta transgenica, que es mas tolerante a una condicion de estres que una planta de referencia correspondiente. Como se usa en este documento, el termino "tolerante", cuando se usa en referencia a una condicion de estres de una planta, significa que la planta particular, cuando se expone a una condicion de estres, muestra menos de un efecto, o nada de efecto, en respuesta a la condicion en comparacion con una planta de referencia correspondiente (planta de tipo silvestre de

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origen natural o una planta que no contiene una construccion de la presente invencion). Como consecuencia, una planta abarcada dentro de la presente invencion muestra produccion agncola mejorada como resultado de tolerancia potenciada a estres abiotico y crece mejor en condiciones mas ampliamente variables, tales como biomasa aumentada y/o producciones mayores y/o produce mas semillas. Preferiblemente, la planta transgenica tiene capacidad de crecimiento sustancialmente normal en condiciones ambientales donde la planta de referencia correspondiente muestra crecimiento, produccion, metabolismo o viabilidad reducida, o esterilidad masculina o femenina aumentada.

Como se usa en este documento, la expresion "tolerancia a seqrna" se refiere a la productividad mas deseable de una planta en condiciones de estres por deficit de agua. El estres por deficit de agua se desarrolla cuando la demanda por evapotranspiracion de agua excede el suministro de agua. El estres por deficit de agua puede ser de magnitud grande o pequena (por ejemplo, dfas o semanas de poca o ninguna agua accesible), pero las plantas tolerantes a seqrna muestran mejor crecimiento y/o recuperacion del estres, en comparacion con plantas sensible a seqrna. Como se usa en este documento, la expresion "eficacia en el uso de agua" se refiere a la productividad mas deseable de una planta por unidad de agua aplicada. El agua aplicada puede ser el resultado de precipitaciones o riego. Como se usa en este documento, la expresion "tolerancia salina" se refiere a la productividad mas deseable de una planta en condiciones de estres por salinidad. Aunque para cada especie difiere el umbral al que el suelo y/o la salinidad del agua (a menudo expresada como conductividad), una planta tolerante a sal tendna un mayor umbral de salinidad antes del descenso de la produccion. La tolerancia salina tambien se refiere a la sensibilidad de la produccion al agua y/o la salinidad del suelo mas alla del umbral. De modo que una planta tolerante a la sal mostrana menos impacto sobre la produccion por unidad de salinidad que una planta sensible a sal. La tolerancia salina se refiere a un umbral aumentado y/o una sensibilidad disminuida mas alla del umbral de produccion a salinidad.

La expresion "casete de expresion" se refiere a cualquier sistema de expresion recombinante para el proposito de expresar una secuencia de acido nucleico de la invencion in vitro o in vivo, de forma constitutiva o inducible, en cualquier celula incluyendo, ademas de celulas vegetales, celulas procariotas, de levadura, fungicas, de insecto o de mairnfero. La expresion incluye sistemas lineales y circulares de expresion. La expresion incluye todos los vectores. Los casetes pueden permanecer episomicos o integrarse en el genoma de la celula hospedadora. Los casetes de expresion pueden tener la capacidad de autorreplicarse o no (es decir, dirigir la expresion unicamente transitoria en una celula). La expresion incluye casetes de expresion recombinantes que contienen solamente los elementos mmimos necesarios para la transcripcion del acido nucleico recombinante.

El termino "inducible" o "induciblemente" significa que los polipeptidos de la presente invencion no se expresan o se expresan a niveles muy bajos, en ausencia de un agente inductor. La expresion de los polipeptidos de la presente invencion se induce enormemente en respuesta a un agente inductor.

Los siguientes ejemplos no limitantes describen metodos y medios de acuerdo con la invencion. Salvo que se indique de otro modo en los ejemplos, todas las tecnicas se realizan de acuerdo con protocolos convencionales en la tecnica. Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar realizaciones de la invencion. Los expertos en la materia deben apreciar, a la luz de la presente descripcion, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se describen y aun obtener un resultado parecido o similar. Mas espedficamente, sera evidente que ciertos agentes que estan tanto qmmica como fisiologicamente relacionados, pueden sustituirse en el lugar de los agentes descritos en este documento, aunque se conseguinan resultado iguales o similares.

Ejemplos

1. El estres osmotico afecta a la proliferacion celular y la aparicion de endorreduplicacion

Para descifrar los mecanismos por los que el deficit de agua inhibe la proliferacion celular, se desarrollo un sistema experimental que reduda de forma reproducible el area foliar en aproximadamente un 50%. Los mejores resultados se obtuvieron por la adicion de manitol al medio de cultivo a una baja concentracion (25 mM), disminuyendo de ese modo el potencial acuoso del medio y, por tanto, la captacion de agua de las rafces expuestas. Se germinaron plantulas de Arabidopsis y se cultivaron en mallas de nylon superpuestas en medio control hasta 9 dfas despues de la estratificacion (DAS), cuando la tercera hoja verdadera esta en plena proliferacion (Skirycz et al., 2010), y posteriormente se transfirieron a medio de control o que contema manitol (Figuras 1A a 1C). Se realizo analisis cinematico, mediante lo cual las hojas se recogieron diariamente durante todo el desarrollo de la hoja 3 (9-20 DAS) y basandose en los esquemas de la epidermis abaxial se calcularon la cantidad de celulas, el area celular, la cantidad de celulas guardianas y las tasas de division celular y expansion celular (De Veylder et al., 2001). La disminucion en el area foliar ya era evidente 24 h despues de la transferencia (Figura 2A; ensayo t, valor p = 0,003) y resulto de tasas reducidas de proliferacion, como se demuestra por las mediciones celulares (Figura 2B). Sin embargo, esta reduccion era a corto plazo ya que las tasas de division celular de plantas estresadas eran indistinguibles de los controles en 72 h de transferencia, y despues de ello incluso ligeramente aumentadas como compensacion de la disminucion inicial (Figura 2B). De forma importante, la propia transferencia no inhida el crecimiento foliar y las cantidades reducidas de celulas podnan atribuirse completamente a estres osmotico (no mostrado). No se alteraron la morfologfa foliar ni de la planta por manitol (Figura 2C). La expansion celular tambien se vio afectada por el estres

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y el area foliar final reducida era una combinacion de menos celulas y mas pequenas (Figura 2D). El mdice estomatico, que representa la cantidad es estomas como una fraccion del numero total de celulas, se redujo tambien (Figura 2E). Para aprender mas acerca de los mecanismos subyacentes a la rapida reduccion de la division celular tras la aparicion del estres, se recogieron muestras foliares diariamente despues de la transferencia. Como una medida de la diferenciacion celular, se examino la distribucion de ploid^a por citometna de flujo. Esto revelo diferencias significativas empezando desde 48 h despues de la imposicion del estres (Figura 3A). En hojas estresadas, empezaron a acumulares nucleos 4C aproximadamente un dfa antes que en los controles a expensas de nucleos 2C (Figura 3A). De forma analoga, la cantidad de nucleos 8C aumento abruptamente en 14 DAS en hojas estresadas, pero solamente en 15 DAS en muestras de control (Figura 3A). De nuevo, la propia transferencia no tuvo efecto sobre los niveles de ploidfa (no mostrado). La aparicion mas rapida de endorreduplicacion implico que el estres inducfa salida mitotica. Esta observacion se investigo adicionalmente con una lmea indicadora CYCB1;1:Dbox-GUS. La tincion para la actividad CYCB1;1:Dbox-GUS visualiza celulas en la transicion G2-a-M, reflejando la actividad mitotica (Colon-Carmona et al., 1999). Las diferencias mas evidentes se observaron 48 h despues de la transferencia. Aunque la diferenciacion en el desarrollo se manifiesta por fuerte tincion en la base de la hoja, pero sin tincion en la punta de la hoja, podna verse claramente en hojas tanto de control como estresadas, que la actividad GUS global era mucho mas debil en las hojas estresadas correspondientes a una cantidad reducida de celulas mitoticas (Figura 3B). Aunque el tamano relativo de la zona de proliferacion celular fue similar en hojas tratadas con manitol, las celulas restantes en proliferacion se encontraron en un patron disperso en toda esta zona. En conclusion, la exposicion de hojas en proliferacion a estres osmotico leve conduce a una rapida disminucion en las tasas de division celular y una aparicion mas rapida de endorreduplicacion, indicativa de una salida mitotica prematura que tambien se observo por la expresion reducida de CYCB1;1:Dbox-GUS tras tratamiento de estres. En unos pocos dfas despues de la transferencia, las tasas de division se adaptaron a las nuevas condiciones y se observaron efectos de compensacion.

2. La detencion y la salida del ciclo celular dependen de la duracion del estres

Para investigar la dinamica de la senalizacion de estres, se transfirieron plantulas de 9-DAS de edad a manitol durante 10, 24 o 48 h y posteriormente se transfirieron de nuevo a medio de control. Aunque en todos los casos el estres osmotico produjo detencion del ciclo celular, ilustrada por un area foliar reducida medida en 10 DAS (24 h despues de la transferencia inicial) (Figura 4A), 10 h de imposicion de estres fue demasiado corto para desencadenar la salida mitotica, mientras que despues de 24 h, era visible alguna diferenciacion prematura (Figura 4C). Ademas, la reduccion inicial en la cantidad de celulas medida despues de exposicion durante 10 h y 24 h se compenso completamente y no pudieron detectarse cambios en la cantidad de celulas en 14 DAS, aunque esta recuperacion fue solamente parcial para plantas expuestas a estres durante 48 h (Figura 4B). Junto con las cantidades de celulas, el mdice estomatico se recupero tambien en estas plantas (no mostrado). En conclusion, una exposicion corta a estres detiene de forma reversible el ciclo celular y solamente cuando el estres persiste se observa salida mitotica y diferenciacion.

3. La actividad aumentada de division meristemoide ayuda en la recuperacion de la cantidad de celulas

Despues de la detencion inicial de division celular en la zona de proliferacion celular y la posterior salida del ciclo celular mitotico, se recuperaron las tasas de division celular y se volvieron ligeramente mayores en hojas tratadas con manitol (Figura 2B) empezando en 13 DAS, un punto temporal en que la zona de division celular definida se reduce a una zona muy estrecha cerca de la base de la hoja. Ademas, cuando las plantas se estresan durante 48 h, momento en el cual habfa sucedido la diferenciacion, y despues se transfirieron de nuevo al medio de control, sus cantidades de celulas se recuperaron parcialmente y, simultaneamente, el mdice estomatico se recupero completamente tambien (Figura 4C). Las divisiones asociadas con la formacion de estomas podnan justificar esta recuperacion. Usando la lmea CYCB1;1:DBox-GUS, de hecho se pudo demostrar que en el momento de la recuperacion de la cantidad de celulas (13-14 DAS) la actividad de division meristemoide era mayor en muestras tratadas con manitol y en muestras en recuperacion del tratamiento de manitol que en muestras de control (Figura 5A). Como el linaje meristemoide esta restringido a la epidermis, tambien se comprobo la actividad de division en los tejidos internos de la hoja y se observo que en 14 DAS aun habfa alguna actividad mitotica en la base de la hoja de plantas cultivadas en manitol, mientras que en hojas de control la zona de proliferacion celular habfa desaparecido completamente (Figura 5B).

4. Apreciacion molecular en la inhibicion del crecimiento revelada por perfilado de transcritos

Para obtener una mejor comprension de los mecanismos molecular que inhiben la division celular durante el estres, los primordios de la hoja en proliferacion se sometieron a perfilado de transcritos del genoma completo. El analisis estadfstico identifico 27, 189, 351, y 886 transcritos regulados positivamente y 31, 145, 84, y 622 regulados negativamente a las 1,5, 3, 12 y 24 h despues de la transferencia a manitol 25 mM, respectivamente. Los datos de microserie seleccionados pudieron validarse con una plataforma nCounter que contema sondas para 100 genes implicados en el crecimiento, el estres y la regulacion hormonal. Se usaron transcritos diferenciales para construir diagramas Venn y se sometieron a agrupaciones de medias k. La cantidad de genes expresados de forma diferencial fue proporcional al tiempo de exposicion a estres y la mayona de los genes que estaban regulados positivamente o negativamente en puntos temporales anteriores permanecieron altos o bajo a las 24 h,

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respectivamente. Posteriormente, se examinaron los transcritos diferenciales con PageMan para calcular la sobrerrepresentacion funcional de categonas MapMan (Thimm et al., 2004; Usadel et al., 2006) y se compararon con experimented de microserie disponibles al publico (vease "materiales y metodos"). Para explicar las reducidas tasas de proliferacion celular, los genes del ciclo celular estaban entre los sospechosos principales. De hecho, varios transcritos que codifican ciclinas de tipo A, By D, CDKB, protemas relacionadas con SIAMESE y un factor de transcripcion MYB3R4 estaban significativamente regulados negativamente (Figura 6A). La comparacion con los datos de expresion obtenidos de cultivos celulares sincronizados (Menges et al., 2003) revelo una sobrerrepresentacion significativa de genes mitoticos entre los transcritos regulados negativamente, tales como las quinasas AURORA y la quinesina HINKEL que estan implicadas en citoquinesis (vease la Figura 6A). Sorprendentemente, la magnitud del cambio para todos los genes del ciclo celular mencionados anteriormente fue similar (aproximadamente del 30%) y sucedio solamente a las 24 h (Figura 6A). Ademas de los transcritos relacionados con el ciclo celular, se puso interes particularmente en genes relacionados con la senalizacion hormonal. Tanto la comparacion con experimentos de adicion de hormonas disponibles al publico (Goda et al., 2008) como el analisis PageMan revelo cambios en la senalizacion de etileno. Los genes sensibles a ACC estaban enriquecidos entre los transcritos regulados positivamente en hojas en proliferacion tan pronto como a las 1,5 y 3 h despues de la aparicion del estres. Tambien se indujo la expresion de genes directamente implicados en la senalizacion de etileno, concretamente los receptores de etileno (ETR2 y ESR1), MAPK CTR1 y MPK3, factores de transcripcion EIN3 y EIL1, EBF1 y EBF2 implicados en la degradacion de la protema EIN3, y varios factores de transcripcion sensibles a etileno (ERF1, ERF2, ERF5, ERF6, y ERF11) (Figura 7A). Aunque los transcritos que codifican enzimas biosinteticas de ACC no estaban afectados, la ACC oxidasa (ACO2), que convierte ACC en etileno, estaba regulada positivamente (Figura 7A). De forma no significativa, no era evidente ninguna activacion de senalizacion de ABA ni de jasmonato, otras dos hormonas clasicas de estres, a partir del analisis del transcriptoma. De forma importante, la propia transferencia no afecto a la expresion de genes seleccionados del ciclo celular y el estres, medida por PCR de transcripcion inversa cuantitativa ((qRT)-PCR), que muestra adicionalmente que no hay respuesta basal a estres en controles debido a la transferencia, que podna enmascarar las respuestas de estres, tal como una respuesta de ABA, en plantas expuestas a manitol. En resumen, la exposicion a estres a corto plazo provoco la rapida induccion de genes implicados en la senalizacion de etileno. Los genes relacionados con el ciclo celular estaban regulados negativamente de forma concomitante, pero solamente 24 h despues de la aparicion del estres.

5. ACC se acumula en brotes de plantas estresadas

Para descubrir si transcritos diferenciales reflejan cambios en niveles hormonales, se determinaron las concentraciones del precursor de etileno ACC en brotes completos de plantas de 9 dfas de edad transferidas a manitol. Ya 1 h despues de la aparicion del estres, los niveles de ACC eran un 30% mayores en muestras estresadas que en las de control, aunque esto no fue significativo, y en 10 h, el aumento era mayor de 2 veces y significativo (Figura 7B). En el momento del analisis, las muestras de brotes estaban principalmente compuestas de celulas en expansion, lo que refleja la importancia global de la senalizacion de etileno para la respuesta de tejidos en crecimiento a estres.

6. La actividad CDKA se reduce en horas de aparicion del estres

Como los transcritos de los genes del ciclo celular estan regulados negativamente por el estres de forma relativamente tardfa, es improbable que los mecanismos transcripcionales contribuyan a la rapida detencion del ciclo celular. Para estudiar la implicacion de los mecanismos postranscripcionales, se investigo la actividad y abundancia proteica de CDKA. CDKA es una protema no redundante situada en el corazon de la regulacion del ciclo celular y promueve transiciones tanto G1-a-S como G2-a-M (Inze y De Veylder, 2006). Aunque los niveles de transcrito y protema de CDKA eran estable durante todo el tratamiento de estres, la actividad CDKA disminma tan pronto como 10 h despues de la aparicion del estres y permaneda baja a las 24 h (Figura 6B). La rapida disminucion en la actividad CDKA tras el estres coincide con la detencion del ciclo celular.

7. El etileno detiene el ciclo celular mitotico

El analisis del transcriptoma revelo una activacion prematura dependiente de estres de genes sensibles a etileno en primordios de la hoja. Para evaluar el papel del etileno en la regulacion del ciclo celular, se analizo el efecto de ACC. Con este fin, se transfirieron plantulas a medio que contema ACC 5 pM (Goda et al., 2008) con el mismo sistema que el usado para los tratamientos con manitol. De forma similar al estres osmotico, la transferencia de plantulas a ACC provoco una rapida reduccion de las tasas de proliferacion celular (Figura 2B) y la actividad CDKA disminuyo tan pronto como 10 h despues de la transferencia (Figura 6B). Sin embargo, en contraste con el tratamiento con manitol, el analisis de ploidfa revelo ausencia de cambios en la aparicion de endorreduplicacion (Figura 3A) y ausencia de diferencias en la expresion de los genes del ciclo celular mitotico CDKB2;1 y CYCB1;1. Coherentemente, la tincion para la actividad CYCB1;1:DBox-GUS revelo ausencia de cambios en la cantidad de celulas mitoticas (Figura 3B). El mdice estomatico no estuvo afectado tampoco (Figura 2E). La posible implicacion del etileno en la inhibicion inducida por estres de la division celular predice que mutantes insensibles a etileno estanan menos afectados por la transferencia a manitol. Para ensayar esta prediccion, se seleccionaron mutantes con ninguno o poco efecto sobre el crecimiento en condiciones normales. Esta hipotesis demostro ser cierta para el

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mutante receptor etr1.3 y para ein5.1, deficiente en la actividad de la exorribonucleasa XRN4 corriente arriba de las protemas F-Box EBF1 y EBF2 (Figuras 8C y 8D). Se midio una diferencia particularmente pronunciada 72 h despues de la transferencia (12 DAS); aunque la reduccion en el area foliar del tipo silvestre fue de ~45%, fue solamente de ~20% y ~30% para ein5.1 y etr1.3, respectivamente (Figura 8C). Una diferencia, aunque no significativa, se midio tambien para el mutante mkk9. De forma importante, la prematura aparicion de endorreduplicacion medida en hojas de tipo silvestre tratadas con estres tambien pudo detectarse en ambos mutantes ein5.1 y etr1.3 (datos no mostrados) expuestos a manitol. Como se ha presentado anteriormente, cuando se dejan en medio que contiene manitol hasta 22 DAS, todos los mutantes, y particularmente ein2.5, desarrollaban fenotipos severos y estaban globalmente mucho mas afectados por el estres que las plantas de tipo silvestre (Skirycz et al., 2010). Ademas del manitol, tambien se ensayo el crecimiento foliar de mutantes insensibles a etileno despues de la transferencia a ACC. Aunque la disminucion relacionada con ACC en el area foliar en mutantes ein3.1 y eill era comparable con la del tipo silvestre, era significativamente menor en mutantes etr1.3, ein5.1, mkk9 y ein2.5 (Figuras 8E y 8F). Coherentemente, la actividad CDKA se redujo por tratamiento con ACC en el tipo silvestre y en el mutante ein3.1 pero no en los mutantes etr1.3 y ein5.1. En conclusion, la adicion de ACC exogeno o la activacion de la produccion de etileno reduce la proliferacion celular sin afectar significativamente a la aparicion de endorreduplicacion y posterior diferenciacion celular de un modo independiente de EIN3.

8. Expresion de una ACC desaminasa bacteriana y de plantas bajo el control de tres promotores diferentes

En este experimento el objetivo fue una regulacion negativa de la ruta de senalizacion de etileno solamente en celulas foliares en proliferacion (genes quimericos con 2 promotores meristematicos diferentes: p4TM1 y pGR5) en comparacion con una regulacion negativa de la senalizacion de etileno en la planta completa (gen quimerico con el promotor de 335S). El transgen que se uso para la regulacion negativa de la senalizacion de etileno fue la ACC desaminasa (una forma bacteriana y una forma vegetal), una enzima que degrada el precursor de etileno ACC. Los 6 genes quimericos diferentes se construyeron clonando una ACC desaminasa bacteriana (bACD) o la ACC desaminasa endogena de Arabidopsis thaliana (AtACDI) bajo el control de los promotores de dos genes cuya expresion esta principalmente limitada a celulas foliares en proliferacion, pGRF5 y p4TM1, y bajo el control del promotor de 35S, que se expresa en la planta completa a traves del desarrollo, como un control. Para cada una de estas 6 construcciones quimericas se aislo un tipo silvestre, junto con uno a tres lmeas transgenicas que mostraban una buena expresion del transgen ACC desaminasa.

Para clonar los promotores de GRF5 (derivado del gen AT3G13960) y 4TM1 (derivado del gen AT5G16250), el fragmento de 2 kb (denominado como pGRF5 y representado en la SEQ ID NO: 5) o el fragmento de 400 pb (denominado como p4TM1 y representado en la SEQ ID NO: 1) precediendo el sitio de inicio de la traduccion se amplifico a partir del ADN genomico con cebadores que portaban sitios attB, permitiendo la recombinacion de acceso en vectores pDONR-P4-P1R. La ACC desaminasa bacteriana (la secuencia de nucleotidos esta representada en la SEQ ID NO: 7), aislada de Pseudomonas putida UW4, se obtuvo del Prof. B.R. Glick (Shah et al. (1998) Can. J. of Microbiol. 44:833-843). La secuencia codificante de AtACDI (gen indicado ATlG48420) se amplifico a partir del ADNc, y ambas secuencias codificantes se recombinaron en el vector pDONR221, la secuencia de nucleotidos de AtACD1 esta representada en la SEQ ID NO: 8. Estos vectores de entrada despues se recombinaron usando acceso en multiples sitios en pK7m34GW-FAST, y los vectores de expresion resultantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90, que se uso para transformar Arabidopsis thaliana acceso Col-0. Para cada construccion se seleccionaron varias lmeas T2 de un locus que portaban una insercion de ADN T homocigotica o sin insercion (controles de tipo silvestre).

Todas las lmeas se cultivaron in vitro en placas A MS con sacarosa al 1%, y todas las lmeas transgenicas se cultivaron en la misma placa con el correspondiente control de tipo silvestre. Para cada lmea, se recogieron 5 brotes y se combinaron, y se extrajo el ARN usando Trizol seguido de tratamiento con DNasa sin RNasa y se limpio con el kit Qiagen RNeasy Plant Mini. Empezando de 1 ug de ARN, se sintetizo ADNc usando el kit de smtesis de ADNc Bio-Rad iScript. Por PCR se amplifico un fragmento espedfico tanto de la ACC desaminasa bacteriana como de la ACC desaminasa endogena, junto con el gen de referencia PP2AA3 (AT1G13320), cuya expresion se informo que era muy estable (Czechowski et al. (2005) Plant Physiology 139: 5-17). Los productos de pCr se separaron en un gel de agarosa al 2%. El resultado del analisis de expresion se representa en la Figura 10.

Las plantas se transfirieron a placas que conteman manitol 25 mM, exponiendolas de ese modo a estres leve de manitol, en una fase donde la tercera hoja esta en plena proliferacion, lo que permite estudiar la respuesta las celulas foliares en proliferacion al estres. Despues de 48 horas en estres leve de manitol, la hoja 3 se microdisecciono y se midio su tamano para calcular el grado de inhibicion del crecimiento. WT y las diferentes lmeas transgenicas se cultivaron cada vez en la misma placa para permitir la comparacion.

El efecto sobre el estres abiotico leve de la expresion de los genes de ACC desaminasa en plantas se estudio con la transformacion de seis genes quimericos diferentes en plantas de Arabidopsis y se analiza mas adelante:

1) Gen quimerico donde la ACC desaminasa bacteriana esta bajo el control del promotor pGRF5 (pGRF5::bACD)

Los datos muestran (vease la Figura 11) que el tipo silvestre estaba inhibido solamente en aproximadamente un 10% en estres abiotico. La lmea transgenica 2 funciona claramente mejor en estres abiotico. Ambas lmeas

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transgenicas eran, sin embargo, claramente mas pequenas que el WT, lo que indica un efecto negativo de la expresion del transgen de la ACC desaminasa bacteriana en plantas expresado bajo el control del promotor de GRF5.

2) Gen quimerico donde la ACC desaminasa bacteriana esta bajo el control del promotor p4TM1 (p4TM1::bACD)

Los datos muestran (vease la Figura 12) que la expresion de la ACC desaminasa bacteriana en lmeas transgenicas, dirigida por el promotor de 4TM, anulaba casi completamente la inhibicion del crecimiento por el estres. Para la lmea transgenica 1 puede observarse un pequeno efecto negativo sobre el tamano de la hoja en condiciones de estres abiotico. Sin embargo, este efecto negativo es ciertamente menor que cuando el transgen de la ACC desaminasa bacteriana esta bajo el control del promotor de GRF5.

3) Gen quimerico donde la ACC desaminasa bacteriana esta bajo el control del promotor p35S (p35S::bACD)

Los datos muestran (vease la Figura 13) una reduccion del crecimiento de las plantas transgenicas (incluso en condiciones no de estres abiotico) tras la expresion del gen quimerico.

4) Gen quimerico donde la ACC desaminasa de Arabidopsis thaliana esta bajo el control del promotor pGRF5 (pGRF5::AtACD1)

Los datos muestran (vease la Figura 14) que similar a la ACC desaminasa bacteriana (comparense los datos de la Figura 11), que la simple expresion de la desaminasa endogena bajo el control del promotor de GRF5 inhibe el crecimiento.

5) Gen quimerico donde la ACC desaminasa de Arabidopsis thaliana esta bajo el control del promotor p4TM1 (p4TM1::AtACD1)

Los datos muestran (vease la Figura 15) que la expresion a partir del promotor de 4TM1 en las lmeas transgenicas de nuevo elimina el efecto negativo del estres abiotico sobre el area foliar.

6) Gen quimerico donde la ACC desaminasa de Arabidopsis thaliana esta bajo el control del promotor p35S (p35S::AtACD1)

Los datos muestran (vease la Figura 16) que se observa un patron similar a aquel con la expresion del transgen dirigida por el promotor de GRF5 (comparese con la Figura 14). Existe un claro efecto negativo sobre el crecimiento normal (es decir, sin estres abiotico) tras la expresion del transgen mientras la inhibicion del crecimiento por estres abiotico no esta afectada.

Se concluye que la expresion de ambas ACC desaminasas tiene un efecto negativo sobre el crecimiento de la planta para genes quimericos donde la expresion esta bajo el control de los promotores p35S y pGRF5. Sin embargo, este efecto sorprendentemente no esta presente cuando la expresion de la ACC desaminasa esta bajo el control del promotor de 4TM1. Ademas, la expresion del gen quimerico que comprende el promotor de 4TM1 y la ACC desaminasa bacteriana puede superar los defectos del crecimiento debidos al estres abiotico. Aunque sin limitar la invencion a un mecanismo particular de accion, la expresion de la ACC desaminasa endogena de A. th. Bajo el control del promotor 4TM1 tiene menos efecto en estres leve que la ACC desaminasa bacteriana, posiblemente debido a mecanismos de regulacion postraduccional.

9. Regulacion negativa especifica de meristemo de la enzima ACC oxidasa en Arabidopsis thaliana Se construye un gen quimerico que contiene los siguientes elementos de ADN

- promotor de 4TM1 (SEQ ID NO: 1) de Arabidopsis thaliana

- un ARN antisentido que codifica la ACC oxidasa de Arabidopsis thaliana

- Un terminador de CaMV 35S

Este gen quimerico se introduce en un vector de ADN T (pK7m24GW-FAST) en combinacion con un marcador de GFP de seleccion. El vector de ADN T se introduce en Agrobacterium tumefaciens y se usa para producir Arabidopsis transgenica.

Se analiza el crecimiento de las hojas de las plantas transgenicas en condiciones optimas y de estres.

Se cultivan semillas de tipo silvestre y transgenicas in vitro con medio de Murashige y Skoog (MS) que contiene sacarosa al 0,5% en un fotoperiodo de 16-h/8-h. Para el estres osmotico, semillas de tipo silvestre y transgenicas se dejan germinar durante 5-7 dfas y se transfieren a placas de agar que contienen manitol (Skirycz et al. 2010). Se mide el peso fresco y seco de los botes, el area foliar, la longitud y la masa de las rafces. En condiciones de suelo, se usa un sistema de control de agua completamente automatizado, de alto rendimiento, llamado WIWAM, implementado en el centro local (Skirycz et al. 2011). Este sistema posibilita mantener niveles estables de agua y es capaz de tomar imagenes digitales de plantas individuales que pueden usarse para determinar el crecimiento de la roseta, el area foliar y la forma de la hoja. Las plantas se cultivan en un regimen de control de riego hasta la fase 1,04 (aproximadamente 12-13 dfas de edad), despues de lo cual se aplica riego controlado o limitado durante 10-12 dfas adicionales. Al final de experimento, se recogen las plantas y se registra la produccion de brotes como una

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medicion de la produccion.

Como alternativas para el promotor de 4TM1 tambien pueden usarse 4TM2 (SEQ ID NO: 2); 4TM3a (SEQ ID NO: 3) o 4TM3b (SEQ ID NO: 4) de Arabidopsis thaliana (o promotores ortologos de plantas de los mismos).

10. Modulacion de la produccion de etileno en meristemos de maiz

Se construyen dos genes quimericos diferentes que contienen los siguientes elementos de ADN:

- un promotor ortologo de Brachypodium distachyon del promotor de 4TM1 de Arabidopsis thaliana unido de forma funcional a

- una ACC desaminasa con sentido de Pseudomonas putida UW4 (SEQ ID NO: 7), y

- un terminador de CaMV 35S y

- un promotor ortologo de Brachypodium distachyon del promotor de 4TM1 de Arabidopsis thaliana unido de forma funcional a

- una ACC oxidasa antisentido de Zea mays, y

- un terminador de CaMV 35S

Estos dos genes quimericos diferentes 2 se introducen en los vectores de destino (pBbm42GW7), que contienen el herbicida BASTA bajo el control del promotor de 35S CaMV y seguido de un terminador de nos como marcador de seleccion. Estas construcciones despues se introducen por separado en Agrobacterium tumefaciens (EHA101) y se usan para transformar embriones inmaduros de mafz de B104 que se regeneran por cultivo tisular para producir 2 tipos diferentes de plantas transgenicas (es decir, plantas transgenicas de mafz que sobreexpresan una ACC desaminasa y plantas transgenicas de mafz que regulan negativamente la ACC oxidasa). Las plantas transgenicas se retrocruzan con B104, produciendo una poblacion de trabajo que segrega en un 50% de plantas sensibles y por tanto de control y un 50% de plantas transgenicas. El crecimiento foliar de la poblacion segregante se analiza en condiciones optimas y de estres por seqrna. Las plantas se cultivas en el suelo y se riegan diariamente: las plantas tratadas con seqrna reciben el 70% del agua que se anade a las plantas de control. El crecimiento foliar se controla midiendo diariamente la longitud de la hoja de la cuarta hoja tras su aparicion, lo que proporciona datos sobre la tasa de elongacion de la hoja y la longitud final de la hoja. Ademas, se determinara la altura final de la planta, el peso fresco y el peso seco de las plantas como una medida de la biomasa de la planta.

Materiales y metodos

1. Crecimiento de la planta

Se cultivaron plantulas de Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn. ecotipo Columbia-0 (Col-0) in vitro en medio de Murashige y Skoog de potencia media (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con sacarosa al 1% en un regimen de 16-h de dfa (110 pmol m-2 s'1) y 8-h de noche. Las placas se recubren con malla de nylon (Prosep, Zaventem, Belgica) de 20 pm de tamano de poro para evitar que las rafces crezcan en el medio. Dependiendo del experimento, se distribuyeron equitativamente 32 o 64 semillas en una placa de 150 mm de diametro. Las plantas mutantes se cultivaron junto con sus controles de tipo silvestre en la misma placa.

2. Tratamientos de estres y quimicos

En 9 DAS, cuando la tercera hoja esta en plena proliferacion, las plantulas se transfirieron a placas que conteman medio de control o medio suplementado con manitol 25 mM (Sigma-Aldrich) o ACC 5 pM (Sigma-Aldrich) levantando suavemente la malla de nylon con forceps. Para el ensayo de actividad CDKA, la transferencia se hizo en 11 DAS; en esta fase, la tercera hoja esta aun en division y puede recogerse rapidamente sin la necesidad de solucion RNAlater (vease a continuacion) que inhibina la actividad CDKA. Todas las transferencias se realizaron 2-3 h en el dfa.

3. Analisis del crecimiento

El analisis del crecimiento se realizo sobre la tercera hoja verdadera recogida en diferentes puntos temporales despues de la transferencia. Despues de limpiar con etanol al 70%, las hojas se montaron en acido lactico en portaobjetos de microscopio. Para cada experimento, se fotografiaron 8-12 hojas con un binocular, y las celulas epidermicas (40-300) se dibujaron para cuatro hojas representativas con un microscopio DMLB (Leica) equipado con un tubo de dibujo y un objetivo de contraste de interferencia diferencial. Las fotograffas de las hojas y los esquemas se usaron para medir el area foliar y celular, respectivamente, con ImageJ v1.41o (NIH;
http://rsb.info.nih.gov/ij/), a partir de lo cual se calcularon las cantidades de celulas. El mdice estomatico se definio como el porcentaje de los estomas por todas las celulas. Para el analisis cinematico las medias transformadas en In del area foliar, el tamano de la celula y la cantidad de celulas se ajustaron localmente a una funcion cuadratica de la que se obtuvo la primera derivada como el crecimiento relativo, la expansion y la tasa de division, respectivamente (De Veylder et al., 2001).

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4. Muestreo para analisis de expresion

Se recogio la hoja 3 de las plantas en 1,5, 3, 12, y 24 h. En resumen, se recogieron plantulas completas en un exceso de solucion RNAlater (Ambion) y, despues de almacenamiento durante una noche a 4°C, se disecciono en un microscopio binocular o en una placa de refrigeracion con microtijeras de precision. Las hojas diseccionadas se transfirieron a un nuevo tubo, se congelaron en nitrogeno lfquido, y se molieron con una maquina Retsch y bolas de metal de 3 mm. Se obtuvieron muestras de tres experimented biologicos independientes y de multiples placas dentro del experimento.

5. Extraccion del ARN

Se extrajo el ARN con TriZol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 4 |jg de glucogeno como vehteulo durante la etapa de precipitacion. Las muestras de ARN se sometieron a digestion de ADN con DNasa I sin RNasa (Roche) y posteriormente se limpiaron con el kit RNeasy Mini (Qiagen).

6. Perfilado de expresion de ATH1 y analisis de datos

Las muestras de ARN se hibridaron con series individuales Affymetrix ATH1 Genome en la VIB Microarray Facility (Leuven, Belgica). Los datos de expresion se procesaron con Robust Multichip Average (RMA) (correccion de fondo, normalizacion y recapitulacion) implementado en BioConductor (Irizarry et al., 2003a, 2003b; Gentleman et al., 2004). Se uso un cdf alternativo ("tinesath1cdf'), en que cada sonda se asigna de forma unica a un transcrito (Casneuf et al., 2007) (
http://www.bioconductor.org/packages/release/data/experiment/html/tinesath1cdf.html). Se uso el paquete BioConductor Limma para identificar genes expresados de forma diferencial (Smyth, 2004). Para comparaciones de interes, se calculo la estadfstica t moderada usando la funcion eBayes y los valores P se corrigieron para multiples ensayos para cada contraste por separado usando topTable. Se uso el valor p corregido por la tasa de falso descubrimiento (FDR) < 0,05 como punto de corte (Benjamini y Hochberg, 1995).

7. Citometria de flujo

Para el analisis de citometna de flujo, se extrajeron los nucleos troceando 4-32 hojas con una cuchilla de afeitar en 1 ml de MgCl2 45 mM, citrato sodico 30 mM, acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico 20 mM, pH 7 y Triton X-100 al 1% (Galbraith et al., 1983). De una reserva de 1 mg/ml de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), se anadio 1 jl al sobrenadante filtrado. Los nucleos se analizaron con un citometro de flujo CyFlow con el Software FloMax (Partec).

8. Ensayo de actividad CDKA

Se extrajo la protema soluble total de 50 hojas anadiendo tampon de extraccion (Van Leene et al., 2007) para moler las muestras, seguido de dos etapas de congelacion-descongelacion y dos etapas de centrifugacion (20,817 g, 10 min, 4°C), mediante lo cual se recogio el sobrenadante cada vez. Se incubaron cantidades iguales de protema total con perlas p9CKS1Hs-sepharose (De Veylder et al., 1997) y se realizaron ensayos de quinasa como se ha descrito (De Veylder et al., 1997) con histona H1 como sustrato de CDK. Para corregir la cantidad de protema CDKA purificada por perlas p9CKS1Hs-spharose, se uso una alteuota de cada muestra para el analisis de transferencia de gel de protemas con anticuerpos primarios de conejo anti-PSTAIRE (Santa Cruz) (diluidos 1:5000) y anticuerpos secundarios de burro anti-conejo conjugados con peroxidasa de rabano rusticano (GE-Healthcare) (diluidos 1:10.000). Las protemas se detectaron por quimioluminiscencia (Western Lightning Plus ECL, PerkinElmer Life Sciences). La actividad CDK y la cantidad de CDKA se cuantificaron con ImageJ v1.41o. Las muestras de control se establecieron arbitrariamente al 100%.

9. Comparacion con datos de microserie disponibles al publico

Los datos de microserie disponibles al publico seleccionados se agruparon de acuerdo con el tipo de experimento (tal como estres abiotico y tratamiento hormonal). Los grupos de experimentos se procesaron por RMA y se sometieron a analisis Limma, como se ha descrito anteriormente. Los conjuntos de genes sensibles se delimitaron siempre con un cambio de expresion de factor 2 y puntos de corte de valor P corregido por FDR <0,05. Aunque estos puntos de corte se eligieron de manera un poco arbitraria, se evaluo la robustez de los resultados ensayando puntos de corte mas y menos rigurosos. Todos los ensayos dieron resultados muy similares. Las listas de genes sensibles se compararon con los identificados en nuestro experimento de microserie para identificar las tendencias globales en el repertorio funcional de los genes afectados que se usaron como indicios para explorar los resultados en mas detalle. La sobrerrepresentacion se ensayo mediante ensayos exactos de Fisher seguidos de correccion de valor P de Bonferroni.

10. qRT-PCR

Para la smtesis de ADNC, se usaron de 100 ng a 2 jg de ARN con el reactivo SuperScript Reverse III (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se disenaron cebadores con el sitio web QuantPrime (Arvidsson et al., 2008; Skirycz et al., 2010). La qRT-PCR se hizo en un LightCycler 480 (Roche Diagnostics) en placas de 384

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pocillos con LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las curvas de fusion se analizaron para comprobar la especificidad de los cebadores. La normalizacion se hizo frente al promedio de los genes constitutivos UBQ10, GAPDH, y CBP20; ACt = Ct (gen) - Ct (media (genes constitutivos)) y AACT = ACt(control)- ACt(manitol). Los valores ACt para las tres replicas biologicas se usaron para el analisis estadfstico. Ct se refiere a la cantidad de ciclos en que la fluorescencia de SYBR Green alcanza un valor arbitrario durante la fase exponencial de la amplificacion de ADNc.

11. Nanoserie

Los niveles de expresion de ARNm se midieron usando un sistema de analisis nCounter (NanoString Technologies) por la VIB MicroArray Facility (
www.microarrays.be) como se ha descrito (Geiss et al., 2008). Se hibrido el extracto de ARN total (100 ng). La expresion genica se midio de forma simultanea para todos los genes en reacciones combinadas. El codigo elaborado nCounter contema pares de sondas para 100 genes de Arabidopsis. Los datos se normalizaron por un procedimiento de dos etapas con controles internos de repuntes y los tres genes de referencia mas estables incluidos en el conjunto de sonda (CDKA_1, UBC, y CBP20).

12. Cuantificacion de ACC

Se disolvieron muestras secadas por congelacion en 500 pl de metanol, incluyendo dos compuestos de patron interno (sulfona de metionina 4 pM usada para la compensacion del area de pico despues de analisis de electroforesis capilar-espectrometna de masas (CE-MS) y D4-ACC 0,2 pM para la cuantificacion de ACC. Despues de la adicion de 500 pl de cloroformo y 200 pl de agua, la mezcla se agito en vortice durante 3 min y se centrifugo a 20.400 g durante 3 min a 4°C. La capa superior se evaporo durante 30 min a 45°C por un concentrador centrifugo y despues se separo en dos capas. La capa superior (100-200 pl) se filtro por centrifugacion a traves de un filtro Millipore de 5-kD de punto de corte a 9.100 g durante 90 min. El filtrado se seco durante 120 min por un concentrador centnfugo. El residuo se disolvio en 10 pl de agua que contema un compuesto de referencia (3- aminopirrolidina). La solucion final (10 pl) se uso para cuantificar los contenidos de ACC por analisis de cationes usando CE-MS. El sistema CE-MS y las condiciones fueron como se ha descrito (Watanabe et al., 2008).

13. Tincion GUS

Se incubaron plantulas completas en heptano durante 10 min, se lavaron en Tris-HCI 100 mM/NaCl 50 mM (pH 7,0), y posteriormente se incubaron en tampon 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronido (X-Gluc) [tampon Tris-HCI 100 mM/NaCl 50 mM (pH 7,0), K3[Fe(CN)6] 2 mM y X-Gluc 4 mM]) a 37°C durante 24 h. Las plantulas se lavaron en Tris- HCI 100 mM/NaCl 50 mM (pH 7,0) y se limpiaron durante una noche en acido lactico al 90%. Las muestras se fotografiaron con un microscopio de contraste de interferencia diferencial (Leica).

14. Mediciones de actividad de division meristemoide

La hoja 3 se corto de plantas CYCB1;1:DBox-GUS en varios puntos temporales en tres replicas biologicas independientes y se tineron como se ha descrito anteriormente. Usando un microscopio de contraste de interferencia diferencial (Leica), los meristemoides tenidos se contaron en un area fija cerca de la punta de la hoja, donde toda la proliferacion celular normal habfa cesado, para 6-12 hojas por experimento. Los valores relativos (en comparacion con muestras de control) se calcularon para cada experimento por separado y se promediaron sobre las replicas.

15. Lineas transgenicas y mutantes

Las semillas de lineas de sobreexpresion inducible por ACS5 las proporciono amablemente J. Ecker (SALK Institute, CA, EE. UU.). las plantas que sobreexpresan EBF1 fueron donaciones de T. Potuschak (CNRS, Strasbourg, Francia). Se obtuvieron mutantes insensibles a etileno del Arabidopsis Seed Stock Center (ein2.5 [N8844], ein3.1 [N8052], etr1.3 [N3070] y ein5.1 [N8053; previamente indicado como ein4]). Todas las lineas transgenicas y mutantes son en un fondo Col-0.

16. Numeros de acceso

Los datos de microserie esta depositados en la base de datos GEO (GSE22107).

17. Mediciones de area foliar

El sistema de crecimiento y estres de la planta fue el mismo que el descrito previamente (Skirycz et al. (2011) Plant Cell 23: 1876-1888). En resumen, las plantas se cultivaron sobre mallas de nylon que recubnan placas de control, y en 9 DAS las mallas se transfirieron a placas de control (como control de transferencia) o a placas que conteman manitol 25 mM. A las 48 horas despues de la aparicion del estres la hoja 3 se microdisecciono, se aclaro en etanol y se monto en acido lactico sobre un portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se fotografiaron y se midio el area foliar usando ImageJ 1.41o.

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Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir una planta tolerante a estres abiotico respecto a una planta de control, disminuyendo la ruta de transduccion de senales de etileno en dicha planta durante el periodo of estres abiotico impuesta sobre dichas plantas, que comprende introducir y expresar en dicha planta un gen quimerico que comprende un promotor de 4TM de plantas seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, sEq ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor de 4TM de plantas ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, en el que dicho promotor esta unido de forma funcional a un gen o fragmento genico derivado de la ruta de transduccion de senales de etileno.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la expresion de dicho gen quimerico en dicha planta conduce a una regulacion negativa de al menos un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ETR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la expresion de dicho gen quimerico en dicha planta conduce a una regulacion positiva de al menos un gen de la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1.
4. 4. Un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un promotor de 4TM de plantas seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor de 4TM de plantas ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, b) una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de ARN bicatenaria capaz de reducir la expresion de un gen de la siguiente lista: ACO1, ACO2, ETR2, ESR1, CTR1, MKK9, MKK7, EIN3, EIN5 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.
5. 5. Un gen quimerico que comprende los siguientes elementos de ADN unidos de forma funcional: a) un promotor de 4TM de plantas seleccionado de la lista que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un promotor de 4TM de plantas ortologo funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, b) una region de ADN que codifica un gen de la siguiente lista: EBF1, EBF2, ACC desaminasa, un receptor de etileno negativo dominante o un factor de transcripcion negativo dominante EIN3 o EIL1 y c) una region final 3' que comprende senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion que funcionan en celulas de dicha planta.
6. 6. Una planta transgenica o una semilla transgenica o una celula de planta transgenica que comprende un gen quimerico de acuerdo con la reivindicacion 4 o de acuerdo con la reivindicacion 5.
7. 7. Una planta transgenica o semilla transgenica o celula de planta transgenica de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que dicha planta, semilla o celula es una planta de cultivo o una monocotiledonea o un cereal tal como arroz, trigo, mafz, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo farro, espelta, secale, escanda, tef, adaza y avena.

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   Actividad CDKA 100

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   10h 24h

   E3 manitol □ ACC

   Figura 7

   A Laga FC +/-manitol

   ERF2 ERF-1 ePF5 ERF6 ERF 11 ERFB ERF9 MPK3 EBF2 ERS2 ERSl ETR2 CTftl EIL1 EBF1 ftTEl FIH3 resp.et. resp.et. resp.et. ACC02

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   ACC. birate

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   1h 10h ■ control c manitol

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   Figura 12

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   Figura 15:

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   Figura 16:

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