ES2608316T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer e infecciones persistentes mediante la inhibición de la ruta de la muerte celular 1 (PD-1) programada - Google Patents

Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer e infecciones persistentes mediante la inhibición de la ruta de la muerte celular 1 (PD-1) programada Download PDF

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E. John Wherry
Gordan Freeman
Arlene Sharpe
David M. Dorfman
Rafi Ahmed
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Brigham and Womens Hospital Inc
Dana Farber Cancer Institute Inc
Emory University
Harvard University
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Brigham and Womens Hospital Inc
Dana Farber Cancer Institute Inc
Emory University
Harvard University
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Abstract

Un compuesto que reduce la actividad o expresión de un polipéptido de muerte programada (PD-1) para su uso en un método para aliviar o prevenir un síntoma del cáncer en un sujeto, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, una molécula de ARNi contra PD-1, una molécula de ARNi contra PD-L1, un ARN antisentido contra PD-1, o un ARN antisentido contra PD-L1; donde el cáncer es un linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfocítico.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y composiciones para el tratamiento del cancer e infecciones persistentes mediante la inhibicion de la ruta de la muerte celular 1 (PD-1) programada
Declaracion relativa al Patrocinio federal de la investigacion
La presente invencion se realizo con las ayudas del Gobierno de los Estados Unidos de America, en virtud de las subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) siguientes: AI39671 y CA84500. El Gobierno posee determinados derechos sobre la invencion.
Campo de la invencion
En general, la presente invencion se refiere composiciones para el tratamiento del linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfodtico.
Antecedentes de la invencion
A pesar de que el desarrollo de vacunas preventivas ha reducido notablemente el mdice de mortalidad por infecciones vmcas, el uso de estas vacunas frente a virus que causan infecciones persistente (por ejemplo, el virus de la hepatitis C) ha tenido un exito limitado. A diferencia de los virus que causan infecciones agudas y autolimitadas, la respuesta inmunitaria que se produce contra los microbios que provocan infecciones persistentes suele ser transitoria e insuficiente para erradicar la infeccion. Como resultado, el microbio infeccioso permanece en el sujeto infectado durante largos penodos de tiempo, sin causar necesariamente danos constantes en el huesped.
Un importante impedimento para la erradicacion de microbios que causan infecciones persistentes es la capacidad de estos microbios para eludir el sistema inmunitario del organismo hospedador. Por ejemplo, determinados virus y parasitos regulan a la baja la expresion de moleculas del huesped necesarias para un eficiente reconocimiento de los linfocitos T de las celulas infectadas. Las infecciones persistentes tambien provocan una alteracion funcional de los linfocitos T CD8+ espedficos de antigeno, que son fundamentales para el control y la erradicacion de las infecciones vmcas. A pesar de que la combinacion de vacunas terapeuticas con citoquinas adyuvantes ha sido prometedora, las respuestas inmunitarias resultantes no han erradicado con exito el patogeno.
Por tanto, se necesitan metodos mejores para tratar, prevenir o aliviar las infecciones persistentes. EP1537878 divulga la inhibicion de PD-1 para tratar el cancer.
Resumen de la invencion
La presente invencion preve el uso de composiciones para el tratamiento y la prevencion o reduccion, o alternativamente, el alivio de uno o mas smtomas del linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfodtico . La invencion se basa en el descubrimiento de que los linfocitos T CD8+ espedficos de antfgeno se vuelven funcionalmente tolerantes («se agotan») frente al agente infeccioso tras la introduccion del polipeptido de muerte programada 1 (PD-1). Por consiguiente, al reducir la expresion o actividad de PD-1 o PD-L1, la proliferacion de linfocitos T CD8+ funcionalmente tolerantes, la produccion de citoquinas y la tasa de eliminacion de un agente infeccioso (por ejemplo, viral, bacteriano, fungico, parasito, micoplasma o cancer) se incrementan de forma que la respuesta inmunitaria espedfica para el agente infeccioso mejora.
Por consiguiente, la divulgacion proporciona un metodo para aliviar o prevenir un smtoma de una infeccion persistente (por ejemplo, una infeccion vmca, una infeccion bacteriana, una infeccion fungica, una infeccion micoplasmica y una infeccion parasitaria) o del cancer, administrando a un sujeto que lo necesita (por ejemplo, un ser humano) un compuesto que reduce la actividad o la expresion de un miembro de la familia similar a CD28 (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, BTLA y un fragmento o variante funcional de los mismos) o ligandos de la familia similar a CD28 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Alternativamente, al sujeto se le administra un linfocito B o un linfocito T espedfico de antfgeno que ha estado en contacto con un compuesto que reduce la expresion o la actividad de un polipeptido PD-1 de la celula. Por ejemplo, el linfocito B o el linfocito T espedfico de antfgeno es espedfico de un antfgeno vmco. El linfocito B o el linfocito T se obtiene de una fuerte autologa o de otro sujeto de la misma especie o de una especie diferente que el sujeto a tratar.
Por otra parte, la divulgacion incluye un metodo para incrementar la actividad citotoxica de un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T anergico o un linfocito T que presenta una tolerancia mayor a los antfgenos), poniendo en contacto el linfocito T con un compuesto que reduce la actividad o la expresion de un polipeptido PD-1.
En todos los aspectos anteriores, las infecciones vmcas persistentes resultan de infecciones como un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotropico de celulas T humano (HTLV), un herpesvirus, un virus de Epstein-Barr o un virus del papiloma humano. Las infecciones vmcas persistentes tambien pueden incluir infecciones causadas por un virus latente. Los canceres incluyen trastornos linfoproliferativos como el linfoma angioinmunoblastico y el linfoma de
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Hodgkin nodular de predominio linfocftico. Es conveniente que el compuesto de la invencion aumente la respuesta inmunitaria espedfica del antigeno mediante un incremento de la actividad de los linfocitos T citotoxicos (por ejemplo, un incremento de la produccion de citoquinas citotoxicas como IFN y, TNFa, o IL- 2, un incremento de la proliferacion de celulas T o un incremento de la eliminacion vmca) en el sujeto a tratar. Por ejemplo, el compuesto reduce la expresion o actividad de un ligando PD de tipo 1 (PD-L1) o un ligando PD de tipo 2 (PD-L2) o reduce la interaccion entre PD-1 y PD-L1 o la interaccion entre PD-1 y PD- L2. Algunos ejemplos de compuestos incluyen anticuerpos (como un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1 y un anticuerpo contra PD-L2), moleculas de ARNi (por ejemplo, moleculas de ARNi contra PD-1, ARNi contra PD-L1 y ARNi contra pD-L2), moleculas antisentido (por ejemplo un ARN antisentido contra PD-1, un ARN antisentido contra PD-L1 y un ARN antisentido contra PD-L2), protemas dominantes negativas (por ejemplo, una protema dominante negativa de PD-1, una protema dominante negativa de PD-L1 y una protema dominante negativa de PD-L2) y moleculas pequenas inhibidoras. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos desinmunizados y protemas de fusion de Ig. Un ejemplo de anticuerpo contra PD-L1 incluye el clon EH12.
Ademas del compuesto que reduce la actividad o expresion de PD-1, al sujeto a tratar tambien se le administra una vacuna que puede incluir o no un adyuvante o una dosis de refuerzo principal. Opcionalmente, al sujeto se le administra un segundo compuesto, como un compuesto antivmico (por ejemplo, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, inhibidor de la transcriptasa inversa analogo de los nucleotidos (NRTI), como AZT (zidovudina), ddl (didanosina), ddC (zalcitabina), d4T (estavudina) o 3TC (lamivudina), inhibidor de la transcriptasa inverso no analogo de los nucleotidos (NNRTI), como nevirapina o delavirdina, inhibidor de la proteasa como saquinavir, ritonavir, indinavir o nelfinavir, ribavirina e interferon), un compuesto antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, compuestos antineoplasicos o un analgesico. El segundo compuesto tambien puede ser un compuesto que reduce la expresion o actividad del antfgeno 4 asociado al linfocito T citotoxico (CTLA-4) o del atenuador de los linfocitos B y T (BTLA). Otros ejemplos de compuestos que se pueden administrar al sujeto son anticuerpos contra CTLA-4, anticuerpos contra BTLA, anticuerpos contra CD28, anticuerpos contra ICOS, anticuerpos contra ICOS-L, anticuerpos contra B7-I, anticuerpos contra B7-2, anticuerpos contra B7-H3, anticuerpos contra B7-H4.
La presente divulgacion proporciona tambien un metodo para identificar un compuesto candidato que modula la actividad o expresion de un polipeptido PD-1 que incluye los pasos siguientes: (a) poner en contacto una celula que expresa un gen PD-1 (por ejemplo, un gen de fusion de PD-1) con un compuesto candidato; (b) medir la expresion o actividad de PD-1 en la celula (por ejemplo, midiendo la expresion de la protema o el ARNm de PD-1); y (c) comparando la expresion o actividad de PD-1 en la celula con esa expresion o actividad en una celula de control que no ha estado en contacto con el compuesto. Un incremento o una disminucion de la expresion o actividad de PD-1 indica que el compuesto candidato es util para modular la actividad o expresion de un polipeptido PD-1.
Alternativamente, el metodo de deteccion puede implicar los pasos siguientes: (a) poner en contacto un linfocito T que presenta una sobreexpresion de un gen PD-1 con un compuesto candidato; y (b) determinar la actividad citotoxica del linfocito T; (c) comparando la actividad citotoxica del linfocito T con respecto a la actividad en una celula de control que no ha estado en contacto con el compuesto. Un incremento o una disminucion de esta actividad indica que el compuesto candidato es util para modular la actividad o expresion de un polipeptido PD-1. La actividad citotoxica incluye la produccion de citoquina, la proliferacion de linfocitos T y la eliminacion vmca.
La divulgacion proporciona tambien un metodo de deteccion que implica los pasos siguientes: (a) poner en contacto un polipeptido PD-1 con un compuesto candidato; (b) determinar si el compuesto candidato interactua con el polipeptido PD-1; y (c) identificar si un compuesto candidato es util para modular la actividad o expresion de PD-1. Es conveniente que el compuesto candidato identificado interactue con el polipeptido PD-1 y que reduzca su actividad.
El compuesto candidato identificado mediante los metodos de deteccion descritos en el presente puede reducir la interaccion entre PD-1 y PD-L1 o la interaccion entre PD-1 y PD-L2. La celula empleada en cualquiera de los metodos de deteccion descritos en el presente incluye celulas de mairnferos, como celulas de roedores o celulas humanas. La celula es una celula inmunitaria, como un linfocito T. Es recomendable que el polipeptido PD-2 empleado en estos metodos de deteccion sea un polipeptido PD-1 humano.
En el presente tambien se proporciona un metodo para diagnosticar que un sujeto presenta o corre el riesgo de presentar una infeccion persistente o un cancer, que implica los pasos siguientes: (a) proporcionar una muestra que contiene celulas inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o B) de un sujeto, y (b) medir la expresion o actividad de PD-1 en la muestra. Un incremento en la expresion o actividad de PD-1 en comparacion con esa expresion o actividad en una muestra de control indica que el sujeto presenta o corre el riesgo de presentar una infeccion permanente o cancer. Resulta recomendable que el paso (b) implique la identificacion de celulas inmunitarias de antfgeno espedfico, como un antfgeno vmico, un antfgeno bacteriano, un antfgeno parasitario o un antfgeno fungico.
Tambien se describe un metodo para seleccionar un tratamiento para un sujeto que presenta o corre el
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riesgo de presentar una infeccion persistente o cancer. Este metodo implica los pasos siguientes: (a) proporcionar una muestra que contiene celulas inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o B) de un sujeto; y (b) medir la expresion o actividad de PD-1 en las celulas inmunitarias, de forma que un incremento de la expresion o actividad de PD-1 en comparacion con esa expresion o actividad en una muestra de control indica que el sujeto presenta o corre el riesgo de presentar una infeccion permanente o cancer; y (c) seleccionar un tratamiento para el sujeto al que se diagnostica que presenta o corre el riesgo de presentar una infeccion persistente o cancer, de forma que el tratamiento incluya un compuesto que reduce la expresion o actividad de PD-1. Es recomendable que el paso (b) implique la identificacion de celulas inmunitarias de antigeno espedfico, como un antigeno vmco, un antigeno bacteriano, un antigeno parasitario o un antigeno fungico.
Las muestras obtenidas de los sujetos incluyen muestras de sangre, biopsias de tejido y biopsias de medula osea. Por otra parte, las celulas de control se pueden obtener de un sujeto que no presenta ni corre el riesgo de presentar infeccion persistente.
Esta divulgacion proporciona tambien una composicion que contiene: (a) un compuesto que reduce el nivel o la actividad de PD-1; y (b) un segundo compuesto, como un compuesto antivmco, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto analgesico, un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra bTlA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, un anticuerpo contra B7-I, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3, o un anticuerpo contra B7-H4.
La divulgacion proporciona tambien un kit que contiene (a) un compuesto que reduce el nivel o la actividad de PD-1; e (b) instrucciones para la administracion del compuesto a un sujeto. Alternativamente, el kit contiene (a) un primer compuesto que reduce el nivel o la actividad de PD-1; y (b) un segundo compuesto, como un compuesto antivmco, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto analgesico, un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra BTLA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, un anticuerpo contra B7-I, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3, o un anticuerpo contra B7-H4; asf como (c) instrucciones para la administracion del primer compuesto y del segundo compuesto a un sujeto.
La presente invencion ofrece significativas ventajas sobre las terapias estandar para el tratamiento, la prevencion y reduccion, o alternativamente, el alivio de uno o mas smtomas de las infecciones persistentes. La administracion del agente terapeutico que reduce el nivel o la actividad de PD-1 incrementa la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+, aumentando a su vez la respuesta inmunitaria frente al agente infeccioso que tiene la capacidad de establecer una infeccion persistente. Por otra parte, los metodos de deteccion del compuesto candidato proporcionados por la presente divulgacion permiten la identificacion de nuevos agentes terapeuticos que modifican el proceso de lesion, en lugar de limitarse a mitigar los smtomas.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos empleados en el presente tienen el significado que normalmente entendena una persona cualificada en el campo al que pertenece la presente invencion. A pesar de que se pueden emplear metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente para la practica o prueba de la presente invencion, a continuacion se describen metodos y materiales apropiados. En caso de conflicto, prevalecera la presente especificacion, incluyendo las definiciones. Por otra parte, los materiales, metodos y ejemplos se ofrecen unicamente a tttulo ilustrativo y no pretenden tener un caracter limitador.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion se pondran de manifiesto en las siguientes reivindicaciones y descripciones detalladas.
Breve descripcion de las ilustraciones
La Figura 1A es un grafico de barras que muestra los niveles de ARNm de PD-1 en linfocitos T espedficos de DbGP33-41 y/o DbGP276-286 de raton transgenico que no ha recibido tratamiento previo: un raton infectado inmune a la enfermedad de Armstrong producida por el virus de la coriomeningitis linfodtica (LCMV) (unos 30 dfas despues de la infeccion), o un raton infectado por LCMV-C1-13 con bajos niveles de CD4 (aproximadamente 30 dfas despues de la infeccion), medidos por un analisis de matriz genica.
La Figura 1B es una serie de imagenes de un experimento de citometna de flujo que muestra la expresion de superficie de PD-1 en linfocitos T CD8+ de tetramero positivo en un raton infectado inmune a la enfermedad de Armstrong por LCMV y un raton infectado por LCMV-Cl-13 con bajos niveles de CD4, aproximadamente 60 dfas despues de la infeccion. Los linfocitos T CD8+ anergicos expresan elevados niveles del polipeptido PD-1 en la superficie celular unos 60 dfas despues de la infeccion cronica por el virus LCMV-CI-13 (indicada como «cronica»), pero los linfocitos T CD8+ de virus espedfico no expresan el polipeptido PD-1 despues de la eliminacion de una infeccion aguda de la enfermedad de Armstrong por LCMV (indicada como «inmune»).
La Figura 1C es una serie de imagenes de un experimento de citometna de flujo que demuestra la presencia de PD-L1 o esplenocitos del raton con infeccion cronica y del raton no infectado. Demuestra
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que la expresion de PD-L1 es maxima en los esplenocitos que estan infectados por el virus.
La Figura 2A es una serie de diagramas de dispersion que muestran que cuando el raton infectado por CI- 13 es tratado entre 23 y 37 dfas despues de la infeccion, se produce un incremento del numero de linfocitos T CD8 espedficos de DbNP396-404 y espedficos DbGP33-41 que practicamente triplica al de los controles sin tratar. A fin de determinar cualquier cambio en la funcion, se midio la produccion de IFN-y y TNF-a en respuesta a ocho epftopos de LCMV diferentes.
La Figura 2B es un diagrama de dispersion que muestra que cuando se miden todas las especificidades conocidas del linfocito T CD8, el numero total de linfocitos T CD8 espedficos de LCMV se multiplica por 2,3.
La Figura 2C es una serie de graficos de citometna de flujo que muestra la produccion de IFN-y y TNF-a en respuesta a ocho epftopos de LCMV diferentes.
La Figura 2D es un diagrama de dispersion que muestra que un numero mayor de linfocitos T CD8 de virus espedfico en el raton tratado tiene la capacidad para producir TNF-a.
La Figura 2E es una serie de graficos de barras que muestran que el bloqueo de PD-L1 tambien se tradujo en un mayor control vftico en el bazo, el hugado, el pulmon y el suero.
La Figura 3A es un grafico que demuestra el incremento de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33- 41 y DbGP276-286 (indicados como «GP33» y «GP276») en el raton infectado por CI-13 con bajos niveles de CD4 tratado con anti-PD-LI (indicado como «aPD-L1») entre los dfas 46 y 60 despues de la infeccion, frente al control (indicado como «untx»), lo que demuestra que el raton tratado con anti-PD-LI contema aproximadamente siete veces mas linfocitos T CD8+ esplenicos espedficos de DbGP276-286 y aproximadamente cuatro veces mas linfocitos T CD8+ esplenicos espedficos de DbGP33-41 que los ratones sin tratar.
La Figura 3B es una serie de imagenes que demuestran la frecuencia incrementada de linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 y DbGP276-286 en el bazo del raton infectado por CI-13 con bajos niveles de cD4 tratado con anti-PD-LI (indicado como «aPD-L1 Tx») entre los dfas 46 y 60 despues de la infeccion frente al control (indicado como «untx»).
La Figura 3C es una serie de imagenes que demuestran una proliferacion aumentada de linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 en el raton tratado contra PD-Ll, medido por la incorporacion de BrdU y la expresion Ki67.
La Figura 3D es un grafico que muestra que el raton que presenta elevados niveles de expansion de linfocitos T CD8+ demuestra una respuesta apreciable en las celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC), tal y como se observa al comparar los linfocitos CD8+ espedficos de DbGP276-286 en las PBMC con los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 en el bazo.
La Figura 4A es una serie de graficos que demuestran el incremento de linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 y DbGP33-41 que producen IFN-y en el raton tratado contra PD-L1, en comparacion con los controles. Tambien se detectaron mayores frecuencias de linfocitos T CD8+ espedficos de DbNP396- 404, KbNP205-212, DbNP166-175, y DbGP92-101 en el raton tratado contra PD-L1.
La Figura 4B es un grafico que demuestra que en el raton tratado contra PD-L1, el 50% de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 produce IFN-y, en comparacion con el 20% de linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 del raton de control.
La Figura 4C es una serie de imagenes que demuestran que un raton cronicamente infectado tratado contra PD-L1 produce unos niveles superiores de TNF-a que el raton cronicamente infectado sin tratar, aunque unos niveles inferiores de TNF-a que el raton inmune infectado por el virus de la enfermedad de Armstrong LCMV.
La Figura 4D es un grafico que demuestra que el tratamiento del raton infectado por LCMV-C1-13 con anti-PD-LI renueva la actividad lftica ex vivo de los linfocitos T de virus espedfico en comparacion con el raton infectado sin tratar, medido utilizando un ensayo de liberacion de cromo 51 (51Cr).
La Figura 4E es una serie de graficos que demuestran la reduccion de tftulos vfticos en diversos organos tras el tratamiento del raton infectado por LCMV-CI-13 con a-PD-L1. Las cifras de reduccion de los tftulos vfticos se multiplicaron aproximadamente por tres en el bazo, por cuatro en el Idgado, por dos en el pulmon y por dos en el suero, despues de dos semanas de tratamiento contra PD-L1, en comparacion con el raton no tratado.
La Figura 5A es una serie de imagenes de un experimento de citometna de flujo que muestra la expresion superficial de PD-1 utilizando 10 tetrameros del VIH espedficos para epftopos dominantes seleccionados en la infeccion cronica por VIH subtipo C. Los porcentajes indican el porcentaje de celulas de tetramero positivo que son PD-1+.
La Figura 5B es una serie de graficos que demuestran que el porcentaje y MFI de PD-1 se ve notablemente regulado al alza en los linfocitos T CD8 espedficos del VIH en comparacion con la
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poblacion total de linfocitos T CD8 (p<0,0001) en individuos que no han recibido terapia antirretroviral, y PD-1 se incrementa en la poblacion total de linfocitos T CD8 en los individuos infectados por VIH frente a los controles seronegativos (p=0,0033 y p<0,0001, respectivamente). En el analisis se incluyeron 120 tinciones de tetrameros del VIH de 65 individuos infectados por el VIH y 11 controles seronegativos.
La Figura 5C es una serie de graficos que muestran el porcentaje medio y MFI de la expresion de PD-1 en las celulas de tetramero positivo por la especificidad del epftopo.
La Figura 5D es un grafico que ilustra la variacion en el porcentaje de celulas PD-1+ en diferentes poblaciones de epftopo espedfico dentro de individuos con multiples respuestas detectables. Las barras horizontales indican el porcentaje medio de celulas de tetramero positivo del VIH PD-1+ en cada individuo.
La Figura 6A es una serie de graficos que demuestran que no existe ninguna correlacion entre el numero de linfocitos T CD8 espedficos del VIH, medida mediante tincion de tetrameros, y la carga viral plasmatica, mientras que sf existe una correlacion positiva entre el porcentaje y MFI de PD-1 en las celulas de tetramero positivo y la carga viral plasmatica (p=0,0013 y p<0,0001, respectivamente).
La Figura 6B es una serie de graficos que muestran que no existe ninguna correlacion entre el numero de celulas de tetramero positivo del VIH y el recuento de CD4, mientras que existe una correlacion inversa entre el porcentaje y MFI de PD-1 en las celulas de tetramero positivo del VIH y el recuento de CD4 (p=0,0046 y p=0,0150, respectivamente).
La Figura 6C es una serie de graficos que demuestran que el porcentaje y MFI de PD-1 sobre la poblacion total de linfocitos T CD8 estan correlacionados de forma positiva con la carga viral plasmatica (p=0,0021 y p<0,0001, respectivamente).
La Figura 6D es una serie de graficos que ilustran el porcentaje y MFI de la expresion de PD-1 sobre la poblacion total de linfocitos T CD8 estan inversamente correlacionados con el recuento de CD4 (p=0,0049 y p<0,0006, respectivamente).
La Figura 7A es una serie de imagenes de un experimento de citometna de flujo que muestran la tincion fenotfpica representativa de linfocitos T CD8 espedficos de B*4201 TL9 del sujeto SK222 en el que el 98% de los linfocitos T CD8 espedficos de B*4201 TL9 son PD-1+.
La Figura 7B es un grafico que ilustra un resumen de los datos fenotfpicos de las personas en las que >95% de los linfocitos T CD8 espedficos del VIH son PD-1+. Se analizaron entre siete y 19 muestras para cada uno de los marcadores fenotfpicos indicados. La barra horizontal indica el porcentaje medio de celulas PD-1 + de tetramero positivo que fueron positivas para el marcador indicado.
La Figura 8A es una serie de imagenes de un experimento de citometna de flujo que muestran los datos representativos del ensayo de proliferacion de un sujeto B*4201 positivo. Tras una estimulacion de seis dfas con el peptido, el porcentaje de linfocitos T CD8 espedficos de B*4201 TL9 aumento del 5,7% al 12,4% en presencia del anticuerpo de bloqueo contra PD-L1.
La Figura 8B es un grafico de lmeas que ilustra el resumen de los datos del ensayo de proliferacion, que indica un incremento significativo de la proliferacion de linfocitos T CD8 espedficos del VIH en presencia del anticuerpo de bloqueo contra PD-Ll (n=28, p=0-0006, test t emparejado).
La Figura 8C es un grafico de barras que muestra los efectos diferenciales del bloqueo de PD-1/PD-L1 sobre la proliferacion de linfocitos T CD8 espedficos del VIH en cada paciente individual. Las barras blancas indican cuantas veces se han incrementado las celulas de tetramero positivo en presencia del peptido solamente, las barras negras indican cuantas veces se han incrementado las celulas de tetramero positivo en presencia del peptido mas el anticuerpo de bloqueo contra PD-L1. Los individuos en los que se realizaron ensayos de CFSe para mas de un epftopo estan indicados mediante los sfmbolos de un asterisco, un cuadrado o un romboide triangular.
Descripcion detallada
El uso de antibioticos y vacunas en las ultimas decadas ha reducido de forma significativa la tasa de mortalidad a consecuencia de infecciones microbianas. No obstante, el exito de las modalidades de tratamiento antimicrobiano ha sido limitado por la capacidad de determinados agentes infecciosos para evadir al sistema inmunitario del organismo hospedador y, a su vez, establecer una infeccion persistente. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria que se produce contra virus como el de la hepatitis y el VIH no es suficiente para eliminar el agente infeccioso, que permanece en el sujeto infectado. En estas infecciones, los linfocitos T CD8+ espedficos del antfgeno se vuelven funcionalmente tolerantes con el agente infeccioso, en un estado conocido como «anergia» o «agotamiento». Los linfocitos T anergicos pierden su actividad citotoxica, es decir su capacidad para producir citoquinas, proliferar y eliminar al agente infeccioso.
La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que la anergia de los linfocitos T es concomitante con una induccion de la expresion de PD-1 y de que la expresion de PD-1 esta correlacionada con determinados tipos de trastornos linfoproliferativos. Por consiguiente, la invencion proporciona composiciones para su uso en metodos para aumentar la citotoxicidad de los linfocitos T al
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poner en contacto un linfocito T con un agente que reduce la expresion o actividad de PD-1 o del ligando PD-1 (PD-L1). Mas concretamente, la invencion proporciona composiciones para su uso en metodos para tratar o prevenir un linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfodtico, mediante la administracion a un sujeto de un agente que reduce la expresion o actividad de PD-1. La reduccion de la actividad o expresion de PD-1 o PD-L1 se traduce en un incremento de la actividad citotoxica de los linfocitos T, incrementando la respuesta inmune espedfica al agente infeccioso. Los resultados proporcionados en el presente documento demuestran que la administracion de anticuerpos de bloqueo contra el ligando 1 de muerte programada (PD-L1) en el raton con infeccion persistente incrementaba la actividad citotoxica de los linfocitos T anergicos. Concretamente, la alteracion de las senales de PD-1 induda la expansion de los linfocitos T CD8+ anergicos, una mayor produccion de citoquinas y una mayor eliminacion vmca. Por otra parte, los linfocitos T CD8+ generados durante infecciones persistentes del raton con bajos niveles de CD4 proliferaban y recuperaban gran parte de su funcion tras el tratamiento contra PD-L1.
Para que los linfocitos T respondan a protemas extranas, las celulas presentadoras de antfgeno (APC) deben proporcionar dos senales a los linfocitos T inactivos. La primera senal, que confiere especificidad a la respuesta inmunitaria, es transducida a traves del receptor de linfocitos T (TCR) tras el reconocimiento de un peptido antigenico extrano presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda senal, denominada coestimulacion, hace que los linfocitos T proliferen y se vuelvan funcionales. La coestimulacion no es de antfgeno espedfico ni esta limitada por el MHC y es proporcionada por uno o mas polipeptidos de superficie celular distintos expresados por las APC. Si los linfocitos T solamente son estimulados a traves del receptor de linfocitos T, sin recibir una senal coestimuladora adicional, dejan de responder, se vuelven anergicos o mueren, lo que resulta en una modulacion a la baja de la respuesta inmunitaria.
Las protemas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), expresadas en las APCs, son polipeptidos coestimuladores fundamentales. Mientras que B7-2 desempena un papel predominante durante las respuestas inmunitarias primarias, B7-1 es regulada al alza posteriormente en el transcurso de una respuesta inmunitaria, con el objeto de prolongar las respuestas primarias o de coestimular las respuestas secundarias de los linfocitos T. Los polipeptidos B7 son capaces de proporcionar senales coestimuladoras o inhibitorias a las celulas inmunitarias, a fin de promover o inhibir las respuestas de las celulas inmunitarias. Por ejemplo, cuando se une a un receptor coestimulador, PD-L1 (B7-4) induce la coestimulacion de las celulas inmunitarias o inhibe la coestimulacion de las celulas inmunitarias cuando esta presente en una forma soluble. Cuando se unen a un receptor inhibidor, las moleculas B7-4 pueden transmitir una senal inhibidora a una celula inmunitaria. Algunos ejemplos de miembros de la familia de B7 incluyen B7-1, B7-2, B7-3 (reconocidos por el anticuerpo bB-1), B7h (PD-L1), y B7-4, asf como fragmentos o derivados solubles de los mismos. Los miembros de la familia de B7 se unen a uno o mas receptores de una celula inmunitaria, como CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 y/u otros receptores y, dependiendo del receptor, tienen la capacidad de transmitir una senal inhibidora o una senal coestimuladora a una celula inmunitaria.
CD28 es un receptor que se expresa constitutivamente en los linfocitos T inactivos. Tras enviar una senal a traves del receptor de linfocitos T, la union de CD28 y la transduccion de una senal coestimuladora provoca que los linfocitos T proliferen y secreten EL-2. CTLA4 (CD152), un receptor homologo a CD28, esta ausente en los linfocitos T inactivos, pero su expresion se induce tras la activacion de los linfocitos T. CTLA4 participa en la regulacion negativa de las respuestas de los linfocitos T. ICOS, un polipeptido relacionado con CD28 y CTLA4, esta implicado en la produccion de IL-10. PD-1, el receptor al que estan unidos PD-L1 y PD-L2, tambien se induce rapidamente en la superficie de los linfocitos T. PD-1 tambien se expresa en la superficie de los linfocitos B (en respuesta a la anti-IgM) y en un subconjunto de timocitos y celulas mieloides.
La implicacion de PD-1 (por ejemplo, mediante enlaces cruzados o agregacion) conduce a la transmision de una senal inhibitoria en una celula inmunitaria, resultando en una reduccion de respuestas inmunitarias concomitantes con un incremento de la energfa de la celula inmunitaria. Los miembros de la familia de PD-1 se unen a uno o mas receptores, como PD-L1 y PD-L2 en las celulas presentadoras de antfgeno.
PD-L1 y PD-L2, siendo ambos polipeptidos del ligando PD-1 humano, son miembros de la familia de polipeptidos B7. Cada ligando PD-1 contiene una secuencia de senal, un dominio IgV, un dominio IgC, un dominio transmembrana y una cola citoplasmica corta. Estos ligandos se expresan en la placenta, el bazo, los nodulos linfaticos, el timo y el corazon. PD-L2 tambien se expresa en el pancreas, el pulmon y el hngado, mientras que PD-L1 se expresa en el hngado fetal, los linfocitos T activados y las celulas endoteliales. Ambos ligandos PD-1 se regulan al alza en las celulas dendnticas y los monocitos activados.
Definiciones
Para los fines del presente, por «infeccion persistente» se entiende una infeccion en la que el agente infeccioso (por ejemplo, virus, bacteria, parasito, micoplasma u hongo) no es erradicado ni eliminado del huesped infectado, ni siquiera tras la induccion de una respuesta inmunitaria. Las infecciones persistentes pueden ser infecciones cronicas, infecciones latentes o infecciones lentas. Mientras que las infecciones agudas son relativamente breves (con una duracion de unos dfas a unas semanas) y se resuelven mediante el sistema inmunitario del organismo, las infecciones persistentes pueden durar meses, anos o
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incluso toda una vida. Estas infecciones tambien pueden recurrir con frecuencia durante un penodo de tiempo prolongado, lo que implica etapas de infeccion silenciosa e infeccion productiva, sin muerte celular o incluso sin producir danos excesivos a las celulas hospedadoras. Los agentes infecciosos causantes tambien se pueden detectar en el huesped (por ejemplo, dentro de celulas espedficas de los individuos infectados) incluso despues de que la respuesta inmunitaria se haya resuelto, utilizando tecnicas estandar. A los mairnferos se les diagnostica que padecen una infeccion persistente conforme a cualquier metodo estandar conocido en el campo y descrito, por ejemplo, en las Patentes estadounidenses n° 6.368.832, 6.579.854, y 6.808.710 y en las Publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n° 20040137577, 20030232323,20030166531, 20030064380, 20030044768,
20030039653,20020164600,20020160000, 20020110836, 20020107363, y 20020106730, quedando todas ellas incorporadas al presente como referencia. Por ejemplo, a un sujeto se le puede diagnosticar que padece una infeccion clamidial persistente tras la deteccion de una especie clamidial en una muestra biologica de ese individuo utilizando un analisis PCR. Los mairnferos no necesitan que se les diagnostique una infeccion persistente para ser tratados conforme a esta invencion. Los agentes microbianos capaces de establecer una infeccion persistente incluyen los virus (por ejemplo, virus del papiloma, virus de la hepatitis, virus de la inmunodeficiencia humana y herpesvirus), bacterias (por ejemplo, Eschericchia coli y Chlamydia spp.), parasitos (por ejemplo, Plasmodium, Leishmania spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Toxoplasma spp.) y hongos.
Por «aliviar un smtoma de una infeccion persistente» se entiende mejorar cualquiera de las condiciones o smtomas asociados con la infeccion persistente, antes o despues de que haya ocurrido. Alternativamente, aliviar un smtoma de una infeccion persistente puede implicar reducir la carga microbiana infecciosa (por ejemplo, vmca, bacteriana, fungica, micoplasmica o parasitaria) en el sujeto con respecto a esa carga en un control no tratado. En comparacion con un control no tratado equivalente, esta reduccion o grado de prevencion es al menos del 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, o 100%, medido mediante cualquier tecnica estandar. Es recomendable que la infeccion persistente sea eliminada por completo cuando sea detectada mediante cualquier metodo estandar conocido en el campo, en cuyo caso la infeccion persistente se considera que ha sido tratada. Un paciente que va a ser tratado por una infeccion persistente es aquel al que un medico le ha diagnosticado esta condicion. El diagnostico se puede realizar a traves de cualquier medio adecuado. El diagnostico y el control pueden implicar, por ejemplo, la deteccion del nivel de carga microbiana en una muestra biologica (por ejemplo, biopsia de tejido, analisis de sangre o analisis de orina), la deteccion del nivel de un marcador indirecto de valoracion de la infeccion microbiana en una muestra biologica, la deteccion de smtomas asociados con las infecciones persistentes, o la deteccion de celulas inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria tfpica de las infecciones persistentes (por ejemplo, la deteccion de linfocitos T de antfgeno espedfico que sean anergicos). Un paciente en el que se va a prevenir el desarrollo de una infeccion persistente puede haber recibido o no este diagnostico. Una persona con conocimientos en el campo entendera que estos pacientes pueden haberse sometido a las mismas pruebas estandar anteriormente descritas o pueden haber sido identificados, sin examen, como pacientes de alto riesgo debido a la presencia de uno o mas factores de riesgo (por ejemplo, historial familiar o exposicion a agente infeccioso).
Para los fines del presente, por «PD-1» se entiende un polipeptido que forma un complejo con protemas PD-L1 o PD-L2 y, por tanto, esta implicado en las respuestas inmunitarias, como la coestimulacion de linfocitos T. Las protemas PD-1 de la invencion son sustancialmente identicas a la PD-1 naturalmente presente (vease, por ejemplo, Ishida et. al. EMBO J. 11:3887-3895, 1992, Shinohara et al. Genomics 23:704-706,1994; y la Patente estadounidense n° 5.698.520. Las senales de PD-1 pueden reducir, por ejemplo, la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ al reducir la proliferacion de linfocitos T, la produccion de citoquinas o la eliminacion vmca. Segun la presente invencion, el polipeptido PD-1 reduce la actividad citotoxica de los linfocitos T CD8+ en al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas del 100% por debajo de los niveles de control, medida mediante cualquier metodo estandar.
Por «gen PD-1» se entiende un acido nucleico que codifica una protema PD-1.
Por «gen de fusion de PD-1» se entiende un promotor de PD-1 y/o la totalidad o parte de una region que codifica PD-1 operativamente unida a una segunda secuencia de acido nucleico heterologa. En realizaciones preferibles, la segunda secuencia de acido nucleico heterologa es un gen informador, es decir, un gen cuya expresion se puede someter a ensayo; los genes informadores incluyen, a tttulo meramente enunciativo, los que codifican glucuronidasa (GUS), luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT), protema fluorescente verde (GFP), fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa.
Por «reducir la expresion o actividad de PD-1» se entiende reducir el nivel o la actividad biologica de PD-1 con respecto al nivel o la actividad biologica de PD-1 en un control no tratado. Segun esta invencion, este nivel o actividad se reduce al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o incluso mas de un 100%, con respecto a un control sin tratar. Por ejemplo, la actividad biologica de PD-1 se reduce si la union de PD-1 a PD-L1, PD-L2 o ambos se reduce, resultando asf en una reduccion de las senales de PD-1 y, por tanto, en un incremento de la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+. Para los fines del presente, el termino «actividad» con respecto a un polipeptido PD-1 incluye cualquier actividad que es inherente a la protema PD-1 naturalmente presente, como la capacidad para modular una senal inhibidora en una celula inmunitaria activada, por ejemplo uniendo un ligando natural a una celula presentadora de
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antfgeno. Esta modulacion de una senal inhibidora de una celula inmunitaria provoca la modulacion de la proliferacion y/o la secrecion de citoquinas por parte de una celula inmunitaria. PD-1 tambien puede modular una senal coestimuladora compitiendo con un receptor coestimulador por la union de una molecula B7. Asf, el termino «actividad de PD-1» incluye la capacidad de un polipeptido PD-1 para unirse a su ligando o ligandos naturales, la capacidad para modular las senales inhibidoras o coestimuladoras de la celula inmunitaria y la capacidad para modular la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, reducir la actividad de PD-1 incluye reducir la interaccion de PD-1 con PD-L1 o PD-L2. Esto se puede conseguir, por ejemplo, bloqueando PD-L1 o PD-L2.
Por «celula inmunitaria» se entiende una celula de origen hematopoyetico y que interviene en la respuesta inmunitaria. Las celulas inmunitarias incluyen linfocitos (por ejemplo, linfocitos B y linfocitos T), celulas asesinas naturales y celulas mieloides (por ejemplo, monocitos, macrofagos, eosinofilos, mastocitos, basofilos y granulocitos).
Por «linfocito T» se entiende un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+. El termino linfocito T incluye tanto celulas TH1 como celulas TH2.
El termino «citotoxicidad de los linfocitos T» incluye cualquier respuesta inmunitaria mediada por la activacion de los linfocitos T CD8+. Algunos ejemplos de respuestas inmunitarias incluyen la produccion de citoquinas, la proliferacion de linfocitos T cD8+, la produccion de granzima o perforina y la eliminacion del agente infeccioso.
Por «ausencia de reactividad» se incluye la refraccion de las celulas inmunitarias a la estimulacion, por ejemplo la estimulacion a traves de un receptor de activacion o una citoquina. La ausencia de reactividad puede ocurrir, por ejemplo, debido a la exposicion a inmunosupresores o la exposicion a altas dosis de antigeno. Para los fines del presente, el termino «anergia» o «tolerancia» incluye la refractividad a la estimulacion mediada por un receptor de activacion. Por lo general, esta refractividad es de antfgeno espedfico y persiste despues de que la exposicion al antfgeno tolerizante haya cesado. Por ejemplo, la anergia en los linfocitos T (a diferencia de la ausencia de reactividad) se caracteriza por la ausencia de produccion de citoquina, por ejemplo IL-2. La anergia de los linfocitos T se produce cuando estos linfocitos estan expuestos al antfgeno y reciben una primera senal (una senal mediada por CD-3 o un receptor de linfocitos T) en ausencia de una segunda senal (una senal coestimuladora). En estas condiciones, la reexposicion de las celulas al mismo antfgeno (incluso cuando la reexposicion se produzca en presencia de una molecula coestimuladora) provoca una ausencia de produccion de citoquinas y, por tanto, de proliferacion. No obstante, los linfocitos T anergicos presentan respuestas a antfgenos no relacionados y pueden proliferar si se cultivan con citoquinas (por ejemplo, EL-2). Por ejemplo, la anergia de los linfocitos T tambien se puede observar por la ausencia de produccion de IL-2 por parte de los linfocitos T, medida por un ensayo de proliferacion o ELISA, utilizando una lmea celular indicadora. Alternativamente, se puede utilizar la estructura de un gen informador. Por ejemplo, los linfocitos T anergicos no inician la transcripcion del gen de IL-2 inducida por un promotor heterologo bajo el control del potenciador del extremo 5'-terminal del gen de IL-2 o por un multimero de la secuencia de API que se puede encontrar dentro del potenciador (Kang et al. Science 257:1134, 1992). Los linfocitos T anergicos de antfgeno espedfico pueden presentar una reduccion de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso el 100% de la actividad citotoxica con respecto al correspondiente linfocito T de antfgeno espedfico de control.
Por «anticuerpo purificado» se entiende un anticuerpo que esta al menos en un 60%, en peso, libre de protemas y moleculas organicas naturalmente presentes con las que esta naturalmente asociado. Preferiblemente, la preparacion es al menos un 75%, mas preferiblemente un 90% y mas preferiblemente al menos un 99%, en peso, anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo espedfico de PD-1, PD-L1 o PD-L2. Se puede obtener un anticuerpo purificado, por ejemplo, mediante cromatograffa de afinidad utilizado protema producida recombinantemente o peptidos de motivos conservados y tecnicas estandar.
Por «se une espedficamente» se entiende un anticuerpo que reconoce y se une a un antfgeno como un polipeptido PD-1, PD-L1 o PD-L2, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moleculas no- antfgeno en una muestra, por ejemplo una muestra biologica que incluye naturalmente protema. Un anticuerpo preferible se une a los polipeptidos PD-1, PD-L1, o PD-L2 divulgados en la Patente estadounidense n° 6.808.710 y en las Publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n° 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380,20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363, y 20020106730, quedando todas ellas incorporadas al presente como referencia.
Por «anticuerpos neutralizantes» se entienden anticuerpos que interfieren en cualquiera de las actividades biologicas de un polipeptido PD-1, en particular la capacidad de un polipeptido PD-1 para reducir una respuesta inmunitaria, como la citotoxicidad de los linfocitos T. El anticuerpo neutralizante puede reducir la capacidad de un polipeptido PD-1 para reducir una respuesta inmunitaria preferiblemente en un 50%, mas preferiblemente en un 70% y mas preferiblemente en un 90% o mas. Cualquier ensayo estandar para medir las respuestas inmunitarias, incluyendo las descritas en el presente, puede ser empleado para valorar los anticuerpos potencialmente neutralizantes.
Por «sustancialmente identico», cuando se habla de una protema o de un polipeptido, se entiende una
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protema o un polipeptido que presenta una identidad de al menos el 75%, aunque preferiblemente el 95%, mas preferiblemente el 90%, mas preferiblemente el 95% o incluso el 99% con una secuencia de aminoacidos de referencia. En el caso de las protemas o los polipeptidos, por lo general la longitud de las secuencias de comparacion sera de al menos 20 aminoacidos, preferiblemente al menos 30 aminoacidos, mas preferiblemente al menos 40 aminoacidos y mas preferiblemente 50 aminoacidos, o la protema o el polipeptido de longitud completa. Los acidos nucleicos que codifican estas protemas o polipeptidos «sustancialmente identicos» constituyen un ejemplo de acidos nucleicos «sustancialmente identicos»; se reconoce que los acidos nucleicos incluyen cualquier secuencia, debido a la degeneracion del codigo genetico, que codifica esas protemas o polipeptidos. Por otra parte, una secuencia de acido nucleico «sustancialmente identica» incluye tambien un polinucleotido que se hibrida con una molecula de acido nucleico de referencia en condiciones de elevada rigurosidad.
Por «condiciones de elevada rigurosidad» se entiende cualquier conjunto de condiciones que se caracterizan por una alta temperatura y una baja fuerza ionica y permiten una hibridacion comparable a las resultantes del uso de una sonda de ADN de al menos 40 nucleotidos de longitud, en una solucion tampon que contiene 0,5 M NaHP04, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, y 1% BSA (Fraccion V), a una temperatura de 65 °C, o una solucion tampon que contiene un 48% de formamida, 4.8XSSC, 0,2 M Tris- Cl, pH 7.6, 1x solucion de Denhardt, 10% sulfato de dextrato, y 0,1% SDS, a una temperatura de 42 °C. Otras condiciones para la hibridacion de alta rigurosidad, como para la PCR, hibridacion Northern, Southern o in situ, secuenciacion de ADN, etc., son bien conocidas por las personas cualificadas en el campo de la biologfa molecular. Vease, por ejemplo, F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998.
Por «sustancialmente puro» se entiende un acido nucleico, polipeptido u otra molecula que ha sido separada de los componentes que naturalmente la acompanan. Tfpicamente, el polipeptido es sustancialmente puro cuando esta al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso un 99%, en peso, libre de las protemas y las moleculas organicas naturalmente presentes con las que esta naturalmente asociado. Por ejemplo, un polipeptido sustancialmente puro se puede obtener mediante extraccion de una fuente natural, mediante expresion de un acido nucleico recombinante en una celula que normalmente no expresa esa protema o mediante smtesis qmmica.
El termino «ADN aislado» significa un ADN que esta libre de los genes que rodean al ADN en el genoma naturalmente presente del organismo del que se obtiene el ADN en cuestion. Por tanto, el termino «ADN aislado» abarca, por ejemplo, ADNc, ADN genomico clonado y ADN sintetico.
Por «una cantidad efectiva» se entiende una cantidad de un compuesto, solo o combinado, necesaria para reducir o evitar la hipertension o para tratar o prevenir una infeccion cronica en un mairnfero. La cantidad efectiva de un compuesto o compuestos activos vana dependiendo de la via de administracion, la edad, el peso corporal y la salud general del sujeto. En ultima instancia, el medico o veterinario responsable decidira la cantidad apropiada y el regimen de administracion.
Por un «compuesto candidato» se entiende un producto qmmico, sea naturalmente presente u obtenido por medios artificiales. Los compuestos candidatos pueden incluir, por ejemplo, peptidos, polipeptidos, moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas naturalmente presentes, moleculas de acido nucleico, moleculas de acido nucleico peptfdico, asf como componentes y derivados de los mismos. Por ejemplo, un compuesto candidato util segun la presente invencion reduce la union de PD-1 a PD-L1, a PD-L2 o a ambos.
Por el termino «composicion farmaceutica» se entiende cualquier composicion, que contiene al menos un agente terapeutica o biologicamente activo y que es adecuado para su administracion al paciente. Cualquiera de estas formulaciones se puede preparar con metodos bien conocidos y aceptados en el campo. Vease, por ejemplo, Remington: +The Science and Practice of Pharmacy, 20.sup.th edition, (ed. A R Gennaro), Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2000.
Metodos de tratamiento
La citotoxicidad de los linfocitos T se incrementa al poner en contacto un linfocito T con un compuesto que reduce la expresion o actividad de PD-1. El linfocito T es un linfocito T sin tratamiento previo, un linfocito T con memoria o un linfocito T activado. Alternativamente, el linfocito T es un linfocito T de antfgeno espedfico. Los linfocitos T de antfgeno espedfico son anergicos o tolerantes al agente infeccioso. La citotoxicidad de los linfocitos T se caracteriza por un incremento de la proliferacion celular y de la liberacion de citoquinas.
Los metodos son utiles para aliviar los smtomas de diversas infecciones y canceres. Una infeccion o un cancer es tratado, prevenido o sus smtomas son aliviados administrando a un sujeto un inhibidor de PD-1. El sujeto es un mamnfero, como un humano, un primate, un raton, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo y un cerdo. El sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una infeccion. Un sujeto que padece o corre el riesgo de desarrollar una infeccion es idoneo para la infeccion en cuestion por metodos estandar.
La infeccion, por ejemplo bacteriana, vmca, fungica, micoplasmica o parasitaria, es una infeccion
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persistente. Las infecciones persistentes, a diferencia de las infecciones agudas, no son eliminadas de forma efectiva al inducir una respuesta inmunitaria en el huesped. El agente infeccioso y la respuesta inmunitaria alcanzan un equilibrio, de forma que el sujeto infectado se mantiene infeccioso durante un periodo de tiempo prolongado, sin que exprese necesariamente smtomas. Las infecciones persistentes incluyen, por ejemplo, infecciones latentes, cronicas y lentas.
En una infeccion cronica, el agente infeccioso se puede detectar en el organismo en todo momento. No obstante, los signos y smtomas de la enfermedad pueden estar presentes o ausentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos ejemplos de infeccion cronica incluyen la hepatitis B (causada por el VHB) y la hepatitis C (causada por el VHC), adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, herpesvirus simple 1, herpesvirus simple 2, herpesvirus humano 6, virus varicela-zoster, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis D, virus del papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus del sarampion, virus de la rubeola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la leucemia de linfocitos T humana de tipo I y virus de la leucemia de linfocitos T humana de tipo II. Las infecciones persistentes parasitarias pueden producirse como resultado de una infeccion por Leishmania, Toxoplasma, Trypanosoma, Plasmodium, Schistosoma, y Encephalitozoon.
En una infeccion latente, el agente infeccioso (por ejemplo, el virus) parece encontrarse inactivo y latente, de forma que el sujeto no siempre presenta signos o smtomas. En una infeccion vftica latente, el virus se mantiene en equilibrio con el huesped durante periodos de tiempo prolongados antes de que los smtomas aparezcan de nuevo; sin embargo, los virus reales no se pueden detectar hasta que se produce una reactivacion de la enfermedad. Algunos ejemplos de infecciones latentes incluyen las causadas por HSV-1 (herpes bucal), HSV-2 (herpes genital), y VZV (varicela, culebrillas).
En una infeccion lenta, los agentes infecciosos aumentan gradualmente de numero durante un periodo de tiempo muy prolongado, en el que no se observan signos ni smtomas significativos. Algunos ejemplos de infecciones lentas incluyen el SIDA (causado por el VIH-1 y VIH-2), lentivirus que causan tumores en los animales y priones.
Por otra parte, las infecciones persistentes suelen surgir como complicaciones tardfas de las infecciones agudas. Por ejemplo, la panencefalitis esclerosante subaguda (SSPE) puede ocurrir tras una infeccion de sarampion aguda o una encefalitis regresiva puede ocurrir como resultado de una infeccion de rubeola.
Los canceres incluyen, por ejemplo, el linfoma angioinmunoblastico o el linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfocftico.
El linfoma angioinmunoblastico (AIL) es un tipo agresivo (que progresa rapidamente) de linfoma no Hodgkin de celulas T que se caracteriza por un aumento de tamano de los nodulos linfaticos e hipergammaglobulinemia Otros smtomas pueden incluir erupcion cutanea, fiebre, perdida de peso, test de Coomb positivo o sudores nocturnos. Esta malignidad se produce habitualmente en adultos. Los pacientes suelen tener entre 40 y 90 anos (con una media de unos 65) y mas habitualmente son hombres. A medida que el AIL progresa, se puede desarrollar una hepatoesplenomegalia, anemia hemolftica e hipergammaglobulinemia policlonal. La piel se ve afectada en aproximadamente el 40-50% de los pacientes.
El linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfocftico es una neoplasia de celulas B que parece proceder de celulas B del centro germinal con genes de inmunoglobulina no funcionales mutados. De forma similar al linfoma angioinmunoblastico, las celulas neoplasicas estan asociadas con una malla de celulas dendrfticas foliculares. La expresion de PD-1 se observa en las celulas T estrechamente asociadas con la celula CD20+ neoplasica en el linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfocftico, en un patron similar al observado para las celulas T CD57+. La celula CD57 ha sido identificada como otro marcador de las celulas T asociadas con el centro germinal, junto con CXCR5, y estos resultados respaldan la conclusion de que las celulas neoplasicas en el linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfocftico mantienen una estrecha relacion con las celulas T asociadas con el centro germinal.
Un inhibidor de PD-1 es cualquier agente que tiene la capacidad de reducir la expresion o la actividad de PD-1, PD-L1 o PD-2 en una celula. La actividad o expresion de PD-1 se reduce al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% en comparacion con esa actividad o expresion en una celula de control. La celula de control es una celula que no ha sido tratada con el inhibidor de PD-1. La actividad o expresion de PD-1 se determina a traves de cualquier metodo estandar en el campo, incluidos los descritos en el presente. Opcionalmente, el inhibidor de PD-1 inhibe o reduce la union de PD- 1 a PD-L1, a PD-L2 o a ambos. Los inhibidores de PD-1 incluyen polipeptidos, polinucleotidos, moleculas pequenas antagonistas o siRNA.
Un polipeptido inhibidor de PD-1 incluye, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que reduce la senal o expresion de PD-1. Algunos ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos contra PD-1, anticuerpos contra PD-L1, anticuerpos contra PD-L2, anticuerpos contra CTLA-4, anticuerpos contra BTLA, anticuerpos contra CD28, anticuerpos contra ICOS, anticuerpos contra ICOS-L, anticuerpos contra B7, anticuerpos contra B7-2, anticuerpos contra B7-H3, o anticuerpos contra B7-H4.
Alternativamente, el inhibidor de PD-1 es una protema negativa dominante o un acido nucleico que
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codifica una protema negativa dominante que interfiere en la actividad biologica de PD-1 (es dedr, la union de PD-1 a PD-L1, PD-L2 o ambos). Una protema negativa dominante es cualquier molecula de aminoacido que tiene una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso el 99% con al menos 10,20, 35, 50,100, o mas de 150 aminoacidos de la protema de tipo salvaje a la que corresponde la protema negativa dominante. Por ejemplo, un PD-1 negativo dominante presenta una mutacion de forma que deja de ser capaz de unirse a PD-L1.
La protema negativa dominante se puede administrar como un vector de expresion. El vector de expresion puede ser un vector no viral o un vector viral (por ejemplo, retrovirus, virus adenoasociado recombinante o un vector adenoviral recombinante). Alternativamente, la protema negativa dominante se puede administrar directamente como una protema recombinante de forma sistemica o en la zona infectada empleando, por ejemplo, tecnicas de microinyeccion.
Las moleculas pequenas incluyen, a tftulo meramente enunciativo, peptidos, peptidomimeticos (por ejemplo, peptoides), aminoacidos, analogos de aminoacidos, polinucleoticos, analogos de polinucleotidos, nucleotidos, analogos de nucleotidos, compuestos organicos e inorganicos (incluyendo compuestos heterorganicos y organometalicos) con un peso molecular inferior a unos 5.000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a unos 2.000 gramos por mol,
compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a unos 1.000 gramos por mol,
compuestos organicos o inorganicos que tienen un peso molecular inferior a unos 500 gramos por mol y
sales, esteres, asf como otras formas farmaceuticamente aceptables de estos compuestos.
El inhibidor de PD-1 es una molecula antisentido, una molecula de ARN pequeno de interferencia (siRNA), o una molecula pequena antagonista que tiene por objetivo la actividad o expresion de PD-1. Por «siRNA» se entiende una molecula de ARN de cadena doble que impide la traslacion de un ARN mensajero diana. Se emplean las tecnicas estandar para introducir siRNA en una celula, incluyendo aquellas en las que el ADN es una plantilla se la que se transcribe un ARN de un ARN pequeno de interferencia. El ARN pequeno de interferencia incluye una secuencia sentido de acido nucleico de PD-1, PD-L1 o PD-L2, una secuencia antisentido de acido nucleico de PD-1, PD-L1 o PD-L2 o ambas. Opcionalmente, el siRNA se construye de forma que una unica transcripcion tenga tanto la secuencia sentido como la secuencia antisentido complementaria del gen diana, por ejemplo una horquilla. La union del siRNA a una transcripcion de PD-1, PD-L1 o PD-L2 en la celula diana resulta en una reduccion de la produccion de PD- 1, PD-L1 o PD-L2 por parte de la celula. La longitud del oligonucleotido es de al menos 10 nucleotidos y puede ser tan largo como la transcripcion de PD-1, PD-L1 o PD-L2 naturalmente presente. Preferiblemente, el oligonucleotido tiene 19-25 nucleotidos de longitud. Mas preferiblemente, el oligonucleotido tiene menos de 75, 50 o 25 nucleotidos de longitud.
Otros inhibidores de PD-1 adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 6.808.710 y en las Publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n° 20040137577, 20030232323,20030166531, 20030064380,20030044768,20030039653,
20020164600,20020160000,20020110836, 20020107363, y 20020106730, quedando todas ellas incorporadas al presente como referencia.
La dosis preferible del inhibidor de PD-1 es una dosis biologicamente activa. Una dosis biologicamente activa es una dosis que inducira un incremento de la actividad citotoxica de los linfocitos T CD8+, el incremento de la respuesta inmunitaria espedfica en el agente infeccioso. Es recomendable que el inhibidor de PD-1 tenga la capacidad para reducir la actividad o expresion de PD-1 en las celulas inmunitarias de antfgeno espedfico (por ejemplo, linfocitos T como los linfocitos T CD8+) al menos en un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas del 100% por debajo de los niveles de control sin tratar. Los niveles de actividad de PD-1 en las celulas inmunitarias se miden a traves de cualquier metodo conocido en el campo, incluyendo, por ejemplo, un ensayo de Western blot, inmunohistoqmmica, ELISA y Northern blot. Alternativamente, la actividad biologica de PD-1 se mide valorando la union de PD-1 a PD-L1, PD-L2 o a ambos. La actividad biologica de PD-1 se determina en funcion de su capacidad para incrementar la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ incluyendo, por ejemplo, la produccion de citoquinas, la eliminacion del agente infeccioso y la proliferacion de linfocitos T CD8+ de antfgeno espedfico. Preferiblemente, el agente que reduce la expresion o actividad de PD-1 puede incrementar la respuesta inmunitaria espedfica para el agente infeccioso al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas del 100% por encima de los niveles de control sin tratar. Por lo tanto, el agente de la presente invencion es cualquier agente que presenta una o mas de estas actividades. A pesar de que el agente de la invencion se expresa preferiblemente en los linfocitos T CD8+, se entiende que cualquier celula que pueda influir en la respuesta inmunitaria frente a infecciones persistentes tambien puede resultar adecuada para los metodos de la invencion, incluyendo, por ejemplo, los linfocitos B.
Opcionalmente, al sujeto se le administra uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Los agentes terapeuticos adicionales incluyen, por ejemplo, compuestos antivmcos (por ejemplo, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, inhibidor de la transcriptasa inversa analogo de nucleotidos (NRTI), como AZT (zidovudina), ddl (didanosina), ddC (zalcitabina), d4T (estavudina) o 3TC (lamivudina), inhibidor de la transcriptasa inverso no analogo de los nucleotidos (NNRTI), como nevirapina o delavirdina, inhibidor de la proteasa (saquinavir, ritonavir, indinavir o nelfinavir, ribavirina o interferon), un compuesto
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antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, compuestos antineoplasicos o un analgesico.
El agente terapeutico adicional se administra con anterioridad, de forma concomitante o con posterioridad a la administracion del inhibidor de PD-1. Por ejemplo, el inhibidor de PD-1 y el agente adicional se administran en formulaciones separadas con un intervalo mmimo de 1, 2, 4, 6,10,12, 18, o mas de 24 horas. Opcionalmente, el agente adicional esta formulado junto con el inhibidor de PD-1. Cuando el agente adicional esta presente en una composicion diferente, se pueden emplear diferentes vfas de administracion. El agente se administra a dosis que se sabe que son efectivas para ese agente para el tratamiento, la reduccion o prevencion de una infeccion.
Las concentraciones del inhibidor de PD-1 y el agente adicional dependen de diferentes factores, incluyendo el medio de administracion, el sitio diana, el estado fisiologico del mairnfero y otra medicacion administrada. Por tanto, las dosis del tratamiento se pueden titular para optimizar la seguridad y eficacia, y esto depende del criterio del especialista. La determinacion de la dosis adecuada y el regimen de administracion para una determinada situacion dependen del criterio del especialista.
Opcionalmente, al sujeto se le administra tambien una vacuna que desencadena una respuesta inmunitaria protectora frente al agente infeccioso que causa una infeccion persistente. Por ejemplo, el sujeto recibe una vacuna que desencadena una respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la tuberculosis, influenza o hepatitis C. Algunos ejemplos de vacunas se describen, por ejemplo, en Berzofsky et al. (J. Clin. Invest. 114:456-462, 2004). Si se desea, la vacuna se administra con una dosis de refuerzo principal o con adyuvantes.
Los inhibidores de PD-1 se administran en una cantidad suficiente para aumentar la citotoxicidad de los linfocitos T, por ejemplo linfocitos T CD8+. Un aumento de la citotoxicidad de los linfocitos T provoca una respuesta inmunitaria aumentada y una reduccion de la infeccion persistente. Una respuesta inmunitaria aumentada se mide, por ejemplo, por el incremento de la proliferacion de celulas inmunitarias, por ejemplo linfocitos T o B, un incremento de la produccion de citoquina y un incremento en la eliminacion de un agente infeccioso. Esta reduccion incluye el alivio de uno o mas de los smtomas asociados con la infeccion persistente. La administracion del inhibidor de PD-1 reduce la infeccion persistente o alivia uno o mas smtomas asociados con la infeccion persistente al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%, en comparacion con un sujeto no tratado.
El tratamiento es eficaz si aporta un beneficio clmico, como una reduccion de la carga del agente infeccioso en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica profilacticamente, el termino «eficaz» significa que el tratamiento retarda o previene el desarrollo de una infeccion. La eficacia se puede determinar empleando cualquier metodo conocido para el diagnostico o el tratamiento de la infeccion en cuestion.
Administracion terapeutica
La invencion incluye la administracion a un sujeto de una composicion que incluye un compuesto que reduce la actividad o expresion de PD-1 (denominado en el presente «inhibidor de PD-1» o «compuesto terapeutico»).
Una cantidad efectiva de un compuesto terapeutico se encuentra preferiblemente entre unos 0,1 mg/kg a unos 150 mg/kg. Las dosis efectivas vanan, como saben las personas cualificadas en el campo, dependiendo de la via de administracion, el uso de excipientes y la administracion concomitante de otros tratamientos terapeuticos, incluyendo el uso de otros agentes contra la infeccion o agentes terapeuticos para tratar, prevenir o aliviar un smtoma de una determinada infeccion o cancer. Un regimen terapeutico se lleva a cabo mediante la identificacion de un mai^ero, por ejemplo un paciente humano que padece (o corre el riesgo de desarrollar) una infeccion o cancer, empleando metodos estandar.
El compuesto farmaceutico se administra a este individuo empleando metodos conocidos en el campo. Preferiblemente, el compuesto se administra por via oral, rectal, nasal, topica o parenteral, por ejemplo subcutanea, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. El compuesto se administra profilacticamente o tras la deteccion de una infeccion. El compuesto es opcionalmente formulado como un componente de un coctel de farmacos terapeuticos para tratar la infeccion. Algunos ejemplos de formulaciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones acuosas del agente activo en una solucion salina isotonica, una solucion de glucosa al 5% u otro excipiente estandar farmaceuticamente aceptable. Los agentes solubilizantes estandar, como las PVP o ciclodextrinas tambien se utilizan como excipientes farmaceuticos para la administracion de los compuestos terapeuticos.
Los compuestos terapeuticos descritos en el presente estan formulados en composiciones para otras vfas de administracion utilizando metodos convencionales. Por ejemplo, el inhibidor de PD-1 esta formulado en una capsula o un comprimido para su administracion oral. Las capsulas pueden contener cualquier material estandar farmaceuticamente aceptable, como gelatina o celulosa. Los comprimidos pueden ser formulados con arreglo a procedimientos convencionales, comprimiendo las mezclas de un compuesto terapeutico con un vehmulo solido y un lubricante. Algunos ejemplos de vehmulos solidos incluyen el almidon y la bentonita de azucar. El compuesto se administra en forma de un comprimido recubierto ngido o una capsula que contiene un aglutinante, como lactosa o manitol, un material de relleno convencional y
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un agente de tableteado. Otras formulaciones incluyen una pomada, un supositorio, una pasta, un espray, un parche, una crema, un gel, una esponja reabsorbible o espuma. Estas formulaciones se producen empleando metodos bien conocidos en el campo.
Cuando el compuesto terapeutico es un acido nucleico que codifica una protema, el acido nucleico terapeutico se administra in vivo para promover la expresion de su protema codificada, integrandolo como parte de un vector de expresion de acido nucleico apropiado y administrandolo de forma que penetre en la celula (por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral), por inyeccion directa, mediante el uso del bombardeo de micropartmulas, mediante el revestimiento con lfpidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o administrandolo conjuntamente con un peptido de tipo caja homeo que se sabe que accede al nucleo (Vease, por ejemplo, Joliot, et al, 1991. Proc Natl Acad Sci USA 88:1864-1868), y similares. Alternativamente, un acido nucleico terapeutico se introduce intracelularmente y se incorpora al ADN celular del huesped para la expresion, mediante recombinacion homologa, o se mantiene episomal.
Para la administracion local de ADN, se emplean vectores de terapia genetica estandar. Estos vectores incluyen vectores virales, incluidos los obtenidos de virus de la hepatitis incapaces de replicarse (por ejemplo, VHB y VHC), retrovirus (vease, por ejemplo, WO 89/07136; Rosenberg et al., 1990, N. Eng. J. Med. 323(9):570-578), adenovirus (vease, por ejemplo, Morsey et al., 1993, J. Cell. Biochem., Supp. 17E,), virus adenoasociados (Kotin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211-2215,), virus del herpes simple incapaces de replicarse (HSV; Lu et al., 1992, Abstract, pagina 66, Abstracts de la Reunion sobre Terapia Genetica, 22-26 de septiembre, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York), y cualquier version modificada de estos vectores. La invencion puede utilizar cualquier otro sistema de administracion que realice la transferencia in vivo de los acidos nucleicos a las celulas eucariotas. Por ejemplo, los acidos nucleicos pueden estar incluidos en liposomas, esto es, liposomas cationicos (Lipofectin), sistemas de administracion mediados por receptores, vectores basados en acidos nucleicos no vmcos, fantasmas de eritrocitos o microesferas (por ejemplo, micropartmulas; vease, por ejemplo, la Patente estadounidense n° 4.789.734; la Patente estadounidense n° 4.925.673; la Patente estadounidense n° 3.625.214; Gregoriadis, 1979, Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press). Tambien se puede administrar ADN desnudo.
El ADN para la terapia genetica se puede administrar a los pacientes parenteralmente, por ejemplo por via intravenosa, subcutanea, intramuscular e intraperitoneal. El ADN o un agente inductor se administra en un vehmulo farmaceuticamente aceptable, es decir un vehmulo biologicamente compatible que es apropiado para su administracion a un animal, como suero salino. Una cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad que es capaz de producir un resultado deseable desde el punto de vista medico, por ejemplo una disminucion de un producto del gen PD-1 en un animal tratado. Esta cantidad puede ser determinada por una persona cualificada en el campo. Como se sabe perfectamente en el campo medico, la dosis para un determinado paciente depende de multiples factores, incluyendo el tamano del paciente, el area de la superficie del cuerpo, la edad, el compuesto concreto a administrar, el sexo, el tiempo y la via de administracion, el estado de salud general y la administracion concomitante de otros farmacos. Las dosis pueden variar, pero una dosis preferible para la administracion intravenosa de ADN es aproximadamente de 106 a 1022 copias de la molecula de aDn. Tfpicamente, los plasmidos se administran a un mairnfero en una cantidad de aproximadamente un nanogramo a unos 5.000 microgramos de ADN. Resulta recomendable que las composiciones contengan entre unos 5 nanogramos y unos 1.000 microgramos de ADN, 10 nanogramos a 800 microgramos de ADN, 0,1 microgramos a 500 microgramos de ADN, 1 microgramo a 350 microgramos de ADN, 25 microgramos a 250 microgramos de ADN, o 100 microgramos a 200 microgramos de ADN. Alternativamente, la administracion de vectores adenovirales recombinantes que codifican el inhibidor de PD-1 a un mamffero se puede realizar a una concentracion de al menos 105, 106,107,108,109,1010, o 1011 unidades formadoras de placa (pfu).
Los productos geneticos de PD-1 se administran al paciente por via intravenosa en un vehmulo farmaceuticamente aceptable como suero fisiologico. Se pueden emplear los metodos estandar para la administracion intracelular de peptidos, por ejemplo insertados en liposomas. Estos metodos son bien conocidos por las personas cualificadas en el campo. Se calcula que se administrana una dosis intravenosa de entre 1 y 100 moles aproximadamente del polipeptido de la invencion por kg de peso corporal y dfa. Las composiciones de la invencion son utiles para la administracion parenteral, por ejemplo intravenosa, subcutanea, intramuscular e intraperitoneal.
Los inhibidores de PD-1 son efectivos tras el contacto directo del compuesto con el tejido afectado. Por consiguiente, el compuesto se puede administrar por via topica. Alternativamente, los inhibidores de PD-1 se pueden administrar de forma sistemica. Adicionalmente, los compuestos se pueden administrar implantando (sea directamente en un organo, como el intestino o el hfgado, o de forma subcutanea), una matriz solida o reabsorbible que libere lentamente el compuesto en los tejidos adyacentes y cercanos del sujeto. Por ejemplo, para el tratamiento de la infeccion gastrointestinal, el compuesto se puede administrar de forma sistemica (por ejemplo, intravenosa, rectal u oral) o local (por ejemplo, directamente en el tejido gastrico). Alternativamente, se coloca una esponja reabsorbible o una pastilla impregnada en el inhibidor de PD-1 en contacto directo con el tejido gastrico. El inhibidor de PD-1 se libera lentamente in vivo mediante la difusion del farmaco de la pastilla y la erosion de la matriz del polfmero. En otro ejemplo, la infeccion del fugado (por ejemplo, hepatitis) se trata mediante la infusion en la vasculatura hepatica de
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una solucion que contiene el inhibidor de PD-1.
Para el tratamiento de infecciones neurologicas, el inhibidor de PD-1 se puede administrar intravenosa o intratecalmente (es decir, mediante infusion directa en el fluido cerebroespinal). Para la administracion local, se coloca una esponja reabsorbible o una pastilla impregnada en el compuesto en contacto directo con el tejido del sistema nervioso central. El compuesto o la mezcla de compuestos se liberan lentamente in vivo mediante la difusion del farmaco de la pastilla y la erosion de la matriz del polfmero. Alternativamente, se realiza una infusion del compuesto en el cerebro o el fluido cerebroespinal empleando metodos estandar. Por ejemplo, un anillo para agujeros de trepano con un cateter para emplearlo como puerto de inyeccion se posiciona para llegar al cerebro por un agujero trepanado en el craneo. A un deposito de lfquido conectado al cateter accede una aguja o estilete insertado a traves de un septo posicionado sobre la parte superior del anillo para agujeros de trepano. El montaje del cateter (descrito, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 5.954.687) proporciona una via para el flujo de fluido adecuada para la transferencia de fluidos hacia o desde un lugar seleccionado en el cerebro, o cerca del mismo, que permite la administracion del farmaco durante un penodo de tiempo.
Para las infecciones cardfacas, el compuesto se puede administrar, por ejemplo, en el tejido cardfaco (es decir, miocardio, pericardio o endocardio) mediante una inyeccion intracoronaria directa a traves de la pared toracica o empleando metodos estandar basados en un cateter percutaneo bajo orientacion fluoroscopica. De este modo, el inhibidor se puede inyectar directamente en el tejido o se puede infundir con una canula o cateter insertado en un lumen corporal. Se puede emplear cualquier variedad de cateter coronario o de perfusion para administrar el compuesto. Alternativamente, el compuesto recubre o esta impregnado en una canula que se coloca en un vaso coronario.
Las infecciones pulmonares se pueden tratar, por ejemplo, administrando el compuesto mediante inhalacion. Los compuestos se administran en forma de un espray aerosol desde un dispensador o contenedor presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo un gas como dioxido de carbono, o un nebulizador.
Una persona con conocimientos en el campo entendera que los pacientes tratados de acuerdo con la invencion pueden haberse sometido a las mismas pruebas para el diagnostico de una infeccion persistente o pueden haber sido identificados, sin previo examen, como personas de alto riesgo debido a la presencia de uno o mas factores de riesgo (por ejemplo, exposicion al agente infeccioso, exposicion a un sujeto infectado, predisposicion genetica o padecer una condicion patologica que predisponga a infecciones secundarias). La reduccion de los danos o smtomas de la infeccion persistente tambien puede incluir, a tftulo meramente enunciativo, el alivio de los smtomas, la reduccion del alcance de la enfermedad, la estabilizacion de la enfermedad (es decir, ausencia de empeoramiento), retraso o ralentizacion del avance de la enfermedad y mejona o paliacion del estado de la enfermedad. El tratamiento se puede administrar en casa, bajo la estrecha supervision del proveedor de asistencia sanitaria, o en un centro de salud.
Metodos para medir la respuesta inmunitaria
Los metodos para medir la respuesta inmunitaria tras el tratamiento de acuerdo con la presente invencion son bien conocidos en el campo. La actividad de los linfocitos T se puede valorar, por ejemplo, a traves de ensayos que detectan la produccion de citoquinas, ensayos que miden la proliferacion de los linfocitos T, ensayos que miden la eliminacion del agente microbiano y ensayos que miden la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+. Estos ensayos se describen, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 6.808.710 y en las Publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n° 20040137577, 20030232323.20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363, y 20020106730, quedando todas ellas incorporadas al presente como referencia.
Opcionalmente, la capacidad de un inhibidor de PD-1 para incrementar la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ es valorada mediante ensayos que miden la proliferacion de los linfocitos T CD8+ (por ejemplo, incorporacion de timidina, ensayos BrdU y tincion con marcadores del ciclo celular (por ejemplo, Ki67 y CFSE), descritos, por ejemplo, por Dong et al (Nature 5:1365-1369,1999). En un ejemplo, la proliferacion de linfocitos T se controla cultivando los linfocitos T purificados que expresan PD-1 con un inhibidor de PD-1, una senal de activacion primaria como se describe anteriormente, y 3H-timidina. El nivel de proliferacion de los linfocitos T se determina midiendo la incorporacion de timidina.
La citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ tambien se valora mediante ensayos de lisis (por ejemplo, ensayos de liberacion de 51Cr o ensayos que detectan la liberacion de perforina o granzima), ensayos que detectan la activacion de caspasa o ensayos que miden la eliminacion del agente microbiano del sujeto infectado. Por ejemplo, la carga viral de una muestra biologica del sujeto infectado (por ejemplo, suero, bazo, tngado, pulmon o el tejido del que el virus es trofico) se puede medir antes y despues del tratamiento.
Tambien se puede medir la produccion de citoquinas, como IFNy, TNF-a, y IL-2. Por ejemplo, los linfocitos T purificados son cultivados en presencia de la protema del inhibidor de PD-1 y una senal de activacion primaria. El nivel de las diversas citoquinas en el supernatante se puede determinar mediante ensayos
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inmunosorbentes ligados a enzimas u otros ensayos convencionales descritos, por ejemplo, en Dong et al (Nature 5:1365-1369, 1999).
Si se desea, la eficacia del inhibidor de PD-1 se valora por su capacidad para inducir la coestimulacion de los linfocitos T. Por ejemplo, un metodo para la coestimulacion de linfocitos T in vitro implica proporcionar linfocitos T purificados que expresan PD-1 con una senal de activacion primera o primaria por el anticuerpo monoclonal contra CD3 o ester de forbol, o por un antigeno en asociacion con un MHC de clase II. La capacidad de un agente de un compuesto candidato para reducir la actividad o la expresion de PD-1 y, por tanto, proporcionar la senal secundaria o coestimuladora necesaria para modular la funcion inmunitaria de estos linfocitos T se puede valorar mediante cualquiera de los diversos ensayos convencionales conocidos en el campo.
Una respuesta de los linfocitos B se valora mediante un ELISA de antigeno espedfico (por ejemplo, LCMV, VIH, tuberculosis o malaria), ELISPOT de celulas plasmaticas, ensayo de linfocitos B de memoria, fenotipo de linfocitos B y analisis de los centros germinales mediante inmunohistoqmmica.
Ensayos de deteccion
La presente divulgacion proporciona metodos de deteccion para identificar compuestos que pueden inhibir la expresion o actividad de PD-1. Los compuestos utiles incluyen cualquier agente que inhibe la actividad biologica o reduce el nivel celular de PD-1. Por ejemplo, los compuestos candidatos pueden reducir la union de PD-1 a PD-L1, a PD-L2 o a ambos. Utilizando estos agentes como compuestos principales, por ejemplo, los presentes metodos de deteccion tambien permiten la identificacion de otros inhibidores nuevos y espedficos de PD-1 que funcionan para tratar, reducir o prevenir infecciones persistentes, o alternativamente para aliviar uno o mas smtomas asociados a estas infecciones. El metodo de deteccion puede implicar tecnicas de alto rendimiento.
Por un «compuesto candidato» se entiende un producto qmmico, sea naturalmente presente u obtenido por medios artificiales. Los compuestos candidatos pueden incluir, por ejemplo, peptidos, polipeptidos, moleculas organicas sinteticas, moleculas organicas naturalmente presentes, moleculas de acido nucleico, moleculas de acido nucleico peptfdico, asf como componentes y derivados de los mismos. Por ejemplo, un compuesto candidato util segun la presente invencion reduce la union de PD-1 a PD-L1, a PD-L2 o a ambos.
Existen diversos metodos disponibles para realizar estos ensayos de deteccion. Segun un planteamiento, los compuestos candidatos se anaden a diversas concentraciones al medio de cultivo de las celulas que expresan PD-1. Por un «gen PD-1» se entiende un acido nucleico que codifica una protema PD-1. Por «gen de fusion de PD-1» se entiende un promotor de PD-1 y/o la totalidad o parte de una region que codifica PD-1 operativamente unida a una segunda secuencia de acido nucleico heterologa. En realizaciones preferibles, la segunda secuencia de acido nucleico heterologa es un gen informador, es decir, un gen cuya expresion se puede someter a ensayo; los genes informadores incluyen, a tttulo meramente enunciativo, los que codifican glucuronidasa (GUS), luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT), protema fluorescente verde (GFP), fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa.
La expresion genetica de PD-1 se mide entonces, por ejemplo, a traves de un analisis estandar de Northern blot (Ausubel et al., supra), utilizando cualquier fragmento preparado a partir de la molecula de acido nucleico de PD-1 como una sonda de hibridacion o a traves de una PCR en tiempo real con los cebadores apropiados. El nivel de expresion genetica en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel medido en un medio de cultivo de control que carece de la molecula candidata. Si se desea, el efecto de los compuestos candidatos puede, alternativamente, medirse por el nivel del polipeptido PD-1 utilizando el mismo planteamiento general y tecnicas inmunologicas estandar, como un ensayo de Western blot o inmunoprecipitacion con un anticuerpo espedfico para PD-1, por ejemplo. Los inmunoensayos pueden utilizarse, por ejemplo, para detectar o controlar el nivel de PD-1. Los anticuerpos policlonales o monoclonales que son capaces de unirse a PD-1 pueden ser empleados en cualquier formato de inmunoensayo estandar (por ejemplo, ensayo ELISA o rIa) para medir los niveles de PD-1. El PD-1 tambien se puede medir empleando la espectroscopia de masa, cromatograffa lfquida de alto rendimiento, tecnicas espectrofotometricas o fluorometricas, o combinaciones de las mismas.
Alternativamente, los metodos de deteccion de la divulgacion pueden utilizarse para identificar compuestos candidatos que disminuyen la actividad biologica de PD-1, reduciendo la union de PD-1 a PD- L1, a PD-L2 o a ambos, al menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o un 100% con respecto al control no tratado. Por ejemplo, un compuesto candidato se puede testar por su capacidad para reducir la actividad de PD-1 en celulas que naturalmente expresan PD-1, tras la transfeccion con ADNc para PD-1, o en soluciones libres de celulas que contienen PD-1, como se describe detalladamente mas abajo. El efecto de un compuesto candidato sobre la union o activacion de PD-1 se puede testar mediante ensayos de union radiactiva y no radiactiva, ensayos de competencia y ensayos de senalizacion del receptor.
En un ejemplo espedfico, las celulas de mairnfero (por ejemplo, celulas de roedor) que expresan un acido nucleico que codifica PD-1 son cultivadas en presencia de un compuesto candidato (por ejemplo, un peptido, polipeptido, molecula organica sintetica, molecula organica naturalmente presente, molecula de
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acido nucleico, o un componente de los mismos). Las celulas pueden expresar PD-1 de forma endogena o bien, alternativamente, estar geneticamente modificadas mediante cualquier tecnica estandar conocida en el campo (por ejemplo, transfeccion e infeccion viral) para sobreexpresar PD-1. El nivel de expresion de PD-1 se mide en estas celulas por medio de un analisis de Western blot, que posteriormente se compara con el nivel de expresion de la misma protema en celulas de control que no han entrado en contacto con el compuesto candidato. Un compuesto que promueve un incremento del nivel de actividad de PD-1 como resultado de la reduccion de su smtesis o actividad biologica se considera util en la invencion.
En un ejemplo concreto, un compuesto que interfiere en la union de PD-1 con PD-L1, con PD-L2 o con ambos (reduciendo asf la actividad biologica de PD-1), que conduce a un incremento de la respuesta inmunitaria, resulta util conforme a la presente invencion. Dada su capacidad para reducir la actividad biologica de PD-1, esta molecula se puede utilizar, por ejemplo, como agente terapeutico para tratar, reducir o prevenir una infeccion persistente o, alternativamente, para aliviar uno o mas smtomas asociados con estas infecciones. En un ejemplo espedfico, un compuesto candidato se puede poner en contacto con dos protemas, siendo la primera protema un polipeptido sustancialmente identico a PD-1 y siendo la segunda protema PD-L1 o PD-L2 (es decir, una protema que se une al polipeptido PD-1 en condiciones que permiten la union y que conducen a una respuesta inmunitaria reducida). Segun este metodo de deteccion concreto, la interaccion entre estas dos protemas se mide tras la adicion de un compuesto candidato. Una reduccion de la union de PD-1 al segundo polipeptido tras la adicion del compuesto candidato (con respecto a esa union en ausencia del compuesto) identifica al compuesto candidato como un compuesto que tiene la capacidad de inhibir la interaccion entre las dos protemas. En ultima instancia, el ensayo de deteccion de la invencion se puede realizar, por ejemplo, en un sistema libre de celulas o utilizando un sistema de doble tffbrido en levaduras. Si se desea, una de las protemas del compuesto candidato se puede inmovilizar en un soporte como se ha descrito anteriormente o puede tener un grupo detectable.
Alternativa o adicionalmente, los compuestos candidatos se pueden detectar para seleccionar los que presentan una union espedfica y, por tanto, inhiben el PD-1. La eficacia de este compuesto candidato dependera de su capacidad para interactuar con PD-1. Esta interaccion se puede testar facilmente empleando cualquier numero de tecnicas de union y ensayos funcionales estandar (por ejemplo, los descritos en Ausubel et al., supra). Por ejemplo, un compuesto candidato se puede testar in vitro para determinar la interaccion y la union con PD-1 y su capacidad para modular respuestas inmunitarias se puede testar mediante ensayos estandar (por ejemplo, los descritos en el presente).
Por ejemplo, un compuesto candidato que se une a PD-1 se puede identificar utilizando una tecnica basada en la cromatograffa. Por ejemplo, un PD-1 recombinante se puede purificar mediante tecnicas estandar a partir de las celulas modificadas para expresar PD-1 (por ejemplo, las anteriormente descritas) y se pueden inmovilizar en una columna. Alternativamente, el PD-1 naturalmente presente se puede inmovilizar en una columna. A continuacion, se pasa una solucion de los compuestos candidatos por la columna y se identifica un compuesto espedfico para PD-1 sobre la base de su capacidad para unirse a PD-1 y para ser inmovilizado en la columna. Para aislar el compuesto, la columna se lava para eliminar las moleculas unidas de forma no espedfica y el compuesto de interes se libera posteriormente de la columna y se recopila. Los compuestos aislados por este metodo (o cualquier otro metodo apropiado) pueden, si se desea, ser posteriormente purificados (por ejemplo, mediante cromatograffa ffquida de alto rendimiento).
La deteccion de nuevos inhibidores y la optimizacion de los principales compuestos se pueden valorar, por ejemplo, evaluando su capacidad para modular la actividad citotoxica de los linfocitos T o la respuesta inmunitaria empleando tecnicas estandar. Por otra parte, estos compuestos candidatos se pueden testar para determinar su capacidad para funcionar como agentes antimicrobianos (por ejemplo, como los descritos en el presente). Los compuestos aislados mediante este planteamiento tambien se pueden utilizar, por ejemplo, como agentes terapeuticos para tratar, reducir o prevenir infecciones persistentes o, alternativamente, para aliviar uno o mas smtomas asociados con estas infecciones. Los compuestos identificados como compuestos que se unen a PD-1 con una constante de afinidad igual o menor que 10 mM se consideran particularmente utiles en la divulgacion.
Los agentes terapeuticos potenciales incluyen moleculas organicas, peptidos, peptidomimeticos, polipeptidos y anticuerpos que se unen a una secuencia de acido nucleico o polipeptido que codifica PD-1 y, por tanto, inhibe o extingue su actividad. Los agentes antimicrobianos potenciales tambien incluyen pequenas moleculas que se unen al sitio de union de estos polipeptidos y lo ocupan, evitando asf la union a moleculas de union celular, de forma que se impide esa actividad biologica normal. Otros agentes antimicrobianos potenciales incluyen moleculas antisentido.
Metodos de diagnostico y pronostico
El cancer, como el linfoma de celulas T angioinmunoblastico o el linfoma de Hodgking nodular de predominio linfodtico, se detecta examinando la cantidad de un polipeptido PD-1 en una muestra de ensayo (es decir, una muestra obtenida de un paciente). Un cambio en el nivel del polipeptido PD-1 en comparacion con una muestra de control es indicativo de cancer en el sujeto. El cambio puede ser un incremento o una disminucion del polipeptido PD-1 con respecto a una muestra de control. La muestra de control se prepara (es decir, se fracciona) de forma similar a la muestra de ensayo.
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Una muestra es, por ejemplo, sangre, suero, Kquido asdtico, orina u otros fluidos corporales. Preferiblemente, la muestra es un linfocito T o un linfocito B.
La cantidad de PD-1 se determina en la muestra de ensayo y se compara con la expresion del nivel de control normal. Por nivel de control normal se entiende el nivel de expresion de un polipeptido PD-1 que se encuentra tipicamente en un sujeto que no padece cancer. Un incremento del nivel de PD-1 en la muestra obtenida del paciente indica que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar un cancer. Por el contrario, cuando los metodos se aplican de forma profilactica, un nivel similar o un descenso de un polipeptido PD-1 en una muestra obtenida del paciente indica que el sujeto no sufre ni corre el riesgo de desarrollar un cancer. Un incremento del nivel de un polipeptido PD-1 en la muestra obtenida del paciente indica que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar un cancer.
La alteracion de la cantidad de polipeptido PD-1 es estadfsticamente significativa. Por estadfsticamente significativa se entiende que la alteracion es mayor de la que cabna esperar que ocurriese por casualidad solamente. La significacion estadfstica se determina por cualquier metodo conocido en el campo. Por ejemplo, la significacion estadfstica se determina por el valor p. Los valores p son una medida de la probabilidad de que una diferencia entre grupos durante un experimento se produzca por casualidad.
(P(z > Zobservado)). Por ejemplo, un valor p de 0,01 significa que existe una probabilidad de uno entre 100 de que el resultado se haya producido por casualidad. Cuanto menor sea el valor p, mas probable es que la diferencia entre grupos haya sido provocada por el tratamiento. Una alteracion es estadfsticamente significativa si el valor p es al menos 0,05. Preferiblemente, el valor p es 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 o menos.
La «precision del diagnostico» de un test, ensayo o metodo se refiere a la capacidad de ese test, ensayo o metodo para distinguir entre los pacientes que tienen cancer o corren el riesgo de desarrollar un cancer, basandose en el hecho de si los pacientes tienen una «presencia clmicamente significativa» de un polipeptido PD-1. Por «presencia clmicamente significativa» se entiende que la presencia del polipeptido PD-1 en el paciente (tfpicamente en una muestra del paciente) es superior o inferior al punto de corte predeterminado (o un valor lfmite) para ese polipeptido PD-1 y, por tanto, indica que el paciente tiene un cancer para el que una presencia suficientemente elevada de esa protema representa un marcador.
Los terminos «precision diagnostica de alto grado» y «precision diagnostica de muy alto grado» se refieren al test o ensayo para ese polipeptido PD-1 con el punto de corte predeterminado correctamente (de forma precisa), lo que indica la presencia o ausencia de cancer. Un test perfecto tendna una precision perfecta. Asf, en los individuos que padecen diabetes, el test indicana solamente unos resultados positivos y no indicana ningun resultado «negativo» para ninguno de estos individuos (no habna «falsos negativos»). Es decir, que la «sensibilidad» del ensayo (el mdice de positivos verdaderos) sena del 100%. Por otra parte, en los individuos que no padecen diabetes, el test indicana solamente resultados negativos y no indicana ningun resultado «positivo» para ninguno de estos individuos (no habna «falsos positivos»). Es decir, que la «especificidad» (el mdice de negativos verdaderos) sena del 100%. Vease, por ejemplo, OTVIarcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results," Clin. Ped. 1993, 32(8): 485-491, que trata sobre la especificidad, la sensibilidad y los valores predictivos positivos y negativos de un test, por ejemplo un test de diagnostico clmico.
Al cambiar el punto de corte o valor lfmite de un test (o ensayo) normalmente vana la sensibilidad y especificidad, aunque en una relacion cualitativamente inversa. Por ejemplo, si el punto de corte se reduce, mas individuos de la poblacion testados tendran tfpicamente unos resultados del test por encima del punto de corte o valor lfmite. Dado que los individuos cuyos resultados del test se encuentran por encima del punto de corte son identificados como individuos que padecen la enfermedad, condicion o smdrome para el que se esta realizando el test, reducir el punto de corte provocara que mas individuos sean identificados como individuos con resultados positivos (es decir, que padecen cancer). Por tanto, una mayor proporcion de los que padecen cancer seran identificados por el test como individuos que lo padecen. Por consiguiente, la sensibilidad (el mdice de positivos verdaderos) del ensayo aumentara. No obstante, al mismo tiempo, habra mas falsos positivos porque un mayor numero de personas que no padecen la enfermedad, la condicion o el smdrome (es decir, personas cuyos resultados son realmente «negativos») seran identificados por el test por presentar unos valores del polipeptido PD-1 por encima del punto de corte y, por tanto, como positivos (es decir, que padecen la enfermedad, la condicion o el smdrome) en lugar de ser correctamente identificados por el ensayo como negativos. Por consiguiente, la especificidad (el mdice de negativos verdaderos) del test disminuira. De un modo similar, al aumentar el punto de corte tendra a disminuir la sensibilidad y aumentar la especificidad. Por tanto, para valorar la eficacia y utilidad de un test, ensayo o metodo medico propuesto para valorar la condicion de un paciente, siempre hay que tener en cuenta la sensibilidad y la especificidad, asf como cual es el punto de corte al que estan sujetas la sensibilidad y especificidad, porque la sensibilidad y la especificidad pueden variar de forma significativa a lo largo del rango de puntos de corte.
No obstante, existe un indicador que permite la representacion de la sensibilidad y la especificidad de un test, ensayo o metodo a lo largo de todo el rango de puntos de corte con tan solo un unico valor. Ese indicador se obtiene de una curva de caractensticas operativas del receptor (ROC) para el test, el ensayo
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o el metodo en cuestion. Vease, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures," el capftulo 14 de Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burtis y Ashwood (eds.), 4a edicion 1996, W.B. Saunders Company, paginas 192-199; y Zweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992, 38(8): 1425-1428.
Una curva ROC es un trazado X-Y de sensibilidad en el eje Y, en una escala de cero a uno (es decir, 100%), frente a un valor igual a uno menos especificidad en el eje X, en una escala de cero a uno (es decir, 100%). En otras palabras, es un trazado del mdice de positivos verdaderos frente al mdice de positivos falsos para ese test, ensayo o metodo. Para elaborar la curva ROC para el test, ensayo o metodo en cuestion, los pacientes son evaluados utilizando un metodo perfectamente preciso o «patron oro» que es independiente del test, ensayo o metodo en cuestion, para determinar si los pacientes son realmente positivos o negativos para la enfermedad, condicion o smdrome (por ejemplo, la angiograffa coronaria es un test de patron oro para la presencia de ateroesclerosis coronaria). Los pacientes tambien son testados empleando el test, el ensayo o metodo en cuestion y para diversos puntos de corte los pacientes son identificados como positivos o negativos de acuerdo con el test, ensayo o metodo. La sensibilidad (el mdice de positivos verdaderos) y el valor igual a uno menos la especificidad (un valor equivalente al mdice de falsos positivos) se determinan para cada punto de corte y cada par de valores X- Y se traza como un unico punto en el diagrama de X-Y. La «curva» que conecta esos puntos es la curva ROC.
El area bajo la curva (AUC) es el indicador que permite la representacion de la sensibilidad y la especificidad de un test, ensayo o metodo a lo largo de todo el rango de puntos de corte con tan solo un unico valor. El AUC maximo es uno (un test perfecto) y el area minima es un medio. Cuanto mas se acerca el AUC a uno, mayor es la precision del test.
Por «precision diagnostica de alto grado» se entiende un test o un ensayo (como el test de la invencion para determinar la presencia clmicamente significativa del polipeptido PD-1, que indica por ello la presencia de diabetes) en el que el AUC (area bajo la curva ROC para el test o el ensayo) es al menos de 0,70, preferiblemente al menos de 0,75, mas preferiblemente al menos de 0,80, preferiblemente al menos de 0,85, mas preferiblemente al menos de 0,90 y mas preferiblemente al menos de 0,95.
Por «precision diagnostica de muy alto grado» se entiende un test o ensayo en el que el AUC (area bajo la curva ROC para el test o el ensayo) es al menos de 0,875, preferiblemente al menos de 0,90, mas preferiblemente al menos de 0,925, preferiblemente al menos de 0,95, mas preferiblemente al menos de 0,975, y mas preferiblemente al menos de 0,98.
Opcionalmente, la expresion de otros biomarcadores conocidos para un determinado cancer tambien se determina como otra indicacion de si el sujeto padece o no padece cancer. Por ejemplo, se detecta CD10, bcl-6, CD20, CD57 o CXCR5.
El polipeptido PD-1 y los biomarcadores adicionales se detectan de cualquier manera adecuada, aunque tfpicamente se detectan poniendo en contacto una muestra del paciente con un anticuerpo que se une a PD-1 o al biomarcador y, por tanto, indican la presencia o ausencia de un producto de la reaccion. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimerico o un fragmento de los anteriores, como se ha tratado detalladamente, y el paso de detectar el producto de la reaccion se puede realizar con cualquier inmunoensayo adecuado. La muestra del sujeto es tfpicamente un fluido biologico como el descrito anteriormente y puede ser la misma muestra de fluido biologico empleada para aplicar el metodo descrito.
La expresion de un polipeptido PD-1 tambien permite controlar la evolucion del tratamiento para el cancer. En este metodo, se proporciona una muestra biologica de un sujeto que se esta sometiendo a tratamiento, por ejemplo quirurgico, quimioterapeutico u hormonal, para el cancer. Si se desea, las muestras biologicas se obtienen del sujeto en distintos puntos temporales, antes, durante o despues del tratamiento. La expresion de un PD-1 se determina y compara despues con una referencia, por ejemplo, un control cuyo estado del cancer es conocido. La muestra de referencia ha sido expuesta al tratamiento. Alternativamente, la muestra de referencia no ha sido expuesta al tratamiento. Opcionalmente, este control se realiza de forma preliminar a unos segundos procedimientos de control quirurgicos y a unos posteriores procedimientos de control quirurgicos. Por ejemplo, se pueden recoger muestras de sujetos que han recibido un tratamiento quirurgico inicial para el cancer y un posterior tratamiento con agentes antineoplasicos para ese cancer, para controlar el progreso del tratamiento.
Si la muestra de referencia es de un sujeto que no tiene cancer, una similitud o una reduccion de la cantidad del polipeptido PD-1 en la muestra de ensayo y la muestra de referencia indica que el tratamiento es eficaz. No obstante, un incremento en la cantidad del polipeptido PD-1 en la muestra de ensayo y la muestra de referencia indica un pronostico o un resultado clmico menos favorable.
Por «eficaz» se entiende que el tratamiento provoca una reduccion en la cantidad de un polipeptido PD-1, o una reduccion en el tamano, la prevalencia o el potencial metastasico de un tumor en un sujeto. La valoracion del cancer se realiza utilizando protocolos clmicos estandar. La eficacia se determina en asociacion con cualquier metodo conocido para el diagnostico o el tratamiento del tumor concreto. La expresion de un polipeptido PD-1 tambien permite la identificacion de pacientes que responderan a la
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terapia sistemica, por ejemplo quimioterapeutica, hormonal o de radiacion. En este metodo, se proporciona una muestra biologica de un sujeto antes de someterse a un tratamiento quirurgico para el cancer. La expresion de un polipeptido PD-1 se determina y compara a continuacion con una muestra biologica obtenida del sujeto tras la extraccion quirurgica del cancer. El paciente probablemente reaccionara al tratamiento sistemico, si la cantidad del polipeptido PD-1 disminuye tras la extraccion quirurgica del cancer. Por el contrario, el paciente probablemente no reaccionara al tratamiento sistemico, si la cantidad del polipeptido se mantiene constante o aumenta tras la extraccion quirurgica del cancer.
La expresion del polipeptido PD-1 o de otros biomarcadores del cancer se determina a nivel de la protema o del acido nucleico, empleando cualquier metodo conocido en el campo. Por ejemplo, se puede utilizar el analisis de hibridacion Northern, utilizando sondas que reconocen espedficamente una o mas de estas secuencias para determinar la expresion genetica. Alternativamente, la expresion se mide utilizando estos ensayos de PCR basados en la transcripcion inversa, por ejemplo utilizando cebadores espedficos para la secuencia de genes expresada diferencialmente. La expresion tambien se determina a nivel de la protema, es decir midiendo los niveles de peptidos codificados por los productos geneticos descritos en el presente o las actividades de los mismos. Estos metodos son bien conocidos en el campo e incluyen, por ejemplo, inmunoensayos basados en anticuerpos para protemas codificadas por los genes. Se puede emplear cualquier material biologico para la deteccion/cuantificacion de la protema o su actividad. Alternativamente, se puede seleccionar un metodo adecuado para determinar la actividad de las protemas codificadas por los genes marcadores en funcion de la actividad de cada una de las protemas analizadas.
El sujeto es preferiblemente un mairnfero. El mairnfero es, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un raton, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca. Los sujetos son tfpicamente mujeres u hombres. Al sujeto se le ha diagnosticado previamente que padece un cancer y posiblemente ya se ha sometido a un tratamiento para el cancer. Alternativamente, al sujeto no se le ha diagnosticado previamente un cancer. La presente invencion resulta util para todos los pacientes que corren el riesgo de desarrollar un cancer. A pesar de que cada tipo de cancer tiene su propio conjunto de factores de riesgo, el riesgo de desarrollar cancer aumenta en funcion de la edad, el sexo, la raza, el historial medico personal y familiar. Otros factores de riesgo estan relacionados en gran medida con el estilo de vida, mientras que determinadas infecciones, exposiciones laborales y algunos factores ambientales tambien pueden estar relacionados con el desarrollo de un cancer.
El diagnostico del cancer se produce tfpicamente mediante la identificacion de una masa durante un examen, aunque tambien puede ser a traves de otro medio, como un diagnostico radiologico o por ultrasonidos. El tratamiento es tfpicamente a traves de cirugfa citorreductora, seguida de un tratamiento con agentes antineoplasicos como docetaxel, vinorelbina, gemcitabina, capecitabina o una combinacion de ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo; ciclofosfamida, doxorubicina y fluorouracilo; doxorubicina y ciclofosfamida; doxorubicina y ciclofosfamida con paclitaxel; doxorubicina seguida de CMF; o ciclofosfamida, epirubicina y fluorouracilo. Por otra parte, muchos pacientes precisaran una terapia de radiacion.
Los inmunoensayos realizados de acuerdo con la presente invencion pueden ser ensayos homogeneos o heterogeneos. En un ensayo homogeneo, la reaccion inmunologica normalmente implica el anticuerpo espedfico (por ejemplo, el polipeptido PD-1), un analito etiquetado y la muestra de interes. La senal que surge de la etiqueta es modificada, directa o indirectamente, tras la union del anticuerpo al analito etiquetado. Tanto la reaccion inmunologica como la deteccion del alcance de la misma se realizan en una solucion homogenea. Las etiquetas inmunoqmmicas que se pueden emplear incluyen radicales libres, radioisotopos, tintes fluorescentes, enzimas, bacteriofagos o coenzimas.
En un planteamiento de ensayo heterogeneo, los reactivos son normalmente la muestra, el anticuerpo y los medios para producir una senal detectable. Se pueden emplear muestras como las descritas anteriormente. Por lo general, el anticuerpo es inmovilizado en un soporte, como un disco, una placa o un portaobjetos, y se pone en contacto con la muestra que se sospecha que contiene el antfgeno en una fase ifquida. El soporte es entonces separado de la fase lfquida y o bien la fase de soporte o bien la fase lfquida es examinada para encontrar una senal detectable, empleando medios para producir esa senal. La senal esta relacionada con la presencia del analito en la muestra. Los medios para producir una senal detectable incluyen el uso de etiquetas radiactivas, etiquetas fluorescentes o etiquetas enzimaticas. Por ejemplo, si el antfgeno a detectar contiene un segundo sitio de union, un anticuerpo que se une a ese sitio se puede conjugar con un grupo detectable y anadirse a la solucion de la reaccion de la fase lfquida antes del paso de separacion. La presencia del grupo detectable sobre el soporte solido indica la presencia del antfgeno en la muestra de ensayo. Algunos ejemplos de inmunoensayos adecuados son radioinmunoensayos, metodos de inmunofluorescencia o inmunoensayos ligados a enzimas.
Las personas con conocimientos en el campo estaran familiarizadas con numerosos formatos de inmunoensayo espedficos y variantes de los mismos, que pueden ser utiles para aplicar el metodo divulgado en el presente. Vease, en general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.); vease tambien la Patente estadounidense n° 4.727.022 de Skold et al. titulada "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application", la Patente estadounidense n° 4.659.678 de Forrest et al. titulada "Immunoassay of Antigens", la Patente estadounidense n° 4.376.110 de David et al., titulada "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies", la Patente estadounidense
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n° 4.275.149 de Litman et al., titulada "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays", la Patente estadounidense n° 4.233.402 de Maggio et al., titulada "Reagents and Method Employing Channeling" y la Patente estadounidense n° 4.230.767 de Boguslaski et al., titulada "Heterogeneous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label". Los anticuerpos se conjugan con un soporte solido adecuado para un ensayo de diagnostico (por ejemplo, discos, placas, portaobjetos o pocillos fabricados en materiales como latex o poliestireno) de acuerdo con tecnicas conocidas, como la precipitacion. Los anticuerpos descritos en el presente pueden igualmente conjugarse con grupos detectables como radioetiquetas (por ejemplo, 35 S, 135 I, 1311), etiquetas enzimaticas (por ejemplo, peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina) y etiquetas fluorescentes (por ejemplo, fluorescema) de acuerdo con tecnicas conocidas.
Los kits de diagnostico para aplicar los metodos descritos en el presente se producen de distintas maneras. En una realizacion, el kit de diagnostico comprende (a) un anticuerpo (por ejemplo, un polipeptido PD-1) conjugado con un soporte solido; y (b) un anticuerpo secundario de la invencion conjugado con un grupo detectable. Los reactivos tambien pueden incluir agentes auxiliares, tales como agentes amortiguadores y agentes estabilizantes de la protema, como polisacaridos y similares. El kit de diagnostico tambien puede incluir, cuando sea necesario, otros miembros del sistema productor de senal, sistema del que es miembro el grupo detectable (por ejemplo, sustratos enzimaticos), agentes para reducir la interferencia de fondo en un test, reactivos de control, aparatos para realizar una prueba y similares. Alternativamente, un kit de ensayo contiene (a) un anticuerpo y (b) un socio de union espedfica para el anticuerpo conjugado con un grupo detectable. Del mismo modo, pueden incluirse agentes auxiliares como los anteriormente descritos. El kit de ensayo puede ser envasado de cualquier manera adecuada, tipicamente con todos los elementos en un unico envase junto con una hoja de instrucciones impresas para realizar el ensayo.
Esta invencion se basa en parte en los experimentos descritos en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan para ilustrar la invencion y no se debera interpretar que tienen un caracter limitador.
Ejemplo 1: Inhibicion de la ruta de PD-1 en ratones cronicamente infectados utilizando anticuerpos contra PD-L1
Los ratones infectados con diversas cepas del virus de la coriomeningitis linfodtica (LCMV) se emplearon para estudiar el efecto de la infeccion vmca cronica sobre la funcion de los linfocitos T CD8+. La cepa de Armstrong LCMV causa una infeccion aguda que se elimina en el plazo de ocho dfas, dejando atras una poblacion de larga vida de linfocitos T CD8+ de memoria, inactivos y altamente funcionales. La cepa LCMV CI-13, por el contrario, establece una infeccion persistente en el huesped, que se caracteriza por una viremia que se prolonga hasta tres meses. El virus permanece en algunos tejidos por tiempo indefinido y los linfocitos T CD8+ de antfgeno espedfico se vuelven funcionalmente incapacitados. Los linfocitos T CD8+ DbNP396-404 son ffsicamente sometidos a delecion, mientras que los linfocitos T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286 CD8+ persisten, aunque pierden la capacidad para proliferar o secretar citoquinas antivirales, como IFN-y y TNF-a.
Los ratones C57BL/6 se adquirieron en el Instituto Nacional contra el Cancer estadounidense (Frederick, MD). Los ratones fueron infectados por via intravenosa con 2x 106 pfu de LCMV-C1-13. Las depleciones de CD4 se realizaron inyectando 500 |jg de GK1.5 en PBS el dfa de la infeccion y el dfa siguiente a la infeccion. Los ratones inmunes al LCMV se generan infectando a los ratones por via intraperitoneal con 2x105 pfu de LCMV Armstrong.
El analisis de matriz genica se realizo en linfocitos T CD8+ transgenicos P14 espedficos de DbGP33-41 desnudo purificado-FACS, linfocitos T CD8+ de memoria espedficos de DbGP33-41 obtenidos de ratones inmunes a LCMV Armstrong y linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 o espedficos de DbGP276-286 obtenidos de ratones infectados con LCMV C1-13 y CD4+ sometidos a deplecion. El aislamiento de ARN y el analisis de matriz genica se realizaron tal y como se describe en Kaech et al., (Cell 111:837-51, 2002). El ARNm de PD-1 se expreso a niveles elevados en los linfocitos T CD8+ agotados con respecto a los linfocitos T CD8+ de memoria (Figura 1 A). Por otra parte, PD-1 se expreso en la superficie de los linfocitos T CD8+ en los ratones infectados por LCMV C1-13, aunque no estuvo presente en la superficie de los linfocitos T CD8+ despues de la eliminacion del LCMV Armstrong (Figura 1B). Los ratones cronicamente infectados tambien expresaron unos niveles superiores de uno de los ligandos de PD-1, PD- L1, en la mayona de los linfocitos y APC en comparacion con los ratones no infectados. Por tanto, la persistencia del antfgeno viral y el agotamiento de los linfocitos T CD8+ son concomitantes con una induccion de la expresion de PD-1.
Para testar la hipotesis de que el bloqueo de la ruta de PD-1/PD-L1 puede restaurar la funcion de los linfocitos T y mejorar el control viral durante la infeccion cronica por LCMV, se interrumpio la ruta coinhibidora de PD-1/PD-L1 durante la infeccion cronica por LCMV utilizando anticuerpos de bloqueo aPD-L1. Se administro un anticuerpo monoclonal contra PD-L1 por via intraperitoneal cada tres dfas a los ratones infectados por LCMV C1-13 (200 jg de anticuerpos monoclonales de rata contra raton PD-L1 IgG2b (clon 10F.5C5 o 10F.9G2)) desde el dfa 23 hasta el dfa 37 despues de la infeccion. En el dfa 37, habfa aproximadamente 2,5 veces mas linfocitos T CD8+ espedficos de DbNP396-404 y tres veces mas linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 en los ratones tratados con respecto a los controles sin tratar
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(Figura 2A). La induccion de la proliferacion fue espedfica para los linfocitos T CD8+, dado que el numero de linfocitos T CD4+ en el bazo era aproximadamente el mismo tanto en los ratones tratados como en los ratones sin tratar (~6x104 IAbGP61-80 de linfocitos T CD4+ por bazo).
Ademas de un aumento de la proliferacion de linfocitos T CD8+, la inhibicion de las senales de PD-1 tambien se tradujo en una produccion aumentada de citoquinas antivirales en los linfocitos T CD8+ de virus espedfico. Se determino la produccion de IFN-y y TNF-cc por parte de los linfocitos T CD8+ hasta ocho epftopos de CTL diferentes. La respuesta combinada fue 2,3 veces mayor en los ratones tratados frente a los ratones no tratados (Figuras 2b y 2C). Tras el tratamiento tambien se observo una frecuencia de las celulas productoras de TNF-a dos veces mayor (Figura 2D). La eliminacion vftica tambien se acelero cuando el virus se elimino del suero, el bazo y el tftgado de los ratones tratados. En los ratones tratados se observaron tftulos virales reducidos en el pulmon y el rinon (unas 10 veces menos) para el dfa 37 despues de la infeccion (14 dfas despues del inicio del tratamiento). Sin embargo, los ratones sin tratar presentaron unos niveles significativos de virus en todos estos tejidos (Figura 2E). Los tftulos virales en suero y homogenados de tejido se determinaron utilizando celulas Vero, tal y como se describe en Ahmed et al. (J. Virol. 51:34-41, 1984). Los resultados muestran que un inhibidor de PD-1 incrementa la proliferacion de linfocitos T CD8+ y la eliminacion viral, lo que indica que la inhibicion de las senales de PD-1 restablece la funcion de los linfocitos T CD8+. Por otra parte, la inhibicion de las senales de PD-1 tambien intensifico las respuestas de los linfocitos B, dado que el numero de celulas secretoras de anticuerpo espedfico para LCMV en el bazo tambien se incremento (mas de 10 veces) tras el tratamiento.
Los linfocitos T CD4+ desempenan un papel fundamental en la generacion y el mantenimiento de las respuestas de los linfocitos T CD8+. A este respecto, los linfocitos T CD8+ cebados en ausencia de linfocitos T CD4+ (llamados linfocitos T CD8+ «indefensos») son incapaces de desencadenar respuestas inmunitarias normales. Por otra parte, la infeccion cronica por LCMV es mas severa en ausencia de linfocitos T CD4+. Por consiguiente, los linfocitos T indefensos generados durante la infeccion por LCMV- C1-13 presentan una incapacidad funcional todavfa mas profunda que los linfocitos T generados en presencia de linfocitos T CD4+. Los linfocitos T CD8+ espedficos de DbNP396-404 se someten a delecion hasta niveles indetectables y los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 y DbGP276-286 pierden por completo su capacidad para secretar IFN-y y TNF-a.
Los linfocitos T CD4+ se sometieron a deplecion en el momento de la infeccion por LCMV-C1-13 y los ratones fueron tratados con un tratamiento de anticuerpos contra PD-L1 desde el dfa 46 hasta el dfa 60 despues de la infeccion. Los linfocitos T CD4+ espedficos de LCMV fueron indetectables mediante tincion intracelular de IFN-y antes o despues del tratamiento. Despues del tratamiento, los ratones tratados teman aproximadamente siete veces mas linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 CD8+ y cuatro veces mas linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 CD8+ en el bazo que los ratones de control sin tratar (Figura 3A). El numero de linfocitos T CD8+ de virus espedfico en el bazo tambien aumento (Figura 3B). Este aumento de los linfocitos T CD8+ de virus espedfico en los ratones tratados se atribuyo a un aumento de la proliferacion, tal y como se detecto mediante la incorporacion de BrdU. El 43% de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y el 2% incorporaron niveles elevados de BrdU en los ratones sin tratar, mientras que el 50% de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y el 37% incorporaron niveles elevados de BrdU en los ratones tratados. El analisis de BrdU se realizo introduciendo 1mg/ml de BrdU en el agua de beber durante el tratamiento y la tincion se realizo conforme al protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, CA). Por otra parte, los ratones tratados conteman un porcentaje mas elevado de linfocitos T CD8+ que expresaban la protema asociada al ciclo celular Ki67 (60% frente al 19% de los ratones sin tratar, Figura 3C). La respuesta al tratamiento en los linfocitos T CD8+ en las PBMC se limito a los ratones que presentaban unos elevados niveles de expansion de los linfocitos T CD8+.
La inhibicion de PD-1 tambien incremento la produccion de citoquina antiviral en los linfocitos T CD8+ de virus espedfico agotados e indefensos. Tras el tratamiento, el numero de linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP33-41 y DbGP276-286 que produdan IFN-y se incremento de forma notable (Figura 4A), aunque las cifras mas elevadas de linfocitos T CD8+ espedficos de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175, y DbGP92-101 CD8+ T tambien se detectaron en los ratones tratados (Figura 4A). El 50% de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 de los ratones tratados pueden producir IFN-y frente al 20% de los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 de los ratones de control sin tratar. (Figura 4B). Los niveles de IFN-y y TNF-a producidos por los linfocitos T CD8+ espedficos de DbGP276-286 en los ratones tratados, sin embargo, fueron inferiores a los de las celulas de memoria espedficas de DbGP276-286 plenamente funcionales. (Figura 4C).
La inhibicion de PD-1 tambien incremento la actividad lftica de los linfocitos T CD8+ de virus espedfico agotados e indefensos. La actividad lftica ex vivo de los linfocitos T CD8+ de virus espedfico se detecto despues del tratamiento, utilizando un ensayo de liberacion de 51Cr (Wherry et al., 2003. J. Virol. 77:491127). Los tftulos virales se redujeron aproximadamente tres veces en el bazo, cuatro en el tftgado, dos en el pulmon y dos en el suero, despues de dos semanas de tratamiento en comparacion con los ratones no tratados. (Figura 4E).
Por tanto, estos resultados demuestran que el bloqueo de la ruta de PD-1 rompe la tolerancia periferica de
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CTL a una infeccion vmca cronica y que los linfocitos T CD8+ agotados y privados de la ayuda de los linfocitos T CD4+ no son inactivados de forma irreversible.
Ejemplo 2: administracion de una vacuna antivirica y un inhibidor de PD-1
Un planteamiento para potenciar las respuestas de los linfocitos T durante una infeccion persistente es la vacunacion terapeutica. La base logica para este planteamiento es que los antigenos endogenos pueden no estar presentes de una manera optima e inmunogenica durante una infeccion vmca cronica y que proporcionar un antigeno en forma de una vacuna puede ofrecer un estimulo mas efectivo para los linfocitos B y T de virus espedfico. Utilizando el modelo del LCMV cronico, a los ratones se les administro un virus vacuna recombinante que expresaba el epftopo GP33 del LCMV como una vacuna terapeutica (WGP33), lo que provoco una modesta mejora de las respuestas de los linfocitos T CD8+ en algunos ratones cronicamente infectados. Cuatro de los nueve ratones cronicamente infectados que recibieron la vacuna terapeutica demostraron una respuesta positiva, mientras que ninguno de los ratones de control demostro un incremento significativo de la respuesta inmunitaria contra GP33. Cuando esta vacunacion terapeutica se combino con un inhibidor de PD-L1, las respuestas de los linfocitos T espedficos del LCMV se intensificaron en un nivel mayor en comparacion con cualquiera de los tratamientos individuales y el efecto del tratamiento combinado fue mas que aditivo.
Ejemplo 3: Inhibicion de la ruta de PD-1 en ratones cronicamente infectados utilizando ARNi de PD- 1
El ARN de interferencia (ARNi) es capaz de silenciar la expresion genetica en las celulas de mairnferos. Los ARN de doble cadena larga (ARNdc) son introducidos en celulas y, a continuacion, son procesados en ARN silenciadores (siRNA) mas pequenos dirigidos a moleculas de ARNm espedficas o a pequenos grupos de ARNm. Esta tecnologfa resulta particularmente util en situaciones en las que los anticuerpos no son funcionales. Por ejemplo, el ARNi se puede emplear en una situacion en la que variantes alternativas unicas producen formas solubles de PD-1 y CTLA-4.
Los ARN silenciadores de PD-1 se insertan en un vector de expresion de siRNA disponible en el mercado, como los vectores adenovirales o vectores de expresion pSilencer™ (Ambion, Austin, TX). Estos vectores se ponen despues en contacto con linfocitos T agotados diana in vivo o ex vivo (vease el Ejemplo 4).
Ejemplo 4: Regeneracion ex vivo de linfocitos T agotados
Los linfocitos T CD8+ agotados de virus espedfico son aislados de los ratones cronicamente infectados por LCMV-C1-13 utilizando perlas magneticas o centrifugado de densidad. Los linfocitos T CD8+ transfectados se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido a PD-L1, PD-L2 o PD-1. Tal y como se describe en el Ejemplo 1, la inhibicion de la ruta de PD-1 provoca la regeneracion de los linfocitos T CD8+. Por consiguiente, se produce un incremento de la proliferacion de linfocitos T CD8+ y de la produccion de citoquinas, por ejemplo. Estos linfocitos T CD8+ regenerados son reintroducidos en los ratones infectados y la carga vmca se mide tal y como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 5: Deteccion in vitro de nuevos compuestos regeneradores de los linfocitos T CD8+
Los compuestos que modulan la ruta de PD-1 se pueden identificar en ensayos de deteccion in vivo y ex vivo basandose en su capacidad para invertir el agotamiento de los linfocitos T CD8+ resultante de la infeccion vmca cronica.
Los linfocitos T CD8+ agotados se obtienen de ratones cronicamente infectados por LCMV-C'-13 y, a continuacion, se ponen en contacto con un compuesto de ensayo. La cantidad de citoquinas antivmicas (por ejemplo, IFN-y o TNF-a) liberadas por los linfocitos T que han estado en contacto con el compuesto se miden, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA u otro metodo cuantitativo y se comparan con la cantidad, si procede, de citoquina antivirica liberada por el linfocito T agotado que no ha estado en contacto con el compuesto del ensayo. Un incremento de la cantidad de citoquina antivirica liberada por las celulas tratadas con respecto a esa cantidad en las celulas no tratadas identifica al compuesto como inhibidor de PD-1, util para modular la actividad de los linfocitos T.
Ejemplo 6: Deteccion in vivo de nuevos compuestos regeneradores de los linfocitos T CD8+
Los linfocitos T CD8+ agotados se obtienen de ratones cronicamente infectados por LCMV-C1-13. Se administra un compuesto de ensayo por via intravenosa a los ratones infectados. La cantidad de citoquinas antivmicas (por ejemplo, IFN-y o TNF-a) liberadas en el suero de los ratones tratados y no tratados se mide, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA u otro metodo cuantitativo y se compara. Un incremento de la cantidad de citoquina antivirica encontrada en el suero del raton tratado con respecto a esa cantidad en los ratones no tratados identifica al compuesto del ensayo como inhibidor de PD-1. Alternativamente, el tftulo vmico (por ejemplo, tttulo vmico en suero) se puede determinar antes y despues del tratamiento con el compuesto de prueba.
Ejemplo 7: Chimpances como modelo para la inmunoterapia de la infeccion persistente por VHC
Los chimpances proporcionan un modelo de persistencia del VHC en los seres humanos. Los defectos en la inmunidad de los linfocitos T que conducen a una persistencia del virus durante toda la vida incluyen
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tanto un deficit de los linfocitos T CD4+ coadyuvantes espedficos del VHC como una actividad alterada de los linfocitos T CD8+ efectores. Los chimpances con una infeccion persistente son tratados con anticuerpos contra CTLA-4, PD-1 o una combinacion de ambos. Se determina la eficacia del bloqueo de las rutas inhibidoras, combinada con la vacunacion empleando protemas del VHC no estructurales y estructurales recombinantes, asf como el hecho de si estas estrategias pueden mejorar la frecuencia y longevidad de los linfocitos T de memoria de virus espedfico. El defecto de la inmunidad de los linfocitos T es exclusivamente espedfico del VHC en los chimpances y los seres humanos que sufren una infeccion persistente. La sangre y el dgado de los chimpances infectados son examinados para determinar la expresion de CTLA-4, PD-1, BTLA y sus ligandos, asf como la presencia de linfocitos Treg. La actividad antivmca se puede entonces restaurar administrando a los chimpances anticuerpos monoclonales humanizados que bloquean las senales a traves de estas moleculas.
Los chimpances que sufren una infeccion persistente son tratados con anticuerpos aCTLA-4 humanizados (MDX-010, Medarex) o anticuerpos aPD-1. La dosis inicial de MDX-010 es de 0,3 mg/kg seguida dos semanas mas tarde por 1,0 mg/kg y posteriormente por 3,10, 30 mg/kg a intervalos de tres semanas. Despues del tratamiento con anticuerpos para las moleculas coinhibidoras, se determinaran las respuestas inmunitarias humorales y celulares, asf como la carga de ARN de VHC. Se tomaran muestras en las semanas 1, 2, 3, 5 y 8, y posteriormente a intervalos mensuales. Las muestras incluyen: 1) suero para el analisis de transaminasas, autoanticuerpos, anticuerpos neutralizantes para el VHC y respuestas de las citoquinas, 2) plasma para la carga vmca y la evolucion del genoma, 3) PBMC para las mediciones in vitro de la inmunidad, la funcion y expresion del receptor inhibidor/coestimulador, 4) dgado natural (sin fijar) para el aislamiento de ARN y linfocitos intrahepaticos, y 5) hfgado fijado (introducido en formalina/parafina) para la histologfa y el analisis inmunohistoqmmico. Los nodulos linfaticos regionales tambien son recogidos en dos o tres puntos temporales, para valorar la expresion de moleculas coinhibidoras y variantes alternativas mediante tecnicas moleculares y de inmunohistoqmmica. Los ensayos para evaluar la eficacia y la seguridad de estas terapias se realizaran como se describe en el presente.
Para determinar si la vacunacion con antfgenos del VHC potencia el efecto terapeutico de los anticuerpos para PD-1, los chimpances reciben el siguiente tratamiento: 1) inmunizacion intramuscular con glicoprotemas de recubrimiento recombinante El y E2 (en adyuvante MF59) y otras protemas (nucleo mas NS 3,4, y 5 formuladas con ISCOMS) en las semanas 0, 4 y 24; 2) inmunizacion intramuscular con la vacuna empleada en 1), pero administrada conjuntamente con anticuerpos aCTLA-4 (30 mg de cada/Kg de peso corporal, por via intravenosa en las semanas 0, 4, y 24 cuando se administra la vacuna); 3) identico a 2) salvo porque los anticuerpos aPD-1 (o BTLA) son sustituidos por los anticuerpos para CTLA- 4; 4) identico a los Grupos 2 y 3, salvo porque se utiliza una combinacion de anticuerpos para CTLA-4 y PD-1 (o BTLA) ademas de la vacuna. Las respuestas de los linfocitos B y T espedficos para el VHC se controlan a intervalos mensuales despues de la inmunizacion, durante un penodo de un ano.
Los marcadores examinados en el tetramero positivo de VHC y los linfocitos T totales de este analisis incluyen marcadores de diferenciacion (por ejemplo, CD45RA/RO, CD62L, CCR7, y CD27), activacion (por ejemplo, CD25, CD69, CD38, y hLA-DR), supervivencia/proliferacion (por ejemplo, bcl-2 y Ki67), potencial citotoxico (por ejemplo, granzimas y perforina), y receptores de citoquina (CD122 y CD127). Existe una correlacion interesante entre los niveles previos a la terapia de la quimioquina IP-10 y la respuesta a IFN-y PEG/ribavirina. Los niveles de IP-10 son medidos para investigar una potencial correlacion entre las rutas reguladoras negativas o las respuestas de los linfocitos T espedficos del VHC y los niveles de IP-10. La expresion de receptores inhibidores y ligandos en las PBMC se realizan mediante citometna de flujo.
Ejemplo 8: Inmunotincion de PD-1 en tejido linfoide reactivo
Materiales
Los materiales del caso se obtuvieron en el Brigham & Women's Hospita*l, Boston, MA, de conformidad con las polfticas institucionales. Todos los diagnosticos se basaron en las caractensticas histologicas e inmunofenotipicas descritas en el sistema de clasificacion de linfomas de la Organizacion Mundial de la Salud (Jaffe ES, et al. 2001) y en todos los casos el material de diagnostico fue revisado por un hematopatologo.
Inmunotinciones
La inmunotincion de PD-1 se realizo en secciones de tejido introducidas en parafina fijadas con formalina tras la recuperacion de antfgenos por microondas en 10 mM de tampon de citrato, pH 6.0 con un anticuerpo monoclonal contra PD-1 humano descrito anteriormente (2H7; 5), utilizando un metodo estandar indirecto de avidina-biotina-peroxidasa de rabano y desarrollo del color con diaminobencidina, tal y como se ha descrito anteriormente (Jones D, et al. 1999; Dorfman DM, et al. 2003). Los casos se consideraron inmunorreactivos para PD-1, si al menos el 25% de las celulas neoplasicas presentaba tincion positiva. La tincion de PD-1 se comparo con la del anticuerpo de control de isotipo de IgG de raton diluido con una concentracion de protema identica para todos los casos estudiados, a fin de confirmar la especificidad de la tincion.
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El anticuerpo monoclonal 2H7 para PD-1 se utilizo para la tincion de muestras introducidas en parafina y fijadas con formalina de tejido linfoide reactivo, timo y una serie de casos de trastornos linfoproliferativos de linfocitos T y linfocitos B. En las muestras de airftgdalas que presentaban cambios reactivos, incluyendo hiperplasia folicular, un subconjunto de linfocitos predominantemente pequenos de los centros germinales presentaba tincion citoplasmica para PD-1, mientras que las celulas positivas para PD-1 observadas en las zonas de los linfocitos T interfoliculares fueron poco frecuentes. El patron de tincion de PD-1 en los centros germinales fue practicamente identico al observado con un anticuerpo para CD3, un panmarcador de linfocitos T, mientras que un anticuerpo para CD20, un panmarcador de linfocitos B, tino la amplia mayona de los linfocitos B del centro germinal. Resultados similares se observaron en las secciones histologicas del nodulo linfatico reactivo y el bazo. No se observo ninguna tincion de PD-1 en el timo adulto.
Ejemplo 9: Inmunotincion de secciones de tejido introducidas en parafina procedentes de trastornos linfoproliferativos de linfocitos T y linfocitos B
Se estudiaron diversos trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B y T, cuyos resultados se resumen en la Tabla 1. Se examinaron 42 casos de trastornos linfoproliferativos de linfocitos B para detectar la expresion de PD-1, incluyendo casos representativos de linfoma linfoblastico/leucemia linfoblastica precursora de celulas B, asf como una serie de trastornos linfoproliferativos de linfocitos B maduros, incluyendo varios linfomas no Hodgkin de celulas B de origen folicular, incluyendo seis casos de linfoma folicular y siete casos de linfoma de Burkitt. Ninguno de los trastornos linfoproliferativos de celulas B presento tincion para PD-1. En algunos casos, habfa presente tejido linfoide reactivo no neoplasico y presento un patron de tincion de PD-1 similar al observado en las airftgdalas y otro tejido linfoide reactivo, como se ha senalado anteriormente.
De forma similar, en 25 casos de linfoma de Hodgkin, incluyendo 11 casos de linfoma de Hodgkin clasico y 14 casos de linfoma de Hodgkin de predominio linfocftico, las celulas neoplasicas no presentaron tincion para PD-1. Es interesante senalar que en los 14 casos de linfoma de Hodgkin de predominio linfocftico, los linfocitos T que rodeaban a las celulas L&H neoplasicas CD20-positivas fueron inmunorreactivos para PD-1, de forma similar al patron de tincion observado para los linfocitos T CD57+ en el linfoma de Hodgkin de predominio linfocftico. Estas celulas positivas para PD-1 eran un subconjunto de la poblacion total de linfocitos T CD3+ presente.
Se estudiaron diversos trastornos linfoproliferativos de linfocitos T para detectar la expresion de PD-1, cuyos resultados se resumen en la Tabla 1. Los casos de linfoma linfoblastico/leucemia linfoblastica precursora de celulas T, una neoplasia de celulas T inmaduras, fueron negativos para PD-1, al igual de las neoplasias de los linfocitos T perifericos, postfmicos, incluyendo casos de leucemia prolinfocftica de celulas T, linfoma de celulas T perifericas, linfoma anaplasico de celulas grandes sin especificar, y linfoma/leucemia de celulas T adultas. Por el contrario, los 19 casos de linfoma angioinmunoblastico conteman focos de celulas positivas para PD-1 que tambien eran inmunorreactivos para panmarcadores de linfocitos T como CD3. Las celulas positivas para PD-1 se encontraban constantemente en focos de redes de celulas dendrfticas foliculares (FDC) CD21+ expandidas, una caractenstica del linfoma angioinmunoblastico.
TABLA 1. Inmunotincion de PD-1 en trastornos linfoproliferativos.
Inmunotincion de PD-1
LPD de celulas B
0/42*
B-LL/LL
0/3
CLL
0/4
MCL
0/4
FL
0/6
MZL
0/3
HCL
0/3
DLBCL
0/6
BL
0/7
LPL
0/3
MM
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Linfoma de Hodgkin
0/25
Clasico
0/11
Nodular de predominio linfocttico
0/14**
LPD de celulas T
18/55
T-LL/LL
0/5
T-PLL
0/3
AIL
19/19
PTCL, sin especificar
0/14
ALCL
0/12
ATLL
0/3
Abreviaturas: B-LL/LL - Linfoma linfoblastico/leucemia linfoblastica precursora de celulas B; CLL - Leucemia linfocftica cronica; MCL - Linfoma de celulas del manto; FL - Linfoma folicular; MZL - Linfoma de zona marginal; HCL - Linfoma de celulas peludas; DLBCL - Linfoma difuso de celulas B grandes; BL - Linfoma de Burkitt; LPL -Linfoma linfoplasmacftico; MM - Mieloma multiple; T-LL/L - Linfoma linfoblastico/leucemia linfoblastica precursora de celulas T; T-PLL- Leucemia prolinfocftica de celulas T; AIL - Linfoma angioinmunoblastico; PTCL - Linfoma de celulas T perifericas, sin especificar; ALCL - Linfoma anaplasico de celulas grandes; ATLL- Linfoma/leucemia de celulas T adultas.
* numero de casos inmunorreactivos/numero total de casos
** las celulas positivas para PD-1 forman rosetas alrededor de las celulas L&H neoplasicas en 14/14 casos
Ejemplo 10: Metodos generales para el estudio de la expresion de PD-1 en linfocitos T CD8 humanos especificos del VIH
Los siguientes metodos se emplearon para realizar los experimentos detallados en los Ejemplos 11 a 14. Sujetos del estudio
Los participates del estudio con infeccion cronica por el VIH de tipo I, subtipo C, fueron reclutados de las clmicas para pacientes externos de los siguientes hospitales: McCord Hospital, Durban, Sudafrica y St.Mary's Hospital, Mariannhill, Sudafrica. Se obtuvo sangre periferica de 65 sujetos de esta cohorte. Ninguno de ellos habfa recibido terapia antirretroviral en el momento del analisis. Los sujetos fueron seleccionados para su inclusion basandose en sus alelos de HLA expresados adecuados para los 10 tetrameros de clase I construidos (vease mas abajo). La carga vmca media de la cohorte era de 42.800 copias de ARN del VIH-1/ml de plasma (rango 163 -750.000), y el recuento absoluto de CD4 medio era de 362 (rango de 129 - 1179). No se dispoma de informacion relativa a la duracion de la infeccion. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio, que fue aprobado por las juntas de revision institucional locales.
Construccion de anticuerpos para PD-1 y PD-L1
Los anticuerpos monoclonales para PD-L1 humano (29E.2A3, IgG2b de raton) y PD-1 (EH12, IgGl de raton) se prepararon como se ha descrito anteriormente y se ha demostrado que bloquean la interaccion de pD-1 con PD-L1.
Tetrameros de clase I del MHC
Para este estudio se emplearon 10 tetrameros de clase I del MHC del VIH, sintetizados como se ha descrito anteriormente (Airman JD, et al. 1996): A*0205 GL9 (p24, GAFDLSFFL; SEC. ID. N°: l), A*3002 KIY9 (Integrasa, KIQNFRVYY; SEC. ID. N°: 2), B*0801 DI8 (p24, DIYKRWH; SEC. ID. N°: 3), B*0801 FL8 (Nef, FLKEKGGL; SEC. ID. N°: 4), B*4201 RM9 (Nef, RPQVPLRPM; SEC. ID. N°: 5), B*4201 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEC. ID. N°: 6), B*4201 TL10 (Nef, TPGPGVRYPL; SEC. ID. N°: 7), B*4201 YL9 (RT, YPGIKVKQL; SEC. ID. N°: 8), B*8101 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEC. ID. N°: 9), y Cw0304 YL9 (p24, YVDRFFKTL; SEC. ID. N°: 10). Las estructuras de plasmidos que expresan A*0205, A*3002, y Cw*0304 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Eugene Ravkov y el Dr. John Airman, NJH Tetramer Core Facility, Atlanta, Georgia.
Tincion del tetramero de clase I del HLA y analisis fenotipico
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Las celulas mononucleares de la sangre periferica reden aislada (PBMC, 0,5 millones) fueron tenidas con tetramero durante 20 minutos a 37°C. Las celulas fueron entonces lavadas una vez con solucion tampon de fosfato (PBS), peletizadas y tenidas directamente con isotiocianato de fluorescerna (FITC) contra CD8 (Becton Dickinson), ficoeritrina contra PD-1 (clon EH12), y ViaProbe (Becton Dickinson). Las celulas fueron incubadas durante 20 minutos a temperature ambiente, lavadas una vez con PBS y resuspendidas en 200 pl PBS con un 1% de paraformaldehfdo e introducidas en un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACSCalibur, Becton Dickinson). Se introdujeron un mrnimo de 100.000 casos en el FACSCalibur.
Ensayos de proliferacion de CFSE
Un millon de PBMC recien aisladas fueron lavadas dos veces con PBS, peletizadas y resuspendidas en 1 ml de 0,5 pM carboxifluorescein diacetato, ester de sucinimidilo (CFSE, Molecular Probes) durante 7 minutos a 37°C. Las celulas fueron lavadas dos veces en PBS, resuspendidas en 1 ml de medio R10 (RPMI1640 suplementado con glutiationa, penicilina, estreptomicina y un 10% de suero fetal bovino [FCS]), y colocadas en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Los estudios iniciales revelaron que una concentracion final de 0,2 pg/ml del peptido produjo unas respuestas proliferativas optimas, por tanto esta fue la concentracion final del peptido en el pocillo utilizado para cada ensayo. Los pocillos de control negativo consistfan en PBMC en medio solamente, o PBMC en medio con anti-PD-L1 purificado (10 pg/ml), y los pocillos de control positivo fueron estimados con 10 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA). Tras seis dfas de incubacion en una incubadora a 37°C, las celulas se lavaron con 2 ml de PBS y se tineron con tetrameros de clase I de MHC conjugadas con PE, ViaProbe (Becton Dickinson), y anticuerpos contra CD8-APC. Las celulas se introdujeron en un FACSCalibur y se analizaron con el software CellQuest® (Becton Dickinson). Las celulas se introdujeron en los linfocitos CD8+ de ViaProbe". La cantidad de veces que se incrementaron las celulas de tetramero positivo se calculo dividiendo el porcentaje de celulas de tetramero positivo de CD8+ en presencia del peptido por el porcentaje de celulas de tetramero positivo de CD8+ en ausencia de estimulacion del peptido.
Analisis estadistico
La correlacion de Spearman, el test de Mann-Whitney, y analisis de tests t emparejados se realizaron utilizando GraphPad Prism Version 4.0a. Todos los tests ternan dos colas y los valores de p de p<0,05 se consideraron significativos.
Ejemplo 11: Expresion de PD-1 en los linfocitos T CD8 espedficos del VIH
Un grupo de 10 tetrameros de clase I de MHC especificos para los epftopos de linfocitos T CD8 del VIH-1, subtipo C fueron sintetizados, basandose en los alelos de HLA prevalentes y los epftopos diana frecuentes en Gag, Nef, integrasa y RT (Kiepiela P, et al. 2004), permitiendo una visualizacion directa de la expresion de superficie de PD-1 en estas celulas. Se realizo una tipificacion de HLA de alta resolucion en toda la cohorte y se selecciono un subconjunto de 65 personas que no habfan recibido terapia antirretroviral previa para el estudio, basandose en la expresion de alelos de HLA pertinentes. Se examinaron un total de 120 epftopos individuales y la tincion ex vivo de PD-1 de celulas de tetramero positivo del VIH se muestra en la Figura 5A. La expresion de PD-1 fue rapidamente evidente en estas celulas de tetramero positivo y fue significativamente superior que en la poblacion total de linfocitos T CD8 para los mismos individuos (p<0,0001); a su vez, la expresion de PD-1 tanto en los linfocitos T CD8 de tetramero positivo como en la poblacion total de linfocitos T CD8 fue significativamente mayor que en los controles seronegativos para el VIH (Figura 5B). Para ocho de los 10 tetrameros testados, al menos se identifico a una persona en la que el nivel de expresion sobre las celulas CD8 de antfgeno espedfico fue del 100% (Figura 5C). Las PBMc de 3 a 25 individuos fueron tenidas para cada respuesta del tetramero del VIH, con unos niveles de expresion de PD-1 medios de entre el 68% y el 94% de las celulas de tetramero positivo (Figura 5C). Estas conclusiones fueron tambien confirmadas mediante un analisis de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de PD-1 tanto en las celulas de tetramero positivo como en la poblacion total de linfocitos T CD8 (Figura 5B, C).
A continuacion se determino si existfan evidencias de diferencias espedficas de los isotopos en terminos de niveles de expresion de PD-1 en las personas con multiples respuestas detectables. De las 65 personas examinadas, 16 individuos ternan entre 3 y 5 respuestas positivas al tetramero cada una. La expresion de PD-1 fue practicamente identica y se aproximo al 100% para cada respuesta analizada para tres de los 16 sujetos; no obstante, los otros 13 individuos presentaban patrones diferentes de expresion de PD-1 dependiendo del epftopo (Figura 5D). +Estos datos indican que la expresion de PD-1 se puede expresar diferencialmente en los linfocitos T CD8 contemporaneos espedficos del epftopo de una sola persona, lo que quizas concuerda con los datos recientes que indican diferencias espedficas del epftopo en la eficacia antivftica (Tsomides TJ, et al. 1994; Yang O, et al. 1996; Loffredo JT, et al. 2005).
Ejemplo 12: La relacion entre la expresion de PD-1 y la progresion de la enfermedad del VIH
Se determino la relacion entre la expresion de PD-1 en linfocitos T CD8 espedficos del VIH y la carga vftica plasmatica y los recuentos de CD4, siendo ambos indicadores de la progresion de la enfermedad del VIH. En lrnea con estudios anteriores, la relacion entre el numero de celulas de tetramero positivo y la carga vftica o el recuento de CD4 no demostro ninguna correlacion significativa (Figura 6A, B). Por el
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contrario, existian importantes correlaciones positivas con la carga vmca y tanto con el porcentaje como con la MFI de la expresion de PD-1 en las celulas de tetramero positivo del VIH (p=0,0013 y p<0,0001, respectivamente; Figura 6A). Tambien existian correlaciones inversas entre el recuento de cD4 y tanto el porcentaje como la MFI de PD-1 en las celulas de tetramero positivo del VIH (p=0,0046 y p=0,0150, respectivamente; Figura 6B). Puesto que los tetrameros testados probablemente representan solamente una fraccion de la poblacion de linfocitos T CD8 espedficos del VIH en estos sujetos, la relacion entre la expresion de PD-1 en todas las celulas CD8 y estos parametros tambien se examino. Se detectaron correlaciones positivas significativas entre la carga vmca y tanto el porcentaje como la MFI de la expresion de PD-1 sobre la poblacion total de linfocitos T CD8 (p=0,0021 y p<0,0001, respectivamente; Figura 6C), y tambien se observaron correlaciones inversas entre el recuento de CD4 y tanto el porcentaje como la MFI de la expresion de PD-1 sobre la poblacion total de linfocitos T CD8 (p=0,0049 y p=0,0006, respectivamente; Figura 6D). En este mismo grupo, la expresion de PD-1 sobre los linfocitos T CD8 espedficos de CMV se testo en cinco sujetos y el nivel de expresion de PD-1 fue significativamente inferior en estas celulas en comparacion con los linfocitos T CD8 espedficos del VIH (media del 23% de PD-1 positivo de tetramero positivo de CMV, datos no mostrados) y no fue diferente a la de los linfocitos T CD8 en general en esos mismos individuos, lo que indica que una elevada expresion de PD-1 no es una caractenstica uniforme de todos los linfocitos T CD8 de virus espedfico. Estos datos sugieren que unas cantidades crecientes de antfgeno en la infeccion cronica por VIH se traducen en una expresion incrementada de PD-1 en los linfocitos T CD8 y son coherentes con los datos murinos sobre la infeccion cronica por LCMV, donde la expresion de PD-1 esta asociada con el agotamiento funcional de los linfocitos T CD8 (Barber DL, et al. 2005). Por otra parte, proporcionan la primera asociacion clara, en un gran estudio que incluye el analisis de multiples epttopos, entre los linfocitos T CD8 espedficos del VIH y la carga vmca o el recuento de CD4.
Ejemplo 13: La relacion entre la expresion de PD-1 y la funcion y el estado de memoria de los linfocitos T CD8
La expresion de PD-1 se analizo a continuacion en el contexto de una serie de marcadores fenotfpicos adicionales asociados con la funcion y el estado de memoria de los linfocitos T CD8, incluyendo CD27, CD28, CD45RA, CD57, CD62L, CD127, CCR7, perforina, granzima B, y Ki67 (Figura 7). Las tinciones representativas para estos marcadores en las celulas de tetramero positivo B*4201 TL9 de un individuo se muestran en la Figura 7A y los datos agregados de los 13 sujetos se muestran en la Figura 7B. Estos estudios se limitaron a aquellas respuestas del tetramero que eran superiores a un 95% de PD-1 positivo, dado que la citometna de flujo multiparametro de mas de cuatro colores no estaba disponible en KwaZulu Natal. Las celulas de PD-1 positivo de tetramero positivo del VIH expresan elevados niveles de CD27 y granzima B, niveles muy reducidos de CD28, CCR7, y Ki67 intracelular, niveles bajos de CD45RA y perforina, asf como niveles intermedios de CD57 y CD62L (Figura 7B). Estos datos indican que los linfocitos T de PD-1 positivo espedficos para el VIH presentan un fenotipo de memoria efector/efector, y son coherentes con informes previos de maduracion sesgada de linfocitos T CD8 espedficos del VIH (Champagne P., et al. 2001; Appay V, et al. 2002; Hess C, et al. 2004). Por otra parte, la secuenciacion del virus se realizo para determinar si estas celulas estaban evadiendo al sistema inmunitario (Brown JA, et al. 2003). De 45 de estas respuestas de tetramero positivo evaluadas, los epttopos vmcos de solo cinco eran diferentes de la secuencia de consenso sudafricana de subtipo C (datos no mostrados), lo que indica que estas celulas ejercen escasa presion de seleccion in vivo.
Experimentos previos con ratones utilizando el modelo del LCMV demostraron que el bloqueo in vivo de la interaccion PD-1/PD-LA mediante la infusion de anticuerpos de bloqueo contra PD-L1 provoca una funcionalidad mejorada de los linfocitos T CD8 espedficos de LCMV, medida por la produccion de citoquinas, la capacidad citotoxica, la capacidad proliferativa y, mas sorprendentemente, la reduccion de la carga vmca (Barber DL, et al. 2005).
Ejemplo 14: Efecto del bloqueo de la ruta de PD-1/PD-L1 sobre la proliferacion de linfocitos T CD8 espedficos del VIH
Dado que los linfocitos T CD8 espedficos del VIH tambien presentan una capacidad proliferativa mermada (Migueles SA, et al. 2002; Lichterfeld M, et al. 2004), se determino si el bloqueo de PD-1/PD-L1 podna mejorar esta funcion in vitro. Los datos representativos de un individuo de B*4201 positivo se muestran en la Figura 8A. La incubacion de PBMC etiquetadas con CFSE recien aisladas con medio solamente o medio con anticuerpo contra PD-L1 resulto en el mantenimiento de una poblacion de linfocitos T CD8 espedficos de B*4201-TL9 (1,2% de linfocitos T CD8) que permanedan en el CFSE10 despues de seis dfas en cultivo. La estimulacion de PBMC etiquetadas con CFSE durante seis dfas con peptido TL9 solamente resulto en un incremento de 4,8 veces las celulas de tetramero positivo de CFSE10 B*4201 TL9, mientras que la estimulacion de PBMC etiquetadas con CFSE con peptido TL9 en presencia de anticuerpo de bloqueo contra PD-L1 intensifico aun mas la proliferacion de celulas espedficas de TL9, resultando en un incremento de 10,3 veces las celulas de tetramero positivo. Los ensayos de proliferacion de CFSE se realizaron en 28 muestras en presencia y ausencia de anticuerpo de bloqueo purificado contra PD-L1 humano. Se observo un aumento significativo de la proliferacion de linfocitos T CD8+ espedficos del VIH en presencia del peptido mas anticuerpo de bloqueo contra PD-L1, en comparacion con la cantidad de proliferacion tras la estimulacion con peptido solamente (Figura 8B;
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p=0,0006, test t emparejado). Este incremento multiplicado de las celulas de tetramero positivo en presencia de anticuerpo de bloqueo contra PD-L1 vario entre individuos y entre epttopos dentro de un individuo dado (Figura 8C), lo que sugiere, una vez mas, diferencias espedficas del epftopo en el grado de agotamiento funcional de estas respuestas.
OTRAS REALIZACIONES
A pesar de que la invencion se ha descrito conjuntamente con las descripciones detalladas de la misma, la anterior descripcion tiene por objeto ilustrar y no limitar el alcance de la invencion, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgacion se describira ahora por referencia a las siguientes clausulas:
1. Un metodo para aliviar o prevenir un smtoma de una infeccion persistente o cancer que consiste en administrar a un sujeto que lo requiera un compuesto que reduce la actividad o expresion de un polipeptido de muerte programada (PD-1) en dicho sujeto.
2. El metodo de la clausula 1, donde dicha infeccion persistente es una infeccion viral, una infeccion bacteriana, una infeccion fungica, una infeccion por micoplasma o una infeccion parasitaria.
3. El metodo de la clausula 2, donde dicha infeccion viral es una infeccion por un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotropico de celulas T humanas (HTLV), un herpesvirus, un virus de Epstein-Barr o un virus del papiloma humano.
4. El metodo de la clausula 2, donde dicha infeccion parasitaria es malaria.
5. El metodo de la clausula 2, donde dicha infeccion bacteriana es tuberculosis.
6. El metodo de la clausula 1, donde dicho cancer es linfoma angioinmunoblastico o linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfodtico.
7. El metodo de la clausula 1, donde dicho compuesto reduce la expresion o actividad de un ligando PD-1 (PD-L1) o un ligando PD de tipo 2 (PD-L2).
8. El metodo de la clausula 1, donde dicho compuesto reduce la interaccion entre PD-1 y PD-L1 o la interaccion entre PD-1 y PD-L2.
9. El metodo de la clausula 1, donde dicho compuesto aumenta la actividad citotoxica de los linfocitos T en dicho sujeto.
10. El metodo de la clausula 9, donde dicha actividad citotoxica de los linfocitos T es la produccion de citoquina, la proliferacion de linfocitos T o la eliminacion de un agente infeccioso.
11. El metodo de la clausula 10, donde dicho agente infeccioso es un virus, una facteria, un hongo, un mycoplasma o un parasito.
12. El metodo de la clausula 9, donde dicho linfocito T es un linfocito T espedfico del cancer.
13. El metodo de la clausula 10, donde dicha citoquina es IFN[gamma], TNF[alpha], o IL-2.
14. El metodo de la clausula 1, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, un anticuerpo contra PD-L2, una molecula de ARNi contra PD-1, una molecula de ARNi contra PD- L1, una molecula de ARNi contra PD- L2, un ARN antisentido contra PD-1, un ARN antisentido contra PD- Ll, un ARN antisentido contra PD-L2, una protema dominante negativa de PD-I, una protema dominante negativa de PD-L1, o una protema dominante negativa de PD-L2.
15. El metodo de la clausula 12, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo desinmunizado o una protema de fusion de Ig.
16. El metodo de la clausula 1, donde dicho compuesto es una molecula pequena.
17. El metodo de la clausula 1, que consiste ademas en la administracion de una vacuna a dicho sujeto.
18. El metodo de la clausula 17, donde dicha vacuna comprende un adyuvante o una dosis de refuerzo principal.
19. El metodo de la clausula 1, que consiste ademas en la administracion de un segundo compuesto a dicho sujeto.
20. El metodo de la clausula 19, donde dicho segundo compuesto es un compuesto antiviral, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antineoplasico o un analgesico.
21. El metodo de la clausula 19, donde dicho segundo compuesto reduce la expresion o la actividad del antfgeno 4 asociado al linfocito T citotoxico (CTLA-4) o del atenuador de los linfocitos B y T (BTLA).
22. El metodo de la clausula 19, donde dicho segundo compuesto reduce el volumen de las celulas cancerosas.
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23. EI metodo de la clausula 19, donde dicho segundo compuesto es un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra BTLA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, un anticuerpo contra B7-I, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3 o un anticuerpo contra B7-H4.
24. EI metodo de la clausula 1, donde dicho sujeto es un ser humano.
25. Un metodo para aliviar o prevenir un smtoma de una infeccion persistente o cancer que consiste en la administracion a un sujeto que lo requiere de un compuesto que reduce la actividad o expresion de un miembro de la familia similar a CD28, donde dicho miembro de la familia similar a CD28 se selecciona del grupo compuesto por PD-1, CTLA-4, BTLA y un fragmento o variante funcional de los mismos.
26. El metodo de la clausula 25, donde dicha infeccion persistente es una infeccion viral.
27. El metodo de la clausula 26, donde dicha infeccion viral es una infeccion por un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotropico de celulas T humano (HTLV), un herpesvirus, un virus de Epstein-Barr o un virus del papiloma humano.
28. El metodo de la clausula 25, donde dicho compuesto aumenta la actividad citotoxica de los linfocitos T en dicho sujeto.
29. El metodo de la clausula 18, donde dicha actividad citotoxica de los linfocitos T es la produccion de citoquina, la proliferacion de linfocitos T o la eliminacion de un agente infeccioso.
30. El metodo de la clausula 25, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, un anticuerpo contra PD-L2, un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra BTLA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, o un anticuerpo contra B7-1, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3 o un anticuerpo contra B7-H4.
31. El metodo de la clausula 25, que consiste ademas en la administracion de una vacuna a dicho sujeto.
32. El metodo de la clausula 25, que consiste ademas en la administracion de un segundo compuesto a
dicho sujeto.
33. Un metodo para aliviar o prevenir un smtoma de una infeccion persistente o cancer en un sujeto que consiste en administrar a dicho sujeto un linfocito T de antigeno espedfico que se ha puesto en contacto con un compuesto que reduce la expresion o actividad de un polipeptido PD-1 en dicha celula.
34. El metodo de la clausula 33, donde al sujeto se le administra ademas un linfocito B de antigeno espedfico que se ha puesto en contacto con un compuesto que reduce la expresion o actividad de un polipeptido PD-1 en dicha celula.
35. El metodo de la clausula 33, donde dicho linfocito T procede de una fuente autologa.
36. El metodo de la clausula 33, donde dicho linfocito T se obtiene de un sujeto de la misma especie que
dicho sujeto.
37. El metodo de la clausula 33, donde dicho linfocito T se obtiene de un sujeto de una especie diferente que el sujeto que se va a tratar.
38. El metodo de la clausula 33, donde dicho linfocito T de antfgeno espedfico es espedfico para un antigeno viral, un antigeno bacteriano, un antfgeno fungico o un antigeno parasitario, o un antfgeno del cancer.
39. El metodo de la clausula 38, donde dicho antigeno viral es un antigeno de un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotropico de celulas T humano (HTLV), un herpesvirus, un virus de Epstein-Barr o un virus del papiloma humano.
40. Un metodo para aumentar la actividad citotoxica de un linfocito T que consiste en poner en contacto dicho linfocito T con un compuesto que reduce la actividad o expresion de un polipeptido PD-1.
41. El metodo de la clausula 40, donde dicha actividad biologica se reduce limitando la expresion o actividad de un ligando de PD-1 (PD-L1) o de un ligando de PD de tipo 2 (PD-2L).
42. El metodo de la clausula 40, donde dicho compuesto reduce la interaccion entre PD-1 y PD-L1 o la interaccion entre PD-1 y PD-L2.
43. El metodo de la clausula 40, donde dicha actividad citotoxica es la produccion de citoquina, la proliferacion de linfocitos T o la eliminacion de un agente infeccioso.
44. El metodo de la clausula 40, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, un anticuerpo contra PD-L2, una molecula de ARNi contra PD-1, una molecula de ARNi contra PD-L1, una molecula de ARNi contra PD- L2, un ARN antisentido contra PD-1, un ARN antisentido contra PD-L1, un ARN antisentido contra PD-L2, una protema dominante negativa de PD-I, una protema dominante negativa de PD-L1, o una protema dominante negativa de PD-L2.
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45. EI metodo de la clausula 40, que consiste ademas en poner en contacto dicha celula con un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, un anticuerpo contra PD-L2, un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra BTLA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, un anticuerpo contra B7-1, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3 o un anticuerpo contra B7-H4.
46. Un metodo para diagnosticar que un sujeto corre el riesgo de padecer o padece una infeccion persistente o cancer, que consiste en:
(a) proporcionar una muestra de dicho sujeto, donde dicha muestra comprende celulas inmunitarias; y (b) medir la expresion o actividad de PD-1 en dicha muestra de dicho sujeto, donde un aumento de la expresion o actividad de PD-1 en comparacion con dicha expresion o actividad en una muestra de control identifica que dicho sujeto padece o corre el riesgo de padecer una infeccion persistente o cancer.
47. Un metodo para seleccionar un tratamiento para un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer una infeccion persistente o cancer, que consta de los pasos siguientes:
(a) Proporcionar una muestra de dicho sujeto que contiene celulas inmunitarias;
(b) Medir la expresion o actividad de PD-1 en dichas celulas inmunitarias, donde un aumento de la expresion o actividad de PD-1 en comparacion con dicha expresion o actividad en una muestra de control identifica que dicho sujeto padece o corre el riesgo de padecer una infeccion persistente o cancer;
(c) Seleccionar un tratamiento para el sujeto para el que se ha diagnosticado que padece o corre el riesgo de padecer una infeccion persistente o cancer, donde dicho tratamiento comprende un compuesto que reduce la expresion o actividad de PD-1.
48. El metodo de la clausula 46 o 47, donde dicho paso (b) comprende ademas la identificacion de celulas inmunitarias de antfgeno espedfico, donde dicho antfgeno es un antfgeno viral, un antfgeno bacteriano, un antfgeno parasitario o un antfgeno fungico.
49. El metodo de la clausula 46 o 47, donde dicha muestra es una muestra de sangre, una biopsia de tejido o una muestra de medula osea.
50. El metodo de la clausula 46 o 47, donde dichas celulas de control se obtienen de un sujeto que no padece ni corre el riesgo de padecer una infeccion persistente o cancer.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que reduce la actividad o expresion de un polipeptido de muerte programada (PD-1) para su uso en un metodo para aliviar o prevenir un smtoma del cancer en un sujeto, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1, un anticuerpo contra PD-L1, una molecula de ARNi contra PD-1, una molecula de ARNi contra PD-L1, un ARN antisentido contra PD-1, o un ARN antisentido contra PD-L1; donde el cancer es un linfoma de Hodgkin nodular de predominio linfodtico.
  2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, donde dicho compuesto reduce la expresion o actividad de un ligando de PD-1 (PD-L1).
  3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1 o 2, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-1 o un anticuerpo contra PD-L1.
  4. 4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuepo humanizado, un anticuerpo desinmunizado o una protema de fusion de Ig.
  5. 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el metodo consiste ademas en administrar una vacuna de dicho sujeto, concretamente donde dicha vacuna comprende un adyuvante o una dosis de refuerzo principal.
  6. 6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el metodo consiste ademas en administrar un segundo compuesto a dicho sujeto.
  7. 7. El compuesto de la reivindicacion 6, donde dicho segundo compuesto es un compuesto antiviral, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifungico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antineoplasico o un analgesico.
  8. 8. El compuesto de la reivindicacion 6, donde dicho segundo compuesto reduce la actividad del antfgeno 4 asociado al linfocito T citotoxico (CTLA-4) o del atenuador de los linfocitos B y T (BTLA).
  9. 9. El compuesto de la reivindicacion 6, donde dicho segundo compuesto reduce el volumen de las celulas cancerosas.
  10. 10. El compuesto de la reivindicacion 6, donde dicho segundo compuesto es un anticuerpo contra CTLA-4, un anticuerpo contra BTLA, un anticuerpo contra CD28, un anticuerpo contra ICOS, un anticuerpo contra ICOS-L, o un anticuerpo contra B7-1, un anticuerpo contra B7-2, un anticuerpo contra B7-H3 o un anticuerpo contra B7-H4.
  11. 11. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho sujeto es un sujeto humano.
  12. 12. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicho compuesto reduce la actividad de PD-L1.
  13. 13. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o 12, donde dicho compuesto es un anticuerpo contra PD-L1.
  14. 14. El compuesto de la reivindicacion 1, donde el compuesto es un anticuerpo contra PD-1.
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