ES2609669T3 - Método para la determinación de variantes de secuencia de polipéptidos - Google Patents

Método para la determinación de variantes de secuencia de polipéptidos Download PDF

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Abstract

Un método para determinar un polipéptido con una secuencia de aminoácidos mutante, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) proporción de al menos dos muestras del polipéptido, b) incubación de cada una de las muestras con la misma proteasa, c) análisis de las muestras incubadas por un análisis de datos bidimensional utilizando una combinación de separación por cromatografía líquida en fase inversa y un análisis por espectrometría de masas y/o un análisis MS/MS, d) definición de la serie de datos obtenida con una muestra de la etapa c) como muestra de referencia y comparación de las series de datos obtenidas con las otras muestras de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia, por lo que cada diferencia de secuencia de aminoácidos con una relación de más de 3 de la intensidad de señal de espectro de la masa de muestra a la intensidad de señal de espectro de la masa de referencia es una mutación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido y determina con ello un polipéptido con una secuencia de aminoácidos mutante, en el que el ancho del marco m/z es igual o superior a 1,6 para la comparación de patrones.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para la determinacion de variantes de secuencia de polipeptidos
En el presente documento se expone un metodo para la determinacion de variantes de secuencia de un polipeptido que comprende una digestion tnptica del polipeptido, una separacion cromatografica de los fragmentos, espectrometna de masas de alta resolucion de los fragmentos separados y la determinacion de variantes de secuencia.
Antecedentes de la invencion
Las protemas desempenan un papel importante en la cartera medica de hoy en dfa. Para la aplicacion en seres humanos, cada protema terapeutica tiene que cumplir con criterios distintos. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmaceuticos en seres humanos, las caractensticas de la protema terapeutica tienen que caer dentro de ciertos lfmites y los subproductos que se acumulan durante el proceso de produccion tienen que eliminarse concretamente.
Cualquier cambio o modificacion de la composicion y la secuencia de aminoacidos, respectivamente, de un polipeptido, que difiere de la forma deseada, se definen como una variante de secuencia. Esta puede ser una mutacion en los acidos nucleicos resultante de un cambio de la secuencia de aminoacidos, modificaciones no deseadas post-traduccionales (MPTs) o variantes de polipeptidos aberrantes (formas acortadas o alargadas).
Para garantizar la consistencia del polipeptido y evitar errores, tienen que ser objeto de evaluacion la influencia de los mecanismos biologicos (por ejemplo, fidelidad de replicacion, precision de la transcripcion y traduccion) y los procesos tecnicos (transfeccion y amplificacion en el desarrollo de la estirpe celular o condiciones fermentativas) en presencia de variantes de secuencia. Asimismo tiene que proporcionarse un metodo que proporciona una alta sensibilidad para hallar e identificar posibles variantes de secuencia.
Por ejemplo, los procesos de desarrollo de estirpes celulares pueden dar lugar a variantes de secuencia que pueden volverse cnticas para los interruptores de la estirpe celular y los cambios de clones, respectivamente. La fermentacion en una escasez inesperada de ciertos componentes de medios en los sustratos alimenticios y las operaciones posteriores de transformacion (OPT) pueden causar variantes de secuencia o la modificacion post- traduccional de aminoacidos, respectivamente. Por lo tanto, la presencia de variantes de secuencia tiene que comprobarse para confirmar la homogeneidad y la consistencia del producto.
Barnes, C.A.S, et al., Mass. Spectrom. Rev. 26 (2007) 370-388 exponen aplicaciones de espectrometna de masas para la caracterizacion estructural de los productos farmaceuticos proteicos recombinantes. La espectrometna de masas para la caracterizacion estructural de anticuerpos terapeuticos es descrita por Zhang, Z., et al., en Mass. Spectrom. Rev. 28 (2009) 147-176. Yu, X. C., et al. (Anal. Chem. 81 (2009) 9282-9290) describen la identificacion de traducciones erroneas de serina a asparagina espedficas de codon en los anticuerpos monoclonales recombinantes por espectrometna de masas de alta resolucion. La determinacion de la oxidacion proteica por espectrometna de masas y la transferencia de metodos para el control de calidad son descritas por Houde, D., et al., J. Chromatogr. 1123 (2006) 189-198.
Sumario de la invencion
En el presente documento se proporciona un metodo para la determinacion de variantes de secuencia de aminoacidos, es decir, las mutaciones en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido. Indirectamente, con ello, tambien pueden determinarse variantes de secuencia de acidos nucleicos.
Con mas detalle, en el presente documento, se describe un metodo para determinar mutaciones en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido (producido), que comprende las siguientes etapas:
a) proporcion de una muestra de un polipeptido (producido), b) incubacion del polipeptido en la muestra con una proteasa, c) realizacion de un analisis bidimensional utilizando cromatograffa de fase inversa acoplada con una espectrometna de masas de alta resolucion (FT-ICR/FT-orbitrap) y analisis MS/MS de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos de los peptidos, d) evaluacion de los datos comparando las series de datos de LC-MS obtenidas para las muestras en paralelo con la serie de datos de una muestra de referencia, mediante la busqueda de diferencias de las intensidades de senal en los tiempos de retencion dados y por la evaluacion de las senales diferenciales con respecto a las mutaciones en la secuencia de aminoacidos. La muestra de referencia para la evaluacion de datos (etapa d) puede ser un patron bien caracterizado o una de las muestras a analizar.
Un primer aspecto, descrito en el presente documento, es un metodo para determinar una variante de secuencia de aminoacidos, concretamente, una mutacion en los aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
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a) proporcion de al menos dos muestras del polipeptido,
b) incubacion de cada una de las muestras con una proteasa,
c) analisis de las muestras incubadas por un analisis de datos bidimensional que comprende la combinacion de separacion por cromatograffa en fase inversa con un analisis por espectrometna de masas y/o un analisis MS/MS,
d) definicion de la serie de datos obtenida con una muestra de la etapa c) como muestra de referencia y comparacion de las series de datos obtenidas con las otras muestras de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia, por lo que cada diferencia determinada es una variante (mutacion) de secuencia de aminoacidos del polipeptido y determina con ello una variante de secuencia de aminoacidos del polipeptido.
Otro aspecto, descrito en el presente documento, es un metodo para determinar una mutacion en la secuencia de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) proporcion de al menos dos muestras del polipeptido,
b) incubacion de cada una de las muestras con una proteasa,
c) analisis de las muestras incubadas por un analisis de datos bidimensional que comprende la combinacion de separacion por cromatograffa en fase inversa con un analisis por espectrometna de masas y/o un analisis MS/MS,
d) definicion de la serie de datos obtenida con una muestra de la etapa c) como muestra de referencia y comparacion de las series de datos obtenidas con las otras muestras de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia, por lo que cada diferencia determinada es una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido y determina con ello una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido.
o las siguientes etapas:
a) proporcion de al menos una muestra del polipeptido,
b) incubacion de la muestras con una proteasa,
c) analisis de la muestra incubada por un analisis de datos bidimensional que comprende la combinacion de separacion por cromatograffa en fase inversa con un analisis por espectrometna de masas y/o un analisis MS/MS,
d) comparacion de la serie de datos obtenida con la muestra de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia determinada con un metodo descrito en las etapas b) y c), por lo que cada diferencia determinada es una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido y determina con ello una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido.
Las muestras proporcionadas pueden proceder de diferentes clones obtenidos por transfeccion transitoria de un acido nucleico que codifica el polipeptido, o de estirpes celulares transfectadas estables, o de estirpes celulares de diferente edad, o diferentes escalas de fermentacion, o la fermentacion se realiza en condiciones diferentes. En una realizacion se proporcionan entre 2 y 10.000 muestras, en otra realizacion se proporcionan entre 2 y 1.000 muestras, y en una realizacion adicional se proporcionan entre 2 y 348 muestras.
En una realizacion, el metodo comprende ademas una etapa:
e) determinacion de la identidad y la posicion de la variante (mutacion) de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos por fragmentacion y analisis de datos de MS/MS.
En otra realizacion, se proporciona una muestra adicional que comprende el polipeptido adicionado en el polipeptido con una variante (mutacion) de secuencia de aminoacidos conocida. La muestra adicional se incuba, se analiza y compara ademas de las muestras proporcionadas. En una realizacion, el analisis se realiza a un valor de pH inferior a 8,0 y a una temperatura inferior a 40 °C. Estas condiciones reducen el metodo inducido por los cambios de la secuencia de aminoacidos. En una realizacion adicional, el valor del pH oscila de pH 6,5 a menos de pH 8,0. En otra realizacion, la temperatura oscila de 20 °C a 40 °C. En otra realizacion, la muestra se proporciona en un tampon tris (hidroximetil)aminometano para la digestion enzimatica. En aun otra realizacion, la incubacion de las muestras con una proteasa es una escision del polipeptido por la proteasa en fragmentos de 3 a 60 restos de aminoacidos de longitud.
En una realizacion, la comparacion en la etapa d) se realiza con los datos de uno, o una parte o la totalidad de los estados de carga de MS. En una realizacion adicional, la comparacion comprende la superposicion del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) de la muestra de referencia y cada una de las otras muestras, por lo que se calcula la relacion de intensidades de todas las masas superpuestas y alineadas, y los picos con una relacion superior a 10 tienen que considerarse como variante de secuencia de aminoacidos (mutacion en la secuencia de aminoacidos). En aun una realizacion adicional, la comparacion comprende ademas la comparacion del patron pepffdico de fragmentos proteoffticos de traduccion de ADN del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) de la muestra. Para la busqueda de la variante de secuencia de aminoacidos (mutacion en la secuencia de aminoacidos) se permiten sustituciones, deleciones e inserciones de
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base unicas de la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido investigado, se obtienen secuencias traducidas in silico y digeridas in silico con la misma enzima que se utiliza en el metodo. Posteriormente, las variantes de secuencia de aminoacidos (mutaciones en la secuencia de aminoacidos) se identifican comparando el espectro de fragmentos determinados experimentalmente por MS/MS de un peptido con los espectros de MS/MS teoricos del peptido derivado del proceso in silico que se ha descrito previamente.
En una realizacion adicional, el polipeptido es una inmunoglobulina completa, un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina. En otra realizacion, el polipeptido de las muestras se reduce y los residuos exentos de sulfhidrilo se carboximetilaron antes de la incubacion con la proteasa.
Todas las muestras se tratan por separado, es decir, de forma individual y no como mezclas, en las etapas de acuerdo con los metodos que se describen en el presente documento. En una realizacion, las muestras se tratan individualmente en la etapa de reduccion, en la etapa de incubacion, y en la etapa de analisis. En una realizacion, el metodo es un metodo para la determinacion de alto rendimiento.
En una realizacion, las muestras se incuban durante 16 horas a 18 horas con la proteasa e inmediatamente despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico. En una realizacion adicional, las muestras se incuban durante 4 horas con la proteasa e inmediatamente despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico.
Otro aspecto que se describe en el presente documento es un metodo para producir un polipeptido que comprende la etapa de seleccionar una celula que produce un polipeptido, por medio de la cual el polipeptido comprende el menor numero y la menor relacion, respectivamente, de variantes de secuencia de aminoacidos, es decir, mutaciones en la secuencia de aminoacidos, de todas las muestras procesadas. Otro aspecto que se describe en el presente documento es un metodo para producir un polipeptido que comprende la etapa de seleccionar una celula que produce un polipeptido, por medio de la cual el polipeptido comprende una mutacion (variantes) en la secuencia de aminoacidos no detectable. En una realizacion, el menor numero y la menor relacion, respectivamente, de las variantes de secuencia de aminoacidos (mutaciones en la secuencia de aminoacidos) se determina con respecto a una muestra de referencia o a una secuencia de aminoacidos predeterminada.
En una realizacion, el metodo comprende las etapas de:
a) proporcion de al menos dos celulas que comprenden un acido nucleico que codifica el polipeptido,
b) deposito y cultivo individual de las celulas,
c) realizacion con las celulas depositadas de forma individual de un metodo que se describe en el presente documento,
d) seleccion de una celula que produce un polipeptido, por medio de la cual el polipeptido comprende el menor numero, y/o la menor relacion de variantes de secuencia de aminoacidos (mutaciones en la secuencia de aminoacidos),
e) cultivo de la celula seleccionada,
f) produccion de un polipeptido por recuperacion del polipeptido de la celula o medio de cultivo.
En una realizacion, la celula proporcionada se selecciona entre una celula transitoriamente transfectada, o una celula transfectada estable, o una celula inmunitaria obtenida a partir de un animal tras la inmunizacion.
Descripcion detallada de la invencion
Las protemas terapeuticas, por ejemplo, producidas por metodos recombinantes, pueden ser una mezcla de moleculas con secuencias de aminoacidos algo diferentes, por lo que la diferencia reside no solo en el extremo C- o N-terminal de la secuencia de aminoacidos sino tambien en la secuencia de aminoacidos (por ejemplo, mutaciones en los aminoacidos, intercambios, oxidacion o formacion por tioeter). Las mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos pueden detectarse con un metodo descrito en el presente documento mediante la metodologfa de mapeo de peptidos. Estas mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos pueden surgir, por ejemplo, i) durante la replicacion de acidos nucleicos por errores de la polimerasa de acido nucleico, o ii) durante la transcripcion de acidos nucleicos por errores de la ARN polimerasa o el aparato de corte y empalme, o iii) durante la traduccion proteica por adquisicion del ARNt incorrecto o por ARNts cargados con el aminoacido incorrecto, o iv) como modificacion post-traduccional no deseada o eliminacion incompleta del peptido senal. Por lo tanto, una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos puede ser resultado del proceso de integracion/amplificacion del ADN que codifica el polipeptido respectivo, o de la replicacion del acido nucleico codificante, o la transcripcion que incluye la modificacion post-transcripcional (por ejemplo, durante el corte y empalme del ARNm o edicion del ARN) o durante la traduccion. Las variantes de aminoacidos resultantes de una modificacion de restos de aminoacidos individuales despues de la liberacion de la molecula del ribosoma se definen como una modificacion post- traduccional no necesariamente indeseada y no son una mutacion (variante) como se denomina en el presente documento.
A partir de la literatura se sabe que las enzimas eucariotas (asf como procariotas) tienen una tasa media de error de:
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replicacion:
-1 por 108 a 1012 bases de acido nucleico replicadas por polimerasas normales,
-1 por 101 a 103 bases de acidos nucleicos replicadas por polimerasas propensas a error;
transcripcion: 1 por 104 a 105 pares de bases de acidos nucleicos transcritos;
traduccion: 1 por 103 a 104 restos de aminoacidos incorporados.
Esto demuestra, por una parte, que las tasas de error durante la etapa de replicacion por induccion de polimerasas propensas a error y, por otra parte, durante la traduccion, tienen la mayor influencia, sobre todo, en combinacion con el "estres" ejercido sobre las celulas, por ejemplo, durante el proceso de seleccion tras la transfeccion o durante el crecimiento en presencia de un agente de seleccion. Adicionalmente, las mutaciones durante la traduccion son acontecimientos estadfsticos mientras que las mutaciones durante la replicacion se originan en acontecimientos unicos con posiciones/emplazamientos estables. Es decir, los errores durante la replicacion se produciran en una posicion de las mutaciones (diferencias) en la secuencia de aminoacidos espedfica y reproducible, mientras que los errores de transcripcion y traduccion pueden producirse en las mutaciones (variantes) en los aminoacidos espedficos sin posicion y una distribucion estadfstica de estos cambios sobre la molecula completa. Por ultimo, tambien el proceso de transfeccion que incluye la integracion en el genoma para obtener la celula recombinante da como resultado hasta un 1 % de ADN cambiado (vease, por ejemplo, Lebkowski, J. S, et al., Mol. Cell Biol. 4 (1984) 1951-1960). Esto resultara en una mutacion (variante) espedfica de la posicion antes de la replicacion con una frecuencia de hasta 1:100.
En el presente documento se describe una preparacion de la muestra, metodo de recogida y evaluacion de datos utilizando el analisis de datos bidimensional que comprende un mapeo de peptidos basados en LC-MS/MS con una cobertura de la secuencia lo mas alta posible con el fin de demostrar la composicion correcta, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido y la cuantificacion relativa de secuencias de aminoacidos potencialmente mutantes (variantes) frente a secuencias de aminoacidos no mutantes (no variantes). Cabe senalar que el metodo que se describe en el presente documento utiliza protemas fragmentadas en vez de protemas intactas o completas para el analisis. Esto aumenta la sensibilidad del metodo con respecto a la deteccion de niveles muy bajos de mutaciones. Esto tambien evita la interferencia y la necesidad de la distincion y la resolucion de masas isobaricas de posibles mutaciones.
Para la determinacion de una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos, son posibles dos posiciones iniciales diferentes:
Caso A: En caso de que una muestra caracterizada se encuentre disponible, esta puede elegirse como muestra de referencia y la muestra a determinar puede compararse con esta: el patron peptfdico conocido y la asignacion de picos se utiliza como referencia y cada diferencia detectada en la muestra puede ser una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos. Dicho material de referencia puede ser un material de una estirpe celular bien caracterizada, por ejemplo, un proceso de fermentacion definido.
Caso B: En caso de que ninguna muestra caracterizada se encuentre ya disponible
a) para la asignacion de picos, puede realizarse una caracterizacion completa de una muestra y el Caso A puede aplicarse/seguirse (Caso B-1); o
b) una muestra se elige arbitrariamente como muestra de referencia (Caso B-2) y las muestras restantes se comparan con esta; esto incluye la determinacion de las diferencias, es decir mutaciones, tanto en la muestra de referencia como en las muestras sin referencia.
La muestra de referencia puede obtenerse de una estirpe celular diferente, o generacion de la estirpe celular, o escala de cultivo, u obtenerse en condiciones de cultivo cambiadas/diferentes (tal como, por ejemplo, composicion del medio).
En una realizacion, en caso de tener que analizarse un gran numero de muestras, puede elegirse cualquier muestra como muestra de referencia y todas las demas muestras pueden agruparse de acuerdo con las mutaciones (variante) en la secuencia de aminoacidos determinada. Posteriormente, se realiza una caracterizacion detallada de cada grupo.
En una realizacion de todos los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido es una inmunoglobulina completa, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina.
Metodologfa general:
Una muestra que contiene el polipeptido a analizar se digiere con una proteasa, por ejemplo tripsina, originando fragmentos (peptidos) de la secuencia de aminoacidos caractenstica. En una realizacion, el tamano de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos se inicia a partir de 3 o 4 restos de aminoacidos y hasta 60 restos de aminoacidos de longitud. En la segunda etapa se realiza una separacion cromatografica de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos (cromatograffa lfquida de alto rendimiento en fase inversa, RP-HPLC) acoplada a
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espectrometna de masas de alta resolucion (MS) utilizando la tecnologfa ion-ciclotron con transformada de Fourier (FT-ICR/FT-orbitrap) y analisis por espectrometna de masas (MS/MS) de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos obtenidos en el espectrometro de masas por disociacion inducida por colision (DIC). Esto es un analisis de datos bidimensional. Debido a las dos dimensiones del analisis, es decir, tiempo frente a masa, puede obtenerse una resolucion mejorada. El analisis bidimensional tambien permite que una baja resolucion de la separacion por cromatograffa lfquida pueda aceptarse antes de que pueda resolverse el analisis por MS como picos superpuestos durante el analisis por MS.
Las series de datos de HPLC-MS obtenidas se comparan despues, es decir, una comparacion de los patrones de elucion de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos y los patrones de masa a carga (m/z) de las muestras y la identificacion de las mutaciones, es decir, diferencias, se realiza por un analisis de los espectros de los fragmentos de MS/MS. En caso de realizarse un analisis basado en la muestra de referencia, se han de realizar la identificacion de los fragmentos de aminoacidos, la asignacion de picos y/o la determinacion de la cobertura de secuencia, ademas de la deteccion de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos que contienen mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos y su cuantificacion relativa. En una realizacion, el polipeptido es una inmunoglobulina o un polipeptido sin inmunoglobulina.
Con el metodo descrito en el presente documento, pueden determinarse la composicion de una muestra y la fraccion de moleculas con las mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos de la misma. Tambien puede realizarse una determinacion cualitativa de la consistencia de una muestra al comparar los datos de fragmentacion por espectrometna de masas determinados experimentalmente con las masas de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos teorica obtenidas por digestion proteolttica in silico del polipeptido y sus variantes y posterior simulacion de la fragmentacion inducida por colision. Finalmente, puede obtenerse una secuencia con mutaciones (variantes) propuestas y posiciones de mutacion (variante) y se confirmo mediante la evaluacion de datos manual. Una vez identificada una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos, puede cuantificarse con respecto a la secuencia de aminoacidos no modificada utilizando los datos de uno, o una parte o la totalidad de los estados de carga de MS.
Se ha hallado mediante el empleo de experimentos de adicion, que el metodo descrito en el presente documento, tiene un lfmite total de deteccion de al menos 0,1-1,0 % de secuencia de aminoacidos mutante (variantes). Ademas, se ha descubierto que resulta, por una parte, ventajoso para evitar los valores de pH basicos y las altas temperaturas durante la preparacion de la muestra con el fin de evitar la desamidacion, es decir, modificaciones inducidas por el metodo. Por lo tanto, en una realizacion del metodo descrito en el presente documento, el metodo se realiza en el intervalo de pH basico neutro y debil, es decir, a un valor de pH inferior a pH 8,0 y superior a un pH 6,5, y a temperaturas moderadas, es decir, a temperaturas inferiores a 40 °C. Se ha descubierto ademas que, a medida que una realizacion utiliza un tampon tris(hidroximetil)aminometano en lugar de un tampon amomaco- bicarbonato utilizado habitualmente para el analisis de masas menos el metodo, se obtienen artefactos dependientes.
El metodo actual utiliza series de datos de LC-MS para la determinacion y permite la deteccion e identificacion de una o mas mutaciones (variantes) en los aminoacidos en una digestion tnptica de un polipeptido de muestra. Para la identificacion pueden utilizarse los datos de MS/MS y el metodo de "busqueda tolerante a errores" identifica las mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos en base a un intercambio, insercion o delecion de acido nucleico unico. De manera analoga, tambien es posible identificar fragmentos y algunas otras modificaciones conocidas.
Este enfoque comparativo puede reducir drasticamente el tiempo necesario para el analisis, ya que solo tienen que analizarse espedficamente las diferencias. Asimismo, en caso de seleccionarse, la muestra de referencia tiene que analizarse solo una vez. Si se presentan muchas mutaciones (diferencias) en las muestras, estas pueden agruparse por modificaciones y pueden analizarse muestras representativas de cada grupo.
Metodo detallado:
En la siguiente realizacion espedfica se describen todos los metodos descritos en el presente documento.
Las muestras pueden reducirse mediante la adicion de ditiotreitol (DDT). Tambien los residuos exentos de sulfhidrilo pueden carboximetilarse por acido yodoacetico. Despues, el tampon de la muestra puede intercambiarse y ajustarse para la digestion enzimatica. La muestra puede digerirse enzimaticamente durante la noche (16 a 18 horas) y la digestion puede detenerse mediante la adicion de acido trifluoroacetico. La muestra digerida puede someterse a una separacion por RP-HPLC y analisis de espectrometna de masas de alta resolucion de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos separada (utilizando, por ejemplo, un espectrometro de masas FT-ICR/FT-orbitrap).
La expresion "serie de datos", como se utiliza en el presente documento, denota las relaciones masa a carga obtenidas resueltas en el tiempo durante la elucion cromatografica en un espectrometro de masas por ionizacion de los fragmentos de la secuencia de aminoacidos resueltos en el tiempo y digeridos, contenidos en una muestra con el fin de generar moleculas cargadas o fragmentos cargados. La serie de datos comprende al menos un cromatograma
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de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) y los datos de espectrometna de masas en tandem (datos de MS/MS) se obtienen por disociacion inducida por colision de las moleculas parentales.
Caso A:
Las muestras a evaluar se analizan junto con una muestra de referencia disponible. Cada muestra y la muestra de referencia deben determinarse al menos dos veces. Como control positivo, una muestra que es similar a la muestra de referencia, es decir, contiene una o dos mutaciones (variantes) en las secuencias de aminoacidos, se adiciona a la muestra de referencia y se utiliza como secuencia (variante) de aminoacidos mutante artificial. La secuencia de aminoacidos mutante artificial (variante) se adiciona a la muestra de referencia, en una realizacion en 0,5% (p/p), para la confirmacion de la sensibilidad total del metodo. Para establecer los parametros del metodo de analisis, pueden compararse los resultados obtenidos con la muestra de referencia, es decir, el polipeptido producido de manera recombinante sin una mutacion (modificacion) o con el patron de mutacion (modificacion) conocida, y con la muestra de referencia adicionada en la secuencia de aminoacidos mutante con la mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos artificial. Con estos parametros puede llevarse a cabo el siguiente analisis.
Para la determinacion puede superponerse el cromatograma de iones totales (CIT) de la muestra de referencia y una muestra a analizar y pueden compararse las intensidades de senal de las senales de masa correspondientes a un tiempo de retencion dado (es decir, tiempo de retencion y masa relacionada). Por consiguiente, en una realizacion, el analisis y/o la determinacion es un analisis bidimensional que utiliza una separacion de acuerdo con el tiempo de retencion y la masa cromatograficos (valor m/z). Se pueden calcular las relaciones de intensidad, es decir, las relaciones de las intensidades de senal de la muestra a las intensidades de senal de la muestra de referencia de todas las masas superpuestas/alineadas. Esta relacion puede representarse contra el tiempo de retencion, por el cual:
a) se indican los picos de la misma masa y con la misma intensidad de la muestra de referencia y de la muestra con valores de aproximadamente 1, a traves de los cuales las masas presentes con mayor frecuencia en la muestra a analizar se indican con valores superiores a 1,
b) todas las masas con un valor superior a 1, se identifican en una realizacion con un valor de mas de 3, o mas de 10, o mas de 100, en una realizacion con un valor comprendido entre 10 y 5*109, en otra realizacion con un valor comprendido entre 100 y 5*109, por lo cual, para la identificacion, se utilizan todos los espectros de MS/MS correspondientes a la masa parental y tambien se tienen en cuenta los diferentes estados de carga,
c) puede llevarse a cabo la cuantificacion de una secuencia (variante) de aminoacidos mutante mediante el uso de uno, una parte o la totalidad de los estados de carga en el espectro de masas relativos entre sf, con lo cual para la secuencia de aminoacidos natural y la secuencia (variante) de aminoacidos mutante se elige el mismo estado de carga, se generan los cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) y el area bajo la curva de los picos correspondientes entre sf en los CIEs se cuantifica relativamente entre sf de acuerdo con la siguiente formula:
100
-------------------------------------------------------------------------------------------------* secuencia de aminoacidos mutante
secuencia de aminoacidos natural + secuencia de aminoacidos mutante
En todas las realizaciones, la ventana m/z utilizada para el analisis es la masa respectiva mas/menos 1,6 uma m/z. Con el fin de garantizar que los datos puedan ser procesados de manera oportuna en todas las realizaciones, se establece una relacion de 3 como umbral, es decir, todas las relaciones inferiores a este lfmite no se analizan.
Caso B:
En este caso la muestra caracterizada ya no se encuentra disponible. Para una de las muestras proporcionadas que se van a analizar (en este caso tiene que estar disponible mas de una muestra a analizar), puede realizarse una alineacion de todas las masas determinadas en el CIT con el patron peptfdico determinado teoricamente, es decir, puede realizarse una asignacion de picos (con proteasa predeterminada para la digestion). Para la alineacion correcta puede ser importante, por una parte, la masa exacta, y por otra parte, la cobertura del fragmento de MS/MS para la confirmacion de la secuencia de las sugerencias peptfdicas. En una realizacion espedfica, las mutaciones (variantes) en las secuencias de aminoacidos pueden identificarse por una busqueda tolerante a errores anadiendo o restando, respectivamente, cada masa teorica calculada de la secuencia de aminoacidos natural, las diferencias de masas resultantes de una mutacion de acidos nucleicos, es decir, sustitucion, delecion o insercion de un unico nucleotido, en un triplete de bases (codon) que da lugar a una diferencia en la secuencia de aminoacidos. Posteriormente, una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos sugerida tiene que confirmarse por el patron de fragmentacion de MS/MS. Con ello, no solo tiene que cubrirse la identidad de la mutacion (diferencia) en la secuencia de aminoacidos, sino tambien la posicion de la mutacion (cambio) de aminoacidos por las masas de los fragmentos en el analisis por MS/MS.
No obstante, la asignacion de picos completa de la serie de datos de LC-MS no es obligatoria y solo pueden analizarse las diferencias. Las muestras restantes pueden compararse con la muestra analizada como se ha descrito anteriormente.
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Se puede llevar a cabo la cuantificacion de una secuencia (variante) de aminoacidos mutante mediante el uso de uno, una parte o la totalidad de los estados de carga en el espectro de masas relativos entre sf, con lo cual para la cada una de la secuencia de aminoacidos natural y la secuencia (variante) de aminoacidos mutante, se elige el mismo estado de carga, se generan los cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) y el area bajo la curva de los picos correspondientes entre sf en los CIEs se cuantifica relativamente entre sf de acuerdo con la siguiente formula:
100 . , r , , , , , ----------------------------------------------------------------------------------* secuencia de aminoacidos mutante
secuencia de aminoacidos natural + secuencia de aminoacidos mutante
Con el metodo que se describe en el presente documento, se encuentra disponible un metodo para la identificacion de las mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos determinado por el intervalo del subporcentaje. La sensibilidad total se determino que era al menos de aproximadamente 0,5 %, en funcion de la naturaleza del fragmento de la secuencia de aminoacidos. En algunos casos, la sensibilidad podna caer por debajo de 0,5 % (por ejemplo, para los fragmentos de la secuencia de aminoacidos con buenas propiedades de cromatograffa y/o ionizacion). En estudios del caso, pueden detectarse variantes entre 0,1 % y 10 %, en algunos casos, hasta 0,02 %. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante una combinacion definida de herramientas informaticas necesarias para lograr resultados significativos y fiables.
En caso de deteccion de mutaciones (variantes) en la secuencia de aminoacidos, los resultados positivos falsos pueden descartarse mediante la confirmacion de la deteccion por:
- aislamiento del polipeptido que contiene la mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos del mapa peptfdico y la realizacion de la secuenciacion de Edman,
- sintetizacion del peptido con la mutacion (variante) en los aminoacidos y adicion en el polipeptido para el analisis por MS y MS/MS que confirma la retencion y el perfil de MS/MS,
- confirmacion de la presencia por secuenciacion del ADN de la muestra respectiva que produce el clon celular,
- digestion con una enzima proteolftica diferente y analisis de los fragmentos obtenidos con la misma.
Ejemplo de un experimento de adicion:
La evaluacion de la sensibilidad para la deteccion de polipeptidos con mutaciones (variantes) se realizo con un polipeptido modelo, un anticuerpo monoclonal (AM), adicionado en un segundo AM con mutaciones (variante) en la secuencia de aminoacidos a varias relaciones, es decir, en diversas concentraciones. En un ejemplo, el AM con una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos se adiciono en 1 % (p/p), es decir, se espera que dos peptidos diferentes se identifiquen por el metodo que se describe en el presente documento.
AM
AM mutante AM
AM mutante
peptido de CL peptido de CL peptido de CP peptido de CP
XXIXXXX
XXVXXXX
XXXXXXXXXXTXXXXX
XXXXXXXXXXIXXXXX
En un segundo ejemplo, el AM mutante (variante) se adiciono a relaciones diferentes (0,5-10 %) en el AM, es decir, se espera 17 peptidos mutantes (variantes) diferentes.
Por consiguiente, en el presente documento, se describe un metodo para determinar un polipeptido con una secuencia de aminoacidos mutante, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) proporcion de al menos dos muestras del polipeptido,
b) incubacion de cada una de las muestras con la misma proteasa,
c) analisis de las muestras incubadas por un analisis de datos bidimensional utilizando una combinacion de separacion por cromatograffa lfquida en fase inversa, y un analisis por espectrometna de masas y/o un analisis MS/MS,
d) definicion de la serie de datos obtenida con una muestra de la etapa c) como muestra de referencia y comparacion de las series de datos obtenidas con las otras muestras de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia, por lo que cada diferencia en la secuencia de aminoacidos determinada es una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido y determina con ello un polipeptido con una secuencia de aminoacidos mutante.
En todas las realizaciones, cada diferencia en la secuencia de aminoacidos con una relacion de mas de 3 de la intensidad de la senal del espectro de masas de la muestra a la intensidad de la senal del espectro de masa de referencia es una mutacion en la secuencia de aminoacidos. En todas las realizaciones, el ancho del marco m/z utilizada en el analisis es igual o superior a 1,6. En una realizacion adicional, el metodo comprende ademas una etapa e) de determinacion de la identidad y la posicion de la mutacion en los aminoacidos en la secuencia de aminoacidos por el analisis MS/MS. En una realizacion, tambien se proporciona una muestra adicional que comprende el polipeptido adicionado en el polipeptido con una mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos
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conocida y la muestra adicional se incuba, se analiza y se compara ademas de las muestras proporcionadas. En una realizacion, el analisis se realiza a un valor de pH inferior a 8,0 y a una temperatura inferior a 40 °C. En otra realizacion, las muestras se proporcionan en un tampon tris(hidroximetil)aminometano. En una realizacion, tambien la incubacion de las muestras con una proteasa es una escision del polipeptido por la proteasa en fragmentos de secuencia de aminoacidos de 3 a 60 restos de aminoacidos de longitud. En aun una realizacion, la comparacion en la etapa d) se realiza con los datos de uno, o una parte o la totalidad de los estados de carga de MS. En una realizacion, el polipeptido es una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o un conjugado de inmunoglobulina. En otra realizacion, las muestras se incuban durante 16 horas a 18 horas con la proteasa, y despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico. En una realizacion adicional, las muestras se incuban durante 4 horas con la proteasa, y despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico. En una realizacion la comparacion tambien comprende la superposicion del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) de la muestra de referencia y cada una de las otras muestras a analizar, por lo que se calcula la relacion de intensidad de todas las masas superpuestas y alineadas, de modo que los picos con una relacion de mas de 3, en concreto, mas de 10, se evaluan como mutacion en la secuencia de aminoacidos. En aun otra realizacion, la comparacion comprende ademas la comparacion del patron peptfdico de fragmentos proteoltticos de traduccion de ADN de la secuencia de aminoacidos teorica y del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) de la muestra a analizar, y las mutaciones en la secuencia de aminoacidos se identifican anadiendo, o restando, respectivamente, cada masa teorica calculada de la secuencia de aminoacidos teorica, las diferencias de masas resultantes de una mutacion, delecion o insercion de acido nucleico en un triplete de bases (codon) con un cambio de aminoacidos.
Un aspecto adicional que se describe en el presente documento es un metodo para producir un polipeptido que comprende la siguiente etapa:
- seleccionar una celula que produce un polipeptido, por la que el polipeptido comprende el menor numero o relacion, respectivamente, de mutaciones en la secuencia de aminoacidos de todas las muestras procesadas o con respecto a una muestra de referencia o secuencia predeterminada de aminoacidos determinada con un metodo descrito en el presente documento.
Asimismo un aspecto descrito en el presente documento es un metodo para producir una inmunoglobulina que comprende las etapas de:
a) proporcion de al menos dos celulas que comprenden un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina,
b) deposito y cultivo individual de las celulas,
c) realizacion de un metodo que se describe en el presente documento,
d) seleccion de una celula que produce una inmunoglobulina, por medio de la cual la inmunoglobulina comprende el menor numero o relacion, respectivamente, de mutaciones en la secuencia de aminoacidos con respecto a una muestra de referencia,
e) cultivo de la celula,
f) produccion de un polipeptido por recuperacion del polipeptido de la celula o medio de cultivo.
Los siguientes ejemplos, listado secuencial y figuras se proporcionan para ayudar a la comprension de la presente invencion, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Descripcion del listado secuencial
SEQ ID NO: 01 dominio variable de la cadena pesada 1 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 02 dominio variable de la cadena ligera 1 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 03 dominio variable de la cadena pesada 2 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 04 dominio variable de la cadena ligera 2 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 05 dominio variable de la cadena pesada 3 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 06 dominio variable de la cadena ligera 3 del anticuerpo anti-CCR5.
SEQ ID NO: 07 region constante de la IgG1 humana.
SEQ ID NO: 08 region constante de la IgG4 humana.
SEQ ID NO: 09 dominio constante de la cadena ligera kappa humana.
SEC ID NO: 10 dominio constante de la cadena ligera lambda humana.
Descripcion de las Figuras
Figura 1 Una secuencia temporal representativa del ciclo de acontecimiento de exploracion para la adquisicion dependiente de datos de espectros de MS/MS; abreviaturas: FT ICR - resonancia ion-ciclotron con transformada de Fourier; TIL - trampa de iones lineal; DIC - disociacion inducida por colision; PR - poder de resolucion; DIF - disociacion inducida por fuente.
Figura 2 Cromatograma de iones totales de mapas de peptidos tnpticos de un anticuerpo de referencia anti-CD 19 (referencia) y un anticuerpo de muestra anti-CD 19 (muestra) adquirido en un LTQ FT ICR (Thermo Scientific).
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Figura 3
Figura 4
Figura 5 Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11 Figura 12 Figura 13
Ejemplo 1
Superposicion de los cromatogramas de LC-MS alineados por tiempo de retencion de picos prominentes. Los datos procedfan de mapas de peptidos tnpticos de dos anticuerpos anti-CD 19 (referencia y muestra). A y B son perfiles medios de ClT de dos replicados cada uno.
Diagrama de dispersion que muestra las diferencias entre el anticuerpo anti-CD 19 de muestra y referencia.
Zoom de la Figura 4.
Espectro de MS/MS asignado del fragmento de la secuencia de aminoacidos de CP del anticuerpo anti- CD 19 de muestra (sucesion y-ion y sucesion b-ion de la disociacion inducida por colision del ion padre doblemente cargado). Los fragmentos de MS/MS caractensticos para la variante de secuencia de aminoacidos se muestran en negrita.
Espectro de MS/MS asignado del fragmento de la secuencia de aminoacidos de CL del anticuerpo anti- CD 19 de muestra (sucesion y-ion y sucesion b-ion de la disociacion inducida por colision del ion padre doblemente cargado). Los fragmentos de MS/MS caractensticos para la variante de secuencia de aminoacidos se muestran en negrita.
Cromatograma de iones extrafdos de la secuencia de aminoacidos natural y la secuencia de aminoacidos del fragmento de la secuencia de aminoacidos de CP del anticuerpo anti-CD 19 de muestra en el ensayo de la muestra LC-MS. Resultado de cuantificacion: esta presente en la muestra un 2 % en peso de la secuencia de aminoacidos mutante (variante).
Cromatograma de iones extrafdos de la secuencia de aminoacidos natural y el fragmento de la secuencia de aminoacidos de CL del anticuerpo anti-CD 19 de muestra en el ensayo de la muestra LC- MS. Resultado de cuantificacion: esta presente en la muestra un 0,5% en peso de la secuencia de aminoacidos mutante (variante).
Superposicion de los cromatogramas de LC-MS alineados por tiempo de retencion de picos prominentes. Los datos procedfan de mapas de peptidos tnpticos de dos anticuerpos anti-CCR5 (referencia y muestra).
Diagrama de dispersion que muestra las diferencias entre el anticuerpo anti-CCR5 de muestra y referencia.
Cromatograma de iones extrafdos de la secuencia de aminoacidos natural y el fragmento de aminoacidos de CL del anticuerpo anti-CCR5 de muestra en el ensayo de la muestra LC-MS. Cromatograma de iones extrafdos de la secuencia de aminoacidos natural y el fragmento de aminoacidos de CP del anticuerpo anti-CCR5 de muestra en el ensayo de la muestra LC-MS.
Materiales y metodos
Metodo de preparacion de muestra para la referencia y la muestra:
a) Reduccion y alquilacion:
Se diluyeron 250 |jg de inmunoglobulina en un volumen de maximo 100 jl con tampon de desnaturalizacion (Tris- HCl 0,4 M, clorhidrato de guanidina 8,0 M, pH 8) a un volumen final de 240 jl. 20 jl de ditiotreitol (240 mM en tampon de desnaturalizacion) se anadieron a la solucion y la mezcla se incubo a 37 °C ± 2 °C durante 60 minutos. Despues se anadieron 20 jl de una solucion de acido yodoacetico (0,6 M en agua purificada), se mezclaron vigorosamente y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La reaccion de alquilacion se detuvo mediante la adicion de 30 jl de una solucion de ditiotreitol (240 mM en tampon de desnaturalizacion).
b) Intercambio de tampon:
El tampon de 300 jl (aproximadamente 250 |jg o 3,2 nmol) de una solucion que comprende la inmunoglobulina carboximetilada reducida, desnaturalizada se intercambio utilizando una columna de desalacion NAP™ 5 Sephadex™ G-25. Brevemente, la columna se equilibro con 10 ml de una solucion tampon que comprende 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, la muestra se aplico a la columna, la columna se lavo con 350 jl de la solucion tampon previa y la muestra se recupero en aproximadamente 480 jl. Entre cada etapa (equilibrio de la columna, aplicacion de la muestra, lavado y elucion), la solucion se introdujo en el lecho de la columna empaquetada completamente.
c) Digestion enzimatica:
Se anadieron 48 jl de una solucion de tripsina (0,2 g/l en Tris-HCl, pH 7,5) a la solucion de inmunoglobulina intercambiada en el tampon y se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 16 horas a temperatura ambiente. La digestion se detuvo mediante la adicion de 20 jl de solucion de acido trifluoroacetico (TFA) al 10 % (v/v).
Metodo de adquisicion de datos de LC-MS/MS:
El analisis LC-MS/MS se realizo mediante una separacion cromatografica (LC) de los peptidos hidroltticos obtenidos en las etapas de digestion tnptica seguida por MS y deteccion MS/MS, respectivamente, utilizando una fuente de
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iones nano ESI de Advion Biosciences como una interfaz entre HPLC y espectrometro de masas. La cromatograffa se llevo a cabo con los siguientes parametros:
HPLC:
Caudal:
Longitud de onda de deteccion UV: Temperatura del horno para columna: Bucle de muestra:
Columna:
Volumen de inyeccion:
Dionex Ultimate 3000 40 pl/min 220 nm y 280 nm 35 °C 10 pl
Dionex pep Map C18, 3 pm, 100 A, 1 x 150 mm 10 pl
Eluyente A = agua de calidad gradiente de HPLC que contiene acido formico al 0,1 % Eluyente B = acetonitrilo de calidad gradiente de HPLC que contiene acido formico al 0,1 %
El gradiente aplicado procedfa de un eluyente B al 5 % en volumen a un eluyente B al 100 % en volumen en 75 minutos.
Se llevo a cabo nano ESI MS o MS/MS con los siguientes parametros:
Fuente nano ESI:
Flujo en la fuente de iones del espectrometro de Presion de gas:
Tension a aplicar:
Ion positivo:
Triversa NanoMate (Advion)
aprox. 200 nl/min gestionado por un divisor
0,1-0,5 psi
1,1-1,7 kV
seleccionado
La deteccion de espectrometna de masas se llevo a cabo con los siguientes parametros:
Instrumento: ESI LTQ FT-ICR (Thermo Scientific)
Temperatura capilar: 175 °C
Energfa de colision en trampa ionica para MS/MS 40 %
Tension de la lente del tubo: 100 V
Caractenstica dinamica de exclusion: habilitada (recuento de repeticiones: 1, duracion de
exclusion: 8 s, ancho de masas de exclusion: 3 ppm).
En la Figura 1 se muestra una secuencia temporal representativa del ciclo del acontecimiento de exploracion para la adquisicion dependiente de datos de espectros MS/MS.
El intervalo de adquisicion de datos era de 350-2.000 m/z para espectros de MS. Se utilizo el intervalo M/Z para espectros de MS/MS de acuerdo con los ajustes del instrumento convencional. El numero de espectros de MS/MS por exploracion FT de alta resolucion puede variar entre 3 a 5. La exploracion DIF no es obligatoria para este tipo de analisis.
Ejemplo 2
Analisis del anticuerpo anti-CD 19 de referencia y muestra Generacion de datos:
La referencia y la muestra del anticuerpo anti-CD 19 se han tratado de acuerdo con la seccion Materiales y Metodos. Los datos de MS se han adquirido de acuerdo con la seccion de Materiales y Metodos.
Analisis de datos:
a) Deteccion de las diferencias entre la referencia y la muestra utilizando series de datos de LC-MS
Para la comparacion de los perfiles de masas obtenidos para la referencia y la muestra (cromatogramas de iones totales (CIT), vease la Figura 2) se ha utilizado el paquete de software SIEVE™ (version 1.1.0 de Thermo Scientific). En pocas palabras, las series de datos de CIT de la referencia y la muestra se alinearon por el tiempo de retencion (Figura 3) y se compararon para las intensidades de pico de masa en una ventana de tiempo de retencion preestablecida determinadas por un umbral predeterminado (Figuras 4 y 5).
Las senales de masas diferentes en la referencia y en la muestra de acuerdo con los parametros predefinidos para la evaluacion se enumeran en la Tabla 1. Las senales de masas presentes a intensidades identicas en la referencia y en la muestra aparecen en una relacion de 1. Las senales de masas con una intensidad mayor en la muestra que en la referencia (por ejemplo, mutaciones puntuales de aminoacidos) aparecen con relaciones mayores a 1. Las relaciones se calcularon dividiendo la intensidad total de la senal en m/z dada frente al marco del tiempo de
retencion de la muestra por la intensidad correspondiente en la referencia. Si la intensidad total de la senal en m/z dada frente al marco del tiempo de retencion de la referencia es cero (por ejemplo, no hay senal alguna de fondo debido a la reduccion activa de ruido durante la adquisicion de datos), la relacion es igual a la intensidad total de la senal de la muestra en el correspondiente marco (por ejemplo, 2-10 coincidencias en la Tabla 1).
Tabla 1: Datos para todos los picos diferenciales con una relacion > 50.
N.°
inicio m/z detencion m/z tiempo de inicio tiempo de detencion relacion interpretacion manual
1
1.061,19 1.062,79 20,7385 21,0385 140.043 mutacion 1; z = 1
2
1.441,94 1.443,54 36,043 36,343 68.943 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
3
1.989.61 1.991.21 36,0909 36,3909 59.552 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
4
1.864,12 1.865,72 36,0909 36,3909 55.943 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
5
890,645 892,245 36,0909 36,3909 52.340 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
6
1.718,96 1.720,56 36,0909 36,3909 52.235 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
7
1.347,59 1.349,19 36,0909 36,3909 45.291 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
8
1.110,76 1.112,36 36,0909 36,3909 45.107 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
9
1.235,23 1.236,83 44,5509 44,8509 36.205 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
10
965,611 967,211 36,0909 36,3909 33.871 antecedente, sin peptido relacionado, sin desencadenamiento MS/MS
11
606,874 608,474 44,0258 44,3258 798 mutacion 2; z = 3
12
607,21 608,81 43,8741 44,1741 571 mutacion 2; z = 3
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606,875 608,475 44,2013 44,5013 261 mutacion 2; z = 3
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910,713 912,313 44,0258 44,3258 194 mutacion 2; z = 2
15
607,879 609,479 44,0258 44,3258 143 mutacion 2; z = 3
16
910,218 911,818 43,8741 44,1741 108 mutacion 2; z = 2
17
601,538 603,138 45,6276 45,9276 96 no identificado
18
735,059 736,659 53,367 53,667 42 presente en los ensayos de LC-MS aunque con solo un ligera intensidad diferente
19
1.022,27 1.023,87 6,84557 7,14557 40 presente en los ensayos de LC-MS aunque con solo un ligera intensidad diferente
10
Los parametros utilizados para la comparacion de los datos de LC-MS de referencia y de muestra con SIEVE fueron los siguientes:
Ancho del marco m/z:
1,6
Ancho del marco de tiempo:
0,3 min
Umbral de intensidad:
10.000
Inicio m/z:
350
Final m/z:
2.000
Ancho del pico de busqueda:
30 %
Inicio del tiempo de retencion:
5 min
Detencion del tiempo de retencion:
60 min
Estos parametros se han optimizado para distinguir las coincidencias relacionadas con la diferencia de la secuencia de aminoacidos a partir de un falso positivo, es decir, coincidencias relacionadas con la diferencia en la secuencia no aminoacida. Solo tienen que ajustarse de acuerdo con los parametros actuales de los datos de LC-MS que son:
15
i) resolucion cromatografica (ancho del marco de tiempo), y
ii) sensibilidad del instrumento utilizado y el ruido de fondo (umbral de intensidad).
Ademas, la sensibilidad requerida del metodo, por ejemplo, para la deteccion de secuencias (variantes) de 20 aminoacidos mutantes muy poco significativas, determina el umbral de intensidad a establecer. Utilizando, por
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ejemplo un instrumento LTQ FT ICR, se han identificado secuencias (variantes) mutantes de hasta 0,2 % de frecuencia absoluta.
b) Identificacion de las diferencias entre la referencia y la muestra utilizando los datos de MS/MS
Se comprobo la identificacion de las diferencias encontradas utilizando el procedimiento descrito en el primer parrafo anterior de todo el grupo de picos de isotopos por ser tipica de los peptidos. A continuacion, se comprobo si se ha seleccionado la senal de m/z respectiva para la generacion de la fragmentacion de MS/MS y si se identifico por medio de la busqueda tolerante a error de Mascot (Mascot ETS). Cada variante de secuencia tentativa identificada por Mascot ETS se comprobo y confirmo manualmente utilizando los espectros ionicos del fragmento de MS/MS obtenidos (vease la Figura 6 y la Figura 7).
Alternativamente, si los datos de MS/MS se han registrado y Mascot ETS no propuso una secuencia, se aplico de forma manual o mediante el uso de software una secuenciacion de novo.
c) Cuantificacion de secuencias (variantes) de aminoacidos mutantes identificadas
La secuencia (variante) de aminoacidos mutante identificada se cuantifico en el nivel del fragmento de secuencia de aminoacidos (triptico) que contiene la mutacion (variante) y en relacion con el fragmento de la secuencia de aminoacidos original, no mutada en la misma muestra (vease la Figura 8 y la Figura 9). Dos cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) se generaron a partir de los datos de LC-MS de la muestra, uno para la muestra y uno para la muestra de referencia. Los cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) incluyen todos los estados de carga y todos los picos isotopicos del peptido respectivo. Los picos generados por los respectivos CEIs se integraron utilizando el software del instrumento (XCalibur), y las areas calculadas por la presente se utilizan en la siguiente formula:
imagen1
En la que se utiliza el area del pico del cromatograma de iones extrafdos teniendo en cuenta todos los estados de carga y todos los picos isotopicos.
Ejemplo 3
Analisis del anticuerpo anti-CCR5 de referencia y muestra
Para la determinacion de un cambio (mutacion) de un unico aminoacido en los dominios variables, es decir, dominio variable de cadena ligera y dominio variable de cadena pesada, se ha empleado un anticuerpo anti-CCR5. El primer anticuerpo anti-CCR5 o el anticuerpo anti-CCR5 de referencia tiene una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera seleccionada a partir de los pares de la SEQ ID NO: 01 y 02, SEQ ID NO: 03 y o4, y SEQ ID NO: 05 y 06. El segundo anticuerpo anti-CCR5 o el anticuerpo anti-CCR5 de muestra tiene las siguientes mutaciones (cambios) en los aminoacidos: en el dominio variable de cadena pesada (VP), el residuo de isoleucina en la posicion del aminoacido 109 se muta (cambia) a treonina (VP-I109T), en el dominio variable de cadena ligera (VL), el residuo de valina en la posicion del aminoacido 52 se muta (cambia) a isoleucina (VL-V52I).
El anticuerpo anti-CCR5 de muestra se ha adicionado en un 1 % en peso al anticuerpo anti-CCR5 de referencia.
a) Deteccion de las diferencias entre las secuencias de aminoacidos de referencia y de muestra utilizando series de datos de LC-MS
Para la comparacion de los perfiles de masas obtenidos para la referencia y la muestra (cromatogramas de iones totales (CITs), se ha utilizado el paquete de software SIEVE™ (version 1.1.0 de Thermo Scientific). En pocas palabras, las series de datos de la referencia y la muestra se alinearon cromatograficamente por el tiempo de retencion (Figura 10) y se compararon para las intensidades de pico de masa en una ventana de tiempo de retencion preestablecida determinadas por un umbral predeterminado (Figura 11).
Las diferencias en las senales de masas de referencia y de muestra de acuerdo con los parametros predefinidos para la evaluacion se enumeran en la Tabla 2. Las senales de masas presentes a intensidades identicas en la referencia y en la muestra aparecen en una relacion de 1. Las senales de masas con una intensidad mayor en la muestra que en la referencia (por ejemplo, mutaciones puntuales de aminoacidos) aparecen con relaciones mayores a 1. Las relaciones se calcularon dividiendo la intensidad total de la senal en m/z dada frente al marco del tiempo de retencion de la muestra por la intensidad correspondiente en la referencia. Si la intensidad total de la senal en m/z
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dada frente al marco del tiempo de retencion de la referencia es cero (por ejemplo, no hay senal alguna de fondo debido a la reduccion activa de ruido durante la adquisicion de datos), la relacion es igual a la intensidad total de la senal de la muestra en el correspondiente marco.
Tabla 2: Datos para picos diferenciales
N.°
inicio m/z detencion m/z tiempo de inicio tiempo de detencion relacion interpretacion manual
1
947,913 947,933 39,6552 42,1552 429464 mutacion
2
948,414 948,434 39,6873 42,1873 312,837 mutacion
b) Identificacion de las diferencias entre la referencia y la muestra utilizando los datos de MS/MS
Se comprobo la identificacion de las diferencias encontradas utilizando el procedimiento descrito en el primer parrafo anterior de todo el grupo de picos de isotopos por ser tfpica de los peptidos. A continuacion, se comprobo si se ha seleccionado la senal de m/z respectiva para la generacion de la fragmentacion de MS/MS y si se identifico por medio de la busqueda tolerante a error de Mascot (Mascot ETS). Cada mutacion (variante) en la secuencia de aminoacidos tentativa identificada por Mascot ETS se comprobo y confirmo manualmente utilizando los espectros ionicos del fragmento de MS/MS obtenidos.
Alternativamente, si los datos de MS/MS se han registrado y Mascot ETS no propuso una secuencia, se aplico de forma manual o mediante el uso de software una secuenciacion de novo.
c) Cuantificacion de variantes de secuencia identificadas
La secuencia (variante) de aminoacidos mutante identificada se cuantifico en el nivel del fragmento de secuencia de aminoacidos (tnptico) que contiene la mutacion (variante) y en relacion con el peptido original, no mutado en la misma muestra (vease la Figura 12 y la Figura 13). Dos cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) se generaron a partir de los datos de LC-MS de la muestra, uno para el peptido mutante (variante) y uno para el peptido nativo. Los cromatogramas de iones extrafdos (CIEs) incluyen todos los estados de carga y todos los picos isotopicos del peptido respectivo. Los picos generados por los respectivos CEIs se integraron utilizando el software del instrumento (XCalibur), y las areas se calcularon por la presente de acuerdo con la formula mostrada en el Ejemplo 1.
LISTADO DE SECUENCIAS
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<120> Metodo para la determinacion de variantes de secuencia de polipeptidos
<130> 26601 WO
<150> EP10001645.0 <151>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 1
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Val Phe

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110
Val lie Val Ser Ser 115
<210>2 <211>108 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>2
5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
10
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<210>3
5 <211> 117
<212> PRT <213> Mus musculus
<400>3
10
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<210>4 <211>108 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Gly Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105
<210>5 <211> 117 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400>5

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Thr Phe 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60

Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser

100 105 110
Val lie Val Ser Ser 115
<210>6 <211>108 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400>6
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<210>7 <211> 330 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>7
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Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar un polipeptido con una secuencia de aminoacidos mutante, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    a) proporcion de al menos dos muestras del polipeptido,
    b) incubacion de cada una de las muestras con la misma proteasa,
    c) analisis de las muestras incubadas por un analisis de datos bidimensional utilizando una combinacion de separacion por cromatograffa Kquida en fase inversa y un analisis por espectrometna de masas y/o un analisis MS/MS,
    d) definicion de la serie de datos obtenida con una muestra de la etapa c) como muestra de referencia y comparacion de las series de datos obtenidas con las otras muestras de la etapa c) con la serie de datos de la muestra de referencia, por lo que cada diferencia de secuencia de aminoacidos con una relacion de mas de 3 de la intensidad de senal de espectro de la masa de muestra a la intensidad de senal de espectro de la masa de referencia es una mutacion en la secuencia de aminoacidos del polipeptido y determina con ello un polipeptido con una secuencia de aminoacidos mutante,
    en el que el ancho del marco m/z es igual o superior a 1,6 para la comparacion de patrones.
  2. 2. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas una etapa:
    e) determinacion de la identidad y la posicion de las mutaciones en los aminoacidos en la secuencia de aminoacidos por analisis MS/MS.
  3. 3. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se proporciona una muestra adicional que comprende el polipeptido adicionado en el polipeptido con una mutacion de secuencia de aminoacidos conocida y la muestra adicional se incuba, se analiza y se compara ademas de las muestras proporcionadas.
  4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la preparacion de la muestra se realiza a un valor de pH inferior a pH 8,0 y a una temperatura inferior a 40 °C.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las muestras se proporcionan en un tampon tris(hidroximetil)aminometano.
  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la incubacion de las muestras con una proteasa es una escision del polipeptido por la proteasa en fragmentos de la secuencia de aminoacidos de 3 a 60 restos de aminoacidos de longitud.
  7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la comparacion en la etapa d) se realiza con los datos de uno, una parte o la totalidad de los estados de carga de MS.
  8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el polipeptido es una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o un conjugado de inmunoglobulina.
  9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las muestras se incuban durante 16 horas a 18 horas con la proteasa, y despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico.
  10. 10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que las muestras se incuban durante 4 horas con la proteasa, y despues se anade acido formico o acido trifluoroacetico.
  11. 11. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la comparacion comprende la superposicion del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TlC) de la muestra de referencia y cada una de las otras muestras a analizar,
    por lo que se calcula la relacion de intensidad de todas las masas superpuestas y alineadas, de modo que los picos con una relacion superior a 10 se evaluan como mutacion de secuencia de aminoacidos.
  12. 12. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la comparacion comprende ademas la comparacion del patron peptfdico de fragmentos proteoltticos de traduccion de ADN de la secuencia de aminoacidos teorica y del cromatograma de iones totales con espectrometna de masas (MS-TIC) de la muestra a analizar, y las mutaciones en la secuencia de aminoacidos se identifican anadiendo, o restando, respectivamente, de cada masa teorica calculada de la secuencia de aminoacidos teorica, las diferencias de masas resultantes de una mutacion, delecion o insercion de acido nucleico en un triplete de bases (codon) con un cambio de aminoacidos.
    Tiempo
    0,4 segundos
    0,6 segundos 0,8 segundos; 1,0 segundos 1,2 seg undos 1,4 segundos
    FT
    Exploracion DIF FT a 50 kPP Acontecimiento de exploracion 1 Programa trazador instantaneo a 25 kRP Adquisicion FT continua a 100 kRP
    Til Acontecimiento de exploracion n.° 2
    MS/MS n.° 1 Acontecimiento de exploracion 3 MS.'VIS n.° 2 j Acontecimiento 1 de exploracion 4 MS/VIS n.° 3 Acontecimiento de exploracion 5 MS/MS n.° 4 Acontecimiento de exploracion 6 MS/MS n.° 5 Acontecimiento de exploracion 7
    Fuente
    DIC ''92 V
    0 V
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    ora*
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    Tiempo (min)
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    o
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    Ht
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    400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
    imagen6
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    Tiempo (min)
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    CO
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    RT: 21,91 M: 119536417
    imagen10
    imagen11
    N
    era
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    Intensidad
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    Tiempo
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    Tiempo medio
    ora*
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  13. 91.02-21.-62
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  14. 91.02-21.-62 ZI.2t0ZU3
    imagen15
    ei
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