ES2612258T3 - Agonistas multiméricos de Tie 2 y usos de los mismos en la estimulación de la angiogénesis - Google Patents

Agonistas multiméricos de Tie 2 y usos de los mismos en la estimulación de la angiogénesis Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende una forma multimérica de monómeros peptídicos de unión a Tie 2, donde la forma multimérica tiene actividad agonista de Tie 2, donde cada monómero peptídico es de no más de 100 aminoácidos de longitud y donde cada monómero peptídico comprende: a) un péptido T7 representado por la SEQ ID NO: 1 o un péptido T7 modificado representado por la SEQ ID NO: 2; b) un péptido GA3 representado por la SEQ ID NO: 3 o un péptido GA3 modificado representado por la SEQ ID NO: 4; c) un péptido T4 representado por la SEQ ID NO: 9 o un péptido T4 modificado representado por la SEQ ID NO: 10; d) un péptido T6 representado por la SEQ ID NO: 7 o un péptido T6 modificado representado por la SEQ ID NO: 8; o e) un péptido T8 representado por la SEQ ID NO: 5 o un péptido T8 modificado representado por la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCION
Agonistas multimericos de Tie 2 y usos de los mismos en la estimulacion de la angiogenesis 5 Antecedentes de la invencion
La angiogenesis es el proceso mediante el cual se generan nuevos vasos sangufneos. Muchas de las rutas de senalizacion que impulsan la respuesta angiogenica se originan en la membrana plasmatica y surgen de la activacion de tirosina cinasas receptoras de celulas endoteliales, incluyendo Tie2/Tek (Jones, N. et al. (2001) Nat. 10 Rev. Mol. Cell. Biol. 4: 257-267; Olsson, A. et al. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5, 359-371). Los miembros 1-4 de las angiopoyetinas (Ang) constituyen una familia de factores de crecimiento proteicos, todos los cuales se ha mostrado que activan la actividad del receptor Tie 2 en diferentes grados.
Todas las Ang se caracterizan estructuralmente por un dominio de superagrupamiento (SCD) N-terminal seguido de 15 un dominio de helice superenrrollada (CCD) y un dominio de tipo fibrinogeno C-terminal (FLD) (Ward, N. y Dumont, D. (2002) Semin. Cell. Dev. Biol. 1: 19-27) y (Tsigkos, K. et al. (2003) Expert Opin. Investig. Drugs 6, 933-941). Estudios funcionales han destacado el papel de SCD y CCD en la formacion de multfmeros de Ang homotopicos de alto orden (Procopio, W. et al. (1999) J. Biol. Chem. 42 30196-30201). La naturaleza especffica de estos multfmeros es variable y parece ser unica para cada miembro de la familia de las Ang. La especificidad de union de las Ang por 20 el receptor Tie 2 se ha atribuido al FLD. Tomados en conjunto, los atributos estructurales unicos de cada miembro de la familia de las Ang promueven la union y agrupacion diferencial de Tie 2. Se cree que los efectos fisiologicos pleyotropicos de Ang 1-4 estan al menos en parte mediados por el agrupamiento apropiado y especffico del receptor (Davis, S. et. al. (2003) Nat. Struct. Biol. 1 38-44; Procopio, W. et. al. (1999) J. Biol. Chem. 42. 30196-30201; Cho, C. et. al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15: 5547-5552; Ward, D. et. al. (2004) Biochem. Biophys. Res. 25 Commun. 3. 937-946; Kim, K-T. et al. (2005) J. Biol. Chem. 280: 20126-20131). Los enfoques de eliminacion genica y transgenico en ratones han destacado un papel indispensable de Ang 1 y Ang 2 en el desarrollo y el mantenimiento de los sistemas vasculares sangufneo y linfatico, asf como del sistema hematopoyetico. Los estudios no geneticos de las Ang se han dificultado por la dificultad inherente asociada a su purificacion, estabilidad y solubilidad.
30
Las heridas cronicas representan un problema medico significativo. Por ejemplo, estimaciones globales resenan que 12,5 millones de pacientes en el mundo padecen heridas cronicas y un numero significativo de estos individuos padecen ulceras de decubito y ulceras del pie diabetico. La curacion de heridas implica una serie bien coreografiada de actividades moleculares que conducen en ultima instancia al cierre de la herida. Estos eventos estan impulsados 35 por tres procesos interrelacionados: inflamacion, proliferacion celular y angiogenesis. La angiogenesis alterada es uno de los varios defectos primarios resenados en pacientes diabeticos. Estos pacientes padecen a menudo una curacion de heridas alterada y como tales padecen una morbilidad significativa asociada al compromiso vascular (Dinh, T. y Veves. A. (2005) Curr. Pharm. Des. 18.145- 153).
40 Se han resenado defectos primarios en la secrecion de factor de crecimiento y/o la escision proteolftica de factores de crecimiento en heridas diabeticas, sugiriendo que la aplicacion terapeutica de estos factores puede ser beneficiosa (Wieman. T. el al. (1998) Diabetes Care 5 822-827; Tsang, M. el. al. (2003) Diabetes Care 6. 18561861). Sin embargo, hasta la fecha, faltan todavfa medios efectivos para estimular la angiogenesis, tales como para uso en el tratamiento de heridas cronicas. Por consiguiente, existe la necesidad de agentes que sean efectivos en la 45 estimulacion de la angiogenesis.
Resumen de la invencion
Esta invencion proporciona agonistas de Tie 2 multimericos que tienen actividad angiogenica y que pueden usarse 50 para promover la curacion de heridas. Es un agonista de Tie 2 de la invencion un mimetico de angiopoyetina que comprende una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2. Se ha demostrado que los agonistas de Tie 2 de la invencion se unen especfficamente y activan Tie 2, como se evidencia por la fosforilacion de Tie 2, y activan rutas de senalizacion que se ha demostrado anteriormente que son posteriores a Tie 2, incluyendo las rutas de MAPK, AKT y eNOS. Los agonistas de Tie 2 de la invencion han demostrado tambien estimular la angiogenesis, 55 dando como resultado vasos bien arborizados. Ademas, cuando se usan para estimular la angiogenesis en combinacion con VEGF, se ha mostrado que los agonistas de Tie 2 mitigan la sinuosidad observada cuando se estimula la angiogenesis por VEGF solo. Usando un modelo in vivo de curacion de heridas, los agonistas de Tie 2 de la invencion han demostrado mejorar el tiempo de cierre de heridas, principalmente mediante un tejido de granulacion aumentado y la neovascularizacion de la herida.
La invencion es como se define en las reivindicaciones.
Por consiguiente, un aspecto de la invencion atane a una composicion que comprende una forma multimerica de los 5 monomeros peptfdicos de union a Tie 2, donde la forma multimerica tiene actividad agonista de Tie 2, donde cada monomero peptfdico es de no mas de 100 aminoacidos de longitud y donde cada monomero peptfdico comprende:
(a) un peptido T7 (SEQ ID NO: 1) o un peptido T7 modificado (SEQ ID NO:2):
(b) un peptido GA3 (SEQ ID NO: 3) o un peptido GA3 modificado (SEQ ID NO:4);
10 (c) un peptido T4 (SEQ ID NO: 9) o un peptido T4 modificado (SeQ ID NO: 10);
(d) un peptido T6 (SEQ ID NO: 7) o un peptido T6 modificado (SEQ ID NO:8); o
(e) un peptido T8 (SEQ ID NO: 5) o un peptido T8 modificado (SEQ ID NO:6).
En una realizacion preferida, la forma multimerica es un tetramero. Como alternativa, la forma multimerica puede ser,
15 por ejemplo, una forma dimerica o multimerica que comprende seis, ocho, diez o doce unidades del monomero peptfdico de union a Tie 2. En aun otras realizaciones, la forma multimerica comprende un numero impar de unidades de monomero peptfdico de union a Tie 2, tal como tres, cinco, siete, nueve u once unidades.
En una realizacion preferida, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende una estructura A-B-C, donde A 20 comprende un peptido de union a Tie 2, B comprende un espaciador y C comprende un grupo multimerizante, donde C tiene afinidad por D, un agente multimerico que comprende multiples sitios de union a C. Por ejemplo, el agente multimerico D puede tener cuatro sitios de union al grupo multimerizante C, de tal modo que se forme un tetramero cuando cuatro monomeros peptfdicos de union a Tie 2, A-B-C, interaccionen con el agente multimerico D. En una realizacion preferida, C comprende un grupo biotina y D comprende un agente seleccionado de entre el grupo 25 consistente en avidina, estreptavidina y neutravidina. En otra realizacion preferida, el espaciador B comprende polietilenglicol (PEG).
En otra realizacion, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende una estructura A-B, donde A comprende un peptido de union a Tie 2 y B comprende un espaciador, donde se crea la forma multimerica mediante ligamiento 30 covalente de multiples monomeros peptfdicos de union a Tie 2 a traves del espaciador B. En una realizacion preferida, el espaciador B comprende polietilenglicol (PEG).
En otra realizacion, la forma multimerica comprende un dfmero peptfdico que comprende: (a) una primera cadena peptfdica; (b) una segunda cadena peptfdica y (c) un resto de ligamiento que conecta dichas primera y segunda 35 cadenas peptfdicas, donde dicho dfmero peptfdico se une a y activa el receptor Tie 2. Preferiblemente, la primera cadena peptfdica es un peptido T7 (SEQ ID NO: 1 o 2). Preferiblemente, la segunda cadena peptfdica es un peptido T7 (SEQ ID NO: 1 o 2). Mas preferiblemente, tanto la primera como la segunda cadenas peptfdicas son peptidos T7 (SEQ ID NO: 1 o 2). Preferiblemente, el resto de ligamiento comprende uno o mas polfmeros hidrosolubles unidos covalentemente a la primera cadena peptfdica y la segunda cadena peptfdica. Mas preferiblemente, el uno o mas 40 polfmeros hidrosolubles son polfmeros lineales. En una realizacion preferida, el polfmero hidrosoluble es un polietilenglicol (PEG) (p.ej., una molecula de PEG lineal). Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 20.000 Da. Mas preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 10.000 Da. En diversas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 3.400 Da, aproximadamente 5.000 Da o 45 aproximadamente 10.000 Da.
En otra realizacion, la forma multimerica comprende un tetramero peptfdico que comprende: (a) una primera cadena peptfdica; (b) una segunda cadena peptfdica; (c) una tercera cadena peptfdica; (d) una cuarta cadena peptfdica y (e) un resto de ligamiento que conecta dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas, donde dicho 50 tetramero peptfdico se une a y activa el receptor Tie 2. Preferiblemente, la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas son peptidos T7 (SEQ ID NO: 1 o 2). Preferiblemente, el resto de ligamiento comprende uno o mas polfmeros hidrosolubles unidos covalentemente a la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas. Mas preferiblemente, el uno o mas polfmeros hidrosolubles son polfmeros de cadena ramificada. En una realizacion preferida, el polfmero hidrosoluble es un polietilenglicol (PEG) (p.ej., una molecula de PEG de cadena ramificada). 55 Preferiblemente, el PEG ramificado tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 20.000 Da. En diversas realizaciones, el PEG ramificado tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 3.400 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 10.000 Da o aproximadamente 20.000 Da.
Las formas multimericas de la invencion exhiben actividad agonista de Tie 2. Por ejemplo, en una realizacion, la forma multimerica estimula la fosforilacion de Tie 2. En otra realizacion, la forma multimerica estimula la fosforilacion de MAPK, AKT y eNOS. Preferiblemente, una forma multimerica de la invencion tiene al menos un efecto sobre las celulas endoteliales seleccionado de entre el grupo consistente en: estimulacion de la migracion de celulas 5 endoteliales, estimulacion de la liberacion de MMP2 de celulas endoteliales y proteccion de celulas endoteliales de la apoptosis inducida por la retirada de suero y, aun mas preferiblemente, tiene los tres efectos sobre las celulas endoteliales. Preferiblemente, la forma multimerica estimula una respuesta angiogenica in vivo en un ensayo de Matrigel. Preferiblemente, la forma multimerica estimula la curacion de heridas en un sujeto cuando se aplica por via topica a una herida del sujeto.
10
En una realizacion particularmente preferida, la invencion proporciona una composicion que comprende una forma tetramerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2, donde el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende una estructura A-B-C donde:
15 A comprende un peptido de union a Tie 2 seleccionado de un peptido T7 (SEQ ID NO: 1 o 2) y un peptido GA3 (SEQ ID NO: 3 o 4);
B comprende un espaciador de polietilenglicol y C comprende un grupo biotina,
donde cuatro copias de A-B-C se asocian con un agente tetramerico D creando la forma tetramerica, estando 20 seleccionado el agente tetramerico D de entre el grupo consistente en avidina, estreptavidina y neutravidina.
Se proporcionan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden la forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 y un portador farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, el portador farmaceuticamente aceptable es adecuado para administracion topica. En otra realizacion, el portador 25 farmaceuticamente aceptable es adecuado para administracion sistemica.
Se describen tambien procedimientos para elaborar las formas multimericas de la invencion. Por ejemplo, la invencion proporciona un procedimiento de elaboracion de un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende una estructura A-B-C, donde:
30 A comprende un peptido de union a Tie 2,
B comprende un espaciador de polietilenglicol y C comprende un grupo biotina;
comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un peptido de union a Tie 2 que comprende un residuo aminoacfdico aminoterminal que comprende un primer grupo reactivo con un reactivo que comprende la estructura: 35 segundo grupo reactivo-B-C, donde el primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo formando A-B- C. Aun mas, la invencion proporciona un procedimiento de elaboracion de una forma tetramerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 A-B-C, comprendiendo el procedimiento combinar el monomero peptfdico de union a Tie 2 A-B-C con un agente tetramerico a una relacion 4:1, estando seleccionado el agente tetramerico D de entre el grupo consistente en avidina, estreptavidina y neutravidina.
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Se describe tambien un procedimiento de deteccion de una forma multimerica de la invencion, donde el procedimiento de deteccion comprende poner en contacto una composicion de la invencion con un anticuerpo monoclonal que se une especfficamente a un peptido de union a Tie 2 contenido en la composicion, por ejemplo una composicion de la invencion que comprende un peptido T7 puede detectarse usando un anticuerpo monoclonal que 45 se una especfficamente al peptido T7. Las composiciones de anticuerpo monoclonal que se unen especfficamente al peptido T7 estan tambien englobadas por la invencion.
Aun otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de activacion de un receptor Tie 2 que comprende poner en contacto el receptor Tie 2 con la forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de 50 tal modo que se active el receptor Tie 2. La activacion del receptor Tie 2 puede probarse, por ejemplo, por la fosforilacion del residuo de tirosina 992 (Y992) del receptor Tie 2 o por la fosforilacion de MAPK, AKT o eNOS.
Aun otro aspecto de la invencion atane a una composicion como se proporciona para uso en un procedimiento de estimulacion de la angiogenesis en un sitio del sujeto, que comprende poner en contacto el sitio con la forma 55 multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que se estimule la angiogenesis en el sitio del sujeto. La forma multimerica puede ponerse en contacto con el sitio, por ejemplo, por administracion topica de la forma multimerica o administracion sistemica de la forma multimerica. Preferiblemente, la angiogenesis estimulada por la forma multimerica se caracteriza por al menos una de las siguientes propiedades:
(a) reclutamiento de celulas de soporte perivasculares;
(b) no filtracion de los vasos; y
(c) arborizacion bien definida
5 En una realizacion del procedimiento de estimulacion de la angiogenesis, el procedimiento comprende ademas poner en contacto el sitio del sujeto con un segundo agente angiogenico, tal como VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF y factor de crecimiento placentario (PLGF). El procedimiento de estimulacion de la angiogenesis puede usarse en situaciones clfnicas tales como la vascularizacion de tejidos regenerativos, enfermedad isquemica de los miembros, isquemia cerebral, afecciones de inflamacion vascular, 10 arteriosclerosis, necrosis avascular, estimulacion del crecimiento del cabello y disfuncion erectil.
Otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de disminucion de la permeabilidad vascular en un sitio de vasos filtrantes. El procedimiento comprende poner en contacto el sitio de vasos filtrantes con una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que disminuya la permeabilidad vascular. El 15 procedimiento de disminucion de la permeabilidad vascular puede usarse en situaciones clfnicas tales como apoplejfa, degeneracion macular, edema macular, edema linfatico, degradacion de la barrera hematorretiniana y normalizacion de los vasos tumorales.
Otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de proteccion de celulas endoteliales. El procedimiento 20 comprende poner en contacto las celulas endoteliales con una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que se protejan las celulas endoteliales. El procedimiento de proteccion de celulas endoteliales puede usarse en situaciones clfnicas tales como fibrosis renal, apoplejfa, degeneracion macular y complicaciones diabeticas.
25 Aun otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de estimulacion de la curacion de una herida en un sujeto, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la herida con la forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que se estimule la curacion de la herida en el sujeto. La forma multimerica puede ponerse en contacto con la herida, por ejemplo, mediante administracion topica de la forma multimerica o administracion sistemica de la forma multimerica. En una realizacion preferida, la herida es una ulcera 30 diabetica. En otras realizaciones, la herida es, por ejemplo, una ulcera de decubito, una ulcera de presion, una incision quirurgica, una lesion traumatica de tejido, una quemadura o un injerto cutaneo.
La invencion proporciona tambien diversos biomateriales a los que se incorpora una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion. El biomaterial puede ser, por ejemplo, Matrigel, un sustituto de 35 la piel o un hidrogel de glicosaminoglicano reticulado. En una realizacion del biomaterial, se incorpora tambien un segundo agente al biomaterial. Dicho segundo agente puede ser, por ejemplo, VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF o factor de crecimiento placentario (PLGF).
Breve descripcion de los dibujos
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La Figura 1A es un diagrama esquematico de vasculotida no agrupada, preparada mediante ligamiento del peptido T7 con un reactivo de marcaje de biotina que contiene un espaciador de PEG (maleimida-PEO2-biotina).
La Figura 1B es una inmunotransferencia de un ensayo de interaccion y precipitacion (pull down) in vitro, que 45 muestra que la vasculotida no agrupada, pero no un peptido biotinilado irrelevante, se une especfficamente a Tie 2 en este ensayo.
La Figura 1C es un analisis de inmunotransferencia de lisados de HUVEC estimuladas con Ang 1, avidina, vasculotida no agrupada o vasculotida agrupada a diversas dosis, mostrando que el tratamiento con vasculotida 50 agrupada da como resultado la activacion de Tie 2 (Tek) y las protefnas de senalizacion posteriores eNOS, MAPK y AKT.
La Figura 1D es una inmunotransferencia de analisis de dosis de lisados de Eahy926 EC estimuladas con vasculotida no agrupada o vasculotida agrupada, que muestra que la vasculotida agrupada activa la fosforilacion del 55 receptor Tie 2 a concentraciones en el intervalo de 200 pM a 750 pM.
La Figura 1E es un analisis de inmunotransferencia de la cinetica de activacion de la activacion de Tie 2 en HUVEC estimuladas con Ang 1 o vasculotida agrupada durante diversos tiempos, mostrando que la vasculotida agrupada activa Tie 2, AKT y MAPK, pero no FAK, en HUVEC, con una cinetica de activacion que imita estrechamente la de
Ang 1 recombinante.
La Figure 1F es un analisis de inmunotransferencia de lisados de celulas C166 (izquierda) o celulas Cos1 (derecha), que son fenotfpicamente nulas de expresion de Tie 2. Se infectaron las celulas con adenovirus recombinante que 5 codifica EGFP (carriles Ad-EGFP) o Tie 2 (carril Ad-Tek; control positivo). Se estimularon las celulas infectadas con Ad-EGFP con vasculotida agrupada o no agrupada, ninguna de las cuales fue capaz de estimular la fosforilacion de AKT o MAPK por encima de los niveles basales no estimulados.
La Figura 2A es una grafica de barras de los resultados de un experimento ELISA de muerte celular, que muestra 10 que la vasculotida agrupada reduce la muerte celular inducida por la retirada de suero de las celulas HUVEC.
La Figura 2B es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de migracion de camara de Boyden modificada, que muestran que la vasculotida agrupada promueve una migracion celular quimiotactica que es indistinguible estadfsticamente de la migracion inducida por VEGF (100 ng/ml) o Ang 1 (500 ng/ml).
15
La Figura 2C es un analisis zimografico en gelatina de medio acondicionado de celulas HUVEC estimuladas con VEGF, vasculotida no agrupada o vasculotida agrupada, indicando un papel para la vasculotida agrupada en la promocion de la liberacion de MMP2.
20 La Figura 3A es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de Matrigel que cuantifica el numero de vasos en cada grupo de tratamiento, mostrando que la vasculotida agrupada, sola o en combinacion con VEGF, aumenta el numero de vasos.
La Figura 3B es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de Matrigel que cuantifica la longitud de vaso 25 en cada grupo de tratamiento, mostrando que la vasculotida agrupada, sola o en combinacion con VEGF, aumenta la longitud de vaso.
La Figura 3C es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de Matrigel que cuantifica el numero de nodos en cada grupo de tratamiento, mostrando que la vasculotida agrupada, sola o en combinacion con VEGF, aumenta 30 el numero de nodos.
La Figura 4A es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de cierre de herida que cuantifica los recuentos de pfxeles totales de los trazados digitales de los margenes de herida con el tiempo, mostrando que el tratamiento con vasculotida agrupada conduda a disminuciones del margen de herida tan pronto como el dfa 2 de 35 tratamiento.
4B es una microfotograffa representativa de secciones de piel tenidas con hematoxilina-eosina (H&E) y tricromica de Masson (MT) de heridas tratadas con PBS, bFGF (10 pg/ml) o vasculotida agrupada (5 nM).
40 La Figura 4C es una grafica de barras de los resultados de puntuacion histologica de un ensayo de cierre de herida que cuantifica la reepitelizacion, tejido de granulacion y neovascularizacion e inflamacion usando una escala de 0-4, mostrando que el tratamiento con vasculotida agrupada daba como resultado una reepitelizacion retardada, pero promovfa grandes aumentos en la regranulacion y neovascularizacion.
45 La Figura 5A es una grafica de barras de los resultados de un ensayo de migracion de camara de Boyden modificada, que muestra que el compuesto que contiene peptido GA3 multimerico promueve la migracion celular quimiotactica.
La Figura 5B es un analisis zimografico en gelatina de medios acondicionados de celulas HUVEC estimuladas con 50 un compuesto que contiene peptido GA3 multimerico que demuestra que el compuesto puede promover la liberacion de MMP2.
La Figura 6 es una ilustracion esquematica de agonistas de Tie 2 que contienen peptido T7 ligados a PEG, a los que se hace referencia en la presente memoria como PEG-vasculotida.
La Figura 7 es un analisis de inmunotransferencia de lisados de celulas endoteliales vasculares bovinas (bVEC) estimuladas con PTE200-T7 (T7 ligado a PEG tetramerico, 20.000 Da de PM) a 5 pg/ml, mostrando que el tratamiento con PTE200-T7 da como resultado la activacion de Tie 2.
La Figura 8 es un analisis de inmunotransferencia de lisados de celulas endoteliales vasculares bovinas (bVEC) estimuladas con DE100-T7 (T7 ligado a PEG dimerico, 10.000 Da de PM) a 250 ng/ml o 500 ng/ml, mostrando que el tratamiento con DE100-T7 da como resultado la activacion de Tie 2.
5 La Figura 9 es un analisis de inmunoprecipitacion/inmunotransferencia de lisados de tejido pulmonar de ratones CD1 estimulados in vivo con DE100-T7 (T7 ligado a PEG dimerico, 10.000 Da de PM) a 5 pg o 100 pg, DE200-T7 (T7 ligado a PEG dimerico, 20.000 Da de PM) a 10 pg o 50 pg), PTE200-T7 (T7 ligado a PEG tetramerico) a 5 pg o 75 pg, o PBS, que examina la fosfonlacion de Tie 2 y de los marcadores de ruta posteriores MAPK y AKT.
10 La Figura 10 es un analisis de transferencia de puntos para valorar la especificidad de anticuerpos monoclonales de raton genomanipulados para detectar el peptido T7 usando PTE200-T7 como antfgeno.
La Figura 11 es un analisis de inmunotransferencia para valorar la especificidad de anticuerpos monoclonales de raton genomanipulados para detectar el peptido T7 usando T7-BSA como antfgeno.
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Descripcion detallada de la invencion
Esta invencion atane a formas multimericas de un monomero peptfdico de union a Tie 2 y a composiciones y usos de las mismas. Como se demuestra en la presente memoria, cuando se multimerizaba un peptido conocido por 20 unirse a Tie 2, se mostraba que era capaz de activar Tie 2 y sus rutas de senalizacion asociadas. Ademas, esta activacion se ha demostrado que da como resultado la produccion de respuestas angiogenicas tanto in vitro como in vivo. Es mas, se ha demostrado que la activacion del eje de senalizacion de Tie 2 pleyotropico por el compuesto multimerico de la invencion puede producir vasos sangufneos que estan altamente organizados y bien soportados por celulas de soporte miogenicas. La estimulacion de la curacion de heridas por la forma multimerica de la 25 invencion se ha demostrado tambien. Por consiguiente, las formas multimericas de la invencion pueden aplicarse a una amplia variedad de situaciones en que sea deseable la estimulacion de la angiogenesis y/o la curacion de heridas.
Antes de describir adicionalmente la invencion, puede ser de ayuda para entender la misma exponer las definiciones 30 de ciertos termicos que se usan en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, el termino “Tie 2” hace referencia a una protefna tirosina cinasa receptora que se expresa casi exclusivamente en celulas endoteliales y que es tambien conocida en la materia como TEK, p140 TEK, CD202B y VMCM. El termino “Tie 2” pretende englobar el receptor de cualquier especie que exprese este 35 receptor, aunque se prefiere Tie 2 humano. Las secuencias de ARNm y protefna de Tie 2 humano se exponen en los numeros de acceso a GenBank NM_000459 y NP_000450, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “angiopoyetina” pretende hacer referencia a una cualquiera de una familia de factores de crecimiento proteicos conocidos por ser ligandos de Tie 2, incluyendo angiopoyetina 1 (o Ang 40 1), angiopoyetina 2 (o Ang 2), angiopoyetina 3 (o Ang 3) y angiopoyetina 4 (o Ang 4). El termino “angiopoyetina” pretende englobar el factor de crecimiento de cualquier especie que exprese el factor de crecimiento, aunque se prefieren los miembros de la familia de angiopoyetina humana. Las secuencias de ARNm y protefna de Ang 1 humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_001146 y NP_001137, respectivamente. Las secuencias de ARNm y protefna de Ang 2 humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_001147 y NP_001138, 45 respectivamente. Las secuencias de ARNm y protefna de Ang 4 humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_015985 y NP_057069, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “MAPK” pretende hacer referencia a la protefna cinasa activada por mitogeno, tambien conocida como ERK o cinasa regulada por senal extracelular, una cinasa intracelular que se 50 fosforila tras la activacion de Tie 2. El termino “MAPK” pretende englobar la cinasa de cualquier especie que exprese la cinasa, aunque se prefiere MAPK humana. Las secuencias de ARNm y protefna de MAPK humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_002736 y NP_002745, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “AKT” pretende hacer referencia a una protefna cinasa tambien 55 conocida como homologo de oncogen vfrico de timoma de murino v-akt, una cinasa intracelular que se fosforila tras la activacion de Tie 2. El termino “AKT” pretende englobar la cinasa de cualquier especie que exprese la cinasa, aunque se prefiere AKT humana. Las secuencias de ARNm y protefna de AKT humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_001014431 y NP_001014431, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “eNOS” pretende hacer referenda a una oxido nftrico sintetasa de celula endotelial, tambien conocida como NOS 3, NOS III o ECNOS, una enzima intracelular que se fosforila tras la activacion de Tie 2. El termino “eNOS” pretende englobar la enzima de cualquier especie que exprese la enzima, aunque se prefiere eNOS humana. Las secuencias de ARNm y protefna de eNOS humana se exponen en los n.os de 5 acceso a GenBank NM_000603 y NP_000594, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “MMP2” pretende hacer referencia a la metaloproteinasa de matriz 2, una protefna secretada por celulas endoteliales que esta implicada en la degradacion de la matriz extracelular. El termino “MMP2” pretende englobar la protefna de cualquier especie que exprese la protefna, aunque se prefiere 10 MMP2 humana. Las secuencias de ARNm y protefna de MMP2 humana se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_004530 y NP_004521, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “VEGF” pretende hacer referencia a factor de crecimiento endotelial vascular, tambien conocido como VPF o factor de permeabilidad vascular, un factor de crecimiento implicado en el 15 crecimiento y angiogenesis de celulas endoteliales. El termino “VEGF” pretende englobar el factor de crecimiento de cualquier especie que exprese el factor de crecimiento, aunque se prefiere VEGF humano. Las secuencias de ARNm y protefna de VEGF humano (variante 1) se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_001025366 y NP_001020537, respectivamente.
20 Como se usa en la presente memoria, el termino “PDGF” pretende hacer referencia al factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor mitogenico para celulas de origen mesenquimatico. El termino “PDGF” pretende englobar el factor de crecimiento de cualquier especie que exprese en factor de crecimiento, aunque se prefiere PDGF humano. La protefna tiene una cadena alfa y una cadena beta y puede existir como homodfmero o heterodfmero. Las secuencias de ARNm y protefna de PDGF alfa humana (isoforma 1) se exponen en los n.os de acceso a GenBank 25 NM_002607 y NP_002598, respectivamente. Las secuencias de ARNm y protefna de PDGF beta humana (isoforma 1) se exponen en los n.os de acceso a GenBank NM_002608 y NP_002599, respectivamente.
Como se usa en la presente memoria, el termino “peptido de union a Tie 2” pretende englobar peptidos de al menos dos aminoacidos de longitud y preferiblemente no mas de 100 aminoacidos de longitud que tienen afinidad de union 30 por Tie 2. El termino “peptido de union a Tie 2” no pretende englobar ligandos de origen natural de Tie 2, tales como protefnas de angiopoyetina completas nativas. Ademas, el termino “peptido de union a Tie 2” pretende englobar peptidos compuestos total o parcialmente por L-aminoacidos, peptidos compuestos total o parcialmente por D- aminoacidos y peptidos compuestos por tanto L- como D-aminoacidos. Es mas, el termino “peptido de union a Tie 2”, pretende englobar peptidos compuestos total o parcialmente por los 20 residuos aminoacfdicos de origen natural, 35 peptidos compuestos total o parcialmente por residuos aminoacfdicos de origen no natural y peptidos compuestos por residuos aminoacfdicos tanto de origen natural como de origen no natural.
Como se usa en la presente memoria, el termino “monomero peptfdico de union a Tie 2” pretende hacer referencia a una unica unidad de compuesto peptfdico de union a Tie 2. El compuesto peptfdico de union a Tie 2, o monomero, 40 comprende el peptido de union a Tie 2 y puede comprender otros restos qufmicos (p.ej., espaciadores, grupos multimerizadores y similares), pero el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende solo una copia (o unidad) del peptido de union a Tie 2 y por tanto tiene una unica valencia para el receptor Tie 2.
Como se usa en la presente memoria, el termino “forma multimerica” de un monomero peptfdico de union a Tie 2 45 pretende hacer referencia a formas que contienen mas de una unidad de monomero peptfdico de union a Tie 2, de tal modo que la forma multimerica (p.ej. dfmero, tetramero y similar) comprenda mas de una copia (o unidad) del peptido de union a Tie 2 y por tanto tenga multivalencia para el receptor Tie 2.
Como se usa en la presente memoria, el termino “alta afinidad”, como se usa con respecto a la union de un peptido 50 de union al receptor Tie 2, pretende significar union del peptido al receptor con una Kd de aproximadamente 10"3 M o menos, mas preferiblemente 10"4 M o menos, aun mas preferiblemente 10"5 M o menos.
Como se usa en la presente memoria, “no inhibe sustancialmente la union de una angiopoyetina a Tie 2”, como se usa con respecto a un peptido de union a Tie 2, pretende significar que la capacidad del peptido de union a Tie 2 de 55 inhibir la union de una angiopoyetina (p.ej., Ang 1) a Tie 2 es esencialmente no mayor que la capacidad de un peptido de control no relacionado (p.ej., un peptido que no tiene afinidad mensurable por Tie 2) de inhibir la union de una angiopoyetina (p.ej., Ang 1) a Tie 2.
Como se usa en la presente memoria, el termino “actividad agonista de Tie 2” pretende hacer referencia a estimular,
potenciar, aumentar o regular positivamente la actividad del receptor Tie 2, como se mide de acuerdo con cualquier procedimiento, tecnica, senal, detector o indicador que sea conocido en la materia por ser indicativo de actividad del receptor Tie 2. Los ejemplos no limitantes de dichos indicadores de la actividad de Tie 2 incluyen la fosforilacion de Tie 2 humano en el residuo aminoacfdico Y992 o la fosforilacion de una o mas de MAPK, AKT y eNOS.
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La invencion se describe con mas detalle en las siguientes subsecciones, presentandose dichas subsecciones solo con fines de claridad y no debiendo en modo alguno considerarse como limitaciones. La invencion se define por las reivindicaciones.
10 I. Formas multimericas de monomeros peptfdicos de union a Tie 2
Esta invencion proporciona una composicion que comprende una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2, donde la forma multimerica tiene actividad agonista de Tie 2. Por tanto, la composicion tiene dos aspectos que considerar: la estructura del monomero peptfdico de union a Tie 2 mismo y los medios mediante los 15 cuales se multimeriza el monomero creando la forma multimerica que tiene actividad agonista de Tie 2, discutiendose ambos de dichos aspectos adicionalmente en la presente memoria. En una realizacion, la forma multimerica comprende un numero par de unidades de monomero. En una realizacion preferida, la forma multimerica es un tetramero. En otra realizacion preferida, la forma multimerica es un dfmero. En aun otras realizaciones, la forma multimerica comprende 6, 8, 10 o 12 unidades del monomero peptfdico de union a Tie 2. En otra realizacion, 20 la forma multimerica comprende un numero impar de unidades de monomero. Por ejemplo, la forma multimerica puede ser un trfmero o la forma multimerica puede comprender 5, 7, 9 u 11 unidades de monomero peptfdico de union a Tie 2.
El monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende un peptido que tiene actividad de union a Tie 2. Ademas, el 25 monomero puede comprender otros restos qufmicos, que se discuten con mas detalle a continuacion.
El peptido de union a Tie 2 contenido en el monomero es de al menos 2 aminoacidos de longitud, mas preferiblemente es de al menos 5 aminoacidos de longitud y aun mas preferiblemente es de al menos 7 aminoacidos de longitud. Es un intervalo de tamano preferido del peptido 7-25 aminoacidos de longitud, mas preferiblemente 7-15 30 aminoacidos de longitud. Otros intervalos de tamano incluyen 5-30 aminoacidos de longitud, 5-40 aminoacidos de longitud, 5-50 aminoacidos de longitud, 5-60 aminoacidos de longitud, 5-70 aminoacidos de longitud, 5-80 aminoacidos de longitud, 5-90 aminoacidos de longitud o 5-100 aminoacidos de longitud. El peptido es de no mas de 100 aminoacidos de longitud.
35 En una realizacion, el peptido de union a Tie 2 en el monomero comprende una secuencia aminoacfdica que esta presente en un ligando de Tie 2 nativo (p.ej. una angiopoyetina, tal como Ang 1 o Ang 2). Por ejemplo, puede usarse un fragmento de una angiopoyetina que retiene la capacidad de unirse a Tie 2 como peptido de union a Tie 2. Como alternativa, en otra realizacion, el peptido de union a Tie 2 en el monomero comprende una secuencia aminoacfdica que no esta presente en un ligando de Tie 2 nativo. Se ha mostrado que pueden seleccionarse peptidos que tienen 40 secuencias aminoacfdicas que difieren de la secuencia primaria de angiopoyetinas que tienen afinidad por Tie 2 (vease, p.ej., Tournaire, R, et al. (2004) EMBO Reports 5 262-267). Dichos peptidos pueden identificarse, por ejemplo, cribando en una coleccion de peptidos exhibida en fago (p.ej., una coleccion aleatoria de 7 unidades) los peptidos que se unen a Tie 2 (p.ej., una protefna de fusion Tie 2-Fc), con confirmacion de la union peptfdica a Tie 2 mediante cribado en el peptido seleccionado de la union a Tie 2 usando un ensayo ELISA (p.ej., como se describe 45 en Tournaire, R. et al. (2004) supra).
Es preferible que el peptido de union a Tie 2 usado en el monomero se una a Tie 2 con alta afinidad, pero que no inhiba sustancialmente la union de una angiopoyetina a Tie 2. Esta realizacion es preferible, de modo que la forma multimerica no compita con las angiopoyetinas nativas por la union a Tie 2. Por ejemplo, preferiblemente el peptido 50 de union a Tie 2 se une a Tie 2 con alta afinidad, pero no inhibe sustancialmente la union de Ang 1 a Tie 2. Adicionalmente, o como alternativa, preferiblemente el peptido de union a Tie 2 se une a Tie 2 con alta afinidad, pero no inhibe sustancialmente la union de, por ejemplo, Ang 2 o Ang 4 a Tie 2.
En una realizacion preferida, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende un peptido T7, comprendiendo 55 dicho peptido T7 una secuencia aminoacfdica: His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 1). En una realizacion, el peptido T7 tiene un residuo de cistefna aminoterminal anadido al mismo y, por tanto, el peptido T7 comprende una secuencia aminoacfdica: Cys-His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 2).
En otra realizacion preferida, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende un peptido GA3, comprendiendo
dicho peptido GA3 una secuencia aminoacfdica: Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg- Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO: 3). En una realizacion, el peptido GA3 tiene un residuo de cistefna aminoterminal anadido al mismo y, por tanto, en esta realizacion el peptido FA3 comprende una secuencia aminoacfdica: Cys-Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys (SEQ 5 ID NO: 4).
En aun otra realizacion, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende un peptido T8, comprendiendo dicho peptido T8 una secuencia aminoacfdica: His-Pro-Trp-Leu-Thr-Arg-His (SEQ ID NO: 5). En una realizacion, el peptido T8 tiene un residuo de cistefna aminoterminal anadido al mismo y, por tanto, en esta realizacion el peptido T8 10 comprende una secuencia aminoacfdica: Cys-His-Pro-Trp-Leu-Thr-Arg-His (SEQ ID NO: 6).
En aun otra realizacion, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende un peptido T6, comprendiendo dicho peptido T6 una secuencia aminoacfdica: Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Lys (SEQ ID NO: 7). En una realizacion, el peptido T6 tiene un residuo de cistefna aminoterminal anadido al mismo y, por tanto, en esta realizacion el peptido T6 15 comprende una secuencia aminoacfdica: Cys-Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Lys (SEQ ID NO: 8).
En una realizacion alternativa, el peptido de union a Tie 2 usado en el monomero puede comprender un peptido que compite con una angiopoyetina (p.ej., Ang 1) por la union a Tie 2. Es un ejemplo no limitante de dicho peptido un peptido T4, comprendiendo dicho peptido T4 una secuencia aminoacfdica: Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser (SEQ ID 20 NO: 9). En una realizacion, el peptido T4 tiene un residuo de cistefna aminoterminal anadido al mismo y, por tanto, en esta realizacion el peptido T4 comprende una secuencia aminoacfdica: Cys-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser (SEQ ID NO: 10).
Los peptidos de union Tie 2 T4, T6, T7 y T8 se describen tambien en Tournaire, R. et al. (2004) EMBO Reports 5: 25 262-267. El peptido de union a Tie 2 Ga3 se describe tambien en Wu, X. et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 315: 1004-1010.
Ademas del peptido de union a Tie 2, el monomero peptfdico de union a Tie 2 puede comprender otros restos o grupos qufmicos tales como espaciadores y/o grupos multimerizadores. Por ejemplo, el peptido de union a Tie 2 30 puede ligarse a un espaciador, que puede servir para una o mas funcionalidades. El espaciador puede funcionar, por ejemplo, aumentando la distancia entre los monomeros cuando se multimerizan, facilitando la interaccion de la forma multimerica con el receptor Tie 2 (p.ej. reduciendo el impedimento esterico). Adicionalmente, o como alternativa, el espaciador puede servir, por ejemplo, como grupo qufmico mediante el cual pueden multimerizarse los monomeros. Ademas, el monomero peptfdico de union a Tie 2 puede comprender uno o mas grupos multimerizantes, restos 35 qufmicos que funcionan facilitando la multimerizacion de los monomeros. Es un grupo multimerizante preferido un grupo biotina, que tiene afinidad por avidina, estreptavidina y neutravidina, de tal modo que puede usarse cualquier de los tres ultimos compuestos para la multimerizacion de monomeros que comprenden un grupo biotina. Es otro ejemplo de un grupo multimerizador un dominio de helice superenrrollada, que puede ligarse con el extremo amino del peptido mediante tecnicas de genomanipulacion de ADN recombinante y que se autoensambla en estructuras 40 oligomericas (veanse, p.ej., las publicaciones de patente de EE.UU. 20030220476 y 20060074230 para una descripcion adicional del uso de dominios de helice superenrrollada para multimerizacion). Los ejemplos no limitantes de dominios de helice superenrrollada adecuados para uso son los dominios de helice superenrrollada del factor de transcripcion de levadura GCN4, de la protefna de matriz de cartflago (CMP) o de la protefna de matriz oligomerica de cartflago (COMP).
45
Es un espaciador preferido un espaciador de polietilenglicol (PEG), que es una molecula polimerica que puede contener diferentes numeros de unidades, tales como 2, 4, 6, 8, 10, 11 o 12 unidades. Los polfmeros de PEG son tambien conocidos en la materia como polfmeros de poli(oxido de etileno) (PEO) y por tanto los terminos PEG y PEO como se usan en la presente memoria se pretende que sean equivalentes. Son bien conocidos en la materia 50 numerosos otros espaciadores adecuados (tambien conocidos como ligadores), cuyos ejemplos no limitantes incluyen otros polialquilenglicoles, poliesteres y polialquilenaminas. Ademas, estan comercialmente disponibles una amplia variedad de espaciadores ligados por un extremo con un resto reactivo y por el otro extremo con un grupo biotina (reactivos EZ-Link Biotina disponibles en Pierce Chemical Co., Rockford, iL, EE.UU.) y pueden usarse en la preparacion de los monomeros peptfdicos de union a Tie 2 de la invencion. Los ejemplos no limitantes de reactivos 55 comercialmente disponibles de estructura: resto reactivo-espaciador-biotina incluyen:
Reactivos que reaccionan con sulfhidrilo:
EZ-Link biotina-BMCC (1-biotinamido-4-(4'-[maleimidoetil-ciclohexano]-carboxamido)butano)
EZ-Link biotina-HPDP (W-(6-(biotinamido)hexil)-3'-(2'-piridilditio)-propionamida EZ-Link yodoacetil-LC-biotina (W-yodoacetil-W-biotinilhexilendiamina)
EZ-Link yodoacetil-PEO2 biotina ((+)-biotinil-yodoacetamidil-3,6-dioxaoctanodiamina)
EZ-Link maleimida PEOn-biotina (n= 2 u 11)
5
Reactivos que reaccionan con amina:
EZ-Link NHS-PEOn-biotina (n= 4 o 12)
EZ-Link NHS-SS-biotina (2-(biotinamido)-etil-1,3'-ditiopropionato) de succinimidilo)
EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina (6-(biotinamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo)
10 EZ-Link TFP-PEO3-biotina (ester tetrafluorofenflico de PEO3-biotina
Reactivos que reaccionan con carboxilo:
EZ-Link 5-(biotinamido)pentilamina
EZ-Link amino-PEO2-biotina reactivo de marcaje ((+)-biotinyl-3,6-dioxaoctanodiamina)
15 EZ-Link amino-PEO3-biotina reactivo de marcaje ((+)-biotinil-3,6,9-trioxaundecanodiamina)
EZ-Link biotina PEO-amina ((+)-biotinil-3,6-dioxaoctanodiamina)
EZ-Link biotina-PEO-LC-amina ((+)-biotinil-3,6,9-trioxaundecanodiamina)
Ademas, puede ligarse un espaciador de brazo ramificado con multiples copias del peptido de union Tie 2 como 20 medio de multimerizar el peptido. Los ejemplos no limitantes incluyen espaciadores de PEG ramificados activados de 2 a 4 brazos, aunque pueden usarse tambien espaciadores con mas brazos, tales como espaciadores de PEG ramificados activados de 8 a 12 brazos. Estan comercialmente disponibles espaciadores de PEG activados ramificados (p.ej., activados con maleimida) (p.ej., NOF Corporation, Tokio, Japon).
25 En una realizacion preferida, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende la estructura: A-B-C, donde A comprende un peptido de union a Tie 2, B comprende un espaciador y C comprende un grupo multimerizador, donde C tiene afinidad por D, un agente multimerico que comprende multiples sitios de union para C. En una realizacion particularmente preferida, el agente multimerico D tiene cuatro sitios de union para el grupo multimerizante C, de tal modo que se forma un tetramero cuando interaccionan cuatro monomeros peptfdicos de union a Tie 2, A-B-C, con el 30 agente multimerico D. Es un agente multimerizante preferido C para uso en la creacion de tetrameros, un grupo biotina. Son agentes multimericos preferidos D para uso en la creacion de tetrameros avidina, estreptavidina y neutravidina. Es bien conocido en la materia que avidina, estreptavidina y neutravidina tienen cuatro sitios de union para biotina y que la biotina se une con alta afinidad con cada una de avidina, estreptavidina y neutravidina. Es un espaciador preferido B, para uso en un monomero de estructura A-B-C, un espaciador de polietilenglicol (PEG).
35
En otra realizacion, el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende la estructura: A-B, donde A comprende un peptido de union a Tie 2 y B comprende un espaciador, donde la forma multimerica se crea mediante ligamiento covalente de multiples monomeros peptfdicos de union a Tie 2 a traves del espaciador B. Es un espaciador preferido B, para uso en un monomero de estructura A-B, un espaciador de polietilenglicol (PEG).
40
En una realizacion particularmente preferida, la invencion proporciona una composicion que comprende una forma tetramerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2, donde el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende la estructura: A-B-C, donde:
45 A comprende un peptido de union a Tie 2 seleccionado de entre un peptido T7 y un peptido GA3;
B comprende un espaciador de polietilenglicol; y C comprende un grupo biotina,
donde se asocian cuatro copias de A-B-C con un agente tetramerico D, creando la forma tetramerica, estando 50 seleccionado el agente tetramerico D de entre el grupo consistente en avidina, estreptavidina y neutravidina. Es un ejemplo especffico de esta realizacion el compuesto vasculotida (descrito con detalle en el Ejemplo), en que A comprende un peptido T7, B comprende un espaciador de polietilenglicol y C comprende un grupo biotina, y donde la vasculotida multimerica comprende avidina como agente tetramerico D.
55 En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende un monomero peptfdico de union a Tie 2, comprendiendo el monomero peptfdico de union a Tie 2 una estructura A-B-C, donde:
A comprende un peptido de union a Tie 2;
B comprende un espaciador; y
C comprende un grupo multimerizante.
Preferiblemente, el peptido de union a Tie 2 A comprende un peptido T7 o un peptido GA3. Como alternativa, el peptido de union a Tie 2 puede comprender, por ejemplo, un peptido T8, un peptido T6 o un peptido T4.
5 Preferiblemente, el espaciador B comprende un espaciador de polietilenglicol. Preferiblemente, el grupo multimerizante C comprende un grupo biotina.
En una realizacion preferida, la forma multimerica de la invencion comprende un dfmero peptfdico que comprende: (a) una primera cadena peptfdica; (b) una segunda cadena peptfdica y (c) un resto de ligamiento que conecta dichas 10 primera y segunda cadenas peptfdicas, donde dicho dfmero peptfdico se une a y activa el receptor Tie 2. Preferiblemente, la primera cadena peptfdica es un peptido T7. Preferiblemente, la segunda cadena peptfdica es un peptido T7. Mas preferiblemente, tanto la primera cadena como la segunda cadena peptfdicas son peptidos T7. Como alternativa, la primera y la segunda cadenas peptfdicas pueden seleccionarse independientemente de entre el grupo consistente en un peptido T7, un peptido gA3, un peptido T4, un peptido T6 y un peptido T8, aunque
15 preferiblemente la primera y segunda cadenas peptfdicas son ambas del mismo tipo de cadena peptfdica. Se
describen con mas detalle a continuacion peptidos de union a Tie 2 adicionales que pueden usarse.
Preferiblemente, el resto de ligamiento comprende uno o mas polfmeros hidrosolubles unidos covalentemente a la primera cadena peptfdica y a la segunda cadena peptfdica. Mas preferiblemente, el uno o mas polfmeros 20 hidrosolubles son polfmeros lineales. En una realizacion preferida, el polfmero hidrosoluble es un polietilenglicol (PEG) (p.ej., una molecula de PEG lineal). Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 20.000 Da. Mas preferiblemente, el PEG lineal tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 10.000 Da. En diversas realizaciones, el PEG lineal tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 3.400 Da, aproximadamente 5.000 Da o 25 aproximadamente 10.000 Da. Se entiende que, en una preparacion dada de PEG, los pesos moleculares variaran
tfpicamente entre las moleculas individuales. Algunas moleculas pesaran mas y algunas menos que el peso
molecular expresado. Dicha variacion se refleja generalmente por el uso de la palabra “aproximadamente” para describir los pesos moleculares de las moleculas de PEG.
30 Como se demuestra en el Ejemplo 11, los dfmeros T7-PEG que comprenden PEG que tiene un peso molecular de
10.000 Da exhibfan una activacion efectiva de Tie 2 y de las rutas posteriores (p.ej., MAPK, AKT) in vivo, mientras que los dfmeros T7-PEG que comprenden PEG que tiene un peso molecular de 20.000 Da no activaban efectivamente Tie 2 ni las rutas posteriores, indicando que el ligador de PEG mas largo daba como resultado un dfmero en que las dos cadenas peptfdicas estaban espaciadas demasiado separadas para una activacion optima de
35 Tie 2 y, por tanto, los ligadores mas cortos pueden se preferibles para resultados optimos. Por consiguiente, se prefieren dfmeros que utilizan un ligador de PEG lineal que tiene un peso molecular menor de aproximadamente
20.000 Da, mas preferiblemente que tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 10.000 Da.
40 En otra realizacion, la forma multimerica de la invencion comprende un tetramero peptfdico que comprende: (a) una primera cadena peptfdica; (b) una segunda cadena peptfdica; (c) una tercera cadena peptfdica; (d) una cuarta cadena peptfdica y (e) un resto de ligamiento que conecta dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas, donde dicho tetramero peptfdico se une a e inactiva el receptor Tie 2. Preferiblemente, la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas son peptidos T7. Como alternativa, la primera, segunda, tercera y 45 cuarta cadenas peptfdicas pueden seleccionarse independientemente de entre el grupo consistente en un peptido T7, un peptido GA3, un peptido T4, un peptido T6 y un peptido T8, aunque preferiblemente la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas son todas del mismo tipo de cadena peptfdica. Se describen con mas detalle anteriormente peptidos de union a Tie 2 adicionales que pueden usarse.
50 Preferiblemente, el resto de ligamiento comprende uno o mas polfmeros hidrosolubles unidos covalentemente a la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas peptfdicas. Mas preferiblemente, el uno mas polfmeros hidrosolubles son polfmeros de cadena ramificada. En una realizacion preferida, el polfmero hidrosoluble es un polietilenglicol (PEG) (p.ej. una molecula de PEG de cadena ramificada). Como se demuestra en el Ejemplo 11, un tetramero T7- PEG que utiliza un ligador de PEG tetramerico de cadena ramificada que tiene un peso molecular de 20.000 Da era 55 efectico para activar Tie 2 y las rutas posteriores (p.ej., MAPK, AKT) in vivo. Preferiblemente, el PEG ramificado tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 3.000 Da a aproximadamente 20.000 Da. En diversas realizaciones, el PEG ramificado tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 3.400 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 10.000 Da o aproximadamente 20.000 Da. Se entiende que, en una preparacion dada de PEG, los pesos moleculares variaran tfpicamente entre las moleculas individuales. Algunas
moleculas pesaran mas y algunas menos que el peso molecular expresado. Dicha variacion se refleja generalmente por el uso de la palabra “aproximadamente” para describir los pesos moleculares de las moleculas de PEG.
En los dfmeros que contienen PEG, se enlaza simultaneamente un resto de PEG unico, preferiblemente lineal, con 5 los extremos (p.ej. los extremos N) de ambas cadenas peptfdicas del dfmero peptfdico. En los tetrameros que contienen PEG, se enlaza simultaneamente un unico resto de PEG de cadena ramificada con los extremos (p.ej., los extremos N) de las cuatro cadenas peptfdicas del tetramero peptfdico. Dichos dfmeros y tetrameros peptfdicos se ilustran esquematicamente en la Figura 6. Para preparar los compuestos dimericos y tetramericos que contienen PEG descritos anteriormente, pueden hacerse reaccionar peptidos de union a Tie 2 con ligadores de PEG activados 10 (p.ej., PEG-dimaleimida para la preparacion de dfmeros, PEG-tetramaleimida para la preparacion de tetrameros) como se describe con detalle en el Ejemplo 9. Dichos ligadores de PEG activados (de cadena lineal o ramificada) estan comercialmente disponibles (p.ej., de NOF America Corporation).
Ademas de los dfmeros y tetrameros descritos anteriormente, la invencion engloba otras formas multimericas que 15 comprenden dos o mas peptidos de union a Tie 2 ligados por un resto de ligamiento, tales como aquellos que contienen 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 peptidos de union a Tie 2 ligados covalentemente con un resto de ligamiento, preferiblemente un resto de ligamiento ramificado tal como una molecula de PEG de cadena ramificada. Dichas formas multimericas alternativas pueden prepararse como se describe para dfmeros y tetrameros, usando restos de ligamiento que tienen el numero apropiado de extremos reactivos (p.ej., seis extremos reactivos para un multfmero 20 que contiene seis cadenas peptfdicas) y la relacion apropiada de peptido a ligador (p.ej., 6:1 para un multfmero que contiene seis cadenas peptfdicas).
Aunque los ligadores de PEG son ligadores polimericos hidrosolubles preferidos de la invencion, los ligadores polimericos hidrosolubles alternativos incluyen, pero sin limitacion, copolfmeros de etilenglicol/propilenglicol, 25 carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilalcohol, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolfmero de etileno/anhfdrido maleico, poliaminoacidos (homopolfmeros o copolfmeros aleatorios), poli(n- vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolfmeros de propilenglicol, copolfmeros de poli(oxido de propileno)/oxido de etileno y polioles polioxietilados. Para dfmeros peptfdicos, preferiblemente el ligador polimerico tiene un peso molecular de menos de 20.000 Da y mas preferiblemente tiene un peso molecular de 10.000 Da. Para tetrameros 30 peptfdicos, preferiblemente el ligador polimerico tiene un peso molecular de 20.000 Da.
Ademas de polfmeros hidrosolubles, pueden usarse otros tipos de restos de ligamiento conocidos en la materia para unir las cadenas peptfdicas en los multfmeros (p.ej., dos cadenas peptfdicas en el dfmero, cuatro cadenas peptfdicas en el tetramero). Los ejemplos no limitantes de restos de ligamiento adecuados adicionales que pueden usarse para 35 unir multiples cadenas peptfdicas formando multfmeros incluyen aquellos descritos en la publicacion de EE.UU. 20070104704 y la publicacion de EE.UU. 20070027074, cuyos contenidos completos de ambas se incorporan expresamente a la presente memoria como referencia.
Se describe tambien una composicion que comprende un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende una 40 estructura A-B, donde:
A comprende un peptido de union a Tie 2 y B comprende un espaciador.
45 Preferiblemente, el peptido de union a Tie 2 A comprende un peptido T7 o un peptido GA3. Como alternativa, el peptido de union a Tie 2 puede comprender, por ejemplo, un peptido T8, un peptido T6 o un peptido T4. Preferiblemente, el espaciador B comprende un espaciador de polietilenglicol.
La divulgacion proporciona tambien kits que comprenden una o mas composiciones de la invencion, preferiblemente 50 envasadas con instrucciones para el uso del kit. Por ejemplo, en una realizacion preferida, la invencion proporciona un kit que comprende un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende la estructura A-B-C, donde A comprende un peptido de union a Tie 2,
B comprende un espaciador y C comprende un grupo multimerizante;
55 envasados junto con un agente multimerico D, donde C tiene afinidad por D, y donde D comprende multiples sitios de union para C. Los ejemplos preferidos de A, B, C y D son como se describen anteriormente en la presente memoria. Preferiblemente, el kit se envasa con instrucciones para crear una forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 combinando la composicion monomerica con los agentes multimericos de tal modo que se produzca una forma multimerica del monomero.
La divulgacion proporciona un kit que comprende un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende la estructura A-B, donde A comprende un peptido de union a Tie 2 y 5 B comprende un espaciador;
envasados junto con instrucciones para crear una forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 mediante multimerizacion a traves del espaciador B. Opcionalmente, el kit puede contener uno o mas reactivos que facilitan la multimerizacion a traves de B. Los ejemplos preferidos de A y B son como se describen anteriormente en la presente memoria.
10
II. Propiedades caracterfsticas de las formas multimericas de monomeros peptfdicos de union a Tie 2
Las formas multimericas de monomeros peptfdicos de union a Tie 2 proporcionadas por la invencion exhiben actividad agonista de Tie 2. Esta actividad agonista de Tie 2 puede detectarse usando indicadores de la activacion 15 de Tie 2 que estan bien establecidos en la materia y que se describen con detalle en los Ejemplos. Por ejemplo, una forma multimerica de la invencion puede estimular la fosforilacion de Tie 2 (p.ej., fosforilacion en el residuo aminoacfdico Y992 de Tie 2 humano). Ademas, una forma multimerica de la invencion puede estimular la fosforilacion de una molecula en una ruta de senalizacion posterior a Tie 2, tal como la fosforilacion de MAPK, AKT (p.ej., fosforilacion en el residuo aminoacfdico S473 de AKT humana) y/o eNOS (p.ej., fosforilacion en el residuo 20 aminoacfdico S1177 de eNOS). En realizaciones particulares, una forma multimerica de la invencion no estimula la fosforilacion de la cinasa de adhesion focal (FAK) (p.ej., la fosforilacion en el residuo aminoacfdico Y397 de FAK humana), lo que diferencia la forma multimerica de la Ang 1 nativa, que se ha mostrado que activa FAK de manera independiente de Tie 2. La capacidad de una forma multimerica de estimular la fosforilacion de protefnas particulares puede determinarse usando tecnicas estandares bien conocidas en la materia, tales como ensayos de 25 inmunotransferencia de lisados celulares tratados con la forma multimerica, como se describe con detalle en el Ejemplo 3.
En realizaciones preferidas, una forma multimerica de la invencion tiene efectos demostrables sobre celulas endoteliales. Por ejemplo, una forma multimerica de la invencion tiene preferiblemente al menos un efecto sobre 30 celulas endoteliales seleccionado de entre el grupo consistente en: estimulacion de la migracion de celulas endoteliales, estimulacion de la liberacion de MPP2 de celulas endoteliales y proteccion de las celulas endoteliales de la apoptosis inducida por la retirada de suero. Mas preferiblemente, una forma multimerica de la invencion tiene al menos dos de estos efectos sobre celulas endoteliales, y aun mas preferiblemente tiene los tres de estos efectos sobre celulas endoteliales. La capacidad de una forma multimerica de tener cualquiera de estos efectos sobre 35 celulas endoteliales puede determinarse usando ensayos conocidos en la materia, tales como un ensayo de camara de Boyden para valorar la migracion celular, un ensayo de zimograffa para valorar la liberacion de MMP2 o un ensayo de ELISA de muerte celular para valorar la apoptosis inducida por la retirada de suero. Dichos ensayos se describen con detalle en el Ejemplo 4.
40 En realizaciones preferidas, una forma multimerica de la invencion tiene efectos demostrables sobre la angiogenesis, como se mide en un ensayo de angiogenesis in vitro o in vivo. Es un ensayo preferido un ensayo de Matrigel in vivo (descrito con detalle en el Ejemplo 5), en que se impregna Matrigel reducido con factor de crecimiento con la forma multimerica y se inyecta por via subcutanea en un animal de prueba. Despues de un periodo de tiempo (p.ej., 14 dfas), el animal de prueba puede tratarse con un agente que facilite la identificacion y cuantificacion de vasos (p.ej., 45 FITC-lectina) y el tapon de Matrigel puede retirarse y examinarse la respuesta angiogenica. Como se demuestra en el Ejemplo 5, una forma multimerica de la invencion es capaz de inducir una respuesta angiogenica robusta, como se prueba por grandes vasos bien ramificados que contienen un espectro continuo de arteriolas pequenas y grandes y venulas y que se tine positivamente con el marcador de celulas de soporte miogenico Sma I. De forma significativa, las formas multimericas de la invencion pueden estimular una respuesta angiogenica en un ensayo in vivo (p.ej., 50 ensayo de Matrigel) que exhibe patrones de ramificacion mas organizados y menos sinuosidad que la respuesta angiogenica estimulada por VEGF. Es mas, las formas mutimericas preferidas de la invencion, cuando se usan en combinacion con VEGF, pueden disminuir el nivel de sinuosidad de vasos que se observa con el tratamiento con VEFG solo.
55 En realizaciones preferidas, una forma multimerica de la invencion puede estimular la curacion de heridas en un sujeto cuando se aplica por via topica a una herida del sujeto. La capacidad de la forma multimerica de estimular la curacion de heridas puede valorarse en un modelo animal, tal como la cepa B6.Cg-m(+/+)Lepr(db)/J (db/db) de raton, una cepa diabetica de raton que presenta una curacion de heridas alterada. Puede hacerse una herida por escision en el raton, la forma multimerica, incorporada a una formulacion topica, puede aplicarse a la herida y puede
valorarse la curacion de herida como se describe en el Ejemplo 6. Las formas multimericas preferidas de la invencion pueden acelerar los tiempos de cierre de herida y/o pueden promover aumentos de la deposicion de colageno y neovascularizacion.
5 III. Preparacion de formas multimericas de monomeros peptfdicos de union a Tie 2
La preparacion de una forma multimerica de la invencion implica tfpicamente al menos dos etapas: primero, la preparacion del monomero peptfdico de union a Tie 2 y, segundo, la multimerizacion del monomero para crear la forma multimerica.
10
El peptido de union a Tie 2 contenido en el monomero puede prepararse mediante uno de los muchos procedimientos conocidos en la materia para sfntesis peptfdica, incluyendo pero sin limitacion la sfntesis peptfdica en fase solida (SPPS) y la sfntesis peptfdica en fase lfquida (LPPS). Las dos qufmicas mas comunes usadas en la sfntesis peptfdica son Fmoc y Boc; cada qufmica tiene sus propias caracterfsticas de proteccion de cadena lateral 15 que permiten una desproteccion selectiva de las cadenas laterales para modificaciones despues de la sfntesis. Para SPPS, puede encontrarse un resumen de muchas tecnicas en J.M. Stewart y J.D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis". W.FI. Freeman Co. (San Francisco) 1963 y J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, vol. 2, pag. 46, Academic Press (Nueva York), 1973. Es un procedimiento de sfntesis peptfdica preferido el Fmoc-SPPS, cuyo resumen reciente puede encontrarse en W. Chan, “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach”. 20 Oxford University Press (Reino Unido) 1999. Los peptidos pueden sintetizarse usando un sintetizador peptfdico automatico, tal como el sintetizador peptfdico ABI433A de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.).
Ademas de contener la secuencia aminoacfdica que interacciona con el receptor Tie 2, el peptido de union a Tie 2 puede modificarse para contener uno o mas residuos aminoacfdicos adicionales que funcionan facilitando la 25 modificacion adicional del peptido. Por ejemplo, puede anadirse un residuo de cistefna aminoterminal durante la sfntesis a la secuencia del peptido de union a Tie 2, proporcionando un grupo sulfhidrilo reactivo que permita el enlazamiento de uno o mas restos qufmicos adicionales a traves del grupo sulfhidrilo. Resultara evidente para el especialista en la materia que pueden efectuarse diversas otras modificaciones qufmicas del peptido para crear un grupo reactivo que pueda usarse para ligar restos qufmicos al peptido. Por ejemplo, el peptido puede modificarse 30 durante la sfntesis para contener un residuo de lisina aminoterminal que proporcione un grupo amino primario reactivo que permita el enlazamiento de uno o mas restos qufmicos adicionales a traves del grupo amina primario. Como alternativa, el peptido puede modificarse durante la sfntesis para contener un residuo de acido aspartico o acido glutamico aminoterminal que proporcione un grupo carboxilo reactivo que permita el enlazamiento de uno o mas restos qufmicos adicionales a traves del grupo carboxilo. Preferiblemente, la modificacion qufmica del peptido 35 se lleva a cabo en el extremo aminoterminal o carboxiterminal del peptido para minimizar cualquier posible interferencia con la porcion de union a Tie 2 del peptido.
Como se discute anteriormente, el monomero peptfdico de union a Tie 2 puede incluir otros restos qufmicos ademas del peptido de union a Tie 2, tales como un resto espaciador y/o un grupo multimerizante, pudiendo enlazarse dichos 40 restos qufmicos adicionales usando reacciones qufmicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, un peptido de union a Tie 2 que contiene un grupo sulfhidrilo reactivo (p.ej., un residuo de cistefna aminoterminal) puede hacerse reaccionar con un grupo maleimida que esta ligado a uno o mas restos qufmicos adicionales de interes, ligando asf los restos qufmicos adicionales al peptido de union a Tie 2. Los ejemplos no limitantes de reactivos comercialmente disponibles que pueden usarse para ligar un grupo espaciador y un grupo multimerizante con un peptido que tiene 45 un grupo sulfhidrilo reactivo incluyen maleimida-PEO2-biotina y maleimida-PEOn-biotina (Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.). Los ejemplos no limitantes de reactivos comercialmente disponibles que pueden usarse para ligar un grupo espaciador y un grupo multimerizante con un peptido que tiene un grupo amina primario reactivo incluyen NHS-PEO4-biotina, NHS-PEO12-biotina y NHS-SS-biotina (Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.). Los ejemplos no limitantes de reactivos comercialmente disponibles que pueden usarse para ligar un grupo espaciador y 50 un grupo multimerizante con un peptido que tiene un grupo carboxilo reactivo incluyen amina-PEO2-biotina y biotina- PEO-LC- amina (Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.uU.). Otros ejemplos de reactivos adecuados para ligar un reactivo espaciador-biotina con un peptido de union a Tie 2 a traves de un grupo sulfhidrilo reactivo, grupo amina primario o grupo carboxilo se exponen en la subseccion I anterior.
55 La divulgacion proporciona un procedimiento de elaboracion de un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende la estructura: A-B-C, donde:
A comprende un peptido de union a Tie 2,
B comprende un espaciador de polietilenglicol y
C comprende un grupo biotina;
comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un peptido de union a Tie 2 que comprende un residuo aminoacfdico aminoterminal que comprende un primer grupo reactivo con un reactivo que comprende la estructura: segundo grupo reactivo-B-C, donde el primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo formando A-B- 5 C. Por ejemplo, el primer grupo reactivo puede ser un grupo sulfhidrilo (p.ej., el residuo aminoacfdico aminoterminal del peptido puede ser un residuo de cistefna) y el segundo grupo reactivo puede ser un grupo maleimida. Otros ejemplos adecuados de primer y segundo grupos reactivos se describen anteriormente con respecto a los reactivos espaciadores comercialmente disponibles adecuados.
10 La divulgacion proporciona tambien un procedimiento de elaboracion de un monomero peptfdico de union a Tie 2 que comprende la estructura A-B, donde:
A comprende un peptido de union a Tie 2 y B comprende un espaciador de polietilenglicol;
15 comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un peptido de union a Tie 2 que comprende un residuo aminoacfdico aminoterminal que comprende un primer grupo reactivo con un reactivo que comprende la estructura: segundo grupo reactivo-B, formando A-B. Por ejemplo, el primer grupo reactivo puede ser un grupo sulfhidrilo (p.ej., el residuo aminoacfdico aminoterminal del peptido puede ser un residuo de cistefna) y el segundo grupo reactivo puede ser un grupo maleimida. Otros ejemplos adecuados de primer y segundo grupos reactivos se describen 20 anteriormente respecto a los reactivos espaciadores comercialmente disponibles adecuados.
Para crear las formas multimericas de los monomeros peptfdicos de union a Tie 2 de la invencion, se ligan conjuntamente multiples copias de los monomeros para multimerizar asf los monomeros. La multimerizacion puede lograrse mediante uno de los varios procedimientos posibles. Por ejemplo, para monomeros que comprenden un 25 grupo multimerizante (p.ej., monomeros de estructura A-B-C), los monomeros pueden combinarse con un agente multimerico que tiene afinidad por el grupo multimerizante y que tiene multiples sitios de union para el grupo multimerizante. Dependiendo del numero de sitios de union que tenga el agente multimerico, la relacion de monomero a agente multimerico puede ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, cuando el grupo multimerizante es biotina y el agente multimerico es avidina, estreptavidina o neutravidina (cada una de las cuales tiene cuatro sitios de 30 union para biotina), la relacion de monomero a agente multimerico puede seleccionarse como 4:1. Por consiguiente, la invencion proporciona un procedimiento preferido de elaboracion de una forma tetramerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de estructura A-B-C, donde A es un peptido de union a Tie 2, B es un espaciador y C es biotina, comprendiendo el procedimiento combinar el monomero peptfdico de union a Tie 2 A-B-C con un agente tetramerico D a una relacion 4:1; estando seleccionado el agente tetramerico D de entre el grupo consistente en 35 avidina, estreptavidina y neutravidina.
En una realizacion alternativa, pueden combinarse relaciones diferentes de monomero (p.ej., A-B-C) y agentes multimericos (p.ej. D) para crear multfmeros que tengan diferentes numeros de unidades monomericas. Por tanto, cuando el agente multimerico es un tetramero, puede usarse una relacion 4:1 de monomero a agente multimerico 40 para conseguir multfmeros tetramericos, pero pueden usarse tambien relaciones menores para conseguir trfmeros o dfmeros. Mas especfficamente, puede usarse una relacion 3:1 de monomeros a agente multimerico para conseguir trfmeros y puede usarse una relacion 2:1 de monomeros a agente multimerico para conseguir dfmeros. Preferiblemente, despues de combinar monomeros y agente multimerico, se llevan a cabo una o mas etapas de purificacion para purificar la forma multimerica deseada y/o para retirar los monomeros no unidos. Los ejemplos no 45 limitantes de tecnicas de purificacion que pueden usarse para aislar la especie multimerica deseada incluyen HPLC, cromatograffa de exclusion por tamano y cromatograffa de avidina en agarosa (para retirar los monomeros no unidos ligados a un grupo multimerizante de biotina).
Para monomeros que tienen la estructura A-B, donde A es un peptido de union a Tie 2 y B es un espaciador, puede 50 lograrse la multimerizacion mediante ligamiento covalente o asociacion no covalente de multiples copias del monomero a traves del espaciador B. Por ejemplo, pueden hacerse reaccionar espaciadores de PEG activados ramificados (comercialmente disponibles en NOF Corporation, Tokio, Japon) con multiples copias del monomero, creando la estructura multimerica. Estan disponibles numerosos grupos reactivos adecuados con los que pueden activarse el espaciador de brazo ramificado incluyendo, pero sin limitacion, maleimida, amina, glutaril-NHS, 55 carboximetil-NHS, carbonato y aldehfdo. Despues de la reaccion del monomero con el espaciador de brazo ramificado, preferiblemente se llevan a cabo una o mas etapas de purificacion para purificar la forma multimerica deseada y/o para retirar los monomeros no unidos, como se describe anteriormente.
IV. Procedimientos de deteccion de una composicion que comprende un peptido de union a Tie 2
Se describe tambien un procedimiento de deteccion de las composiciones de la invencion que comprenden una forma multimerica del peptido de union a Tie 2. En el procedimiento de deteccion, se pone en contacto una composicion de la invencion con un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente con el peptido de union a 5 Tie 2 contenido en la forma multimerica, de tal modo que se detecte el peptido de union a Tie 2. Los formatos espedficos de ensayo de deteccion conocidos en la materia que son aplicables a la deteccion del peptido de union a Tie 2 incluyen, por ejemplo, ensayo de inmunosorcion ligado a enzima (ELISA) y radioinmunoensayo (RIA). Los anticuerpos monoclonales preferidos para uso en los ensayos son aquellos que se unen espedficamente al peptido T7 contenido en formas multimericas del peptido T7, tales como aquellos descritos en el Ejemplo 12. Los 10 anticuerpos monoclonales que se unen al peptido de union a Tie 2 (p.ej., T7) pueden prepararse mediante tecnicas estandares. La valoracion de la union del anticuerpo monoclonal al peptido de union a Tie 2 puede efectuarse tambien mediante tecnicas estandares, tales como ELISA, RIA, analisis de transferencia de puntos, analisis de inmunotransferencia, inmunoprecipitacion y similares, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 12.
15 Tambien se describen composiciones de anticuerpo monoclonal que se unen espedficamente al peptido T7. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos secretados por los clones de hibridoma 2C11, 13D4, 3E4 y 4H6 descritos adicionalmente en el Ejemplo 12.
V. Composiciones farmaceuticas y administracion de las mismas
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Otro aspecto de la invencion atane a composiciones farmaceuticas que comprenden formas multimericas de los monomeros peptfdicos de union a Tie 2 de la invencion. Las composiciones farmaceuticas incluyen tfpicamente la forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 y un portador farmaceuticamente aceptable. Los portadores farmaceuticamente aceptables pueden seleccionarse para ser adecuados para la via de administracion 25 deseada. Por ejemplo, en una realizacion, el portador farmaceuticamente aceptable es adecuado para administracion topica. Es un ejemplo no limitante de un portador adecuado para administracion topica IntraSite Gel (comercialmente disponible en Smith & Nephew). En otra realizacion, el portador farmaceuticamente aceptable es adecuado para administracion sistemica. Es un ejemplo no limitante de un portador adecuado para administracion sistemica (p.ej., intravenosa) la solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
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Como se usa en la presente memoria, “portador farmaceuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administracion topica o para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, 35 espinal o epidermica (p.ej., por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, concretamente la forma multimerica del monomero de union a Tie 2, puede recubrirse con un material para proteger al compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. 40 Una “sal farmaceuticamente aceptable” hace referencia a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto original y que no confiere ningun efecto toxicologico indeseado (vease, p.ej., Berge, S. M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos no toxicos tales como clortndrico, mtrico, fosforico, sulfurico, bromtndrico, yodhfdrico, fosforoso y similares, asf como de acidos organicos no toxicos 45 tales como acidos mono- y dicarboxflicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asf como de aminas organicas no toxicas tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocama, colina, dietanolamina, etilendiamina, procama y similares.
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Una composicion farmaceutica de la invencion puede incluir tambien un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistema, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno 55 butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares y (3) agentes quelantes metalicos tales como acido dtrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.
Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y
similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
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Estas composiciones pueden contener tambien, por ejemplo, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y/o agentes dispersantes. La prevencion de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilizacion como mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. Puede ser tambien deseable incluir agentes 10 isotonicos tales como azucares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Ademas, puede producirse la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable por la inclusion de agentes que retardan la absorcion tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones terapeuticas deben ser tfpicamente esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y 15 almacenamiento. Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido de esterilizacion por microfiltracion. La composicion puede formularse como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol 20 (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion.
25
La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una unica forma de dosificacion variara dependiendo del sujeto que se este tratando y del modo de administracion particular. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una unica forma de dosificacion sera generalmente aquella cantidad de la composicion que produzca un efecto terapeutico. Generalmente, en 30 porcentaje, esta cantidad oscilara de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 99 % de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 70 %, lo mas preferiblemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 % de ingrediente activo en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
Los regfmenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta optima deseada (p.ej., una respuesta 35 terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo intravenoso unico, puede administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indique por las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificacion unitaria por la facilidad de administracion y uniformidad de la dosificacion. Forma de dosificacion unitaria, como se usa en la presente memoria, hace referencia a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones 40 unitarias para los sujetos para tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas de dosificacion unitaria de la invencion esta dictada por y es directamente dependiente de (a) las caracterfsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular para conseguir y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de la mezcla farmaceutica tales como un compuesto activo para el tratamiento 45 de sensibilidad en individuos.
Para la administracion sistemica de la forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2, la dosificacion oscilara tfpicamente de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas habitualmente de 0,001 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 pg/kg, 5 pg/kg, 50 pg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 50 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,01-1 mg/kg. Para administracion topica, los intervalos de dosificacion ejemplares son de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 5 mg/kg, mas preferiblemente de 50 pg/kg a 2 mg/kg, tal como 1 mg/kg.
55 Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden variarse para obtener una cantidad de ingrediente activo que sea efectiva para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particular sin ser toxico para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas, o el ester, sal o amida
de las mismas, la via de administracion, el momento de administracion, la tasa de excrecion del compuesto particular que se este empleando, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con las composiciones empleadas, la edad, sexo, peso, condicion, salud general e historial medico previo del paciente que se este tratando y factores similares bien conocidos en las artes medicas. Una “dosificacion 5 terapeuticamente efectiva” de la forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion da preferiblemente como resultado una angiogenesis aumentada, la estimulacion de la curacion de heridas o ambas. Un especialista en la materia serfa capaz de determinar dichas cantidades basandose en factores tales como el tamano del sujeto, la gravedad de los sfntomas del sujeto y la composicion o via de administracion particular seleccionada.
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Una composicion de la presente invencion puede administrarse por una o varias vfas de administracion usando uno o una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Como se apreciara por el especialista en la materia, la via y/o modo de administracion variara dependiendo de los resultados deseados. Las vfas preferidas de administracion para las formas multimericas de la invencion incluyen vfas no parenterales, incluyendo vfas de 15 administracion topica, epidermica o mucosa, por ejemplo intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o topica. Como alternativa, otras vfas de administracion preferidas incluyen las vfas parenterales, incluyendo intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, espinal, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, transtraqueal, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusion.
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En ciertas realizaciones, las formas multimericas de los monomeros peptfdicos de union a Tie 2 de la invencion pueden administrarse en combinacion con otros agentes terapeuticos, tales como otros agentes que promuevan la angiogenesis y/o estimulen la curacion de heridas. Los ejemplos no limitantes de otros agentes con los que pueden combinarse las formas multimericas de la invencion incluyen VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana 25 recombinante, bFGF y factor de crecimiento placentario (PLGF).
VI. Procedimientos de uso de formas multimericas de monomeros peptfdicos de union a Tie 2
Se proporcionan composiciones para uso en procedimientos de uso de las formas multimericas de los monomeros 30 peptfdicos de union a Tie 2 de la invencion. Como se discute en la presente memoria, las formas multimericas tienen actividad agonista de Tie 2. Por consiguiente, las formas multimericas pueden usarse para activar el receptor Tie 2, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, en una realizacion, la invencion proporciona un procedimiento de activacion de un receptor Tie 2 que comprende poner en contacto el receptor Tie 2 con la forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 de tal modo que se active el receptor Tie 2. La activacion del receptor Tie 2 puede 35 probarse por cualquiera de numerosos posibles indicadores de la activacion de Tie 2 bien establecidos en la materia, incluyendo pero sin limitacion, los diversos ensayos in vitro e in vivo descritos con detalle en los Ejemplos. En una realizacion, por ejemplo, la activacion del receptor Tie 2 se prueba por la fosforilacion del residuo tirosina 992 (Y992) del receptor Tie 2. En otra realizacion, por ejemplo, la activacion del receptor Tie 2 se prueba por la fosforilacion de MAPK. AKT o eNOS.
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Puesto que las formas multimericas de la invencion tienen actividad angiogenica, la invencion permite tambien un procedimiento de estimulacion de la angiogenesis en un sitio de un sujeto, donde el procedimiento comprende poner en contacto el sitio con la forma multimerica del monomero peptfdico de union a Tie 2 de tal modo que se estimule la angiogenesis en el sitio del sujeto. En una realizacion, se pone en contacto la forma multimerica con el sitio por 45 administracion topica de la forma multimerica. En otra realizacion, se pone en contacto la forma multimerica con el sitio por administracion sistemica de la forma multimerica. La angiogenesis puede confirmarse mediante la presencia de una o mas caracterfsticas bien establecidas de la angiogenesis. En una realizacion preferida, la angiogenesis estimulada por la forma multimerica se caracteriza por al menos una de las siguientes propiedades:
50 a) reclutamiento de celulas de soporte perivasculares;
b) no filtracion de los vasos; y
c) arborizacion bien definida.
El reclutamiento de celulas de soporte perivasculares puede demostrarse mediante la deteccion de un marcador de 55 celulas de musculo liso, por ejemplo mediante inmunotincion con un anticuerpo contra actina 1 de musculo liso (Sma 1). La no filtracion de los vasos puede valorarse usando ensayos de permeabilidad de vasos establecidos en la materia, incluyendo ensayos in vitro y/o in vivo. Es un ejemplo no limitante de un ensayo de permeabilidad de vasos in vivo el ensayo de Miles, que usa azul de Evan o FITC-albumina. Como se usa en la presente memoria, los vasos se van a considerar “sin filtracion” si el grado de permeabilidad de los vasos es menor que el grado de
permeabilidad de los vasos cuyo crecimiento se estimulaba por el tratamiento con VEGF. La arborizacion bien definida puede demostrarse, por ejemplo, mediante la formacion de imagenes de los vasos recien formados y la cuantificacion del numero de vasos y del numero de nodos en un campo de imagen particular (vease el Ejemplo 5 para una descripcion mas detallada). Se indica una arborizacion bien definida, por ejemplo, por una ramificacion 5 significativa y organizada de los vasos, tal como una angiogenesis en que la relacion del numero de vasos al numero de nodos sea de 1,0:0,5, mas preferiblemente de 1,0:0,7 o aun mas preferiblemente de 1,0:1,0. Ademas, la dinamica de flujo de los neovasos puede valorarse usando ultrasonido microDoppler.
En el procedimiento para estimular la angiogenesis, el sitio puede ponerse contacto con la forma multimerica sola o, 10 como alternativa, el sitio puede ponerse en contacto con uno o mas agentes angiogenicos adicionales. Por tanto, en otra realizacion, el procedimiento de angiogenesis comprende ademas poner en contacto el sitio en el sujeto con un segundo agente angiogenico. Los ejemplos no limitantes de agentes angiogenicos adicionales que pueden usarse en combinacion con las formas multimericas de la invencion incluyen VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF y factor de crecimiento placentario (PLGF). Como se demuestra en la presente memoria, se ha 15 mostrado que una forma multimerica de la invencion, cuando se usa en combinacion con VEGF, reduce la sinuosidad de vasos y la permeabilidad vascular observadas cuando se usa VEGF solo para estimular la angiogenesis. Por tanto, en un procedimiento de angiogenesis preferido de la invencion, se usa una forma multimerica de la invencion en combinacion con VEGF.
20 Dada la capacidad de las formas multimericas de la invencion de estimular la angiogenesis, las formas multimericas pueden usarse en una variedad de situaciones clfnicas en que sea deseable la promocion de la angiogenesis. Los ejemplos no limitantes de dichas indicaciones incluyen vascularizacion de tejidos regenerativos, enfermedad isquemica de los miembros, isquemia cerebral, afecciones de inflamacion vascular incluyendo arterioesclerosis, necrosis avascular, estimulacion del crecimiento capilar y disfuncion erectil.
25
Ademas, dada la capacidad de las formas multimericas de reducir la permeabilidad vascular inducida por otros agentes tales como VEGF, las formas multimericas pueden usarse clfnicamente para contrarrestar la permeabilidad vascular inducida, por ejemplo, por VEGF, radiacion, un patogeno u otro evento clfnico relevante (p.ej. apoplejfa). Se ha resenado la capacidad de Ang 1 de proteger los vasos frente a la filtracion y/o de contrarrestar la permeabilidad 30 endotelial inducida por otros agentes (veanse, p.ej., Thurston, G et al. (1999) Science 286: 2511-2514; Thurston, G, et al. (2000) Nat. Med. 6: 460-463; Pizurki, L. et al. (2003) Br. J. Pharmacol. 139: 329-336; Jho, D. et al. (2005) Circ. Res. 96: 1282-1290). Ademas, se ha resenado que Ang 1 reduce la filtracion de vasos sangufneos cerebrales y promueve la estabilizacion de vasos angiogenicos en modelos experimentales de apoplejfa (Zhang, Z.G. et al. (2002) Neurosci. 113: 683-687; Zacharek, A. et al. (2006) Neurosci. Lett. 404: 28-32) para inhibir la 35 degradacion de la barrera hematorretiniana (Nambu, H. et al. (2004) Gene Therap. IT 865-873) y para inhibir el desprendimiento de retina en un modelo de retinopatfa proliferativa (Nambu, H. et al. (2005) J. Cell. Physiol. 204: 227-235). En vista de los efectos demostrados de las formas multimericas de la invencion sobre la disminucion de la permeabilidad vascular, otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de disminucion de la permeabilidad vascular en un sitio de vasos filtrantes, comprendiendo el procedimiento poner en contacto el sitio de vasos filtrantes 40 con una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que disminuya la permeabilidad vascular. Dicho procedimiento puede usarse en una variedad de situaciones clfnicas, cuyos ejemplos no limitantes incluyen apoplejfa, degeneracion macular, edema macular, edema linfatico, degradacion de la barrera hematorretiniana, degradacion de la barrera hematoencefalica (p.ej., durante tratamiento quimioterapeutico) y normalizacion de los vasos tumorales para facilitar el suministro de farmacos y aumentar la sensibilidad a la 45 radiacion.
Las formas multimericas de la invencion han mostrado tambien tener un efecto protector sobre las celulas endoteliales, p.ej. al inhibir la apoptosis de celulas endoteliales. Se ha resenado que la capacidad de un agonista de Tie 2 de proteger celulas endoteliales de los vasos renales mejora la fibrosis renal en un modelo experimental (Kim, 50 W. et al. (2006) J. Am. Soc. Nephrol. 17. 2474-2483). En vista de los efectos demostrados de las formas multimericas de la invencion en la proteccion de celulas endoteliales, otro aspecto de la invencion atane a un procedimiento de proteccion de celulas endoteliales, comprendiendo el procedimiento poner en contacto las celulas endoteliales con una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que se protejan las celulas endoteliales. Dicho procedimiento puede usarse en una variedad de situaciones clfnicas, 55 cuyos ejemplos no limitantes incluyen fibrosis renal, apoplejfa, degeneracion macular y complicaciones diabeticas (p.ej., en rinon, ojo, piel y/o miembros).
Las formas multimericas de la invencion han mostrado tambien ser efectivas en la estimulacion de la curacion de heridas. Por consiguiente, en aun otro aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de estimulacion de la
curacion de una herida en un sujeto, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la herida con una forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la invencion de tal modo que se estimule la curacion de la herida en el sujeto. En una realizacion, se pone en contacto la forma multimerica con la herida por administracion topica de la forma multimerica. En otra realizacion, se pone en contacto la forma multimerica con la herida por 5 administracion sistemica de la forma multimerica. La estimulacion de la curacion de heridas puede probarse, por ejemplo, por un tiempo de cierre de herida acelerado en comparacion con la curacion de heridas en ausencia de la forma multimerica, un tejido de granulacion aumentado en el sitio de herida en comparacion con ningun tratamiento con la forma multimerica y/o una neovascularizacion potenciada de la herida en comparacion con ningun tratamiento con la forma multimerica.
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En una realizacion preferida, se usa el procedimiento de estimulacion de la curacion de heridas en el tratamiento de una ulcera diabetica. Actualmente, hay 16 millones de personas con diabetes en los EE.UU., con 798.000 nuevos casos resenados anualmente y una prevalencia de aproximadamente un 6 % de la poblacion. Las estimaciones resenan que un 10-15 % de los diabeticos desarrollaran ulceras del pie, de los cuales un 14-20 % requeriran 15 amputacion. La ulceracion del pie es precursora de aproximadamente un 85 % de las amputaciones de extremidades inferiores. Como se demuestra en la presente memoria, una forma multimerica de la invencion puede estimular la curacion de heridas en un modelo animal de ulceras diabeticas cuando se aplica por via topica la forma multimerica a la herida (vease el Ejemplo 6).
20 En otras realizaciones, la estimulacion de la curacion de una herida puede usarse en una variedad de situaciones clfnicas que implican heridas, incluyendo pero sin limitacion, ulceras de decubito, ulceras de presion, incisiones quirurgicas, lesiones traumaticas de tejido, quemaduras e injertos cutaneos.
Las formas multimericas de la invencion pueden incorporarse tambien a un biomaterial que puede implantarse en un 25 sitio de un sujeto para proporcionar asf los efectos de la forma multimerica en ese sitio. Son adecuados para uso biomateriales que proporcionan una matriz o andamiaje. La forma multimerica puede incorporarse sola o en combinacion con uno o mas agentes adicionales, tales como VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF y factor de crecimiento placentario (PLGF). Los ejemplos no limitantes de biomateriales adecuados incluyen Matrigel, sustitutos cutaneos e hidrogeles de glicosaminoglicanos reticulados (p.ej., como se 30 describe en Riley, C.M. et al. (2006) J. Biomaterials 27 5935-5943). Por consiguiente, se describe tambien una composicion de biomaterial en que se incorpora una forma multimerica de la invencion, sola o en combinacion con uno o mas agentes adicionales. Un material envasado que comprende el biomaterial esta tambien englobado por la invencion. El material envasado puede marcarse para uso del biomaterial.
35 Se describen ademas diversos aspectos y realizaciones de la presente invencion mediante los siguientes Ejemplos. Los Ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.
EJEMPLOS
40 Ejemplo 1: Preparacion de un peptido de union a Tie 2 tetramerico, vasculotida
En este ejemplo, se preparo una forma tetramerica de un peptido de 7 unidades conocido por unirse a Tie 2 usando un sistema de biotina-avidina para agrupar el peptido en forma de tetramero. El peptido, al que se hace referencia como T7, se ha descrito anteriormente en Toumaire R. et al. (2004) EMBO Reports 5. 262-267 y tiene una secuencia 45 aminoacfdica His-His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 1).
El peptido se sintetizo usando sfntesis peptfdica en fase solida de Fmoc, un resumen de cuyo procedimiento de sfntesis puede encontrarse en W. Chan, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press (RU), 1999. El peptido se sintetizo usando el sintetizador peptfdico ABI433A de Applied Biosystems 50 (Foster City, CA, EE.UU.) usando las instrucciones del fabricante con unas pocas modificaciones. Las modificaciones son: 1) se alargo el tiempo de acoplamiento a 17,5 minutos y 2) se sustituyo HBTU por HATU. La resina usada era resina de Wang. Para crear un grupo sulfhidrilo libre en el peptido para modificacion adicional, se anadio un residuo de cistefna aminoterminal al peptido de tal modo que la secuencia final del peptido fuera Cys-His- His-His-Arg-His-Ser-Phe (SEQ ID NO: 2). Los grupos de proteccion para el residuo de cadena lateral eran: Cys- 55 (tBu), His-(Trt), Arg-(Pbf) y Ser-(tBu). Los derivados aminoacfdicos usados aquf eran de forma L para imitar la conformacion de plegamiento natural en celulas de mamffero. El coctel de escision usado para escindir el peptido T7 del soporte de resina en fase solida contenfa: 90 % de acido trifluoroacetico (TFA), 8 % de TIPS y 2 % de EDT. Se efectuo la escision en atmosfera de gas nitrogeno durante 3 horas. Se separaron el coctel de escision y la mezcla de resina mediante un embudo Kimax Fritted. Se precipito entonces el peptido T7 con eter frfo y se centrifugo a 2700 x
g durante 5 minutos a 4 °C. Se lavo el sedimento durante un total de 4 veces con eter trio. Se llevo a cabo cada lavado con 30 s de agitacion con vortex y 5 min de centritugacion a 2700 x g a 4 °C. Finalmente, se seco el sedimento de peptido T7 en atmostera de gas nitrogeno.
5 Para crear el tetramero, se moditico en primer lugar el peptido T7 mediante la adicion de un resto de polietilenglicol (PEG) biotinilado-maleimida de 29 angstrom, que se ilustra esquematicamente en la Figura 1A. Se conjugo la biotina con el peptido T7 usando EZ-link-PEO-maleimida-biotina (numero de catalogo de Pierce 21901) de acuerdo con las instrucciones del tabricante. Se disolvieron 20 mg de peptido T7 en 5 ml de tampon de conjugacion (EDTA 0,001 M, tampon tostato 0,2 M, pH 7,4) en un tubo de 15 ml. Se disolvieron 10 mg de EZ-link-PEO-maleimida-biotina en 1 ml 10 de tampon de conjugacion, se anadieron entonces a la solucion del peptido T7 y se mezclaron mediante 5 segundos de agitacion con vortex. Se envolvio la mezcla en papel de aluminio y se incubo a entre 20-25 °C durante 4 horas, y se almaceno entonces a -20 °C hasta puriticacion por HPLC.
Se puritico el producto T7-biotina de la mezcla de reaccion anterior usando HPLC en tase inversa en las siguientes 15 condiciones:
Columna: Agilent Zorbax Extended-C18 (n.os de cat. 770450-902), 4,6 mm (diametro interno) x 250 mm (longitud), partfculas de 5 micrometres, tamano de poro de 80 A
20 Fase movil:
A: hidroxido de amonio 20 mM (0,701 g/l) en agua destilada.
B: hidroxido de amonio 20 mM (0,701 g/l) en 90 % de metanol, 10 % de agua destilada.
25 Deteccion: UV 215 y 280 nm
Se equilibro la columna con 90 % de tase movil A durante 15 minutos a un caudal de 1 ml por minuto. Se inyectaron 200 microlitros de la mezcla de reaccion de conjugacion peptido-biotina anterior a tiempo cero de acuerdo con el siguiente esquema de tlujo:
30
Tiempo
Caudal Porcentaje de B (todas las etapas eran isocraticas)
0 minutos
0,2 ml/min 10 %
5 minutos
0,5 ml/min 10 %
10 minutos
1 ml/min 33,1 %
30 minutos
1 ml/min 33,2 %
45 minutos
1 ml/min 33,3 %
60 minutos
1 ml/min 33,4 %
70 minutos
1 ml/min 0 %
Se recogieron los eluyentes en un tubo cada minuto. Se consiguio la elucion isocratica de T7-biotina a un 33,3 % de tase movil B a un tiempo de retencion de 49 minutos. Se veritico por espectrometrfa de masas (EM) que esta traccion contiene un ion original de m/z= 1585,69 (pico monoisotopico protonado una vez). La m/z teorica del 35 producto esperado es de 1585.6894.
El agrupamiento despues de la sfntesis de este peptido biotinilado-PEG, al que se hace reterencia de aquf en adelante como vasculotida, con avidina a una relacion 4:1 (vasculotida:avidina) daba lugar a un compuesto tetramerico obligado.
40
Ejemplo 2: Caracterizacion de la union de Tie 2 a vasculotida
En este ejemplo, se ensayo la capacidad de la vasculotida de unirse al receptor Tie 2, a pesar de las moditicaciones genomanipuladas, en un ensayo de interaccion y precipitacion in vitro. En el ensayo de interaccion y precipitacion, se 45 prepare un lisado celular de celulas endoteliales EaHy926 (que expresan altos niveles de Tie 2) en tampon de lisis Phospho Lipase Cy (tampon Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 10 % de glicerol, 1 % de Triton X-100, MgCh 1,5 mM, EGTA 1,0 mM, NaPPi 10 mM, NaF 100 nM, Na3VO4 2 mM, 1x aprotinina, 1x leupeptina y 1x PMSF). Se mezclo el lisado celular completo con vasculotida biotinilada no agrupada o peptido irrelevante biotinilado. Se aislaron entonces los peptidos biotinilados con avidina-agarosa y se ensayo posteriormente su capacidad de precipitar Tie 2
mediante analisis de inmunotransferencia estandar usando anticuerpo anti-Tie 2.
Se muestran los resultados de la inmunotransferencia en la Figura 1B. Los resultados demostraban que, cuando se purifica usando resina de agarosa con avidina, la vasculotida, pero no un peptido biotinilado irrelevante, era capaz de 5 precipitar Tie 2. La adicion de un exceso de 10 veces de vasculotida preagrupada con avidina soluble era capaz de competir por el Tie 2 disponible y era capaz de anular esta interaccion (Figura 1B, carril final).
Ejemplo 3: Caracterizacion de la activacion de Tie 2 por vasculotida
10 Habiendo establecido que la vasculotida era capaz de unirse a Tie 2 (vease el Ejemplo 2), se ensayo la capacidad de la vasculotida, cuando se agrupa con avidina a una relacion 4:1 (vasculotida:avidina) de activar el receptor Tie 2 examinando varias rutas de senalizacion posteriores bien establecidas en celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Cambrex, Nueva Jersey). Dichas rutas de senalizacion se describen, por ejemplo, en Kim, I. et al. (2000) Circ. Res. 9: 952-959; Fujikawa, K. et al. (1999) Exp. Cell. Res. 2: 663-672; Babaei, S. et al. (2003) Am. J. 15 Pathol. 6: 1927-1936.
Se hicieron crecer HUVEC en placas de 6 pocillos o 10 cm (Nunc) recubiertas con gelatina (Sigma). Se cultivaron HUVEC en medio de crecimiento F12 que contiene 10 % de suero fetal bovino (FBS), sulfato de heparina 0,1 mg/ml, 1x penicilina, 1x estreptomicina, 1x glutamina, VEGF 10 ng/ml, EGF 10 ng/ml, bFGF 5 ng/ml. Se usaron todas las 20 HUVEC entre las pasadas 3-9.
Se estimularon HUVEC con uno cualquiera de Ang 1 (R&D Systems), vasculotida, avidina o vasculotida agrupada (preagrupada con una relacion molar 4:1 de peptido:avidina en PBS durante 2 horas a 4 °C) a diversas dosis. Se efectuaron las estimulaciones con vasculotida en medio de crecimiento que contiene suero completo durante 15 25 minutos a menos que se indique otra cosa. Se efectuaron las preparaciones de lisado celular y analisis de inmunotransferencia mediante procedimientos estandares. Los anticuerpos usados para inmunotransferencia (en este y/o ejemplos posteriores) eran monoclonal anti-Tie 2 (Pharminogen), policlonal anti-pY992 Tie 2, (Cell Signaling Technology), policlonal anti-MAPK (Cell Signaling Technology), monoclonal anti-fosfoMAPK (Cell Signaling Technology), policlonal anti-AKT (Cell Signaling Technology), policlonal anti-pS473 AKT (Cell Signaling Technology), 30 monoclonal anti-pS1177 eNOS (BD Biosciences), policlonal anti-pY397 FAK (Biosource), policlonal anti-FAK (Santa Cruz), policlonal anticonjugado directo de actina de musculo liso-Cy3 (Dako), policlonal anti-PECAM (Pharminogen) y policlonal anti-actina de musculo liso (Sigma).
Se muestran los resultados del analisis de inmunotransferencia en la Figura 1C. El analisis de inmunotransferencia 35 de lisados celulares completos revelo que la vasculotida agrupada activa Tie 2 (pY992 Tie 2) a concentraciones en el intervalo de 20 nM a 750 pM, pareciendo optimas 5-10 nM. Significativamente, solo cuando se preagrupaba con avidina, era la vasculotida capaz de estimular la fosforilacion de Tie 2 (veanse avidina sola y vasculotida no agrupada). Coincidentemente con la activacion del receptor, se observo la fosforilacion de varias protefnas sensibles a Tie 2 conocidas, incluyendo MAPK, AKT y eNOS.
40
Paradojicamente, las altas concentraciones de vasculotida agrupada no eran capaces de activar la actividad del receptor Tie 2 en HUVEC (vease vasculotida agrupada 50 nM). Se teorizo que esto era debido al hecho de que las altas relaciones de vasculotida agrupada:Tie 2 disminuirfan el agrupamiento de receptor. Para ensayar esta hipotesis, se utilizaron Eahy926 EC, que expresan niveles mucho mas altos de Tie 2. Para analisis de 45 inmunotransferencia, se inmunoprecipito Tie 2 de las celulas Eahy926 con anticuerpos monoclonales anti-Tie 2 (Pharmingen, clon 33.1) y protefna G-Sepharose (Amersham) y monoclonales anti-pY (Upstate Biotechnology, clon 4G10), de acuerdo con tecnicas estandares. Los resultados de esta inmunotransferencia se muestran en la Figura 1D. Usando esta lfnea celular, se demostro la activacion especffica del receptor Tie 2 a concentraciones en el intervalo de 200 pM a 750 pM, sugiriendo que la relacion de vasculotida agrupada:Tie 2 es crftica para la activacion. 50
Para examinar la cinetica de activacion de Tie 2, se estimularon HUVEC con Ang 1 nativa o vasculotida agrupada durante diversos tiempos. Se efectuo la estimulacion en FBS al 10 %. Se muestran los resultados en la Figura 1E. La vasculotida agrupada a baja concentracion (2 nM) se comparaba favorablemente con la estimulacion con Ang 1 (400 ng/ml) en su capacidad de activar la fosforilacion de Tie 2. Globalmente, la activacion del receptor por 55 cualquiera de Ang 1 o vasculotida agrupada segufa un curso temporal muy similar, volviendo la fosforilacion a niveles casi basales a veces despues de 2 horas. De nuevo, se observaron aumentos notables de pMAPK y pAKT.
Previamente, se ha mostrado que Ang 1 activa la cinasa de adhesion focal (FAK) de manera independiente de Tie 2 mediante implicacion directa de la integrina aVp1 (Hu, B. et al. (2006) Cancer. Res. 2 775-783; Kim, I et al.
(2000) Circ. Res. 9: 952-959; Dallabrida, S. et al. (2005) Circ. Res. 4: 8-24). Para ensayar si la vasculotida agrupada era capaz de activar este brazo de la cascada de senalizacion de Ang 1, se examino la activacion de FAK, cuyos resultados se muestran tambien en la Figura 1E (panel inferior). Como se resena anteriormente, Ang 1 activaba FAK dependientemente del tiempo, mientras que la vasculotida agrupada no tenia un efecto significativo. Estos 5 resultados sugieren un papel mas directo de la vasculotida en el desencadenamiento de la senalizacion especifica de Tie 2.
Para dirigirse mas formalmente a la especificidad de la vasculotida agrupada por el receptor Tie 2, se efectuaron experimentos de reconstitucion en celulas de fibroblasto Cos 1 y C166 EC, ambas de las cuales eran 10 fenotipicamente nulas de Tie 2. Se mantuvieron las celulas Cos 1 y C166 (ATCC) en placas de 10 cm de diametro (Nunc) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10 %, 1x penicilina, 1x estreptomicina y L-glutamina 200 mM (todos de Gibco BRL) en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 °C. Se infectaron celulas Cos1 o C166 (MOI 30) durante una noche con adenovirus que codifican uno cualquiera de proteina fluorescente verde (EGFP) o Tie 2. Se confirmo la eficiencia de la infeccion por epifluorescencia (EGFP) o 15 por inmunotransferencia (Tie 2).
Las celulas infectadas con adenovirus recombinante que codifica EGFP o Tie 2 se dejaron sin estimular o se estimularon con vasculotida, vasculotida agrupada o avidina durante 16 horas, despues de lo cual se aplico reactivo MTS a todas las muestras durante 4 horas. Se midio la absorbancia a 492 usando un lector de placas multipocillo 20 (Power Wave X340, Biotek Instruments Inc). Para examinar ampliamente la posibilidad de que la vasculotida agrupada estuviera activando las rutas de senalizacion posteriores independientemente de Tie 2, se examino la activacion de MAPK y AKT en las celulas infectadas con EGFP. Se muestran los resultados en la Figura 1F. Ni la vasculotida ni la vasculotida agrupada inducian significativamente la fosforilacion de MAPK o AKT en las celulas infectadas con EGFP anteriores como se apuntaba en muestras no estimuladas. Como se esperaba, la 25 sobreexpresion de Tie 2 en cualquiera de los tipos celulares daba como resultado su activacion constitutiva (vease pY992 Tie 2) asi como la activacion de MAPK y AKT. Este hecho descartaba estimular estas celulas adicionalmente con vasculotida o vasculotida agrupada. Debido a que MAPK y AKT se activan en gran medida posteriormente en un hospedador de receptores de superficie celular, se razona que estos resultados sugieren en gran medida un papel especifico y dependiente de Tie 2 para la vasculotida agrupada en estos eventos.
30
Ejemplo 4: Efectos de vasculotida sobre la apoptosis y migracion de celulas endoteliales
Ang 1, y en menor medida Ang 2, han mostrado proteger las celulas endoteliales (EC) de diversas condiciones diferentes inductoras de la apoptosis incluyendo la retirada de suero (Kwak, H et al. (1999) FEBS Lett. 2-3: 249-253; 35 Harfouche, R. y Hussain, R. (2006) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291: H1635-1645). Basandose en el hecho de que la vasculotida agrupada activa fuertemente la proteina antiapoptotica AKT (vease el Ejemplo 3), se examino la capacidad de la vasculotida de proteger EC de la muerte celular inducida por la retirada de suero. Para hacer eso, se mantuvieron HUVEC en medio F12 mas 0,1 % de FBS durante 16 horas en presencia de diversas concentraciones de vasculotida no agrupada o agrupada, seguido de analisis de la apoptosis celular mediante ELISA 40 de muerte celular. Se efectuo el analisis de la apoptosis usando Cell Death ELISA Plus (Roche) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Se muestran los resultados en la Figura 2A, en que se normalizaron los valores a los niveles basales de muerte celular para HUVEC mantenidas en medio F12 completo suplementado con factor de crecimiento con 10 % de FBS. Los resultados mostrados representan la media de tres repeticiones mas o menos 1 DE. Se uso la prueba de t de Student para analisis estadfstico con el valor de P indicado. Los resultados revelaron 45 una disminucion estadfsticamente significativa de la apoptosis cuando se trataron EC con vasculotida agrupada a 500 pM (p= 0,002) en comparacion con celulas no tratadas. La vasculotida no agrupada y la avidina sola no tenfan efecto sobre la supervivencia, ilustrando adicionalmente que la vasculotida esta solo activa cuando se preagrupa con avidina.
50 La migracion de EC es un evento considerado crftico para la revascularizacion tras lesion. La migracion debe tener lugar de forma coordinada, con las EC respondiendo a senales quimiotacticas del estroma y secretando a su vez las proteasas necesarias para abrir camino a su migracion direccional. Estudios anteriores subrayan el papel de Ang 1 en la promocion de la migracion de EC y la liberacion de la enzima degradante de matriz MMP2 (Kim, I. et al. (2000) Circ. Res. 9 952-959; Witzenbichler, B. et al. (1998) J. Biol. Chem. 29 18514-18521). Para ensayar si la 55 vasculotida, como Ang 1, era capaz de promover estos procesos, se ensayo el efecto de la vasculotida sobre la migracion de EC usando un ensayo de camara de Boyden modificado. Se sembraron HUVEC a una densidad de 8,4 x 104 celulas en 500 pl de medio de crecimiento F12 mas 0,1 % de FBS en la camara superior de una camara de Boyden modificada de tamano de poro de 8 pm (Falcon). Se dispusieron en la camara inferior 500 pl de medio F12 mas 0,1 % de FBS mas diversos factores de crecimiento (Ang 1 (R& D Systems), vasculotida agrupada o no
agrupada, VEGF (R&D Systems) o vasculotida agrupada en combinacion con VEGF) o controles. Se dejaron migrar las celulas durante 4 horas en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2. Se rasparon las celulas no migrantes y se fijaron los filtros con 100 % de metanol durante 5 minutos, se tineron con hematoxilina de Harris (BDH) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con agua corriente durante 3 minutos cada vez. Se montaron entonces los filtros 5 usando el medio de montaje Aquapolymount. Se puntuaron como positivas de migracion las celulas que habfan migrado mas de un 50 % del camino a traves del poro.
Se muestran los resultados en la Figura 2B. Se uso la prueba de t de Student para ensayar la significancia estadfstica con un intervalo de confianza del 95 %. Se efectuaron estimulaciones por triplicado y se contaron las 10 celulas migrantes en 6 campos microscopicos por repeticion. Las barras de error mostradas en la Figura 2B representan media +/- DE. Los resultados mostraban que la vasculotida agrupada, a las dos dosis examinadas (2 nM y 10 nM), promovfa aumentos significativos en la migracion celular quimiotactica cuando se comparaban con sin tratamiento. La migracion apuntada no era significativamente diferente de la observada en muestras tratadas con VEGF o Ang 1. La vasculotida no agrupada no promovfa la migracion por encima de la observada en la muestra no 15 tratada y la combinacion de VEGF y vasculotida tratada no ofrecfa ningun efecto adicional mas alla del observado para cualquiera de VEGF o vasculotida agrupada solo.
In vivo, las EC no pueden migrar hasta que secretan las enzimas necesarias para degradar los componentes de la matriz extracelular. Se empleo zimograffa en gelatina para determinar si la vasculotida agrupada promovfa la 20 secrecion de MMP2. Para efectuar la zimograffa, se cultivaron HUVEC en medio F12 mas 0,1 % de FBS y se estimularon durante 16 h con VEGF, vasculotida no agrupada o vasculotida agrupada a diversas concentraciones. Se centrifugo el medio acondicionado para retirar los desechos celulares y se preparo para electroforesis en gel usando condiciones no reductoras. Se lavaron los geles dos veces durante 30 minutos con Triton X-100 al 2,5 % para retirar el dodecilsulfato de sodio y se incubaron entonces en tampon de sustrato (Tris-HCl 50 mmol/l, pH 8,8, 25 CaCl2 5 mmol/l) durante 16 horas a 37 °C. Se tineron entonces los geles con 0,5 % de azul de Coomasie en 30 % de metanol/10 % de acido acetico durante 2 horas a temperatura ambiente, y se destineron con 50 % de metanol/10 % de acido acetico. Se indico la presencia de metaloproteinasas mediante zonas proteolfticas no tenidas en el gel. Se muestran los resultados en la Figura 2C. El analisis del medio acondicionado revelo que la gelatina se degradaba dependientemente de la dosis de vasculotida agrupada a un peso molecular que era consistente con las formas pro 30 y activa de MMP2. Tomado en conjunto con los resultados del analisis de migracion, este dato indica que la aplicacion de vasculotida agrupada puede ofrecer distintas ventajas in vivo a las celulas endoteliales migrantes.
Ejemplo 5: Promocion de la angiogenesis por vasculotida en el ensayo de Matrigel
35 Para examinar adicionalmente el potencial angiogenico in vivo de la vasculotida, se efectuo un ensayo de Matrigel. Mas especfficamente, se impregno Matrigel (BD Biosciences) reducido con factor de crecimiento con cualquiera de vasculotida agrupada o uno de varios factores de control diferentes. Se inyectaron estas muestras de Matrigel por via subcutanea en la region del flanco de ratones CD1 de 3 meses de edad. 14 dfas despues de la implantacion e inmediatamente antes del sacrificio, se inyecto IV FITC-lectina (100 pg) y se dejo circular durante 10 minutos para 40 facilitar la identificacion y cuantificacion de vasos. Se extirparon quirurgicamente los tapones y se fijaron con paraformaldehfdo (PFA) al 4 % durante 16 h. Se tomaron imagenes de la topologfa vascular usando un microscopio de diseccion Zeiss a 4x aumentos. Tras la fijacion, se tineron todos los tapones enteros montados con anti-Sma1- Cy3. Se analizaron los tapones con un microscopio confocal Zeiss Axiovert 100 M (Carl Zeiss) para reconstruccion de imagen tridimensional y se procesaron las fotos usando LSM Image Browser y Adobe Photoshop 7.0. Se efectuo 45 la cuantificacion morfometrica de las caracterfsticas del vaso esqueletizando proyecciones de imagenes confocales con el kit Image Processing Tool Kit 5.0 (IPTK 5.0). Se uso la prueba de t de Student para ensayar la significancia estadfstica con un intervalo de confianza del 95 %. Se efectuaron todos los experimentos con tres repeticiones cada uno, con al menos 5 pilas de imagenes aleatorias.
50 Tras la retirada quirurgica de los tapones, se observo una respuesta angiogenica nftida y robusta en la capsula membranosa que rodeaba los tapones impregnados con vasculotida agrupada, VEGF o vasculotida agrupada mas VEGF. En el caso de las muestras de vasculotida agrupada, estaban presentes en la superficie vasos claros, grandes y bien arborizados. Estos vasos estaban bien ramificados y contenfan un espectro continuo de arteriolas pequenas y grandes y venulas. Consistentemente con los informes de la bibliograffa (Connolly, D. et al. 55 (1989) J_Clin. Invest. 5.1470-1478), el crecimiento de vasos promovido por la adicion de VEGF solo era evidente, aunque la naturaleza de estos vasos era altamente sinuosa. Los vasos localizados en el tejido proximal circundante de estos tapones parecfan tambien agrandados e inflamados tras el examen. La aplicacion de vasculotida agrupada en combinacion con VEGF no parecfa aumentar la densidad microvascular global, sino que en lugar de ello contribufa a disminuciones en el nivel de sinuosidad observado con VEGF solo.
Para dirigirse mas completamente y asignar parametros de vaso cuantitativos a los diferentes grupos de tratamiento, se fijaron los tapones y se examinaron con analisis de microscopfa confocal laser combinado con analisis de imagen postprocesamiento (kit Image Processing Tool Kit 5.0, Reindeer Graphics, NC). Se cuantificaron los parametros de 5 vaso, incluyendo longitud, numero y puntos de ramificacion (nodos) en al menos 6 campos representativos. Se efectuo el analisis estadfstico mediante la prueba de t de Student no pareada. Se muestran graficas de barras del numero de vasos, longitud de vaso y numero de nodos, para cada grupo de tratamiento, en las Figuras 3A, 3B y 3C, respectivamente. Se apunta que la mala perfusion de FlTC-lecitina en ratones que albergan vasculotida agrupada 20 nM mas VEGF evitaba el analisis estadfstico, por lo tanto las barras son la media de dos campos separados. Todas 10 las demas barras mostradas representan media +/- DE. Los resultados muestran que no se apuntaba un crecimiento de vaso significativo en tapones que contienen Matrigel o Matrigel impregnado con vasculotida no agrupada. Los tapones que conteman VEGF, vasculotida agrupada o vasculotida agrupada mas VEGF exhibfan una induccion robusta de la angiogenesis. Estadfsticamente, VEGF, vasculotida, o combinacion de los mismos no difenan en el numero total de vasos, longitud o puntos de ramificacion. Como se apuntaba en la capsula membranosa, las 15 muestras que conteman vasculotida exhibfan patrones de ramificacion mas organizados y menos sinuosidad que los tapones que conteman VEGF solo (sin embargo, estos eran parametros que no podfan cuantificarse espedficamente mediante asignacion de un valor numerico).
Se ha resenado que Ang 1 potencia el reclutamiento de celulas de soporte miogenicas (Suri, C. et al. (1996) Cell 87: 20 1171-1180) e inhibe la permeabilidad vascular inducida por VEGF mediante mecanismos que no son bien entendidos (Thurston, G. et al. (2000) Nat. Med. 6 460-463). Para determinar si la vasculotida, como Ang 1, era capaz de iniciar el reclutamiento de pericitos, se efectuo una inmunofluorescencia de montaje completo frente a actina 1 de musculo liso (Sma1). Los analisis de angiogenesis impulsada por VEGF en tapon de Matrigel revelaron una ausencia relativa de celulas de tincion positiva con Sma1. Las muestras que conteman vasculotida agrupada 25 sola o en combinacion con VEGF exhidan un aumento significativo de la tincion global con Sma 1. La tincion con Sma 1 estaba asociada estrechamente al exterior de los vasos y estaba enriquecida en los vasos mayores. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran potentes efectos angiogenicos in vivo de la vasculotida agrupada e indican que, cuando se combina con VEGF, la vasculotida agrupada es capaz de contrarrestar la permeabilidad inducida por VEGF y la formacion aberrante de vasos.
30
Ejemplo 6: Curacion de heridas por vasculotida administrada por via topica
Las heridas cronicas, tales como ulceras del pie neuropaticas o neuroisquemicas, son prevalentes en pacientes diabeticos. Estas heridas pueden surgir por la incapacidad del paciente de sentir la lesion (neuropatica) o debido a 35 defectos microvasculares (neuroisquemica). Existen modelos animales de diabetes de tipo II que recuerdan estrechamente los defectos de curacion de heridas observados en diabeticos humanos. Aqrn, se usaron ratones B6.Cg-m(+/+)Lepr(db)/J (db/db), una cepa de ratones diabeticos que presenta una curacion de heridas alterada, para ensayar si la vasculotida agrupada podfa mejorar los tiempos de cierre de herida.
40 Se adquirieron ratones B6.Cg-m(+/+)Lepr(db)/J (db/db) de 9 semanas de edad libres de patogenos en Jackson Laboratories. Se hicieron heridas circulares totalmente excisionales de 6 mm de diametro, de acuerdo con las directrices de aprobacion del comite de experimentacion animal, separadas a igual distancia del lado dorsal de los ratones. Se suspendieron varios factores en gel Intrasite Topical esteril (Smith and Nephew) a las concentraciones apuntadas. Los tratamientos fueron como sigue: vedculo n= 8, bFGF (10 pg/ml) n= 8, vasculotida agrupada (20 nM) 45 n= 4, vasculotida agrupada (5 nM) n= 4. Se aplicaron las preparaciones el dfa 0 (momento de la herida), los dfas 2, 4 y 6. Se tomaron imagenes estandarizadas los dfas 0, 2, 4, 6 y 7 usando una camara Canon EOS digital Rebel. Se uso la imagen J (NIH) para trazar manualmente el penmetro de herida del que se determinaron los recuentos de pfxeles totales (area de herida). Se sacrificaron los ratones el dfa 7, se extirparon los lechos de herida completos, incluyendo el margen, y se fijaron con PFA al 4 %. Se cortaron las heridas a la mitad en el punto mas ancho y se 50 preparo cada mitad para secciones de parafina o congeladas. Se procesaron las secciones de cera de acuerdo con los protocolos estandares de tincion H&E y tricromica de Masson. Se capturaron imagenes usando un microscopio de luz compuesta Leica DMLS y una camara Pixel Link a 5X y 20X. Se uso la prueba de t de Student para ensayar la significancia estadfstica.
55 Se resumen los datos de cierre de herida en la grafica de barras de la Figura 4A, en que se presentan los datos como recuentos de pfxeles de los trazados digitales de los margenes de la herida con el tiempo. Todas las barras mostradas representan media +/- DE. Se apuntaron disminuciones significativas del margen de herida en las muestras de vasculotida agrupada (20 nM, p=0,05, n=4) tan pronto como el dfa 2. Coincidentemente con un cierre de herida mejorado, hubo un cambio en la apariencia de las heridas tratadas con vasculotida agrupada. Estas
heridas presentaban una costra de apariencia ligeramente mas mucoide. El cierre de margen en las heridas tratadas con vasculotida agrupada continuaba a un ritmo acelerado durante la duracion del ensayo. Como era el caso in vitro, la vasculotida agrupada aplicada a menor concentracion parecfa ofrecer mas beneficios. Aunque esto parece ser insolito, se apuntaron tambien resultados similares con la aplicacion topica de Regranex, una preparacion topica de 5 PDGF modificado (Mustoe, T. et al. (1994) Arch. Surg. 129: 213-219). Ademas, estos resultados destacan adicionalmente la necesidad de optimizar la relacion de vasculotida: Tie 2 para facilitar el agrupamiento apropiado del receptor. Aunque la vasculotida proporcionaba la curacion mas rapida en puntos temporales tempranos, el dfa 7 de tratamiento el cierre de herida promovido por bFGF a 10 pg/ml era estadfsticamente indistinguible de la vasculotida agrupada a 20 nM o 5 nM.
10
Se examinaron las secciones transversales embebidas en parafina de todas las heridas tenidas con hematoxilina y eosina (H & E) y tricromica de Masson por un patologo para analisis con anonimato independiente. Se muestra en la Figura 4B una microfotograffa representativa de las secciones cutaneas tenidas con hematoxilina-eosina (H&E) y tricromica de Masson (MT) de heridas tratadas con PBS, bFGF (10 pg/ml) o vasculotida agrupada (5 nM). La tincion 15 con H&E y MT mostraba drasticos aumentos en la produccion de tejido de granulacion en todas las heridas tratadas con vasculotida. Adicionalmente, la tincion MT revelaba una deposicion de colageno marcada en las muestras tratadas con vasculotida.
Para la puntuacion histologica, se fijaron las secciones con paraformaldelmdo al 4 %, se embebieron en parafina y se 20 seccionaron y tineron con H&E y tricromica de Masson. Se evaluaron en las secciones por un patologo reepitelizacion, formacion de tejido de granulacion e inflamacion, con criterios usados para puntuar la piel como sigue:
Reepitelializacion
25
0 - ninguna
1- minima (0-20 % de recrecimiento de los margenes de herida)
2- leve (25 a 50 % de recrecimiento)
3- moderada (> 50 % de recrecimiento hasta 100 %, pero no > 2 celulas de grosor en toda la longitud)
30 4- recrecimiento completo (epitelio > 1 celula de grosor en toda la longitud, queratinizado)
Tejido de granulacion (GT) y neovascularizacion:
0 - ninguno
35 1- mmimo (1-3 islas pequenas aisladas de GT en los margenes del defecto)
2- leve (islas irregulares multifocales de GT por debajo del defecto de tejido, < 10 nuevos vasos sangumeos)
3- moderado (bandas localmente extensas de GT por debajo de la longitud del defecto)
4 - marcado (bandas densas de GT en los margenes y por debajo de la longitud del defecto con fibrillas de colageno y numerosos vasos sangumeos)
40
Inflamacion (sin defecto):
0 - ninguna
1- minima (unos pocos neutrofilos dispersos en los margenes del defecto)
45 2- leve (agregados multifocales de hasta 5 neutrofilos por debajo del defecto)
3- moderada (agregados multifocales de hasta 10 neutrofilos y macrofagos ocasionales, edema mmimo a leve)
4- marcada (infiltrados neutrofflicos densos localmente extensos con numeros menores de macrofagos, edema leve- moderado)
50 Los resultados de la puntuacion histologica se ilustran en la Figura 4C. Las diferencias entre vehmulo y bFGF, aunque evidentes en los tiempos de cierre de herida, existfan solo al nivel de inflamacion (p= 0,0486). La aplicacion de vasculotida agrupada daba como resultado una reepitelizacion retardada (20 nM, p= 0,0004 y 5 nM, p= 0,029) pero promovfa profundos aumentos de regranulacion y neovascularizacion (20 nM y 5 nM p= 0,0006). La inflamacion apuntada en las muestras de vasculotida agrupada aumentaba solo ligeramente a 20 nM (p= 0,034) y no era 55 significativamente diferente del vehroulo a la dosis de 5 nM (p= 0,0979).
Los analisis inmunohistoqmmicos de las heridas con anticuerpos dirigidos contra PECAM1, ICAM 1, Pan EC, podoplanina y actina de musculo liso demostraban claras diferencias entre las muestras tratadas con vasculotida agrupada y no tratadas. En primer lugar, se apunta que el examen histopatologico de los tejidos tenidos de
tratamientos con vasculotida agrupada 5 nM y 20 nM no revelaba diferencias estadfsticamente significativas en los resultados para las dosis de vasculotida usadas. A ambas dosis de vasculotida, se observaban aumentos de las celulas endoteliales totales (tincion de PECAM), activacion de las celulas endoteliales (tincion de ICAM1) y activacion de fibroblastos (tincion de Sma 1) en todas las heridas tratadas con vasculotida. Ademas, las heridas 5 tratadas con vasculotida agrupada exhibfan aumentos drasticos del numero de vasos positivos de PECAM 1 y Pan EC en el tejido de granulacion. De forma importante, muchos de los nuevos vasos en el tejido de granulacion estaban acompanados de celulas de soporte positivas de SMA. Ademas, estos vasos eran tambien positivos de ICAM 1, un marcador de celulas endoteliales activadas, demostrando que estaba ocurriendo un proceso de curacion de herida activo. El aumento de la densidad de vasos no estaba sorprendentemente acompanado de un aumento de 10 la linfangiogenesis, como se detalla por los numeros similares de vasos positivos de podoplanina. La deposicion global de colageno, como se valora por tincion tricromica de Masson, aumentaba drasticamente a ambas concentraciones de vasculotida agrupada en comparacion con las muestras de vehfculo y bFGF. La deposicion de colageno, mediada principalmente por fibroblastos activados, desempena un papel necesario en la contraccion de los margenes de herida, ofrece resistencia a la traccion, proporciona un andamiaje para la neovascularizacion y 15 facilita la senalizacion celular para las celulas migrantes a traves de la implicacion de integrina. Basandose en analisis patologicos e inmunohistoqufmicos, se concluye que los tiempos de cierre de herida mejorados apuntados en las muestras de vasculotida agrupada son una consecuencia probable de los fuertes efectos de contraccion causados por los aumentos en la deposicion de colageno y neovascularizacion.
20 Ejemplo 7: Administracion sistemica de vasculotida
En este ejemplo, se examino el efecto de la vasculotida administrada por via sistemica sobre las celulas endoteliales en circulacion. Se inyectaron en ratones CD1 de tres meses de edad por via intravenosa PBS (vehuculo) o 50 pg de vasculotida agrupada. 24 horas despues de la inyeccion, se recogio sangre periferica con heparina mediante 25 puncion cardiaca y se clasificaron las celulas endoteliales en circulacion (CEC) no hematopoyeticas usando un enfoque FACS de cuatro canales. Se definieron las CEC como CD13+/VEGFR-2+/CD45- viables (yoduro de propidio). Los numeros de celulas resenados son numeros de celulas viables/pl de sangre periferica. Se determino tambien el recuento de globulos blancos totales usando un hemocitometro.
30 Los resultados demostraban que el suministro sistemico de vasculotida estaba bien tolerado y daba como resultado una disminucion del numero de celulas endoteliales en circulacion. Esto se ha descrito tambien para Ang 1 suministrada por infeccion adenovfrica, sugiriendo que la vasculotida tiene propiedades similares en el nicho de citoblastos que Ang 1.
35 Ejemplo 8: Agonista de Tie 2 multimerico que comprende un peptido GA3
En este ejemplo, se preparo una forma alternativa de molecula de vasculotida en que se uso un peptido GA3 en lugar de un peptido T7. La secuencia aminoacfdica del peptido GA3 era como sigue: Trp-Thr-Ile-Ile-Gln-Arg-Arg-Glu- Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO: 3). Para facilitar la modificacion adicional 40 del peptido, se sintetizo como se describe en el Ejemplo 1, con un residuo de cistefna aminoterminal adicional de tal modo que la secuencia aminoacfdica del peptido usado en la forma multimerica fuera como sigue: Cys-Trp-Thr-Ile- Ile-Gln-Arg-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-Arg-Thr-Trp-Lys-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO: 4). Se conjugo el peptido que contiene cistefna con biotina usando EZ-link-PEO-maleimida-biotina (numero de catalogo de Pierce 21901) como se describe en el Ejemplo 1. El agrupamiento despues de la sfntesis de este peptido biotinilado-PEG 45 con avidina a relacion 4:1 daba lugar a un compuesto tetramerico obligado
El compuesto que contiene GA3 tetramerico se ensayo en el ensayo de migracion de celulas endoteliales como se describe con detalle en el Ejemplo 4. Se muestran los resultados en la Figura 5A, que demuestran que el compuesto que contiene GA3 tetramerico era efectivo en la promocion de la migracion de celulas endoteliales.
50
El compuesto que contiene GA3 tetramerico se ensayo tambien en el ensayo de zimograffa como se describe con detalle en el Ejemplo 4. Se muestran los resultados en la Figura 5B, que demuestran que el compuesto que contiene GA3 tetramerico era efectivo en la promocion de la liberacion de MMP2.
55 Estos resultados demuestran la actividad agonista de un compuesto que contiene un segundo peptido de union a Tie 2 multimerico, donde el compuesto contiene un peptido GA3 en lugar de un peptido T7.
Ejemplo 9: Preparacion de agonistas de Tie 2 multimericos ligados a PEG
En este ejemplo, se prepararon agonistas de Tie 2 multimericos usando ligadores de polietilenglicol (PEG) para unir covalentemente los componentes peptfdicos de los agonistas. Se prepararon tres agonistas de Tie 2 ligados a PEG diferentes: (i) un agonista en que se unieron dos peptidos T7 usando un ligador de PEG de 10.000 Da de PM; (ii) un agonista en que se unieron dos peptidos T7 usando un ligador de PEG de 20.000 Da de PM y (iii) un agonista en 5 que se unieron cuatro peptidos T7 usando un ligador de PEG tetramerico de 20.000 Da de PM. Para preparar estas moleculas, se adquirieron PEG de brazo ramificado activado en NOF America. Los PEG usados en este ejemplo fueron Sunbright DE-100MA (PEG-dimaleimida de PM 10.000 Da, actividad terminal 79 %), Sunbright DE-200Ma (PEG-dimaleimida de PM 20.000 Da, actividad terminal 85,1 %) y Sunbright PTE-200MA (PEG-tetramaleimida de PM 20.000 Da, actividad terminal 94 %). Se hizo reaccionar el peptido T7 con PEG activados como sigue: en el caso 10 de los dos dimaleimida-PEG, se disolvieron exactamente dos equivalentes molares de peptido T7 y 1 equivalente molar de dimaleimida-PEG en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,2. En el caso de tetramaleimida- PEG, se disolvieron exactamente cuatro equivalentes molares de peptido T7 y 1 equivalente molar de tetramaleimida-PEG en PBS a pH 7,2. Se dejaron proseguir las reacciones a 21 °C durante 16 horas. Se ilustran esquematicamente en la Figura 6 las estructuras de los agonistas de Tie 2 multimericos resultantes. Se hace 15 referencia en la presente memoria a estos agonistas de Tie 2 multimericos que contienen peptido T7 ligados a PEG como PEG-T7 vasculotida.
Ejemplo 10: Caracterizacion de la activacion de Tie 2 por PEG-vasculotida
20 En este ejemplo, se examino la capacidad de los compuestos de PEG-T7 vasculotida, preparados como se describe en el Ejemplo 9, de activar el receptor Tie 2 en un ensayo de activacion de Tie 2 in vitro. Se usaron compuestos de PEG-T7 vasculotida en estimulaciones de celulas endoteliales como sigue. Se hicieron crecer celulas endoteliales vasculares bovinas purificadas (bVEC) en placas de 6 pocillos (Nunc) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de FBS, 1x penicilina, 1x estreptomicina y L-glutamina 200 mM (todos de Gibco 25 BRL) en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 °C. Se estimularon las bVEC con cualquiera de PBS, PEG T7 vasculotida tetramerica de PM 20.000 Da (PTE200-T7; 5 pg/ml) o PEG-T7 vasculotida dimerica de PM 10.000 Da (DE100-T7; 250 ng/ml o 500 ng/ml) durante 10 minutos. Se prepararon lisados celulares en tampon de lisis RIPA (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1 % de Igepal, 0,5 % de desoxicolato de sodio, 0,1 % de dodecilsulfato de sodio, 1x aprotinina, 1x leupeptina y 1x PMSF). Se resolvieron electroforeticamente cantidades iguales de protema celular y 30 se transfirieron a membrana de PVDF para analisis de inmunotransferencia. Se efectuo el analisis de inmunotransferencia de acuerdo con las practicas estandares, usando anticuerpo monoclonal anti-Tie 2 (Pharminogen) y anticuerpo policlonal anti-pY992 Tie 2 (Cell Signaling Technology), y empleando procedimientos de deteccion con peroxidasa de rabano picante.
35 Se muestran en la Figura 7 los resultados de estimulacion con 5 pg/ml de PTE200-T7 y se muestran en la Figura 8 los resultados de estimulacion con cualquiera de 250 ng/ml o 500 ng/ml de DE100-T7. Los resultados muestran que aparedan niveles aumentados de activacion de Tie 2, como se detectan por fosforilacion en Y992, en las muestras tratadas con PTE200-T7 o DE100-T7, pero no en las muestras tratadas con PBS, demostrando que ambos compuestos de PEG-T7 vasculotida son capaces de activar el receptor Tie 2 in vitro.
40
Ejemplo 11: Activacion de Tie 2 in vivo por PEG-vasculotida
En este ejemplo, se examino la capacidad de los compuestos de PEG-T7 vasculotida, preparados como se describe en el Ejemplo 9, de activar el receptor Tie 2 in vivo mediante la administracion de los compuestos a ratones, seguido 45 del examen en el tejido celular pulmonar de la activacion de Tie 2 y las rutas posteriores, puesto que el tejido de pulmon contiene una densidad vascular muy alta y por tanto sirve como organo ideal para examinar la activacion de Tie 2.
Se inyectaron por via intravenosa en la vena de la cola de ratones CD1 de tipo silvestre de 12 semanas de edad 50 PTE200-T7 vasculotida (5 pg o 75 pg), DE200-T7 vasculotida (10 pg o 50 pg) o DE100-T7 vasculotida (5 pg o 100 pg) suspendidos en PBS esteril o PBS solo. Despues de 20 minutos, se sacrificaron los ratones mediante dislocacion cervical, se retiraron los pulmones y se congelaron a -80 °C para analisis. Se liso tejido pulmonar descongelado en tampon de lisis RIPA (descrito adicionalmente en el Ejemplo 10). Se determinaron las concentraciones de protema para cada muestra y se inmunoprecipitaron iguales cantidades de protema para Tie 2 55 (Pharminogen, anti-Tie 2 clon 33.1 y protema G-Sepharose, Amersham). Se resolvieron electroforeticamente los inmunoprecipitados y se transfirieron a membrana de PVDF para analisis de inmunotransferencia. Se determino la fosforilacion total de Tie 2 usando un anticuerpo anti-pY (Upstate Biotechnology, clon 4G10). Adicionalmente, se separaron electroforeticamente cantidades iguales de lisado celular completo y se transfirieron a membrana de PVDF para analisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-panMapk, anti-fosfoMapk, anti-panAkt y anti-pS473-
Akt como se describe anteriormente en el Ejemplo 3.
Se muestran los resultados en la Figura 9. Se apuntaron aumentos en la activacion de Tie 2 total en ratones que recibieron PEG-T7 dimerico de PM 10.000 Da (DE100-T7) y PEG-T7 tetramerico de PM 20.000 Da (PTE200-T7). 5 Tambien se activaron las rutas posteriores a Tie 2, incluyendo Mapk y Akt, tras tratamiento con PEG-T7 dimerico de PM 10.000 Da y PEG-T7 tetramerico de PM 20.000 Da, pero no PEG-T7 dimerico de PM 20.000 (DE200-T7), sugiriendo que el espaciamiento del peptido T7 apropiado es crftico para una activacion optima de Tie 2/Mapk/Akt (veanse pMapk y pS473Akt en comparacion con el control de PBS). Ademas, consistentemente con los datos generados usando la vasculotida tetramerica con avidina-biotina, se observo que las dosis menores de PEG-T7 10 vasculotida promovfan una activacion mas robusta de Tie 2 y los eventos de senalizacion posteriores.
Ejemplo 12: Preparacion y caracterizacion de anticuerpos monoclonales especfficos del peptido T7
En este ejemplo, se prepararon anticuerpos monoclonales especfficos del peptido T7 y se caracterizaron. Se 15 conjugo covalentemente el peptido T7 con BSA o KLH usando el kit de Pierce Chemical Company “Imject Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit with mcKLH and BSA” de acuerdo con las instrucciones del kit. Se efectuaron la inyeccion del inmunogeno en ratones BALB/c hembra de 4 semanas de edad, la recogida de suero, la preparacion de hibridomas y el cribado de anticuerpos todos de acuerdo con las instrucciones del kit y segun con las directrices de cuidado animal del Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada).
20
Se cribaron inicialmente los sobrenadantes de hibridoma por ELISA estandar usando T7- BSA como antfgeno, cuyos resultados se muestran a continuacion en la Tabla 1:
Tabla 1: Resultados de cribado de ELISA para sobrenadantes de hibridoma
Hibridoma de T7
Clon monocelular Resultado de ELISA Fondo
F11.4F2
0,258 0,037
F11.4H6
Si 0,641 0,039
F11.2C11
Si 0,307 0,043
F11.9G8
0,379 0,033
F11.15F3
0,374 0,033
F11.3E4
Si 0,249 0,047
F11.7G4
0,182 0,4
F11.7E7
0,339 0,035
F11.7B12
0,186 0.035
F11.7D6
0,168 0,036
F11.13G12
0,117 0,034
F11.12B7
0,278 0,037
F11.13D4
Si 0,955 0,04
F11.14A4
195 0,036
F11.9B11
0,105 0,034
F11.2G6
0,208 0,051
Todos los clones que se probaron positivos durante el cribado inicial se presentan en la Tabla 1. Todos los clones monocelulares se ensayaron adicionalmente para valorar la especificidad.
30 Se efectuo el analisis de transferencia de puntos para valorar la especificidad de hibridomas monoclonales de raton genomanipulados para detectar el peptido T7. Se punteo PEG-T7 tetramerico (PTE200-T7) sobre membrana de PVDF a 17 ng, 83 ng y 333 ng (estas cantidades representan el contenido de T7 global aplicado a la membrana y no dan cuenta del peso del PEG). Se dejo secar la membrana, en cuyo punto se bloqueo con leche desnatada sin grasa al 5 % y se sondeo con los sobrenadantes de hibridoma 2C11, 13D4, 7E7, 3E4 y 4H6 a dilucion 1:500. Se efectuo la
35 dilucion de acuerdo con practicas estandares usando un anticuerpo secundario de cabra anti-raton con peroxidasa de rabano picante a dilucion 1:10.000. Se muestran los resultados en la Figura 10. Todos los clones, excepto 7E7,
fueron capaces de detectar PEG-T7 tetramerico a las concentraciones ensayadas. Se incluyo lisado de celulas enteras de tejido (WCL, 70 pg) como control de especificidad y los resultados indican que el anticuerpo secundario usado en la deteccion interacciona no especfficamente con algun componente del lisado de celula completa.
5 Para valorar adicionalmente la union de anticuerpos monoclonales anti-T7 de raton de 2C11, 13D4, 3E4 y 4H6, se efectuo un analisis de inmunotransferencia con T7-BSA como antfgeno. Para preparar el antfgeno T7-BSA, se conjugo covalentemente el peptido T7 con seroalbumina bovina usando el kit “Imject Maleimide Activated Immunogen Conjugation Kit with mcKLM and BSA” suministrado por Pierce de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se resolvio electroforeticamente el T7-BSA resultante, solo o adicionado con 100 pg de lisado de celulas 10 completas de pulmon de raton (en condiciones no reductoras) y se transfirio a membrana de PVDF para analisis de inmunotransferencia. Se sondearon las membranas de PVDF con el sobrenadante de hibridoma 2C11, 13D4, 3E4 y 4H6 de acuerdo con la practica de inmunotransferencia estandar. Se muestran los resultados en la Figura 11. Todos los clones ensayados eran capaces de detectar T7-BSA (la cantidad total de T7 era igual a 75 ng) en grados variables. Las inmunotransferencias mostraban distintas bandas a aproximadamente 70 kDa, 140 kDa y 210 kDa 15 que se cree que representan agregados no reducidos de BSA-T7. Los clones ensayados detectaban tambien una sola protefna en el lisado de celulas completas pulmonares de aproximadamente 200 kDa.
LISTADO DE SECUENCIAS
20
<110> SUNNYBROOK HEALTH SCIENCES CENTER
Van Slyke, Paul Dumont, Daniel
25 <120> AGONISTAS DE TIE 2 MULTIMERICOS Y USOS DE LOS MISMOS EN LA ESTIMULACION DE LA
ANGIOGENESIS
<130> 9627-3
30 <150> 60/854.950
<151>
<160> 10
35 <170> Patentln Ver. 3.3
<210>
<211> <212> 40 <213>
1
7
PRT
Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
45 <400> 1
His His His Arg His Ser Phe
1 5
<210> <211 > <212> 50 <213>
2
8
PRT
Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
55 <400> 2
Cys His His His Arg Hia Ser Phe
<210> 3
<211> 22
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
10
<400> 3
Trp Thr He lie Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser val Asp Phe Gin Arg
15 10 15
Thr Trp Lys Glu Tyr lys 20 * "
15 <210> <211> <212> <213>
4
23
PRT
Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
25
30

<400> 4

Cys Trp Thr Tie Tie Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp phe Gin 1 5 10 15
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys 20 '

<210> 5

<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
<400>
35
Hip
1
<210> <211 > <212> 40 <213>
5
Pro Trp Leu Thr Arg His
5
6 8
PRT
Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
45 <400> 6

Cys His Pro Trp Leu Thr Arg His 1 5

<210> 7

<211> 7
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
10

<400> 7
Lys Leu Trp Val lie Pro Lys

1 5

<210> 8

15 <211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
20 <223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 8

Cys Lys Leu Trp Val lie Pro Lys 1 5

25 <210> 9

<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico

<400> 9

Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser 1 5
35

<210> 10

<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: peptido sintetico
<400>
Cys
1
10
Asn Leu Leu Met Ala Ala ser 5

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende una forma multimerica de monomeros peptfdicos de union a Tie 2, donde la forma multimerica tiene actividad agonista de Tie 2, donde cada monomero peptfdico es de no mas de 100
    5 aminoacidos de longitud y donde cada monomero peptfdico comprende:
    a) un peptido T7 representado por la SEQ ID NO: 1 o un peptido T7 modificado representado por la SEQ ID NO: 2;
    b) un peptido GA3 representado por la SEQ ID NO: 3 o un peptido GA3 modificado representado por la SEQ ID NO:
    4;
    10 c) un peptido T4 representado por la SEQ ID NO: 9 o un peptido T4 modificado representado por la SEQ ID NO: 10;
    d) un peptido T6 representado por la SEQ ID NO: 7 o un peptido T6 modificado representado por la SEQ ID NO: 8; o
    e) un peptido T8 representado por la SEQ ID NO: 5 o un peptido T8 modificado representado por la SEQ ID NO: 6.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, donde la forma multimerica es un tetramero o un dfmero o 15 comprende 6, 8, 10 o 12 unidades de monomero peptfdico de union a Tie 2.
  3. 3. La composicion de la reivindicacion 1, donde el monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende una estructura A-B-C, donde A comprende un peptido de union a Tie 2, B comprende un espaciador y C comprende un grupo multimerizante, donde C tiene afinidad por D, un agente multimerico que comprende multiples sitios de
    20 union para C, donde opcionalmente el agente multimerico D tiene cuatro sitios de union para el grupo multimerizante C, de tal modo que se forma un tetramero cuando interaccionan cuatro monomeros peptfdicos de union a Tie 2, A-B- C, con el agente multimerico D.
  4. 4. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende una estructura: A-B, donde A comprende un 25 peptido de union a Tie 2 y B comprende un espaciador, donde los multiples peptidos de union a Tie 2 estan ligados
    covalentemente con el espaciador B.
  5. 5. La composicion de la reivindicacion 1, donde la forma multimerica es una forma tetramerica de monomeros peptfdicos de union a Tie 2, donde cada monomero peptfdico de union a Tie 2 comprende una
    30 estructura: A-B-C, donde
    A comprende un peptido de union a Tie 2 seleccionado de entre un peptido T7 representado por la SEQ ID NO: 1, un peptido T7 modificado representado por la SEQ ID NO: 2, un peptido GA3 representado por la SEQ ID NO: 3 y un peptido GA3 modificado representado por la SEQ ID NO: 4;
    35
    B comprende un espaciador de polietilenglicol (PEG), donde el espaciador contiene 2-12 unidades de PEG y C comprende un grupo biotina;
    donde se asocian cuatro estructuras A-B-C con un agente tetramerico D creando la forma tetramerica, estando 40 seleccionado el agente tetramerico D de entre el grupo consistente en avidina, estreptavidina y neutravidina.
  6. 6. La composicion de la reivindicacion 1, donde la forma multimerica es un dfmero peptfdico que comprende: (a) un primer monomero peptfdico; (b) un segundo monomero peptfdico y (c) un resto de ligamiento que conecta dichos primer y segundo monomeros peptfdicos, donde el resto de ligamiento comprende un polietilenglicol
    45 (PEG) de 3.000 Da a 10.000 Da.
  7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, donde el primer monomero peptfdico y el segundo monomero peptfdico son peptidos T7 representados por la SEQ ID NO: 1, peptidos T7 modificados representados por la SEQ ID NO: 2 o combinaciones de los mismos.
    50
  8. 8. La composicion de la reivindicacion 1, donde la forma multimerica es un tetramero peptfdico que comprende: (a) un primer monomero peptfdico; (b) un segundo monomero peptfdico; (c) un tercer monomero peptfdico; (d) un cuarto monomero peptfdico y (e) un resto de ligamiento que conecta dichos primer, segundo, tercer y cuarto monomeros peptfdicos, donde el resto de ligamiento comprende uno o mas polfmeros solubles unidos
    55 covalentemente al primer, segundo, tercero y cuarto monomeros peptfdicos.
  9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, donde el primer, segundo, tercer y cuarto monomeros peptfdicos son peptidos T7 representados por la SEQ ID NO: 1, peptidos T7 modificados representados por la SEQ ID NO: 2, peptidos GA3 representados por la SEQ ID NO: 3 o peptidos GA3 modificados representados por la SEQ
    ID NO: 4 o combinaciones de los mismos.
  10. 10. La composicion de la reivindicacion 9, donde el primer, segundo, tercer y cuarto monomeros peptfdicos son peptidos T7 representados por la SEQ ID NO: 1 o peptidos T7 modificados representados por la SEQ
    5 ID NO: 2 o combinaciones de los mismos.
  11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el polfmero hidrosoluble es un polfmero hidrosoluble de cadena ramificada tal como un polietilenglicol (PEG) de cadena ramificada.
    10 12. La composicion de la reivindicacion 11, donde el PEG de cadena ramificada es de 3.000 a 20.000 Da.
  12. 13. Un procedimiento de activacion de un receptor Tie 2 que comprende poner en contacto el receptor Tie 2 con la forma multimerica de un monomero peptfdico de union a Tie 2 de la reivindicacion 1 de tal modo que se active el receptor Tie 2, donde la activacion del receptor Tie 2 se prueba por la fosforilacion del residuo de tirosina
    15 992 (Y992) del receptor Tie 2.
  13. 14. Una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para uso en la estimulacion de la angiogenesis en un sitio de un sujeto, donde opcionalmente la angiogenesis estimulada por la forma multimerica se caracteriza por al menos una de las siguientes propiedades:
    20
    a) reclutamiento de celulas de soporte perivasculares;
    b) sin filtracion de vasos; y
    c) arborizacion bien definida.
    25 15. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 14, que comprende ademas un segundo
    agente angiogenico, donde el segundo agente angiogenico se selecciona opcionalmente de entre el grupo consistente en PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF, VEGF y factor de crecimiento placentario (PLGF).
    30 16. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 14, donde se estimula la angiogenesis en
    una situacion clfnica seleccionada de entre el grupo consistente en vascularizacion de tejidos regenerativos, enfermedad isquemica de los miembros, isquemia cerebral, afecciones de inflamacion vascular, arterioesclerosis, necrosis avascular, estimulacion del crecimiento capilar y disfuncion erectil.
    35 17. Una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para uso (i) para
    disminuir la permeabilidad vascular en un sitio de vasos filtrantes; (ii) para proteger celulas endoteliales o (iii) para estimular la curacion de una herida en un sujeto.
  14. 18. Un biomaterial en que se ha incorporado la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 12.
  15. 19. El biomaterial de la reivindicacion 18, en que se incorpora un segundo agente seleccionado de entre el grupo consistente en VEGF, PDGF, G-CSF, eritropoyetina humana recombinante, bFGF y factor de crecimiento placentario (PLGF).
    45
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