ES2612747T3 - Una composición farmacéutica que usa combinaciones de variantes de la Hormona Liberadora de las Gonadotropinas (GnRH) como inmunógeno - Google Patents

Una composición farmacéutica que usa combinaciones de variantes de la Hormona Liberadora de las Gonadotropinas (GnRH) como inmunógeno Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica utilizando combinaciones de la hormona GnRH nativa y/o alguno de sus miméticos, unidos indistintamente por sus extremos amino o carboxilo a una molécula portadora, en uncaso por su extremo carboxilo y en el otro por su amino terminal,generando una rápida y potente respuesta inmunológica contra lahormona GnRH endógena que conduce finalmente a la ablación de laGnRH y por tanto del resto de las hormonas involucradas en la cascada GnRH/LH-FSH/Testosterona-(estrógenos) y facilitando la exposición al sistema inmune de un mayor número de epítopes de la GnRHo sus miméticos y minimizando el impedimento estérico que producen los portadores. Esta invención tiene una aplicación directa enla castración de animales de interés económico y animales mascotas, en el control de la fertilidad en humanos, y en el tratamiento de tumores hormonosensibles; de próstata, mama, ovario, endometrio, testículo, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores humanos.

Description

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1.1. Grupos Experimentales
1 – Placebo.
2-Carboxilo terminal (GnRHm1 -TT) 750 μg de péptido total.
3-Amino terminal (TT-GnRHm1) 750 μg de péptido total
4-Combinación 50/50 (peso/peso) en una misma emulsión de las variantes carboxilo terminal (GnRHm1 -TT) + amino terminal (TT-GnRHm1). Se usaron 375 μg de cada uno a sumar 750 μg totales
5-Combinación 70/30 (peso/peso) en una misma emulsión de las variantes carboxilo (GnRHm1 -TT) y amino terminal (TT-GnRHm1). Se utilizaron: (525 μg de GnRHm1-TT y 225 μg de TT-GnRHm1) para un total de 750 μg.
6-Inmunización alterna con 750 μg de la variante carboxilo terminal (GnRHm1 -TT) a los 0, 30 y 60 días y con 750 μg de la amino terminal (TT-GnRHm1) a los 15 y 45 días.
En todos los casos se realizaron 5 inmunizaciones subcutáneas para cada variante, usando el adyuvante Montanide
1.2. Desarrollo experimental:
1.2.1. Preparación de los inmunógenos, inmunización de los animales y chequeo de los resultados:
1.2.2. Adyuvación: La variante del péptido carboxilo terminal GnRHm1 -TT y/o la variante del péptido amino terminal TT-GnRHm1 en las dosis correspondientes se resuspendieron individualmente en agua para inyección. Posteriormente se realizó una mezcla al 50 % (v/v) de los péptidos resuspendidos con igual volumen de adyuvante oleoso. La mezcla fue finalmente agitada en un mezclador mecánico durante 20 minutos hasta que se formó una emulsión de color blanco lechosa, lista para ser administrada.
1.2.3. Inmunización: La emulsión fue cargada en jeringuillas desechables de 1 ml e inyectada por vía subcutánea en la región dorsal de ratas Copenhagen de 9-12 semanas de edad, usando un esquema quincenal.
1.2.4. Medición de los títulos de anticuerpos anti-GnRH: Los anticuerpos circulantes anti GnRH obtenidos por la vacunación fueron determinados usando un sistema ELISA, (del inglés Enzyme-linked-immunoassay). Para ello, fueron recubiertas placas de poliestireno de 96 pozos con 100 μl del péptido nativo GnRH a una concentración de 5 μg/ml en Na2CO3 (pH 9.6) 100 mM e incubadas toda la noche a 4 °C. Después de varios lavados con PBS 1 x (pH 7.4), las placas fueron saturadas durante una hora con 2 % de BSA in PBS. El suero de los animales se diluyó (rango: 1/60 hasta 1/2000) en PBS conteniendo 1 % de BSA, Tween 20 (0.01 %, peso/vol) e incubadas por 3h a 37 °C. Las placas fueron lavadas varias veces con PBS y puestas a reaccionar con anticuerpos anti-IgG de rata conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma Biochemical, EE.UU.). Después de otros lavados, las placas se incubaron con una mezcla que contenía Ortofenilen-diamina (OPD – Ortophenilen-diamine) y el sustrato peróxido de hidrógeno en buffer citrato. Los títulos de anticuerpos fueron calculados como la máxima dilución a la cual la absorbancia de las muestras fue 2 veces superiores al valor de corte del ensayo.
1.2.5. Determinación de niveles de testosterona: Los niveles de testosterona fueron determinados usando el estuche TESTO CT2 (CisBio, International, Francia). Para este proceder, se tomaron 25 μl de suero de cada muestra y se dispensaron directamente en tubos prerecubiertos. Las muestras fueron incubadas por duplicado. Finalmente los tubos fueron lavados con agua destilada y leídos en un contador gamma. Los resultados fueron expresados en nmol/l.
1.2.6. Sacrificio de los animales y análisis estadístico: Los animales fueron anestesiados y luego sacrificados de acuerdo a las normas de buenas prácticas de laboratorio, un mes posterior a la quinta inmunización (100 días). Para la evaluación de las diferencias estadísticas del tamaño de los testículos y la próstata se utilizó el Test de Duncan del software Stat -Graphic. De forma similar los niveles de testosterona fueron analizados usando este mismo paquete estadístico (SAS Institute Inc , SAS/STAT™ User's Guide, Edición Release 6.03. Cary, NC: SAS Institute Inc., 1988. págs.. 1028).
1.3 Resultados experimentales.
1.3.1. Análisis de la Seroconversiόn:
La molécula GnRH, como se ha explicado anteriormente tiene un 100 % de homología en todos los mamíferos y en un elevado nivel en los vertebrados superiores. Tiene además un tamaño muy pequeño (solo diez aminoácidos), lo que le confiere a este péptido muy poco poder inmunogénico en contraste su alta capacidad tolerogénica, debido a su naturaleza endógena.
En el ejemplo que describimos, el grupo inmunizado con la variante amino terminal (TT-GnRHm1), tuvo un 100 % de seroconversión después de la primera inmunización, mientras que el grupo inmunizado con la variante carboxilo
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en la proporción 70/30, y el esquema de inmunización alterno, desarrollaron un 100v% de seroconversión, después de la tercera inmunización (Fig. 7).
2.3.2. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH:
La Figura 8 relaciona los títulos de anticuerpos anti GnRH de los sueros de cada uno de los grupos experimentales. En este gráfico se observa que el grupo P48-P64K-GnRHm1 fue el que mostró mayor velocidad en la aparición de los títulos anti GnRH, los cuales oscilaron entre 1/5000 y 1/8000, al final del experimento. De las variantes combinadas, las variantes 50/50 y 70/30, mostraron similares títulos de anticuerpos anti GnRH. Sin embargo, la variante 50/50, fue la que mostró mayor velocidad de aparición de los títulos. Por su parte, el esquema de inmunización alterno con las variantes GnRHm1-P48-P64K y P48-P64K-GnRHm1, mostró niveles de inmunogenicidad similares a los inducidos cuando se utilizó la variante 70/30, aunque no se logró mantener los títulos a niveles tan altos como con la primera. En el grupo inmunizado con la variante GnRHm1-P48-P64K, los títulos aparecieron más tarde que en el resto de los grupos experimentales, y no alcanzaron niveles superiores a 1/1000 en los mejores casos.
2.3.3. Correlación entre los títulos de anticuerpos anti GnRH inducidos contra diferentes zonas de la hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana.
Como puede observarse en las Figuras 7 y 8, mientras la inmunización con la variante amino terminal P48-P64K-GnRHm1 mostró una alta inmunogenicidad, la variante carboxilo terminal (GnRHm1-P48-P64K), mostró una seroconversión mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra la GnRH. Estas diferencias en la seroconversión, no resultaron sin embargo, en diferencias evidentes en el efecto sobre los órganos diana al momento del sacrificio. Así, títulos tan altos como 1:8000 del grupo inmunizado con la variante amino terminal (P48-P64K-GnRHm1), produjo efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata) que el grupo inmunizado con la variante carboxilo terminal (GnRHm1 -P48-P64K) (Figs. 9 y 10).
Por su parte, las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, logran una respuesta inmunológica significativamente superior a la obtenida con el péptido carboxilo terminal individual, y aunque inferior a los títulos obtenidos con el uso de la variante amino terminal, el efecto biológico resulta significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna (Figs. 8, 9 y 10).
Ejemplo 3. Correlación entre los títulos de anticuerpos anti GnRH inducidos contra diferentes zonas de la hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana. La combinación de estos efectos.
Una vez analizados los títulos de anticuerpos, se realizó un análisis de correlación entre estos y el efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos). Como puede observarse en las figuras 3 y 8, en los grupos experimentales 2 y 3, correspondiente a las variantes carboxilo terminal y amino terminal, se observó un comportamiento totalmente diferente respecto a su capacidad inmunogénica, es decir, mientras el amino terminal, representado por los péptidos TT-GnRHm1 y P48-P64K-GnRHm1, mostraron una alta velocidad de producción de anticuerpos contra la GnRH en los modelos utilizados y elevados títulos contra esta hormona, las variantes carboxilo terminal (GnRHm1-TT y GnRHm1-P48-P64K), mostraron una seroconversión mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra la GnRH. Estos diferentes resultados en la seroconversión y en la titulación de los sueros, arrojaron sin embargo similares resultados en su acción sobre los órganos diana cuando los animales fueron evaluados al sacrificio. Así, se pudo observar que títulos de anticuerpos tan altos como 1:12000 en los grupos inmunizados con las variantes amino terminal, produjeron efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata) que los grupos inmunizados con las variantes carboxilo terminal (Figs. 4 y 5 y 9 y 10). Sin embargo, si las variantes carboxilo y amino terminal se mezclan en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, se logra por una parte, una respuesta inmunológica significativamente superior a la obtenida con el péptido carboxilo terminal individual, la cual aunque no llega a alcanzar valores de titulación tan elevados como con el uso de la variante amino terminal, produce sin embargo, un efecto biológico significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna (Figs. 4, 5, 9y10).
Los resultados descritos aquí, hablan a favor de que la presencia del grupo carboxilo libre en la GnRH estimula de forma muy potente la respuesta inmunológica contra esta hormona, cuando esta es unida a una molécula portadora por su extremo amino terminal y probablemente a otra zona alejada del carboxilo. Lo contrario sucede con la variante GnRH1-TT, la cual al unirse con la molécula portadora por su extremo carboxilo, parece estar comprometiendo la exposición al sistema inmunológico de esta zona y solo exponiendo su extremo amino, el cual no presenta la alta capacidad inmunoestimulante que el primero, pero que sin embargo, es capaz de generar una respuesta que aunque es 10 veces menor, es similarmente neutralizante de la hormona, cuando se administra en iguales dosis que la variante TT-GnRHm1.
Basado en estos hallazgos se puede afirmar que para la GnRH las zonas más inmunogénicas, no son necesariamente las zonas inmunoneutralizantes. Lo mismo ocurre con otras proteínas y péptidos.
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Ejemplo 4. Experimentos de terapia usando las variantes GnRHm1-TT y TT-GnRHm1 individuales y sus combinaciones (GnRHm1-TT +TT-GnRHm1) en ratas adultas Copenhagen implantadas con la línea celular Dunning R3327-H.
4.1. Animales, modelo tumoral: Fragmentos de tumor de (2 x 2 x 2 mm) del modelo tumoral murino Dunning R3327-H, fueron transplantados subcutáneamente (s.c). en la zona distal de la extremidad posterior derecha de ratas Copenhagen adultas con un peso de entre 150 y 200 g. (CENPALAB, Cuba). Esta es una línea celular tumoral altamente diferenciada, hormono-dependiente, con un tiempo de replicación, (VDT del inglés volume doubling time) de 17 días. Para la determinación de la tasa de crecimiento tumoral, los tumores fueron medidos rutinariamente una vez por semana. El volumen tumoral fue calculado usando la fórmula 4/3 π r3 donde r, es la media del radio. Los animales fueron mantenidos con dieta comercial y agua fresca at libitum.
4.2. Diseño experimental:
El experimento contó con los siguientes grupos:
1.
Animales placebos (inmunizados con PBS en Montanide ISA 51).
2.
Animales castrados quirúrgicamente.
3.
Animales inmunizados con el péptido GnRHm1-TT
4.
Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHm1-TT + TT-GnRHm1
5.
Animales inmunizados con el péptido GnRHm1-P48-P64K
6.
Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHm1-P48-P64K + P48-P64K-GnRHm1.
4.3. Tratamiento de los animales:
El tratamiento de los animales se realizó usando un modelo terapéutico, en el cual se inocularon fragmentos de la línea celular tumoral Dunning R3327-H, tal y como se describe en el acápite 3.1.1. La intervención terapéutica (inmunizaciones), se comenzó cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 10 mm. Las inmunizaciones se realizaron con un intervalo quincenal.
Las dosis utilizadas en el experimento para los grupos del 3 al 6, fueron las mismas que las descritas en el acápite 1.1.
4.4. Resultados experimentales:
Evaluación de la tasa de crecimiento tumoral de las ratas Copenhagen implantadas con la línea celular tumoral Dunning R3327-H.
Como puede apreciarse en la Figura 11, mientras que en el grupo placebo se observó un crecimiento abrupto del tumor, en los grupos castrados e inmunizados se observó una marcada inhibición del crecimiento tumoral. No obstante la mayor inhibición del crecimiento tumoral se observó en los animales castrados y en los grupos de animales inmunizados con las variantes combinadas GnRHm1-TT+TT-GnRHm1 (50/50) y GnRHm1-P48-P64K + P48-P64K-GnRHm1 (50/50). La inhibición para estas 3 variantes experimentales fue muy similar y resultó significativamente diferente en comparación con el grupo placebo y los otros grupos.
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