ES2613986T3 - Complejo biológicamente activo y su preparación - Google Patents

Complejo biológicamente activo y su preparación Download PDF

Info

Publication number
ES2613986T3
ES2613986T3 ES11804746.3T ES11804746T ES2613986T3 ES 2613986 T3 ES2613986 T3 ES 2613986T3 ES 11804746 T ES11804746 T ES 11804746T ES 2613986 T3 ES2613986 T3 ES 2613986T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
hamlet
cells
protein
cell
ion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11804746.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Catharina Svanborg
Kenneth Hun Mok
Maria Trulsson
Ann-Kristin Mossberg
Petter Storm
Ching Shing Ho
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hamlet Pharma AB
Original Assignee
Hamlet Pharma AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1019936.2A external-priority patent/GB201019936D0/en
Priority claimed from GBGB1019937.0A external-priority patent/GB201019937D0/en
Application filed by Hamlet Pharma AB filed Critical Hamlet Pharma AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2613986T3 publication Critical patent/ES2613986T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un complejo biológicamente activo que comprende un péptido de hasta 50 aminoácidos que comprende un fragmento de alfalactalbúmina en que cualquier resto de cisteína se remplaza por otros aminoácidos; y una sal farmacéuticamente aceptable de un ácido graso o un lípido: en el que el fragmento es de la SEQ ID NO 3 o de la SEQ ID NO 4 KQFTKXELSQLLKDIDGYGGIALPELIXTMFHTSGYDTQA (SEQ ID NO 3) LDDDITDDIMXAKKILDIKGIDYWLAHKALXTEKLEQWLXEKL (SEQ ID NO 4) donde X es un resto de aminoácido diferente a cisteína.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
15
25
35
45
55
65
lugar de con sales solubles en agua de ácidos grasos para producir complejos altamente eficaces sin pérdida de actividad, pero con una mayor facilidad de producción. Por tanto, parece que la presencia de un resto protonado no es esencial para la formación de complejos estables.
Sin embargo, también se ha descubierto que cuando la proteína aplicada a una columna es alfalactalbúmina humana, y la columna se ha pre-tratado o acondicionado usando una solución de una sal de ácido oleico, los rendimientos son comparables o mejores que los conseguidos usando ácido oleico. Esto es sorprendente a la luz de la descripción del documento WO2010/131237.
Además, se ha descubierto que las sales de ácidos grasos y, en particular, oleatos tienen actividad intrínseca en la activación de los canales de iones lo que se ha encontrado que son relevantes para la actividad de HAMLET. Por tanto, puede esperarse que el uso de dichas sales pueda ser beneficioso en una función clínica o como un componente de nuevas entidades terapéuticas.
Los polipéptidos usados en el proceso están en un estado desplegado y, por lo tanto, si se someten a plegamiento, pueden requerir una etapa de tratamiento preliminar para desplegarlos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, en condiciones ácidas y se forman estados similares a pH neutro tras la eliminación del ión Ca2+ unido fuertemente por agentes quelantes tales como EDTA (ácido etilen diamina tetraacético), por reducción de los enlaces disulfuro o a temperaturas elevadas (Pfeil et al., 1987 Biochim Biophys Acta, 911:114-116; Kuwajima 1996 Faseb J. 1:102-109; Shulman et al., 1995 J. Mol. Bol. 253, 651-657).
Sin embargo, por el uso de un péptido que se sintetiza de acuerdo con la secuencia de una proteína que carece de enlaces o entrecruzamientos disulfuro intramoleculares, no se necesitan etapas de pretratamiento, por ejemplo, por tratamiento con un agente quelante de calcio tal como EDTA, sometiendo el material a bajo pH o a alta temperatura, para retirar el calcio y aumentar la cantidad de material de tipo globular fundido presente.
En particular, cuando se usa el método de la invención, se obtienen altos rendimientos del complejo biológicamente activo, convenientemente.
El polipéptido como se define anteriormente es activo cuando se mezcla con el lípido. La proteína desplegada adecuadamente se pone en contacto con la sal del ácido graso o lípido en condiciones que permitirán que tenga lugar el intercambio iónico, en particular, en una columna de intercambio iónico, específicamente una columna de intercambio aniónico tal como una columna de DEAE-Trisacryl M (disponible en BioSepra, Ville-neuf, Francia). La columna adecuadamente se "pre-acondiciona" con una sal del ácido graso tal como oleato sódico, antes de aplicar la proteína a la misma. Esto puede conseguirse eluyendo o acondicionando la columna en primer lugar con la sal, que está adecuadamente en forma de una solución acuosa. Adecuadamente, la solución salina se eluye a través de una columna que contiene nuevo material no usado o reacondicionado de intercambio iónico tal como DEAE-Trisacryl. Los tampones adecuados de elución incluyen Tris-HCl y NaCl con un pH de 8,5. La cantidad de solución salina aplicada a la columna de este modo puede depender poco de factores tales como el tamaño de la columna y el volumen de proteína recombinante necesaria para convertirse en complejo biológicamente activo. Por ejemplo, se ha descubierto que pueden usarse solamente 10 mg de ácido para acondicionar una columna de 14 cm x 1,6 cm.
Después de haber aplicado el polipéptido a la columna (por ejemplo, en solución en un tampón adecuado), después se eluye con un gradiente lineal de sal, y se aísla la fracción que eluye alto contenido de sal (NaCl 0,7-1 M o equivalente).
Como alternativa, como se describe en el documento WO2008138348, el polipéptido puede mezclarse con una solución del ácido graso o lípido antes del contacto con el medio de intercambio iónico, en particular, por elución en una columna de intercambio iónico.
Por tanto, puede producirse un complejo biológicamente activo poniendo en contacto un polipéptido que tiene la secuencia de alfa lactalbúmina o variante de la misma que carece de enlaces disulfuro intramoleculares (entrecruzamientos), con una sal de ácido oleico o con una columna de intercambio aniónico en condiciones en que se forma un complejo biológicamente activo, eluyendo la columna con un gradiente salino y aislando el complejo de una fracción que eluye a alta concentración de sal.
La expresión "alta concentración de sal" se refiere a concentraciones de sales con cationes tales como aluros y, en particular, cloruros a concentraciones en exceso de 0,5 M, por ejemplo, en exceso de 0,75 M y, en particular, a aproximadamente 1 M.
La concentración necesaria puede variar dependiendo de la sal usada, pero en una realización particular, la sal es NaCl y adecuadamente NaCl 0,7-1 M.
Adecuadamente, la sal de ácido oleico usada en el proceso está en forma pura.
Puede usarse una columna pre-tratada de forma repetida para convertir numerosas fracciones de una proteína
15
25
35
45
55
65
natural y también recombinante que tiene la secuencia de α-lactalbúmina o un de fragmento de la misma en complejo biológicamente activo como se describe anteriormente. Una vez agotada la columna o disminuida la tasa de conversión hasta niveles inaceptables, la etapa de pre-tratamiento puede repetirse para restaurar la actividad de producción de complejo.
Un medio de intercambio iónico que se ha pre-tratado con una solución, adecuadamente una solución acuosa, de una sal de ácido graso o lípido, en particular ácido oleico es, por lo tanto, adecuado para su uso en un proceso como se describe anteriormente.
Los medios adecuados de intercambio iónico son resina de intercambio aniónico, que puede ser intercambiadores fuertes o débiles de aniones. Por ejemplo, en una realización particular, el medio de intercambio iónico puede ser DEAE Trisacryl, pero las alternativas incluyen DEAE Ceramic, Capto Q, DEAE Sepharose Q, Sepharose XL, Q Sepharose XL, Source 3OQ o Unosphere Q. En una realización particular, el medio de intercambio iónico es una resina fuerte basada en amonio cuaternario (Q). Los tamaños de partícula adecuadamente varían de 40-165 micrómetros. En particular, el medio de intercambio iónico está en forma de una columna de intercambio iónico convencional.
Los complejos obtenidos como se describe usando alfalactalbúmina humana y oleato sódico se ha descubierto que son biológicamente activos porque tienen actividad en inducir la muerte de células tumorales, por ejemplo, por apoptosis y/o tienen un efecto bactericida que es al menos igual al obtenido con otros complejos biológicamente activos tales como HAMLET. Además, se ha descubierto que sales y, en particular, sales oleato tales como oleato sódico parecen tener algún efecto tumoricida inherente. Por lo tanto, la inclusión de este en el complejo puede dar lugar a aumentos de la actividad.
Sin embargo, las sales también pueden tener utilidad terapéutica, por ejemplo, en combinación con otros agentes terapéuticos antineoplásicos incluyendo complejos. Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer pueden contener adecuadamente dichas sales.
Además, se ha descubierto que complejos de este tipo general pueden abordar específicamente núcleos celulares y también pueden usarse para "transportar" de forma eficaz reactivos a los núcleos de las células para maximizar su efecto. Esto es particularmente útil cuando el complejo aborda específicamente una célula tumoral, por ejemplo. Por tanto, los complejos pueden comprender adicionalmente un reactivo secundario que se combina con el complejo, de modo que se transporta al núcleo plasma de las células que son susceptibles al complejo. Se describen complejos análogos, por ejemplo, en el documento WO 99/27967.
Dicho reactivo secundario puede acoplarse por conjugación o por unión covalente, por ejemplo, mediante un grupo enlazador o espaciador como se entendería en la técnica. Las reacciones enzimáticas pueden mediar o facilitar el acoplamiento.
Las técnicas de producción recombinante también permiten la posibilidad de que el polipéptido del complejo pudiera producirse en forma de una proteína de fusión con dicho reactivo secundario.
Ejemplos de dichos reactivos secundarios incluyen citoxinas tales como reactivos quimioterapéuticos conocidos usados para el tratamiento del cáncer, toxinas microbianas tales como toxina diftérica y anticuerpos monoclonales. Como alternativa, dicho reactivo secundario comprende un agente de marcaje tal como biotina o marcadores radiactivos tales como 125I. Por ejemplo, puede introducirse un grupo de marcaje en una proteína usando una reacción enzimática o teniendo un elemento de construcción marcado (tal como isótopos radiactivos, por ejemplo, 14C, 35S) dentro de la proteína. El marcaje con 125I puede realizarse de forma enzimática acoplando 125I a la proteína con la ayuda de lactoperoxidasa. La biotinilización de la proteína se realiza permitiendo que el éster de Nhidroxisuccinimida del ácido D-biotinil-ε-aminocapróico reaccione con la proteína formando un enlace amida estable con grupos amino libres en la proteína.
La proteína también puede marcarse añadiendo un aminoácido radiactivo durante la producción de una proteína recombinante.
Dependiendo de la naturaleza de dicho reactivo secundario, el complejo de la invención puede usarse en el diagnóstico y/o en el tratamiento del cáncer. Para este fin, el complejo adecuadamente se formula como una composición farmacéutica.
Por tanto, los complejos como se describe anteriormente pueden formularse en composiciones farmacéuticas útiles combinándolos con vehículos farmacéuticamente aceptables del modo convencional. Dichas composiciones forman un aspecto adicional de la invención.
Las composiciones de acuerdo con este aspecto de la invención son adecuadamente composiciones farmacéuticas en una forma adecuada para uso tópico, por ejemplo, como cremas, pomadas, geles o soluciones o suspensiones acuosas u oleosas. Estos pueden incluir los vehículos, cargas y/o excipientes habitualmente conocidos, que son
15
25
35
45
55
65
farmacéuticamente aceptables.
Las soluciones tópicas o cremas adecuadamente contienen un agente emulsionante para el complejo proteico junto con un diluyente o base de crema.
La dosis diaria del complejo varía y depende del paciente, la naturaleza de la afección que se está tratando, etc., de acuerdo con la práctica clínica normal. Como norma general, se usan de 2 a 200 mg/dosis del complejo biológicamente activo para cada administración.
Un método para tratar el cáncer comprende administrar a un paciente que lo necesite un complejo biológicamente activo como se describe en anteriormente.
En particular, el complejo puede usarse para tratar cánceres tales como papilomas humanos de la piel, cáncer humano de vejiga y glioblastomas. En el último caso, la administración puede ser por infusión como se sabe en la técnica.
La invención proporciona adicionalmente el complejo biológicamente activo como se define anteriormente para su uso en terapia, en particular en el tratamiento del cáncer.
Además, se ha descubierto que el uso de una sal de un ácido graso en lugar del propio ácido graso en la producción conduce a un rendimiento potenciado de complejo biológicamente activo, que es bastante inesperado.
Sin embargo, como se menciona anteriormente, la identificación del repertorio de canales de iones abre una gama de opciones terapéuticas específicas que se esperará que proporcionen terapias potenciadas contra el cáncer.
Por tanto, un método para abordar selectivamente células cancerosas comprende aplicar a un paciente que lo necesite
(i)
un reactivo que modula selectivamente los canales de iones en una membrana celular y se inhibe por amilorida o por sustancias comparativas; y/o
(ii)
un reactivo que modula selectivamente los canales de potasio en una membrana celular y se inhibe por cloruro de bario (BaCl2) o por sustancias comparativas; en combinación con
(iii) un reactivo que causa muerte celular al menos en células tumorales.
Los solicitantes han descubierto que estos canales particulares pueden ser más susceptibles a la modulación en células tumorales de lo que son en células sanas y que, por lo tanto, abordando específicamente estos canales, puede aumentarse la selectividad de los agentes citotóxicos para células tumorales por co-administración de estas sustancias, reduciendo de ese modo el riesgo de efectos secundarios.
Como se usa en este documento, la expresión "modula selectivamente" significa que el reactivo actúa sobre o activa una cantidad limitada de canales de iones solamente. Al hacer esto, el reactivo será capaz de tener un impacto terapéutico sobre la célula, pero también limitando los efectos a esos canales que son particularmente sensibles en células tumorales, esto minimizará los efectos no específicos sobre las células sanas. En el caso del reactivo (i) anterior, dicho reactivos pueden identificarse en virtud del hecho de que se inhiben por amilorida (3,5-diamino-6cloro-N-(diaminometilen)pirazina-2-carboxamida) u otras sustancias comparativas. En el caso del reactivo (ii) anterior, dichos reactivos pueden identificarse en virtud del hecho de que se inhiben por BaCl2 u otras sustancias comparativas.
Como se usa en este documento, la expresión "sustancias comparativas" se refiere a bloqueantes de canales con actividad comparable o sustancias que modulan canales de iones similares de un modo similar al compuesto de referencia. En líneas generales, sin embargo, los reactivos para su uso en la invención tendrán capacidad de identificarse con referencia a la capacidad de los compuestos de referencia para inhibir la modulación de los canales de iones usando métodos convencionales, por ejemplo, como se ilustra posteriormente en este documento en los ejemplos.
Adecuadamente, los reactivos (i) y (ii) no modulan o abren canales mecanosensibles en el sentido de que no se inhiben por cloruro gadolinio (GdCl3), o canales generales de Ca2+ como se ilustra porque se inhiben por rojo de rutenio (oxicloruro de rutenio amoniacado) o canales de potasio activados por Ca2+ de gran conductancia como se ilustra por la inhibición por tetrandrina (6,6’,7,12-tetrametoxi-2,2’-dimetil-1 beta-berbanano).
En una realización particular, los reactivos (i), (ii) y/o (iii) pueden comprender un único reactivo que será diferente a HAMLET o análogos terapéuticos conocidos del mismo. Los análogos de HAMLET son conocidos, por ejemplo, a partir del documento WO03074547, cuyo contenido se incorpora en este documento por referencia.
Una forma particular de único reactivo que puede conseguir esta función es un complejo biológicamente activo como se describe anteriormente.
15
25
35
45
55
65
Sin embargo, este resultado puede conseguirse por terapias de combinación, en que, por ejemplo, un reactivo que es agentes citotóxicos no específicos relativamente eficaces se asocian con un reactivo que cumple los requisitos de
(i) y/o (ii) anteriores o una combinación de reactivos que consigue este efecto. Los agentes citotóxicos (iii) pueden asociarse con los reactivos (i) y/o (ii) que se unen, por ejemplo, se unen covalentemente a las moléculas. Sin embargo, también puede ser suficiente la asociación mediante la formación de complejos u otros efectos de enlace de hidrogeno.
Sin embargo, ejemplos de dichos reactivos (i) y/o (ii) pueden incluir complejos proteína desplegada-lípido (diferentes de HAMLET), anticuerpos, moléculas pequeñas, ARNip o ARNhc, lípidos o sales de lípidos. Los reactivos pueden ser moduladores conocidos de canales de iones o pueden identificarse reactivos adecuados usando métodos adecuados de selección, por ejemplo, como se describe a continuación.
En particular, el agente citotóxico es uno que interacciona con la ruta de p38 para lograr el efecto de eliminación.
Una composición para abordar selectivamente células cancerosas puede comprender una composición que comprende
(i)
un reactivo que modula selectivamente los canales de iones en una membrana celular y se inhibe por amilorida o por sustancias comparativas; y/o
(ii)
un reactivo que modula selectivamente los canales de potasio en una membrana celular y se inhibe por cloruro de bario (BaCl2) o por sustancias comparativas; en combinación con
(iii) un reactivo que causa muerte celular al menos en células tumorales.
Dichas composiciones pueden comprender una única composición o, cuando los componentes son componentes individuales, pueden envasarse por separado para administración secuencial o concurrente. Las composiciones generalmente comprenderán adicionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables como es convencional en la técnica. Incluyen diluyentes sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones son adecuadamente composiciones farmacéuticas en una forma adecuada para uso tópico, por ejemplo, como cremas, pomadas, geles o soluciones o suspensiones acuosas u oleosas. Estos pueden incluir los vehículos, cargas y/o excipientes habitualmente conocidos, que son farmacéuticamente aceptables.
Las soluciones tópicas o cremas contienen adecuadamente un agente emulsionante para el complejo proteico junto con un diluyente o base de crema.
Además, un método para identificar reactivos que pueden ser útiles en los métodos y composiciones anteriores comprende aplicar un reactivo de ensayo a célula; determinar el efecto sobre los canales de iones en presencia o en ausencia de amilorida o una sustancia comparativa; y/o en presencia o en ausencia de BaCl2 o moléculas comprables; e identificar aquellos reactivos cuya actividad se inhibe por la presencia de al menos uno de amilorida o BaCl2.
El efecto sobre los canales de iones puede determinarse, por ejemplo, por co-administrador de un indicador que es capaz de penetrar en las células cuando se abren los canales de iones. Una vez presentes en las células, dichos indiciadores reaccionan en el entorno celular para desarrollar una señal detectable. Uno de dichos indicadores es FluoxORTM disponible en Tecan Group, Suiza.
Adecuadamente, la célula usada en el ensayo es una célula tumoral que se ha descubierto que es particularmente susceptible a reactivos que modulan los canales de iones de este modo. Sin embargo, el hecho de que este repertorio de canales esté compartido por bacterias puede significar que las células usadas en el método de selección puedan ser células bacterianas ya que, de hecho, las células bacterianas pueden proporcionar una imitación de las células tumorales susceptibles en este caso.
Para asegurar una selectividad óptima por células tumorales, el ensayo se realiza también en presencia o en ausencia de al menos un inhibidor seleccionado de gadolinio, tetrandina y rojo de rutenio, y aquellos compuestos donde la presencia o la ausencia del inhibidor no afecta a la permeabilidad celular en estos casos, puede seleccionarse como candidato preferido para evaluación adicional.
Los reactivos de ensayos adecuados incluyen moléculas pequeñas y restos químicos, así como complejos de proteína desplegada/lípido (diferentes de HAMLET), anticuerpos, moléculas pequeñas, ARNip o ARNhc, lípidos o sales de lípidos.
Aunque la transformación oncogénica y la función de las células cancerosas requieren el apoyo de los canales de iones, la variabilidad y la complejidad de los canales de iones es considerable. Los genes que codifican canales de iones frecuentemente se sobreexpresan en cánceres humanos, debido a amplificaciones génicas, regulación epigenética o variantes de corte y empalme de los genes que codifican los canales. Excepto KCNRG, que codifica una proteína reguladora del canal de K+ con propiedad supresoras tumorales, no se ha informado de mutaciones
imagen7
15
25
35
45
55
65
La invención se describirá ahora particularmente a modo de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos que muestran los resultados de experimentos expuestos a continuación.
Los experimentos que dan lugar a la invención se describirán ahora particularmente a modo de ilustración y ejemplo. Los ejemplos se refieren a figuras que pueden resumirse del siguiente modo:
Figura 1. HAMLET altera la morfología de vesículas lipídicas por elongación de la membrana e induce flujos de iones en células tumorales. (A, paneles superiores) Micrografías de campo claro que muestran vesículas de yema de huevo adherentes a vidrio antes y después de una exposición de 40 minutos a HAMLET, α-lactalbúmina (HLA) o ácido oleico (OA). La morfología se registró por microscopía de contraste de interferencia diferencial. Barra de escala 20 µM. A T = 0, las vesículas eran rígidas, con morfología predominantemente redondeada. Después de la exposición a HAMLET, las estructuras unilamelares eran más prominentes y las membranas estaban alargadas (véanse las flechas negras). La morfología de las vesículas tratadas con HLA u OA estaba inalterada. (Paneles inferiores) Efecto de HAMLET sobre PMV de células de carcinoma pulmonar. Las PMV sobre placas de fondo de vidrio se expusieron a HAMLET, a HLA o a OA y se tiñeron con rojo Nilo para microscopia confocal. Después de la exposición a HAMLET, se detectaron invaginaciones de membrana en células tumorales, pero no en células diferenciadas normales. Como control, también se expusieron PMV de células diferenciadas sanas en placas de fondo de vidrio a HAMLET y se tiñeron con rojo Nilo. No se detectaron cambios en la composición de membrana.
(B)
Por fluorometría, se demostró que los flujos de Ca2+, K+ y Na+ eran específicos de HAMLET, ya que PBS, αlactalbúmina o ácido oleico no tenían efecto. Amilorida o BaCl2 inhibían los flujos de Ca2+. Para los efectos de otros inhibidores de canales de iones, véase la Figura 8. (C) HAMLET desencadena flujos de K+ y de Ca2+, visualizados por imágenes confocales a tiempo real de células de carcinoma pulmonar, cargadas con el fluoróforo de Ca2+ Fluo-4 AM o con el fluoróforo de K+ FluxORTM. Figura 2. Los inhibidores de canales de iones rescatan las células de carcinoma de muerte y bloquean la captación de HAMLET y el cambio morfológico.
(A)
Viabilidad de células de carcinoma pulmonar después de exposición a HAMLET (21 o 35 µM, 3 horas), cuantificada por exclusión de azul de tripano (niveles de ATP en la figura S2). Se inhibió el efecto tumoricida de HAMLET por amilorida o BaCl2, pero GdCl3, rojo de rutenio y tetrandrina no mostraron efecto (medias +ETM, dos a tres experimentos). (B) BaCl2 y amilorida evitaban que las células de carcinoma cambiaran su morfología en respuesta a HAMLET (media de dos imágenes en un experimento +ETM). (C) Internalización de HAMLET marcado con Alexa-fluor por células tumorales (35 µM, 1 hora), visualizada por microscopia confocal. Amilorida o BaCl2 inhibía la internalización, dejando HAMLET asociado con la superficie celular. (D) Transferencia de Western de lisados celulares, que confirma la reducción en HAMLET asociado a células por amilorida y BaCl2 (35 µM, 1 hora, detectado con anticuerpos anti-α-lactalbúmina). GAPDH era el control de carga. (E) La respuesta transcriptómica a HAMLET requiere canales de iones funcionales. Amilorida reducía notablemente la respuesta transcripcional global a HAMLET en células de carcinoma pulmonar. (F) La cantidad de genes expresados de forma diferencial (cambio factorial log2 > 1 y valor-p ajustado a FDR < 0,05) se reducía enormemente por amilorida. Para los efectos de los bloqueantes de canales de iones sobre células de carcinoma renal y de linfoma, véase la Figura 9 y 10. Figura 3. HAMLET activa la ruta de señalización de p38
(A)
Se identificaron cambios transcripcionales en células de carcinoma pulmonar A549 tratadas con HAMLET. Trescientos sesenta y siete genes mostraron un cambio factorial log2 mínimo de 1,2 en comparación con células de control tratadas con PBS, con un valor p ajustado de Benjamini-Hochberg < 0,05. Diez genes en la ruta de p38 estaban regulados positivamente (rojo) tres horas después del tratamiento con HAMLET (21 µM) de células de carcinoma pulmonar (A549), como se marca en la ruta canónica. (B, C) Mapa térmico (triplicado para cada periodo de tiempo) y relaciones log2 de genes expresados de forma diferencial en la ruta de p38, 1, 3, 6 y 24 horas después de la exposición a HAMLET. (D, E) Fosforilación aumentada de p38α, β, γ y HSP27 y reducida de ERK1/2 en células de carcinoma renal (D) y pulmonar (E) expuestas a HAMLET (35 µM, 30 minutos). Las membranas con anticuerpos fosfoespecíficos se sondearon con lisados proteicos de células de carcinoma tratadas con HAMLET o con PBS (control). Se cuantificó la fosforilación de las proteínas usando ImageJ. Los datos son la media ±ETM de tres experimentos. Se dan imágenes de serie completa en la figura S2. (F) Fosforilación de p38 dependiente de la dosis y del tiempo en respuesta a HAMLET. Se sondearon las transferencias de lisados proteicos con anticuerpos específicos para p38 fosforilado (Thr180/Tyr182). Se trataron células de carcinoma pulmonar con HAMLET y se compararon con controles negativos tratados con PBS. Las membranas se separaron y se volvieron a sondear con anticuerpo contra p38 total y contra GAPDH como control de carga. Para los efectos sobre la señalización de p38 en células de carcinoma renal, véase la Figura 11. Figura 4. La inhibición de p38 rescata células de carcinoma y de linfoma de muerte y del cambio morfológico en respuesta a HAMLET (A, B) La inhibición de p38 (SB202190, 20 µM) rescataba células de carcinoma (A549 y A498) y de linfoma de células T (Jurkat) de la muerte en respuesta a HAMLET (7-49 µM, 3 h). Se cuantificó la viabilidad por exclusión de azul de tripano (A) o como niveles de ATP (B). Los datos son las medias +ETM para tres experimentos independientes. (C) Imágenes a tiempo real de morfología celular después de exposición a HAMLET, que muestran que la inhibición de p38 evita los cambios morfológicos en células de carcinoma (condensación nuclear, redondeo y formación de ampollas). HAMLET marcado con Alexa-fluor 568 es rojo y los núcleos son azules (Hoechst 33342). (D-E) Se transfectaron células de carcinoma pulmonar A549 usando ARNip contra
15
25
35
45
55
65
p38α/MAPK14 y/o p38β/MAPK11 o ARNip no dirigido. Se muestran los niveles relativos de ARNm de MAPK11 y de MAPK14 (MAPK/GAPDH, en % de células no transfectadas) como las medias +ETM para 4 experimentos independientes. También se confirmó la reducción sobre el nivel de proteína por transferencia de Western frente a p38 total (transferencia representativa mostrada). Se usó GAPDH como control de carga. (F) Se cuantificó el efecto citotóxico de HAMLET 48 horas después de la transfección como reducción en los niveles de ATP. Los datos son las medias +ETM para cuatro experimentos independientes. *p<0,05, ***p<0.001. Para los efectos del inhibidor de p38 Birb0796, véase la Figura 13. Figura 5. Los inhibidores de canales de iones reducen la fosforilación de proteínas. Amilorida o BaCl2 redujo la fosforilación de dianas en la señalización de p38 y las rutas de estrés del RE. Se expusieron células de carcinoma pulmonar a HAMLET (21 y 35 µM) durante 1 hora, se transfirieron los lisados proteicos, se incubaron con anticuerpos como se indica en la figura y se cuantificaron usando ImageJ (transferencia representativa, +ETM de 2-3 experimentos independientes). (A) Amilorida o BaCl2 (30 minutos de pretratamiento) inhibía la fosforilación de p38 inducida por HAMLET y (B) el estrés del RE, como se muestra por fosforilación reducida de eIF2α. (C) Amilorida o BaCl2 inhibía el cambio de señalización Ras/RAF/MEK-MAPK ya que se revertía la supresión de la fosforilación de p-ERK1/2 por HAMLET. Figura 6. Respuesta inmunitaria innata a HAMLET en células diferenciadas normales
(A)
La respuesta transcripcional a HAMLET es cualitativamente diferente en células normales (RPTEC), como se muestra por el mapa térmico de genes con un cambio factorial log2 >2 en cualquier punto temporal. (B) La cantidad de genes expresados de forma diferencial (cambio factorial log2 ≥2) estaba reducida en comparación con células de carcinoma. (C) Siete genes relacionados con inmunidad innata están regulados positivamente en células normales, 75 minutos después de tratamiento con HAMLET. Dos genes, p38 y MKK3/6 están regulados negativamente. (D) Confirmación de la respuesta inmunitaria innata a HAMLET. Niveles elevados de TNF, IL-8 e IL-6 en sobrenadantes de células diferenciadas normales, pero no en células de carcinoma tratadas con HAMLET (21-42 µM, 6 h). Los datos son las medias ±ETM de triplicados de tres experimentos independientes. (E, F) Diferencia en la fosforilación de p38 entre células diferenciadas normales (HRTEC) y células de carcinoma renal, visualizadas por anticuerpos fosfoespecíficos. Para la supresión de las respuestas inmunitarias innatas por amilorida y BaCl2, véase la Figura 14. Figura 7. (A) Los flujos de iones inducidos por HAMLET (35 µM) o sus constituyentes (todo-ala α-lactalbúmina 35 µM u oleato sódico 175 µM) se cuantificaron por fluorometría, como se describe. Ambos constituyentes mostraron actividad independiente de activación de canales de iones. El mutante parcialmente desplegado αlactalbúminaaII-ala desencadenaba flujos de K+ comparables con HAMLET y flujos más débiles de Na+ o de Ca2+. El oleato desencadenaba flujos de K+, pero los efectos sobre los flujos de Na+ o de Ca2+ eran bajos. (B) Se estudió la respuesta transcripcional global a HAMLET por microserie y los 3000 genes superiores por varianza visualizados en un mapa térmico. HAMLET y el oleato causaban una respuesta transcripcional muy similar mientras que el ácido oleico era similar a controles no tratados. Rojo = alta expresión, verde = baja. (C) Los genes expresados de forma diferencial (cambio factorial log2 de más de 1 en comparación con células de control tratadas con PBS y valor-p ajustado <0,05) eran muy similares entre células tratadas con HAMLET y con oleato.
(D)
Usando Ingenuity Pathway Analysis se visualizaron p38 y genes asociados con p38 en una red de señalización y se demostró que estaban regulados positivamente por HAMLET o por oleato. (E) HAMLET y el oleato causaban corte y empalme de XBP1, indicativo de estrés del RE, así como fosforilación de p38. (F) Las concentraciones de oleato correspondientes a 15 x la de HAMLET (35 µM) no eran tumoricidas (para detalles sobre oleato como cofactor en la formación de complejos HAMLET y muerte celular). Figura 8. Magnitud de los picos de Ca2+ con inhibidores diferentes. Se pre-trataron células de carcinoma (A549) y células diferenciadas sanas (HRTEC) con inhibidores y medios sin calcio según se indica. La magnitud del primer y el segundo pico de Ca2+ se cuantificaron usando el software LSM. Figura 9A. Inhibidores de canales de iones rescatan células HeLa de muerte celular inducida por HAMLET. Se pre-incubaron células HeLa con inhibidores de canales de iones según se indica y se trataron con HAMLET (2135 µM) durante tres horas. Se cuantificó la muerte celular por ensayo con azul de tripano y por niveles de ATP. Figura 9B. Inhibidores de canales de iones rescatan células Jurkat de muerte celular inducida por HAMLET. Se pre-incubaron células de linfoma Jurkat con inhibidores de canales de iones según se indica y se trataron con HAMLET (21-35 µM) durante tres horas. Se cuantificó la muerte celular por ensayo de azul de tripano y por niveles de ATP. Figura 10. Expresión diferencial de genes en la ruta de señalización de p38. Se expusieron células de carcinoma renal humano A498 a HAMLET durante tres horas y los genes expresados de forma diferencial se clasificaron de forma funcional usando Ingenuity Pathway Analysis. Se identificó la ruta de señalización de p38 como la ruta de valoración superior. Figura 11. Fosforilación de MAPK en respuesta a HAMLET. A) Células de carcinoma renal responden a HAMLET por fosforilación de p38α, p38β y p38γ, así como la diana corriente abajo HSP27. ERK1/2 se desfosforilaba. Los lisados de células de carcinoma renal (A498) se expusieron a HAMLET (35 µM) durante 30 minutos. Las membranas con anticuerpos fosfoespecíficos se sondearon con lisados proteicos de células de carcinoma tratadas con HAMLET o con PBS (control). Se cuantificó la fosforilación de las proteínas usando ImageJ. Los datos son la media ±DT. B) Las células de carcinoma pulmonar regulan negativamente ERK1/2 y activan p38 en respuesta a HAMLET. C) La inhibición de p38 por SB202190 anula la fosforilación de p38 y HSP27. Las células de carcinoma pulmonar se pre-incubaron con SB202190 (20 µM, 30 minutos) y se trataron con HAMLET (35 µM, 30 minutos). D) Células diferenciadas sanas no activan p38 en respuesta a HAMLET. Se trataron células renales pediátricas en cultivo primario con HAMLET (49 µM, 30 minutos).
15
25
35
45
55
65
Figura 12. BIRB796 rescata células tumorales de muerte celular inducida por HAMLET. (A, B) La inhibición de p38 (BIRB796, 10 µM) rescataba células de carcinoma (A549 y A498) de muerte en respuesta a HAMLET (7-35 µM, 3 h). Se cuantificó la viabilidad por niveles de ATP. (B) BIRB796 (10 µM) disminuye los cambios morfológicos asociados con muerte celular inducida por HAMLET (35 µM, 3 h). Figura 13. Respuesta transcripcional global en células diferenciadas sanas y tumorales. A) Mapa térmico de respuesta transcripcional global en células de carcinoma renal A498 tratadas con HAMLET y en células renales sanas. Las células de carcinoma mostraban una inducción más fuerte de la expresión génica que las células sanas. B, C) Agrupamiento jerárquico de todas las muestras de células renales sanas y de células de carcinoma renal A498. Las células renales sanas mostraban una normalización de la expresión 24 horas después de la exposición a HAMLET pareciéndose su perfil de expresión a células de control. Este no fue el caso para las células de carcinoma renal A498, donde varias rutas permanecían activadas. La Figura 14 es una serie de gráficos que muestran los resultados de un ensayo de muerte celular como se describe a continuación, donde Ct es el control, HL es HAMLET, OA ácido oleico y Na-OA representa oleato sódico. La Figura 15 es una serie de gráficos de un ensayo de muerte celular similar al asociado con la Figura 14 pero con el fin de determinar una respuesta a dosis. La Figura 16 muestra los resultados de la producción de HAMLET usando columnas condicionadas con ácido oleico (A) u oleato sódico (B). La Figura 17 muestra los resultados de espectros CD de UV lejano y próximo recogidos sobre HAMLET y NaOA-HAMLET. La Figura 18 muestra los resultados de los estudios sobre el impacto de sustancias que incluyen complejos de acuerdo con la invención sobre canales de iones de potasio. La Figura 19 muestra los resultados de los estudios sobre el impacto de sustancias que incluyen complejos de acuerdo con la invención sobre canales de iones de sodio. La Figura 20 muestra la estructura de alfalactalbúmina con los dominios individuales resaltados. La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo de muerte celular realizado usando diversas sustancias que incluyen complejos de la invención y componentes de los mismos.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Producción de HAMLET
HAMLET se produjo como se ha descrito previamente (Svensson et al., (2000). Proc Natl Acad Sci U S A 97, 42214226). Se purificó α-lactalbúmina nativa de leche humana por cromatografía de interacción hidrófoba. La proteína se desplegó con EDTA, se sometió cromatografía de intercambio iónico en una matriz pre-acondicionada con ácido oleico y se eluyó con alta concentración salina. HAMLET se liofilizó después de la purificación.
Células
Se cultivaron células (ATCC) de linfoma de células T (Jurkat), células de carcinoma pulmonar (A549), de ovario (HeLa) y renal (A498) en RPMI-1640 con aminoácidos no esenciales (1:100), piruvato sódico 1 µM, 50 µg/ml de gentamicina (Gibco), y suero fetal de ternera (FCS) al 5 % (A549 y A498) o al 10 % (HeLa y Jurkat), respectivamente. Las células epiteliales renales humanas (HRTEC) las proporcionó amablemente la Dr. Diana Karpman (Lund University, Lund, Suecia) y se cultivaron en DMEM/F12 con FCS al 15 % (Karpman et al., 1998). Seobtuvo la aprobación IRB del Comité Ético Médico de la Lund University Medical Faculty, Lund, Suecia (número de decisión LU 456-96). Las células RPTEC primarias (células epiteliales del túbulo proximal renal humano) se adquirieron de Lonza y se cultivaron en DMEM-F12 suplementado con NEAA, piruvato sódico, gentamicina, glutamax y FBS al 15 % (Gibco).
Flujos de iones
Se realizó el ensayo del canal de potasio (K+) FluxOR™ en el TECAN infinite F200 (Tecan Group, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). En resumen, este implicaba el tampón de carga FluxOR™ (solución salina equilibrada de Hank (HBSS), tamponada con HEPES 20 µM pH ajustado a 7,4 con NaOH). Se usó concentrado Powerload™ y Probenecid soluble en agua respectivamente para potenciar la solubilidad y la retención del colorante, respectivamente. Se retiró el medio de las placas celulares manualmente, y se aplicaron 80 µl de tampón de carga que contenía la mezcla de colorante FluxORTM a cada pocillo. Una vez dentro de la célula, la forma de éster AM no fluorescente del colorante FluxORTM se escinde por esterasas endógenas en un indicador sensible a talio. El colorante se cagó durante 60 minutos a temperatura ambiente y después se retiró con el sobrenadante. Después de lavar con tampón PBS sin colorante, se añadió un volumen final de 80 µl de tampón de ensayo que contenía probenecib soluble en agua. Las células recibieron uno de los siguientes inhibidores de canales: 3,3 µl por pocillo de amilorida 30 µM, 3,0 µl de BaCl2 32 µM, 1,8 µl de gadolinio 5,4 µM, 3 µl de tetrandrina 3,2 µM y 2,3 µl de rojo de rutenio 2,6 µM, y se después se incubaron a temperatura ambiente (23-25 ºC) durante 30 minutos para permitir el equilibrado de los compuestos de ensayo. Antes de la inyección, se preparó tampón de estimulación a
15
25
35
45
55
65
partir del tampón sin cloruro y reactivos de talio proporcionados en el kit, así como HAMLET, para conseguir concentraciones añadidas finales de T1+ 2 mM y HAMLET 35 µM después de dilución 1:5 tras inyección del tampón de estímulo en las células que se habían cargado con colorante FluxORTM
Ensayo de muerte celular
Las células se desprendieron de los matraces de cultivo celular con versen (0,2 g de EDTA en 200 ml de H2O y 800 ml de PBS), se lavaron con PBS y se resuspendieron en RPMI-1640 sin suero. Se incubó HAMLET disuelto en PBS con las células (0,5 x 106/ml para A549, A498 y células HeLa; 1 * 106/ml para Jurcat) a 37 ºC. Se añadió FCS después de 1 hora. La muerte celular se cuantificó por exclusión de azul de tripano (Chroma Gesellschaft Schmid & Co) o midiendo los niveles de ATP (kit ATPlite, PerkinElmer, Infinite 200, Tecan). Se capturaron imágenes ópticas usando el microscopio holográfico digital HoloMonitor™ M2 (Phase Holographic Imaging AB, Lund, Suecia).
Inhibidores e iARN
Para estudios con inhibidores, se pre-trataron las células durante 30 minutos. Los inhibidores usados fueron cloruro de gadolinio (GdClg, 100 µM), cloruro de bario (BaCl2, 1 µM), rojo de rutenio (30 µM), tetrandrina (10 µM) y amilorida (1µM), todos de Sigma Aldrich. Para la inhibición de p38, se usó SB202190 (20 µM, Sigma Aldrich) o BIRB796 (10 µM, Axon Medchem) disuelto en DMSO. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se añadió medio nuevo con inhibidor. Para interferencia de ARN, se usó pre-mezclas de ARNip FlexiTube contra MAPK11 (SI00606053), MAPK14 (SI00300769) y ARNip de control negativo All Star (SI03650318) de Qiagen. Se transfectó A549 directo usando concentración de ARNip final 25 nM en placa de 24 pocillos. Después de 48 horas, se examinó la reducción por transferencia de Western (anti-p38, 1:1000, Cell Signalling) y por RT-PCR (MAPK14, QT00079345, QIAGEN).
RT-PCR y corte y empalme de XBP1
Se preparó ARN con el kit RNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania) y se trató con DNasa I (QIAGEN). Se sintetizó el ADNc usando el sistema de RT-PCR de primera hebra Superscript III (Invitrogen). La PCR de XBP1 con corte y empalme y sin corte y empalme fue como se describe (Yoshida et al., 2001). Se realizó PCR a tiempo real en un instrumento Rotorgene 2000 (Corbett Life Science, Sídney, Australia) usando ensayos de expresión génica TaqMan (Applied BioSystems) de CHOP/DDIT3 (Hs01090850), de IL6 (Hs00985639), de IL8 (Hs00174103) y de TNFα (Hs00174128). Se usó GAPDH (Hs99999905_ml) para la normalización.
Imágenes de células vivas
Para las imágenes de células vivas, las células se pre-trataron con SB202190 durante 30 minutos, se tiñeron los núcleos con Hoechst 33342 (Invitrogen) y se añadió HAMLET marcado con Alexa-Fluor 568 (HAMLET marcado al 10 %, Molecular Probes) en medio libre de suero. Se añadió FCS después de 1 hora. Se detectó la fluorescencia con ajustes del estenopeico correspondientes a 1 unidad de Airy. Las células se mantuvieron a 37 ºC, CO2 al 5 % y se examinaron sin fijar por microscopia confocal LSM510 DUO (Carl Zeiss).
Transferencia de Western y cuantificación de citoquinas
Se separaron volúmenes iguales de lisados por SDS-PAGE en geles de Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF. Para otras transferencias de Western, se permitió que 200.000 células se adhirieran durante una noche en una placa de 6 pocillos. Después del tratamiento con HAMLET, las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis M-PER (Pierce) que contenía coctel inhibidor de proteasa completo y coctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP (ambos de Roche). Las células desprendidas se recogieron por centrifugación. Los lisados se aclararon por centrifugación y se midieron las concentraciones de proteínas usando el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se separaron cantidades iguales de proteína por SDS-PAGE en geles de Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare). Las membranas se saturaron con BSA (GAPDH) o leche en polvo desnatada (fosfo-p38, p38, fosfo-ERK1/2, ERK1/2) y se incubaron con anticuerpos anti-p38, anti-fosfo-p38, anti-ERK1/2, anti-fosfo-(Thr202/Tyr204)-p44/42 (todos 1:500-1000, Cell Signaling Technology), anti-ATF6 (1:1000, IMG-273, Imgenex), anti-fosfo-eIF2α (Ser51), (1:500, Cell Signaling Technology) o anti-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) seguido por anticuerpos conjugados a peroxidasa de rábano rusticano anti-conejo (1:1000, Dako-Cytomation, Glostrup, Dinamarca) o antiratón (1:40000-50000, Novus Biologicals) para la tinción. Los anticuerpos unidos se detectaron con el reactivo de transferencia de Western (GE Healthcare, Little Chalfont, R.U.) y el equipo GelDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Si fuera necesario, las membranas se separaron con tampón de separación de transferencia de Western Restore (Pierce, Rockford, IL), se bloquearon y se volvieron a sondear con nuevos anticuerpos. Se analizó la fosforilación de MAP quinasa en una serie de Phospho-MAPK humana (Proteome Profiler Array, R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Se cuantificaron las intensidades de banda y manchas usando ImageJ (Abramoff et al., 2004). La cuantificación de citoquinas (IL6, IL8, TNFα) se realizó en un sistema de inmunoensayo IMMULITE 1000 (Siemens Diagnostics).
imagen8
imagen9
imagen10
imagen11
Gen_símbolo NEK2
NKX3-1
NFKBIZ NR4A1 NUBPL OBFC2A PER1 PMAIP1 PHLDA11 PARP1 PABPC1L PABPN1 POLR2B PRDM1 PCYOX1
PREPL
PTGS2 PSMD12 PPP1CB PPP1R15A PRPF3 RHOB RGS2 RTN4IP1 RND3 RNGTT SKP2 SAMHD1 SGK1 SNHG12 SNORA12
SLC25A24
SLC9A2 SFRS2 SFRS5 SPRY2 SBNO1
SUMF1
TAF1D THBS1 TRA2A TM9SF2 TMEM168 TMEM30A TRIB1 WRB TSC22D3
TUFT1
TNFRSF10D TNFAIP3 TP53INP1 USP9X UXS1 UNC119B MAFF MYC ZC3HAV1 ZNF280D ZFP36L1 ZFYVE27 Gen_nombre quinasa 2 relacionada con NIMA (gen a nunca en mitosis) factor nuclear de homeobox 1 NK3 del potenciador génico de polipéptido ligero kappa en inhibidor de células B, zeta subfamilia 4 de receptores nucleares, grupo A, miembro 1 tipo proteína de unión a nucleótidos plegamiento de unión a oligonucleótido/oligosacárido que contiene 2A homólogo 1 de period (Drosophila) proteína 1 inducida por forbol-12-miristato-13-acetato dominio tipo homólogo de pleckstrina, familia A, miembro 1 poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 proteína de unión a poli(A), tipo 1 citoplasmática proteína de unión a poli(A), nuclear 1 polipéptido B de polimerasa (ARN) II (dirigido por ADN), 140 kDa dominio PR que contiene 1, con dominio ZNF prenilcisteína oxidasa 1 prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 de tipo prolil endopeptidasa (prostaglandina G/H sintasa y ciclooxigenasa) proteasoma (prosoma, macropaína) subunidad 26S, no ATPasa, 12 proteína fosfatasa 1, subunidad catalítica, isoforma beta proteína fosfatasa 1, subunidad 15A reguladora (inhibidor) homólogo 3 de factor de procesamiento de pre-ARNm PRP3 (S. cerevisiae) familia del gen homólogo de ras, miembro B regulador de señalización 2 de proteína G, 24 kDa proteína 1 de interacción con reticulon 4 GTPasa 3 de familia Rho ARN guanililtransferasa y 5’-fosfatasa proteína 2 asociada a quinasa de fase S (p45) dominio SAM y dominio 1HD quinasa 1 regulada con suero/glucocorticoides gen 12 hospedador de ARN nucleolar pequeño (no codifica proteína) ARN nucleolar pequeño, caja 12 H/ACA familia 25 de transportador de solutos (transportador mitocondrial; transportador de fosfato), miembro 24 familia 9 de transportador de solutos (intercambiador de sodio/hidrógeno), miembro 2 factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 2 factor de corte y empalme, rico en arginina/serina 5 homólogo 2 de sprouty (Drosophila) homólogo 1 de strawberry Notch (Drosophila) factor asociado a proteína de unión a caja TATA (TBP) factor 1 modificador de sulfatasa, ARN polimerasa I, D, 41 kDa trombospondina 1 homólogo alfa de transformador 2 (Drosophila) miembro 2 de la superfamilia de transmembrana 9 proteína transmembrana 168 proteína transmembrana 30A homólogo 1 de tribbles (Drosophila) proteína básica rica en triptófano familia de dominio TSC22, miembro 3 superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral tuftelina 1, miembro 10d, señuelo con truncamiento dominio de muerte proteína 3 inducida por factor de necrosis tumoral alfa proteína 1 nuclear inducida por proteína p53 tumoral peptidasa 9 específica de ubiquitina, ligada a X UDP-glucuronato descarboxilasa 1 homólogo B de unc-119 (C. elegans) homólogo F de oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf (aviar) homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis v-myc (aviar) dedos de zinc tipo CCCH, antivírico 1 proteína de dedos de zinc 280D proteína de dedos de zinc 36, tipo 1 C3H dedos de zinc, dominio FYVE que contiene 27
imagen12
imagen13
15
25
35
45
55
65
En células diferenciadas sanas, HAMLET activa la inmunidad innata sin una respuesta de p38
Para examinar la base molecular de la diferencia en la susceptibilidad a HAMLET entre células de carcinoma y células diferenciadas sanas, se compararon los perfiles transcripcionales. Las células sanas respondían menos fuertemente a HAMLET que las células de carcinoma renal (2064 genes en riñón pediátrico en comparación con 4424 en células de carcinoma renal, Figura 6A) y mostraron una respuesta transitoria, en lugar de sostenida (Figura 6B). Extraordinariamente, la ruta de señalización de p38 mostró evidencias de regulación negativa en puntos temporales prematuros con expresión disminuida de MKK3, p38 y HSP27 después de 60 y 75 minutos de exposición a HAMLET (Figura 6E). Se descubrió que las rutas reguladas significativamente por HAMLET en células sanas estaban implicadas en la regulación de la inmunidad innata (ruta de IL-6, Figura 6C) y la señalización de glucocorticoides. Aquellos genes prominentes regulados positivamente identificados incluían IL-1, IL-6, c-Jun, c-Fos, IκB y TNFα, y se confirmó un claro aumento en los niveles de proteínas secretadas para IL-6, IL-8 y TNFα (Figura 6D). Estas citoquinas no se secretaban por las células de carcinoma. Además, otras rutas de señalización relacionadas con muerte identificadas como expresadas de forma diferencial en células de carcinoma tales como el receptor de muerte, p53 y estrés del RE, no mostraron regulación significativa en células diferenciadas sanas. Por tanto, las células diferenciadas sanas expuestas a HAMLET mostraban una respuesta inmunitaria innata independiente de p38 restringida.
La fosforilación de p38 y de eIF2α inducida por HAMLET y las respuestas inmunitarias innatas se previenen por inhibidores de canales de iones
Para examinar si los canales de iones también controlaban la fosforilación en respuesta a HAMLET, se pre-trataron células tumorales con inhibidores de canales de iones y se cuantificó la fosforilación de p38, eIF2α y ERK1/2 usando anticuerpos fosfoespecíficos. Los bloqueantes de canales de iones redujeron la fosforilación de p38 o de eIF2α en células de carcinoma (Figura 7A y B) y en paralelo, se revirtió la reducción en la fosforilación de ERK1/2 (Figura 7B). Por tanto, los bloqueantes de canales de iones eran capaces no solamente de bloquear los cambios transcripcionales en respuesta a HAMLET, sino también de anular la fosfoseñalización dentro de estas rutas.
Para examinar adicionalmente si la respuesta inmunitaria innata en células diferenciadas sanas requiere canales de iones funcionales, se cuantificó la expresión de ARNm de IL-6, IL-8 y TNFα en células pre-tratadas con amilorida y BaCl2, usando qRT-PCR. HAMLET (21 µM, 1 hora) causó un aumento de 30 veces en el ARNm de IL-6 que se anuló por amilorida (Figura 7D). Se observaron resultados similares para IL-6 y TNFα. BaCl2 no inhibió la respuesta de IL-6 y de IL-8 a HAMLET, pero causó una reducción en la expresión de TNFα inducida por HAMLET.
Estos resultados confirman que los flujos de iones y la activación de los canales de iones es una etapa esencial para activar las diferentes respuestas celulares a HAMLET tanto en células de carcinoma como en células diferenciadas sanas. De forma interesante, la ruta de Ras/MAPK, que es crucial para su supervivencia celular, se mantenía cuando las células con HAMLET se pre-trataban con inhibidores.
Ejemplo 2
Comparación de las respuestas celulares provocadas por HAMLET/oleato y ácido oleico
Métodos
Preparaciones de soluciones madre:
Ácido oleico:
Se "diluyeron" 5 µl de ácido oleico en 1 ml de RPMI para dar una "solución turbia" 16 mM. Oleato: se disolvieron 5 mg de oleato sódico en 1 ml de RPMI para dar una solución transparente 16 mM. HAMLET, preparado se describe, por ejemplo, en el documento WO9926979: se diluyó 1 mg en 100 ul de PBS. 0,001/15200= 6,6 x 10-8 mol
Se añadió a cada uno de los pocillos:
HAMLET: 50 ul = 3,3 x 10-8 mol ALA, 16,5 x 10-8 mol OA
Oleato/OA: 10 ul = 1 x 10-5 l x 16 x 10-3 = 1,6 x 10-7 = 16 mol OA
(10 ul de las soluciones madre de oleato y ácido oleico es equivalente molar a los moles de OA/Na-oleato presente en 0,5 mg de HAMLET).
Ensayo de muerte celular
Se sembraron células A549 hasta una densidad de 0,8 -1,0 x 106 células/pocillo en RPMI sin FCS. Se añadieron diferentes volúmenes de soluciones de HAMLET/oleato y ácido oleico. Las células se incubaron durante 1 hora a 37
imagen14
imagen15
imagen16

Claims (1)

  1. imagen1
ES11804746.3T 2010-11-24 2011-11-24 Complejo biológicamente activo y su preparación Active ES2613986T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1019936.2A GB201019936D0 (en) 2010-11-24 2010-11-24 Therapeutic method
GBGB1019937.0A GB201019937D0 (en) 2010-11-24 2010-11-24 Biologically active complex and its preparation
GB201019937 2010-11-24
GB201019936 2010-11-24
PCT/GB2011/052310 WO2012069836A2 (en) 2010-11-24 2011-11-24 Biologically active complex and its preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2613986T3 true ES2613986T3 (es) 2017-05-29

Family

ID=45444635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11804746.3T Active ES2613986T3 (es) 2010-11-24 2011-11-24 Complejo biológicamente activo y su preparación

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9085643B2 (es)
EP (1) EP2643010B1 (es)
DK (1) DK2643010T3 (es)
ES (1) ES2613986T3 (es)
HU (1) HUE031912T2 (es)
PL (1) PL2643010T3 (es)
WO (1) WO2012069836A2 (es)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8796218B2 (en) 2009-01-09 2014-08-05 Hamlet Pharma Ab Complex and production process
ES2613986T3 (es) 2010-11-24 2017-05-29 Hamlet Pharma Ab Complejo biológicamente activo y su preparación
CA2842377C (en) * 2011-07-19 2019-08-27 Ovizio Imaging Systems N.V. A method and system for detecting and/or classifying cancerous cells in a cell sample
HUE038910T2 (hu) 2012-08-09 2018-12-28 Hamlet Pharma Ab Profilaktikus és gyógytáp terápia
GB2536650A (en) 2015-03-24 2016-09-28 Augmedics Ltd Method and system for combining video-based and optic-based augmented reality in a near eye display
CA2997674A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Theoria Science Inc. Exosome secretion inhibitor
GB201621752D0 (en) * 2016-12-20 2017-02-01 Hamlet Pharma Ab Therapeutically active complexes
JP6917165B2 (ja) * 2017-03-07 2021-08-11 雪印メグミルク株式会社 小胞体ストレス軽減用組成物及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料
JP6917163B2 (ja) * 2017-03-07 2021-08-11 雪印メグミルク株式会社 小胞体ストレス軽減用組成物及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料
JP6917164B2 (ja) * 2017-03-07 2021-08-11 雪印メグミルク株式会社 小胞体ストレス軽減用組成物及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料
GB201707715D0 (en) * 2017-05-14 2017-06-28 Hamlet Pharma Ab Preperation of biologically active complexes
US12521201B2 (en) 2017-12-07 2026-01-13 Augmedics Ltd. Spinous process clamp
US12458411B2 (en) 2017-12-07 2025-11-04 Augmedics Ltd. Spinous process clamp
US11980507B2 (en) 2018-05-02 2024-05-14 Augmedics Ltd. Registration of a fiducial marker for an augmented reality system
WO2019243547A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Hamlet Pharma Ab Therapeutically active complexes
US11766296B2 (en) 2018-11-26 2023-09-26 Augmedics Ltd. Tracking system for image-guided surgery
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US12178666B2 (en) 2019-07-29 2024-12-31 Augmedics Ltd. Fiducial marker
US11980506B2 (en) 2019-07-29 2024-05-14 Augmedics Ltd. Fiducial marker
WO2021032807A1 (en) 2019-08-20 2021-02-25 Hamlet Pharma Ab Combination of a chemotherapeutic agent and alpha-lactoglubulin-oleic acid complex for cancer therapy
US11382712B2 (en) 2019-12-22 2022-07-12 Augmedics Ltd. Mirroring in image guided surgery
US11389252B2 (en) 2020-06-15 2022-07-19 Augmedics Ltd. Rotating marker for image guided surgery
US12239385B2 (en) 2020-09-09 2025-03-04 Augmedics Ltd. Universal tool adapter
US12502163B2 (en) 2020-09-09 2025-12-23 Augmedics Ltd. Universal tool adapter for image-guided surgery
GB202015836D0 (en) 2020-10-06 2020-11-18 Hamlet Pharma Ab Compositions
US11896445B2 (en) 2021-07-07 2024-02-13 Augmedics Ltd. Iliac pin and adapter
US12150821B2 (en) 2021-07-29 2024-11-26 Augmedics Ltd. Rotating marker and adapter for image-guided surgery
EP4387552A4 (en) 2021-08-18 2025-04-30 Augmedics Ltd. AUGMENTED REALITY SURGICAL SYSTEM USING DEPTH SENSING
EP4511809A4 (en) 2022-04-21 2026-03-11 Augmedics Ltd Systems and methods for medical image visualization
EP4587881A1 (en) 2022-09-13 2025-07-23 Augmedics Ltd. Augmented reality eyewear for image-guided medical intervention
GB202303177D0 (en) * 2023-03-03 2023-04-19 Linnane Pharma Ab Method of predicting response to treatment

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1032596T3 (da) 1997-11-21 2007-09-10 Nya Hamlet Pharma Ab Fremgangsmåde til fremstilling af lactalbumin
GB9725126D0 (en) 1997-11-27 1998-01-28 Svanborg Catharina Therapeutic agents
AU5928599A (en) 1999-09-09 2001-04-10 Efa Sciences Llc. Methods for treating cell proliferative disorders including cancer
US6639089B2 (en) 2000-11-08 2003-10-28 Soda Aromatic Co., Ltd. Anticancer agents, perfumes or foods and drinks
GB0205347D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Svanborg Catharina Biologically active complex
KR100716119B1 (ko) * 2005-10-24 2007-05-10 (주)케어젠 모발 성장을 촉진하는 펩티드 및 이를 이용한 화장품
EP2094309A2 (en) * 2006-11-17 2009-09-02 Nya Hamlet Pharma AB Alpha-lactalbumin composition
WO2008138348A1 (en) 2007-05-09 2008-11-20 Nya Hamlet Pharma Ab Preparation of complexed lactalbumin
US8796218B2 (en) 2009-01-09 2014-08-05 Hamlet Pharma Ab Complex and production process
WO2010131237A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 Agriculture And Food Development Authority (Teagasc) A process for producing a biologically active globular protein complex
ES2613986T3 (es) 2010-11-24 2017-05-29 Hamlet Pharma Ab Complejo biológicamente activo y su preparación

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012069836A3 (en) 2012-08-09
HUE031912T2 (en) 2017-08-28
EP2643010A2 (en) 2013-10-02
US20140051636A1 (en) 2014-02-20
PL2643010T3 (pl) 2017-05-31
US20150344526A1 (en) 2015-12-03
US9085643B2 (en) 2015-07-21
DK2643010T3 (en) 2017-02-27
WO2012069836A2 (en) 2012-05-31
US9487561B2 (en) 2016-11-08
EP2643010B1 (en) 2016-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2613986T3 (es) Complejo biológicamente activo y su preparación
Hu et al. Blockade of the forward Na+/Ca2+ exchanger suppresses the growth of glioblastoma cells through Ca2+‐mediated cell death
ES2632345T3 (es) Inhibición de la señalización AXL en terapia antimetastásica
Redpath et al. Ferlins show tissue‐specific expression and segregate as plasma membrane/late endosomal or Trans‐Golgi/recycling ferlins
McIlwain et al. APE1/Ref-1 redox-specific inhibition decreases survivin protein levels and induces cell cycle arrest in prostate cancer cells
Fahmy et al. Myoferlin plays a key role in VEGFA secretion and impacts tumor‐associated angiogenesis in human pancreas cancer
ES2437337T3 (es) Composiciones para diagnosis y terapia de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de futrinas (R-Espondinas)
WO2012047354A4 (en) Environmentally sensitive compositions
Smith et al. A Peptide mimicking a region in proliferating cell nuclear antigen specific to key protein interactions is cytotoxic to breast cancer
KR102009560B1 (ko) 저산소환경에 의해 활성화되고 미토콘드리아에 대한 특이적 표적화가 가능한 항암 치료진단제
Amiri et al. Inhibition of carbonic anhydrase IX in glioblastoma multiforme
BRPI0908853B1 (pt) Composto oligopeptídico, usos do referido composto oligopeptídico, composição farmacêutica, kit e lipossoma
Tanimoto et al. The perlecan-interacting growth factor progranulin regulates ubiquitination, sorting, and lysosomal degradation of sortilin
Truong et al. Salmonella exploits host Rho GTPase signalling pathways through the phosphatase activity of SopB
Shi et al. QKI‐6 inhibits bladder cancer malignant behaviours through down‐regulating E2F3 and NF‐κB signalling
CN104311426A (zh) 芳香硝基乙烯化合物的新用途
Xiong et al. Cathepsin L is involved in X-ray-induced invasion and migration of human glioma U251 cells
JP2012530725A (ja) ソリシジン由来ペプチドならびにｔｒｐｖ−６がんの検出および薬剤送達のための方法
ES2821599A1 (es) Compuestos y metodos para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer
Jagan et al. PTEN phosphatase-independent maintenance of glandular morphology in a predictive colorectal cancer model system
Kim et al. mDia1 regulates breast cancer invasion by controlling membrane type 1-matrix metalloproteinase localization
Xia et al. Imaging and inhibiting cyclooxygenase-2 using aspirin-based fluorescent reporter for the treatment of breast cancer
Sun et al. Deapioplatycodin D inhibits glioblastoma cell proliferation by inducing BNIP3L-mediated incomplete mitophagy
Ikeda et al. Hyperosmotic stress up-regulates the expression of major vault protein in SW620 human colon cancer cells
HRP20010013A2 (en) Novel poly (adp-ribose)polymerase gene