ES2614936T3 - Membrana de material compuesto para un sensor enzimático - Google Patents

Abstract

Una membrana de material compuesto para un sensor enzimático, que comprende: una capa de membrana interna que comprende una membrana polimerizable regenerable, estando la capa de membrana interna adaptada para funcionar como membrana de rechazo de interferencias; una capa de membrana externa basada en poliuretano, adaptada para su disposición adyacente a un canal de flujo durante su uso; y una capa enzimática dispuesta entre, y en contacto con, las capas interna y externa de la membrana, comprendiendo dicha capa enzimática una matriz que comprende al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en creatinasa y sarcosina oxidasa, un agente de reticulación y un estabilizante enzimático seleccionado del grupo que consiste en polietilenimina, polipropilenimina, poli(N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina y protamina, en la que la membrana externa está adaptada para controlar la difusión de un analito en la capa enzimática.

Description

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Membrana de material compuesto para un sensor enzimatico

DESCRIPCION

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de los sensores electroqulmicos, particularmente sensores de electrodo enzimatico, y a la regeneracion o mantenimiento de las propiedades funcionales de las membranas de dichos sensores.

Antecedentes de la invencion

En diversas situaciones cllnicas es importante medir ciertas caracterlsticas qulmicas de la sangre del paciente, tales como el pH, el hematocrito, la concentracion ionica de calcio, potasio, cloruro, sodio, glucosa, lactato, creatinina, creatina, urea, la presion parcial de O2 y CO2, y similares. Estas situaciones oscilan desde una visita rutinaria de un paciente a una consulta medica hasta el seguimiento de un paciente durante cirugla a corazon abierto. La velocidad, exactitud y otras caracterlsticas de realizacion requeridas varlan con cada situacion.

Tlpicamente, los sistemas sensores electroqulmicos que proporcionan analisis qulmicos de sangre son maquinas independientes o estan adaptados para su conexion a una derivacion extracorporea o a una fuente de sangre ex vivo, tal como una maquina para el corazon/pulmones usada para mantener a un paciente durante la cirugla. Asl, por ejemplo, pequenas muestras de ensayo de sangre ex vivo se pueden desviar fuera de llnea desde la via de flujo venoso o arterial de una maquina para el corazon/los pulmones directamente a una camara expuesta a un banco de microelectrodos que genera senales electricas proporcionales a las caracterlsticas qulmicas de la muestra de sangre que fluye en tiempo real.

Los sistemas de sensores electroqulmicos son herramientas anallticas que combinan un componente de reconocimiento qulmico o bioqulmico (por ejemplo, una enzima) como un transductor flsico, tal como un electrodo de platino. El componente de reconocimiento qulmico o bioqulmico es capaz de interaccionar de manera selectiva con un analito de interes y de generar, directa o indirectamente, una senal electrica a traves del transductor. Los sistemas sensores electroqulmicos desempenan una funcion creciente en la resolucion de problemas anallticos y cllnicos y encuentran aplicaciones en el campo de los diagnosticos medicos.

La selectividad de ciertos componentes de reconocimiento bioqulmicos hace posible desarrollar sensores electroqulmicos que puedan detectar con exactitud ciertos analitos biologicos, incluso en una mezcla de analitos compleja, tal como sangre entera. A pesar del alto grado de selectividad de ciertos componentes de reconocimiento bioqulmico, la selectividad de tales sensores en conjunto puede, sin embargo, estar comprometida por la presencia de ciertos interferentes biologicos (por ejemplo, acido ascorbico, acido urico, paracetamol, cistelna, etc.) que pueden interaccionar directamente con el transductor flsico si no se evita que lo hagan. La exactitud y la precision de los sistemas sensores electroqulmicos con compuestos de reconocimiento bioqulmicos tambien estan comprometidas por los niveles residuales de analito que permanecen en el sensor de una muestra previa, que afectan al analisis de la muestra posterior.

Sumario de la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un sistema y metodo para aumentar la exactitud y la duracion durante toda la vida eficaz de un sensor electroqulmico. La polimerizacion de monomeros electropolimerizables en una membrana polimerica interna sobre el sensor electroqulmico forma una membrana de rechazo de interferencias. Esta membrana polimerica interna actua protegiendo el sensor electroqulmico del ensuciamiento o interferencia por compuestos en la muestra y, de este modo, aumenta la exactitud que se pierde por la degradacion por ensuciamiento de la membrana o por interferencia por compuestos analitos de la muestra.

En un aspecto de la presente invencion, un sensor electroqulmico incluye al menos un electrodo y una membrana de material compuesto. La membrana de material compuesto incluye una capa externa, una capa enzimatica y una capa interna regenerable. La capa interna esta en contacto con al menos un electrodo e incluye una membrana polimerizable.

La capa externa de la membrana de material compuesto es una capa de membrana basada en poliuretano.

La capa enzimatica incluye enzimas como se define en la reivindicacion 1. En una realizacion, el sensor electroqulmico incluye ademas una superficie regenerada sobre la capa interna en la que la superficie es regenerada por el monomero polimerizado. La capa interna del sensor electroqulmico puede incluir un compuesto seleccionado del grupo que consiste en benzotiofeno, fenilendiaminas y dihidroxibencenos.

En un aspecto, un cartucho de sensores electroqulmicos incluye una tarjeta sensora electroqulmica, al menos un sensor electroqulmico y un deposito que contiene una solucion de monomero electropolimerizable en comunicacion

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fluida con la tarjeta sensora electroqulmica.

En una realizacion, el cartucho de sensores electroqulmicos puede incluir una tarjeta sensora electroqulmica que incluye al menos una membrana de material compuesto. En otra realizacion, el cartucho de sensores electroqulmicos puede incluir una membrana de material compuesto con una capa interna regenerable.

En una realizacion, el cartucho de sensores electroqulmicos incluye al menos un deposito de solucion de calibracion en comunicacion fluida con la tarjeta sensora electroqulmica. En otra realizacion, la solucion de monomero electropolimerizable se puede combinar con la solucion de calibracion en un deposito unico. En otra realizacion de la presente invencion, el cartucho de sensores electroqulmicos incluye una solucion de monomero electropolimerizable en la solucion de calibracion, en la que la concentracion del monomero esta en el intervalo de aproximadamente 1100 mM.

En otra realizacion, al menos uno de los sensores electroqulmicos del cartucho de sensores electroqulmicos comprende un sensor de electrodo enzimatico. En otra realizacion, el sensor electroqulmico del cartucho de sensores electroqulmicos se forma sobre un electrodo compuesto por un material seleccionado del grupo que consiste en platino, oro, carbono o uno de su estructura modificada. En otra realizacion, el sensor electroqulmico incluye un monomero electropolimerizable seleccionado de un grupo que consiste en benzotiofeno, fenilendiaminas y dihidroxibencenos. En otra realizacion, el sensor electroqulmico es selectivo para un ion hidrogeno, dioxido de carbono, oxlgeno, ion sodio, ion potasio, calcio ionizado, cloruro, hematocrito, glucosa, lactato, creatina, creatinina o urea. En otra realizacion mas, el sensor electroqulmico incluye un monomero electropolimerizable que es un derivado de fenilendiamina.

En otro aspecto, un sistema de sensores electroqulmicos incluye una tarjeta sensora electroqulmica que incluye al menos un sensor electroqulmico, en el que el sensor electroqulmico incluye al menos una membrana polimerica. El sistema sensor electroqulmico tambien incluye un aparato sensor electroqulmico que esta en contacto electrico con la tarjeta sensora electroqulmica. El aparato sensor electroqulmico se configura para medir senales electricas procedentes de la tarjeta sensora electroqulmica y puede proporcionar un potencial electrico al sensor electroqulmico para la polimerizacion de la solucion de monomero electropolimerizable a la membrana polimerica. El sistema sensor electroqulmico tambien incluye un deposito que contiene una solucion de monomero electropolimerizable en comunicacion fluida con la tarjeta sensora electroqulmica. La solucion de monomero electropolimerizable se polimeriza a la membrana polimerica mediante el potencial electrico proporcionado por el aparato sensor electroqulmico.

En una realizacion, el cartucho de sensores electroqulmicos puede incluir una tarjeta sensora electroqulmica que incluye al menos una membrana de material compuesto. En otra realizacion, el cartucho de sensores electroqulmicos puede incluir una membrana de material compuesto con una capa interna regenerable.

En una realizacion, el sistema de sensores electroqulmicos incluye ademas una solucion de calibracion en un deposito junto con una solucion de monomero electropolimerizable. La concentracion de la solucion de monomero electropolimerizable esta en el intervalo de aproximadamente 1-100 mM. En otro ejemplo, el sistema de sensores electroqulmicos incluye al menos un sensor de electrodo enzimatico. En otra realizacion mas, el sistema de sensores electroqulmicos incluye un sensor electroqulmico que es selectivo para un compuesto seleccionado de un grupo que consiste en ion hidrogeno, dioxido de carbono, oxlgeno, ion sodio, ion potasio, calcio ionizado, cloruro, hematocrito, glucosa, lactato, creatina, creatinina o urea.

En otra realizacion mas, el sistema de sensores electroqulmicos incluye un monomero electropolimerizable que se selecciona de un grupo que consiste en benzotiofeno, fenilendiaminas y dihidroxibencenos, en los que la concentracion de la solucion de monomero electropolimerizable en la solucion de calibracion es 1-100 mM. En otra realizacion, el sistema sensor electroqulmico incluye un aparato sensor electroqulmico capaz de proporcionar un potencial electrico durante al menos la eliminacion parcial de agentes de interferencia en la membrana polimerica. En otra realizacion, el sistema de sensores electroqulmicos incluye ademas una membrana externa y una capa enzimatica, en el que la capa enzimatica esta en contacto con la membrana externa y la membrana polimerica.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a acelerar la recuperacion del sensor electroqulmico durante el proceso de aclarado despues de exposicion a una muestra, de manera que el tiempo de recuperacion del sistema de sensores electroqulmicos sea un perlodo de tiempo mas corto. La reduccion en el tiempo de recuperacion se realiza retirando agentes de interferencia de la capa de membrana polimerica. La concentracion residual de los sustratos para la reaccion enzimatica y los productos de la reaccion enzimatica despues de exposicion del sensor electroqulmico a una muestra son ejemplos de agentes de interferencia. Otro ejemplo de agentes de interferencia es la concentracion residual del monomero electropolimerizable en la membrana polimerica despues de exposicion del sensor electroqulmico a la solucion de monomero electropolimerizable.

La eliminacion de agentes de interferencia de una membrana polimerica se lleva a cabo proporcionando un sensor electroqulmico que incluye un electrodo y una membrana de material compuesto, incluyendo la membrana de material compuesto al menos una membrana polimerica, una fuente electrica en contacto electrico con dicho

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electrodo y aplicando un potencial electrico al electrodo suficiente para causar al menos una porcion de los agentes interferentes en la membrana polimerica en contacto con el electrodo que se tiene que eliminar. En una realizacion, el potencial electrico esta en un intervalo de aproximadamente 0, 1 a 0, 8 V frente al electrodo de referencia integrado y se aplica durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10 a 200 segundos. En otra realizacion, el potencial electrico es de aproximadamente 0, 4 V frente al electrodo de referencia integrado y se aplica durante aproximadamente 50 segundos.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere al metodo para recuperar las propiedades funcionales de un sensor electroqulmico. El metodo incluye proporcionar un sistema electroqulmico, que incluye una tarjeta sensora electroqulmica que incluye al menos un sensor electroqulmico. El sensor electroqulmico incluye un electrodo y una membrana de material compuesto, incluyendo la membrana de material compuesto al menos una membrana polimerica. El sistema sensor electroqulmico tambien incluye un aparato sensor electroqulmico en contacto electrico con la tarjeta sensora electroqulmica. El aparato sensor electroqulmico se configura para medir senales electricas desde la tarjeta sensora electroqulmica y proporcionar un potencial electrico al sensor electroqulmico. El sistema sensor electroqulmico tambien incluye un deposito que contiene un monomero electropolimerizable en una solucion en comunicacion fluida con la tarjeta sensora electroqulmica. La solucion de monomero electropolimerizable se polimeriza a la membrana polimerica mediante el potencial electrico proporcionado por el aparato sensor electroqulmico. El metodo de recuperacion de las propiedades funcionales de un sensor electroqulmico tambien incluye poner en contacto el sensor electroqulmico con la solucion y aplicar un potencial electrico de suficiente intensidad y suficiente duracion para causar que se polimerice al menos una porcion del monomero electropolimerizable en la solucion sobre la membrana polimerica.

En una realizacion, el metodo de recuperacion de las propiedades funcionales de un sensor electroqulmico incluye anadir el monomero electropolimerizable a una solucion de calibracion para formar la solucion de monomero electropolimerizable. En una realizacion, el potencial electrico comprende un intervalo de aproximadamente 0, 1 a 0, 8 V frente al electrodo de referencia integrado y se aplica durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 30 segundos a 1 hora. En otra realizacion, el potencial electrico comprende aproximadamente 0, 4 V frente a un electrodo de referencia integrado y se aplica durante aproximadamente 3 minutos.

En una realizacion, el metodo de recuperacion de las propiedades funcionales de un sensor electroqulmico incluye ademas la etapa de aplicar un potencial electrico adicional de suficiente intensidad y suficiente duracion al electrodo para causar la eliminacion de al menos una porcion de agentes de interferencia en la membrana polimerica. En una realizacion, el potencial electrico esta en un intervalo de aproximadamente 0, 1 a 0, 8 V frente al electrodo de referencia integrado y se aplica durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10 a 200 segundos.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere al metodo para recuperar las propiedades funcionales de un cartucho de sensores electroqulmicos. El metodo incluye las etapas de conectar un cartucho de sensores electroqulmicos que incluye un sensor electroqulmico a un aparato sensor electroqulmico. El sensor electroqulmico incluye un electrodo y una membrana de material compuesto, que incluye al menos una membrana polimerica. El metodo incluye ademas poner en contacto el sensor electroqulmico con solucion de monomero electropolimerizable del cartucho y aplicar un potencial electrico de suficiente intensidad y suficiente duracion para causar que al menos una porcion de la solucion de monomero electropolimerizable se polimerice sobre una membrana polimerica. En un ejemplo, el metodo incluye ademas anadir un monomero electropolimerizable a una solucion de calibracion para formar la solucion de monomero electropolimerizable. En una realizacion en particular, se aplica un potencial electrico en un intervalo de aproximadamente 0, 1 a 0, 8 V frente al electrodo de referencia integrado. El potencial electrico se puede aplicar durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 30 segundos a 1 hora. En una realizacion, el metodo tambien incluye aplicar un potencial electrico adicional de suficiente intensidad y suficiente duracion al electrodo para causar la eliminacion de al menos una porcion de agentes de interferencia en la membrana polimerica. En una realizacion, el potencial electrico esta en un intervalo de aproximadamente 0, 1 a 0, 8 V frente al electrodo de referencia integrado y se aplica durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10 a 200 segundos.

En otro aspecto, la invencion se refiere a una membrana de material compuesto para un biosensor, como se define en la reivindicacion 1.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a una matriz para un sensor enzimatico. La matriz incluye lactato oxidasa, un agente de reticulacion y un estabilizante enzimatico. En una realizacion, la matriz forma una matriz reticulada de protelnas que tienen actividad enzimatica. La matriz puede formar un electrodo electroqulmico. La matriz tambien puede incluir seroalbumina bovina. Tambien se pueden incluir otras protelnas inertes similares a la seroalbumina bovina. En otra realizacion, uno o mas del agente de reticulacion presentes en la matriz pueden incluir un dialdehldo, glutaraldehldo, por ejemplo, un diisocianato, 1, 4-diisocianatobutano, por ejemplo, y un diepoxido, 1,2,7,8- diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxidecano, como ejemplos. En otra realizacion, el agente de reticulacion presente en la matriz es 1-10 % de glutaraldehldo en peso. En otra realizacion mas, el agente de reticulacion presente en la matriz es 5 % de glutaraldehldo en peso. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en la matriz puede incluir uno o mas de los compuestos polietilenimina, polipropilenimina, poli(N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en

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la matriz es 1-20 % de polietilenimina en peso. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en la matriz es 5 % de polietilenimina en peso.

En otro aspecto mas, la divulgacion se refiere a una matriz para un sensor enzimatico que incluye creatinasa, sarcosina oxidasa, un agente de reticulacion y un estabilizante enzimatico. En una realizacion, la matriz tambien incluye creatininasa. En una realizacion, la matriz forma una matriz reticulada de protelnas que tienen actividad enzimatica. El sensor enzimatico puede formar un sensor electroqulmico. En otra realizacion, uno o mas del agente de reticulacion presentes en la matriz pueden incluir un dialdehldo, glutaraldehldo, por ejemplo, un diisocianato, 1, 4- diisocianatobutano, por ejemplo, y un diepoxido, 1,2,7,8-diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxidecano, como ejemplos. En otra realizacion, el agente de reticulacion presente en la matriz es 1-10 % de glutaraldehldo en peso. En otra realizacion mas, el agente de reticulacion presente en la matriz es 5 % de glutaraldehldo en peso. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en la matriz puede incluir uno o mas de los compuestos polietilenimina, polipropilenimina, poli(N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en la matriz es 1-20 % de polietilenimina en peso. En otra realizacion, el estabilizante enzimatico presente en la matriz es 5 % de polietilenimina en peso.

En otro aspecto mas, la divulgacion se refiere a una matriz para un sensor enzimatico que incluye una o mas de las enzimas, lactato oxidasa, creatinasa, sarcosina oxidasa y creatininasa, un agente de reticulacion y un estabilizante enzimatico.

Estos y otros objetos, junto con ventajas y caracterlsticas de la presente invencion divulgadas en el presente documento, llegaran a ser evidentes por referencia a la siguiente descripcion, los dibujos adjuntos y las reivindicaciones. Ademas, se tiene que entender que las caracterlsticas de las diversas realizaciones descritas en el presente documento no son mutuamente excluyentes y pueden existir en diversas combinaciones y permutaciones.

Breve descripcion del dibujo

Los objetos, caracterlsticas y ventajas anteriores y otros de la presente invencion divulgados en el presente documento, as! como la propia invencion, se entenderan mas completamente a partir de la siguiente descripcion de realizaciones preferidas y reivindicaciones cuando se leen junto con los dibujos acompanantes. Las figuras no son necesariamente a escala, generalmente poniendose en lugar de ello enfasis en la ilustracion de los principios de la invencion.

La figura 1 es un diagrama esquematico de los componentes de un aparato sensor electroqulmico que incluye un cartucho de sensores con un banco de sensores y un bloque termico para hidratacion acelerada y calibracion de los sensores.

La figura 2 ilustra una vista frontal inversa de la tarjeta sensora, particularmente fragmentaria, de una realizacion de un cartucho.

Las figuras 3A-B ilustran vistas transversales de un sensor enzimatico.

La figura 4 ilustra una realizacion de un sensor de pO2.

La figura 5 ilustra una vista frontal de la tarjeta de electrodo contenida en un ejemplo del cartucho.

La figura 6 ilustra vistas transversales de un sensor de iones.

Las figuras 7A-G ilustran los componentes de un conjunto de bloque termico.

Descripcion detallada de la invencion

La presente divulgacion proporciona electrodos y sistemas sensores electroqulmicos para medir caracterlsticas de muestras acuosas, incluyendo, pero sin limitaciones, sangre, suero u otros fluidos corporales. Especlficamente, la divulgacion se refiere a dichos sensores en los que los electrodos incluyen una membrana de rechazo de interferencias, que es la membrana polimerica interna de la membrana de material compuesto y se puede regenerar in situ. Los sistemas sensores electroqulmicos presentan una exactitud y precision aumentadas y expectativas de vida eficaces aumentadas. En realizaciones preferidas de la invencion, el sistema sensor se adapta para medir la concentracion o la actividad de los gases en sangre (por ejemplo, oxlgeno y dioxido de carbono) iones (por ejemplo, sodio, cloruro, potasio y calcio), glucosa, lactato, creatina, creatinina, pH de la sangre y hematocrito.

Definiciones

Para senalar y describir de un modo mas claro y conciso la materia objeto que el solicitante considera como la invencion, se proporcionan las siguientes definiciones para ciertos terminos usados en la siguiente descripcion y reivindicaciones.

Como se usa en el presente documento, el termino "electrodo" se refiere a un componente de un dispositivo electroqulmico que hace la interferencia entre el conductor electrico externo y el medio ionico interno. El medio ionico interno, tlpicamente, es una solucion acuosa con sales disueltas. El medio tambien puede comprender protelnas en una matriz estabilizante.

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Los electrodos son de tres tipos, electrodos de trabajo o indicadores, electrodos de referenda y contraelectrodos. Un electrodo de trabajo o indicador mide una especie quimica espedfica, tal como un ion. Cuando se miden los potenciales electricos mediante un electrodo de trabajo, el metodo se denomina potenciometna. Todos los electrodos selectivos de iones funcionan mediante potenciometna. Cuando se mide la corriente mediante un electrodo de trabajo, el metodo se denomina amperometria. La medicion de oxigeno se realiza por amperometria. Los electrodos de trabajo tambien pueden actuar incluyendo una enzima como parte de una capa enzimatica que es parte de una capa de material compuesto que esta en contacto intimo con el electrodo. La enzima, que es espedfica para un analito en particular, produce peroxido de hidrogeno, un subproducto de la reaccion catalitica de la enzima sobre el analito. Se detecta peroxido de hidrogeno mediante el electrodo y se convierte en una senal electrica. Un electrodo de referencia sirve como un punto de referencia electrico en un dispositivo electroquimico frente al que se miden y se controlan los potenciales electricos. En una realizacion, la plata -nitrato de plata forma los electrodos de referencia. Otros tipos de electrodos de referencia son mercurio-cloruro mercurioso-cloruro de potasio o plata-cloruro de plata-cloruro de potasio. Un contraelectrodo actua como un disipador para la ruta de la corriente.

Como se usa en el presente documento, el termino "sensor" es un dispositivo que responde a variaciones en la concentracion de una especie quimica determinada, tal como glucosa o lactato, en una muestra, tal como una muestra de fluido corporal. Un sensor electroquimico es un sensor que funciona basandose en un principio electroquimico y requiere al menos dos electrodos. Para mediciones selectivas de iones, los dos electrodos incluyen un electrodo selectivo de iones y un electrodo de referencia. Los electrodos enzimaticos amperometricos requieren adicionalmente un tercer electrodo, un contraelectrodo. Por otra parte, tambien son frecuentes los sensores enzimaticos basados en dos electrodos, un electrodo de trabajo y de referencia.

Como se usa en el presente documento, la expresion "electrodo selectivo de iones" se refiere, en general, a un hilo de plata recubierto con cloruro de plata en contacto con una solucion tampon que contiene una concentracion de cloruro (la solucion interna). La solucion tampon se cubre con una membrana selectiva de iones polimerica que esta en contacto con la solucion de ensayo. La membrana selectiva de iones polimerica consiste tipicamente en PVC de alto peso molecular, un plastificante, un ionoforo espedfico de un ion en particular y una sal de borato. La superficie de la membrana polimerica esta en contacto con la muestra de ensayo en un lado y la solucion tampon interna en el otro lado de la membrana.

Como se usa en el presente documento, la expresion "sensor electroquimico seco" se refiere al electrodo selectivo de iones, descrito anteriormente, y un electrodo de referencia, descrito anteriormente. En la realizacion "quimico seco", los electrodos selectivos de iones presentan la misma configuracion que se ha descrito anteriormente, sin embargo, la solucion interna que contiene cloruro, se seca, es decir, se deshidrata, de modo que deja una capa de sal seca. Para actuar como un sensor electroquimico, la sal seca se debe solubilizar en agua para obtener una solucion tampon.

Como se usa en el presente documento, la expresion "electrodo enzimatico" se refiere en general a una membrana de material compuesto depositada sobre un electrodo de metal, que comprende, por ejemplo, platino. La membrana de material compuesto tiene al menos tres capas distintas, incluyendo una membrana polimerica externa en el lado de la membrana de material compuesto en contacto con la muestra que forma una capa protectora, una capa enzimatica media que esta situada entre las capas externa e interna y una membrana polimerica interna lo mas proxima al electrodo de metal que forma la membrana de rechazo de interferencias, interna. La membrana polimerica externa, que esta compuesta por uno o mas compuestos polimericos, en general actua protegiendo y manteniendo la estructura de la capa enzimatica media y controlando la difusion del analito a la capa enzimatica media. La capa media o enzimatica comprende al menos una especie proteica con actividad enzimatica. La actividad enzimatica tambien se puede proporcionar mediante compuestos que incluyen ADN, ARN y carbohidrato, por ejemplo. La enzima se estabiliza en una matriz que conduce a la actividad de la enzima. La membrana interna o de rechazo de interferencias es una membrana polimerica que actua aislando el electrodo de hilo de los compuestos en la muestra que interfieren con el funcionamiento y la exactitud del electrodo.

Como se usa en el presente documento, el termino "hidratacion" se refiere al proceso de solubilizacion de las sales de una capa de sal interna del sensor por el paso de agua a traves de la membrana polimerica externa selectiva de iones que une un lado de la capa de sal interna, a la capa de sal interna para formar una solucion. Normalmente se puede conseguir hidratacion por mero contacto del exterior de la membrana polimerica y la solucion de sal interna con una solucion acuosa de sal para una duracion requerida.

Como se usa en el presente documento, "ciclacion termica" es el proceso por el que la temperatura de un sensor electroquimico, empapado en una solucion acuosa de sal, se eleva a una temperatura elevada especificada durante una extension de tiempo especificada, y despues se disminuye.

Como se usa en el presente documento, el termino "calibracion" se refiere al proceso por el cual las caracteristicas de respuesta de un sensor a un analito espedfico se determinan de manera cuantitativa. Para calibrar un sensor, el sensor se expone a al menos dos muestras de reactivos, teniendo cada muestra de reactivos una concentracion conocida diferente de un analito. Las respuestas, es decir, las senales, medidas por el sensor, relativas a las

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concentraciones del analito en las dos muestras de reactivos diferentes, sirven como puntos de referenda para las mediciones del analito en las muestras que tiene concentraciones desconocidas del analito.

Con referencia a la figura 1, el sistema 8 de sensores electroqulmicos emplea un conjunto de sensores, generalmente indicado en 10, que incorpora una pluralidad de electrodos adaptados para realizar mediciones electricas en una muestra, tal como una muestra de sangre, introducida en el conjunto 10 de sensores. Las muestras de sangre que se tienen que analizar con el sistema se introducen por una entrada 13a de muestras. Las muestras de sangre se obtienen mediante, por ejemplo, flebotomla, o se derivan sobre una base periodica desde un circuito de flujo sangulneo extracorporeo conectado a un paciente durante, por ejemplo, cirugla a corazon abierto. Las muestras de sangre se pueden introducir en la entrada 13a de muestras por otros medios automaticos o manualmente, como mediante jeringuilla. Las muestras de sangre se pueden introducir como muestras distintas.

El sistema 8 electroqulmico que incluye una serie de componentes esenciales como se ha descrito anteriormente en una realization preferida de la presente invention esta contenido en un cartucho 37 desechable. Un cartucho de un tipo similar se explica con detalle en la Patente de Estados Unidos n.° 4.734.184. En una realizacion, el sistema 8 de sensores electroqulmicos incorpora en el cartucho 37 al menos dos recipientes 14 y 16 preenvasados, conteniendo cada uno una solution acuosa de calibration que tiene valores conocidos de los parametros que se tienen que medir mediante el sistema. Para fines de referencia, la solucion contenida dentro del recipiente 14 preenvasado se denominara solucion de calibracion A, la solucion contenida dentro del recipiente 16 preenvasado se denominara solucion de calibracion B. En otras realizaciones, el sistema 8 electroqulmico ilustrado en la figura 1 incluye un tercer recipiente 23 preenvasado que contiene la solucion de calibracion Ao. Cada uno de los recipientes 14, 16 y 23 preenvasados contiene una cantidad suficiente de su solucion de calibracion para permitir que el sistema se calibre un numero sustancial de veces antes de que llegue a estar vaclo el recipiente preenvasado. Cuando uno o mas de los recipientes 14, 16 y 23 que contienen las soluciones de calibracion estan vaclos, se debe reemplazar el cartucho que contiene los recipientes 14, 16 y 23 preenvasados.

En una realizacion particular, la solucion de calibracion AO contiene monomero electropolimerizable. El monomero electropolimerizable tal como m-fenilendiamina puede estar incluido en las soluciones de calibracion en una concentration en un intervalo de aproximadamente 1 a 100 mM, preferentemente aproximadamente 15 mM. En otra realizacion, una solucion de monomeros electropolimerizables esta contenida en un recipiente preenvasado (no mostrado) separado de los recipientes 14 y 16 preenvasados para las soluciones calibradas en una concentracion en un intervalo de aproximadamente 1 a 100 mM, preferentemente aproximadamente 15 mM.

Con referencia a la figura 1, en una realizacion, el recipiente 14 preenvasado esta conectado a la entrada de una valvula 18 de varias posiciones a traves de una llnea 20 de flujo y el recipiente 16 preenvasado esta conectado a una segunda entrada de la valvula 18 de varias posiciones a traves de una llnea 22 de flujo. En otra realizacion mas, el recipiente 23 esta conectado a una tercera entrada de la valvula 18 de varias posiciones a traves de una llnea 25 de flujo. Otro recipiente 17 contiene una solucion de aclarado y esta conectado a la entrada de la valvula 18 de varias posiciones a traves de una llnea 21 de flujo. En otra realizacion mas, la bolsa 17 de aclarado se elimina y se usa una de las soluciones de calibracion A o B como una solucion de aclarado, tambien. La llnea 12 de salida es la salida de la valvula 18 de varias posiciones y esta conectada a la llnea de entrada 13 de la muestra por un estilete 11. Dependiendo de la position de la valvula 18, las llneas de entrada 20, 21, 22, 25 o el aire esta abierto a la valvula 18. De manera similar, cuando el estilete esta en una posicion normal (posicion 11b) de la llnea de entrada 13b de la muestra, la llnea 12b esta abierta a la llnea de entrada 13b de la muestra y permite el paso de la solucion de calibracion o de aclarado, o de aire, por la llnea de entrada 13b de la muestra al conjunto 10 de sensores a traves de la llnea 24, facilitada por la operation de una bomba peristaltica ilustrada esquematicamente en 26. Sin embargo, en una muestra que acepta el modo (13a), la llnea 12 se separa de la llnea de entrada de la muestra (posicion 12a) y la muestra se introduce directamente en el conjunto 10 de sensores a traves de la llnea 24, facilitado por la operacion de la bomba peristaltica 26.

El cartucho 37 tambien incluye un recipiente 28, para una solucion de referencia. El recipiente 28 esta conectado al conjunto de sensores mediante una llnea de flujo 30. El sistema incluye ademas un recipiente 32 para desechos, que recibe las muestras de sangre, las soluciones de calibracion y la solucion de referencia despues de que hayan pasado por el conjunto 10 de sensores, a traves de un conducto 34 flexible que presenta entrada desde el conjunto 10 de sensores.

Tanto el conducto 34 de flujo de desechos como la llnea 30 de flujo de solucion de referencia consisten en o incluyen secciones de tuberla de paredes flexibles que pasan a traves de la bomba peristaltica 26. La bomba 26 comprime y recorre las secciones flexibles de las llneas 30 y 34 de flujo para inducir un flujo presurizado de solucion de referencia desde el recipiente 28 al conjunto 10 de electrodos y crear una presion negativa sobre los productos de desecho en la llnea 34 de flujo de manera que se extraigan fluidos, incluyendo los fluidos con los monomeros polimerizables, en la llnea 24 de flujo a traves de pasos en el conjunto 10 de electrodos pasadas las membranas de los sensores. Esta disposition, a diferencia de la alternativa de inducir presion positiva en la sangre y las soluciones de calibracion para forzarlas a traves del conjunto 10 de electrodos, evita la imposition de fuerzas mecanicas innecesarias y, posiblemente, traumaticas en la muestra de sangre y minimiza las posibilidades de fugas en el conjunto 10 de electrodos.

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El cartucho 37 tambien contiene una tarjeta 50 sensora que proporciona una camara impermeable a los gases de volumen bajo, en que la muestra, tal como una muestra de sangre, solucion de calibracion o solucion que contiene monomero, se presenta a uno o mas sensores electroqulmicos, es decir, los sensores de pH, pCO2, pO2, Na+, Ca++, glucosa, lactato, creatina, creatinina y hematocrito, junto con el electrodo de referencia indicado colectivamente como sensores 10, son partes integrales de la camara. Las membranas hidrofobas qulmicamente sensibles formadas tlpicamente a partir de pollmeros, tales como cloruro de polivinilo, ionoforos especlficos y un plastificante adecuado, se unen de manera permanente al cuerpo de la camara. Estas membranas hidrofobas, qulmicamente sensibles, descritas a continuacion con detalle, son la interfaz entre la muestra o las soluciones de calibracion y la solucion tampon en contacto con el electrodo interno (plata/cloruro de plata).

En una realizacion, con referencia aun a la figura 1, hay incluidas en el cartucho 37 tres soluciones que permiten calibraciones a concentraciones altas y bajas para todos los parametros excepto el hematocrito, que se calibra en un nivel. En una realizacion, el cartucho 37 tambien incluye el brazo 5 del rotor para entrada de la muestra, la tuberla 24, 30 y 34 de la bomba, el estilete 11 de muestreo, una bolsa 32 de desechos, el recipiente 28 de la solucion de referencia, el recipiente 17 de la solucion de aclarado, los recipientes 14, 16 y 23 de la solucion de calibracion, la valvula 33 de comprobacion y los tubos 12, 20, 21, 22 y 25. Se evita que las muestras de sangre que se han analizado fluyan de vuelta a la tarjeta 50 sensora del recipiente 32 de desechos debido a la presencia de una valvula 33 de comprobacion de un solo sentido en la llnea 34 de desecho. Despues del uso en el sistema 8, se desea que el cartucho 37 se deseche y se reemplace por otro cartucho.

Con referencia a la figura 1, los sensores estan disponibles como un banco de electrodos 10 fabricados en una tarjeta 50 de plastico y alojados en el cartucho 37 desechable que interacciona con un conjunto 39 de bloque termico de una maquina de analisis qulmico de sangre adaptada de manera conveniente. El conjunto 39 de bloque termico aloja los dispositivos de calentamiento/enfriamiento, tales como un elemento resistivo o un dispositivo de efecto Peltier, un termistor 41 para vigilar y controlar la temperatura, la interfaz 38 electrica entre los sensores en la tarjeta 50 de plastico y el microprocesador 40 a traves del tablero 45 analogico. El tablero 45 analogico aloja convertidores de analogico a digital y digital a analogico. La senal de la interfaz 38 del electrodo pasa a traves del convertidor de analogico a digital, convertido en forma digital para el procesador 40 para almacenar y presentar. A la inversa, las senales digitales del procesador 40, por ejemplo, el voltaje de polarizacion para el sensor de oxlgeno, van por el convertidor de digital a analogico, convertido en una forma analogica y se alimenta a los sensores para el control, a traves de la interfaz 38 del electrodo.

El sistema 8 de sensores electroqulmicos se forma en la insercion del cartucho 37 en el aparato sensor electroqulmico. Tras la insercion, la tarjeta 10 sensora se dispone en el conjunto 39 de bloques del calentador, descrito con detalle a continuacion y el conjunto de calentamiento/enfriamiento regulado por el microprocesador 40 cicla la temperatura de la tarjeta 50 sensora y la solucion en contacto con los sensores en el interior de la tarjeta 50 sensora a traves de una temperatura especlfica para una duracion especificada. El conjunto 39 de bloques del calentador permite el calentamiento y enfriamiento rapidos aplicando, por ejemplo, un dispositivo termoelectrico, por ejemplo, el efecto Peltier, controlado mediante un termistor 41, todo controlado mediante el microprocesador 40. Los sensores se conectan a la interfaz 38 del electrodo que selecciona una de la pluralidad de senales electricas generadas por los sensores y pasa la senal electrica al microprocesador 40 en la maquina por un convertidor de analogico a digital en el tablero 45 analogico, donde se convierte de forma analogica a digital, adecuada para almacenamiento y presentacion. Con referencia a la figura 1, el conjunto 10 de electrodos presenta una serie de conectores 36 del borde en un banco, que permiten que se conecte en un conector 38 compatible hembra para que los electrodos formados en el conjunto 10 se puedan conectar al microprocesador 40 a traves del tablero 45 analogico. El microprocesador 40 se conecta a la valvula 18 de multiples puertos a traves de un conductor 43 de valvulas por una llnea 42 y al motor de la bomba peristaltica 26 mediante un conductor 45 de la bomba por una llnea 44. El microprocesador 40 controla la posicion del brazo 5 de la muestra por el conductor 15 del brazo y la posicion de la valvula 18 y la energizacion de la bomba 26 para producir secuencias de muestras de sangre y soluciones de calibracion que tienen que pasar por el conjunto 10 de electrodos. Cuando las soluciones de calibracion de, por ejemplo, los recipientes 14, 16 y 23 se bombean al conjunto 10 de electrodos, los electrodos que forman parte del conjunto hacen mediciones de los parametros de la muestra y el microprocesador 40 almacena estos valores electricos. Basandose en mediciones hechas durante el paso de las soluciones de calibracion a traves del conjunto 10 de electrodos y los valores conocidos de los parametros medidos contenidos dentro de la solucion de calibracion de los recipientes 14, 16 y 23, el microprocesador 40 crea de manera eficaz una curva de calibracion para cada uno de los parametros medidos de manera que cuando se haga pasar una muestra de sangre por el conjunto 10 de electrodos las mediciones hechas por los electrodos se puedan usar para derivar mediciones precisas de los parametros de interes. Estos parametros se almacenan y se presentan mediante el microprocesador 40. El microprocesador 40 se programa de manera conveniente para realizar funciones de medicion, calculo, almacenamiento y control, tales como diferencias en potencial electrico por uno o mas electrodos.

Soluciones de calibracion

En una realizacion, una composicion de la solucion A de calibracion usada para la calibracion del segundo punto, preparada a 37 °C y a presion atmosferica tonometrada con 9 % CO2 14 % de O2 y 77 % de gas helio, es como

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sigue: tampon organico de pH 6,9; pCO2= 63 mm de Hg ; pO2=100 mm de Hg ; Na+=100 mmoles/l; K+= 7 mmoles/l; Ca++= 2,5 mmoles/l; glucosa = 150 mg/dl; lactato=4 mmoles/l; creatina= 0,5 mmoles/l; creatinina= 0,5 mmoles/l; tensioactivo y conservante inerte.

En otra realizacion, una composicion de la solucion B de calibracion usada para la calibracion y aclarado de un punto, preparada a 37 °C y a presion absoluta de 700 mm de Hg tonometrada con 27 % de O2, 5 % de CO2 y 68 % de gas helio, es como sigue: tampon organico de pH 7,40; pCO2= 34 mm de Hg; pO2= 180 mm de Hg); Na+= 140mmol/l; K+=3,5 mmol/l; Ca++= 1,0 mmol/l; tensioactivo y conservante inerte.

En otra realizacion mas, una composicion preferida de la solucion AO de calibracion para la calibracion de oxlgeno de bajo nivel y regeneracion in situ de la membrana polimerica interna para los sensores enzimaticos contiene solucion acuosa de sal de Na+, K+, Ca++; 15 mmol/l de m-fenilendiamina, 20 mmol/l de sulfito, tensioactivo y conservante inerte; tampon organico, pCO2. La solucion de referencia contiene AgNO3=1mmol/l; KNO3=1 mol/l; tensioactivo.

Las composiciones de las soluciones de calibracion A y B se eligen de manera que para cada una de las caracterlsticas medidas por el sistema se obtiene un par de valores que estan espaciados por el intervalo de valores permisibles que se miden mediante el sistema, proporcionando una calibracion de 2 puntos equilibrados para el instrumento. La solucion de calibracion AO se elige para la calibracion de oxlgeno de bajo nivel y la regeneracion de la membrana polimerica interna en los sensores de glucosa, creatina, creatinina y lactato.

Las composiciones de calibracion A y B se preparan mediante la premezcla de todos los constituyentes en un cierto orden partiendo del tampon y terminando con la sal de bicarbonato de sodio, despues midiendo con el tonometro la solucion con oxlgeno y CO2 mezclado con helio para producir el nivel deseado de pCO2 y pO2. La solucion de calibracion AO se prepara con una ligera diferencia en el procedimiento. Las sales con la excepcion de sulfito de sodio, m-fenilendiamina y bicarbonato de sodio se anaden a agua y la solucion se mide con el tonometro con helio para llevar el pO2 a menos de 30 mm de Hg. Despues, se anaden las sales restantes a la solucion y se mide mediante tonometro la mezcla final con mezcla de pCO2 y helio para producir el nivel de pCO2 deseado.

Se anade al menos un monomero electropolimerizable a al menos una de las soluciones de calibracion, solucion AO en el recipiente 23 por ejemplo. La ausencia de oxlgeno disuelto en la solucion AO, debido a la presencia de ion sulfito, permite una vida util mas larga de monomero electropolimerizable en la solucion AO debido a que el oxlgeno disuelto oxidara el monomero electropolimerizable y, de este modo, hace que el monomero no pueda polimerizar. Los monomeros electropolimerizables m-fenilendiamina por ejemplo, se pueden incluir en una solucion de calibracion en una concentration en un intervalo entre aproximadamente 1 y 100 mM, preferentemente 15 mM. El monomero electropolimerizable puede estar incluido en el cartucho 37 en un deposito aparte.

La temperatura y la presion a las que se preparan las soluciones de calibracion y su metodo de envasado deben ser tales que se impidan la posibilidad de que salgan gases disueltos de la solucion en el recipiente, que afectarla a la concentracion de gases en las soluciones de calibracion y se minimice la tendencia a permear los gases a traves incluso de los materiales mas impermeables obtenibles de forma practica. Las soluciones de calibracion se envasan con las soluciones llenando completamente los recipientes, de manera que no haya camara de aire, evacuando los recipientes previamente a su llenado de una manera que se describira mas adelante.

Llenando con la solucion de calibracion el recipiente 14, 16, 23 de paredes flexibles, evacuados, a temperaturas elevadas y presion subatmosferica, la solucion no tendra ninguna tendencia a una temperatura de uso inferior para desgasificacion y producir de este modo burbujas de gas en el recipiente. Si se produce desgasificacion, las concentraciones de los gases en la solucion se verlan afectadas, creando una falta de precision en la calibracion de los instrumentos. De manera similar, las soluciones de calibracion no se deben envasar a una presion demasiado baja, es decir, no por debajo de aproximadamente 625 mm de Hg, debido a que la capacidad de absorcion de la solucion para gases aumenta de manera concebible a medida que disminuye la presion de envasado y por debajo de ese valor de la presion la capacidad de absorcion de la solucion puede ser suficientemente alta como para que tienda a extraer gases dentro por la ligera permeabilidad inherente de incluso el material de envasado flexible impermeable a la mayorla de los gases, durante largos periodos de tiempo. De acuerdo con eso, se prefiere una presion de envasado en el intervalo de 625-700 mm de Hg.

En una realizacion, una solucion de calibracion preparada a una temperatura en exceso de su temperatura de uso deseada, de manera que a la temperatura inferior haya menos tendencia a que se desgasifiquen los gases disueltos. Esto coopera con el envasado a presion reducida para minimizar la posibilidad de desgasificacion.

La solucion de calibracion A, B y AO se preparan a una temperatura por encima de su temperatura de uso deseada a una presion controlada proxima a la presion atmosferica. Por el uso de temperatura elevada (por ejemplo, 37 °C) se puede preparar la solucion a aproximadamente presion atmosferica sin ninguna posibilidad de microburbujas posteriores dentro del recipiente o transferencia de gas a traves del recipiente cuando se envasa en un recipiente impermeable a los gases, flexible con espacio de cabeza cero.

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Las envolturas que forman los recipientes 14, 16, 23, preenvasados de la solucion de calibracion se forman, por ejemplo, con laminas rectangulares, se sellan con calor en los bordes y se sellan con calor en una esquina a un vastago de entrada de la valvula 18 que se usa para fines de llenado. En la realizacion preferida ilustrada, los recipientes 14, 16 y 23 preenvasados y las llneas 20, 22 y 25 de los recipientes preenvasados se forman en un grupo unitario con la valvula 18 de manera que el espacio muerto de la fase gaseosa en las llneas 20, 22, 25 se evita de ese modo. En un procedimiento preferido para purgar y llenar las bolsas de las envolturas, la envoltura se evacua primero y despues se llena con la solucion preparada. La bolsa se agita despues mientras la solucion en exceso fluye fuera de manera continua de la bolsa. Este proceso retira toda burbuja de gas residual de la bolsa. A continuacion, se sella la solucion en el recipiente.

Las soluciones de calibracion de los recipientes 14, 16 y 23 preenvasados presentan excelente estabilidad y una vida util larga. Cuando esta a la temperatura de uso y a presion atmosferica, no hay posibilidad de desgasificacion alguna del llquido para formar burbujas de gas dentro de los recipientes 14, 16 y 23 preenvasados.

Solucion de referencia

La solucion de referencia dispuesta en el recipiente 28 preenvasado se emplea en el conjunto 10 de electrodos como una fuente de suministro a un electrodo de referencia para proporcionar una union llquida y aislar de ese modo el electrodo de referencia del potencial electroqulmico variable de la solucion de calibracion o la sangre de una manera que se describira mas adelante. En una realizacion, la solucion es 1 mol/l de nitrato de potasio y 1 mmol/l de solucion de nitrato de plata. La solucion tambien contiene un tensioactivo, tal como Brij 35. La solucion se envasa en un recipiente flexible sellado sin espacio de cabeza.

Conjunto de electrodos

Haciendo referencia a la figura 1, durante el funcionamiento de la bomba 26, el conjunto 10 de electrodos recibe un flujo pulsante constante de la solucion de referencia mediante la llnea 30 y flujos pulsantes intermitentes, secuenciales, de la muestra de sangre o de una de las soluciones de calibracion mediante la llnea 24. El conjunto tambien proporciona una salida correspondiente de sus productos de desecho a una bolsa 32 de recogida de desecho mediante la llnea 34.

Haciendo referencia a la figura 2, a modo de ejemplo, el conjunto 10 de electrodos en una realizacion preferida consiste en una tarjeta 50 rectangular estructuralmente rlgida de cloruro de polivinilo que tiene con una placa 52 de cobertura de aluminio (u otro material adecuado) rectangular adherida a una de sus superficies. La placa 52 de cobertura cierra los canales 56 de flujo formados en una superficie de la tarjeta 50 y tambien actua como medio de transferencia de calor mediante hidratacion de los sensores por ciclado termico, descrito a continuacion, y para mantener los fluidos que fluyen a traves del conjunto 10 de electrodos y los propios electrodos, a una temperatura constante durante la calibracion y durante la medicion de los parametros relevantes en una muestra del paciente. Esto se puede conseguir midiendo la temperatura de la placa 52 y empleando un elemento de calentamiento o enfriamiento adecuado, por ejemplo, un dispositivo de efecto Peltier y un termistor 41 para mantener la temperatura de la placa 52 a una temperatura deseada.

Haciendo referencia a la figura 2, se introduce una solucion de referencia en un pozo 64, formado en la superficie del sustrato 50 de la misma manera que los otros canales 56 de flujo y se cubren de manera similar con la placa 52 de metal. La llnea 30 de flujo de solucion de referencia pasa por un agujero inclinado en el pozo 64. El pozo 64 esta conectado a la seccion 34 de salida del canal 56 de flujo a traves de una seccion 66 capilar muy delgada formada en la superficie del sustrato 50 de plastico de la misma manera que los canales 56 de flujo principales. El canal 66 capilar es sustancialmente mas superficial y mas estrecho que el canal 56 de flujo principal; su seccion transversal es aproximadamente 0, 5 mm cuadrados. El fluido de referencia bombeado al pozo 64 por la bomba 26, mediante una llnea 30 (vease tambien la figura 1), llena el pozo y se fuerza a traves de la seccion 66 capilar donde se une a la corriente de salida de fluido que pasa por la seccion 56 del canal de flujo principal y despues fluye con el a la bolsa 32 de desecho. La influencia combinada de su mayor densidad descrita anteriormente y la capilaridad del canal 66 de flujo sirve para minimizar cualquier posibilidad de que pase solucion de calibracion o sangre hacia abajo por el canal 66 al pozo 64 y que se perturben las mediciones electroqulmicas.

Como una cantidad de muestra de sangre o solucion de calibracion introducida en el canal 24 de flujo pasa por el canal 56 de flujo a la seccion 34 de salida, pasa por una serie de electrodos como se ilustra en la figura 2.

En referencia a las figuras 1 y 2, la placa 52 de calor colinda y forma una pared del canal 56 de la muestra. La placa 52 de calor esta en contacto con el dispositivo de efecto Peltier del conjunto 39 de bloque termico descrito a continuacion. El conjunto 39 de bloque termico es capaz de cambiar y controlar la temperatura de la placa 52 de calor entre 15 °C y 75 °C. El cambio y control de la temperatura se controla mediante un termistor 41 y se regula mediante el microprocesador 40. Un reloj digital interno del microprocesador 40 controla el tiempo y puede encender y apagar el conjunto 39 de bloque termico segun un programa prefijado. Por tanto, el microprocesador 40 controla el conjunto 39 de bloque termico, regulando el ajuste de la temperatura y la duracion de cada temperatura fijada de la placa 52 de calor.

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Los electrodos

El orden de conjunto de los electrodos proporcionado a continuacion es solo como ejemplo y no se pretende que limite el orden proporcionado.

El par de electrodos del hematocrito

Haciendo referencia a la figura 2, un par de hilos 98 y 100 de oro forma electrodos para determinar el hematocrito (Hct) de una muestra basandose en su conductividad. Los hilos hacen contacto con los conectores 102 y 104 del borde del circuito impreso, respectivamente, tambien ilustrado en la figura 5.

El sensor de oxigeno

Haciendo referencia a la figura 2, el siguiente sensor en el canal 56 de flujo es el sensor 70 de oxigeno con una configuracion de tres electrodos, tambien ilustrado en la figura 4.

El electrodo sensor de iones potasio, calcio y sodio

A continuacion, en la parte superior del canal de flujo es un electrodo 78 sensor de sodio, seguido de un electrodo 86 sensor de calcio y un electrodo 90 sensor de potasio, incluyendo una membrana activa y un hilo de plata fijado y un conector de borde asociado.

El electrodo de pH

Haciendo referencia a la figura 2, despues, a lo largo del canal 56 de flujo hay un electrodo 94 sensible al pH tambien ilustrado en la figura 6, que incluye una membrana 148 y un hilo 87 de plata fijado o ajustado a presion por el espesor del plastico 50 en el canal 56 de flujo. Haciendo referencia a la figura 6, unido en el lado opuesto del canal 56 de flujo hay una seccion 88 conductora impresa de almohadilla (tambien vease la figura 5), que forma un conector de borde. La naturaleza de este electrodo de pH se describira con detalle mas adelante.

El electrodo de dioxido de carbono

Haciendo referencia a la figura 2, el electrodo 93 siguiente a lo largo del canal 56 de flujo mide el dioxido de carbono disuelto en la sangre o solucion de calibracion y trabaja junto con el electrodo 94 de pH.

El electrodo de lactato

Haciendo referencia a la FIG. 2, a continuacion, a lo largo del canal 56 de flujo, el electrodo 92 de lactato funciona midiendo subproductos de una reaccion enzimatica de la lactato oxidasa sobre lactato. El lactato oxidasa presente en la capa enzimatica oxida el lactato que produce peroxido de hidrogeno, que es detectado por el electrodo del sensor de lactato.

El electrodo de glucosa

Haciendo referencia a la figura 2, un electrodo 91 de glucosa es el electrodo siguiente, que, como el electrodo 92 de lactato, funciona mediante la deteccion de peroxido de hidrogeno producido por una reaccion enzimatica en la capa enzimatica. La enzima glucosa oxidasa especlficamente oxida la glucosa y produce peroxido de hidrogeno, un compuesto detectado por el electrodo del sensor de glucosa.

Los electrodos de creatina y creatinina:

La medicion de creatinina en una muestra de sangre requiere dos electrodos. Un electrodo mide la concentracion total de creatinina y creatina y el otro electrodo mide la concentracion de solo creatina. La concentracion de creatinina se determina mediante la resta de la creatina de las concentraciones de creatina y creatinina combinadas. Haciendo referencia a la figura 2, los siguientes dos electrodos, creatinina 116 y creatina 118, que, como el electrodo 91 de glucosa y el electrodo 92 de lactato, funcionan mediante la deteccion de H2O2 producido mediante la reaccion enzimatica en sus respectivas capas enzimaticas. En el electrodo 116 de creatinina, la capa enzimatica incluye una mezcla de tres enzimas: creatininasa, creatinasa y sarcosina oxidasa. Esta mezcla enzimatica oxida especlficamente creatinina y creatina y produce H2O2 en la siguiente reaccion en cascada.

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En el electrodo 118 de creatinina, la capa enzimatica incluye una mezcla de dos enzimas: creatinasa y sarcosina oxidasa. Esta mezcla enzimatica oxida especificamente solo la creatina y produce H2O2 en la siguiente reaccion en cascada:

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La tierra

La tierra 105 ilustrada en la figura 2 es un hilo de plata insertado a traves del sustrato 50. Una tierra sirve como un punto de referencia electrico comun para todos los electrodos. La tierra tambien puede servir como un contraelectrodo para el sistema de sensores amperometricos.

El electrodo de referencia

Como se ilustra en la figura 2, dos hilos 106 de plata estan fijados por el espesor del tablero 50 de sustrato de plastico en el pozo 64 de solucion de referencia para actuar como el electrodo de referencia integrado. El uso de dos hilos 106 de plata que estan conectados electricamente asegura el contacto continuo entre el hilo de plata y la solucion de referencia en presencia de burbujas de aire. Las burbujas de aire pueden formar en el canal de referencia como resultado de la desgasificacion de la solucion de referencia a la temperatura elevada del control del sensor. Un elemento 108 de circuito impreso, tambien ilustrado en la figura 5, se extiende a lo largo de la parte de atras del panel entre un extremo de este electrodo de referencia y el borde del tablero para proporcionar un conector de borde.

La construccion y el funcionamiento especificos de los electrodos se describiran ahora con detalle.

Detalles de los electrodos selectivos de iones

Los detalles de los electrodos selectivos de iones se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 4.214.968 y la patente de Estados Unidos n.° 4.734.184.

Las membranas selectivas de iones de este tipo, que tambien se conocen como membranas liquidas, constituyen una matriz polimerica con un plastificante no volatil que forma la fase liquida en que se dispersa un portador ionico o selector referido habitualmente como un ionoforo, que imparte selectividad a la membrana.

Polimero de membrana selectiva de iones

Los polimeros para su uso en la membrana selectiva de iones incluyen cualquiera de los polimeros naturales o sinteticos hidrofobos capaces de formar peliculas delgadas de suficiente permeabilidad para producir, junto con los ionoforos y disolvente o disolventes ionoforos, movilidad ionica aparente a su traves. Se han encontrado utiles especificamente cloruro de polivinilo, cloruro de vinilideno, acrilonitrilo, poliuretanos (en particular poliuretanos aromaticos), copolimeros de cloruro de vinilo y cloruro de polivinilideno, polivinilbutiral, polivinilformal, acetato de polivinilo, elastomeros de silicona y copolimeros de alcohol polivimlico, esteres de celulosa, policarbonatos, polimeros carboxilados de cloruro de polivinilo y mezclas y copolimeros de tales materiales. Las peliculas de dichos materiales que incluyen los ionoforos y plastificantes se pueden preparar usando tecnicas de recubrimiento de pelicula o fundicion convencionales y, como se muestra en los ejemplos siguiente, se pueden formar mediante recubrimiento y formacion de pelicula directamente sobre el electrodo de referencia interno o alguna intercapa adecuada o por formacion por separado y laminacion a la misma.

Ionoforo

El ionoforo usado en la membrana selectiva de iones es, generalmente, una sustancia capaz de asociar selectivamente o unir a si misma preferentemente un metal alcalino especifico deseado, alcalinoterreo, amonio u otros iones. Los ionoforos adecuados se describen mas completamente a continuacion.

La selectividad del electrodo para un ion en particular se debe a la naturaleza quimica del ionoforo y, por tanto, el uso de diferentes componentes quimicos ya que el ionoforo proporciona diferentes membranas para su uso en electrodos selectivos de iones especificos para diferentes iones. Ejemplos de tales componentes son un gran numero de sustancias, algunas de ellas conocidas como antibioticos, que incluyen: 1 2 3

(1) valinomicina, un ionoforo selectivo de potasio;

(2) polieteres ciclicos de diversa constitucion que hacen la membrana selectiva a litio, rubidio, potasio, cesio o sodio y

(3) otras sustancias con selectividad ionica similar a la valinomicina, tales como otras sustancias del grupo de la

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valinomicina, tetralactonas, macrolidos actinas (monactina, nonactina, dinactina, trinactina), el grupo enniatina (enniatina A, B), ciclohexadepsipeptidos, gramicidina, nigericina, dianemicina, nistatina, monensina, esteres de monensina (especialmente metilmonensina para membranas selectivas de iones sodio), antamanida y alameticina (polipeptidos clclicos).

Otros numerosos materiales utiles se describen en las publicaciones y patentes anteriores, as! como en otra bibliografla sobre este tema.

La concentracion de ionoforo en la membrana variara, por supuesto, con el vehlculo concreto usado, el analisis ionico experimentado, el plastificante, etc. Se ha encontrado en general, sin embargo, que las concentraciones de ionoforos inferiores a aproximadamente 0,1 g/m2 de membrana suponiendo los espesores de membrana preferidos en el presente documento dan como resultado respuestas marginales y, en general, no deseables. Las concentraciones de ionoforo de entre aproximadamente 0, 3 y aproximadamente 0,5 g/m2 son preferidas. El ionoforo se puede incorporar a niveles mucho mayores que este; sin embargo, debido al coste de muchos de estos materiales, el uso de tales niveles no es economicamente solido.

Plastificante

El plastificante proporciona movilidad ionica en la membrana y, la presencia de un plastificante es necesaria para obtener buena transferencia de iones.

El plastificante debe, por supuesto, ser compatible con el pollmero de membrana y ser un disolvente para el ionoforo.

La otra caracterlstica altamente deseable es que el plastificarte sea suficientemente insoluble en agua para que no migre significativamente a una muestra acuosa puesta en contacto con la superficie de la membrana como se describe de ahora en adelante. En general, un llmite de solubilidad superior en agua serla aproximadamente 4,0 g/l encontrandose un llmite preferido por debajo de aproximadamente 1 g/l. Dentro de estos llmites, se puede usar sustancialmente cualquier disolvente para el ionoforo que sea tambien compatible con el pollmero. Tambien es deseable que el plastificante ionico sea sustancialmente no volatil para proporcionar una vida util prolongada para el electrodo. Entre los disolventes utiles se encuentran ftalatos, sebacatos, eteres aromaticos y alifaticos, fosfatos, fosfatos alifaticos aromaticos mixtos, adipatos y mezclas de los mismos. Plastificantes utiles especlficos incluyen trimelitatos, bromofenilfenileter, ftalato de dimetilo, ftalato de dibutilo, fosfonato de dioctilfenilo, bis(2-etilhexil)ftalato, fosfato de octildifenilo, fosfato de tritolilo, fosfato de tris(3-fenoxifenilo), fosfato de tris(2-etilhexilo) y sebacato de dibutilo. Son preferidos en particular entre esta clase bromofenilfenileter y trimelitatos para electrodos de potasio usando valinomicina como vehlculo.

Un gran numero de otros plastificantes utiles permite el ensamblaje de electrodos del tipo descrito en el presente documento y se pueden usar en la practica exitosa de la presente invencion.

La concentracion de plastificante en la membrana tambien variara enormemente con los componentes de una membrana determinada; sin embargo, las relaciones en peso entre el plastificante y el pollmero de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:2 proporcionan membranas utiles. El espesor de la membrana afectara a la respuesta del electrodo como se describe con mas detalle de algun modo a continuation y se prefiere para mantener el espesor de esta capa por debajo de aproximadamente 5 milipulgadas y, preferentemente, aproximadamente 1 milipulgada. Como tambien se describe con mayor detalle a continuacion, la uniformidad de espesor de la membrana selectiva de iones desempena una funcion importante en la utilization optima de los electrodos del tipo descrito en el presente documento. Por tanto, si se tiene que obtener la maxima ventaja en terminos de capacidad de almacenamiento, la membrana selectiva de iones deberla ser de espesor relativamente uniforme como se definio anteriormente.

Soporte

Haciendo referencia a la figura 1, los electrodos incluyen un soporte o tarjeta 50 que puede estar constituida por cualquier material capaz de soportar, directamente o por medio de alguna capa que mejore la adhesion, intermedia, las otras porciones necesarias del electrodo que se describen con detalle de ahora en adelante. Asl, el soporte puede comprender ceramica, madera, vidrio, metal, papel o materiales de plastico o polimericos fundidos, extruidos o moldeados, etc. La composition del soporte que soporta los componentes del electrodo suprayacente debe ser inerte; es decir, no interfiere con los potenciales indicadores observados como, por ejemplo, por reaction con uno de los materiales suprayacentes de una manera no controlada. Ademas, la composicion del soporte debe resistir las temperaturas elevadas a que se expondran los sensores, durante la extension de tiempo requerida para hidratar y/o calibrar los sensores. En el caso de materiales porosos tales como madera, papel o ceramica, puede ser deseable sellar los poros antes de aplicar los componentes del electrodo suprayacentes. Los medios para proporcionar dicho sellado son conocidos y no es necesaria ninguna discusion adicional de los mismos en el presente documento.

Segun una realization altamente preferida de la presente invencion, el soporte comprende una lamina o pellcula de

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un material polimerico aislante. Una variedad de materiales polimericos formadores de pellcula son adecuados para este fin, tales como, por ejemplo, acetato de celulosa, poli(tereftalato de etileno), policarbonatos, poliestireno, cloruro de polivinilo, etc. El soporte polimerico puede ser de cualquier espesor adecuado, tlpicamente de aproximadamente 20-200 milipulgadas. De manera similar, se podlan usar capas o superficies delgadas de otros materiales mencionados anteriormente. Los metodos para la formacion de dichas capas son bien conocidos en la tecnica.

Detalles del electrodo enzimatico

Un sensor enzimatico comprende un sistema de tres electrodos, que incluye un electrodo de trabajo, uno de referencia y un contraelectrodo. El electrodo de trabajo incluye una membrana de material compuesto que se deposita sobre una superficie en contacto con un hilo conductor, por ejemplo, un hilo de platino. La membrana de material compuesto comprende dos o mas capas, incluyendo una capa enzimatica y una membrana de rechazo de interferencias interna, por ejemplo.

La fabricacion del sensor puede basarse en tecnicas de fundicion con disolvente bien conocidas en la materia. El espesor de las capas se puede controlar dispensando volumenes precisos de solutos encontrados en las capas. La membrana polimerica que comprende una membrana de rechazo de interferencias interna, descrita con detalle a continuacion, se forma sobre el electrodo de hilo por electropolimerizacion de monomeros electropolimerizables, como se describe a continuacion.

En referencia a las figuras 3A y 3B, un electrodo 59 enzimatico, tal como un electrodo de glucosa, se situa en el canal 56 de flujo de la tarjeta 50 sensora. La figura 3B es una seccion ampliada de la figura 3A. El electrodo 59 enzimatico incluye una membrana 60 de material compuesto de tres capas que comprende, del canal 56 de flujo al hilo 57, una membrana 51 externa adyacente al canal 56 de flujo, una capa 53 enzimatica, situada entre la membrana 51 externa y una membrana 55 de rechazo de interferencias interna adyacente a un hilo 57. El electrodo 59 enzimatico se pone en contacto con la muestra a medida que la muestra fluye a lo largo del canal 56 de flujo y por la membrana 51 externa del electrodo 59 enzimatico. La serial electrica generada por el electrodo 59 enzimatico se realiza por el hilo 57 y se transfiere al conductor 61 que esta en comunicacion electrica con el conjunto 10 de electrodos mostrado en la figura 2.

En referencia a las figuras 3A y 3B, la membrana 51 externa del electrodo 59 enzimatico actua en general controlando la difusion del analito a la capa 53 enzimatica y protegiendo a los otros componentes del electrodo 59 de contacto directo con constituyentes de la muestra en el canal 56. En una realizacion, la membrana 51 externa es una membrana polimerica que comprende uno o mas compuestos a base de poliuretano. La hidrofobicidad de la membrana se determina por la mezcla de especies de compuestos polimericos. A medida que aumenta la hidrofobicidad de la membrana, la capacidad del oxlgeno para difundirse por la membrana aumenta al tiempo que disminuye la capacidad de los analitos para difundir por la membrana. La composicion preferida de la membrana 51 externa es la concentracion en que existe un equilibrio optimo de velocidades de difusion de oxlgeno, que es un sustrato requerido de las reacciones enzimaticas y analito (lactato en un sensor de lactato o creatinina y creatina en un sensor de creatinina y glucosa en un sensor de glucosa) en condiciones tlpicas. Puede preferirse una membrana externa altamente hidrofoba debido a que el oxlgeno difundira rapidamente a la capa 53 enzimatica y, por tanto, no sera un factor limitante para la reaccion enzimatica. La membrana 51 externa puede presentar un espesor preferible de 8 a 15 micrometres y podia funcionar como un espesor en el intervalo de 5 a 30 micrometres.

La membrana 51 externa esta compuesta por una mezcla de poliuretanos con diferentes niveles de absorcion de agua. Una composicion tlpica de la membrana 51 externa es 77 % de poliuretano a base de polieter, alifatico, con 20 % de absorcion de agua, 17 % de poliuretano a base de polieter, alifatico, con 60 % de absorcion de agua y 6 % de poliuretano a base de polieter, alifatico, con 3 % de absorcion de agua. La membrana 51 externa con esta composicion se puede producir dispensando un volumen de una solucion de 3,0 ml de disolvente de ciclohexanona, 17,0 ml de disolvente tetrahidrofurano, 1,08 g de poliuretano de 20 % de absorcion de agua, 0,24 g como poliuretano de 60 % de absorcion de agua y 0,08 g como poliuretano de 3 % de absorcion de agua sobre la capa 53 enzimatica de la membrana 60 de material compuesto.

Haciendo referencia a la figura 3B, la membrana 51 externa, que se estratifica directamente sobre y en contacto con la capa 53 enzimatica, actua conservando la capa 53 enzimatica evitando la exposicion de una enzima 49 embebida en la capa 53 enzimatica y la matriz estabilizante en que esta embebida la enzima 49, a protelnas o compuestos degradatorios de la muestra en el canal 56. Asimismo, la membrana 51 externa evita la difusion de la enzima 49 fuera de la capa 53 enzimatica. La membrana 51 externa tambien actua controlando la velocidad de difusion del analito (por ejemplo, glucosa, lactato, creatina y creatinina) y oxlgeno de la muestra a la capa 53 enzimatica. El fracaso en el control de la difusion del analito y oxlgeno a la capa 53 enzimatica da como resultado mediciones no lineales e inexactas del analito en la muestra.

Haciendo referencia aun a la figura 3B, la capa 53 enzimatica del sensor de glucosa o lactato, incluye al menos una enzima 49, especie requerida para la reaccion enzimatica en que el analito especlfico participa, que se estabiliza en la matriz de la capa 53 enzimatica. En una realizacion, la enzima 49 incluye al menos una protelna con actividad enzimatica. En otras realizaciones, la enzima 49 incluye una mezcla de diversas enzimas, protelnas y estabilizantes,

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por ejemplo.

En una realizacion concreta, la enzima 49 proteica glucosa oxidasa o lactato oxidasa esta embebida en la capa 53 enzimatica y crea un electrodo 91 y 92 sensible de manera especlfica a glucosa y lactato, respectivamente, presentes en la muestra. El electrodo 91 de glucosa incluye glutaraldehldo y glucosa oxidasa en la capa 53 enzimatica. En una realizacion, el electrodo 91 de glucosa puede incluir 0,10 g de glutaraldehldo por gramo de glucosa oxidasa. En una realizacion concreta, el electrodo 92 de lactato incluye al menos glutaraldehldo, seroalbumina bovina, un estabilizante enzimatico tal como, por ejemplo, polietilenimina y lactato oxidasa en la capa 53 enzimatica. En una realizacion, el electrodo 92 de lactato incluye 45 % de lactato oxidasa en peso, 45 % de seroalbumina bovina en peso, 5 % de polietilenimina (un estabilizante enzimatico) en peso y 5 % de glutaraldehldo en peso, por ejemplo. Las fracciones en peso de lactato oxidasa y seroalbumina bovina pueden variar. El porcentaje en peso de polietilenimina en la capa enzimatica puede variar de 1 a 20 y el porcentaje en peso de glutaraldehldo puede variar de 1 a 10. Otros estabilizantes enzimaticos incluyen, pero sin limitaciones, compuestos poliionicos tales como polipropilenimina, poli(N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados.

En otra realizacion mas, la capa 53 enzimatica incluye una mezcla de diversas enzimas, protelnas y estabilizantes embebidos en la matriz de la capa 53 enzimatica para deteccion especlfica de creatinina y creatina o creatina sola. Se usan mezclas enzimaticas en el electrodo 116 de creatinina y el electrodo 118 de creatina. La creatina sola se detecta con el electrodo 118 de creatina. En una realizacion concreta, el electrodo 116 de creatinina incluye una mezcla de 5 % de creatininasa en peso, 55 % de creatinasa en peso, 30 % de sarcosina oxidasa en peso, 5 % de poli(N-vinilimidazol) (un estabilizante enzimatico) en peso y 5 % de glutaraldehldo en peso, por ejemplo. Las fracciones en peso de creatininasa, creatinasa y sarcosina oxidasa en el electrodo de creatinina y las fracciones en peso de creatinasa y sarcosina oxidasa en el electrodo de creatina pueden variar. El porcentaje en peso de poli(N vinilimidazol) en electrodos de creatinina y creatina pueden variar, por ejemplo, de 1 % a 20 %, y el porcentaje en peso de glutaraldehldo en los electrodos de creatinina y creatina tambien pueden variar, por ejemplo, de 1 % a 10 %. Tambien se pueden usar estabilizantes poliionicos, distintos de poli(N-vinilimidazol), para estabilizar la mezcla enzimatica. Ejemplos de compuestos poliionicos incluyen, pero sin limitaciones, polietilenimina, polipropilenimina, polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina, protamina y sus derivados.

En una realizacion de los electrodos de glucosa, lactato, creatina y creatinina, la capa 53 enzimatica consiste en una matriz reticulada de enzimas, estabilizantes tales como polietilenimina o poli (N-vinilimidazol) y otras protelnas tales como seroalbumina bovina. La reticulacion de las enzimas, estabilizantes y otras moleculas proteicas se realiza con, por ejemplo, glutaraldehldo, un dialdehldo. Tambien se pueden usar Otros agentes de reticulacion, tales como 1,4- diisocianatobutano, un diisocianato, 1,2,7,8-diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxidecano, ambos diepoxidos. La reticulacion de las moleculas enzimaticas y el uso de los estabilizantes poliionicos y protelnas inertes en la matriz enzimatica pueden prolongar significativamente la vida util y la vida de uso de los electrodos enzimaticos.

En aun otra realizacion relacionada con los electrodos de creatinina 116 y creatina 118, la capa 53 enzimatica incluye una mezcla de diversas enzimas, protelnas, pero carece de estabilizante enzimatico. En esta realizacion, el electrodo 116 de creatinina incluye una mezcla de 30 % de creatininasa, 30 % de creatinasa, 30 % de sarcosina oxidasa y 10 % de glutaraldehldo (porcentajes en peso). En esta realizacion, el electrodo 118 de creatina incluye una mezcla de 45 % de creatinasa, 45 % de sarcosina oxidasa y 10 % de glutaraldehldo (porcentajes en peso). La capa 53 enzimatica puede presentar un espesor en el intervalo de 1 a 10 micrometres, preferentemente 2-5 micrometres medidos desde la superficie interna de la membrana 51 externa a la superficie exterior de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna.

En referencia a las figuras 3A y 3B, el electrodo 59 enzimatico tambien incluye una membrana 55 de rechazo de interferencias interna que es una membrana polimerica regenerable en contacto Intimo con el hilo 57. La membrana 55 de rechazo de interferencias interna se puede formar por la polimerizacion de monomeros electropolimerizables. Entre los monomeros electropolimerizables adecuados se incluyen benzotiofeno, fenilendiaminas y fenoles, por ejemplo. La membrana 55 de rechazo de interferencias interna, que es tlpicamente menor que un micrometro de espesor, alsla o protege el hilo 57 de compuestos en la muestra, especlficamente compuestos oxidables, que interfieren con el propio funcionamiento del electrodo enzimatico.

En una realizacion de acuerdo con la invention, la membrana polimerica que comprende la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se forma por la aplicacion de un potencial electrico al hilo 57 en presencia de monomeros electropolimerizables. Los monomeros en presencia de un potencial electrico se polimerizan sobre el hilo 57 para formar una membrana 55 de rechazo de interferencias interna sobre el hilo 57, ilustrado en las figuras 3A y 3B. El peroxido de hidrogeno, que se genera por la actividad de la enzima del electrodo enzimatico sobre un analito especlfico, pasa por los poros de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna y se pone en contacto con el hilo 57 haciendo que se genere una serial electrica en el hilo 57. El tamano menor de los poros en la membrana 55 de rechazo de interferencias interna restringe los compuestos encontrados en la muestra, mayores que peroxido de hidrogeno, tales como paracetamol, acido ascorbico, acido urico, cistelna y otros compuestos electroactivos que son mas grandes que H2O2 de interferir con y reducir de exactitud del electrodo 59 del sensor electroqulmico.

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De acuerdo con una realization de la invention, la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se puede regenerar sobre una base repetida para regenerar su funcion. Despues de exposition repetida a muchas muestras, la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se degrada o se ensucia por compuestos presentes en la muestra. La degradation de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se caracteriza por fisuras en la estructura polimerica de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Tales fisuras evitan la capacidad de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna para proteger el hilo 57 de compuestos interferentes presentes en la muestra analltica, por ejemplo, acido ascorbico, paracetamol y acido urico, de ponerse en contacto con el hilo 57 y alterar la senal electrica detectada por el hilo 57.

Para evitar problemas inducidos por la degradation de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna, se puede combinar un monomero electropolimerizable con una solution de calibration, tal como solution AO contenida en el recipiente 23 preenvasado del sistema 8 de sensores electroqulmicos, ilustrado en la figura 1, por ejemplo, para usar en la repolimerizacion y regeneration de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. La polimerizacion del monomero tiene lugar cuando se bombea una solution AO que contiene monomero de un recipiente preenvasado y se hace pasar por el canal 56 de flujo sobre la tarjeta 50 sensora durante la aplicacion de un potencial electrico generado por el aparato 8 sensor electroqulmico, ilustrado en la figura 1 al hilo 57. Durante el procedimiento de polimerizacion el monomero en la solution de calibration en el canal 56 de flujo difunde por la membrana 51 externa y la capa 53 enzimatica hasta que alcanza la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Una vez en la membrana 55 de rechazo de interferencias interna, los monomeros presentes en la solution entran en las areas de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna que han perdido la integridad estructural por degradation, division o agrietamiento y median la regeneration de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna por polimerizacion para rellenar la estructura danada de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. El monomero se expone a un potencial electrico generado a partir de una fuente electrica y se transfiere al hilo 57 en las areas de integridad perdida de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. El potencial electrico polimeriza el monomero sobre la estructura polimerica existente de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna en las areas danadas de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna hasta que se regenera la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Una vez que se regenera la membrana 55 de rechazo de interferencias interna las propiedades aislantes de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se renuevan y se secuestra el monomero presente en la membrana 55 de rechazo de interferencias interna a partir del potencial electrico del hilo 57. Esta regeneration autolimitante de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna se repite de manera automatica cada 24 horas, por ejemplo. La regeneration autolimitante, automatica, regular, de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna asegura la exactitud del sensor 59 enzimatico. Se pueden emplear ciclos de regeneration mas o menos frecuentes de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna para estimar diferentes situaciones.

El potencial electrico para el proceso de polimerizacion generado por el sistema 8 sensor electroqulmico ilustrado en la figura 1 se aplica al hilo 57 en el intervalo de 0,1 a 0,8 V frente al electrodo 106 de referencia integrado, durante aproximadamente 30 segundos a una hora. Un potencial de polarization optimo es 0,5 V frente al electrodo 106 de referencia integrado durante 3 minutos, repetidos cada 24 horas. El potencial electrico es demasiado bajo si no produce la reaction de polimerizacion y el potencial electrico es demasiado alto si produce hidrolisis de agua y formation de gas en la membrana 55 de rechazo de interferencias interna produciendo as! dano al electrodo 59 enzimatico.

Detalles del electrodo de PO?

Un sensor de oxlgeno comprende un sistema de tres electrodos que incluye un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un electrodo de tierra. En un ejemplo, el electrodo 70 de trabajo de oxlgeno comprende un hilo 74 de platino que se fija en el centro de un disco 109 de vidrio aislante y dos membranas 120 y 122 protectoras mostradas mejor en la figura 4. El disco presenta preferentemente un espesor de aproximadamente 40 milipulgadas mientras el tablero 50 puede presentar un espesor de aproximadamente 85 milipulgadas. El diametro del disco de vidrio es, preferentemente, de aproximadamente 100 milipulgadas.

Se prepara una serie de discos de vidrio con los hilos de platino embebidos insertando una longitud ajustada de hilo de platino en la abertura de un tubo capilar de vidrio y fundiendo despues el tubo de manera que se fusione al hilo. Despues de que se endurece el tubo con el hilo embebido, los discos de espesor axial determinado se cortan, mediante una sierra electrica, por ejemplo.

El disco de vidrio es practicamente impermeable al oxlgeno mientras el cloruro de polivinilo del tablero 50 es relativamente permeable. El disco de vidrio protege as! el electrodo 74 de platino del gas de manera que solo es activo su extremo distal que se enfrenta al canal 56 de flujo.

Las dos membranas 120 y 122 sobre el disco de vidrio protegen el hilo 74 de platino del contacto directo con los constituyentes de la muestra en el canal 56. En una realization, la membrana 120 es un hidrogel basado en esteres metacrllicos que esta unidos mediante enlaces covalentes al disco de vidrio. La membrana 122 por debajo de 120 cubre solo el area alrededor del hilo de platino y esta hecha de alcohol polivinllico. La membrana 60 de material

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compuesto que incluye 120 y 122 proporciona una mejor proteccion y realizacion del sensor que cualquiera de las membranas solas. El tipo de hidrogel que se emplea esta basado en esteres metacrllicos, aunque se pueden usar hidrogeles no basados en esteres de acido metacrllico. Para formar un gel, el monomero, tal como metacrilato de hidroxietilo o metacrilato de hidroxipropilo, por ejemplo, se copolimeriza con un agente de reticulacion, tal como, dimetacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de dietilenglicol o dimetacrilato de tetraetilenglicol. La reaccion de reticulacion puede ser iniciada por un fotoiniciador tal como dimetoxifenilacetofenona. Se puede usar un disolvente, tal como etilenglicol o agua, para diluir las reacciones y controlar la viscosidad de la solucion.

Es de considerable ventaja que la membrana de hidrogel no se despegue de la superficie del electrodo de oxlgeno cuando se hidrata la membrana. Esto se consigue por funcionalizacion del disco de vidrio con grupos metacrllicos y reticulando la membrana a la superficie. La superficie del disco de vidrio se siliniza con hexametildisilizano y se funcionaliza con grupos metacrllicos por reaccion con metacrilato de trimetoxisililpropilo.

Despues de la funcionalizacion del disco de vidrio, se dispensa una pequena gota de una solucion de alcohol polivinllico en agua en el centro del disco directamente sobre el hilo de platino y se permite que el agua se evapore para formation de la membrana de alcohol polivinllico. Despues se dispensa una solucion de componente de hidrogel como se ha descrito anteriormente sobre el disco en una cantidad que corresponde a pellcula gruesa de 50 micrometres. El disco se expone a una luz UV de banda ancha durante 5 minutos para fotopolimerizar la membrana de hidrogel.

El disco de vidrio con la membrana de material compuesto en un lado del mismo se embebe en una forma retralda por el espesor del tablero 50 de plastico de manera que la superficie no de hidrogel se nivela con la superficie del tablero opuesta a la placa 52 de cubierta y la superficie de hidrogel del disco se nivela con el fondo del canal 56 de flujo.

El sensor de oxlgeno descrito en el presente documento presenta diversas ventajas cuando se compara con el electrodo convencional (electrodo de Clark), incluyendo un tamano de electrodo menor, fabrication de electrodo mas simple, tiempo de respuesta mas rapido y vida de uso mas prolongada. La separation de los electrodos de referencia y el contraelectrodo del electrodo de trabajo permite un tamano mas pequeno del electrodo de trabajo y fabricacion del electrodo mas simple. El tiempo de respuesta del oxlgeno se reduce debido a la ausencia de solucion interna y la membrana mas delgada resultante sobre el electrodo de trabajo. El uso de electrodo de referencia externa elimina la formacion de dendritas de plata sobre el electrodo de trabajo, que es un modo comun de fallo en un electrodo de oxlgeno Clark con un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

Sobre la funcion amperometrica del electrodo en funcionamiento, se aplica un potencial negativo relativo al electrodo 106 de referencia integrado al hilo 74 de platino mediante el procesador 40 cuyo potencial disminuido sirve para reducir cualquier oxlgeno que alcance su extremo y produce de ese modo una corriente electrica proporcional a la difusion de oxlgeno por las capas 120 y 122. La capa 120 y 122 hidratada proporciona una ruta de flujo conductor fiable entre el electrodo de platino y el electrodo 106 de referencia integrado para proporcionar un potencial de polarization entre el platino y la solucion en la capa hidratada. El flujo de corriente resultante entre el electrodo 74 de platino y el electrodo de tierra se mide y es proporcional a la concentration de oxlgeno en el fluido de ensayo que se esta controlando.

Electrodos de detection de pCO?. pH, potasio, sodio y calcio

Los electrodos, mejor ilustrados en general en la figura 2, que conectan los hilos 78, 86, 90, 93 y 94 de plata que detectan actividades de Na, Ca, potasio, pCO2 y pH, respectivamente, son de construction similar. La diferencia esta en la composition de las capas de las membranas. Un electrodo selectivo de iones tlpico se ilustra en la figura 6. Cada uno presenta una perla o una capa 152 interna de sal, que en la hidratacion forma la capa de solucion interna. Esta capa esta en contacto con la pellcula delgada de la capa 154 de plata/cloruro de plata obtenida por anodization de la parte superior de los hilos de plata. La capa 148 externa es esencialmente la capa de membrana selectiva de iones, polimerica. Esta capa se forma por el residuo de sal seco de la capa interna en un pozo 150 superficial como un residuo seco restante despues de la elimination del disolvente de una matriz de una membrana hidrofoba permeable que forma solucion tal como una solucion que contiene cloruro de polivinilo, un plastificante, un ingrediente activo sensible a los iones apropiado y una sal de borato. La membrana externa se aplica como una solucion, tlpicamente en tetrahidrofurano (tHf) en una gotita pequena. Una vez que se evapora el disolvente, se forma la membrana y se une a la tarjeta de plastico. En el caso de electrodos de pH y pCO2, el ingrediente activo selectivo de iones puede ser tridodecilamina (TDDA) o un componente sensible al pH adecuado. Para el electrodo de potasio, se puede usar un antibiotico monoclclico, tal como valinomicina, como el ingrediente activo. El electrodo de calcio emplea un componente sensible selectivo a los iones calcio como su ingrediente activo, tal como (-)- (R,R)-N,N'-(Bis(11-etoxicarbonil)undecil) )-N,N'-4,5-tetrametil-3,6-dioxaoctanodiamida; N,N'-[(4R,5R)-4, 5dimetil- 1, 8-dioxo-3, 6-dioxaoctametilen]-bis (12-metilamino-dodecanoato) de dietilo u otra sustancia selectiva sensible al calcio adecuada. El electrodo de sodio emplea ester de metilmonensina o cualquier otro ingrediente activo sensible al sodio adecuado. Los electrodos de sodio, potasio y calcio usan una sal tampon como MES (acido 2-[N-morfolino] etanosulfonico) junto con las respectivas sales de cloruro para su solucion interna.

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Los electrodos de pH y pCO2 comparten las mismas capas externas, mientras las capas internas difieren de manera significativa. La capa interna para pH usa un tampon fuerte, por ejemplo, tampon MES, mientras que para el electrodo de CO2 se usa un tampon de bicarbonato.

Todos los electrodos selectivos de iones, excepto el electrodo de CO2 funcionan mediante por la medicion del potencial entre el electrodo selectivo de iones y el electrodo 106 de referencia (figura 2), el cambio en potencial es directamente proporcional al cambio en el logaritmo de la actividad del ion medido.

El sensor de CO2 es una combinacion de electrodos de CO2 y pH trabajando juntos. En funcion se mide el potencial entre el electrodo de CO2 y pH. La superficie externa de ambos electrodos responde al pH de la misma manera y se anulan entre si. La superficie interna de la membrana de pH presenta un tampon alto con pH constante y no produce ningun cambio en el potencial medido. Sin embargo, para el CO2, la membrana es permeable libremente a CO2, que se disuelve en el tampon de bicarbonato cambiando su pH. Esto produce un cambio en la respuesta del potencial de la superficie interna de la membrana de CO2, que es el unico cambio para el potencial medido total. Asl, el potencial por los electrodos de CO2 y pH mide directamente la variacion en las concentraciones de CO2 de la muestra.

El procedimiento de hidratacion de la capa de sal interna en estos electrodos selectivos de iones se consigue remojando la superficie externa de las membranas externas en una solucion acuosa de sal, normalmente una solucion de reactivo de calibracion. La hidratacion, sin embargo, es un proceso muy lento, ya que el agua tiene que permear por la membrana externa hidrofoba en forma de vapor. El ciclado termico por temperaturas altas facilita el proceso. Durante el procedimiento de ciclado termico, la composicion y la integridad de las capas de la membrana permanecen intactos.

La hidratacion y calibracion de los electrodos sensibles de iones se lleva a cabo por etapas similares a las descritas para el electrodo de pO2. La hidratacion de un estado seco se puede acelerar remojando los sensores en una solucion electrolltica, tales como las soluciones de calibracion descritas anteriormente, y ciclando termicamente los sensores por una temperatura elevada mayor que la de uso normal. Por ejemplo, los sensores se empapan en la solucion B de calibracion a una temperatura entre 55 °C y 75 °C durante l5 minutos y despues se enfrlan a 37 °C. Los ciclos de calibracion empiezan tan pronto como la temperatura alcanza 37 °C. En una realizacion preferida, los sensores se empapan en una solucion de calibracion a una temperatura de 60 °C durante 12 minutos y despues enfrlan a 37 °C. Los ciclos de calibracion empiezan tan pronto como la temperatura vuelve a 37 °C.

Medicion del hematocrito

La medicion de hematocrito (Hct) se realiza por una medicion de la resistividad entre los hilos 98 y 100 de oro. El sensor opera midiendo la resistividad de la solucion o muestra de sangre colocada entre los electrodos. El hematocrito se calcula como una funcion de la resistividad usando la ecuacion de Maxwell.

Eliminacion de agentes de interferencia

La exposicion del electrodo 59 enzimatico a la muestra en el canal 56 de flujo produce que la membrana 60 de material compuesto retenga concentraciones residuales de sustrato de la muestra y productos de la reaccion enzimatica de la operacion del electrodo 59 enzimatico. Estas sustancias son ejemplos de los agentes de interferencia que causaran que el electrodo 59 enzimatico pierda exactitud y precision en la medicion del analito especlficamente deseado. Para regenerar la exactitud y precision para el electrodo 59 enzimatico, se eliminan agentes de interferencia de la membrana 60 de material compuesto del electrodo 59 enzimatico aplicando una amplitud adicional de polarizacion al hilo 57 del electrodo 59 enzimatico.

Se puede aplicar un pulso de polarizacion mediante una fuente electrica al hilo 57 despues de cada exposicion del electrodo 59 a una muestra para preparar el electrodo 59 para la siguiente medicion. Por ejemplo, peroxido de hidrogeno, un producto de la reaccion de la enzima y el analito de la operacion del electrodo 59, es un ejemplo de un agente de interferencia. Para retirar agentes de interferencia tales como peroxido de hidrogeno, se aplica una amplitud adicional de polarizacion al hilo 57 que produce oxidacion del agente de interferencia. La oxidacion del agente de interferencia hace que el agente de interferencia sea incapaz de afectar a la actividad electrica en el hilo 57 retirando de manera eficaz los agentes del electrodo 59. Los analitos, tales como glucosa y lactato, tambien constituyen agentes interferentes cuando las concentraciones residuales de glucosa y lactato permanecen en el electrodo 59 enzimatico entre lecturas de las muestras. Un pulso de polarizacion aplicado al hilo 57 oxida al analito residual y asl elimina la contribucion del analito residual entre muestras para mediciones de analito erroneas.

En una realizacion de acuerdo con la invencion, despues de que se completa la medicion de un analito en una muestra, el electrodo 59 enzimatico se regenera bombeando la muestra fuera del canal 56 de flujo y se bombea un volumen de solucion de lavado del deposito 17 por el canal 56 de flujo. Durante este tiempo, se superpone una polarizacion adicional sobre la polarizacion estable aplicada de manera continua a los electrodos 59 despues de una medicion de la muestra. La polarizacion se devuelve despues a su nivel de referencia y se introduce una solucion de calibracion en el canal 56 de flujo seguido por una calibracion de un punto para tener listo el electrodo 59 para la siguiente medicion.

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La suficiente amplitud y duracion del pulso de polarizacion requerido para la oxidacion del agente de interferencia se determina por la geometria del canal 56 de flujo. Se requieren amplitudes de pulso mayores y duraciones del pulso mas largas para un electrodo 59 con un canal 56 de flujo estrecho y un caudal lento de solucion de lavado. En una realizacion preferida ilustrada en la figura 3A, una amplitud de polarizacion de 0,4 V frente al electrodo de referencia integrado para una duracion de 50 segundos es suficiente para eliminar compuestos interferentes de la membrana 60 de material compuesto y mejorar de este modo la exactitud y la precision de las mediciones del electrodo 59. Una amplitud de la polarizacion en el intervalo de 0,1 a 0,8 V frente al electrodo de referencia integrado para una duracion de 10 a 200 segundos tambien puede ser suficiente.

Regeneracion de la membrana interna (rechazo de interferencias) de la membrana de material compuesto

Una etapa adicional para regenerar la funcion de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de la membrana 60 de material compuesto del sensor 59 enzimatico ilustrado, por ejemplo, en la figura 3B. Esta etapa incluye la regeneracion de la integridad y el funcionamiento apropiado de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de los electrodos enzimaticos. Dentro de la membrana 60 de material compuesto, ilustrada en la figura 3B, la restauracion de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna tiene lugar mediante la polimerizacion in situ de monomeros electropolimerizables sobre la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de la membrana 60 de material compuesto.

En una realizacion, los monomeros electropolimerizables estan en solucion en la solucion de calibracion AO en el recipiente 23 ilustrado en la figura 1. La solucion de calibracion AO se hace pasar a traves del canal 56 de flujo de la tarjeta 50 sensora ilustrada en la figura 3A. La solucion AO con los monomeros electropolimerizables pone en contacto el electrodo 59 enzimatico en la membrana 51 externa polimerica de la membrana 60 de material compuesto. Los monomeros electropolimerizables difunden primero por la membrana 51 externa y despues por la capa 53 enzimatica de la membrana 60 de material compuesto, hasta que los monomeros alcanzan la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de la membrana 60 de material compuesto. Un potencial electrico mayor que el valor basal, 0,5 v frente al electrodo de referencia integrado se aplica al hilo 57 durante 3 minutos, por ejemplo, lo que hace que los monomeros electropolimerizables se polimericen sobre la estructura polimerica existente de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de la membrana 60 de material compuesto. Despues de la polimerizacion de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna, se regeneran las propiedades aislantes de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Debido a que los monomeros electropolimerizables restantes en la solucion de calibracion ya no se exponen al potencial electrico, ya no puede tener lugar la polimerizacion de los monomeros.

La amplitud del potencial electrico y el periodo de tiempo del potencial elevado suficiente para regeneracion de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de la membrana 60 de material compuesto se determinan mediante la configuracion especifica del electrodo 59. La composition y la geometria concreta del electrodo afecta a la amplitud del potencial electrico y el periodo de tiempo requerido para la regeneracion completa de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Una membrana 60 de material compuesto de una composicion o geometria que disminuye la difusion de los monomeros del canal 56 de flujo a la membrana 55 de rechazo de interferencias interna requerira una amplitud de polimerizacion mayor para una mayor duracion de tiempo. Una polarizacion de aproximadamente 0,1 a 0,8 V frente al electrodo de referencia integrado aplicado durante aproximadamente 30 segundos a 1 hora es adecuada para la regeneracion al menos parcial de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Una vez que la regeneracion de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna es completa, la solucion AO en el canal 56 de flujo se reemplaza con solucion 17 de aclarado y se devuelve el potencial electrico al valor basal.

Operation de la solucion de referencia

Haciendo referencia a la figura 2, como se ha observado, la solucion de referencia llena el pozo 64 donde se pone en contacto con un hilo 106 de plata y se bombea a traves del canal 66 capilar para unir la salida de la linea de flujo principal. La solucion de referencia es esencialmente una solucion hipertonica de nitrato de potasio, con respecto a la sangre o las soluciones de calibracion y, de acuerdo con ello, el dominio del electrodo 106 de referencia constituye una union liquida de potencial estable entre el electrodo de referencia y la sangre o la solucion de calibracion, estableciendo de ese modo un entorno que es independiente de la actividad ionica de la sangre o de la solucion de calibracion.

Dado que la solucion de referencia une el canal de flujo principal aguas abajo de los electrodos, no afecta a las mediciones de ninguna manera. La solucion de referencia es de alta densidad y con fuerza de bombeo debe fluir hacia arriba contra la gravedad a la salida. Por tanto, cuando la bomba se detiene, en cuanto al equilibrado de los electrodos, la solucion de referencia permanece estacionaria en el pozo 64 de referencia y la section 66 capilar y tiende a no difundir en la solucion de calibracion o la sangre en el canal de flujo principal. Por tanto, el tubo 66 capilar debido al gradiente de densidad, actua como una valvula de una sola direction permitiendo que la solucion de referencia bombeada pase hacia arriba por el capilar pero evitando el paso inverso no deseado o el mezclamiento de la sangre o solucion de calibracion en el pozo de referencia.

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Conjunto de bloque calentador

En referenda a las figuras 7A-7G, el conjunto 39 de bloque calentador incluye un dispositivo 230 termoelectrico, un termistor 41, un bloque de aluminio que caracteriza dos carcasas 220a, 220b de aluminio, la interfaz 156 del electrodo, la placa 234 de metal, el disipador 236 de calor, las conducciones 229, 229', 231, 231', electricas y el cable 226. El bloque de aluminio aloja una tarjeta 10 sensora cuando el cartucho con la tarjeta sensora se inserta en el instrumento 8 de analisis de fluidos.

Haciendo referencia a la figura 7A, el conjunto 39 de bloque calentador de aluminio incluye dos carcasas 220a, 220b de aluminio que forman juntas una toma 222 en que se puede insertar una tarjeta 10 sensora (no mostrado). Como se ilustra en la figura 7B, la conexion 156 electrica situada en la toma 222 forma interfaz con los correspondientes conectores de borde en la tarjeta sensora ilustrada en, por ejemplo, la figura 5, para transmitir las senales desde los sensores. Un cable 226 conecta los conectores electricos de la tarjeta sensora a un microprocesador 40 por un talero 45 analogico (Vease la figura 1). Un tablero de circuito impreso (tablero analogico situado antes del procesador) controla los sensores y mide la salida del sensor. Los tableros de circuitos impresos dentro del conjunto de bloque calentador contienen postamplificadores que amplifican las senales del sensor en la tarjeta sensora. La salida de los sensores son senales analogicas. Las senales analogicas se convierten en senales digitales via un convertidor de analogico a digital y las senales digitales son transmitidas al microprocesador para almacenamiento, analisis y presentacion.

Haciendo referencia a la figura 7C, la superficie 221 interior de la carcasa 220b de aluminio entra en contacto con la placa 52 de metal de un cartucho 10 de sensores (vease la figura 2). En la superficie 223 externa de la carcasa 220b de aluminio, se situa un termistor 41 como se ilustra en la figura 7C. Extendiendose desde el termistor 41 estan las conexiones 229, 229' electricas que conectan el termistor 41 a un microprocesador 40.

En la parte de arriba de la superficie 223 externa de la carcasa 220b de aluminio y por el termistor 41, se coloca un dispositivo 230 termoelectrico ilustrado en la figura 7D. Los dispositivos termoelectricos en el conjunto de bloque calentador pueden usar, por ejemplo, el efecto Peltier, para calentar y enfriar el bloque de aluminio. Las derivaciones 231, 231' electricas suministran corriente electrica programada controlada mediante un microprocesador 40 al dispositivo 230 termoelectrico. La direccion y duracion de la corriente se controla mediante el microprocesador 40 y determina si el dispositivo 230 termoelectrico que recubre la carcasa 220b de aluminio esta en un modo de calentamiento o enfriamiento. La temperatura de la carcasa 220b de aluminio se mide mediante el termistor 41 que transmite senales al microprocesador 40. El microprocesador 40 esta programado para transmitir senales electricas al dispositivo termoelectrico, dependiendo las senales del termistor, para calentar o enfriar la carcasa 220b de aluminio que a su vez calienta, enfrla o mantiene la temperatura de una tarjeta sensora insertada en la toma 222. Cuando la corriente fluye en el dispositivo 230 termoelectrico en la direccion hacia delante, la placa 220b de metal se calienta y este calor es transmitido a la tarjeta sensora en la toma 222. Cuando la corriente fluye en la direccion inversa, la placa 220b de metal se enfrla y el efecto de enfriamiento es transmitido a la tarjeta sensora en la toma 222.

En referencia a las figuras 7D y 7E, la superficie 233 externa del dispositivo 230 termoelectrico esta en contacto con una placa 234 de metal. La superficie 235 externa de la placa 234 de metal esta en contacto con un disipador 236 de calor, ilustrado en la figura 7F.

La toma 222 del cartucho ensamblado, la carcasa 220b de aluminio, el termistor 41, el dispositivo 230 termoelectrico, la placa 234 de metal, el disipador 236 de calor y las derivaciones 229, 229' electricas del termistor 41 y las derivaciones 231, 231' electricas del dispositivo 230 termoelectrico al microprocesador 40 se ilustra en la figura 7G.

En una realization preferida del conjunto 39 de bloque calentador, la temperatura para un cartucho de sensores se puede aumentar desde aproximadamente 37 °C a aproximadamente 60 °C a 65 °C en un minuto, mantenido a 60 °C durante 12 minutos con solo 1,0 °C de fluctuation de la temperatura y enfriado a 37 °C desde 60 °C en aproximadamente dos minutos.

Operation inicial del conjunto

Haciendo referencia a la figura 1, cuando el cartucho con el conjunto 10 de sensores y las bolsas 14, 16 y 28 llenas se usan primero, la valvula 18 se controla para dirigir una de las soluciones de calibration, por ejemplo, la solution B de calibracion, al conjunto sensor, por lo que se llena completamente el canal de flujo. A continuation se detiene la bomba durante un perlodo de 10-30 minutos, preferentemente 12-15 minutos durante los cuales los electrodos sensores qulmicos secos se hidratan por ciclado termico, por ejemplo, de 37 °C a 60 °C y de nuevo a 37 °C.

En una realizacdion, el conjunto 10 de sensores de electrodos qulmicos, secos, se inserta en el sistema 8 de sensores electroqulmicos y la valvula 18 se controla por el microprocesador 40 para dirigir las soluciones B de calibracion al conjunto 10 de sensores. El conjunto 39 de bloques termicos se fija a una temperatura segun la cual la

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temperatura de la placa 52 termica es suficiente para calentar la solucion de calibracion en contacto con el sensor qulmico seco a una temperatura en un intervalo de 55 °C a 75 °C, preferentemente a 60 °C, durante 10-30 minutos, preferentemente 12 minutos. Despues del perlodo de tiempo especificado, el microprocesador 40 invierte el flujo de la corriente a traves del dispositivo termoelectrico para enfriar la placa 52 termica. La tarjeta 50 sensora y la solucion de calibracion en contacto con la placa 52 termica se enfrla a 37 °C. La temperatura, controlada mediante el microprocesador 40, se mantiene 37 °C durante la vida del cartucho 37. Despues de hidratacion de los sensores, el ciclo de acondicionamiento de los electrodos 59 enzimaticos empieza bombeando la solucion AO 23 a la tarjeta 50 sensora y remojando los electrodos 59 durante 1 a 6 minutos, preferentemente, durante 3 minutos mientras el potencial de polarizacion de los electrodos 59 enzimaticos se eleva de 0,25 a 0,5 V frente al electrodo de referencia integrado. Durante la exposicion de AO, se regenera la membrana 55 de rechazo de interferencias interna de los electrodos 59 enzimaticos, ilustrados en la figura 3B. Por otra parte, en este ciclo tambien se calibra el nivel de oxlgeno bajo. En la terminacion del ciclo de AO, el ciclo de aclarado empieza bombeando solucion de aclarado desde el recipiente 17 preenvasado el canal 56 de flujo por la bomba 26 peristaltica. Durante el ciclo de aclarado, el potencial de polarizacion de los electrodos 59 enzimaticos cambia desde 0,5 a 0,4 V para acelerar la eliminacion de los residuos AO de la membrana 55 de rechazo de interferencias interna. Despues de la terminacion del ciclo de aclarado, el potencial de polarizacion de los electrodos 59 enzimaticos disminuye de nuevo al nivel normal de aproximadamente 0,25 V frente al electrodo de referencia integrado. A continuacion, comienza un ciclo de calibracion con las soluciones A 14 y B 16. El cartucho 37 llega a estar listo para medicion de muestras en 30 minutos de la insercion del cartucho 37 en el sistema 8 de sensores electroqulmicos.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una membrana de material compuesto para un sensor enzimatico, que comprende:

   una capa de membrana interna que comprende una membrana polimerizable regenerable, estando la capa de membrana interna adaptada para funcionar como membrana de rechazo de interferencias; una capa de membrana externa basada en poliuretano, adaptada para su disposicion adyacente a un canal de flujo durante su uso; y

   una capa enzimatica dispuesta entre, y en contacto con, las capas interna y externa de la membrana, comprendiendo dicha capa enzimatica una matriz que comprende al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en creatinasa y sarcosina oxidasa, un agente de reticulacion y un estabilizante enzimatico seleccionado del grupo que consiste en polietilenimina, polipropilenimina, poli(N-vinilimidazol), polialilamina, polivinilpiridina, polivinilpirrolidona, polilisina y protamina,

   en la que la membrana externa esta adaptada para controlar la difusion de un analito en la capa enzimatica.
2. 2. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende creatininasa.
3. 3. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho sensor enzimatico comprende un electrodo electroqulmico.
4. 4. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho agente de reticulacion se selecciona del grupo que consiste en un dialdehldo, un diisocianato y un diepoxido; opcionalmente en la que dicho agente de reticulacion (a) comprende 1,4- diisocianatobutano o (b) se selecciona del grupo que consiste en 1,2,7,8- diepoxioctano y 1,2,9,10-diepoxidecano.
5. 5. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho agente de reticulacion comprende glutaraldehldo; opcionalmente, en la que dicho agente de reticulacion comprende aproximadamente 1-10 % de glutaraldehldo en peso; opcionalmente en la que dicho agente de reticulacion comprende aproximadamente 5 % de glutaraldehldo en peso.
6. 6. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la capa enzimatica tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 1 micrometro a aproximadamente 10 micrometres; opcionalmente, en la que la capa enzimatica tiene un espesor en el intervalo de 2 micrometres a 5 micrometres.
7. 7. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la capa de membrana externa comprende una mezcla de poliuretano que tiene diferentes niveles de absorcion de agua.
8. 8. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la capa de membrana externa tiene un espesor entre 8 micrometres y 15 micrometres.
9. 9. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el estabilizante enzimatico comprende un porcentaje en peso de la capa enzimatica que esta entre 1 % y 20 % de polietilenimina.
10. 10. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el estabilizante enzimatico es polietilenimina.
11. 11. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el estabilizante enzimatico es poli(N-vinilimidazol).
12. 12. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el estabilizante enzimatico comprende un porcentaje en peso de poli(N-vinilimidazol) entre 1 % y 20 %.
13. 13. La membrana de material compuesto de acuerdo con reivindicacion 1, en la que el estabilizante enzimatico comprende aproximadamente 5 % de poli(N-vinilimidazol) en peso.
14. 14. La membrana de material compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la membrana de polimerizacion regenerable se forma mediante la polimerizacion de monomeros electropolimerizables seleccionados del grupo que consiste en benzotiofeno, fenilendiaminas y fenoles.