ES2616092T3 - Clarificación de leche transgénica mediante el uso de filtración en profundidad. - Google Patents

Abstract

Un método para separar una proteína de interés de una corriente de alimentación que comprende leche de un mamífero transgénico, mediante un proceso de filtración en profundidad que separa una proteína de interés de dicha corriente de alimentación en función del tamaño de las partículas, donde el contenido de leche se combina 1:1 con sulfato de amonio 3,8M antes de llevar a cabo la filtración en profundidad.

Description

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bajo o cambiar rápidamente el entorno iónico o pH. El proceso típicamente emplea una membrana de microfiltración que se utiliza para extraer un producto de interés de una suspensión mientras se mantiene la concentración de la suspensión como una constante.

Corriente de alimentación El material bruto o disolución bruta proporcionado para un proceso o método que contiene una proteína de interés y que también puede contener diversos contaminantes incluidos microorganismos, virus y fragmentos celulares. Una

corriente de alimentación preferida de la presente invención es leche transgénica que contiene una proteína exógena de interés. Torta de filtración Sólidos retenidos y medios de filtración en el elemento de filtración. Flujo de filtrado (J) Representa la tasa en la que una porción de la muestra ha pasado a través de la membrana. Velocidad de flujo (V) La velocidad en la que el flujo pasa por la superficie de la membrana se considera la velocidad de flujo de fluido. El

flujo de producto se medirá a medida que se varíe la velocidad de flujo. La relación entre las dos variables permitirá determinar una ventana de operación óptima para el flujo. Fraccionamiento La separación de moléculas preferida basada en un resto físico o químico.

Capa de gel La capa microscópicamente delgada de moléculas que puede formarse sobre la parte superior de una membrana. Puede afectar la retención de moléculas por la obstrucción de la superficie de la membrana y reducir así el flujo del filtrado.

Clasificación del tamaño de los poros de la membrana (MPSR, por sus siglas en inglés)

Una clasificación del tamaño de los poros de la membrana, típicamente presentada como un valor en micrones, indica que las partículas más grandes que la clasificación serán retenidas por la membrana. Corte de peso molecular nominal (NMWCO, por sus siglas en inglés) La designación del tamaño (kilodaltons) para las membranas de ultrafiltración. El NMWCO se define como el peso

molecular de la proteína globular que se retiene en un 90 % en la membrana. Límites del peso molecular nominal (NMWL, por sus siglas en inglés) Un sistema de clasificación de membranas que indica que la mayoría de las macromoléculas disueltas con pesos

moleculares más altos que el NMWL y algunas con pesos moleculares más bajos que el NMWL serán retenidas por la membrana en cuestión.

Permeabilidad de agua normalizada (NWP, por sus siglas en inglés) La tasa de flujo de filtrado de agua establecida a una tasa de recirculación específica durante la limpieza inicial del dispositivo de TFF. Este valor se utiliza para calcular la recuperación de la membrana.

Microfiltración La microfiltración es un proceso de separación sólido-líquido a presión. Según la invención, las técnicas de

microfiltración son capaces de extraer sólidos suspendidos en el rango de 0,10-1,0 micrón. En comparación, la ultrafiltración se utiliza normalmente con sólidos en el rango de 0,01-0,10. Molécula de interés Partículas u otros especies de moléculas que se separarán de una disolución o suspensión en un fluido, por ej., un

líquido. Las partículas o moléculas de interés se separan del fluido y, en la mayoría de los casos, de otras partículas

o moléculas en el fluido. El tamaño de la molécula de interés que se separará determinará el tamaño del poro de la membrana que se utilizará. Preferiblemente, las moléculas de interés son de origen biológico o bioquímico o producidas mediante procesos transgénicos o in vitro e incluyen proteínas, péptido, polipéptidos, anticuerpos o 7 5

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fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de orígenes de corriente de alimentación preferidos incluyen leche de mamíferos, cultivo celular de mamíferos y cultivo celular de microorganismos tales como bacterias, hongos y levadura. Cabe señalar también que las especies que se extraerán por filtración incluyen polipéptidos, proteínas, componentes celulares, ADN, coloides, micoplasma, endotoxinas, virus, carbohidratos y otras moléculas de interés biológico no deseables, estén glicosiladas o no.

Prerrecubrimiento

Un prerrecubrimiento es una capa delgada, típicamente de entre 1,5 y 3,0 mm, de un auxiliar de filtración que se aplica al tabique antes del proceso de filtración real. En general no se necesita un prerrecubrimiento cuando se utiliza un filtro de profundidad como el tabique

Filtración de flujo tangencial

Un proceso en el que la mezcla de fluido que contiene los componentes que se separarán por filtración se recircula a velocidades tangenciales altas hacia el plano de la membrana para aumentar el coeficiente de transferencia de masa para la retrodifusión. En dichas filtraciones, se aplica una caída de presión a lo largo de la longitud de la membrana para provocar que el fluido y los solutos filtrables fluyan a través del filtro. Esta filtración se lleva a cabo de forma adecuada como un proceso en lotes así como un proceso de flujo continuo. Por ejemplo, se puede hacer pasar la disolución de forma repetida por la membrana mientras que dicho fluido que pasa a través del filtro se extrae de forma continua hacia una unidad separada o se pasa la disolución una vez por la membrana y el fluido que pasa a través del filtro se procesa de forma continua más adelante.

Recuperación

La cantidad de una molécula de interés que se puede recuperar tras el proceso. En general, se expresa como un porcentaje del material de partida o rendimiento.

Retenido

La porción de la muestra que no pasa a través de la membrana, también conocida como concentrado. El retenido se recircula durante la TFF.

La industria de productos biológicos muestra una preocupación creciente por la seguridad y pureza de los productos, así como el costo de las mercaderías. La utilización de DF, según la presente invención, es un método rápido, más económico y eficaz para la separación de biomoléculas. Se puede aplicar a una amplia gama de campos de la biología como la inmunología, química de proteínas, biología molecular, bioquímica y microbiología.

Cabe señalar también que los productos biofarmacéuticos manipulados genéticamente se purifican a partir de un sobrenadante que contiene una variedad de contaminantes diversos de la célula hospedadora. La cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (RP-HPLC, por sus siglas en inglés) es otro método que se puede utilizar para la purificación proteica dado que puede separar de forma eficaz especies moleculares que son excepcionalmente similares entre sí en términos de estructura o peso. Se han publicado procedimientos que utilizan RP-HPLC para muchas moléculas. McDonald y Bidlingmeyer, "Strategies for Successful Preparative Liquid Chromatography", PREPARATIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY, Brian A. Bidlingmeyer (Nueva York: Elsevier Science Publishing, 1987), tomo 38, págs. 1-104; Lee et al., Preparative HPLC. En el 8º Simposio de biotecnología, Pt. 1, 593-610 (1988). Sin embargo, a escala comercial la RP-HPLC no es tan rentable ni eficaz como la presente invención.

La presente invención proporciona los resultados de la clarificación de leche de cabra transgénica utilizando filtración de «extremo cerrado» o «filtración en profundidad». Hasta el uso de estas sales tampón específicas en la leche, la misma no se podría clarificar de forma eficaz utilizando DF debido a que el tamaño de la micela de caseína era demasiado pequeño para quedar retenido en estos filtros gruesos. Los filtros finos capaces de retener la caseína se obstruían rápidamente y no se podían utilizar con eficacia. Según una realización preferida de la presente invención, la leche de un animal lechero transgénico, una cabra, se purificó en un material a granel clarificado utilizando filtración en profundidad. La ventaja de la filtración en profundidad con respecto a la filtración de flujo tangencial es que no se necesita recirculación para la filtración del proceso. El líquido simplemente se bombea a través del sistema y el filtrado sale por la corriente posterior del filtro designado. Los elementos de filtro luego se desechan, eliminado así la necesidad de limpiar los filtros. Además, la leche que se clarifica utilizando filtración en profundidad se produce en una única etapa, en oposición al largo proceso de recirculación requerido por la filtración de flujo tangencial u otros esquemas de filtración. Se podrían aplicar también usos similares de las realizaciones de la presente invención para aislar una proteína de interés a partir de una corriente de alimentación de cultivo celular.

Etapas del proceso

Las etapas del proceso a partir de mamíferos transgénicos incluyen las siguientes:

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Según realizaciones preferidas de la presente invención, se llevaron a cabo pasadas de procesamiento de DF utilizando una cámara de prueba de 90 mm y un disco de medio de filtración. Los experimentos iniciales reconocieron cuatro grados diferentes de medios que variaban de 2,5um hasta 15um de «tamaño de poro». Tras seleccionar el grado ideal del medio, la leche clarificada se purificó y utilizó en la primera etapa del proceso de purificación a escala reducida. Los resultados de esta porción del experimento confirmaron que la tecnología es comparable con la leche clarificada más convencional que utiliza filtración en flujo tangencial.

Materiales y métodos

Materiales

Descripción

Número de pieza

• Cámara de prueba de 90 mm c/ manómetro

M90 PD

• Bomba Masterflex L/S (10-600RPM)

07524-40

• Tubería de silicona No. 14 Masterflex

96420-14

• Medio de filtración Ertel Elsop -2,5um

M453

• Medio de filtración Ertel Elsop -5um

M403

• Medio de filtración Ertel Elsop -10um

M103

• Medio de filtración Ertel Elsop -15um

M053

• Prefiltro malla 2mm

N/A

• Sulfato de amonio 3,8M, Fosfato sódico 0,2M,

pH 6,5

Leche de cabra transgénica

La leche transgénica se recogió por separado de cada una de las cabras transgénicas y se mantuvo a 4 -8 °C hasta 10 la clarificación (<4 días, a menos que se indique lo contrario).

Número de cabra

Fecha de recolección Temp. de almacenamiento

G0881

Ago. -Dic. 2005 4-8 °C

G0737

Ago. -Dic. 2005 4-8 °C

C248

Ago. -Dic. 2005 4-8 °C

C239

Ago. -Dic. 2005 4-8 °C

B121

Ago. -Dic. 2005 4-8 °C

Clarificación -Selección de medios

Se llevaron a cabo cuatro experimentos de clarificación separados utilizando filtración en profundidad (DF) con parámetros de funcionamiento similares. El objetivo de este experimento fue el de observar el efecto de los diferentes grados de los medios en la clarificación. Inicialmente se agregaron 150ml de leche al depósito de

15 alimentación desinfectado y se agregaron 150ml de sulfato de amonio 3,8M al depósito de tampón desinfectado del sistema de microfiltración (MF). A continuación se utilizaron una bomba de cabezal doble y un mezclador estático para mezclar las dos corrientes en relaciones iguales. Después se hizo pasar la mezcla a través del grado de medio seleccionado y se recogió el filtrado. La leche clarificada final se filtró de forma aséptica y se almacenó en una botella de PETG (siglas en inglés para tereftalato de polietileno modificado con glicol) a 4 °C.

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este método precipitan las micelas de caseína al tiempo que no crean una pérdida de producto siempre que la proteína de interés permanezca soluble.

Leche como corriente de alimentación

La leche puede ser el producto de un mamífero transgénico que contiene una sustancia biofarmacéutica u otra molécula de interés. En una realización preferida, el sistema se diseña de forma tal que sea altamente selectivo para la molécula de interés. La etapa de clarificación extrae la materia en partículas más grandes, tales como glóbulos de grasa y micelas de caseína de la corriente de alimentación de leche. Las etapas de concentración/fraccionamiento extraen la mayor parte de las moléculas pequeñas, incluidas la lactosa, minerales y agua, para aumentar la pureza y reducir el volumen del producto. El producto del proceso DF a continuación se concentra hasta un nivel adecuado para una purificación posterior óptima y una estabilidad general del producto. Este producto concentrado, que contiene las moléculas de interés, a continuación se filtra de forma aséptica para garantizar una carga biológica mínima (es decir, endotoxina) y mejorar la estabilidad de la molécula de interés durante períodos de tiempo prolongados. Según la realización preferida de la presente invención, el producto a granel tendrá una pureza de entre 35 % y 65 % y pueden contener componentes tales como anticuerpos de cabra (tales como cabras transgénicas), proteínas de lactosuero (β Lactoglobulina, α Lactalbúmina y BSA) así como niveles bajos de grasa y caseína residuales. Este producto parcialmente purificado es un material de alimentación de partida ideal para técnicas cromatográficas convencionales posteriores para seleccionar y aislar adicionalmente las moléculas de interés que podrían incluir, sin limitación, una proteína recombinante producida en la leche, una inmunoglobulina producida en la leche o una proteína de fusión.

Según la presente invención, se demuestra el objetivo de separar la proteína de interés de las proteínas contaminantes utilizando DF. La meta de esta clarificación es retener la grasa, caseína y proteínas precipitadas no deseadas mientras pasa el producto soluble y las proteínas de la leche. Los resultados de RPC y SDS gel muestran de forma concluyente que los componentes contaminantes de la leche se pueden reducir de forma eficaz durante la clarificación. Se extrae todo excepto el producto y las proteínas de la leche solubles de forma eficaz utilizando el filtro de DF de 5µm y los métodos de la invención.

Clasificación del tamaño de los poros de la membrana (MPSR, por sus siglas en inglés)

El tamaño de poro de DF y la condición del tampón de la leche tienen un rol importante en la eficacia de la clarificación. Se evaluaron diversos tamaños de poro de DF incluidos 2,5µm, 5.0µm, 10µm y 15µm. Si el tamaño del poro es demasiado pequeño como en el caso de 2,5µm, el rendimiento y el flujo disminuyen, sin embargo, la claridad del permeado es buena. Se evaluó la calidad, rendimiento y flujo del permeado de cada tamaño de poro mayor. Los filtros de 2,5µm, 5,0µm, 10µm retuvieron todos la mayor parte de la grasa y los componentes de la leche precipitados. El filtro de 15µm no se pudo utilizar de forma eficaz para esta filtración dado que la calidad del permeado era más baja y una porción de la grasa pasó a través de la membrana creando un permeado opacificado. El filtro de 5,0µm exhibió el mejor rendimiento, flujo y calidad de permeado inicialmente y después de la optimización. El tamaño del poro de este filtro resultó ser el tamaño más grande que se puede utilizar, que aún es capaz de retener los contaminantes de la leche insolubles.

En relación con las Figuras 2A-2D, las mismas demuestran la resistencia del filtro y el rendimiento volumétrico de acuerdo con la realización preferida de la invención.

En relación con la Figura 3, se proporciona una SDS PAGE no reducida que confirma que la mayor parte de la rhAT se recuperó en el filtrado de cada uno de los experimentos según la presente invención. También cabe señalar la similitud entre cada una de las corrientes de filtrado (Fig. 3).

Clarificación / Purificación

En relación con la Figura 4, luego de elegir el filtro grado M403 (5,0µm) para la filtración en profundidad/clarificación de la leche entera, se agruparon varios lotes, se concentraron y se diafiltraron utilizando una membrana de ultrafiltración de 30kD. Esta muestra agrupado luego se purificó utilizando una columna de heparina de 16ml. La leche clarificada de la presente clarificación de 500 K y el proceso de TFF doble con 0,1 µm también se compararon. En la Fig. 11, la SDS PAGE muestra que los carriles 2, 7 y 11 contienen la fracción de elución de rhAT purificada. Tal como se puede observar, cada una es similar en composición excepto la del carril 11 donde se puede observar un aglomerado. Este aglomerado fue más evidente en la muestra de TFF doble con 0,1um.

En los datos para la invención proporcionados en la presente se muestra que la clarificación utilizando filtración en profundidad es fiable y puede optimizar la purificación de varias moléculas a partir de una corriente de alimentación de leche. Se señala que según las realizaciones preferidas de la presente invención, los procesos son ampliables, económicos y tienen un rendimiento de producto alto sostenido (>90 %).

Otros datos indican que la ampliación del disco de 90mm a un cartucho lenticular de 1,1pies2 mejora la eficacia del proceso global. Este cartucho tendrá el potencial de clarificar 3 litros de leche entera.

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Procesamiento de la leche

Según los métodos de la presente invención, es preferible si la temperatura de la leche se eleva hasta 15-25 °C después de agruparla. La leche se agrupa en un depósito y se prepara un volumen igual de tampón de sal en un segundo depósito. A continuación se conectan los dos depósitos a una bomba y un mezclador estático en línea. Luego de conectar el conducto de corriente de alimentación al elemento de filtro, la bomba se enciende para combinar la leche y el tampón antes de la filtración. El uso del mezclador estático es importante dado que el tiempo de mezclado y resonancia es uniforme a lo largo de toda la filtración. Mezclar la leche y el tampón en un tanque a granel antes de la filtración es menos deseable dado que el tiempo que la mezcla descansa antes de la filtración es variable. La bomba se ajusta hasta la tasa de flujo deseada en función del flujo promedio de 50LMH. Después de 5 minutos, se toma(n) la(s) muestras(s) de permeado inicial(es) y se verifican las presiones críticas y las tasas de flujo. La DF se lleva a cabo a 50LMH con menos de 15psi de presión de transmembrana a lo largo de la filtración. La temperatura de la leche debe permanecer en 20 °C ± 5. Luego de que se haya consumido el volumen total de leche y tampón, se agrega un volumen de tampón igual al 10 % del volumen de leche de partida al filtro para garantizar que la mayor parte de la proteína soluble haya pasado al permeado.

Tras finalizar la filtración, el recipiente de recolección del permeado se desconecta, los filtros se desechan y el sistema se drena y limpia. El permeado clarificado de DF se filtra de forma aséptica y se almacena a 4 °C antes de la purificación posterior.

Producción de animal transgénico

Otros problemas afectan el rendimiento global de cualquier proceso de fabricación que incluye mamíferos transgénicos: estabilidad de las construcciones, control de la expresión y variaciones estacionales en la lactación, entre otros. Una comprensión cabal de la salud y fisiología de las especies de ganado utilizadas es esencial dado que un animal transgénico puede vivir durante 7-10 años y experimentará cambios fisiológicos y diversos entornos a lo largo de su vida a medida que se desarrolla, pare y en última instancia lacta. Los procesos de recuperación deben ser suficientemente sólidos para manejar dichos cambios, pero si los avances en nuestra comprensión de la composición de la leche y las técnica de bioprocesamiento continúan, dichos desafíos se superarán también.

Según la presente invención, la extracción de una molécula de interés de una corriente de alimentación dada en preparación para uso por un usuario final se podría concluir con una serie de etapas de purificación adicionales. En general, se prefiere un proceso de múltiples etapas, pero no es necesario. Un proceso de dos o tres etapas de ejemplo consistiría en un filtro(s) grueso(s) para extraer el precipitado grande y restos celulares, posteriormente se procedería a una segunda etapa de pulido con un filtro(s) con tamaños de poro nominales mayores que 0,2 micrones pero menores que 1 micrón. La combinación óptima será una función de la distribución del tamaño del precipitado así como otras variables. Además, las operaciones de una sola etapa que emplean un filtro relativamente estrecho o centrifugación producen también un producto de buena calidad. Desde un punto de vista más general, cualquier enfoque de clarificación que incluye filtración de extremo cerrado, microfiltración, centrifugación o alimentación de relleno de auxiliares de filtración (por ejemplo, tierra de diatomeas) en combinación con filtración de extremo cerrado o en profundidad, que proporcionan un filtrado de claridad adecuada para no provocar incrustaciones en la membrana y/o resina en las etapas posteriores, será aceptable para poner en práctica dentro de la presente invención.

Protocolos de limpieza y almacenamiento

La limpieza de los filtros DF no es necesaria ya que son desechables; es una de las ventajas obvias con respecto a sistemas reutilizables que requieren un gran volumen de disolución de limpieza y agua. Luego de finalizar la filtración, los elementos de filtración se extraen y desechan. A continuación, el alojamiento del filtro, el recipiente de alimentación y la bomba son los únicos componentes que requieren limpieza. Se ha demostrado que un ciclo de treinta (30) minutos con hidróxido de sodio 0,5M y posteriormente ácido cítrico 0,3M es eficaz cuando se limpian componentes de acero inoxidable en la industria lechera. Luego de finalizar el ciclo de limpieza, los componentes se enjuagan con agua y los filtros se vuelven a instalar antes del siguiente uso.

Producción recombinante

Una cantidad creciente de proteínas recombinantes se están desarrollando para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Sin embargo, muchas de estas proteínas pueden resultar costosas o difíciles de producir en una forma funcional y/o en las cantidades necesarios mediante el uso de métodos convencionales. Los métodos convencionales implican la inserción de un gen responsable de la producción de una proteína específica en células hospedadoras tales como bacterias, levadura o células de mamíferos, p. ej., células COS o CHO y luego el cultivo de las células en medios de cultivo. A continuación, las células cultivadas sintetizan la proteína deseada. Los sistemas tradicionales de bacterias o levadura pueden no ser capaces de producir muchas proteínas complejas en una forma funcional. Aunque las células de mamíferos pueden reproducir proteínas complejas, en general su cultivo es difícil y costoso y a menudo producen solo cantidades en mg/L de la proteína. Además, las proteínas no

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