ES2616129T3 - Combinaciones de marcadores moleculares en cáncer de próstata que proporcionan una herramienta para diagnóstico con mejor sensibilidad/especificidad - Google Patents
Combinaciones de marcadores moleculares en cáncer de próstata que proporcionan una herramienta para diagnóstico con mejor sensibilidad/especificidad Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la determinación in vitro cáncer de próstata de alto grado en una muestra de orina o derivada de orina procedente de un individuo humano que se sospecha que padece cáncer de próstata, que comprende: - determinar los niveles de expresión de DLX1 y HOXC6; y - determinar el aumento del nivel de expresión de DLX1 y HOXC6 en comparación con los niveles de expresión de DLX1 y HOXC6 en una muestra procedente de un individuo que no padece cáncer de próstata o en comparación con un valor de referencia indicador de un nivel de expresión sin enfermedad; por lo que, basándose en el aumento de los niveles de expresiónDLX1 y HOXC6, proporcionar dicha determinación del cáncer de próstata de alto o bajo grado en dicha muestra.
Description
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DESCRIPCION
Combinaciones de marcadores moleculares en cancer de prostata que proporcionan una herramienta para diagnostico con mejor sensibilidad/especificidad
La presente invencion se refiere a metodos para probar in vitro o diagnosticar, el cancer de prostata de alto grado o bajo grado en una muestra, preferiblemente en una muestra facilmente obtenible tal como una muestra de orina, una muestra de lfquido prostatico o eyaculacion o una muestra procesada o una de sus muestras derivadas, procedentes de individuos humanos que se sospecha que padecen cancer de prostata mediante el analisis del nivel de expresion de una combinacion de dos o tres marcadores moleculares para el cancer de prostata. La presente invencion se refiere ademas al uso en el analisis de nivel de expresion de estos marcadores combinados para probar in vitro el cancer de prostata de alto grado o bajo grado.
En la poblacion masculina occidental, el cancer de prostata se ha convertido en un importante problema de salud publica. En muchos pafses desarrollados no solo es la neoplasia maligna mas comunmente diagnosticada, sino que es tambien la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cancer en varones. Debido a que la incidencia del cancer de prostata aumenta con la edad, el numero de casos recien diagnosticados continua aumentando a medida que aumenta la esperanza de vida de la poblacion general. En los Estados Unidos, aproximadamente 218.000 hombres, y en Europa aproximadamente 382.000 hombres son diagnosticados con cancer de prostata cada ano.
Los estudios de epidemiologfa demuestran que el cancer de prostata es una enfermedad indolora y que mueren mas hombres con cancer de prostata que de el. Sin embargo, una fraccion significativa de los tumores se comportan agresivamente y como resultado aproximadamente 32.000 hombres americanos y aproximadamente 89.000 hombres europeos mueren de esta enfermedad anualmente.
La alta tasa de mortalidad es una consecuencia del hecho de que no hay opciones curativas terapeuticas para el cancer de prostata metastasico. La ablacion androgenica es el tratamiento de eleccion en hombres con enfermedad metastasica. Inicialmente, del 70 al 80% de los pacientes con enfermedad avanzada presentan respuesta a la terapia, pero con el tiempo la mayona de los tumores se vuelven independientes de los androgenos. Como resultado la mayona de los pacientes desarrollaran enfermedad evolutiva.
Dado que no hay opciones terapeuticas eficaces para el cancer de prostata avanzado, la deteccion temprana de este tumor es fundamental y puede aumentar la tasa de exito curativo. Aunque el uso rutinario de la comprobacion del antfgeno espedfico de la prostata (PSA) ha aumentado indudablemente la deteccion del cancer de prostata, uno de sus principales inconvenientes ha sido la falta de especificidad.
El PSA serico es un excelente marcador para las enfermedades prostaticas e incluso elevaciones modestas casi siempre reflejan una enfermedad o perturbacion de la glandula prostatica que incluidas la hiperplasia prostatica benigna (HPB) y la prostatitis. Desde la aparicion de la comprobacion frecuente del PSA hace mas de 20 anos, la especificidad de PSA para el cancer ha disminuido debido a la seleccion de un gran numero de hombres que han elevado el PSA debido a mecanismos no cancerosos. Esto da lugar a una alta tasa de biopsias negativas.
Por lo tanto, se necesitan urgentemente analisis moleculares (no invasivos) que puedan identificar con precision a aquellos hombres que tienen cancer de prostata clmicamente localizado, en fase incipiente, y que obtendnan supervivencia prolongada y calidad de vida a partir de la intervencion radical temprana. Los biomarcadores moleculares identificados en los tejidos pueden servir como objetivo para nuevos analisis moleculares basados en lfquidos corporales.
Un biomarcador adecuado cumple preferiblemente los siguientes criterios:
1) debe ser reproducible (en y entre hospitales); y
2) debe tener un impacto en el tratamiento clmico. Ademas, para el diagnostico, es importante que los biomarcadores se evaluen en cuanto a su especificidad Idstica y potencial de discriminacion entre cancer de prostata, prostata normal y HPB. Ademas, cabe esperar que los ensayos (multiples) basados en biomarcadores mejoren la especificidad para la deteccion del cancer.
Teniendo en cuenta lo anterior, hay necesidad urgente de biomarcadores moleculares de pronostico para predecir el comportamiento biologico del cancer de prostata y el resultado.
Para la identificacion de nuevos marcadores experimentales para el cancer de prostata, es necesario estudiar patrones de expresion tanto en tejidos de prostata malignos asf como no malignos, preferiblemente en relacion con otros datos medicos.
Los avances recientes en el campo de las tecnicas moleculares han proporcionado nuevas herramientas que
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permiten la evaluacion tanto de las alteraciones genomicas como proteomicas en estas muestras de una manera comprensiva y rapida. Estas herramientas han llevado al descubrimiento de muchos nuevos biomarcadores prometedores para el cancer de prostata. Estos biomarcadores pueden ser instrumentales en el desarrollo de nuevas pruebas que tienen una gran especificidad en el diagnostico y el pronostico del cancer de prostata.
Por ejemplo, la identificacion de diferentes anomalfas cromosomicas como cambios en el numero de cromosomas, translocaciones, eliminaciones, reordenamientos y duplicaciones en las celulas pueden estudiarse mediante el analisis de hibridacion in situ por fluorescencia (FISH). La hibridacion genomica comparada (HGC) es capaz de identificar todo el genoma por grandes cambios en el numero de copias de secuencias de ADN o eliminaciones mayores de 10 pares de megabases.
El analisis de presentacion diferencial, el analisis en serie de la expresion genica (SAGE), las matrices de oligonucleotidos y las matrices de ADNc caracterizan los conjuntos de caractensticas de expresion genica. Estas tecnicas se utilizan a menudo combinadas con chips de tejidos (TMA) para la identificacion de genes que desempenan una funcion importante en procesos biologicos espedficos.
Dado que las alteraciones geneticas a menudo conducen a protemas mutadas o alteradas, las vfas de senalizacion de una celula pueden verse afectadas. Eventualmente, esto puede conducir a una ventaja de crecimiento o supervivencia de una celula cancerosa. La proteomica estudia la identificacion de protemas alteradas en relacion con su estructura, cantidad y modificaciones tras la traduccion. Las protemas relacionadas con la enfermedad pueden secuenciarse directamente e identificarse en secciones intactas de tejido completo utilizando desorcion- ionizacion mediante laser asistida por matriz acoplada a un espectrometro de masas en tiempo de vuelo (MALDI- TOF). Ademas, la espectrometna de masas (MS) en tiempo de vuelo mediante desorcion-ionizacion por laser mejorado de superficie (SELDI)-TOF puede proporcionar un rapido conjunto de caractensticas de expresion de protemas de celulas de tejidos y lfquidos corporales como el suero o la orina.
En los ultimos anos, estas herramientas moleculares han conducido a la identificacion de centenares de genes que se cree que son relevantes en el desarrollo de cancer de prostata. No solo estos hallazgos han conducido a un mayor conocimiento en el comienzo y la evolucion del cancer de prostata, sino que tambien han demostrado que el cancer de prostata es una enfermedad heterogenea.
Varios tumores de prostata pueden ocurrir en la prostata de un solo paciente debido a la naturaleza multifocal de la enfermedad. Cada uno de estos tumores puede presentar diferencias notables en la expresion genica y el comportamiento que estan asociadas a diferentes pronosticos. Por lo tanto, en la prediccion del resultado de la enfermedad es mas probable que un conjunto de diferentes marcadores llegue a ser cimicamente importante.
Los biomarcadores pueden clasificarse en cuatro episodios espedficos del cancer de prostata: alteraciones genomicas, procesos biologicos espedficos del cancer de prostata, modificaciones epigeneticas y genes expresados unicamente en el cancer de prostata.
Uno de los factores de riesgo epidemiologico mas fuertes para el cancer de prostata son unos antecedentes familiares positivos. Un estudio de 44.788 pares de gemelos en Dinamarca, Suecia y Finlandia ha demostrado que el 42% de los casos de cancer de prostata fueron atribuibles a la herencia. En hermanos de los pacientes afectados se ha observado un riesgo consecuentemente mayor de la enfermedad en comparacion con los hijos de los mismos pacientes. Esto ha llevado a la hipotesis de que hay un componente genetico relacionado con el cromosoma X o recesivo involucrado en el riesgo de cancer de prostata.
Las exploraciones del genoma completo en familias afectadas implicaron al menos siete locus de sensibilidad al cancer de prostata, HPC1 (lq24), CAPB (lp36), PCAP (lq42), ELAC2 (17p11), HPC20 (20q13), 8p22-23 y HPCX (Xq27-28). Recientemente, tres genes de cancer de prostata hereditario experimentales se han cartografiado para estos locus, ribonucleasa L (RNASEL) dependiente de HPC1/2'-5'-oligoadenilato en el cromosoma 1q24-25, el gen del fagocito 1 macrofago (MSR1) situado en el cromosoma 8p22-23 y HPC2/ELAC2 en el cromosoma 17p11.
Se ha estimado que los genes con sensibilidad para el cancer de prostata probablemente representan solo el 10% de los casos de cancer de prostata hereditario. Los canceres de prostata familiar estan mas probablemente relacionados con factores ambientales compartidos o con variantes geneticas o polimorfismos mas frecuentes. Dado que dichas variantes pueden ocurrir a altas frecuencias en la poblacion afectada, su impacto en el riesgo de cancer de prostata puede ser sustancial.
Recientemente, los polimorfismos en los genes que codifican el receptor de androgeno (RA), 5a-reductasa de tipo II (SRD5A2), CYP17, CYP3A, receptor de vitamina D (RVD), PSA, PGT-T1, PGT-M1, PGT-P1, Factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) y protema de union a IGF 3 (IGFBP3).
Estos estudios se realizaron para comprobar si estos genes pueden predecir la presencia de cancer de prostata en pacientes indicados para biopsias de prostata debido a niveles de PSA > 3 ng/ml. No se encontraron relaciones entre los genotipos Ra, SRD5A2, CYP17, CYP3A4, VDR, PGT-M1, PGT-P1 e IGFBP3 y el riesgo de cancer de
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prostata. Solo se encontro que los polimorfismos PGT-T1 e IGF-I estaban modestamente relacionados con el riesgo de cancer de prostata.
A diferencia del gen adenomatoso de poliposis coli (APC) en el cancer de colon familiar, ninguno de los genes y locus con sensibilidad al cancer de prostata mencionados es por sf mismo responsable de la mayor parte de los canceres de prostata.
Los estudios epidemiologicos apoyan la idea de que la mayona de los canceres de prostata se pueden atribuir a factores como la raza, el estilo del vida y la dieta. La funcion de las mutaciones genicas en oncogenes conocidos y genes supresores de tumores es probablemente muy pequena en el cancer de prostata primario. Por ejemplo, la frecuencia de las mutaciones de p53 en el cancer de prostata primario es baja, pero se ha observado en casi el 50% de los canceres de prostata avanzados.
El cribado en hombres para detectar la presencia de mutaciones de genes espedficos del cancer o polimorfismos es largo y costoso. Ademas, es muy ineficaz en la deteccion de canceres de prostata primarios en la poblacion masculina general. Por lo tanto, no se puede aplicar como una prueba de cribado del cancer de prostata
El ADN mitocondrial esta presente en aproximadamente 1.000 a 10.000 copias por celula. Debido a estas cantidades, las mutaciones del ADN mitocondrial se han utilizado como objetivo para el analisis de plasma y ADN serico de pacientes con cancer de prostata. Recientemente, se detectaron mutaciones del ADN mitocondrial en tres de cada tres pacientes con cancer de prostata que teman las mismas mutaciones en el ADN mitocondrial en su tumor primario. Deben estudiarse diferentes muestras de tumores urologicos y se necesitan grupos de pacientes mas grandes para definir la sensibilidad del diagnostico general de este metodo.
Alteraciones cnticas en la expresion genica pueden conducir a la evolucion del cancer de prostata. Las alteraciones microsatelites, que son secuencias de ADN polimorficas repetitivas, aparecen con frecuencia como perdida de heterozigosidad (PDH) o como inestabilidad microsatelite. Se conocen alteraciones microsatelites definidas en el cancer de prostata. La utilidad clmica hasta ahora es insignificante. Todo el genoma y las matrices de SNP se consideran poderosas herramientas de descubrimiento.
Alteraciones en el ADN, sin cambiar el orden de las bases en la secuencia, a menudo conducen a cambios en la expresion genica. Estas modificaciones epigeneticas incluyen cambios tales como la metilacion del ADN y la acetilacion/desacetilacion de histonas. Muchos activadores de genes contienen regiones ricas en GC tambien conocidas como islas CpG. La metilacion anormal de las islas CpG da lugar a una disminucion de la transcripcion del gen en el ARNm.
Recientemente, se ha sugerido que el estado de metilacion del ADN puede ser influenciado en la juventud por exposiciones ambientales, tales como factores nutricionales o estres, y que esto conduce a un mayor riesgo de cancer en adultos. Se han observado cambios en los tipos de metilacion del ADN en muchos tumores humanos. Para la deteccion de la hipermetilacion del activador se utiliza una tecnica denominada PCR espedfica de metilacion (MSP). A diferencia del analisis microsatelite o PDH, esta tecnica requiere una relacion tumoral a normal de solo 0,10,001%. Esto significa que utilizando esta tecnica, se pueden detectar alelos hipermetilados del ADN tumoral en presencia de cantidades en exceso de 104-105 de alelos normales.
Por lo tanto, la metilacion del ADN puede servir como marcador util en la deteccion del cancer. Recientemente, ha habido muchos informes sobre los genes hipermetilados en el cancer de prostata humano. Dos de estos genes son RASSF1A y PGTP1.
La hipermetilacion de RASSF1A (isoforma A de protema de la familia con dominio de asociacion ras) es un fenomeno corriente en el cancer de mama, cancer de rinon, cancer de fngado, cancer de pulmon y cancer de prostata. El crecimiento de celulas cancerosas humanas puede reducirse cuando se reexpresa RASSF1A. Esto apoya un papel de RASSF1A como gen supresor de tumores. Inicialmente no se detecto hipermetilacion de RASSF1A en el tejido prostatico normal. Recientemente, se observo la metilacion del gen RASSF1A tanto en neoplasias intraepiteliales prostaticas premalignas como en epitelios prostaticos benignos. Se ha observado hipermetilacion de RASSF1A en el 60-74% de los tumores de prostata y en el 18,5% de las muestras de HBP. Ademas, la frecuencia de metilacion esta claramente asociada con la puntuacion de Gleason elevada y la fase. Estos hallazgos sugieren que la hipermetilacion de RASSF1A puede distinguir los tumores mas agresivos de los indoloros.
La alteracion epigenetica mas descrita en el cancer de prostata es la hipermetilacion del activador de la glutation S- transferasa P1 (PGTP1). PGTP1 pertenece al sistema de proteccion celular contra los efectos toxicos y como tal esta enzima esta implicada en la desintoxicacion de muchos xenobioticos.
La hipermetilacion de PGTP1 se ha descrito en aproximadamente el 6% de las lesiones de atrofia inflamatoria proliferativa (AIP) y en el 70% de las lesiones de NPl. Se ha demostrado que algunas lesiones de AIP se fusionan directamente con NPI y las lesiones incipientes de carcinoma, aunque son necesarios mas estudios para confirmar
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estos hallazgos. Se ha detectado hipermetilacion de PGTP1 en mas del 90% de los tumores de prostata, mientras que no se ha observado hipermetilacion en HBP y tejidos prostaticos normales.
La hipermetilacion del gen PGTP1 se ha detectado en el 50% de eyaculaciones de pacientes con cancer de prostata, pero no en hombres con HBP. Debido al hecho de que las eyaculaciones no siempre se obtienen facilmente de pacientes con cancer de prostata, la hipermetilacion de PGTP1 se determino en sedimentos de orina obtenidos de pacientes con cancer de prostata despues de un masaje de prostata. Se pudo detectar cancer en el 77% de estos sedimentos.
Por otra parte, la hipermetilacion de PGTP1 se ha encontrado en los sedimentos de orina despues del masaje de prostata en el 68% de los pacientes con enfermedad incipiente confinada, el 78% de los pacientes con enfermedad localmente avanzada, el 29% de los pacientes con NPI y el 2% de los pacientes con hBp. Estos hallazgos dieron lugar a una especificidad del 98% y una sensibilidad del 73%. El valor diagnostico negativo de esta prueba fue de 80%, lo que demuestra que este ensayo tiene un gran potencial para reducir el numero de biopsias innecesarias.
Recientemente, se confirmaron estos resultados y se observo una mayor frecuencia de PGTP1 metilacion en la orina de los hombres con enfermedad en fase 3 en comparacion con la fase 2.
Debido a que la hipermetilacion de PGTP1 tiene una alta especificidad para el cancer de prostata, la presencia de hipermetilacion de PGTP1 en sedimentos de orina de pacientes con biopsias negativas (33%) y pacientes con atipia o NPI en alto grado (67%) sugiere que estos pacientes pueden tener cancer de prostata oculto.
Recientemente, se probo un ensayo multiplexado consistente en 3 marcadores de metilacion, PGTP1, RARB, APC y una referencia endogena en muestras de orina de pacientes con concentraciones en el suero de PSA > 2,5 pg/l. Se observo una buena correlacion de PGTP1 con el numero de nucleos positivos de cancer de prostata en la biopsia. Ademas, las muestras que conteman metilacion para PGTP1 o RARB se correlacionaron con mayores volumenes tumorales. Los genes metilados tienen el potencial para proporcionar una nueva generacion de biomarcadores de cancer.
Los estudios con chips han sido muy utiles e informativos para identificar genes que aumentan o disminuyen constantemente en el cancer de prostata en comparacion con el tejido benigno de prostata. Estos genes pueden proporcionar biomarcadores espedficos del cancer de prostata y nos dan mas informacion sobre la etiologfa de la enfermedad.
Para el diagnostico molecular del cancer de prostata, los genes que aumentan mucho en el cancer de prostata en comparacion con la expresion baja o normal en el tejido prostatico normal son de especial interes. Dichos genes podnan permitir la deteccion de una celula tumoral en un fondo enorme de celulas normales, y por lo tanto podna aplicarse como un marcador de diagnostico en la deteccion del cancer de prostata.
El analisis de expresion genica diferencial se ha utilizado con exito para identificar biomarcadores espedficos de cancer de prostata al comparar tejidos de prostata malignos con no malignos. Recientemente, se utilizo un nuevo metodo bioestadfstico denominado analisis del conjunto de caractensticas atfpicas de cancer (COPA) para identificar genes que se expresan diferencialmente en un subconjunto de canceres de prostata. COPA identifico fuertes caractensticas atfpicas para oncogen E26 del virus de la eritroblastosis v-ets (ERG) y el gen 1 variante de ets (ETV1) en el 57% de los casos de cancer de prostata. Esto estaba en concordancia con los resultados de un estudio donde la sobreexpresion ERG asociada al cancer de prostata se encontro en el 72% de los casos de cancer de prostata. En > 90% de los casos que sobreexpresaron ERG o ETV1 se encontro una fusion de la region 5' no traducida de la prostata espedfica y del gen serina proteasa de la transmembrana regulado por androgeno (TMPRSS2) con estos miembros de la familia ETS. Recientemente, se ha descrito otra fusion entre TMPRSS2 y un miembro de la familia ETS, la fusion TMPRSS2-ETV4, aunque esta fusion se encuentra esporadicamente en los canceres de prostata.
Ademas, se encontro una fusion de TMPRSS2 con ETV5. Se demostro que la sobreexpresion de ETV5 in vitro induda un programa invasivo de transcripcion. Estas fusiones pueden explicar la sobreexpresion aberrante dependiente de androgenos de los miembros de la familia ETS en subconjuntos de cancer de prostata porque TMPRSS2 esta regulado por androgenos. El descubrimiento de la fusion del gen TMPRSS2-ERG y el hecho de que el ERG es el proto-oncogen mas frecuentemente sobreexpresado descrito en celulas epiteliales malignas de la prostata sugiere su papel en la tumorigenia de prostata. Fusiones de la region 5' no traducida del gen TMPRSS2 con los factores de transcripcion de ETS ERG, ETV1 y ETV4 se han descrito en el cancer de prostata.
Recientemente, se demostro que la deteccion no invasiva de transcritos de fusion TMPRSS2-ERG es factible en sedimentos de orina obtenidos despues del ERD utilizando un ensayo de investigacion basado en RT-PCR. Debido a la alta especificidad del ensayo (93%), la combinacion de transcritos de fusion TMPRSS2-ERG con el gen 3 del cancae de prostata (PCA3) mejoro la sensibilidad desde el 62% (PCA3 solo) al 73% (combinado) sin comprometer la especificidad para detectar cancer de prostata.
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Se ha descubierto que el gen que codifica la a-metilacil-CoA racemasa (AMACR) en el cromosoma 5p13 aumenta constantemente en el cancer de prostata. Esta enzima desempena un papel cntico en la beta-oxidacion peroxisomica de moleculas de acidos grasos de cadena ramificada obtenidas de productos lacteos y de vacuno. Curiosamente, el consumo de productos lacteos y de carne de vacuno se ha relacionado con un mayor riesgo de cancer de prostata.
En tejidos clmicos de cancer de prostata, se ha encontrado una sobreexpresion de 9 veces de AMACR ARNm en comparacion con el tejido prostatico normal. Los estudios inmunohistoqmmicos (IHQ) y los analisis de inmunotransferencia han confirmado el aumento de AMACR en la cantidad de protemas. Ademas, se ha demostrado que el 88% de los casos de cancer de prostata y tanto de metastasis no tratadas como de canceres de prostata resistentes al tratamiento con hormonas fueron muy positivos para AMACR. La expresion de AMACR no se ha detectado en glandulas atroficas, hiperplasia basocelular y epitelio urotelial o metaplasia. Los estudios IHQ tambien demostraron que la expresion de AMACR en biopsias con aguja teman un 97% de sensibilidad y una especificidad del 100% para la deteccion del cancer de prostata.
Combinado con una tincion para p63, un marcador de celulas basales que falta en el cancer de prostata, AMACR facilito enormemente la identificacion de las celulas malignas de la prostata. Su alta expresion y la especificidad de celulas cancengenas implican que AMACR tambien puede ser un candidato para el desarrollo de sondas moleculares que pueden facilitar la identificacion del cancer de prostata mediante modalidades de diagnostico por la imagen no invasivas.
Se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar un analisis basado en lfquidos corporales para AMACR. Un pequeno estudio indico que un analisis cuantitativo en tiempo real por PCR en muestras de orina obtenidas despues del masaje de prostata tiene potencial para excluir a los pacientes con enfermedad clmicamente insignificante cuando la expresion de AMACR ARNm se normaliza para PSA. El analisis de inmunotransferencia Western en muestras de orina obtenidas despues del masaje de prostata tema una sensibilidad del 100%, una especificidad del 58%, un valor pronostico positivo (VPP) del 72% y un valor pronostico negativo (VPN) del 88% para el cancer de prostata. Estos ensayos que utilizan AMACR ARNm para la deteccion de cancer de prostata en muestras de orina son prometedores.
Utilizando el analisis en chip de ADNc, se ha demostrado que la hepsina, una serina proteasa transmembrana de tipo II, es uno de los genes sobreexpresados de manera mas diferenciada en el cancer de prostata en comparacion con el tejido prostatico normal y el tejido de HPB. Utilizando un analisis cuantitativo en tiempo real de PCR se ha demostrado que la hepsina se sobreexpresa en el 90% de los tejidos de cancer de prostata. En el 59% de los canceres de prostata esta sobreexpresion fue mas de 10 veces.
Tambien ha habido una correlacion significativa entre el aumento de hepsina y grado tumoral. Otros estudios tendran que determinar la especificidad hfstica de la hepsina y el valor diagnostico de esta serina proteasa como un nuevo marcador serico. Dado que la hepsina aumenta en los tumores avanzados y mas agresivos, ello sugiere un papel como marcador pronostico del tejido para determinar la agresividad de un tumor.
La telomerasa, ribonucleoprotema, participa en la smtesis y reparacion de telomeros que tapan y protegen los extremos de los cromosomas eucariotas. Los telomeros humanos consisten en repeticiones en tandem de la secuencia TTAGGG asf como en varias protemas de union diferentes. Durante la division celular los telomeros no pueden replicarse completamente y se voleran mas cortos. La telomerasa puede alargar los telomeros y asf evita el acortamiento de estas estructuras. La division celular sin actividad de telomerasa conducira al acortamiento de los telomeros. Como resultado, se limita la longevidad de las celulas y esto conducira al envejecimiento y la muerte celular.
En las celulas tumorales, incluidas las celulas de cancer de prostata, los telomeros son significativamente mas cortos que en las celulas normales. En las celulas cancerosas con telomeros cortos, se requiere actividad de la telomerasa para escapar al envejecimiento y para permitir el crecimiento inmortal. Se ha encontrado gran actividad de la telomerasa en el 90% de los canceres de prostata y se ha demostrado que falta en el tejido prostatico normal.
Un pequeno estudio sobre 36 muestras la actividad de la telomerasa se ha utilizado para detectar celulas de cancer de prostata en la orina evacuada o el lavado de la uretra despues del masaje de prostata. Esta prueba tema una sensibilidad del 58% y una especificidad del 100%. El valor pronostico negativo de la prueba fue del 55%.
Aunque ha sido un estudio pequeno y preliminar, el bajo valor pronostico negativo indica que la actividad de la telomerasa medida en muestras de orina no es muy prometedora para reducir el numero de biopsias innecesarias.
La cuantificacion de la subunidad catalftica de la telomerasa, hTERT, mostro una sobreexpresion media de hTERT ARNm de 6 veces en los tejidos de cancer de prostata en comparacion con los tejidos normales de la prostata. Se encontro una relacion significativa entre la expresion de hTERT y la fase tumoral, pero no con la puntuacion de Gleason. La cuantificacion de hTERT utilizando PCR en tiempo real demostro que hTERT bien podna discriminar los tejidos del cancer de prostata de los tejidos prostaticos no malignos. Sin embargo, hTERT ARNm se expresa en
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leucocitos, que estan presentes regularmente en Kquidos corporales tales como sangre y orina. Esto puede ocasionar falsa positividad. Como tal, la medicion cuantitativa de hTERT en Kquidos corporales no es muy prometedora como herramienta de diagnostico para el cancer de prostata.
El antigeno de membrana espedfico de la prostata (PSMA) es una glucoprotema transmembrana que se expresa en la superficie de las celulas epiteliales de la prostata. La expresion de PSMa parece estar restringida a la prostata. Se ha demostrado que la PSMA aumenta en el tejido del cancer de prostata en comparacion con los tejidos benignos de prostata. No se ha encontrado ninguna coincidencia en la expresion de PSMa entre la HPB y el cancer de prostata, lo que indica que la PSMA es un marcador de diagnostico muy prometedor.
Recientemente, se ha demostrado que la alta expresion del PSMA en casos de cancer de prostata se correlaciona con el grado tumoral, la fase patologica, la aneuploidfa y recurrencia bioqmmica. Ademas, el aumento de la expresion de PSMA ARNm en canceres de prostata primarios y metastasis se correlaciono con la sobreexpresion de la protema PSMA. Su utilidad clmica como marcador de diagnostico o pronostico del cancer de prostata se ha visto obstaculizada por la falta de un inmunoanalisis sensible para esta protema. Sin embargo, una combinacion de matrices ProteinChip® (Ciphergen Biosystems) y SELDI-TOF MS ha dado lugar a la Introduccion de un inmunoanalisis de biochip de protemas para la cuantificacion de PSMA en el suero. Se demostro que las cantidades medias de PSMA en el suero para pacientes con cancer de prostata eran significativamente mas altos en comparacion con las de los hombres con HBP y referencias sanas. Estos descubrimientos implican un papel de PSMA en el suero para distinguir hombres con hBp de pacientes con cancer de prostata. Sin embargo, se necesitan mas estudios para evaluar su valor diagnostico.
Una combinacion de matrices ProteinChip® y SELDI-TOF MS ha conducido a la introduccion de un inmunoanalisis de biochip de protemas para la cuantificacion de PSMA en el suero. Se demostro que las cantidades medias de PSMA en el suero para pacientes con cancer de prostata eran significativamente mayores en comparacion con las de hombres con HBP y referencias sanas. Estos descubrimientos implican un papel de PSMA en el suero para distinguir hombres con HBP de pacientes con cancer de prostata. Sin embargo, se necesitan mas estudios para evaluar su valor diagnostico.
Los estudios de RT-PCR han demostrado que PSMA en combinacion con su variante de corte y empalme PSM' podna utilizarse como marcador pronostico para el cancer de prostata. En la prostata normal, la expresion de PSM' es mas alta que la expresion de PSMA. En los tejidos de cancer de prostata, la expresion de PSMA es mas dominante. Por lo tanto, la proporcion de PSMA a PSM' es muy indicativa de la evolucion de la enfermedad. El diseno de un analisis de PCR cuantitativo que discrimina entre las dos formas de PSMA podna dar otra aplicacion para PSMA en el diagnostico y el pronostico del cancer de prostata.
Debido a su expresion espedfica en las celulas epiteliales de prostata y su aumento en el cancer de prostata, PSMA se ha convertido en el objetivo para los tratamientos. Las estrategias propuestas van desde toxinas dirigidas y radionuclidos hasta agentes inmunoterapeuticos. Los productos de primera generacion han entrado en pruebas clmicas.
Se ha demostrado que la delta-catenina (p120/CAS), una protema asociada a la union adhesiva, es muy discriminatoria entre la HBP y el cancer de prostata. Los estudios de hibridacion in situ mostraron la expresion mas alta de los transcritos de 6-catenina en el adenocarcinoma de la prostata y baja a ninguna expresion en el tejido de la HBP. La sobreexpresion media de 6-catenina en el cancer de prostata en comparacion con la HBP es de 15,7 veces.
Tanto la PCR cuantitativa como el analisis de hibridacion in situ no pudieron encontrar una correlacion entre la expresion de 6-catenina y las puntuaciones de Gleason.
El aumento de la expresion de 6-catenina en el cancer de prostata humano produce alteraciones del ciclo celular y genes de supervivencia, favoreciendo de este modo la evolucion del tumor. Se detecto 6-catenina en prostasomas de la orina humana evacuada sin celulas. La inmunorreactividad de 6-catenina aumento significativamente en la orina de pacientes con cancer de prostata. Se necesitan mas estudios para evaluar su posible utilidad en el diagnostico de cancer de prostata.
Se ha identificado PCA3, anteriormente conocido como DD3, utilizando analisis diferencial de visualizacion. Se encontro que el PCA3 estaba muy sobreexpresado en tumores de prostata en comparacion con el tejido prostatico normal del mismo paciente usando analisis de inmunotransferencia Northern. Ademas, se encontro que el PCA3 estaba fuertemente sobreexpresado en mas del 95% de las muestras de cancer de prostata primario y en metastasis de cancer de prostata. Ademas, la expresion de PCA3 esta restringida al tejido prostatico, es decir, no se ha encontrado expresion en otros tejidos humanos normales.
El gen codifica PCA3 se encuentra en el cromosoma 9q21.2. El PCA3 de ARNm contiene una alta densidad de codones de terminacion. Por lo tanto, carece de un marco de lectura abierto dando lugar a un ARN no codificante. Recientemente, se ha desarrollado un analisis RT-PCR cuantitativo con resolucion temporal (utilizando un patron
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interno y una curva de calibracion externa). El poder de cuantificacion exacto de este analisis mostro un aumento medio de 66 veces de PCA3 en el tejido del cancer de prostata en comparacion con el tejido prostatico normal. Ademas, se encontro un aumento medio de 11 veces en los tejidos prostaticos que contienen menos del 10% de celulas de cancer de prostata. Esto indicaba que PCA3 era capaz de detectar un pequeno numero de celulas tumorales en un fondo enorme de celulas normales.
Esta hipotesis ha sido probada utilizando el analisis cuantitativo por RT-PCR en muestras de orina evacuada. Estas muestras de orina se obtuvieron despues del examen rectal digital (ERD) de un grupo de 108 hombres que fueron indicados para biopsias de prostata basadas en un valor de PSA en suero total de mas de 3 ng/ml. Esta prueba tema 67% de sensibilidad y 83% de especificidad utilizando biopsias prostaticas como metodo de referencia para la presencia de un tumor. Ademas, esta prueba tuvo un valor pronostico negativo del 90%, lo que indica que la determinacion cuantitativa de los transcritos de PCA3 en sedimentos de orina obtenidos despues de un masaje extenso de prostata tiene un gran potencial en la reduccion del numero de biopsias invasivas guiadas por TRUS en esta poblacion de hombres.
La especificidad hustica y la alta sobreexpresion en los tumores de prostata indican que el PCA3 es el gen mas espedfico del cancer de prostata descrito hasta ahora. Gen-probe Inc. tiene la licencia exclusiva mundial para la tecnologfa de PCA3. Estudios multicentricos utilizando el ensayo de PCA3 validado pueden proporcionar la primera base para los diagnosticos moleculares en la practica clmica urologica.
La expresion modulada de protemas citoplasmicas HSP-27 y miembros de la familia isoenzimatica PKC se han correlacionado con la evolucion del cancer de prostata.
La modulacion de la expresion ha identificado claramente los canceres que son agresivos y, por tanto, los que pueden requerir tratamiento urgente, independientemente de su morfologfa. Aunque no estan ampliamente empleados, los anticuerpos contra estas protemas estan autentificados, estan disponibles en el mercado y son sencillos de aplicacion e interpretacion, particularmente junto con otros reactivos como preparados con doble tincion.
La importancia de este grupo de marcadores es que distinguen con precision canceres de prostata de fenotipo agresivo. El modulado en su expresion por canceres invasivos, en comparacion con los tejidos prostaticos no neoplasicos, los tumores malignos que expresan HSP27 o PKCp a alto nivel invariablemente presentan un resultado clmico deficiente. El mecanismo de esta asociacion garantiza esclarecimiento y validacion.
Los factores de transcripcion E2F, incluido E2F3 situado en el cromosoma 6p22, modulan directamente la expresion de EZH2. La sobreexpresion del gen EZH2 ha sido importante en el desarrollo del cancer de prostata humano.
EZH2 se identifico como un gen sobreexpresado en el cancer de prostata metastasico resistente al tratamiento con hormonas y demostro que los pacientes con cancer de prostata clmicamente localizado que expresan EZH2 tienen una peor evolucion que aquellos que no expresan la protema.
Usando chips del tejido, la expresion de grandes cantidades de E2F3 nuclear se produce en una alta proporcion de canceres humanos de la prostata pero es un fenomeno raro en epitelio prostatico no neoplasico. Estos datos, junto con otra informacion publicada, sugieren que el eje de referencia pRB-E2F3-EZH2 puede tener un papel crucial en la modulacion de la agresividad de cada uno de los canceres humanos de prostata.
El principal reto para el diagnostico molecular es la identificacion de cancer de prostata clmicamente insignificante, es decir, separar los canceres biologicamente agresivos de los tumores indoloros. Ademas, se necesitan urgentemente marcadores que predigan y hagan el seguimiento de la respuesta al tratamiento.
En los entornos clmicos actuales sobre diagnostico y sobre tratamiento se vuelven cada vez mas manifiestos, subrayando aun mas la necesidad de biomarcadores que puedan ayudar a la identificacion precisa de los pacientes que no necesitan y necesitan tratamiento.
El uso de inmunohistoqmmica AMACR se utiliza actualmente en la identificacion de procesos malignos en la prostata ayudando asf al diagnostico de cancer de prostata. Lamentablemente, la introduccion de marcadores moleculares en tejidos como herramienta de pronostico no ha sido validada para ninguno de los marcadores expuestos.
Las experiencias de las dos ultimas decadas han revelado la complejidad practica y logfstica en el traslado de los marcadores moleculares al uso clmico. En la actualidad se estan llevando a cabo varios esfuerzos prospectivos, teniendo en cuenta estas cuestiones, para demostrar la utilidad clmica de una serie de marcadores. Evidentemente, los biorepositorios de tejidos de muestras bien documentadas, incluidos los datos de seguimiento clmico, desempenan un papel fundamental en el proceso de validacion.
Nuevas pruebas de lfquidos corporales basadas en la hipermetilacion de PGTP1 y el gen PCA3, que esta muy sobreexpresado en el cancer de prostata, permitio la deteccion de cancer de prostata en lfquidos corporales, tales
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como orina o eyaculaciones, obtenidos de manera no invasiva.
El documento WO 2010/037735 describe un procedimiento para determinar in vitro cancer de prostata de alto grado o bajo grado que comprende determinar el nivel de expresion de uno o mas genes de cada siete genes incluidos HOXC6 y HOXD10, en una muestra de tejido. La aplicacion de nuevas tecnologfas ha demostrado que un gran numero de genes aumentan o disminuyen en el cancer de prostata.
En la tecnica, hay continua necesidad de analisis que proporcionan la determinacion, o diagnostico, de bajo grado, es decir, una puntuacion de Gleason de 6 o menor, o de alto grado, es decir, una puntuacion de Gleason de 7 o mas, cancer de prostata con sensibilidad y especificidad maximas.
La sensibilidad se relaciona con la capacidad del analisis para identificar resultados positivos. En el presente contexto, la sensibilidad indica la proporcion de individuos que padecen de pruebas positivas de cancer de prostata para cancer de prostata de bajo grado o alto grado.
La especificidad se refiere a la capacidad de la prueba para identificar resultados negativos. En el presente contexto, especificidad se define como la proporcion de individuos que no padecen de pruebas negativas de cancer de prostata de bajo grado o alto grado para ello.
Es un objeto de la presente invencion, proporcionar un analisis para determinar o diagnosticar cancer de prostata de alto grado en una muestra de un individuo humano que se sospecha que padece cancer de prostata, ayudando de este modo al desarrollo de un estrategia clmica eficaz para tratar el cancer de prostata. La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se describen:
un analisis y medios para llevar a cabo el analisis que permite detectar cancer de prostata de alto y bajo grado con mejor sensibilidad/especificidad.
Se describe:
un procedimiento para determinar in vitro cancer de prostata de alto y bajo grado en una muestra procedente de una persona que se sospecha que padece cancer de prostata que comprende:
- determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6; y
- determinar el nivel de aumento de los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata;
por lo que, basandose en los niveles de aumento de DLX1 y HOXC6, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto o bajo grado en dicha muestra.
Se describe:
un procedimiento para determinar in vitro cancer de prostata de alto o bajo grado en una muestra procedente de una persona que se sospecha que padece cancer de prostata que comprende:
- determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10; y
- determinar el nivel de aumento del nivel de expresion de DLX1 y el nivel de disminucion del nivel de expresion de HOXD10 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata;
por lo que, basandose en el nivel de aumento de DLX1 y el nivel de disminucion de HOXC6, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto grado o bajo grado en dicha muestra.
Se describe:
un procedimiento para determinar in vitro cancer de prostata de alto o bajo grado en una muestra procedente de una persona que se sospecha que padece cancer de prostata que comprende:
- determinar los niveles de expresion de HOXC6 y HOXD10; y
- determinar el nivel de aumento del nivel de expresion de HOXC6 y el nivel de disminucion del nivel de expresion de HOXD10 en comparacion con los niveles de expresion de HOXC6 y HOXD10 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata;
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por lo que, basandose en el nivel de aumento de HOXC6 y el nivel de disminucion de HOXD10, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto grado o bajo grado en dicha muestra.
Se describe ademas:
un procedimiento para determinar in vitro cancer de prostata de alto grado o bajo grado en una muestra procedente de una persona que se sospecha que padece cancer de prostata que comprende:
- determinar los niveles de expresion de DLX1, HOXD10 y HOXC6; y
- determinar el nivel de aumento de los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6 y el nivel de disminucion del nivel de expresion de HOXD10 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1, HOXD10 y HOXC6 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata;
por lo que, basandose en los niveles de aumento de DLX1 y HOXC6 y el nivel de disminucion de HOXD10, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto grado o bajo grado en dicha muestra.
En la presente descripcion, se hace referencia a genes humanos adecuados como biomarcadores para el cancer de prostata haciendo referencia a sus nombres arbitrariamente asignados. Aunque el experto en la tecnica es capaz de identificar y utilizar facilmente los genes presentes como biomarcadores basandose en estos nombres, las figuras adjuntas proporcionan tanto la secuencia de ADNc como las secuencias de las protemas de estos genes en la base de datos publica. Basandose en los datos proporcionados en las figuras, el experto en la tecnica, sin excesiva experimentacion y utilizando medios convencionales de biologfa molecular, sera capaz de determinar los niveles de expresion de los biomarcadores indicados en una muestra, proporcionando de este modo los presentes metodos.
En la presente descripcion, el analisis de nivel de expresion comprende determinar una expresion aumentada (DLX1, HOXC6) o disminuida (HOXD10) de un gen en comparacion con la expresion de estos genes en una muestra similar, equivalente o correspondiente procedente de una persona que no padece de celulas de tumor de prostata o de tejido de tumor de prostata, o de un individuo que no padece cancer de prostata. En otras palabras, un nivel de expresion aumentado o disminuido de un gen segun la presente invencion es una medida de la expresion genica con relacion a un modelo sin enfermedad.
Por ejemplo, la determinacion de una expresion aumentada de DLX1 y HOXC6, en comparacion con la expresion de este gen en condiciones de cancer no prostatico, permite determinar o diagnosticar cancer de prostata de bajo grado o alto grado, proporcionando asf pronostico y/o prediccion de supervivencia de la enfermedad y una ayuda para disenar un protocolo de tratamiento clmico.
HOXD10 es un miembro de la familia de los genes homeosecuencia (Hox) que son genes reguladores que dirigen la organogenia y mantienen la funcion tnstica diferenciada. HOXD10 ayuda a mantener un fenotipo quiescente y diferenciado en celulas endoteliales al suprimir la expresion de genes involucrados en la remodelacion de la matriz extracelular y la migracion celular.
HOXC6 es tambien un miembro familiar de la superfamilia homeosecuencia de genes y la subfamilia HOX contienen miembros que son factores de transcripcion involucrados en el control y la coordinacion de funciones complejas durante el desarrollo mediante patrones de expresion espacial y temporal. En los seres humanos hay 39 genes clasicos de HOX organizados en los grupos A, B, C y D. Se ha demostrado que HOXC6 es crucial para el desarrollo y la proliferacion de celulas epiteliales en respuesta a senales hormonales.
Con respecto a la expresion de HOXC6, se conocen al menos variantes de transcripcion. Dentro del contexto de la presente invencion, la determinacion del nivel de expresion de HOXC6 se refiere a los niveles de expresion combinados de las variantes 1 y 2.
DLX1 pertenece a la familia de factores de transcripcion de homeodominio que estan relacionados con el gen menos distal (Dll) de Drosophila. La familia se ha relacionado con una serie de caractensticas de desarrollo y parece estar bien conservada a traves de las especies. Los genes Dlx estan implicados en la migracion tangencial de interneuronas desde el subpalio al palio durante el desarrollo del cerebro de los vertebrados. Se ha sugerido que Dlx favorece la migracion de interneuronas reprimiendo un conjunto de protemas que normalmente se expresan en neuronas terminalmente diferenciadas y actuan para favorecer el desarrollo de dendritas y axones.
Con respecto a la expresion de DLX1, se conocen al menos las variantes de transcripcion. En el contexto de la presente invencion, la determinacion del nivel de expresion de DLX1 se refiere solamente a la determinacion del nivel de expresion de la variante representada en las figuras.
La determinacion de niveles de expresion comprende determinar los niveles de expresion de ARNm. En otras palabras, la determinacion de los niveles de expresion comprende determinar los niveles de transcripcion.
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Determinar los niveles de expresion comprende determinar los niveles de protema. En otras palabras, la determinacion de los niveles de expresion comprende determinar los niveles de traduccion.
Segun la presente descripcion, la determinacion del cancer de prostata de bajo grado comprende la determinacion del cancer de prostata con una puntuacion de Gleason de 6 o inferior y la determinacion del cancer de prostata de alto grado comprende la determinacion de una puntuacion de Gleason de 7 o superior.
El cancer de prostata de bajo grado (PrCa, puntuacion de Gleason igual o inferior a 6) representa a pacientes con buen pronostico clmico. El cancer de prostata de alto grado (PrCa, puntuacion de Gleason de 7 o mas) representa a pacientes con pronostico clmico deficiente. El grupo de pacientes con pronostico clmico deficiente puede diferenciarse mas en pacientes con metastasis (PrCa Met) y pacientes que son resistentes a la castracion (CPRC) que representan un grupo de pacientes con enfermedad agresiva localizada.
Por consiguiente, los metodos segun la presente descripcion se refieren preferiblemente a demostrar ademas cancer de prostata metastatizado (PrCa Met) y/o cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC).
Segun una realizacion especialmente preferida de la presente invencion, los metodos descritos anteriormente se realizan en una muestra seleccionada del grupo que consiste en muestras de orina, derivado de orina, lfquido prostatico, derivado de lfquido prostatico, eyaculacion y derivado de eyaculacion, orina o un derivado de orina. Estas muestras son las muestras que pueden mas facilmente obtenerse de muestras obtenidas del cuerpo humano.
Sin embargo, hasta la presente invencion, no se ha descrito una prueba de diagnostico fiable utilizando estos lfquidos corporales.
Dentro del contexto de la presente descripcion, una muestra derivada de orina, lfquido prostatico o eyaculacion es una muestra procedente de estos lfquidos corporales, es decir, una muestra de estos lfquidos ademas procesada, por ejemplo, por sedimentacion, extraccion, precipitacion, dilucion, etc.
Se describe el uso de una combinacion de analisis del nivel de expresion de DLX1 y HOXD10 para demostrar in vitro el cancer de prostata de grado bajo o grado alto.
Se describe el uso de una combinacion de analisis de nivel de expresion de DLX1 y HOXC6 para demostrar in vitro el cancer de prostata de grado bajo o grado alto.
Se describe el uso de una combinacion de analisis del nivel de expresion de HOXD10 y HOXC6 para demostrar in vitro el cancer de prostata de grado bajo o grado alto.
Se describe el uso de una combinacion de analisis del nivel de expresion de DLX1, HOXC6 y HOXD10 para demostrar in vitro el cancer de prostata de grado bajo o grado alto.
Los aspectos anteriores de la presente invencion se ponen en practica preferiblemente en una muestra seleccionada del grupo que consiste en muestra de orina, derivado de orina, lfquido prostatico, derivado de lfquido prostatico, eyaculacion y derivado de eyaculacion, en una orina, o un derivado de orina.
Se describe un equipo de partes para demostrar in vitro un cancer de prostata de grado alto o grado bajo en una muestra procedente de un individuo humano que se sospecha que padece cancer de prostata, que comprende:
- medios de analisis de nivel de expresion para determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6;
- instrucciones de uso.
Se describe un equipo de partes para demostrar in vitro un cancer de prostata de grado alto o grado bajo en una muestra procedente de un individuo humano que se sospecha que padece cancer de prostata, que comprende:
- medios de analisis de nivel de expresion para determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10;
- instrucciones de uso.
Se describe un equipo de partes para demostrar in vitro un cancer de prostata de grado alto o grado bajo en una muestra procedente de individuos humanos que se sospecha que padecen cancer de prostata, que comprende:
- medios de analisis de nivel de expresion para determinar los niveles de expresion de HOXC6 y HOXD10;
- instrucciones de uso.
Se describe un equipo de partes para demostrar in vitro un cancer de prostata de grado alto o grado bajo en una muestra procedente de individuos humanos que se sospecha que padecen cancer de prostata, que comprende:
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- medios de analisis de nivel de expresion para determinar los niveles de expresion de DLX1, HOXD10 y HOXC6;
- instrucciones de uso.
En los kits de partes anteriores segun la presente descripcion, los medios de analisis de nivel de expresion comprenden preferiblemente medios de analisis de nivel de expresion de ARNm, preferiblemente para PCR, rtPCR, NASBA o hibridacion in situ.
En una determinada realizacion ventajosa, la descripcion proporciona un metodo para determinar si un cancer de prostata debe clasificarse como cancer de prostata de alto grado, comprendiendo el metodo:
1) determinar el nivel de expresion de los genes DLX1, HOXD10 y HOXC6 en una muestra obtenida de un individuo y expresar cada uno de los niveles de expresion como un valor numerico;
2) multiplicar los tres valores numericos asf obtenidos con cada uno de los demas para obtener un valor de expresion multiplicado;
3) comparar el valor de expresion multiplicado con un valor de referencia predeterminado;
en donde el cancer de prostata se clasifica como un cancer de prostata de alto grado si el valor de expresion multiplicado es superior al valor de referencia predeterminado. Esto se denomina mas adelante en la presente memoria la prueba de tres marcadores.
Los niveles de expresion de los genes DLX1, HOXD10 y HOXC6 pueden obtenerse de cualquier manera convencional conocida en la tecnica. Preferiblemente, se obtienen cuantificando los niveles de expresion de ARNm.
Los niveles de expresion de los tres genes se suelen expresar como niveles de expresion en relacion con un nivel tfpico tal como un gen constitutivo, pero tambien pueden usarse niveles absolutos dependiendo del metodo de medicion.
Los valores numericos obtenidos se procesan a continuacion, como por ejemplo multiplicando por cada uno de los demas, lo que significa que el nivel de expresion de DLX1 veces es el inverso del nivel de expresion de HOXD10 (invHOXDlO), veces el nivel de expresion de HOXC6. La cifra asf obtenida se denomina valor de expresion multiplicado.
El valor de expresion multiplicado se encontro que era un parametro muy util para diagnosticar cancer de prostata de alto grado. En una poblacion de 234 individuos (58 con cancer de prostata de alto grado y 176 con cancer de prostata de bajo grado o biopsias negativas) se encontro que la prueba de tres marcadores superaba el potencial de diagnostico de cada uno de los genes marcadores.
La prueba de tres marcadores proporciono inesperadamente un efecto sinergico ya que su potencial de diagnostico era mejor que la suma de las partes, es decir, cada uno de los tres genes.
Es evidente a partir de las figuras 6, 7, 8 y 9 que la prueba de tres marcadores supera tanto la prueba de dos marcadores con DLX1 y HOXC6 como una prueba de referencia de dos marcadores PCA3 y TMPRSS2-ERG, en concreto en el intervalo de 75% a 98%, que es un intervalo adecuado para el diagnostico de cancer de prostata de alto grado.
El valor de referencia predeterminado puede obtenerse experimentalmente utilizando muestras de una poblacion de prueba de cancer de prostata de alto grado y de grado no alto conocido. Dependiendo de la especificidad y sensibilidad deseadas este valor puede variar.
Una manera ventajosa de determinar el valor de referencia o valor lfmite es determinar la media y la desviacion tfpica de valores de expresion multiplicados en un numero de muestras de individuos que no padecen cancer de prostata de alto grado y elegir la media mas una o dos veces la desviacion tfpica como valor de referencia. Cualquier otra forma de determinar un valor de referencia puede proporcionar igualmente buenos resultados.
El metodo segun la descripcion puede utilizarse tambien como ensayo de diferenciacion, es decir, puede aplicarse para distinguir los canceres de prostata de alto grado de los de bajo grado en un grupo de individuos ya diagnosticados con cancer de prostata. En este caso, la prueba de tres marcadores proporciona resultados especialmente buenos en el intervalo de especificidad del 65% al 98%.
Se obtuvieron resultados especialmente buenos cuando las muestras se obtuvieron de la orina, sedimento de orina, lfquido prostatico o eyaculacion.
La presente invencion se explicara ademas en el siguiente ejemplo detallado de realizaciones preferidas de la
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invencion en donde se hace referencia a las figuras, en donde:
Figura 1A presenta las secuencias de ADNc y de aminoacidos de la variante 1 del gen HOXC6 (NM_004503.3, NP_004494 .1);
Figura 1B presenta las secuencias de ADNc y de aminoacidos de la variante 2 del gen HOXC6 (NM_153693.3, NP_710160.1);
Figura 2 presenta las secuencias de ADNc y de aminoacidos del gen HOXD10 (NM_002148.3, NP_002139.2);
Figura 3 presenta las secuencias de ADNc y de aminoacidos de la variante 1 de la transcripcion del gen DLX1
(NM_178120, NP_835221) segun la presente invencion;
Figura 4
Figura 5 Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9 Ejemplo
presenta la discriminacion de DLX1 y HOXC6 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (Puntuacion de Gleason <6)y biopsias negativas;
presenta la discriminacion de DLX1 y HOXC6 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (Puntuacion de Gleason < 6);
presenta la discriminacion de una combinacion de DLX1 y HOXC6 o una combinacion de DLX1, HOXC6 y HOXD10 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (puntuacion de Gleason < 6) y biopsias negativas.
presenta la discriminacion de una combinacion de DLX1 y HOXC6 o una combinacion de DLX1, HOXC6 y HOXD10 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (Puntuacion de Gleason < 6).
presenta, en comparacion con un analisis de tumor de prostata, la discriminacion de una combinacion de DLX1, HOXC6 y HOXD10 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (Puntuacion de Gleason < 6) y biopsias negativas.
presenta en comparacion con un analisis de tumor de prostata, la discriminacion de una combinacion de DLX1, HOXC6 y HOXD10 para tumores de prostata de alto grado (Puntuacion de Gleason > 7) en comparacion con tumores de prostata de bajo grado (Puntuacion de Gleason < 6).
Materiales y metodos
Se analizo una cohorte de 234 pacientes consecutivos que fueron admitidos para biopsias de prostata, basandose en las concentraciones de PSA en el suero de mas de 3 ng/ml. Despues del ERD se recogieron muestras de orina evacuada y se determinaron cuantitativamente los niveles de expresion de ARNm de DLX1, HOXC6, HOXD10, TMPRSS2-ERG en los sedimentos de orina obtenidos.
Ademas, se utilizo la prueba Progensa PCA3 para determinar los niveles de expresion de PCA3 en la muestra de orina recogida. En esta cohorte, 102 biopsias de prostata dieron positivas para cancer de prostata. De todos los canceres de prostata encontrados, 58 teman una puntuacion de Gleason > 7 en 44 teman una puntuacion de Gleason < 6.
Para visualizar la eficacia de los presentes biomarcadores para discriminar canceres de prostata (n = 58) con puntuacion de Gleason > 7 de las biopsias negativas (n = 176) con puntuacion de Gleason < 6 y sin un valor lfmite arbitrario, los datos se resumieron utilizando una curva caractenstica de funcionamiento del receptor (ROC).
En una curva ROC la tasa positiva real para detectar canceres de prostata con puntuacion de Gleason > 7 (Sensibilidad) se representa en funcion de la tasa de falsos positivos (es decir, positivos en la puntuacion de Gleason < 6 y la poblacion de biopsias de prostata negativas) (100 - especificidad) para diferentes puntos lfmite de un parametro.
Cada punto de la curva ROC representa un par sensibilidad/especificidad correspondiente a un umbral de decision determinado. El area bajo la curva ROC es una medida de lo bien que un parametro puede distinguir entre dos grupos (canceres de prostata con puntuacion de Gleason > 7 comparados con los de puntuacion de Gleason < 6 + biopsias de prostata negativas).
Cuando la variable estudiada no puede distinguir entre los dos grupos, es decir, en caso de que no haya diferencia
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entre las dos distribuciones, el area sera igual a 0,5 (la curva ROC coincidira con la diagonal).
Una prueba con discriminacion perfecta (sin coincidencia en las dos distribuciones) tiene una curva ROC que pasa por la esquina superior izquierda (100% de sensibilidad, 100% de especificidad). Por lo tanto, cuanto mas cercana este la curva ROC de la esquina superior izquierda, mayor sera la precision global de la prueba.
Ademas, se trazo una curva ROC hecha para visualizar la eficacia de los biomarcadores para discriminar canceres de prostata (n = 58) con puntuacion de Gleason > 7 de los canceres de prostata (n = 44) con puntuacion de Gleason < 6 sin un valor lfmite arbitrario.
A continuacion, se exponen los resultados obtenidos y se muestran en las presentes figuras 4 a 9.
Resultados Figura 4
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de expresion de DLX1 y HOXC6 en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG > 7 del resto (biopsias con PG < 6 y negativas). El area bajo curva (ABC) para DLX-1 es 0,75 (IC del 95%: 0,66-0,83) y para HOXC6 es 0,72 (IC del 95%: 0,64-0,80).
A una especificidad > 70%, DLX1 tiene una sensibilidad significativamente mayor para la deteccion de PG > 7 tumores del resto que HOXC6.
Figura 5
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de la expresion de DLX1 y HOXC6 en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG > 7 de PG < 6. El area bajo curva (ABC) para DLX-1 es 0,74 (IC del 95%: 0,65 - 0,84) y para HOXC6 es 0,66 (IC del 95%: 0,55 - 0,77). En general, DLX1 tiene una sensibilidad significativamente mayor para la deteccion de tumores con PG > 7 de tumores de prostata con PG < 6 antes que HOXC6.
Figura 6
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de la combinacion de DLX1 con expresion de HOXC6 y la combinacion de DLX1 con expresion de HOXC6 y HOXD10 inv(erso) (debido a la disminucion correlacionada con la expresion de HOXD10, DLX1 y HOXC6 presentan aumento) en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG > 7 del resto (biopsias con PG < 6 y negativas).
El area bajo curva (ABC) para la combinacion DLX1-HOXC6 es 0,78 (IC del 95%: 0,70 - 0,85) y para DLX1-HOXC6- invHOXD10 es 0,77 (IC del 95%: 0,69 - 0,85). A una especificidad > 80%, el DLX1-HOXC6-invHOXD10 tiene una mayor sensibilidad para la deteccion de PG > 7 tumores en el resto de la combinacion DLX1-HOXC6.
Figura 7
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de la combinacion de DLX1 con expresion de HOXC6 y la combinacion de DLX1 con HOXC6 y expresion de invHOXD10 en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG > 7 de tumores de prostata con PG < 6.
El area bajo curva (ABC) para la combinacion DLX1-HOXC6 es 0,74 (IC del 95%: 0,65 - 0,84) y para DLX1-HOXC6- invHOXD10 es 0,76 (IC del 95%: 0,67 - 0,85). A una especificidad > 75%, el DLX1-HOXC6-invHOXD10 tiene una mayor sensibilidad para la deteccion de tumores con Pg > 7 de los tumores de prostata con PG < 6 que la combinacion DLX1-HOXC6.
Figura 8
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de la combinacion de DLX1 con HOXC6 y expresion de invHOXD10 y la combinacion de PCA3 con TMPRSS2-ERG en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG > 7 del resto (biopsias con PG < 6 y negativas).
El area bajo la curva (ABC) para la combinacion DLX1-HOXC6-invHOXDlO es 0,78 (IC del 95%: 0,71 - 0,86) y para la combinacion PCA3 con TMPRSS2-ERG es 0,78 (IC del 95%: 0,71 - 0,85). A una especificidad > 80%, el DLX1- HOXC6-invHOXD10 tiene una mayor sensibilidad para la deteccion de tumores con PG> 7 del resto que la combinacion PCA3_TMPRSS2-eRg.
Figura 9
En una curva Receptor en operacion (ROC), se visualiza el potencial de la combinacion de DLX1 con HOXC6 y
expresion de invHOXDIO y la combinacion de PCA3 con expresion de TMPRSS2-ERG en sedimentos de orina para discriminar tumores de prostata con PG> 7 de tumores de prostata con PG < 6.
El area bajo la curva (ABC) para la combinacion DLX1-HOXC6-invHOXD10 es 0,77 (IC del 95%: 0,68 - 0,86) y para la combinacion PCA3 con TMPRSS2-ERG es 0,68 (IC del 95%: 0,57-0,78). En general, el DLX1-HOXC6- 5 invHOXD10 tiene una mayor sensibilidad para la deteccion de tumores con PG> 7 de los tumores de prostata con PG < 6 que la combinacion de PCA3 con TMPRSS2-ERG.
Exposicion
Como se demostro anteriormente, los presentes marcadores moleculares, o biomarcadores, para cancer de prostata proporcionan, especialmente en combinacion, un analisis y medios para realizar el analisis que permite detectar 10 cancer de prostata de alto y bajo grado con mejor sensibilidad/especificidad, especialmente cuando se compara con biomarcadores actualmente disponibles tales como la prueba Progensa PCA3.
Claims (6)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la determinacion in vitro cancer de prostata de alto grado en una muestra de orina o derivada de orina procedente de un individuo humano que se sospecha que padece cancer de prostata, que comprende:- determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6; y- determinar el aumento del nivel de expresion de DLX1 y HOXC6 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1 y HOXC6 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata o en comparacion con un valor de referencia indicador de un nivel de expresion sin enfermedad;por lo que, basandose en el aumento de los niveles de expresionDLXI y HOXC6, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto o bajo grado en dicha muestra.
- 2. Procedimiento para la determinacion in vitro de cancer de prostata de alto grado en una muestra de orina o derivada de orina procedente de un individuo humano que se sospecha que padece cancer de prostata, que comprende:- determinar los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10 y HOXC6; y- determinar el aumento de los niveles de expresion de DLX1 y el nivel de regulacion a la baja del nivelde expresion de HOXD10 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10 y el nivel de disminucion del nivel de expresion de HOXD10 en comparacion con los niveles de expresion de DLX1 y HOXD10 y HOXC6 en una muestra procedente de un individuo que no padece cancer de prostata o en comparacion con un valor de referencia indicativo de un nivel de expresion sin enfermedad;por lo tanto, basandose en el aumento de DLX1 y HOXC6 en la disminucion de HOXD10, proporcionar dicha determinacion del cancer de prostata de alto grado en dicha muestra.
- 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la determinacion de dichos niveles de expresion comprende la determinacion de los niveles de expresion del ARNm.
- 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la determinacion de dichos niveles de expresion comprende la determinacion de los niveles de protemas.
- 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la determinacion del cancer de prostata de alto grado es la determinacion de una puntuacion de Gleason de 7 o superior.
- 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en donde la determinacion del cancer de prostata de alto grado comprende ademas la determinacion del cancer de prostata metastasizado (CaPr Met) y/o del cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC).
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