ES2663069T3 - Marcadores moleculares en cáncer de próstata - Google Patents

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Abstract

Método para el diagnóstico in vitro del cáncer de próstata PrCa de alto grado (HG PrCa), PrCa Met y CPRC en un individuo humano que comprende: - determinar la expresión de DLX1; y - establecer el aumento o la disminución de la expresión de DLX1 en comparación con la expresión de DLX1 en una muestra de un individuo sin cáncer de próstata; proporcionando de ese modo dicho diagnóstico in vitro del cáncer de próstata PrCa de alto grado (HG PrCa), PrCa Met y CPRC.

Description

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DESCRIPCION
Marcadores moleculares en cáncer de próstata
La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico de cáncer de próstata (PrCa).
En la población masculina occidental, el cáncer de próstata se ha convertido en un problema importante de salud pública. En muchos países desarrollados no es sólo el cáncer más frecuentemente diagnosticado sino que también es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en varones. Debido a que la incidencia del cáncer de próstata aumenta con la edad, el número de casos recién diagnosticados sigue aumentando a medida que aumenta la esperanza de vida de la población general. En los Estados Unidos, aproximadamente 218.000 hombres y en Europa aproximadamente 382.000 hombres son recién diagnosticados con cáncer de próstata cada año.
Estudios epidemiológicos demuestran que el cáncer de próstata es una enfermedad indolora y que mueren más hombres con cáncer de próstata que de él. Sin embargo, una fracción significativa de los tumores se comporta agresivamente y como resultado aproximadamente 32.000 hombres americanos y aproximadamente 89.000 hombres europeos mueren por esta enfermedad anualmente.
La alta tasa de mortalidad es consecuencia del hecho de que no existen opciones terapéuticas curativas para el cáncer de próstata metastásico. La ablación de andrógenos es el tratamiento de elección en hombres con metástasis. Inicialmente, el 70 a 80% de los pacientes con enfermedad avanzada muestran respuesta al tratamiento, pero con el tiempo la mayoría de los tumores se vuelven independientes de los andrógenos. Como resultado la mayoría de los pacientes desarrollará enfermedad progresiva.
Dado que no existen opciones terapéuticas eficaces para el cáncer de próstata avanzado, la detección precoz de este tumor es fundamental y puede aumentar la tasa de éxito curativo. Aunque el uso rutinario de pruebas del antígeno prostático específico (PSA) de suero sin duda ha aumentado la detección de cáncer de próstata, uno de sus principales inconvenientes ha sido la falta de especificidad. El PSA del suero es un marcador excelente para enfermedades de la próstata e incluso modestas elevaciones reflejan casi siempre una enfermedad o perturbación de la próstata como la hiperplasia prostática benigna (BPH) y la prostatitis. Desde la aparición de frecuentes pruebas de PSA hace más de 20 años, la especificidad del PSA para el cáncer ha disminuido debido a la selección de un gran número de hombres que tienen elevados de PSA debido a mecanismos no cancerosos. Esto da lugar a una tasa de biopsia muy negativa.
Por lo tanto, se necesitan urgentemente pruebas moleculares (no invasivas), que pueden identificar con precisión aquellos hombres que están en la fase inicial, el cáncer de próstata clínicamente localizado y que se beneficiarían de una supervivencia prolongada y de calidad de vida desde la intervención radical temprana. Los biomarcadores moleculares identificados en los tejidos pueden servir como blanco para nuevas pruebas moleculares basado en fluidos corporales.
Un biomarcador adecuado preferentemente cumple los siguientes criterios: 1) debe ser reproducible (intra- e interinstitucional) y 2) debe tener un impacto en la gestión clínica.
Además, con fines de diagnóstico, es importante que los biomarcadores se prueban en cuanto a la especificidad en los tejidos y la posible discriminación entre el cáncer de próstata, próstata normal y HPB. Además, cabe esperar que ensayos de biomarcadores (múltiples) mejoren la especificidad para la detección del cáncer.
Teniendo en cuenta lo anterior, hay una necesidad urgente de biomarcadores moleculares de pronósticos para predecir el comportamiento biológico del cáncer y resultados.
Para la identificación de nuevos marcadores experimentales para el cáncer de próstata, es necesario estudiar patrones de expresión en tejidos de próstata malignos como no malignos, preferiblemente en relación con otros datos médicos.
Desarrollos recientes en el campo de las técnicas moleculares han proporcionado nuevas herramientas que permitieron la evaluación tanto de alteraciones genómicas como de alteraciones proteómicas en estas muestras de una manera integral y rápida. Estas herramientas han llevado al descubrimiento de muchos nuevos biomarcadores prometedores para el cáncer de próstata. Estos biomarcadores pueden ser instrumentales en el desarrollo de nuevas pruebas que tienen una alta especificidad en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata.
Por ejemplo, la identificación de diferentes anomalías cromosómicas como cambios en el número de cromosomas, translocaciones, supresiones, reconfiguraciones y duplicaciones en las células puede estudiarse usando análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH). La hibridación genómica comparativa (CGH) es capaz de identificar todo el genoma para grandes cambios en el número de copias de la secuencia de ADN o supresiones más de 10 millones de pares de bases. Análisis de expresión diferencial, análisis en serie de expresión génica (SAGE), chips de oligonucleótidos y chips de ADNc caracterizan perfiles de expresión génica. Estas técnicas se utilizan a menudo combinado con chips de tejido (TMA) para la identificación de genes que desempeñan una función importante en
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procesos biológicos específicos.
Dado que las alteraciones genéticas a menudo conducen a proteínas mutadas o alteradas, las vías de señalización de una célula pueden ser afectadas. Eventualmente, esto puede llevar a una ventaja del crecimiento o la supervivencia de una célula de cáncer. La proteómica estudia la identificación de proteínas alteradas en cuanto a estructura, cantidad y modificaciones tras la traducción. Proteínas relacionadas con la enfermedad pueden secuenciarse directamente e identificarse en secciones de tejido completo intacto usando desorción-ionización mediante láser asistida por matriz acoplada a un espectrómetro de masas en tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Además, Desorción-ionización mediante láser asistida por matriz acoplada a un espectrómetro de masas (MS) en tiempo de vuelo (SELDI)-TOF puede proporcionar un perfil rápido de expresión proteica de células de tejidos y fluidos corporales como el suero o la orina.
En los últimos años, estas herramientas moleculares han llevado a la identificación de cientos de genes que se cree que son relevantes en el desarrollo de cáncer de próstata. No sólo estos resultados han llevado a una percepción en la iniciación y evolución del cáncer de próstata, sino que también han demostrado que el cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea.
Algunos tumores de próstata pueden ocurrir en la próstata de un solo paciente debido a la naturaleza multifocal de la enfermedad. Cada uno de estos tumores puede mostrar diferencias notables en la expresión génica y el comportamiento que se asocian con diferentes pronósticos. Por lo tanto, para predecir el resultado de la enfermedad es más probable que un conjunto de diferentes marcadores sea clínicamente importante.
Los biomarcadores pueden clasificarse en cuatro casos específicos de cáncer de próstata diferentes: alteraciones genómicas, procesos biológicos específicos de cáncer de próstata, modificaciones epigenéticas y genes expresados únicamente en cáncer de próstata.
Uno de los factores de riesgo epidemiológico más fuertes para el cáncer de próstata es una historia familiar positiva. Un estudio de 44.788 pares de gemelos en Dinamarca, Suecia y Finlandia ha demostrado que el 42% de los casos de cáncer de próstata fueron atribuibles a la herencia. Consecuentemente se ha observado mayor riesgo de la enfermedad en hermanos de pacientes afectados en comparación con los hijos de los mismos pacientes. Esto ha llevado a la hipótesis de que hay un componente genético ligado a X o recesivo en el riesgo de cáncer de próstata.
Exploraciones en el genoma completo en familias afectadas implicadas al menos en siete locus con sensibilidad al cáncer de próstata, HPC1 (1q24), CAPB (1 p 36), PCAP (1q42), ELAC2 (17p11), HPC20 (20q13), 8 p22-23 y HPCX (Xq27-28). Recientemente, se han asignado a estos locus tres genes experimentales de cáncer de próstata hereditario, ribonucleasa L dependiente de HPC1/2'-5'-oligoadenilato (RNASEL) en el cromosoma 1q24-25, gen del fagocitador 1de macrófagos (MSR1) situado en el cromosoma 8p22-23 y HPC2/ELAC2 en el cromosoma 17p11.
Se ha estimado que genes con sensibilidad al cáncer de próstata probablemente representan sólo el 10% de los casos de cáncer de próstata hereditario. Los cánceres de próstata familiares son los más probablemente relacionados con los factores ambientales compartidos o con variantes genéticas o polimorfismos más comunes. Dado que dichas variantes pueden ocurrir con mucha frecuencia en la población afectada, su impacto sobre el riesgo de cáncer de próstata puede ser sustancial.
Recientemente, se han estudiado polimorfismos en los genes que codifican el receptor del andrógeno (AR), 5a- reductasa tipo II (SRD5A2), CYP17, CYP3A, receptor de vitamina D (VDR), PSA, GST-T1, GST-M1, GST-P1, factor de crecimiento insulínico (IGF-I) y proteína de unión a IGF 3 (IGFBP3).
Estos estudios fueron realizados para comprobar si estos genes pueden predecir la presencia de cáncer de próstata en los pacientes indicados para las biopsias de próstata debido a concentraciones de PSA > 3 ng/ml. No se encontraron asociaciones entre genotipos de AR, SRD5A2, CYP17, CYP3A4, VDR, GST-M1, GST-P1 e IGFBP3 y riesgo de cáncer de próstata. Sólo los polimorfismos GST-T1 y IGF-I se encontraron que estaban moderadamente relacionados con el riesgo de cáncer de próstata.
A diferencia del gen de poliposis adenomatosa coli (APC) en cáncer de colon familiar, ninguno de los genes y locus con sensibilidad al cáncer de próstata mencionados es por sí mismo responsable de la mayor parte de los cánceres de próstata.
Estudios epidemiológicos apoyan la idea de que más cánceres de próstata pueden ser atribuidos a factores como la raza, la forma de vida y la alimentación. El papel de las mutaciones génicas en conocidos oncogenes y genes supresores de tumores es probablemente muy pequeño en el cáncer primario de próstata. Por ejemplo, la frecuencia de las mutaciones de p53 en el cáncer de próstata primario está publicado que es baja, pero se han observado en casi el 50% de los cánceres de próstata avanzados.
La detección en hombres de la presencia de mutaciones o polimorfismos en el gen específico del cáncer es lenta y costosa. Por otra parte, es muy poco eficaz en la detección de cánceres primarios de próstata en la población masculina general. Por lo tanto, no puede aplicarse como una prueba para la detección el cáncer de próstata.
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El ADN mitocondrial está presente en aproximadamente 1.000 a 10.000 copias por célula. Debido a estas cantidades, mutaciones de ADN mitocondrial se han utilizado como blanco para el análisis de ADN del plasma y suero de pacientes con cáncer de próstata. Recientemente, se detectaron mutaciones de ADN mitocondrial en tres de cada tres pacientes con cáncer de próstata tenían las mismas mutaciones de ADN mitocondrial en su tumor primario. Diferentes muestras de tumor urológico deben estudiarse y mayores grupos de pacientes son necesarios para definir la sensibilidad general del diagnóstico de este método.
Las alteraciones críticas en la expresión génica pueden conducir a la evolución del cáncer de próstata. Alteraciones de microsatélites, que son secuencias de ADN repetitivas polimórficas, aparecen a menudo como pérdida de heterocigosidad (PDH) o como inestabilidad de microsatélites. En el cáncer de próstata se conocen alteraciones definidas de microsatélites. Hasta ahora, la utilidad clínica es insignificante. Los chips del genoma completo y de SNP se consideran herramientas poderosas de descubrimiento.
Las alteraciones en el ADN, sin cambiar el orden de las bases en la secuencia, conducen a menudo a cambios en la expresión génica. Estas modificaciones epigenéticas incluyen cambios tales como metilación del ADN y la acetilación/desacetilación de histonas. Muchos activadores de genes contienen regiones ricas en GC también conocidas como islas de CpG. La metilación anormal de islas de CpG da como resultado la transcripción disminuida del gen en el ARNm.
Recientemente, se ha sugerido que el estado de metilación de ADN puede ser influenciado en primeros años de vida por exposiciones ambientales, tales como factores nutricionales o el estrés, y que esto lleva a un mayor riesgo de cáncer en adultos. Se han observado cambios en los patrones de metilación del ADN en muchos tumores humanos. Para la detección de la hipermetilación del activador se utiliza una técnica llamada PCR específica de metilación (MSP). En contraste con los análisis de microsatélites o PDH, esta técnica requiere una relación de tumor a normal de sólo 0,1-0,001%. Esto significa que utilizando esta técnica, pueden detectarse alelos hipermetilados en el ADN del tumor en presencia de 104 -105 cantidades en exceso de alelos normales.
Por lo tanto, la metilación del ADN puede servir como un marcador útil en la detección del cáncer. Recientemente, ha habido muchos informes sobre los genes hipermetilados en cáncer de próstata humano. Dos de estos genes son RASSF1A y GSTP1.
La hipermetilación de RASSF1A (isoforma A de la proteína de la familia con dominio de asociación ras) es un fenómeno común en el cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y cáncer de próstata. El crecimiento de las células cancerosas humanas puede reducirse cuando se expresa nuevamente RASSF1A. Esto apoya el papel de RASSF1A como gen supresor del tumor. Inicialmente no se detectó hipermetilación de RASSF1A en el tejido prostático normal. Recientemente, la metilación del gen RASSF1A se observó en neoplasias intraepiteliales prostáticas pre-malignas y en epitelios prostáticos benignos. La hipermetilación de RASSF1A se ha observado en el 60-74% de los tumores de próstata y en el 18,5% de las muestras de HPB. Además, la frecuencia de metilación está claramente relacionada con la alta puntación de Gleason y la fase. Estos resultados sugieren que la hipermetilación de RASSF1A puede distinguir los tumores más agresivos de los indoloros.
La alteración epigenética más descrita en el cáncer de próstata es la hipermetilación del activador de la Glutatión S- transferasa P1 (GSTP1). GSTP1 pertenece al sistema de protección celular contra los efectos tóxicos y como tal esta enzima está implicada en la desintoxicación de muchos xenobióticos.
La hipermetilación de GSTP1 se ha descrito en aproximadamente el 6% de las lesiones de atrofia proliferativa inflamatoria (PIA) y en el 70% de las lesiones PIN. Se ha demostrado que algunas lesiones de PIA se combinan directamente con PIN y las lesiones de carcinoma precoz, aunque son necesarios estudios adicionales para confirmar estos resultados. Se ha detectado hipermetilación de GSTP1 en más del 90% de los tumores de próstata, mientras que no se ha observado hipermetilación en la HBP y los tejidos de próstata normales.
La hipermetilación del gen GSTP1 se ha detectado en el 50% de los eyaculados de pacientes de cáncer de próstata pero no en hombres con HBP. Debido al hecho de que los eyaculados no son siempre fácilmente obtenidos de pacientes de cáncer de próstata, la hipermetilación del GSTP1 se determinó en los sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con cáncer de próstata después de masaje prostático. El cáncer podría detectarse en el 77% de estos sedimentos.
Por otra parte, la hipermetilación del GSTP1 se ha encontrado en los sedimentos urinarios después de masaje prostático en 68% de los pacientes con enfermedad precoz confinada, el 78% de los pacientes con enfermedad localmente avanzada, el 29% de los pacientes con PIN y 2% de los pacientes con HBP. Estos resultados dieron lugar a una sensibilidad del 73% y una especificidad del 98%. El valor predictivo negativo de esta prueba fue del 80%, lo que demuestra que este análisis tiene gran potencial para reducir el número de biopsias innecesarias.
Recientemente, se confirmaron estos resultados y se observó una mayor frecuencia de metilación de GSTP1 en la orina de hombres con enfermedad en fase 3 frente a en fase 2.
Debido a que la hipermetilación de GSTP1 tiene una gran especificidad para el cáncer de próstata, la presencia de hipermetilación de GSTP1 en sedimentos urinarios de pacientes con biopsias negativas (33%) y pacientes con
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atipias o PIN de alto grado (67%) sugiere que estos los pacientes pueden tener cáncer de próstata oculto.
Recientemente, se probó un ensayo multiplexado que consta de 3 marcadores de metilación, GSTP1, RARB, APC y una referencia endógena en muestras de orina de pacientes con concentraciones séricas de PSA >2,5 pg/l. Se observó una buena correlación de GSTP1 con el número de núcleos positivos a cáncer de próstata en la biopsia. Además, las muestras que contenían metilación para GSTP1 o RARB se correlacionaron con volúmenes tumorales mayores. Los genes metilados tienen potencial para proporcionar una nueva generación de biomarcadores del cáncer.
Los estudios con microchips han sido muy útiles e informativos para identificar genes que están constantemente regulados por incremento o regulados por disminución en el cáncer de próstata en comparación con el tejido prostático benigno. Estos genes pueden proporcionar biomarcadores específicos para el cáncer de próstata y dar más información en la etiología de la enfermedad.
Para el diagnóstico molecular del cáncer de próstata, los genes que están muy regulados por incremento en el cáncer de próstata en comparación con la expresión baja o normal en el tejido prostático normal son de especial interés. Dichos genes podrían permitir la detección de una célula tumoral en un enorme fondo de células normales, y por lo tanto podrían aplicarse como marcadores de diagnóstico en la detección del cáncer de próstata.
El análisis diferencial de expresión génica se ha utilizado con éxito para identificar biomarcadores específicos de cáncer de próstata al comparar tejidos de próstata malignos con no malignos. Recientemente, se utilizó un nuevo método bioestadístico llamado análisis de perfil atípico del cáncer (COPA) para identificar genes que se expresan diferencialmente en un subconjunto de cánceres de próstata. COPA identificó potentes perfiles atípicos para el oncogén E26 del virus de la eritroblastosis v-ets (ERG) y gen 1 variante ets (ETV1) en el 57% de los casos de cáncer de próstata. Esto estaba en concordancia con los resultados de un estudio donde la sobreexpresión de ERG asociada al cáncer de próstata se encontró en el 72% de los casos de cáncer de próstata. En más del 90% de los casos que sobreexpresaron ERG o ETV1 se encontró una fusión de la región 5' no traducida del gen de serina proteasa transmembrana específico de la próstata y regulado por andrógenos (TMPRSS2) con estos miembros de la familia ETS. Recientemente, se ha descrito otra fusión entre TMPRSS2 y un miembro de la familia ETS, la fusión TMPRSS2-ETV4, aunque esta fusión se encuentra esporádicamente en cánceres de próstata.
Además, se encontró una fusión de TMPRSS2 con ETV5. Se demostró que la sobreexpresión de ETV5 in vitro induce un programa de transcripción invasivo. Estas fusiones pueden explicar la aberrante sobreexpresión dependiente de andrógenos de los miembros de la familia ETS en subconjuntos de cáncer de próstata porque TMPRSS2 está regulado por andrógenos. El descubrimiento de la fusión del gen TMPRSS2-ERG y el hecho de que ERG es el proto-oncogén sobreexpresado más frecuentemente descrito en las células epiteliales prostáticas malignas sugiere su papel en la tumorigénesis de próstata. Se han descrito fusiones de la región 5' no traducida del gen TMPRSS2 con los factores de transcripción de ETS ERG, ETV1 y ETV4 en el cáncer de próstata.
Recientemente, se demostró que la detección no invasiva de transcritos de fusión TMPRSS2-ERG es factible en sedimentos urinarios obtenidos después del ERD usando un ensayo de investigación basado en RT-PCR. Debido a la alta especificidad de la prueba (93%), la combinación de transcritos de fusión TMPRSS2-ERG con el gen 3 del cáncer de próstata (PCA3) mejoró la sensibilidad del 62% (PCA3 solo) al 73% (combinado) sin afectar la especificidad para detectar el cáncer de próstata.
Se ha encontrado que el gen que codifica la a-metilacil-CoA racemasa (AMACR) en el cromosoma 5p13 está constantemente regulado por incremento en el cáncer de próstata. Esta enzima desempeña una función crítica en la oxidación peroxisomal beta de moléculas de ácidos grasos con cadena ramificada obtenidas a partir de productos lácteos y carne de vacuno. Curiosamente, el consumo de lácteos y carne de vacuno se ha asociado a un mayor riesgo de cáncer de próstata.
En el tejido de cáncer de próstata clínico, se ha encontrado una sobreexpresión de 9 veces del AMACR ARNm en comparación con el tejido de próstata normal. Estudios inmunohistoquímicos (IHC) y análisis de transferencia Western han confirmado la regulación por incremento de AMACR en las proteínas. Además, se ha demostrado que el 88% de los casos de cáncer de próstata y tanto las metástasis no tratadas como los cánceres de próstata resistentes a hormonas fueron muy positivos a AMACR. La expresión de AMACR no se ha detectado en glándulas atróficas, hiperplasia de células basales y epitelio urotelial o metaplasia. Los estudios de IHC también demostraron que la expresión de AMACR en biopsias con aguja tenía una sensibilidad del 97% y una especificidad del 100% para la detección de cáncer de próstata.
Combinado con una tinción para p63, un marcador de células basales que no está en el cáncer de próstata, AMACR facilitó en gran medida la identificación de células de próstata malignas. Su alta expresión y la especificidad de las células cancerígenas implican que AMACR también puede ser un candidato para el desarrollo de sondas moleculares que pueden facilitar la identificación del cáncer de próstata utilizando modalidades de diagnóstico por la imagen no invasivas.
Se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar un ensayo basado en fluidos corporales para AMACR. Un pequeño estudio indicó que un análisis de PCR en tiempo real cuantitativo basado en AMACR en muestras de orina
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obtenidas después del masaje prostético tiene el potencial de excluir a los pacientes con enfermedad clínicamente insignificante cuando la expresión del AMACR ARNm se normaliza para el PSA. El análisis de transferencia Western en muestras de orina obtenidas después del masaje prostático tuvo una sensibilidad del 100%, una especificidad del 58%, un valor predictivo positivo (VPP) del 72% y un valor predictivo negativo (VPN) del 88% para el cáncer de próstata. Estos ensayos que usan AMACR ARNm para la detección de cáncer de próstata en muestras de orina son prometedores.
Usando análisis de chip de ADNc, se ha demostrado que la hepsina, una serina proteasa transmembrana de tipo II, es uno de los genes sobreexpresados de manera más diferenciada en el cáncer de próstata en comparación con el tejido de próstata normal y el tejido de BPH. Usando un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real, se ha demostrado que la hepsina está sobreexpresada en el 90% de los tejidos de cáncer de próstata. En el 59% de los cánceres de próstata, esta sobreexpresión fue de 10 veces mayor.
También ha habido una correlación significativa entre la regulación por incremento de hepsina y el grado tumoral. Se necesitarán más estudios para determinar la especificidad hística de la hepsina y el valor diagnóstico de esta serina proteasa como nuevo marcador sérico. Dado que la hepsina está regulada por incremento en tumores avanzados y más agresivos, sugiere un papel como marcador de tejido pronóstico para determinar la agresividad de un tumor.
La telomerasa, una ribonucleoproteína, participa en la síntesis y reparación de los telómeros que cubren y protegen los extremos de los cromosomas eucarióticos. Los telómeros humanos consisten en repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG así como varias proteínas de unión diferentes. Durante la división celular, los telómeros no se pueden replicar por completo y serán más cortos. La telomerasa puede alargar los telómeros y así evitar el acortamiento de estas estructuras. La división celular en ausencia de actividad de telomerasa conducirá al acortamiento de los telómeros. Como resultado, la vida útil de las células se vuelve limitada y esto conducirá al envejecimiento y la muerte celular.
En las células tumorales, incluidas las células de cáncer de próstata, los telómeros son significativamente más cortos que en las células normales. En las células cancerosas con telómeros cortos, se requiere la actividad de la telomerasa para escapar del envejecimiento y permitir el crecimiento inmortal. Se ha encontrado una alta actividad de la telomerasa en el 90% de los cánceres de próstata y se ha demostrado que está ausente en el tejido prostático normal.
En un pequeño estudio sobre 36 muestras de telomerasa la actividad se ha utilizado para detectar células de cáncer de próstata en orina evacuada o lavado uretral después de un masaje prostático. Esta prueba tenía una sensibilidad del 58% y una especificidad del 100%. El valor predictivo negativo de la prueba fue del 55%.
Aunque ha sido un estudio pequeño y preliminar, el bajo valor predictivo negativo indica que la actividad de la telomerasa medida en muestras de orina no es muy prometedora para reducir el número de biopsias innecesarias.
La cuantificación de la subunidad catalítica de la telomerasa, hTERT, mostró una sobreexpresión media de hTERT ARNm de 6 veces en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos de próstata normales. Se encontró una relación significativa entre la expresión de hTERT y la fase tumoral, pero no con puntuación de Gleason. La cuantificación de hTERT usando PCR en tiempo real demostró que hTERT podría distinguir los tejidos de cáncer de próstata de los tejidos de próstata no malignos. Sin embargo, hTERT ARNm se expresa en leucocitos, que están regularmente presentes en los fluidos corporales, como la sangre y la orina. Esto puede producir falsos positivos. Como tal, la medición cuantitativa de hTERT en fluidos corporales no es muy prometedora como herramienta de diagnóstico para el cáncer de próstata.
El antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) es una glucoproteína transmembrana que se expresa en la superficie de las células epiteliales de próstata. La expresión de PSMA parece estar restringida a la próstata. Se ha demostrado que el PSMA aumenta en el tejido del cáncer de próstata en comparación con los tejidos de próstata benignos. No se ha encontrado una superposición en la expresión de PSMA entre BPH y el cáncer de próstata, lo que indica que PSMA es un marcador de diagnóstico muy prometedor.
Recientemente, se ha demostrado que la expresión alta de PSMA en los casos de cáncer de próstata se correlaciona con el grado tumoral, la fase patológica, la aneuploidía y la recaída bioquímica. Además, la expresión incrementada de PSMA ARNm en cánceres de próstata primarios y metástasis se correlacionaba con la sobreexpresión de la proteína PSMA. Su utilidad clínica como marcador de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de próstata se ha visto obstaculizada por la falta de un inmunoanálisis sensible para esta proteína. Sin embargo, una combinación de chips ProteinChip® (Ciphergen Biosystems) y SELDI-TOF MS ha llevado a la introducción de un inmunoanálisis de biochips de proteínas para el análisis cuantitativo de PSMA en suero. Se demostró que los niveles séricos promedio de PSMA en pacientes con cáncer de próstata era significativamente mayor en comparación con los de hombres con BPH y referencias sanas. Estos hallazgos implican un papel para la PSMa sérica para distinguir a los hombres con BPH de los pacientes con cáncer de próstata. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar su valor diagnóstico.
Una combinación de chips ProteinChip® y SELDI-TOF MS ha llevado a la introducción de un inmunoanálisis con biochip de proteínas para la cuantificación de PSMA en el suero. Se demostró que las concentraciones promedio de
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PSMA en el suero para pacientes con cáncer de próstata eran significativamente más altas en comparación con las de los hombres con BPH y referencias sanas. Estos resultados implican un papel para la PSMA sérica para distinguir a los hombres con BPH de los pacientes con cáncer de próstata. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar su valor diagnóstico.
Los estudios de RT-PCR han demostrado que PSMA en combinación con su variante de empalme PSM' podría usarse como un marcador de pronóstico para el cáncer de próstata. En la próstata normal, la expresión de pSm' es mayor que la expresión de PSMA. En los tejidos de cáncer de próstata, la expresión de PSMA es más dominante. Por lo tanto, la relación de PSMA a PSM' es muy indicativa de la evolución de la enfermedad. Diseñar un análisis cuantitativo de PCR que discrimine entre las dos formas de PSMA podría generar otra aplicación para PSMA en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata.
Debido a su expresión específica en las células epiteliales de próstata y su aumento en el cáncer de próstata, PSMA se ha convertido en el objetivo de los tratamientos. Las estrategias propuestas van desde toxinas específicas y radionúclidos a agentes inmunoterapéuticos. Productos de primera generación han entrado en pruebas clínicas.
Delta-catenina (p120/CAS), una proteína asociada a la unión adhesiva, ha demostrado ser muy discriminativa entre BPH y el cáncer de próstata. Los estudios de hibridación in situ mostraron la expresión más alta de transcritos de 8- catenina en el adenocarcinoma de próstata y una expresión baja o nula en el tejido de BPH. La sobreexpresión media de 8-catenina en el cáncer de próstata en comparación con BPH es 15,7 veces.
Tanto la PCR cuantitativa como el análisis de hibridación in situ no pudieron encontrar una correlación entre la expresión de 8-catenina y las puntuaciones de Gleason.
El aumento de la expresión de 8-catenina en el cáncer de próstata humano da como resultado alteraciones del ciclo celular y genes de supervivencia, favoreciendo así la progresión tumoral. Se detectó 8-catenina en prostasomas de orina humanos evacuados sin células. La inmunorreactividad de 8-catenina aumentó significativamente en la orina de pacientes con cáncer de próstata. Se necesitan más estudios para evaluar su utilidad potencial en el diagnóstico del cáncer de próstata.
PCA3, anteriormente conocido como DD3, ha sido identificado usando análisis de expresión diferencial. Se encontró que PCA3 estaba muy sobreexpresada en tumores de próstata en comparación con el tejido de próstata normal del mismo paciente usando análisis de transferencia Northern. Además, se encontró que PCA3 se sobreexpresaba fuertemente en más del 95% de las muestras de cáncer de próstata primario y en la metástasis del cáncer de próstata. Además, la expresión de PCA3 está restringida al tejido prostático, es decir, no se ha encontrado expresión en otros tejidos humanos normales.
El gen que codifica PCA3 se encuentra en el cromosoma 9q21.2. El PCA3 ARNm contiene una alta densidad de codones de terminación. Por lo tanto, falta un marco de lectura abierto que lo que da como resultado un ARN no codificante. Recientemente, se ha desarrollado un análisis cuantitativo RT-PCR resuelto en el tiempo (que utiliza un patrón interno y una curva de calibración externa). El poder de cuantificación preciso de este análisis mostró un aumento medio de 66 veces de PCA3 en el tejido de cáncer de próstata en comparación con el tejido de próstata normal. Por otra parte, se encontró un aumento medio de 11 veces en los tejidos de próstata que contienen menos del 10% de las células de cáncer de próstata. Esto indicó que PCA3 era capaz de detectar un pequeño número de células tumorales en un gran fondo de células normales.
Esta hipótesis ha sido probada usando el análisis cuantitativo RT-PCR en muestras de orina evacuadas. Estas muestras de orina se obtuvieron después del examen rectal digital (ERD) de un grupo de 108 hombres a quienes se les había indicado biopsias de próstata en base a un valor de PSA sérico total de más de 3 ng/ml. Esta prueba tenía 67% de sensibilidad y 83% de especificidad usando biopsias prostáticas como patrón oro de la presencia de un tumor. Además, esta prueba tenía un valor predictivo negativo del 90%, lo que indica que la determinación cuantitativa de transcritos de PCA3 en sedimentos urinarios obtenidos después de un extenso masaje de próstata tiene un gran potencial en la reducción del número de biopsias invasivas guiadas por TRUS en esta población de hombres.
La especificidad hística y la alta sobreexpresión en tumores de próstata indican que PCA3 es el gen más específico para el cáncer de próstata descrito hasta ahora. Gen-probe Inc. tiene la licencia mundial exclusiva para la tecnología PCA3. Los estudios multicéntricos que usan el análisis de PCA3 validado pueden proporcionar la primera base para el diagnóstico molecular en la práctica urológica clínica.
La expresión modulada de las proteínas HSP-27 citoplasmáticas y los miembros de la familia de la isoenzima PKC se han correlacionado con la evolución del cáncer de próstata.
La modulación de la expresión ha identificado claramente aquellos cánceres que son agresivos y, por lo tanto, aquellos que pueden requerir tratamiento urgente, independientemente de su morfología. Aunque no se emplean ampliamente, los anticuerpos contra estas proteínas están autentificados, están disponibles en el mercado y son sencillos en su aplicación e interpretación, especialmente junto con otros reactivos como preparados doblemente teñidos.
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La importancia de este grupo de marcadores es que distinguen con precisión los cánceres de próstata de fenotipo agresivo. Modulados en su expresión por cánceres invasivos, en comparación con los tejidos prostáticos no neoplásicos, los tumores malignos que expresan HSP27 o PKCp a alto nivel presentan invariablemente un resultado clínico pobre. El mecanismo de esta asociación garantiza dilucidación y validación.
Los factores de transcripción E2F, incluido el E2F3 situado en el cromosoma 6p22, modulan directamente la expresión de EZH2. La sobreexpresión del gen EZH2 ha sido importante en el desarrollo del cáncer de próstata humano.
Varambally y colegas identificaron EZH2 como un gen sobreexpresado en cáncer de próstata metastásico resistente a hormonas y demostraron que los pacientes con cánceres de próstata clínicamente localizados que expresan EZH2 tienen una evolución peor que los que no expresan la proteína.
Usando chips de tejido, la expresión de altos niveles de E2F3 nuclear ocurre en una gran proporción de cánceres de próstata humanos, pero es un caso raro en el epitelio prostático no neoplásico. Estos datos, junto con otra información publicada, sugirieron que el eje de referencia pRB-E2F3-EZH2 puede tener un papel crucial en la modulación de la agresividad de los cánceres de próstata humanos individuales.
El principal desafío para diagnósticos moleculares es la identificación del cáncer de próstata clínicamente insignificante, es decir, separar los cánceres biológicamente agresivos de los tumores indoloros. Además, los marcadores que predicen y controlan la respuesta al tratamiento se necesitan urgentemente.
En los establecimientos clínicos actuales el sobrediagnóstico y el sobretratamiento se vuelve cada vez más manifiestos, lo que subraya la necesidad de biomarcadores que pueden ayudar en la identificación precisa de los pacientes que no necesitan tratamiento y que lo necesitan.
El uso de la inmunohistoquímica de AMACR se usa ahora en la identificación de procesos malignos en la próstata, lo que ayuda al diagnóstico del cáncer de próstata. Lamentablemente, la introducción de marcadores moleculares en el tejido como herramienta de pronóstico no ha sido validada para ninguno de los marcadores expuestos.
Las experiencias en las últimas dos décadas han revelado la complejidad práctica y logística en la traducción de marcadores moleculares en uso clínico. Varios esfuerzos prospectivos, teniendo en cuenta estos problemas, están actualmente en curso para establecer la utilidad clínica de una serie de marcadores. Claramente, las biorreservas de tejido de muestras bien documentadas, incluidos los datos de seguimiento clínico, desempeñan un papel fundamental en el proceso de validación.
Nuevas pruebas de fluidos corporales basadas en la hipermetilación de GSTP1 y el gen PCA3, que está muy sobreexpresado en el cáncer de próstata, permitieron la detección del cáncer de próstata en fluidos corporales obtenidos de manera no invasiva, como la orina o los eyaculados.
La aplicación de nuevas tecnologías ha demostrado que una gran cantidad de genes han aumentado en el cáncer de próstata. Por ejemplo, el documento WO 2009/042742 describe un método para diagnosticar in vitro cáncer de próstata en un ser humano determinando la expresión de DLX1, estableciendo su aumento o disminución y posteriormente diagnosticando el cáncer de próstata.
Aunque los marcadores descritos anteriormente, al menos parcialmente, abordan la necesidad en la técnica de marcadores tumorales, y especialmente marcadores tumorales de próstata, existe una necesidad continua de marcadores tumorales (prostáticos) fiables, y especialmente marcadores indicativos del curso de la enfermedad.
Es un objeto de la presente invención, entre otros, alcanzar al menos parcialmente, si no completamente, el objeto anterior.
Según la presente invención, el objeto anterior, entre otros, se cumple mediante marcadores tumorales y métodos como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
Específicamente, el objeto anterior, entre otros, se cumple mediante un método para el diagnóstico in vitro de cáncer de próstata en un ser humano que comprende:
- determinar la expresión de DLX1; y
- establecer el aumento o disminución de la expresión de la expresión de DLX1 en comparación con la expresión de DLX1 en una muestra de un individuo sin cáncer de próstata;
proporcionando de ese modo dicho diagnóstico de cáncer de próstata.
Según la presente invención, el diagnóstico del cáncer de próstata preferiblemente comprende el diagnóstico, el pronóstico y/o la predicción de la supervivencia de la enfermedad.
Según la presente invención, el análisis de expresión comprende establecer una expresión aumentada o disminuida
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de un gen en comparación con la expresión del gen en un tejido de cáncer no prostético, es decir, en condiciones sin enfermedad.
Según una realización preferida, el presente método se realiza en muestras urinarias, preferiblemente de sedimentos urinarios.
Según una realización preferida del presente método, determinar la expresión comprende determinar la expresión de ARNm de dichos gen o más genes.
El análisis de expresión basado en ARNm es generalmente conocido en la técnica y se practica rutinariamente en laboratorios de diagnóstico en todo el mundo. Por ejemplo, las técnicas adecuadas para el análisis de ARNm son técnicas basadas en la hibridación y amplificación de transferencia Northern tales como PCR, y especialmente PCR en tiempo real, y NASBA.
Según una realización particularmente preferida, el análisis de expresión comprende un análisis de chips de ADN de alto rendimiento que no solo permite el análisis simultáneo de múltiples muestras sino también un procesamiento de análisis automático.
El presente método proporciona diagnóstico de cáncer de próstata en un ser humano seleccionado del grupo consistente en diagnosticar PrCa de alto grado (HG), PrCa Met y CPRC.
LG indica PrCa de bajo grado (puntuación de Gleason igual o menor a 6) y representa pacientes con buen pronóstico. HG indica PrCa de alto grado (puntuación de Gleason de 7 o más) y representa pacientes con mal pronóstico. CPRC indica cáncer de próstata resistente a la castración y representa a pacientes con enfermedad agresiva localizada. Por último, PrCa Met representa pacientes con mal pronóstico.
Según una realización particularmente preferida del presente método, la presente invención proporciona el diagnóstico de CPRC.
Teniendo en cuenta el valor de diagnóstico de los genes presentes como biomarcadores de cáncer de próstata, la presente invención también se refiere al uso de DLX1 para el diagnóstico in vitro del presente cáncer de próstata.
En la presente descripción, se hace referencia a genes adecuados como biomarcadores para cáncer de próstata al
referirse a sus nombres arbitrariamente asignados. Aunque el experta en la técnica es capaz de identificar fácilmente y usar los genes presentes como biomarcadores basándose en estos nombres, las figuras adjuntas proporcionan tanto la secuencia de ADNc como las secuencias de proteínas de estos genes en la base de datos pública como también las referencias que describen estos genes. Basándose en los datos proporcionados en las figuras, el experto en la técnica, sin excesiva experimentación y usando medios normales de biología molecular, será capaz de determinar la expresión de los biomarcadores indicados en una muestra proporcionando de este modo el presente método de diagnóstico.
La presente invención se aclarará más en los siguientes ejemplos. En los ejemplos, se hace referencia a las figuras, en las que:
Figuras 1-13: muestran las secuencias de ARNm y aminoácidos del gen ACSM1 (NM_052956, NP_443188); del gen ALDH3B2 (NM_000695, NP_000686); del gen CGREF1 (NM_006569, NP_006560); del gen COMP (NM_000095, NP_000086); del gen C19orf48 (NM_199249, NP_954857); del gen DLX1 (NM_178120, NP_835221); del gen GLYATL1 (NM_080661, NP_542392); del gen MS4A8B (NM_031457, NP_113645); del gen NKAIN1 (NM_024522, NP_078798); del gen PPFIA2
(NM_003625, NP_003616); del gen PTPRT (NM_133170, NP_573400); del gen TDRD1
(NM_198795, NP_942090) y del gen UGT2B15 (NM 001076, NP 001067).
Figuras 14-26: muestra diagramas de caja basados en los datos de validación de TLDA en los grupos de próstata
normal (NPr), BPH, cáncer de próstata de bajo grado (LG PrCa), HG, cáncer de próstata de alto
grado (HG PrCa), CPRC, metástasis de cáncer de próstata (PrCa Met), vejiga normal, linfocitos de sangre periférica (PBL) y sedimentos urinarios.
Figuras 27-33: muestran las secuencias de ADNc y aminoácidos del gen HOXC6 (NM_004503.3, NP_004494.1); del gen SFRP2 (NM_003013.2, NP_003004.1); del gen HOXD10 (NM_002148.3, NP_002139.2); del gen RORB (NM_006914.3, NP_008845.2); del gen RRM2 (NM_001034.2, NP_001025.1); del gen TGM4 (NM_003241.3, NP_003232.2); y del gen SNAI2 (NM_003068.3, NP_003059.1,
respectivamente;
Figuras 34-40: muestran los datos del TLDA en diagrama de caja basados en el análisis de expresión del grupo LG (bajo grado), HG (alto grado), CPRC (resistente a la castración) y PrCa Met (metástasis del cáncer de próstata) del gen HOXC6 (NM_004503.3); del gen SFRP2 (NM_003013.2); del gen HOXD10 (NM_002148.3); del gen RORB (NM_006914.3,); del gen RRM2 (NM_001034.2); del gen TGM4 (NM_003241.3); y del gen SNAI2 (NM 003068.3), respectivamente. Np indica sin cáncer de próstata,
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es decir, niveles de expresión normales o estándar.
Ejemplo 1
Para identificar marcadores de cáncer de próstata agresivo, se utilizó el perfil de expresión génica (chips Affymetrix exon 1.0) de muestras de pacientes con cáncer de próstata en las siguientes categorías:
Se usaron muestras de próstata en las siguientes categorías:
- Próstata normal (NPr), n = 8.
- Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), n = 12.
- Cáncer de próstata de bajo grado (LG PrCa): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason <6 obtenidas después de prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con un buen pronóstico, n = 25.
- Cáncer de próstata de alto grado (HG PrCa): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason >7 obtenidas después de una prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con mal pronóstico, n = 24.
- Cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC): las muestras de tejido se obtienen de pacientes que están bajo tratamiento endocrino progresivo y que se someten a una resección transuretral de la próstata (RTUP), n = 23
- Metástasis de cáncer de próstata (Met PrCa): las muestras de tejido se obtienen de linfomas positivos después de LND o después de la autopsia. Este grupo representa pacientes con mal pronóstico, n = 7.
Además, para diagnosticar cáncer de próstata clínicamente significativo (pacientes con mal pronóstico), se determinaron los perfiles de expresión de las categorías pT2 (tumor confinado a la próstata, n = 10) y pT3 (cáncer de próstata localmente avanzado, n = 9).
El análisis de expresión se realiza según protocolos normalizados.
En pocas palabras, el tejido de pacientes con cáncer de próstata (pertenecientes a una de las últimas cuatro categorías mencionadas anteriormente) se obtuvo después de la prostatectomía radical o RTUP. La próstata normal se obtuvo de regiones sin cáncer de estas muestras o de la autopsia. El tejido de BPH se obtuvo de RTUP o prostatectomía abierta transvesical (Hryntschak). Los tejidos se congelaron rápidamente y las secciones de criostato se tiñeron H.E. para su clasificación por un patólogo
Se disecaron las áreas con tumor y sin tumor y se extrajo todo el ARN con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se purificó todo el ARN con el miniequipo Qiagen RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.). La integridad del ARN se comprobó por electroforesis usando Agilent 2100 Bioanalyzer.
A partir del ARN total purificado, se utilizó 1 |jg para el GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.). Según el protocolo de este ensayo, la mayoría del ARN ribosómico se eliminó utilizando un RiboMinus Human/ Mouse Transcriptoma Isolation Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Utilizando un hexámero aleatorio que incorpora un activador T7, se sintetizó ADNc bicatenario. Luego se generó ARNc a partir de la plantilla de ADNc bicatenario mediante una reacción de transcripción in vitro y se purificó utilizando el módulo de limpieza de muestras Affymetrix. El ADNc monocatenario se regeneró mediante una transcripción inversa cebada aleatoriamente usando una mezcla de dNTP que contenía dUTP. El ARN se hidrolizó con ribonucleasa H y el ADNc se purificó. El ADNc se fragmentó a continuación por incubación con una mezcla de endonucleasas de restricción UDG (uracil ADN glucosilasa) y APE1 (endonucleasa 1 apurínica/apirimidínica) y, por último, se marcó en el extremo mediante una reacción de transferasa terminal que incorpora un didesoxinucleótido biotinilado.
Se añadieron 5,5 jg del ADNc biotinilado y fragmentado a una mezcla de hibridación, se cargaron en un chip ST de Exón 1.0 humano y se hibridaron durante 16 horas a 45°C y 60 rpm.
Utilizando el chip de exón de Affymetrix, se miden indirectamente los genes por el análisis de exones cuyas mediciones se pueden combinar en mediciones de grupos de transcripción. Hay más de 300.000 grupos de transcripción en el chip, de los cuales 90.000 contienen más de un exón. De estos 90.000, hay más de 17.000 genes de alta confianza (CORE) que se utilizan en el análisis predeterminado. En total, hay más de 5,5 millones de elementos por chip.
Después de la hibridación, el chip se lavó y se tiñó según el protocolo de Affymetrix. El chip teñido se escaneó a 532 nm utilizando un Affymetrix GeneChip Scanner 3000, generando archivos cEl para cada chip.
Los valores de expresión en el exón procedían de las intensidades de hibridación en la sonda de archivo CEL
utilizando el algoritmo RMA basado en modelo tal como se realizó en el programa informático Affymetrix Expression Consolé™. RMA (Robust Multiarray Average) realiza la normalización, la corrección de fondo y el resumen de datos.
Los genes expresados diferencialmente entre las condiciones se calculan utilizando Anova (ANalysis Of Variance), prueba de la T para más de dos grupos.
5 La identificación del objetivo está sesgada ya que se analizaron grupos de riesgo clínicamente bien definidos. Los marcadores se clasifican según su función en la biología del cáncer. Para la identificación de marcadores se compararon diferentes grupos: NPr con LG- y HG PrCa, PrCa Met con LG- y HG PrCa, CPRC con LG- y HG PrCa. Por último, las muestras se clasificaron según el estadio clínico y se comparó PrCa confinado en un órgano (pT2) con PrCa no confinado en un órgano (pT3).
10 En base al análisis de expresión obtenido, se identificaron biomarcadores basados en 99 muestras de próstata; las diferencias en los niveles de expresión entre los diferentes grupos se proporcionan en la Tabla 1 a, b, c y d.
Tabla 1a: Diferencias de nivel de expresión entre PrCa de bajo grado (LG) y de alto grado (HG) frente a próstata normal (NPr) de 25 dianas según el análisis de 99 muestras muy comentadas
Símbolo del gen
Nombre del gen Asignación del gen Cambio de veces LG + HG frente a NPr Fila
CRISP3
proteína 3 secretora rica en cisteína NM_006061 17,05 aumento 1
GLYATL1
seudoglicina-N-aciltransferasa 1 NM_080661 10,24 aumento 2
AMACR
alfa-metilacil-CoA racemasa NM_014324 9,59 aumento 4
TARP
proteína alternativa del marco de lectura TCR gamma NM_001003799 9,42 aumento 5
ACSM1
miembro 1 de la familia de cadena media acil-CoA sintetasa NM_052956 8,43 aumento 7
TDRD1
dominio tudor que contiene 1 NM_198795 7,70 aumento 8
TMEM45B
proteína transmembrana 45B NM_138788 7,05 aumento 9
FOLH1
folato hidrolasa (antígeno de membrana específico de la próstata) 1 NM_004476 6,47 aumento 10
C19orf48
marco de lectura abierto 48 del cromosoma 19 NM_199249 5,91 aumento 12
ALDH3B2
familia de aldehído deshidrogenasa 3, miembro B2 NM_000695 5,66 aumento 13
NETO2
neurofilina (NRP) y seudotolloid (TLL) 2 NM_018092 5,63 aumento 14
MS4A8B
miembro 8B de la subfamilia A de 4 dominios que cubren la membrana NM_031457 5,00 aumento 18
TLCD1
dominio TLC que contiene 1 NM_138463 4,73 aumento 21
FASN
ácido graso sintasa NM_004104 4,69 aumento 22
GRPR
receptor del péptido liberador de gastrina NM_005314 4,51 aumento 24
HPN
hepsina NM_182983 4,44 aumento 25
PTPRT
proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, T NM_133170 4,21 aumento 29
TOP2A
topoisomerasa (ADN) II alfa 170 kDa NM_001067 3,79 aumento 37
FAM111B
miembro B de la familia con similitud de secuencia 111 NM_198947 3,77 aumento 39
NKAIN1
ATPasa interactuante 1 transportadora de NA+/K+ NM_024522 3,76 aumento 40
DLX1
homeosecuencia 1 menos distante NM_178120 3,54 aumento 52
TPX2
TPX2, homólogo, asociado a microtúbulos NM_012112 3,47 aumento 54
CGREF1
regulador de crecimiento celular con dominio mano EF NM_006569 3,22 aumento 66
DPT
Dermatopontina NM_001937 -6,31 disminución 2
ASPA
aspartoacilasa (enfermedad de Canavan) NM_000049 -5,17 disminución 7
Tabla 1b: Diferencias de nivel de expresión entre metástasis de cáncer de próstata (Met PrCa) frenta a PrCa de bajo grado (LG) y de alto grado (HG) de 11 dianas basadas en el análisis de 99 muestras muy comentadas
Símbolo del gen
Nombre del gen Asignación del gen Cambio de veces PrCa Met frente a LG + H Fila
PPFIA2
proteína a2 que interactúa con receptor tipo f de proteína tirosina fosfatasa NM_003625 4,59 aumento 3
CDC20
homólogo 20 del ciclo de división celular (S. cerevisiae) NM_001255 4,27 aumento 4
FAM110B
miembro B de la familia con similitud de secuencia 110 NM_147189 3,70 aumento 6
TARP
proteína alternativa del marco de lectura TCR gamma NM_001003799 3,26 aumento 12
ANLN
anillin, proteína de unión a actina NM_018685 3,17 aumento 13
KIF20A
miembro 20A de la familia de cinesina NM_005733 3,16 aumento 14
TPX2
TPX2, homólogo, asociado a microtúbulos NM_012112 3,15 aumento 15
CDC2
ciclo 2 de división celular, G1 a S y G2 a M NM_001130829 2,88 aumento 23
PGM5
fosfoglucomutasa 5 NM_021965 -15,71 disminución 10
MSMB
microseminoproteína, beta- NM_002443 -12,23 disminución 15
HSPB8
proteína 8 del choque térmico de 22 kDa NM_014365 -12,10 disminución 16
Tabla 1c: Diferencias de nivel de expresión entre CPRC frente a PrCa de bajo grado (LG) y alto grado (HG) de 21 5 dianas basadas en el análisis de 99 muestras muy comentadas
Símbolo del gen
Nombre del gen Asignación del gen Cambio de veces CPRC frente a LG + HG Fila
AR
Receptor de andrógenos NM_000044 4,66 aumento 1
UGT2B15
polipéptido B15 de la familia de UDP glucuronosiltranferasa 2 NM_001076 4,20 aumento 2
CDC20
homólogo 20 del ciclo de división celular (S. cerevisiae) NM_001255 3,86 aumento 4
TOP2A
topoisomerasa (ADN) II alfa 170 kDa NM_001067 3,54 aumento 5
MKI67
antígeno identificado por anticuerpo monoclonal Ki-67 NM_002417 3,47 aumento 6
TPX2
TPX2, homólogo, asociado a microtúbulos NM_012112 3,40 aumento 7
AKR1C1
Miembro C1 de la familia aldo-ceto reductasa 1 NM_001353 3,35 aumento 8
CDC2
ciclo 2 de división celular, G1 a S y G2 a M NM_001130829 3,21 aumento 10
ANLN
anillin, proteína de unión a actina NM_018685 3,08 aumento 11
KIF4A
miembro 4A de la familia de cinesina NM_012310 3,02 aumento 12
PTTG1
Transformante 1 del tumor de pituitaria NM_004219 2,95 aumento 13
KIF20A
miembro 20A de la familia de cinesina NM_005733 2,90 aumento 14
AKR1C3
Miembro C3 de la familia aldo-ceto reductasa 1 NM_003739 2,88 aumento 15
FAM111B
miembro B de la familia con similitud de secuencia 111 NM_198947 2,81 aumento 16
CKS2
subunidad 2 reguladora de proteína cinasa CDC28 NM_001827 2,79 aumento 19
UGT2B17
polipéptido B17, de la familia UDP glucuronosiltransferasa 2 NM_ 2,77 aumento 20
BUB1
incipiente no inhibido por homólogo 1 de bencimidazoles NM_004336 2,75 aumento 21
MSMB
microseminoproteína, beta- NM_002443 -6,99 disminución 6
NR4A1
miembro 1, grupo A, subfamilia 4 del receptor nuclear NM_002135 -6,57 disminución 7
MT1M
metalotioneína 1M NM_176870 -6,08 disminución 10
DUSP1
fosfatasa 1 de doble especificidad NM_004417 -5,59 disminución 12
Tabla 1d: Diferencias de nivel de expresión entre PrCa(pT2) confinada en el órgano frente a (pT3)PrCa no confinada en el órgano de 21dianas basadas en el análisis de 99 muestras muy comentadas
Símbolo del gen
Nombre del gen Asignación del gen Cambio de veces pT3 frente a pT2 Fila
TTN
Titina NM_133378 4,88 aumento 2
SSL
Sarcolipina NM_003063 3,62 aumento 3
PPFIA2
proteína a2 que interactúa con receptor tipo f de proteína tirosina fosfatasa NM_003625 3,47 aumento 4
COMP
proteína de matriz oligomérica del cartílago NM_000095 2,74 aumento 6
ABI3BP
miembro 3 de la familia ABI NM_015429 2,71 aumento 7
NEB
Nebulina NM_004543 2,58 aumento 8
MT1M
metalotioneína 1M NM_176870 -6,03 disminución 1
MT1G
metalotioneína 1G NM_005950 -3,61 disminución 2
5 Como puede verse claramente en la tabla 1, un aumento o disminución de la expresión de los genes mostrados se asoció con el cáncer de próstata, CPRC, metástasis de próstata o fase tumoral.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores obtenidos en 99 muestras tumorales, los datos de expresión demuestran claramente que estos genes son adecuados como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de próstata.
10 Ejemplo 2
Utilizando el perfil de expresión génica (chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, Affymetrix) en 99 muestras de próstata, se encontró que varios genes se expresan diferencialmente en próstata normal en comparación con cáncer de próstata y/o cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC) o se expresan diferencialmente entre el cáncer de próstata de bajo grado y de alto grado en comparación con CPRC y/o la metástasis del cáncer de próstata. Junto 15 con varios otros en los genes expresados diferencialmente chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, los niveles de expresión de estos genes se validaron usando los chips TaqMan® de baja densidad (TLDA, Applied Biosystems). En la Tabla 2, se muestra una descripción general de los genes validados.
Tabla 2: Ensayos de expresión génica utilizados para el análisis de TLDA
Símbolo del gen
Descripción ID del gen Tamaño del amplicón (pb)
ABI3BP
proteína de unión familia ABI, miembro 3 (NESH) NM_015429 84
ACSM1
miembro 1 de la familia de cadena media acil-CoA sintetasa NM_052956 74
ALDH3B2
familia de aldehído deshidrogenasa 3, miembro B2 NM_000695 126
AMACR
alfa-metilacil-CoA racemasa NM_014324 97
ANLN
anillina, proteína de unión a actina NM_018685 71
ASPA
aspartoacilasa (enfermedad de Canavan) NM_000049 63
BUB1
incipiente no inhibido por homólogo 1 de bencimidazoles NM_004336 61
C19orf48
marco de lectura abierto 48 del cromosoma 19 NM_199249 59
CDC2
ciclo 2 de división celular, G1 a S y G2 a M NM_033379 109
CDC20
Homólogo del ciclo 20 de división celular (S. cerevisiae) NM_001255 108
CGREF1
regulador de crecimiento celular con dominio mano EF NM_006569 58
CKS2
subunidad 2 reguladora de proteína cinasa CDC28 NM_001827 73
COMP
proteína de matriz oligomérica del cartílago NM_000095 101
CRISP3
proteína 3 secretora rica en cisteína NM_006061 111
DLX1
homeosecuencia 1 menos distal NM_178120 95
DPT
Dermatopontina NM_001937 67
DUSP1
fosfatasa 1 de doble especificidad NM_004417 63
ERG
homólogo de oncogén del virus E26 de la eritroblastosis v-ets NM_004449 104
FAM110B
miembro B de la familia con similitud de secuencia 110 NM_147189 74
FAM111B
miembro B de la familia con similitud de secuencia 111 NM_198947 68
FASN
sintasa de ácido graso NM_004104 62
FOLH1
folato hidrolasa (antígeno de membrana específico de la próstata) 1 NM_004476 110
GLYATL-1
seudoglicina-N-aciltransferasa 1 NM_080661 83
GRPR
receptor del péptido liberador de gastrina NM_005314 68
HPRT1
Hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 NM_000194 72
HSPB8
proteína 8 del choque térmico de 22 kDa NM_014365 66
KIF20A
miembro 20A de la familia de cinesina NM_005733 71
KIF4A
miembro 4A de la familia de cinesina NM_012310 88
MKI67
antígeno identificado por anticuerpo monoclonal Ki-67 NM_002417 66
MS4A8B
miembro 8B de la subfamilia A de 4 dominios que cubren la membrana NM_031457 62
MSMB
microseminoproteína, beta- NM_138634 149
MT1M
metalotioneína 1M NM_176870 144
NETO2
neurofilina (NRP) y seudotolloid (TLL) 2 NM_018092 66
NKAIN1
ATPasa interactuante 1 transportadora de NA+/K+ NM_024522 96
NR4A1
miembro 1, grupo A, subfamilia 4 del receptor nuclear NM_002135 79
PCA3
antígeno 3 del cáncer de próstata AF103907 52
PGM5
fosfoglucomutasa 5 NM_021965 121
PPFIA2
proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, polipéptido f NM_003625 66
PTPRT
proteína tirosina fosfatasa, receptor tipo T NM_133170 62
PTTG1
transformante 1 del tumor de pituitaria NM_004219 86
TDRD1
dominio tudor que contiene 1 NM_198795 67
TLCD1
dominio TLC que contiene 1 NM_138463 63
TMEM45B
proteína transmembrana 45B NM_138788 70
TOP2A
topoisomerasa (ADN) II alfa 170 kDa NM_001067 125
TPX2
TPX2, homólogo, asociado a microtúbulos NM_012112 89
5
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40
45
TIN
Titina NM_133378 85
UGT2B15
polipéptido B15 de la familia de UDP glucuronosiltranferasa 2 NM_001076 148
Se usaron muestras de próstata en las siguientes categorías:
- Próstata normal (NPr) (n = 6)
- Hiperplasia Prostética Benigna (HPB) (n = 6)
- Cáncer de próstata de bajo grado (LG PrCa) (n = 14): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason < 6 obtenidas después de prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con un buen pronóstico.
- Cáncer de próstata de alto grado (HG PrCa) (n = 14): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason > 7 obtenido después de la prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con mal pronóstico.
- Cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC) (n = 14): las muestras de tejido se obtienen de pacientes que son progresivos bajo terapia endocrina y que se sometieron a una resección transuretral de la próstata (RTUP).
- Metástasis del cáncer de próstata (Met PrCa) (n = 8): las muestras de tejido se obtienen de linfomas positivos después de la LND o después de la autopsia. Este grupo representa a pacientes con mal pronóstico.
Todas las muestras de tejido se congelaron rápidamente y las secciones de criostato se tiñeron con hematoxilina y eosina (H.E.). Estas secciones teñidas con H.E. fueron clasificadas por un patólogo.
Se disecaron áreas de tumor y sin tumor. El ARN se extrajo de secciones en serie de 10 pm de espesor que se recogieron de cada muestra de tejido en varios niveles. El tejido se evaluó mediante tinción con HE de secciones en cada nivel y se verificó al microscopio. El ARN total se extrajo con TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.
La cantidad y calidad de ARN se evaluaron en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, De., EE. UU.) yen un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA., EE. UU.).
Se transcribieron de forma inversa 2 |jg de ARN completo tratado con desoxirribonucleasa usando transcriptasa inversa SuperScript™ II (Invitrogen) en una reacción de 37, 5 jl según el protocolo del fabricante. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 25°C, 60 minutos a 42°C y 15 minutos a 70°C. Al ADNc, se añadieron 62, 5 jl de milliQ.
Para la validación, no solo se usaron muestras de tejido de próstata. Para investigar si los marcadores seleccionados podrían detectarse con éxito en fluidos corporales, también se incluyeron muestras normales de tejido de vejiga, de linfocitos de sangre periférica (PBL) y muestras de sedimento urinario en la etapa de validación del marcador. La señal de fondo de los marcadores en la vejiga normal y los sedimentos urinarios de pacientes sin cáncer de próstata debe ser baja.
Estas muestras de sedimento urinario se recogieron en tres hospitales una vez que todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento aprobado por la junta de revisión institucional. Las primeras muestras de orina evacuada se recogieron después del examen rectal digital (ERD) de hombres para los que se prevé cáncer de próstata. Después de la recogida de muestras de orina, el urólogo realizó biopsias de próstata según un protocolo normalizado. Se evaluaron las biopsias de próstata y, en caso de que hubiera cáncer de próstata, se determinó la puntuación de Gleason.
En primer lugar se recogió la orina evacuada después del ERD (20-30 ml) en un tubo codificado que contenía 2 ml de EDTA 0,5M, pH 8,0. Todas las muestras se enfriaron inmediatamente a 4°C y se enviaron en lotes con paquetes congelados al laboratorio de NovioGendix. Las muestras se procesaron en las 48 h posteriores a la adquisición de las muestras para garantizar una buena calidad de muestra. Tras la centrifugación a 4°C y 1.800 x g durante 10 minutos, se obtuvieron sedimentos urinarios. Estos sedimentos urinarios se lavaron dos veces con solución de cloruro de sodio tamponada enfriada con hielo (a 4°C y 1.800 x g durante 10 minutos), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70°C.
Se extrajo todo el ARN de estos sedimentos urinarios, utilizando el reactivo de aislamiento TriPure (Roche Diagnostics, Almere, Países Bajos) según el protocolo de los fabricantes.
Se añadieron dos pasos adicionales. En primer lugar se añadieron 2 jl de glucógeno (15 mg/ml) como vehículo
5
10
15
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40
(Ambion, Austin (TX), EE.UU.) antes de la precipitación con isopropanol. En segundo lugar, se realizó una segunda etapa de precipitación con acetato de sodio 3 M pH 5,2 y 100% de etanol para descartar restos de reactivo de aislamiento TriPure.
El ARN se disolvió en agua sin ribonucleasa y se incubó durante 10 minutos a 55-60°C. El ARN se trató con desoxirribonucleasa utilizando DNasal de calidad amplificación (Invitrogen™, Breda, Holanda) según el protocolo del fabricante. De nuevo se añadió glucógeno como vehículo y el ARN se precipitó con acetato de sodio 3 M pH 5,2 y etanol al 100% durante 2 horas a -20°C.
Después de eliminar los últimos restos de etanol, el sedimento de ARN se disolvió en 16,5 pl de agua exenta de ribonucleasa. La concentración de ARN se determinó mediante medición de D.O. (Nanodrop) y se usó 1 pg de ARN completo para la amplificación de ARN utilizando el kit de expresión Ambion®WT (Ambion, Austin (TX), EE. UU.) según el protocolo del fabricante.
Para determinar los niveles de expresiones génicas, el ADNc generado a partir del ARN extraído tanto de las muestras de tejido como de los sedimentos urinarios se utilizó como plantilla en los chips de baja densidad TaqMan® (TLdA; Applied Biosystems).
En la Tabla 2 se proporciona una lista de los ensayos utilizados en este estudio. De cada uno de los ADNc, se añaden 5 pl a 50 pl de Taqman® Universal Probe Maxter Mix (Applied Biosystems) y 50 pl de milliQ. Se cargaron 100 pl de cada muestra en 1 depósito de muestra de una TaqMan® Array (tarjeta de micro-fluido de 384 pocillos) (Applied Biosystems). La TaqMan® Array se centrifugó dos veces durante 1 minuto a 280 g y se selló para evitar la contaminación de pozo a pozo. Las tarjetas se colocaron en el bloque de muestra de tarjeta de micro-fluido de un sistema 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Las condiciones del ciclo térmico fueron: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 94,5°C, seguido de 40 ciclos durante 30 segundos a 97°C y 1 minuto a 59,7°C.
Los datos brutos se registraron con el programa informático Sequence detection System (SDS) de los instrumentos. Las Micro Fluidic Cards se analizaron con documentos RQ y el Rq Manager Software para el análisis automático de datos. Los valores del umbral del ciclo delta (Ct) se determinaron como la diferencia entre el Ct de cada gen de prueba y el Ct de hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT) (gen de referencia endógeno).
Además, los valores de expresión génica se calcularon en base al método del ciclo de umbral comparativo (Ct), en el que una muestra de ARN de próstata normal se designó como un calibrador al que se compararon las demás muestras.
Para la validación de los genes expresados de forma diferencial encontrados mediante chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, se usaron 60 muestras de tejido de próstata en los chips de baja densidad TaqMan® (TLDA). Para investigar si los marcadores podrían usarse en fluidos corporales, también se incluyeron 2 muestras de tejido vesical normal, 2 muestras de linfocitos de sangre periférica y 16 sedimentos urinarios (de los cuales 9 tenían PrCa en sus biopsias y 7 no).
En los TLDA, se determinaron los niveles de expresión para los 47 genes de interés. Las muestras de cáncer de próstata se ordenaron a partir de próstata normal, BPH, puntuaciones bajas de Gleason, puntuaciones altas de Gleason, CPRC y por último metástasis de cáncer de próstata. Tanto el chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® como los datos TLDa se analizaron usando diagramas de dispersión y de caja.
Después del análisis de los diagramas de caja y de dispersión, se obtuvo una lista de genes indicativos de cáncer de próstata y su pronóstico (Tabla 3, Figuras 14 t/m 26).
Tabla 3: Lista de genes identificados
Símbolo del gen
Descripción del gen Aumento/disminución en grupo Fila ID del gen
ACSM1
miembro 1 de la familia de cadena media acil-CoA sintetasa Aumento en LG/HG frente a NPr 7 NM_052956
ALDH3B2
familia de aldehído deshidrogenasa 3, miembro B2 Aumento en LG/HG frente a NPr 13 NM_000695
CGREF1
regulador de crecimiento celular con dominio mano EF Aumento en LG/HG frente a NP 66 NM_006569
COMP
Proteína de matriz oligomérica del cartílago Aumento en pT3 frente a pT2 6 NM_000095
C19orf48
marco de lectura abierto 48 del cromosoma 19 Aumento en LG/HG frente a NPr 12 NM_199249
DLX1
homeosecuencia 1 menos distal Aumento en LG/HG frente a NPr 52 NM_178120
GLYATL1
seudoglicina-N-aciltransferasa 1 Aumento en LG/HG frente a NPr 1 NM_080661
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15
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25
30
35
40
MS4A8B
miembro 8B de la subfamilia A de 4 dominios que cubren la membrana Aumento en LG/HG frente a NPr 18 NM_031457
NKAIN1
ATPasa interactuante 1 transportadora de NA+/K+ Aumento en LG/HG frente a NPr 40 NM_024522
PPFIA2
proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, polipéptido f (PTPRF) Aumento en Meta frente a LG/HG 3 NM_003625
Aumento en pT3 frente a pT2
4
PTPRT
proteína tirosina fosfatasa, receptor tipo T Aumento en LG/HG frente a NPr 29 NM_133170
TDRD1
dominio tudor que contiene 1 Aumento en LG/HG frente a NPr 8 NM_198795
UGT2B15
polipéptido B15 de la familia de UDP glucuronosiltranferasa 2 Aumento en CPRC frente a LG/HG 2 NM_001076
ACSM1 (Figura 14): Los presentes datos del chip ST del exón 1.0 humano GeneChip® demostraron que ACSM1 aumentó en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron este aumento positivo en PrCa. Por lo tanto, ACSM1 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de ACSM1 en vejiga normal y PBL es muy baja. Además, la expresión de ACSM1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, ACSM1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
ALDH3B2 (Figura 15): Los presentes datos del chip ST del exón 1.0 humano GeneChip® demostraron que ALDH3B2 aumentó en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron el aumento en estos grupos con excepción de PrCa Met. Por lo tanto, ALDH3B2 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de ALDH3B2 en vejiga normal y PBL es muy baja. Además, la expresión de ALDH3B2 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, ALDH3B2 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
CGREF1 (Figura 16): los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que CGREF1 aumentó en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron este aumento. Por lo tanto, CGREF1 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de CGREF1 en vejiga normal y PBL es muy baja. Además, la expresión de CGREF1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor (casi dos grupos independientes) en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, CGREF1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
COMP (Figura 17): Los datos del presente chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que COMP aumentó (hasta 3,5 veces) en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación usando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y mostraron un aumento incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 32,5 veces). Por lo tanto, concluimos que COMP tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de COMP en vejiga normal y PBL es muy baja a niveles indetectables. Además, la expresión de COMP en los sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, COMP tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para cáncer de próstata.
La expresión de COMP en PrCa localmente avanzado (pT3) es mayor que en PrCa confinada en un órgano (pT2). Por lo tanto, COMP se puede utilizar como marcador de pronóstico para el cáncer de próstata (datos de GeneChip®).
C19orf48 (Figura 18): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que C19orf48 aumentó en los grupos lG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron este aumento. Por lo tanto, C19orf48 tiene potencial de diagnóstico.
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La expresión de C19orf48 en la vejiga normal y PBL es muy baja. La expresión media de C19orf48 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa no es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Sin embargo, en dos de cada nueve sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa, la expresión es sumamente más alta (estrellas en el gráfico de caja) y en estos dos pacientes no se detectaría por la mayoría de los otros biomarcadores. Por lo tanto, C19orf48 tiene potencial de diagnóstico complementario como marcador urinario para cáncer de próstata.
DLX1 (Figura 19): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que DLX1 aumentó (hasta 5,6 veces) en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH.
Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y demostraron un aumento incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 183,4 veces). Por lo tanto, DLX1 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de DLX1 en vejiga normal y PBL es indetectable a muy baja. Además, la expresión de DLX1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mucho mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, DLX1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
GLYATL1 (Figura 20): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que GLYATL aumentó en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto. Por lo tanto, GLYATL tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de GLYATL1 en vejiga normal y PBL es indetectable a muy baja. Además, la expresión de GLYATL1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, GLYATL1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
MS4A8B (Figura 21): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que MS4A8B aumentó en LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met (hasta 8,3 veces) en comparación con NPr y BPH. Los
experimentos de validación usando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y demostraron un aumento
incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 119,8 veces). Por lo tanto, MS4A8B tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de MS4A8B en vejiga normal y PBL es indetectable. Además, la expresión de MS4A8B en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, MS4A8B tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
NKAIN1 (figura 22): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que NKAIN1 aumentó en LG PrCa, Hg PrCa, CPRC y PrCa Met (hasta 4,6 veces) en comparación con NPr y BPH. Los
experimentos de validación usando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y mostraron un aumento
incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido NPr (hasta 61,4 veces). Por lo tanto, NKAIN1 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de NKAIN1 en vejiga normal y PBL es indetectable. Además, la expresión de NKAIN1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mayor (casi dos grupos independientes en el gráfico de caja) en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, NKAIN1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
PPFIA2 (Figura 23): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que PPFIA2 aumentó en LG PrCa, hG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Este aumento fue mayor en PrCa Met.
Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron el aumento en estos grupos. Por lo tanto, PPFIA2 tiene potencial de diagnóstico
La expresión de PPFIA2 en vejiga normal y PBL es baja a indetectable. Además, la expresión de PPFIA2 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mucho más alta (casi dos grupos independientes en el gráfico de caja) en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, PPFIA2 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
PTPRT (Figura 24): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que PTPRT aumentó (hasta 11,1 veces) en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y mostraron un aumento incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 55,1 veces). Por lo tanto, PTPRT tiene potencial de diagnóstico.
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La expresión de PTPRT en vejiga normal y PBL es muy baja a indetectable. Además, la expresión de PTPRT en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mucho más alta (casi dos grupos independientes en el gráfico de caja) en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, PTPRT tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
TDRD1 (Figura 25): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que TDRD1 se aumentó (hasta 12,6 veces) en los grupos LG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y mostraron un aumento incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 184,1 veces), especialmente en el grupo de LG PrCa. Por lo tanto, TDRD1 tiene potencial de diagnóstico.
La expresión de TDRD1 en la vejiga normal es muy baja. Además, la expresión de TDRD1 en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes con PrCa es mucho más alta (dos grupos independientes en el gráfico de caja) en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, TDRD1 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
UGT2B15 (Figura 26): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que UGT2B15 aumentó (hasta 5,2 veces) en los grupos lG PrCa, HG PrCa, CPRC y PrCa Met en comparación con NPr y BPH. Los experimentos de validación usando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esto y mostraron un aumento incluso mayor en tejido de PrCa frente a tejido de NPr (hasta 224,4 veces). La expresión de UGT2B15 en la vejiga normal es muy baja. Además, la expresión de UGT2B15 en sedimentos obtenidos de pacientes con PrCa es mayor en comparación con su expresión en sedimentos urinarios obtenidos de pacientes sin PrCa. Por lo tanto, UGT2B15 tiene potencial de diagnóstico como marcador urinario para el cáncer de próstata.
Dado que UGT2B15 aumenta mucho en pacientes con CPRC, es un marcador adecuado para controlar a los pacientes sometidos a terapia hormonal para su cáncer de próstata localmente avanzado. Por lo tanto, UGT2B15 también tiene valor pronóstico.
Ejemplo 2
Para identificar marcadores de cáncer de próstata agresivo, se utilizó el perfil de expresión génica (chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, Affymetrix) de muestras de pacientes con cáncer de próstata en las siguientes categorías:
- LG: PrCa de bajo grado (puntuación de Gleason igual o inferior a 6). Este grupo representa pacientes con buen pronóstico;
- HG: PrCa de alto grado (puntuación de Gleason de 7 o más). Este grupo representa pacientes con mal pronóstico; tipo de muestra, ARNm de tumor primario;
- PrCa Met. Este grupo representa pacientes con mal pronóstico; tipo de muestra; ARNm de metástasis de PrCa;
- CPRC: cáncer de próstata resistente a la castración; ARNm de material de tumor primario de pacientes que son progresivos bajo terapia endocrina. Este grupo representa pacientes con enfermedad localizada agresiva.
El análisis de expresión se realiza según protocolos habituales. Brevemente, en pacientes con cáncer de próstata (que pertenecen a una de las cuatro categorías mencionadas anteriormente) se obtuvo tejido tras una prostatectomía radical o RTUP. Los tejidos se congelaron rápidamente y las secciones de criostato se tiñeron con H.E. para su clasificación por un patólogo.
Se disecaron las áreas tumorales y se extrajo el ARN completo con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA., EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN completo se purificó con el mini kit RNeasy de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA., EE.UU.). La totalidad del ARN se comprobó por electroforesis usando el Agilent 2100 Bioanalyzer.
Del ARN total purificado, se usó 1 |jg para el GeneChip WholeTranscript (WT) Sense Target Labeling Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA., EE. uU.). Según el protocolo de este ensayo, la mayoría del ARN ribosómico se eliminó usando un RiboMinus Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA., EE. UU.). Utilizando un hexámero aleatorio que incorpora un activador T7, se sintetizó ADNc bicatenario. A continuación, se generó ARNc a partir de la plantilla de ADNc bicatenario mediante una reacción de transcripción in vitro y se purificó usando el módulo de limpieza de muestras Affymetrix. El ADNc monocatenario se regeneró a través de una transcripción inversa cebada aleatoriamente usando una mezcla de dNTP que contenía dUTP. El ARN se hidrolizó con ribonucleasa H y el ADNc se purificó. El ADNc se fragmentó a continuación mediante incubación con una mezcla de endonucleasas de restricción UDG (uracil ADN glucosilasa) y APE1 (endonucleasa 1 apurinica/apirimidínica) y, por último, se marcó en el extremo mediante una reacción de transferasa terminal que incorpora un didesoxinucleótido biotinilado.
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Se añadieron 5,5 |jg del ADNc biotinilado fragmentado a una mezcla de hibridación, se cargaron en un GeneChip ST del exón 1.0 humano y se hibridaron durante 16 horas a 45°C y 60 rpm.
Usando el chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® (Affymetrix), los genes se miden indirectamente mediante el análisis de exones cuyas mediciones se pueden combinar en mediciones de grupos de transcripción. Hay más de 300.000 grupos de transcripción en el chip, de los cuales 90.000 contienen más de un exón. De estos 90.000, hay más de 17.000 genes de alta confianza (CORE) que se usan en el análisis predeterminado. En total, hay más de 5,5 millones de funciones por chip.
Después de la hibridación, el chip se lavó y se tiñó según el protocolo de Affymetrix. El chip teñido se escaneó a 532 nm utilizando un Affymetrix GeneChip Scanner 3000, generando archivos cEl para cada chip.
Los valores de expresión en el exón procedían de las intensidades de hibridación en la sonda de archivo CEL utilizando el algoritmo RMA basado en modelo tal como se ejecutó en el programa informático Affymetrix Expression Console™. RMA (Robust Multiarray Average) realiza la normalización, la corrección de fondo y el resumen de datos. Los genes expresados de forma diferencial entre las condiciones se calculan utilizando Anova (ANalysis Of Variance), una prueba de la T para más de dos grupos.
La identificación de la diana es parcial ya que se analizaron grupos de riesgo clínicamente bien definidos. Los marcadores se clasifican según su función en la biología del cáncer. Para la identificación de marcadores, el grupo PrCa Met se compara con 'HG' y 'LG'.
En base al análisis de expresión obtenido, se identificaron biomarcadores basados en 30 tumores; los perfiles de expresión de los biomarcadores se proporcionan en la tabla 4.
Tabla 4: Características de la expresión de 7 dianas que caracterizan el fenotipo metastásico agresivo del cáncer de próstata basado en el análisis de 30 muestras muy conocidas
Nombre del gen
Asignación del gen Expresión en PrCa Met Met-LG Fila Met-HG Fila Met-CPRC
PTPR
NM_003625 Aumento 15,89 4 8,28 4 11,63
EPHA6
NM_001080448 Aumento 15,35 5 9,25 2 8,00
Placofilina 1
NM_000299 Aumento 5,28 28 4,92 8 5,46
HOXC6
NM_004503 Aumento 5,35 27 3,34 43 3,51
HOXD3
NM_006898 Aumento 1,97 620 2,16 238 1,40
sFPR2
NM_003013 Disminución -6,06 102 -13,93 15 -3,53
HOXD10
NM_002148 Disminución -3,71 276 -3,89 238 -5,28
Ejemplo 3
El protocolo del ejemplo 1 se repitió en un grupo de 70 muestras. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 5.
Tabla 5: Características de expresión de 7 dianas validadas en el grupo de 70 tumores
Nombre del gen
Asignación del gen Expresión en PrCa Met Met-LG Fila Met-HG Fila Met-CPRC Fila
PTPR
NM_003625 Aumento 6,92 1 2,97 11 3,66 2
EPHA6
NM_001080448 Aumento 4,35 4 3,97 3 3,18 3
Placofilina 1
NM_000299 Aumento 3,18 12 4,00 2 4,11 5
HOXC6
NM_004503 Aumento 1,77 271 1,75 208 1,44 6
HOXD3
NM_006898 Aumento 1,62 502 1,66 292 1,24 7
sFPR2
NM_003013 Disminución -6,28 46 -10,20 10 -5,86 1
HOXD10
NM_002148 Disminución -2,48 364 -2,55 327 -2,46 4
Como puede verse claramente en las tablas 4 y 5, un aumento de la expresión de PTPR, EPHA6, Placofilina 1, HOXC6 (Figura 27) y HOXD3 se asoció al cáncer de próstata. Además, como puede verse claramente en las tablas 4 y 5, una disminución de la expresión de sFRP2 (Figura 28) y HOXD10 (Figura 29) se asoció al cáncer de próstata.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores obtenidos en 70 muestras tumorales, los datos de expresión 5 demuestran claramente la idoneidad de estos genes como marcador biológico o molecular para el diagnóstico de cáncer de próstata.
Ejemplo 4
Usando el perfil de expresión génica (chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, Affymetrix) en 70 cánceres de próstata, se descubrió que varios genes se expresaban de forma diferencial en cáncer de próstata de bajo grado y 10 alto en comparación con la metástasis de cáncer de próstata y cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC). Junto con varios otros en los genes expresados de forma diferencial chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, los niveles de expresión de estos genes se validaron usando los chips TaqMan® de baja densidad (TLDA, Applied Biosystems). En la tabla 6 se muestra una visión general de los genes validados.
Tabla 6: Ensayos de expresión génica utilizados para el análisis TLDA
Símbolo
Descripción del gen Número de ingreso Tamaño del amplicón
AMACR
alfa-metilacil-CoA racemasa NM_014324 97-141
B2M
beta-2-microglobulina NM_004048 64-81
CYP4F8
citocromo P450, familia 4, subfamilia F NM_007253 107
CDH1
E-Cadherina NM_004360 61-80
EPHA6
receptor A6 de efrina NM_001080448 95
ERG
homólogo del oncogén del virus E26 de eritroblastosis v-ets NM_004449 60-63
ETV1
variante 1 de ets NM_004956 74-75
ETV4
variante 4 de ets NM_001986 95
ETV5
variante 5 de ets NM_004454 70
FASN
ácido graso sintasa NM_004104 144
FOXD1
forkhead box D1 NM_004472 59
HOXC6
homeosecuencia C6 NM_004503 87
HOXD3
homeosecuencia D3 NM_006898 70
HOXD10
homeosecuencia D10 NM_002148 61
HPRT
hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 NM_000194 72-100
HSD17B6
homólogo 6 de hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa NM_003725 84
CDH2
N-cadherina (neuronal) NM_001792 78-96
CDH11
OB-cadherina (osteoblasto) NM_001797 63-96
PCA3
gen 3 del cáncer de próstata AF103907 80-103
PKP1
Placofilina 1 NM_000299 71-86
KLK3
antígeno específico de la próstata NM_001030047 64-83
PTPR
proteína tirosina fosfatasa. Tipo receptor, polipéptido f NM_003625 66
RET
proto-oncogén ret NM_020975 90-97
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RORB
receptor B sin interés comercial relacionado con RAR NM_006914 66
RRM2
ribonucleótido reductasa M2 NM_001034 79
SFRP2
proteína 2 relacionada con la rizada segregada NM_003013 129
SGP28
proteína granular específica (28 kDa)/proteína 3 secretora rica en cisteína CRISP3 NM_006061 111
SNAI2
homólogo 2 de caracol SNAI2 NM_003068 79-86
SNAI1
homólogo 1 de caracol SNAI1 NM_005985 66
SPINK1
inhibidor de serina peptidasa, Kazal tipo 1 NM_003122 85
TGM4
transglutaminasa 4 (próstata) NM_003241 87-97
TMPRSS2
serina proteasa 2 de transmembrana NM_005656 112
TWIST
homólogo 1 de twist NM_000474 115
Se usaron muestras de cáncer de próstata en las siguientes categorías:
- Cáncer de próstata de bajo grado (LG): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason < 6 obtenidas después de una prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con un buen pronóstico.
- Cáncer de próstata de alto grado (HG): muestras de tejido de tumores primarios con una puntuación de Gleason >7 obtenida después de una prostatectomía radical. Este grupo representa pacientes con mal pronóstico.
- Metástasis del cáncer de próstata: las muestras de tejido se obtienen a partir de linfonodos positivos después de LND o después de autopsia. Este grupo representa a pacientes con mal pronóstico
- Cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC): las muestras de tejido se obtienen de pacientes que son progresivos bajo terapia endocrina y que se sometieron a una resección transuretral de la próstata (RTUP).
Todas las muestras de tejido se congelaron rápidamente y las secciones de criostato se tiñeron con hematoxilina y eosina (H.E.). Estas secciones teñidas con H.E. fueron clasificadas por un patólogo.
Se disecaron las áreas tumorales. Se extrajo ARN de secciones en serie de 10 pm de espesor que se recogieron de cada muestra de tejido en varios niveles. El tejido se evaluó por tinción con He de secciones en cada nivel y se verificó al microscopio. El ARN completo se extrajo con TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se purificó usando el RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA., EE.UU.). La cantidad y calidad de ARN se evaluaron en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE., EE. UU.) y en un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA., EE. UU.).
Se transcribieron de forma inversa 2 |jg de ARN completo tratado con desoxirribonucleasa usando transcriptasa inversa SuperScript™ II (Invitrogen) en una reacción de 37, 5 jl según el protocolo del fabricante. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 25°C, 60 minutos a 42°C y 15 minutos a 70°C. Se añadieron 62,5 jl de milliQ al ADNc.
Se midieron los niveles de expresión génica usando los chips de baja densidad TaqMan® (TLDA; Applied Biosystems). En la Tabla 5 se proporciona una lista de los ensayos utilizados en este estudio. Se añaden 3 jl de cada uno de los ADNc a 50 jl de Taqman® Universal Probe Master Mix (Applied Biosystems) y 47 jl de milliQ. Se cargaron 100 jl de cada muestra en un depósito de muestra de un TaqMan® Array (tarjeta microfluida de 384 pocillos) (Applied Biosystems). El TaqMan® Array se centrifugó dos veces durante 1 minuto a 280 g y se selló para evitar la contaminación pozo a pozo. Las tarjetas se colocaron en el bloque de muestra de tarjeta de microfluido de un PCR 7900 HT Real-Time pCr System (Applied Biosystems). Las condiciones del ciclo térmico fueron: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 94,5°C, seguido de 40 ciclos durante 30 segundos a 97°C y 1 minuto a 59,7°C.
Los datos brutos se registraron con el programa informático Sequence detection System (SDS) de los instrumentos. Las Micro Fluidic Cards se analizaron con documentos RQ y el Rq Manager Software para el análisis automático de datos. Los valores del umbral del ciclo delta (Ct) se determinaron como la diferencia entre el Ct de cada gen de
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prueba y el Ct de la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT) (gen de referencia endógeno). Además, los valores de expresión génica se calcularon en base al método del ciclo de umbral comparativo (Ct), en el que una muestra de aRn de próstata normal se designó como calibrador con el que se compararon las demás muestras.
Para la validación de los genes expresados diferencialmente encontrados por chip 1.0 ST de exón humano GeneChip®, se utilizaron 70 muestras de cáncer de próstata en los chips de baja densidad TaqMan® (TLDA). En estos TLDA, se determinaron los niveles de expresión para los 33 genes de interés. Las muestras de cáncer de próstata se ordenaron a partir de las bajas puntuaciones de Gleason, altas puntuaciones de Gleason, CPRC y por último la metástasis de cáncer de próstata. Tanto el chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® como los datos TLDA se analizaron usando diagramas de dispersión y de caja.
En una primera aproximación, se realizaron diagramas de dispersión en los que las muestras se ordenaron a partir de bajas puntuaciones de Gleason, altas puntuaciones de Gleason, CPRC y por último metástasis de cáncer de próstata. En una segunda aproximación, se incluyeron los datos de seguimiento clínico. Las muestras se clasificaron en seis grupos: pacientes con cáncer de próstata con tratamiento curativo, pacientes con recaída bioquímica lenta (después de 5 años o más), pacientes con recaída bioquímica rápida (dentro de 3 años), pacientes que evolucionaron, pacientes con CPRC y por último pacientes con metástasis de cáncer de próstata. Después del análisis de los diagramas de dispersión y de caja utilizando ambas aproximaciones, se obtuvo una lista de genes indicativos indicativos para cáncer de próstata y el pronóstico de los mismos (tabla 7, figuras 34-40).
Tabla 7: Lista de genes identificados
Símbolo
Descripción del gen Número de ingreso Tamaño del amplicón
HOXC6
homeosecuencia C6 NM_004503 87
SFRP2
proteína 2 relacionada con la rizada segregada NM_003013 129
HOXD10
homeosecuencia D10 NM_002148 61
RORB
receptor B sin interés comercial relacionado con RAR NM_006914 66
RRM2
ribonucleótido reductasa M2 NM_001034 79
TGM4
transglutaminasa 4 (próstata) NM_003241 87-97
SNAI2
homólogo 2 de caracol SNAI2 NM_003068 79-86
HOXC6 (Figura 34): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® mostraron que HOXC6 aumentó en las metástasis de cáncer de próstata en comparación con los cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron este aumento. Además, se encontró que HOXC6 había aumentado en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, HOXC6 tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observó que todos los pacientes con enfermedad progresiva y 50% de pacientes con recurrencia bioquímica dentro de los 3 años posteriores al tratamiento inicial tenían un aumento mayor de la expresión de HOXC6 en comparación con los pacientes con recidiva bioquímica después de 5 años y pacientes con tratamiento curativo. Los pacientes con recidiva bioquímica dentro de los 3 años posteriores al tratamiento inicial que tenían una expresión de HOXC6 mayor también tenían un peor pronóstico en comparación con los pacientes con una expresión de HOXC6 más baja. Por lo tanto, la expresión de HOXC6 se correlaciona con la evolución del cáncer de próstata.
SFRP2 (figura 35): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que SFPR2 aumentaba en las metástasis de cáncer de próstata en comparación con los cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron disminución. Además, se encontró que SFRP2 disminuye en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, SFRP2 tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observaron diferencias en la expresión de SFRP2 entre los pacientes con tratamiento curativo, recaída bioquímica después del tratamiento inicial y enfermedad progresiva. Más del 50% de las metástasis mostraron una gran disminución de SFRP2. Además, también unos pocos pacientes con CRPC mostraron una expresión de SFRP2 muy baja. Por lo tanto, SFRP2 puede usarse para la detección de pacientes con progresión bajo terapia endocrina (CRPC) y pacientes con metástasis de cáncer de próstata. Por lo tanto se sugiere que, en combinación con un marcador que aumenta en metástasis, se podría utilizar una relación de ese marcador y SFRP2 para la detección de células tumorales circulantes.
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HOXD10 (figura 36): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que HOXD10 disminuía en metástasis de cáncer de próstata en comparación con los cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron esta disminución. Además, se encontró que HOXD10 disminuía en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, HOXD10 tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observaron diferencias en la expresión de HOXD10 entre los pacientes con tratamiento curativo, recaída bioquímica después del tratamiento inicial y enfermedad progresiva. Todas las metástasis mostraron una gran disminución de HOXD10. Además, también algunos pacientes con CRPC presentaban una baja expresión de HOXD10. Por lo tanto, HOXD10 puede utilizarse para la detección de pacientes con evolución bajo terapia endocrina (CRPC) y pacientes con metástasis de cáncer de próstata.
RORB (Figura 37): Los datos actuales del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que RORB había aumentado en metástasis de cáncer de próstata y CRPC en comparación con cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando chips de baja densidad TaqMan® confirmaron este aumento. Además, se encontró que RORB disminuye en todos los cánceres de próstata de bajo y alto grado en comparación con la próstata normal. En CRPC y metástasis, RORB se reexpresa en próstata normal. Por lo tanto, RORB tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observaron diferencias en la expresión de RORB entre los pacientes con tratamiento curativo, recaída bioquímica después del tratamiento inicial y enfermedad progresiva. Sin embargo, en una serie de casos en el CRPC y metástasis, el aumento de RORB coincide con una disminución de SFRP2. Utilizando una proporción de RORB sobre SFRP2 podría detectarse el 75% de las metástasis del cáncer de próstata. Además, varios pacientes con CRPC tenían una alta relación RORB/SFRP2. Por lo tanto, esta relación se puede usar en la detección de pacientes con células tumorales circulantes y pacientes progresivos con CRPC.
RRM2 (figura 38): los experimentos utilizando chips de baja densidad TaqMan® presentaban un aumento de RRM2 en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, RRM2 tiene potencial de diagnóstico. Además, la expresión de RRM2 es mayor en CRPC y metástasis demostrando que puede estar involucrado en el potencial invasivo y metastásico de las células de cáncer de próstata. Por lo tanto, RRM2 se puede usar para la detección de células tumorales de próstata circulantes.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observaron diferencias en la expresión de RRM2 entre los pacientes con tratamiento curativo, recaída bioquímica después del tratamiento inicial y enfermedad progresiva.
TGM4 (figura 39): Los presentes datos de chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que TGM4 había disminuido en metástasis de cáncer de próstata en comparación con los cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando matrices de baja densidad TaqMan® confirmaron esta disminución. Además, se encontró que TGM4 había disminuido mucho en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, TGM4 tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observó que los pacientes con enfermedad progresiva presentaban una disminución mayor de TGM4 (subgrupo de pacientes) en comparación con los pacientes con tratamiento curativo y recaída bioquímica después del tratamiento inicial. En metástasis, la expresión de TGM4 ha disminuido completamente. Por lo tanto, TGM4 tiene potencial de pronóstico.
SNAI2 (figura 40): Los presentes datos del chip 1.0 ST de exón humano GeneChip® demostraron que SNAI2 había disminuido en metástasis de cáncer de próstata en comparación con cánceres de próstata primarios de alto y bajo grado. Los experimentos de validación utilizando matrices de baja densidad TaqMan® confirmaron esta disminución. Además, se encontró que SNAI2 disminuye en los cuatro grupos de cáncer de próstata en comparación con la próstata normal. Por lo tanto, SNAI2 tiene potencial de diagnóstico.
Utilizando datos de seguimiento clínico, se observaron diferencias en la expresión de SNAI2 entre los pacientes con tratamiento curativo, recaída bioquímica después del tratamiento inicial y enfermedad progresiva.

Claims (3)

  1. 10
    REIVINDICACIONES
    1. Método para el diagnóstico in vitro del cáncer de próstata PrCa de alto grado (HG PrCa), PrCa Met y CPRC en un individuo humano que comprende:
    - determinar la expresión de DLX1; y
    - establecer el aumento o la disminución de la expresión de DLX1 en comparación con la expresión de DLX1 en una muestra de un individuo sin cáncer de próstata;
    proporcionando de ese modo dicho diagnóstico in vitro del cáncer de próstata PrCa de alto grado (HG PrCa), PrCa Met y CPRC.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en donde la determinación de dicha expresión comprende determinar la expresión del ARNm.
  3. 3. Utilización de la expresión de DLX1 para el diagnóstico in vitro del cáncer de próstata PrCa de alto grado (HG PrCa), PrCa Met y CPRC, preferiblemente CPRC.
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