ES2616569T3 - Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos se inmovilizan a alta temperatura sobre una matriz - Google Patents

Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos se inmovilizan a alta temperatura sobre una matriz Download PDF

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Abstract

Procedimiento para el aislamiento y/o purificación de ácidos nucleicos, que comprende las siguientes etapas de procedimiento a) lisado de una muestra biológica que contiene células y/o virus y/o fagos, b) inmovilización del o de los ácidos nucleicos liberados en una matriz sobre una base de uno o varios compuestos de silicio-oxígeno en presencia de un alcanol ramificado o no ramificado elegido de isopropanol y etanol y un compuesto caotrópico y, en su caso, lavado del o de los ácidos nucleicos inmovilizados sobre la matriz, c) separación del ácido nucleico unido de manera en sí conocida, tratándose en el caso de la matriz de partículas magnéticas con una superficie de sílice y teniendo lugar la inmovilización del o de los ácidos nucleicos en un intervalo de temperaturas de 50 a 65º C.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para el aislamiento de acidos nucleicos en el que los acidos nucleicos se inmovilizan a alta temperatura sobre una matriz
La presente invencion se refiere a un procedimiento mejorado para el aislamiento de acidos nucleicos.
El aislamiento de acidos nucleicos tales como ADN o ARN de celulas vegetales, animales o humanas, asf como de cultivos celulares o cultivos de virus, tiene lugar, por lo general, segun un modelo base uniforme: en primer lugar, los materiales de partida que contienen acidos nucleicos se descomponen - de manera parcial bajo utilizacion de enzimas degradadoras de protemas. Entonces, en pasos siguientes pueden ser separados constituyentes individuales bajo utilizacion de los mas diversos metodos.
La separacion de la parte proteica que se presenta inevitablemente en cada lisado celular representa, en este caso, un paso particularmente importante. La separacion puede tener lugar, por ejemplo, mediante puesta en contacto de la mezcla de protemas/acidos nucleicos con fenol y/o mezclas de cloroformo/alcohol isoairnlico. La parte proteica, sin embargo, tambien puede ser precipitada, mediante adicion de sales desnaturalizantes - tales como, por ejemplo, hidrocloruro de guanidinio, isotiocianato de guanidinio - de la fase acuosa. Junto a ello, las protemas pueden ser descompuestas y, a continuacion, eliminadas mediante la adicion de proteasas. Por ultimo, mediante la adicion opcional de DNasa o RNasa, se puede separar el acido nucleico no deseado y mantener la fraccion de acido nucleico deseada en cada caso. Para la proteccion de los acidos nucleicos ante una degradacion enzimatica no intencionada, durante el proceso de aislamiento, debe trabajarse, no obstante, bajo condiciones esteriles y libres de nucleasa. La separacion de los acidos nucleicos puede, junto a ello, tambien tener lugar por la via de la centrifugacion.
El documento EP1479769 da a conocer un procedimiento mediante el cual el ADN y ARN pueden ser aislados separados uno de otro. El enlace tiene lugar en presencia de un compuesto caotropico, pero en ausencia de un alcanol. El documento WO98/31840 da a conocer un procedimiento en el cual acidos nucleicos, en presencia de un compuesto caotropico, son unidos a partmulas de silice magneticas. La union tiene lugar igualmente en ausencia de un alcanol. Smith et al, 1995 (Biotechniques, Vol. 18, N°. 6 p 970 - 975), da a conocer un procedimiento para el aislamiento de ADN a partir de muestras no complejas, mediante la union a leche en vaso en presencia de yoduro de sodio. El documento WO95/01359 da a conocer un procedimiento para la purificacion y separacion de mezclas de acidos nucleicos en presencia de altas concentraciones en sal y/o altas concentraciones en alcohol. El documento US 6.562.568 da a conocer un procedimiento de varias etapas para el aislamiento de acidos nucleicos de una muestra biologica mediante la union a partfculas de vidrio magneticas y ensena que muchos o, dado el caso, incluso todos los pasos pueden ser realizados esencialmente a la misma temperatura. Esta temperatura esta en el intervalo de la temperatura ambiente hasta 70°C. El documento WO01/71732 da a conocer partmulas de silice magneticas porosas y procedimiento para la fabricacion de estas. Ademas, da a conocer el uso de estas partmulas magneticas para el aislamiento de acidos nucleicos en presencia de agentes caotropicos y/o alcohol.
La mayona de los procedimientos conocidos por el estado de la tecnica se basan en uno de los dos siguientes principios de separacion:
Los "procedimientos clasicos" se basan en un proceso de una sola etapa, en el cual tras la adicion de un tampon, el cual en la mayona de los casos contiene una sal de guanidinio, y tras adicion de un agente de extraccion organico - por lo general cloroformo o fenol - se realiza una extraccion. Las sustancias acompanantes indeseadas se desechan entonces con la fase organica. Los acidos nucleicos que permanecen en la fase acuosa pueden a continuacion ser separados y aislados mediante una separacion por fases.
La fundamental desventaja de este procedimiento estriba en que junto con la utilizacion de sustancias venenosas y perjudiciales para la salud - tal como isotiocianato de guanidino, fenol o cloroformo - permanecen en la disolucion de acido nucleico acuosa sustancias solubles en agua como impurezas, las cuales deben ser separadas en otros pasos de purificacion que requieren mucho tiempo. Esta problematica dificulta la aplicacion de estos procedimientos para el aislamiento de acidos nucleicos, por ejemplo de plantas, dado que estas contienen la mayona de las veces grandes cantidades en polisacaridos y sustancias solubles en agua similares.
A la vista de estas desventajas, se ha impuesto, por lo tanto, en el estado de la tecnica un proceso alternativo, el cual se basa en la adsorcion selectiva de acidos nucleicos en soportes solidos, generalmente minerales tales como dioxido de silicio. En este caso, en un procedimiento de varias etapas se anade al lisado de celulas o de virus diferentes disoluciones tampon (tampon de lisis, de union, de lavado y de elucion) ,una detras de otra; en la ultima etapa se eluye del soporte el acido nucleico purificado.
En el mundo cientffico, entretanto, se ha investigado el principio ffsico-qmmico de la union de acidos nucleicos a soportes minerales en presencia de sales caotropicas. Se ha postulado que la union de los acidos nucleicos a las superficies de los soportes minerales se basa en una destruccion de las estructuras del medio acuoso mas relevantes, mediante las cuales los acidos nucleicos se adsorben a la superficie de materiales minerales, en particular de partmulas de vidrio o bien de sflice.
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Desventajoso en los procedimientos arriba descritos es, en particular, que con el uso de muestras, las cuales estan enriquecidas con una porcion especialmente alta de sustancias secundarias nocivas, para la alta pureza pretendida deben ser aceptadas perdidas de rendimiento considerables.
La mision de la presente invencion consiste, por lo tanto, en poner a disposicion un procedimiento para el aislamiento de ARN o bien ADN, el cual no presente las desventajas arriba descritas y conocidas por el estado de la tecnica y poner a disposicion acidos nucleicos en un alto rendimiento y pureza.
Este problema se resuelve mediante los procedimientos de acuerdo con la invencion de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
De manera inesperada se descubrio que se puede lograr una mejora de la union de acidos nucleicos a partfculas de silice magneticas en ausencia de agentes caotropicos y alcohol de acuerdo con las reivindicaciones, si la disolucion que contiene acido nucleico se calienta antes o durante la union. Esta mejora repercute, en particular, tanto en la union de ARN y ADN virales como de ARN sintetico e, igualmente, en otras especies de acido nucleico.
Por materiales biologicos se entienden materiales de base en partfculas o molecular. A ellos pertenecen, en particular, virus, fagos y celulas tales como, p. ej., bacterias, pero tambien celulas humanas, animales (por ejemplo leucocitos) o vegetales. En particular, el procedimiento de acuerdo con la invencion es adecuado, sin embargo, preferiblemente para el aislamiento de acidos nucleicos tales como ADN o ARN de materiales de muestra de origen humano o animal - tal como por ejemplo muestras clmicas, tal como sangre, plasma, suero, lfquido de enjuague bucal, orina, lfquido cerebral, esputo, excremento, punciones, frotis de epitelio, biopsias y otras muestras de tejido o medula de hueso.
La muestra tambien puede proceder del campo de la analttica del medio ambiente, analftica de los alimentos o de la investigacion molecular-biologica, p. ej., de cultivos de bacterias, cultivos de virus, lisados de fagos, filtros de aire o de agua.
Con el procedimiento de acuerdo con la invencion se puede aislar material biologico nativo o modificado. Por material biologico nativo se entiende un material, cuya estructura no se modifico de manera irreversible, en comparacion con los materiales biologicos que aparecen de forma natural. Esto, sin embargo, no descarta la modificacion de otros constituyentes de la muestra. Si, por ejemplo, deben aislarse celulas, entonces ciertamente el medio que rodea las celulas puede estar modificado, pero no las celulas como tales. Si deben ser aislados acidos nucleicos, tambien estos deben estar modificados en la forma nativa, es decir, no cortados o modificados mediante acoplamiento de grupos reactivos. Por lo tanto, la expresion material biologico nativo comprende, en particular, acidos nucleicos biotinilados. Ejemplos de materiales biologicos nativos representan, entre otros, ADN virales, ARN virales o acidos nucleicos celulares de materiales de muestra humanos o animales.
Materiales biologicos modificados comprenden materiales, los cuales no aparecen en la naturaleza, p. ej., acidos nucleicos, los cuales estan modificados mediante fijacion de grupos reactivos, detectables, estabilizantes o aptos para la inmovilizacion, p. ej., acidos nucleicos biotinilados; junto a ellos, se han de mencionar ADN y ARN sinteticos pero tambien, por ejemplo, ARN blindado ("armored RNA").
En determinados casos, la muestra puede ser utilizada sin tratamiento previo en el procedimiento de acuerdo con la invencion. En muchos casos, la muestra, sin embargo, debena ser descompuesta mediante un metodo adecuado y liberado el material biologico contenido en la muestra. Procedimientos para la descomposicion de muestras son conocidos para el experto en la materia y pueden ser de naturaleza qmmica, enzimatica o ffsica. Tambien es posible una combinacion de estos procedimientos.
En este caso, se pueden manifestar como mas ventajosos diversos metodos para diferentes materiales biologicos, pero, por otro lado, en principio, es adecuado cada uno de los metodos expuesto a continuacion: lisis con ayuda de detergentes ionicos y no ionogenos tales como, p. ej., SDS, LiDS o sarcosil en tampones adecuados, la utilizacion de sales caotropicas tales como, por ejemplo, hidrocloruro de guanidinio (GHCI), tiocianato de guanidinio (GTC), yoduro sodico, perclorato sodico, etc.; el desgarrado mecanico tal como, p. ej., por medio de una prensa French, ultrasonidos, molienda con esferas de vidrio, aluminio o en nitrogeno lfquido, lisis enzimatica, por ejemplo con lisozima, proteinasas, pronasas o celulasas u otras enzimas para la lisis adquiribles en el comercio; lisis de la celula por medio de bacteriofagos o infeccion vmca; liofilizacion; choque osmotico; tratamiento por microondas; tratamiento termico, p. ej., calentando o hirviendo o congelando, p. ej., en hielo seco o nitrogeno lfquido y descongelacion, lisis alcalina.
Como ya se ha mencionado arriba, todos los procedimientos anteriores representan tecnicas estandares para la lisis, las cuales son suficientemente conocidas por el estado de la tecnica y puede ser aplicadas en cada uno de los procedimientos, o combinaciones de estos.
Asf, es particularmente efectiva una combinacion de caotropos y detergentes para la lisis de celulas bacterianas. Un agente a modo de ejemplo, adecuado para la lisis, contiene, por lo tanto, un caotropo tal como, p. ej., GTC o GHCI y un detergente tal como, p. ej., SDS o sarcosil. Estos agentes para la lisis se pueden presentar en disolucion acuosa o en una disolucion tampon, es decir, como el denominado tampon de lisis. Como tampon se puede utilizar cualquier
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tampon adecuado tal como, por ejemplo, tampon Tris, bicina, tricina o fosfato. Alternativamente a ello, el agente de lisis tambien puede ser anadido por separado. Concentraciones y cantidades adecuadas de los agentes de lisis vanan en funcion del sistema respectivo, de la naturaleza de las celulas, etc. y pueden ser determinadas por el experto en la materia, pudiendo ser utilizadas, por ejemplo, concentraciones en el intervalo de 2 M a 7 M de caotropo tal como, p. ej., GTC, GHCI, Nal o perclorato de sodio, agentes alcalinos 0,1 M a 1 M tales como, p. ej., NaOH, y detergentes al 0,1 a 50% en peso (peso/volumen). Un ejemplo de un tampon de lisis de este tipo contiene, por tanto, un disolucion acuosa de GTC 4 M y sarcosil al 1% (peso/volumen).
Para diferentes sistemas de lisis pueden ser adecuadas diferentes condiciones de incubacion, las cuales son conocidas por el estado de la tecnica. Para un tampon de lisis que contiene detergentes y/o caotropos, por ejemplo, la incubacion puede tener lugar a temperatura ambiente o a temperatura elevada, por ejemplo en un intervalo de 37 a 65° C.
De la misma manera tambien se puede variar el tiempo de incubacion, desde unos pocos minutos hasta 24 horas, por ejemplo 5 minutos hasta 2 horas. En el caso del tampon de lisis de GTC/sarcosil y celulas bacterianas, por ejemplo, se ha acreditado una incubacion a 65° C durante 10 a 20 minutos, la cual, sin embargo, tambien puede ser variada cuando sea necesario. Para la lisis enzimatica, por ejemplo por medio de proteinasa K, etc., pueden ser necesarios tiempos de tratamiento mas largos, por ejemplo a lo largo de un espacio de tiempo de 12 horas.
Preferiblemente, la lisis tiene lugar en presencia de sales caotropicas, oscilando la concentracion de estas sales entre 2 y 8 mol/l, preferiblemente de 4 a 6 mol/l. En el caso de sales caotropicas se trata, p. ej., de yoduro de sodio, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio. La union, sin embargo, no esta limitada a estos compuestos. El enlace tiene lugar en presencia de un alcohol. Se utilizan alcanoles de cadena corta, ramificados o no ramificados, seleccionados de etanol, propanol e isopropanol. En este caso, la concentracion de los alcanoles se mueve en el intervalo de 1 a 100% (volumen/volumen), preferiblemente de 2 a 80%, mas preferiblemente de 5 a 70%, aun mas preferiblemente de 10 a 60% y lo mas preferiblemente de 15 a 50%. De manera sorprendente, se demuestra que el calentamiento de la disolucion que contiene el acido nucleico en ausencia de reactivos caotropicos y alcohol, ejerce una influencia similar, tanto sobre la union de ARN y ADN virales como sobre los ARN sinteticos y otras especies de acidos nucleicos.
Para el aislamiento de los acidos nucleicos, la muestra se pone en contacto con el material de soporte, es decir las partfculas arriba mencionadas, y se incuba durante un tiempo suficiente para la union. Para acidos nucleicos, pueden ser apropiados tiempos de incubacion entre 10 segundos y 30 minutos. De manera practica, se han mostrado como ventajosos tiempos de incubacion en un intervalo de 11 +/-10 minutos.
Para el aislamiento de acidos nucleicos se utilizan preferiblemente partfculas magneticas silanizadas, las cuales tienen forma de perla o de esfera y presentan un tamano de partfcula en el intervalo de 5 a 25 pm, de manera preferida 6 a 15 pm y de manera particularmente preferida de 6 a 10 pm, asf como con una distribucion segun el tamano muy estrecha. Partfculas de sflice magneticas, las cuales de manera ventajosa pueden ser utilizadas en el procedimiento de acuerdo con la invencion, se describen, p. ej., en la solicitud de patente internacional WO 01/71732 pagina 6, lmea 29 a pagina 8 lmea 8, a la cual por la presente se hace referencia a su contenido completo. De acuerdo con la invencion, la union tiene lugar, en este caso, en un intervalo de temperaturas de 50 a 65° C y, de manera muy particularmente preferida, a 56° C.
Efectos similares sobre la union de acidos nucleicos los muestran, entre otros, sustancias desnaturalizantes tales como, por ejemplo, dimetilsulfoxido.
Tras la incubacion tiene lugar la separacion del material biologico, preferiblemente de los acidos nucleicos del lfquido de muestra. Esto, en general, se logra mediante la separacion de los acidos nucleicos unidos de acuerdo con la invencion a las partmulas - en el caso de utilizar partmulas de silice magneticas - con ayuda de un campo magnetico. Por ejemplo, las partmulas magneticas pueden ser atrafdas a la pared del recipiente, en el cual tuvo lugar la incubacion. A continuacion, puede ser separado el lfquido con las sustancias constitutivas de la muestra, las cuales no se unieron a las partmulas magneticas.
Esta separacion depende del tipo de recipiente en el cual ha tenido lugar la incubacion. Etapas de procedimiento adecuadas para la supresion del lfquido son, p. ej., pipeteado o succion del lfquido.
En caso deseado, las partmulas cargadas - magneticas - pueden ser limpiadas una o varias veces con una disolucion de lavado. La disolucion de lavado se elige de manera que, a ser posible, no tenga lugar - o bien, no en una medida digna de mencion - un desprendimiento del material biologico, p. ej., de los acidos nucleicos, de la superficie de las partmulas, sin embargo, impurezas todavfa existentes son separadas por lavado lo mejor posible. Esta etapa de lavado tiene lugar preferiblemente mediante incubacion de la disolucion de lavado con las partmulas cargadas, efectuando, preferiblemente, una resuspension de las partmulas, p. ej., mediante agitacion o aplicacion de un campo magnetico que no es identico al primer campo magnetico. La disolucion de lavado con impurezas se suprime, preferiblemente, igual que el lfquido del lisado que permanece tras la union de los acidos nucleicos.
Como disolucion de lavado se puede utilizar cualquier tampon de lavado convencional o cualquier otro medio adecuado. En general, se prefieren tampones con fuerza ionica baja a moderada tal como, p. ej., Tris-HCI 10 mM
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con un pH de 8, 0 - NaCI 10 mM. Ademas, tambien se pueden utilizar tampones de lavado, los cuales presentan elevadas concentraciones en sales - tales como, p. ej., hidrocloruro de guanidinio 3 M. Igualmente, se pueden utilizar otros medios estandares para la realizacion de la etapa de lavado, por ejemplo medios alcoholicos tales como, p.ej., disoluciones de alcanos de cadena corta con uno a cinco atomos de carbono, preferiblemente, disoluciones de etanol en agua y de manera particularmente preferida, etanol acuoso al 70 por ciento.
La utilizacion de partfculas magneticas posibilita una realizacion sencilla de las etapas de lavado mediante la agregacion magnetica de las partfculas, separacion del medio que une acidos nucleicos, supresion del medio de lavado y adicion de medio de lavado nuevo tan a menudo como le parezca necesario al experto en la tecnica.
Tras el procedimiento del aislamiento de acidos nucleicos y, en su caso, de cada una de las etapas de lavado deseada, el soporte que porta el acido nucleico puede ser transferido, p. ej., resuspendido o sumergido, en cualquier medio adecuado, p. ej., agua o un tampon con fuerza ionica baja.
A continuacion de la ultima etapa de lavado, se puede realizar una breve etapa de secado de las partfculas magneticas al vacfo o (dejando) evaporar el lfquido.
Es evidente que las etapas del lavado y del secado descritas anteriormente no solo pueden ser llevadas a cabo durante el lavado y/o el aislamiento de acidos nucleicos, sino tambien son adecuadas para el lavado y/o el aislamiento de los otros materiales biologicos anteriormente nombrados.
En funcion del soporte y del tipo de un subsiguiente tratamiento, puede ser deseable disolver el acido nucleico del soporte o no disolver este del soporte. En el caso de un soporte particularmente solido tal como las partfculas magneticas arriba mencionadas, este puede, en muchos casos, ser utilizado directamente tal como, p. ej., en la PCR u otros metodos de amplificacion sin tener que eluir los acidos nucleicos del soporte. Ademas, tampoco es necesaria una elucion para muchos procedimientos de deteccion o procedimientos de identificacion de ADN, ya que, aunque el ADN, casualmente, esta en contacto con la superficie de las bolitas y puede estar unido con una multitud de puntos mediante uniones por puente de hidrogeno o enlaces ionicos u otra fuerzas, esta a disposicion una longitud de ADN suficiente para la hibridacion con oligonucleotidos y para la multiplicacion.
Para el caso de que en el material biologico se trate de acidos nucleicos nativos, se puede separar el acido nucleico por medio de un tampon de elucion con contenido bajo en sales de las partfculas de acuerdo con la invencion. Tampones de este tipo son conocidos por el estado de la tecnica [Analytical Biochemistry 175,196-201 (1988)]. Como tampon de elucion con bajo contenido en sales se utilizan, en particular, tampones con un contenido en sales de menos de 0,1 mol/l. De manera particularmente preferida, el tampon de elucion contiene Tris-HCl.
Tambien es particularmente adecuada para la elucion agua desmineralizada.
En caso deseado, tambien es posible separar el ARN del ADN, lo cual se puede lograr mediante la destruccion del ARN antes de la etapa de la separacion de ADN, por ejemplo mediante adicion de RNasa o alcalis tal como, p. ej., NaOH.
Mediante combinacion del aislamiento de celulas de acuerdo con la invencion arriba descrito con el aislamiento de acidos nucleicos de acuerdo con la invencion, igualmente descrito, mediante la union en su forma nativa a materiales de soporte magneticos, en forma de partfcula, a la temperatura de enlace elevada de acuerdo con la invencion, resulta un procedimiento particularmente ventajoso para el aislamiento de acidos nucleicos de muestras que contienen celulas. Las ventajas de esta forma de realizacion no solo consisten en su simplicidad y alta sensibilidad, asf como su sencilla capacidad de automatizacion sino, particularmente, en su alto rendimiento mediante la union de acuerdo con la invencion de los acidos nucleicos a las superficies de silice a temperaturas elevadas.
Los materiales biologicos aislados a consecuencia del procedimiento de acuerdo con la invencion pueden ahora continuar siendo utilizados de manera arbitraria. Por ejemplo, se pueden utilizar como sustrato para diferentes reacciones enzimaticas. En el caso de los acidos nucleicos se mencionan como ejemplos la secuenciacion, el marcaje radiactivo o no radiactivo, la amplificacion de una o varias secuencias contenidas en ellos, la transcripcion, la hibridacion con acidos nucleicos con sondas marcados, la traslacion o la ligacion. Una ventaja del procedimiento de acuerdo con la invencion es que la separacion del material biologico, en particular de los acidos nucleicos del lfquido, no es solo muy sencilla, sino tambien se puede llevar a cabo con altas ganancias y alto rendimiento.
La Figura 1 muestra valores medios de los valores Ct de ARN del VHC segun (RT)-PCR en tiempo real en funcion de la temperatura de enlace. Una descripcion adicional de la figura se encuentra en el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra los valores medios de los valores Ct de ARN del VHC (Fig. 2 a)) ADN del VHB (Fig. 2b)) y VIH blindado ("armored-HIV") (Fig. 2 c)) segun (RT)-PCR en tiempo real en funcion de la temperatura de enlace. Una descripcion adicional de la figura se encuentra en el Ejemplo 2.
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Ejemplo 1
Extraccion de ARN viral y de ADN viral (Nevada a cabo con el kit MagAttract Virus Mini M 48 (QIAGEN, Hilden, Alemania)).
400 |jl de plasma, suero o CSF (Uquido) se combinan y mezclan con ayuda de un tampon de lisis adquirible comercialmente, p. ej., 435 jl de Tampon de Lisis AL de QIAGEN, que contiene 3 jg de ARN de soporte y una proteasa, p. ej,. 80 jl de proteasa liofilizada de QIAGEN, resuspendida en Tampon de Resuspension de Proteasa de QIAGEN. La mezcla se incuba durante un espacio de tiempo de 15 minutos a una temperatura de 56 °C.
Despues se mezclan las partfculas de sflice magneticas - p. ej. 30 jl MagAttract Suspension B (QIAGEN, Hilden, Alemania) - y 525 jl de isopropanol. Tiene lugar una incubacion durante 5 minutos a 8 °C, 18 °C, 26 °C, 36 °C, 46 °C, 56 °C, 65 °C o 75 °C (vease abajo), durante la cual se unen los acidos nucleicos a las partfculas de silice magneticas. Tras la separacion de las partfculas, se retira la fase lfquida y las partfculas se lavan con un tampon de lavado, p. ej. con 500 jl de Tampon de Lavado AW 1 de QIAGEN reconstituido con etanol. Tras la separacion de las partfculas se retira la fase lfquida y se lavan de nuevo las partfculas - p. ej. con 500 jl de Tampon de Lavado AW 2 de QIAGEN reconstituido con etanol. Se repite el ultimo proceso de lavado. Despues se lavan las partfculas con 500 jl de etanol. Tras la separacion de las partfculas se retira la fase etanolica y las partfculas se secan a temperatura ambiente. A continuacion, se eluye el acido nucleico con un tampon de elucion obtenible comercialmente - p. ej., con 100 jl de Tampon de Elucion QIAGEN AVE -, las partfculas de sflice magneticas se retiran y el material eluido se calienta durante un espacio de tiempo de 5 minutos a un temperatura de 75 °C.
De acuerdo con la metodologfa arriba descrita se mezclo plasma humano negativo con VHC (ARN viral). 12 replicas de las muestras se calentaron respectivamente a 8 °C, 18 °C, 26 °C, 36 °C, 46 °C, 56 °C, 65 °C o bien 75 °C antes de la union. Los materiales eluidos obtenidos se sometieron en cada caso a una (RT)-PCR en tiempo real espedfica para el VHC. De los valores medios de los valores Ct en funcion de la temperatura de enlace representados en la Fig. 1, es evidente que con la realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion en el caso de la union en un intervalo de temperaturas 36 °C a 75 °C, la mision que sirve de base para la invencion se resuelve de manera impresionante.
Ejemplo 2
En otro experimento se mezclo, de acuerdo con la metodologfa descrita en el ejemplo anterior, plasma humano negativo con VHC (un virus de ARN de una cadena) y VHB (un virus de ADN de doble cadena), asf como VIH blindado ("armored-HIV") (un ARN sintetico, el cual fue empaquetado en una envoltura de protema).
En cada caso se procesaron 6 repeticiones de ensayo (operaciones) con en cada caso 6 replicas de las muestras, por un lado, con el protocolo estandar MagAttract Virus Mini M 48 de QIAGEN (protocolo como en el Ejemplo 1, union de acido nucleico, pero a 8 °C), asf como un protocolo MagAttract Virus Mini M 48 modificado, en el cual el lisado se calento hasta 56 °C antes de la union. Los materiales eluidos obtenidos se sometieron en cada caso a una (RT)-PCR en tiempo real espedfica para el VHC, VHB y VIH. De los valores medios de los valores Ct en funcion de la temperatura de enlace representados en la Fig. 2a) a c), es evidente que en el caso de la realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, la union del acido nucleico a temperatura elevada, aumenta significantemente el rendimiento.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para el aislamiento y/o purificacion de acidos nucleicos, que comprende las siguientes etapas de procedimiento
    a) lisado de una muestra biologica que contiene celulas y/o virus y/o fagos,
    b) inmovilizacion del o de los acidos nucleicos liberados en una matriz sobre una base de uno o varios compuestos de silicio-oxfgeno en presencia de un alcanol ramificado o no ramificado elegido de isopropanol y etanol y un compuesto caotropico y, en su caso, lavado del o de los acidos nucleicos inmovilizados sobre la matriz,
    c) separacion del acido nucleico unido de manera en sf conocida,
    tratandose en el caso de la matriz de partfculas magneticas con una superficie de sflice y teniendo lugar la inmovilizacion del o de los acidos nucleicos en un intervalo de temperaturas de 50 a 65° C.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la inmovilizacion tiene lugar a una temperatura de 56 °C.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto caotropico se representa mediante una sal de sodio o de guanidinio caotropica.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, en el que la sal de sodio o de guanidinio caotropica es yoduro de sodio, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, iso-tiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio, o representa una mezcla de dos o mas de las sales mencionadas.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el alcanol se representa mediante mezclas de los alcanoles nombrados.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 5, en el que el alcanol se presenta en forma de una disolucion acuosa en una concentracion de 1 a 100% (volumen/volumen), preferiblemente 2 a 80%, mas preferiblemente de 5 a 70%, aun mas preferiblemente de 10 a 60% y lo mas preferiblemente de 15 a 50%.
  7. 7. Procedimiento para la inmovilizacion de acidos nucleicos en una matriz, en la cual se trata de partfculas magneticas con una superficie de sflice, en presencia de un alcanol ramificado o no ramificado, elegido de isopropanol, propanol y etanol y un compuesto caotropico, en el que la inmovilizacion del o de los acidos nucleicos tiene lugar en un intervalo de temperaturas de 50 a 65 °C.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el alcanol se presenta en disolucion acuosa.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que el alcanol se representa mediante mezclas de los alcanoles mencionados.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que la inmovilizacion tiene lugar en presencia de una disolucion acuosa de etanol, propanol y/o isopropanol en un concentracion en un intervalo de 1 a 100% (volumen/volumen), preferiblemente de 2 a 80%, mas preferiblemente de 5 a 70%, aun mas preferiblemente de 10 a 60% y lo mas preferiblemente de 15 a 50% a una temperatura de 56 °C.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el compuesto caotropico se representa mediante una sal de sodio o de guanidinio caotropica.
  12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, en el que la sal de sodio o de guanidinio caotropica es yoduro de sodio, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio o representa una mezcla de dos o mas de de las sales mencionadas.
  13. 13. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que la inmovilizacion tiene lugar a una temperatura de 56 ° C.
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