ES2617226T3 - Ensayos multiplexados basados en aptámeros - Google Patents

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Abstract

Un método que comprende: proporcionar un aptámero que está inmovilizado en un primer soporte sólido, teniendo el aptámero una afinidad de unión específica por la molécula diana y albergando un primer marcador, que tiene una afinidad por un primer elemento de captura, comprendiendo el primer soporte sólido un primer elemento de captura y estando el primer marcador asociado al primer elemento de captura para inmovilizar el aptámero sobre el primer soporte sólido, habiendo sido lavado dicho primer soporte sólido con una o más soluciones que disocian los aptámeros agregados; poner en contacto dicho aptámero inmovilizado con la muestra de ensayo, en donde se forma un complejo de afinidad aptámero-diana, si dicha molécula diana está presente en dicha muestra de ensayo; retirar uno o más componentes de la mezcla no asociados a dicho primer soporte sólido; unir un segundo marcador con una afinidad por un segundo elemento de captura a dicha molécula diana en el complejo de afinidad aptámero-diana; liberar el complejo de afinidad aptámero-diana de dicho primer soporte sólido; exponer el complejo de afinidad aptámero-diana liberado a un segundo soporte sólido que comprende un segundo elemento de captura y permitir que el segundo marcador se asocie a dicho segundo elemento de captura; retirar cualquier componente de la mezcla no asociado a dicho soporte sólido; y eluir los aptámeros de dicho segundo soporte sólido con una o más soluciones que comprenden una sal caotrópica que altera las interacciones aptámero/analito.

Description

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DESCRIPCION
Ensayos multiplexados basados en aptameros Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos, dispositivos, reactivos y kits disenados para mejorar la actuacion de ensayos multiplexados basados en aptameros. Dichos metodos tienen una amplia utilidad en aplicaciones diagnosticas, as! como en el descubrimiento de biomarcadores y el diseno y desarrollo de herramientas para la investigation y desarrollo y agentes terapeuticos basados en aptameros. Especlficamente, se proporcionan materiales y metodos para la reduction o elimination de la senal de fondo.
Antecedentes
La siguiente description proporciona un sumario de information relevante para la presente divulgation y no una concesion de que cualquier informacion que se proporciona o publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento es una tecnica anterior a la invencion reivindicada en el presente.
Los ensayos dirigidos a la detection y cuantificacion de moleculas fisiologicamente significativas en muestras biologicas y otras muestras son herramientas importantes en la investigacion cientlfica y en el campo de la salud publica. Una clase de dichos ensayos implica el uso de una micromatriz que incluye uno o mas aptameros inmovilizados en un soporte solido. Los aptameros son capaces de unirse cada uno a una molecula diana de una manera altamente especlfica y con una afinidad muy alta. Vease por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 5.475.096 titulada “Nucleic Acid Ligands”, vease tambien, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 6.242.246, Patente de EE. UU. N° 6.458.543 y Patente de EE. UU. N° 6.503.715, cada una de las cuales se titula "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Una vez que la micromatriz se pone en contacto con una muestra, los aptameros se unen a sus moleculas diana respectivas presentes en la muestra y de esta manera se hace posible una determination de la ausencia, presencia, cantidad, y/o concentration de las moleculas diana en la muestra.
Los ensayos multiplexados de aptameros que proporcionan la interaction dirigida basada en una solution y las etapas de separation disenadas para retirar componentes especlficos de una mezcla de ensayo tambien se han descrito, vease, Patente de EE. UU. N° 7.855.054 y 7.964.356 y Publicaciones de EE. UU. N° US/2011/0136099 y US/2012/0115752. Los metodos de ensayo de aptameros que se describen utilizan una o mas etapas de captura especlfica para separar los componentes de una muestra de ensayo a partir de la diana o dianas que se van a detectar mientras que se alsla el complejo de afinidad aptamero-diana.
La sensibilidad y especificidad de muchos formatos de ensayos estan limitadas por la capacidad del metodo de deteccion para distinguir una senal verdadera de la senal que se produce debido a asociaciones no especlficas durante el ensayo y que da como resultado una senal detectable. Esto es particularmente cierto en los ensayos multiplexados basados en aptameros. Se habla observado que una de las principales fuentes de union no especlfica en este tipo de ensayo es una funcion de la interaccion aptamero-aptamero no anticipadas. Como la interaccion diana/aptamero depende del mantenimiento de caracterlsticas estructurales del aptamero especlfico de la diana, cualquier metodo para reducir las interacciones aptamero-aptamero necesita estar equilibrado de manera que no reduzca las interacciones aptamero/diana especlficas. La presente divulgacion describe metodos para eliminar la senal de fondo en un ensayo de aptamero multiplexado o sencillo mientras se mantienen las interacciones diana/aptamero especlficas.
Sumario
La presente divulgacion proporciona metodos, dispositivos, reactivos, y kits disenados para mejorar la actuacion de ensayos de analito unico y multiplexados basados en aptameros. Especlficamente, se proporcionan materiales y metodos para la reduccion o eliminacion de la senal de fondo.
En una realization, se proporcionan aptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana y un primera marcador que se puede liberar. En algunas realizaciones, los aptameros son fotoaptameros. En algunas realizaciones este primer marcador que se puede liberar es una biotina fotoescindible. Se describen otros marcadores y restos escindibles y aptameros que contienen dichos marcadores y restos escindibles.
El aptamero que comprende el primer marcador liberable que tiene una afinidad especlfica por una molecula diana se inmoviliza en un soporte solido en solucion antes de la union de equilibrio con la muestra de ensayo. La fijacion del aptamero al soporte solido se consigue poniendo en contacto un primer soporte solido con el aptamero y permitiendo que el primer marcador liberable incluido en el aptamero se asocie o directa, o indirectamente, con un primer agente de captura apropiado que esta fijado a o forma parte del primer soporte solido. Tras la fijacion, se lava con una solucion tampon a un pH de 11 para retirar los agregados aptamero/aptamero, reduciendo de esta manera la senal de fondo (inmovilizacion de “Captation 0”, definition posterior).
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Se prepara entonces una muestra de ensayo y se pone en contacto con los aptameros inmovilizados que tienen una afinidad especifica para sus moleculas diana respectivas. Si la muestra de ensayo contiene la molecula(s) diana, se formara un complejo de afinidad aptamero-diana en la mezcla con la muestra de ensayo. Notese que ademas de los complejos de afinidad aptamero-diana, tambien se unira el aptamero que no ha formado un complejo al primer soporte solido. El complejo de afinidad aptamero-diana y el aptamero que no ha formado complejo que se han asociado a la sonda en el soporte solido se separan del resto de la mezcla, retirando de esta manera la diana libre y todo el resto de material que no ha formado complejos de la muestra de ensayo (matriz de muestra); es decir, los componentes de la mezcla que no se han asociado al primer soporte solido. Se hace referencia a esta etapa de particion como la particion de Captura-1 (vease la definicion posteriormente). Despues de la particion del complejo de afinidad aptamero-diana, junto con cualquier aptamero que no ha formado complejos, se libera del primer soporte solido utilizando un metodo apropiado para el primer marcador liberable particular que se haya empleado.
En una realizacion, los complejos de afinidad de aptamero-diana unidos al soporte solido se tratan con un agente que introduce un segundo marcador al componente de molecula diana de los complejos de afinidad aptamero-diana. En una realizacion, la diana es una proteina o un peptido, y la diana se biotinila tratandola con NHS-PEO4-biotina. El segundo marcador que se introduce en la molecula diana puede ser el mismo o diferente del marcador de captura del aptamero. Si el segundo marcador es el mismo que el primer marcador, o el marcador de captura del aptamero se pueden bloquear los sitios de captura libres del primer soporte solido antes de iniciar esta etapa de marcado. Los metodos de marcado, y en particular, el marcado de dianas tales como peptidos y proteinas se describen en la Patente de EE. UU. N° 7.855.054.
La particion se completa liberando los aptameros que no han formado complejos y los complejos de afinidad aptamero-diana del primer soporte solido. En una realizacion, el primer marcador liberable es un resto fotoescindible que se escinde por irradiacion con una lampara UV en condiciones que escinden > 90 % del primer marcador liberable. En otras realizaciones, la liberacion se consigue por el metodo apropiado para el resto liberable seleccionado en el primer marcador liberable. Los complejos de afinidad aptamero-diana se pueden eluir y recolectar para su uso adicional en el ensayo o se pueden poner en contacto con otro soporte solido para llevar a cabo el resto de etapas del ensayo.
En una realizacion, se lleva a cabo una segunda particion (a la que se hace referencia como particion de Captura-2, vease la definicion posteriormente) para retirar el aptamero libre. Como se ha descrito anteriormente, en una realizacion, se puede anadir un segundo marcador que se utiliza en la particion Captura-2 a la diana mientras que el complejo de afinidad aptamero-diana todavia esta en contacto con el soporte solido utilizado en la captura Captura- 0. En otras realizaciones, el segundo marcador se puede anadir a la diana en otro momento del ensayo antes de iniciar la particion Captura-2. La mezcla se pone en contacto con un soporte solido, teniendo el soporte solido un elemento de captura (segundo) adherido a su superficie que es capaz de unirse al marcador de captura de la diana (segundo marcador), preferentemente con una alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido son perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin Cl) que estan contenidas en un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura (segundo elemento de captura) es estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de los componentes separados de la mezcla. Los complejos de afinidad aptamero-diana contenidos en la mezcla se unen de esta manera al soporte solido por medio de la interaccion de union del marcador de captura de la diana (segundo) y el segundo elemento de captura del segundo soporte solido. El complejo de afinidad aptamero-diana se separa entonces del resto de la muestra, por ejemplo, lavando el soporte con soluciones tampon, incluyendo tampones que comprenden disolventes organicos que incluyen, pero no se limitan a glicerol.
Los aptameros se eluyen entonces selectivamente de los complejos aptamero-diana con tampones que comprenden sales caotropicas del grupo que incluyen, pero no se limitan a perclorato sodico, cloruro de litio, cloruro sodico y cloruro magnesico. Loa aptameros retenidos en las perlas de Captura-2 gracias a la interaccion aptamero/aptamero no se eluyen por este tratamiento.
En otra realizacion, el aptamero que se libera de la particion Captura-2 es detectado y es cuantificado adicionalmente por cualquiera de los metodos de deteccion de acido nucleico adecuados, tales como, por ejemplo, hibridacion en micromatrices de ADN, Q-PCR, espectrometria de masas, ensayo Invader, secuenciacion de proxima generacion y similares. Estos metodos de deteccion se describen con mayor detalle posteriormente.
Se puede utilizar cualquiera de los metodos que se describen en el presente documento para llevar a cabo un ensayo de analito unico o un analisis multiplexado de una muestra de ensayo. Cualquier analisis multiplexado puede incluir el uso de dos, decenas, cientos o miles de aptameros para ensayar simultaneamente un numero igual de moleculas diana de una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica, por ejemplo. En estas realizaciones, se introduce una pluralidad de aptamero en la muestra de ensayo y se puede llevar a cabo cualquiera de los ensayos descritos anteriormente. Tras la liberacion de los aptameros, se puede emplear cualquiera de los metodos de deteccion de acido nucleico multiplexado adecuados para medir independientemente los diferentes aptameros que se han liberado. En una realizacion, esto se puede conseguir por hibridacion con sondas complementarias que se han dispuesto por separado en una superficie solida. En otra realizacion, cada uno de los diferentes aptameros se puede detectar basandose en su peso molecular utilizando espectrometria de masas. En otra realizacion mas, cada
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uno de los diferentes aptameros se pueden detectar basandose en la movilidad electroforetica, tal como, por ejemplo, en electroforesis capilar, en un gel o por cromatografia liquida. En otra realizacion, se pueden utilizar sondas PCR unicas para detectar y cuantificar opcionalmente cada uno de los diferentes aptameros utilizando Q- PCR. En otra realizacion, se pueden utilizar metodos de secuenciacion de proxima generation para detectar y opcionalmente cuantificar cada uno de los diferentes aptameros.
En cada uno de los ensayos desvelados en el presente documento, se puede utilizar un desafio cinetico para aumentar la especificidad del ensayo y para reducir la union no especifica. En una realizacion, que se puede emplear opcionalmente en cada uno de los ensayos descritos en el presente documento, se puede conseguir una reduction adicional en la union no especifica por pre-incubacion con un competidor con la muestra de ensayo o por adicion de un competidor a la mezcla durante la union en equilibrio. En otras realizaciones el desafio cinetico se lleva a cabo por dilucion.
Otra realizacion describe un metodo para detectar una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo: exponer un aptamero que tienen una afinidad especifica por la molecula diana y que alberga un primer marcador que tiene afinidad especifica por un primer elemento de captura con un primer soporte solido que comprende un primer elemento de captura y permite que se asocie el primer marcador con el primer elemento de captura; lavar dicho soporte solido con una o mas soluciones tampon que disocia los aptameros agregados, y eluir los aptameros de dicho soporte solido con una o mas soluciones tampon que comprenden sales caotropicas que altera las interacciones aptamero/analito pero mantienen las interacciones aptamero/aptamero e hibridacion ADN. En una realizacion la sal caotropica se selecciona de entre el grupo que consiste en perclorato sodico, cloruro de litio, cloruro sodico, y cloruro magnesico y la solution tampon que disocian los aptameros agregados comprende un disolvente organico. En una realizacion el disolvente organico es glicerol.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 representa graficamente la retention dependiente de aptamero y la elucion posterior de aptameros de las perlas de Captura-2. El aptamero radiomarcado que no alberga biotina se incubo con perlas magneticas con estreptavidina que llevaban cantidades crecientes de un aptamero biotinilado no radiomarcado y se lavaron. El material retenido se eluyo entonces con cloruro sodico 1 M en tampon CAPS a pH 10. La cantidad de aptamero radiomarcado eluido es proporcional a la cantidad de aptamero frio adsorbido por las perlas de Captura-2.
Las Figuras 2A-2F ilustran el efecto de la concentration de plasma sanguineo en el ensayo cuando el aptamero no se pre-inmoviliza antes de equilibrarse con la muestra de ensayo. Con referencia a la Figura 2, el plasma se titulo desde un 0 % v/v a un 25 % v/v. Como se puede ver, la senal de la mayoria de los analitos se estabiliza entre un 10 y un 20 %.
Las Figuras 3A-3F representan graficamente la recuperation del aptamero en el eluido de fotoescision en funcion de la concentracion de plasma cuando el aptamero no se pre-inmoviliza antes de equilibrarse con la muestra de ensayo. El eluido de la fotoescision de Captura-1 se recupero y se cuantifico por hibridacion (eje Y, unidades de fluorescencia relativa). Como se puede ver, la recuperacion de aptamero disminuye drasticamente al aumentar la concentracion de plasma, cuyos efectos significativos se ven incluso con un 5 % de plasma. Se desconoce si la union de analito afecta la union de aptamero a las perlas, sin embargo, se deberia senalar que la perdida preferente de aptameros que forman complejos generaria efectos dependientes del plasma incluso mas grandes.
Las Figuras 4A-4D representan graficamente una comparacion de las titulaciones de plasma en ensayos convencionales (curvas negras) y pre-inmovilizados (curvas discontinuas).
Las Figuras 5A-5D representan graficamente una comparacion de la elucion con 1 M de NaCl/CAPSO y la elucion con 1,8 M de NaClO4/PIPES utilizando el formato de ensayo pre-inmovilizado descrito en el presente documento. Las curvas convencionales en tampon (curvas inferiores) y con vertido de un 40 % de plasma (curvas superiores) se ejecutaron en un formato de ensayo pre-inmovilizado.
La Figura 6 representa los CV (coeficientes de variation) de 8 pocillos repetidos solo con tampon utilizando la elucion con perclorato y aptameros pre-inmovilizados.
La Figura 7 ilustra el vertido y recuperacion medidos para 300 analitos. La recuperacion con vertido se define como (senal de analito 10 pM vertido en plasma- senal de analito plasma) /senal de analito 10 pM vertido de tampon).
La Figura 8 ilustra el giro a la izquierda de la respuesta a la dosis de tampon en el formato inmovilizado para la proteina ERBB2. Los niveles endogenos medidos son mas de diez veces menores y muy cercanos a los niveles endogenos informados.
La Figura 9 ilustra una titulacion proteica mejorada en tampon, el mejor comportamiento de vertido y recuperacion, el comportamiento mas lineal de la titulacion de plasma y los niveles de proteina endogena previstos mas estables para la proteina Activina A.
Descripcion detallada
Ahora se hara referencia en detalle a las realizaciones representativas de la invention. Aunque la invention se describira en conjuncion con las realizaciones enumeradas, se entendera que la invencion no pretende limitarse a estas realizaciones. Por el contrario, se pretende que la invencion cubra todas las alternativas, modificaciones, y
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equivalentes que se puedan incluir en el alcance de la presente invencion como se define por las reivindicaciones.
La practica de la presente invencion emplea, a menos de que se indique otra cosa, metodos convencionales de qulmica, microbiologla, biologla molecular, y tecnicas de ADN recombinante al nivel del experto en la tecnica. Dichas tecnicas estan totalmente explicadas en la bibliografla. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual (Ultima Edicion); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Ultima Edicion); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., Ultima Edicion); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., Ultima Edicion).
A menos de que se defina otra cosa, los terminos tecnicos y cientlficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habituado en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Aunque se pueden utilizar cualquiera de los metodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento para la practica o ensayo de la invencion, los metodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora.
Los ejemplos de las publicaciones que se citan y las limitaciones relacionadas con ellas pretenden ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de las publicaciones que se citan seran evidentes para los expertos en la tecnica con la lectura de la memoria descriptiva y un estudio de los dibujos.
La presente divulgacion incluye metodos, dispositivos, reactivos y kits disenados para mejorar la actuacion de los ensayos basados en aptameros multiplexados. Los metodos, dispositivos, reactivos y kits desvelados proporcionan ensayos de alta sensibilidad para la detection y/o cuantificacion de moleculas diana en una muestra de ensayo reduciendo o eliminando la senal de fondo.
Es digno de senalar que, a menos de que se especifique otra cosa en una realization particular, los metodos para la deteccion y/o cuantificacion de una molecula diana descritos en el presente documento son independientes del orden especlfico en el que se describen las etapas. Con el fin de ilustracion, se describen los metodos con una secuencia especlfica de etapas; sin embargo, se tiene que entender que es posible cualquier numero de permutaciones de la secuencia de etapas especificada siempre que se consigue el objetivo del ensayo particular que se describe. Dicho de otra manera, las etapas enumeradas en cualquiera de los metodos desvelados se pueden llevar a cabo en cualquier orden factible, y los metodos de la invencion no se limitan a cualquier orden en particular que se presente en cualquiera de las realizaciones descritas, los ejemplos o las reivindicaciones adjuntas. Ademas, por conveniencia y facilidad de presentation, se describen los distintos metodos en referencia a una unica molecula diana y un unico aptamero. Sin embargo, se tiene que entender que cualquiera de los metodos descritos se pueden llevar a cabo en un formato multiple que puede proporcionar la deteccion y/o cuantificacion de multiples dianas utilizando multiples aptameros, de manera que , por ejemplo, se puedan detectar y/o cuantificar multiples moleculas diana en una muestra de ensayo poniendo en contacto la muestra de ensayo con multiples aptameros, en los que cada aptamero tiene una afinidad especlfica para una molecula dina particular (es decir, en un formato multiple).
Como se utiliza en la presente divulgacion, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, y “el” incluyen las referencias plurales, a menos de que el contenido dicte claramente otra cosa, y se utilizan de manera intercambiable con “al menos uno” y “uno o mas”. Por lo tanto, la referencia a “un aptamero” incluye mezclas de aptameros, y similares.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “aproximadamente” representa una modification o variation insignificante o variacion del valor numerico de manera que la funcion basica del artlculo al que se refiere el valor numerico no cambia.
La expresion “cada uno” cuando se utiliza en el presente documento para referirse a una pluralidad de artlculos pretende referirse a al menos dos de los artlculos. Necesita que no sea necesario que todos los artlculos que forman la pluralidad satisfagan una limitation adicional asociada.
Como se utiliza en el presente documento, los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “contiene”, “que contiene”, y cualquier variacion de los mismos, pretende cubrir una inclusion no excluyente, de manera que un procedimiento, metodo, producto por el procedimiento, o composition de material que comprende, incluye , o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solamente esos elementos sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho procedimiento, metodo, producto por el procedimiento, o composicion de material.
Como se utiliza en el presente documento, “asociado”, “asocia”, y cualquier variacion de los mismos se refiere a una interaction o formation de complejos entre un marcador y una sonda dando como resultado un complejo lo suficientemente estable para permitir una separation de materiales “no asociados” o no unidos, tal como, por ejemplo, componentes no unidos de una muestra de ensayo, a partir del complejo marcador-sonda en condiciones de formacion de complejos o reaction determinadas. Un marcador y una sonda se pueden asociar entre ellos directamente interactuando y uniendose entre ellos con especificidad. Un marcador y una sonda se pueden asociar tambien entre ellos de manera indirecta tal como cuando su formacion de complejo esta mediada por una molecula
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enlazadora.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “nucleotido” se refiere a un ribonucleotido o desoxirribonucleotido, o una forma modificada del mismo, asi como un analogo del mismo. Los nucleotidos incluyen especies que incluyen purinas (por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina, y sus derivados y analogos) asi como pirimidinas (por ejemplo, citosina, uracilo, timina, y sus derivados y analogos).
Como se utiliza en el presente documento, “acido nucleico”, “oligonucleotido”, y “polinucleotido” se utilizan de manera intercambiable para referirse a un polimero de nucleotidos e incluyen ADN, ARN, hibridos ADN/ARN y modificaciones de estos tipos de acido nucleico, oligonucleotidos y polinucleotidos, en los que se incluye la union de varias entidades o restos a las unidades de nucleotido en cualquier posicion. Los terminos “polinucleotido”, “oligonucleotido” y “acido nucleico” incluye moleculas de cadena doble o sencilla asi como moleculas de cadena multiple (es decir, helicoidales triples). Acido nucleico, oligonucleotido y polinucleotido son terminos mas amplios que el termino aptamero y, por lo tanto, los terminos acido nucleico, oligonucleotido y polinucleotido incluyen polimeros de nucleotidos que son aptameros pero los terminos acido nucleico, oligonucleotido y polinucleotido no se limitan a aptameros.
Como se utiliza en el presente documento, “ligando de acido nucleico”, “aptamero”, “SOMAmero” y “clon” se utilizan de manera intercambiable para referirse a un acido nucleico de origen no natural que tiene una accion deseable sobre una molecula diana. Una accion deseable incluye, pero no se limita a, union a la diana, cambio catalitico de la diana, reaccionar con la diana de una manea que modifique o altere la diana o la actividad funcional de la diana, la union covalente a la diana (como en un inhibidor suicida), y facilitar la reaccion entre la diana y otra molecula. En una realizacion, la accion es la union de afinidad especifica de una molecula diana, siendo dicha molecula diana una estructura quimica tridimensional distinta de un polinucleotido que se une al ligando de acido nucleico por medio de un mecanismo que es independiente al emparejamiento de bases de Watson/Crick o formacion de una triple helice, en el que el aptamero no es un acido nucleico que tenga una funcion fisiologica conocida o que se une a la molecula diana. Los aptameros contra una determinada molecula incluyen acidos nucleicos que se identifican de entre una mezcla de acidos nucleicos candidatos, donde el aptamero es un ligando de la diana, por un metodo que comprende: (a) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, en la que los acidos nucleicos que tienen un aumento de afinidad por la diana con respecto a otros acidos nucleicos en la mezcla de candidatos se pueden separar del resto de la mezcla de candidatos; (b) separar los acidos nucleicos con aumento de afinidad a partir del resto de la mezcla de candidatos; y (c) amplificar los acidos nucleicos con afinidad aumentada para dar lugar a una mezcla enriquecida en ligandos de acidos nucleicos, por la que se identifican los aptameros de la molecula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son un caso de grados; sin embargo, en este contexto, la “afinidad de union especifica” de un aptamero por su diana significa que el aptamero se une a su diana con un grado de afinidad mucho mayor que al que se une a otros componentes no diana de una mezcla o muestra. Un aptamero puede incluir cualquier cantidad de nucleotidos adecuada. “Aptameros” se refiere a mas de uno de dichos grupos de moleculas. Diferentes aptameros pueden tener el mismo o diferente numero de nucleotidos. Los aptameros pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla, cadena doble, o contener regiones de doble cadena o triple cadena. Los aptameros pueden disenarse con cualquier combinacion de las bases de nucleotidos modificadas que se desee.
Como se utiliza en el presente documento, un “SOMAmero” o Aptamero modificado de tasa de disociacion lenta se refiere a un aptamero (incluyendo un aptamero que comprende al menos un nucleotido con una modificacion hidrofoba) con una tasa de disociacion (t©) de > 30 minutos. En algunas realizaciones, los SOMAmeros se generan utilizando los metodos SELEX mejorados descritos en la Patente de EE. UU. N° 7.947.447, titulada “Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".
Un aptamero se puede identificar utilizando cualquier metodo conocido incluyendo le procedimiento SELEX. Vease, por ejemplo, La Patente de EE. UU. N° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands". Una vez identificado, un aptamero se puede preparar o sintetizar de acuerdo con cualquier metodo conocido, incluyendo metodos sinteticos quimicos y metodos sinteticos enzimaticos.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “complejo de afinidad aptamero-diana”, “complejo de afinidad de aptamero” o “complejo de aptamero” se refiere a un complejo no covalente que esta formado por la interaction de un aptamero con su molecula diana. “Complejos de afinidad aptamero-diana”, “complejos de afinidad de aptamero” o “complejos aptamero” se refiere a mas de uno de dichos grupos de complejos. Un complejo de afinidad aptamero-diana, complejo de afinidad de aptamero o complejo de aptamero pueden revertirse o disociarse en general por un cambio en las condiciones ambientales, por ejemplo, un aumento de la temperatura, un aumento en la concentration salina, o la adicion de un desnaturalizante.
En algunas realizaciones, se proporciona un complejo no covalente de un aptamero y su diana, en el que el aptamero tiene una Kd para la diana de aproximadamente 100 nM o menos, en el que la tasa de disociacion (segun se determina por la semivida del complejo; t1/2) del aptamero de la diana es mayor o igual a aproximadamente 30 minutos; y/o en el que una, varias o todas las pirimidinas de la secuencia de acido nucleico del aptamero estan modificadas en la posicion 4 de la base.
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Como se utiliza en el presente documento, “complejo no especlfico” se refiere a una asociacion no covalente entre dos o mas moleculas distintas de aptamero y su molecula diana. Debido a que el complejo no especlfico no se selecciona basandose en una interaccion de afinidad entre sus moleculas constituyentes, si no que representa una interaccion entre clases de moleculas, las moleculas asociadas en un complejo no especlfico presentaran, en promedio, afinidades mucho menores entre ellas y tendran consecuentemente una mayor tasa de disociacion que un aptamero y su molecula diana. Los complejos no especlficos incluyen complejos formados entre un aptamero y una molecula no diana, un aptamero y otro aptamero, un competidor y una molecula no diana, un competidor y una molecula diana, un aptamero y un competidor, y una molecula diana y una molecula no diana, as! como agregados de mayor orden de aptamero, molecula diana, molecula no diana, superficie y competidor.
Como se utiliza en el presente documento, “molecula diana”, “analito”, y “diana” se utilizan de manera intercambiable para referirse a cualquier molecula de interes a la que se puede unir un aptamero con alta afinidad y especificidad y que puede estar presente en la muestra de ensayo. Una “molecula de interes” incluye cualquier variacion menor de una molecula particular, tal como en el case de una protelna, por ejemplo, variaciones menores de la secuencia de aminoacidos, formacion de puentes disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modification, tal como la conjugation con un componente marcador que no altere sustancialmente la identidad de la molecula. Moleculas diana a modo de ejemplo incluyen protelnas, oligopeptidos, acidos nucleicos, carbohidratos, llpidos, polisacaridos, glucoprotelnas, hormonas, receptores, antlgenos, anticuerpos, aficuerpos, mimeticos de anticuerpos, virus, agentes patogenos, sustancias toxicas, sustratos, metabolitos, analogos de estados de transition, inhibidores, farmacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, celulas, tejidos, y cualquier fragmento o parte de cualquiera de los anteriores, Un aptamero se puede identificar virtualmente por cualquier molecula qulmica o biologica de cualquier tamano, y por lo tanto virtualmente cualquier molecula qulmica o biologica de cualquier tamano puede ser una diana adecuada. Una diana tambien se puede modificar para aumentar la probabilidad o la fuerza de interaccion entre la diana y el aptamero. Una diana se puede modificar tambien para incluir un marcador, como se ha definido anteriormente. En realizaciones a modo de ejemplo, la molecula diana es una protelna. Vease la Patente de EE. UU. N° 6.376.190 titulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein" para los metodos en los que la diana SELEX es un peptido.
“Polipeptido”, “peptido”, y “protelna” se utilizan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a pollmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El pollmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos engloban tambien un pollmero de aminoacidos que se ha modificado naturalmente o por intervention; por ejemplo, por formacion de enlaces disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente marcador. Tambien se incluyen en la definition, por ejemplo, los polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), as! como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Los polipeptidos pueden ser de cadena sencilla o con cadenas asociadas.
La expresion “muestra de ensayo” se refiere en el presente documento a cualquier material, solution, o mezcla que contiene una pluralidad de moleculas y puede incluir al menos una molecula diana. La expresion muestra de ensayo incluye muestras biologicas, como se define posteriormente, y muestras que se pueden utilizar para ensayos ambientales o toxicologicos, tales como agua contaminada o potencialmente contaminada y vertidos industriales, por ejemplo. Una muestra de ensayo tambien puede ser un producto final, un producto intermedio, o un subproducto de un procedimiento preparatorio, por ejemplo un procedimiento de fabrication. Una muestra de ensayo puede incluir cualquier medio de ensayo adecuado, tampon, o diluyente que se ha anadido a un material, solucion, o mezcla que se obtiene de un organismo o de cualquier otra fuente (por ejemplo, el medio ambiente o una fuente industrial).
La expresion “muestra biologica” se refiere a cualquier material, solucion, o mezcla obtenida de un organismo. Esto incluye la sangre (incluyendo sangre completa, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma, y suero), esputo, exhalation, orina, semen, saliva, llquido cefalorraquldeo, llquido amniotico, llquido glandular, llquido linfatico, aspirado del pezon, aspirado bronquial, llquido sinovial, aspirado articular, celulas, extracto celular y llquido cefalorraquldeo. Tambien se incluyen fracciones separadas experimentalmente de todos los precedentes. La expresion “muestra biologica” tambien incluye materiales, soluciones, o mezclas que contienen material solido homogeneizado, tal como de una muestra de heces, una muestra tisular, o una biopsia de tejido, por ejemplo. La expresion “muestra biologica”, incluye tambien materiales, soluciones, o mezclas derivados de una llnea celular, cultivo tisular, cultivo celular, cultivo bacteriano, cultivo vlrico o sistema biologico celular libre (por ejemplo, IVTT).
En cualquiera de las realizaciones desveladas en el presente documento, se puede comparar una muestra de ensayo con una muestra de referencia. Una “muestra de referenda” se refiere en el presente documento a cualquier material, solucion, o mezcla que contiene una pluralidad de molecula y que se sabe que incluye al menos una molecula diana. La cantidad precisa o concentration de cualquiera de las moleculas diana presentes en la muestra de referencia tambien puede ser conocida. La expresion muestra de referencia incluye muestras biologicas, como se han definido en el presente documento, y muestras que se pueden utilizar para ensayos medioambientales o toxicologicos, tal como agua contaminada o potencialmente contaminada y vertidos industriales, por ejemplo. Una muestra de referencia tambien puede ser un producto final, un producto intermedio, o un subproducto de un proceso preparatorio, por ejemplo un procedimiento de fabricacion. Una muestra de referencia puede incluir cualquier medio
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de ensayo adecuado, tampon, o diluyente que se ha anadido a un material, solucion, o mezcla obtenida de un organismo o de cualquier otra fuente (por ejemplo, el medioambiente o una fuente industrial).
Como se utiliza en el presente documento, “molecula no diana” y “no diana” se utilizan de manera intercambiable para hacer referencia a una molecula contenida en una muestra de ensayo y que puede formar un complejo no especlfico con un aptamero. Se apreciara que una molecula que es una no diana para un primer aptamero puede ser una diana para un segundo aptamero. De igual manera, una molecula que es una diana para un primer aptamero puede ser una no diana para el segundo aptamero.
Como se utiliza en el presente documento “particion” se refiere a una separacion, concentration o elimination de una o mas especies moleculares de la muestra de ensayo u otras moleculas de la muestra de ensayo. La particion se puede utilizar para aumentar la sensibilidad y/o reducir la senal de fondo. La particion es mas eficaz despues de la formation del complejo de aptamero o cuando, el complejo de afinidad aptamero-diana se vuelve irreversible debido al enlace covalente introducido durante el entrecruzamiento. Se puede introducir una etapa de particion tras cualquier etapa, o tras cada etapa, cuando el complejo de afinidad aptamero-diana esta inmovilizado. La particion puede basarse tambien en la diferenciacion de tamano u otra propiedad especlfica que existe diferencialmente entre el complejo de afinidad aptamero-diana y otros componentes de la muestra de ensayo. La particion tambien se puede conseguir por medio de una interaction especlfica con un aptamero o diana. La particion puede conseguirse tambien basandose en las propiedades flsicas o bioqulmicas del aptamero, diana, complejo de afinidad aptamero- diana o complejo covalente aptamero-diana.
En los ensayos de analito unico y de aptameros multiplexados, se han disenado varias etapas para separar los complejos de afinidad especlficos de aptameros de los materiales de la muestra o los reactivos del ensayo que pueden dar lugar a senales de fondo confusas. A pesar de implementar estas etapas, la senal de fondo sigue siendo un problema en este tipo de ensayos. La senal de fondo en un metodo analltico se puede afrontar emplricamente o una estrategia mejor es identificar la fuente de la senal de fondo y eliminar la interaccion que da lugar al fondo. Se ha descubierto que la interaccion aptamero-aptamero es una fuente de fondo en los metodos de aptamero multiplexado. Los reactivos que reducen las interacciones ADN-ADN y ARN-ARN, incluyendo los que se basan en la secuencia son conocidos. Debido a que las interacciones internas de un aptamero determinan la estructura secundaria y terciaria del aptamero, no se espera que estos tipos de reactivos reduzcan sustancialmente la senal de fondo en un ensayo multiplexado sin afectar el plegamiento del aptamero y por lo tanto, la union a sus dianas correspondientes. Se describen materiales y metodos que equilibran la necesidad de reducir la senal de fondo con el mantenimiento de la estructura del aptamero.
La presente divulgation describe metodos mejorados para llevar a cabo los ensayos multiplexados basados en aptameros y fotoaptameros para la cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo en la que se puede separar el aptamero (o fotoaptamero) del complejo de afinidad aptamero- diana (o complejo covalente fotoaptamero-diana) para la detection final utilizando cualquier metodo de detection de acidos nucleicos adecuado en tanto en cuanto se pueden utilizar los materiales y metodos descritos en el presente documento para mejorar la actuation total del ensayo. Los fotoaptameros y aptameros comprenden grupos funcionales fotorreactivos que hacen posible que los aptameros se unan covalentemente o se “fotoentrecrucen” con sus moleculas diana.
Aparecieron dos limitaciones no previstas al examinar detalladamente los metodos descritos anteriormente para llevar a cabo los ensayos basados en aptameros sencillos o multiples, incluyendo los ensayos de afinidad de aptameros proteomicos multiplexados. En primer lugar, se identificaron las interacciones aptamero/aptamero como la fuente primaria de fondo del ensayo y de limitation potencial para la capacidad multiple. En segundo lugar, se descubrio que las matrices de muestras (primariamente suero y plasma) inhiblan la inmovilizacion de aptameros biotinilados en matrices sustituidas con estreptavidina. Se describen en el presente documento tres innovaciones primarias que reducen y/o eliminan ambas limitaciones del procedimiento. Dos son unicas de un metodo mejorado descrito en el presente documento (a las que se hace referencia en el presente documento como “Version 3”” del ensayo multiplexado); la otra se implemento en una version anterior del ensayo como se describe en Gold et al. (Dic. 2010) "Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery," PLoS One 5(12):e15005). La Version 3 es una realizacion de la invencion descrita en el presente documento.
La primera mejora en el ensayo, como se describe en Gold et al. (PLoS One (2010) 5(12):e15005), comprende el uso de disolventes organicos en algunos de los tampones de lavado de la etapa de Captura-2 para disminuir la constante dielectrica del medio. La adicion de estos tampones de lavado acentua eficazmente la repulsion tipo carga de matrices fosfodiester adyacentes de los aptameros, promoviendo de esta manera la disociacion de los aptameros que interactuan produciendo la senal de fondo.
La segunda mejora del procedimiento que se describe en el presente documento proporciona una ventaja doble. En primer lugar, como en el caso de la adicion de disolventes organicos a algunos de los tampones de lavado utilizados en la etapa de Captura-2 del ensayo, tambien se tiene en cuenta la tendencia de los aptameros para interactuar, y por lo tanto se disminuye la senal de fono y se aumenta la capacidad multiple. Sin embargo, su ventaja primaria es contrarrestar la inhibition dependiente de matriz de la absorcion del aptamero biotinilado por las matrices de
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estreptavidina. Dicha inhibicion es detectado facilmente incluso a un 5 % v/v de plasma o suero, y limita las concentraciones de trabajo del ensayo a concentraciones de un 5-10 % de plasma o suero. Esta limitacion limita a su vez la sensibilidad del ensayo.
La segunda mejora para el ensayo multiplexado, como se describe en el presente documento comprende la pre- inmovilizacion de los aptameros marcados en matrices de soporte solido antes de equilibrarse (denominado “Captura-0) con la solucion de ensayo. El equilibrado con la solucion de ensayo se lleva entonces a cabo con aptameros unidos, en los mismos matraces del procedimiento. Como se describe en el presente documento con fines solo de ilustracion, los aptameros biotinilados se pre-inmovilizaron en matrices de perlas con estreptavidina, y se llevo a cabo el equilibrado con la solucion de ensayo con los aptameros unidos a las perlas. Esta etapa de inmovilizacion permite la inmovilizacion en condiciones en las que los aptameros tienen una disminucion de la tendencia a interactuar y tambien permite lavados muy rigurosos (con bases y con sales caotropicas) antes del equilibrado, alterando los aptameros que interaction y eliminando todos los aptameros no unidos gracias a la interaction muy robusta de la biotina-estreptavidina. Esto reduce la cantidad de “grumos” de aptamero atravesando el ensayo - grumos que con cierta frecuencia retenlan el resto de biotina detectable o se convertlan en biotinilados en el ensayo. Hay que senalar que la radiation escinde la mayorla, pero no todos los restos de biotina fotoescindible de los aptameros, mientras que algunos aptameros se convierten en biotinilados por medio de un tratamiento de biotina-NHS que pretende “marcar” protelnas. El aptamero biotinilado que se captura en la etapa Captura-2 crea una senal de fondo interactuando con el volumen de aptameros fotoescindidos, que se liberan entonces con la elucion (Figura 1). Tambien se deberla senalar que un formato pre-inmovilizado soportara probablemente capacidades multiples muy altas ya que se pueden inmovilizar paneles de aptameros por separado y luego combinarse en forma de union en perlas, rodeando de esta manea las condiciones en las que los aptameros puedan interactuar y aglomerarse.
Por lo tanto, la pre-inmovilizacion rodea la necesidad de la adsorcion del aptamero en presencia de la solucion de analito, asegurando de esta manera la inmovilizacion cuantitativa incluso cuando hay concentraciones inhibidoras del ensayo de soluciones de analito. Esto hace posible el uso de concentraciones mucho mayores, de hasta, e incluyendo al menos un 40 % v/v de plasma o suero, mas que la concentration maxima del 10 % del procedimiento que se habla descrito anteriormente. (Gold et al. (PLoS One (Dic. 2010) 5(12):e15005) o la concentracion maxima del 5 % utilizando en las ediciones mas recientes del procedimiento aumentando de esta manera la sensibilidad aproximadamente 4 a 8 veces, as! como aumentando, la robustez total del ensayo.
La tercera mejora del procedimiento total, como se describe en el presente documento comprende el uso de una sal caotropica a pH neutro para la elucion durante la etapa Captura-2 como se describe detalladamente posteriormente. Los metodos anteriores comprendlan el uso de cloruro sodico a pH alto (10), que alteraba la hibridacion de ADN y la interaccion aptamero/aptamero as! como la interaccion protelna/aptamero. Como se ha senalado anteriormente, la hibridacion de ADN y la interaccion aptamero/aptamero contribuyen a la senal de fondo del ensayo. Las sales caotropicas, que incluyen, pero no se limitan a perclorato sodico, cloruro de litio, cloruro sodico y cloruro magnesico a pH neutro, soportan la hibridacion de ADN y las interacciones aptamero/aptamero, aunque alteran las interacciones aptamero/protelna. El resultado neto disminuye significativamente (aproximadamente 10 veces) la senal de fondo, con un aumento concomitante de la sensibilidad del ensayo.
Revision de los ensayos de aptamero multiples descritos anteriormente
Los aptameros se equilibraron con una muestra de ensayo (por ejemplo, plasma) en solucion. Los complejos entre analitos y aptameros de larga duration (semivida media cercana a 30 minutos), particularmente los aptameros de tasa de disociacion lenta se formaban en este periodo. La mezcla de equilibrado, que comprendla la matriz de muestra, el aptamero, los analitos proteicos y los complejos aptamero/ analito se exponlan entonces a estreptavidina inmovilizada en perlas de agarosa (SA-agarosa) (en el caso en el que el aptamero estaba marcado con un resto de biotina). Los aptameros de la mezcla se capturaban en las SA-agarosa por medio del resto de biotina adjunto. Notese que el ensayo es dependiente de la captura cuantitativa de aptamero en esta etapa. Los aptameros inmovilizados se lavaban entonces en condiciones suaves, que eliminaba la protelna libre y unida debilmente, pero dejaba los aptameros y los complejos aptamero/analito detras. Esta etapa, denominada “Captura-1”, puede pensarse que es una etapa de purification proteica (Vease, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N° 7.947.447 y 7.855.054).
Las perlas de agarosa, que albergan los aptameros y los complejos analito/aptamero, se trataban entonces con biotina-NHS, dejando un “marcador” biotina en los analitos proteicos unidos a aptameros. Tras un lavado adicional, los aptameros, incluyendo los complejos analito biotinilado/aptamero se liberaban de las perlas de agarosa por medio de la escision de un enlazador labil entre el aptamero y el resto de biotina (como se describe en el ejemplo posterior, con fines solo de ilustracion, se utiliza un enlazador fotolabil que se escinde al exponerlo a luz UV). El denominado eluldo fotoescindido se transfiere entonces a un pocillo que contiene perlas de estreptavidina magneticas. Los complejos de aptamero/analito biotinilado se adsorben preferentemente. Se hace referencia a esta etapa de captura como “Captura-2”. (Vease, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N° 7.947.447 y 7.855). Despues de los lavados, los aptameros que estan unidos ahora a las perlas por medio de los analitos se eluyeron con una solucion de cloruro sodico a pH elevado. Los aptameros recuperados es cuantificadoron entonces por hibridacion
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con micromatrices comerciales. Las cantidades recuperadas de aptamero sirven como un equivalente de la concentracion de proteina, que se determina formalmente por medio de una curva de referencia.
Como se ha senalado anteriormente, se habia observado que las cantidades sustanciales de aptamero que atraviesan el ensayo (es decir que pasan a traves de las etapas de particion) y crean la senal de fondo incluso en ausencia de proteina anadida de una muestra de ensayo. La fuente de esta senal de fondo independiente de la proteina se trazo respecto a la interaccion aptamero/aptamero, como se ilustra en la Figura 1. Se exploraron varias estrategias de mitigacion para afrontar este problema, que se describen en Gold et al. (PLoS One (2010) 5(12):e15005). En ultimo termino, se seleccionaron lavados en glicerol caliente como una estrategia eficaz y adecuada para mitigar este problema. Sin embargo, distintos disolventes y reactivos que reducen la constante dielectrica del agua son capaces de mitigar la senal de fondo del ensayo de manera similar. Ejemplos incluyen, por no se limitan a glicerol, propilenglicol, trealosa, etanol y similares.
Mitigacion de la inhibicion de captura por la pre-absorcion de aptameros
Como se ha senalado anteriormente, se determino que el suero y el plasma disminuyen la eficacia de captura de aptameros, limitando la concentracion que se puede medir y se ilustra en las Figuras 2 y 3.
Como se ilustra en la Figura 4, la pre-inmovilizacion de los aptameros y el equilibrado posterior, como se describe en el presente documento, mitiga el problema de inhibicion de captura y hace posible el uso de concentraciones de plasma mucho mas altas. Especificamente, se pueden utilizar concentraciones de hasta, y que incluyen al menos un 40 % v/v de plasma o suero, en vez de la concentracion maxima del 10 % del procedimiento descrito anteriormente en Gold et al. (PLoS One (Dic. 2010) 5(12):e15005), o la concentracion maxima del 5 % en las ediciones mas recientes, de manera que aumenta la sensibilidad aproximadamente 4 a 8 veces, asi como, aumenta la robustez total del ensayo.
En referencia a la Figura 4, se puede ver que se puede observar un aumento lineal en la senal todo el tiempo hasta el 40 % v/v de plasma (comparese la linea marcada con (g), formato pre-inmovilizado, con la linea marcada con (s), formato convencional). Notese que una senal observada con un Espuriomero (un equivalente para la senal de fondo dependiente de proteina, en los dos paneles inferiores) se considera mayor en el formato convencional, sugiriendo que la pre-inmovilizacion puede reducir la senal de fondo dependiente de proteina.
Reduccion de la senal de fondo del ensayo y aumento de la sensibilidad del ensayo utilizando una sal caotropica para la elucion
Como se ilustra en la Figura 5, el uso de una sal caotropica para la elucion disminuye la senal de fondo y aumenta la sensibilidad del ensayo. En referencia a la Figura 5, se puede ver que la senal de fondo del ensayo en el tampon se reduce significativamente con la elucion en perclorato (comparese la curva inferior de la Figura 5A con la cura inferior de la Figura 5B). La senal de fondo del ensayo cayo hasta 20-40 RFU. Los niveles endogenos aparentes se reducen tambien de alguna manera para la IL-11 con la elucion en perclorato, indicando la disminucion de la senal de fondo dependiente de proteina (aproximadamente 0,2 pM frente a 1 pM).
La siguiente Tabla resume los resultados (RFU) de la comparacion de la elucion con CAPSO/NaCl y perclorato. Se muestran la mediana y la media de las senales para todos los SOMAmeros de cada grupo de dilucion (columna 2) en presencia de plasma (5 % v/v de plasma para un 5 % de SOMAmeros; 0,316 % v/v de plasma para 0,316 % de SOMAmeros, y 0,01 % de plasma para 0,01 % de SOMAmeros) en las filas 1-6; las medianas y medias de las senales para todos los SOMAmeros llamados Espuriomeros (SOMAmeros disenados en silicio que no tienen un analito equivalente) en presencia de un 5 % de plasma se muestran en las filas 8 y 9; y las senales medianas y medias de todos los SOMAmeros en todas las soluciones en presencia solo de tampon se muestran en la fila 10.
Tabla 1
dilucion CAPSO NaClO4
Mediana
5 % 850 400
Media
5 % 6500 6200
Mediana
0,316 % 8500 7300
Media
0,316 % 20000 22000
Mediana
0,01 % 27000 22000
Media
0,01 % 62000 63000
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Mediana
Espuriomero 280 85
Media
Espuriomero 350 150
Mediana
Tampon 75 20
Media
Tampon 95 28
Los resultados representados en la Figura 5 se reflejan en los resultados mostrados en la tabla. La elucion con perclorato genera comparativamente senales mas bajas en el tampon, senales de espuriomero significativamente reducidas en el plasma, y senales marginalmente reducidas en las mezclas del 0,01 % y 0,316 % donde las senales se originan sin ambiguedad de analitos equivalentes.
Los coeficientes de variacion (CV) en las senales del tampon de la elucion con perclorato se midieron en 8 repeticiones, razonando que las senales cercanas a la senal de fondo de la maquina se titulaban como ruidosas y por lo tanto se podia excluir de la realizacion de los llmites inferiores muy bajos (LLOQ) sugeridos por estas senales de fondo muy bajas. En este experimento, con una senal mediana de solo 32 RFU, el CV mediano bruto era del 6,2 % (Figura 6). La estabilidad de estas senales muy bajas probablemente no era un factor que limitara los LLOQ.
Comparacion de la realizacion del ensayo
Se hizo una comparacion formal entre la version mas reciente del metodo desvelado en Gold et al. (PLoS One (Dic. 2010) 5(12):e15005) (denominada “Ensayo Previo” en la Tabla 2) y la presente divulgacion (Version 3 en la Tabla 2). El alto grado de similitud entre los protocolos permitla un ensayo en el que se podlan ejecutar ambos protocolos de ensayo en una unica ejecucion robotica, de hecho sobre las mismas placas de filtro, con una intervencion manual minima. El ensayo incluia 8 muestras de plasma repetidas, para determinar la variabilidad, 8 pocillos de respuesta a la dosis de tampon, y 8 pocillos con vertido de plasma. Notese que la Version 3 utilizaba concentraciones de plasma mucho mas grandes que una version del ensayo anterior que se hacia con el ensayo previo (40, 1,3 y 0,044 % en oposicion a 5, 0,167, y 0,0056 %). Un resumen de los resultados en el espacio RFU y RFU normalizadas a la concentracion se muestran a continuation (Tabla 2).
Tabla 2
Ensayo previo Version 3 Cambio (veces)
Espuriomero y senal no humana (rfu)
756 (18, 120) 5 % plasma 202 (505) 40 % de plasma Menos de 3,7 veces (menos de 30 veces)
Alta abundancia (rfu) (rfu normalizada)
42,313 (7,61 x 108) 0,0056 % de plasma 50.741 (1,14 x 108) 0,044 % de plasma Hasta 1,2 veces (Menos de ~ 7 veces)
Abundancia media (rfu) (rfu normalizada)
22.375 (1,3 X 107) 22.812 (1,7 X 106) 1,3 % de plasma Aproximadamente igual (menos de ~ 7 veces)
Abundancia baja (rfu) (rfu normalizada)
1540 (30,800) 931 (2.327) 40 % de plasma Menos de 1,7 veces (menos de 13 veces)
Solo tampon (todos)
252 27 Por debaio de 9,3 veces
En referencia a la Tabla 2, se puede ver que las senales de fondo brutas disminuyen en la Version 3 aproximadamente 4 veces segun se determina por las senales del Espuriomero y los aptameros para dianas no humanas, mientras que las senales de analito brutas son aproximadamente las mismas, segun se mide por las senales de los analitos con abundancia media y alta. Notese que estos valores se obtuvieron con un 40 % de plasma en la Version 3, mientras que se utilizo un 5 % de plasma en una version anterior del ensayo. Si se normalizan las senales a un 100 % de plasma (valores entre parentesis), las senales de fondo caen significativamente (aproximadamente 30 veces) mientras que las senales con analito estan por debajo de aproximadamente 7 veces. Las senales solo con tampon caen cerca de un log. Notese que la reduccion en la senal de fondo tiene un coste -se necesitaban aproximadamente 15 pl de plasma en el ensayo previo, mientras que se necesitan aproximadamente 60 pl para la Version 3. Este consumo elevado de muestra tiene poca importancia probablemente para las muestras de animales grandes (por ejemplo, el ser humano), pero puede ser un factor para el analisis de muestras longitudinales para pequenos animales tales como los ratones. Las recuperaciones totales de vertido eran mucho mayores para la realizacion de la presente invention que se demuestra en la Version 3, que para la version del ensayo anterior, con medianas siendo del 80 % frente a justo el 25 % para la version del ensayo anterior, como se ilustra en la Figura 7. La mayoria de esta mejoria se puede atribuir a la inmovilizacion de los aptameros antes del equilibrado.
Las Figuras 8 y 9 representan dos ejemplos de una comparacion directa de las curvas de titulacion proteica en el tampon (paneles de la izquierda, curva inferior), las proteinas vertidas en el plasma (paneles de la izquierda, curva superior), titulacion de plasma (paneles medios) y niveles endogenos calculados (mapeado de la titulacion de
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plasma en las curvas de protelna de referenda, paneles de la derecha) para el ensayo previo (paneles superiores) y el metodo descrito en el presente documento (paneles inferiores). Notese que la protelna vertida en un 5 % de plasma para el ensayo previo y un 40 % de plasma para el metodo descrito en el presente documento. Una curva de comparacion tlpica muestra la respuesta a la dosis del tampon, vertido de plasma, y niveles endogenos medidos que se pueden ver en la Figura 8. Un ejemplo claro de recuperacion del vertido mejorado se puede ver en la Figura 9.
Ensayo de aptameros multiplexados mejorado
En una realizacion, se proporcionan aptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana y un primer marcador liberable. En algunas realizaciones los aptameros son fotoaptameros. En otra realizacion, se anade el primer marcador liberable en cualquier momento del ensayo antes de la particion de Captura-1 (como se define posteriormente en el parrafo [0082]). En una realizacion, este primer marcador liberable es una biotina fotoescindible. Se describen otros marcadores y restos escindibles y aptameros que contiene dichos marcadores y restos escindibles.
El aptamero que comprende el primer marcador liberable que tiene una afinidad especlfica por una molecula diana se inmoviliza en un soporte solido en solucion antes del equilibrado con la muestra de ensayo. La fijacion del aptamero al soporte solido se consigue poniendo en contacto un primer soporte solido con el aptamero y permitiendo que el primer marcador liberable incluido en el aptamero se asocia bien directa o indirectamente, con un primer agente de captura apropiado que esta unidos al primer soporte solido. Los lavados con una solucion tampon a un pH 11 retira los agregaos aptamero/aptamero, reduciendo de esta manera la senal de fondo del ensayo. Estas etapas comprenden la “Captura-0”.
Una muestra de ensayo se prepara entonces (como se describe en el Ejemplo) y se pone en contacto con los aptameros inmovilizados que tienen una afinidad especlfica por sus respectivas moleculas diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula(s) diana, se formara un complejo de afinidad aptamero-diana en la mezcla con la muestra de ensayo. Notese que ademas de los complejos de afinidad aptamero-diana, tambien se uniran aptameros que no forman complejos en el primer soporte solido. El complejo de afinidad aptamero-diana y el aptamero que no forma complejos que esta asociado al soporte solido se separa entonces del resto de la mezcla, retirando de esta manera la diana libre y todo el otro material que no forma complejos de la muestra de ensayo (matriz de muestra); es decir, los componentes de la mezcla que no se asocian con el primer soporte solido. Despues de la particion, el complejo de afinidad aptamero-diana, junto con cualquier aptamero que no ha forma do complejos, se libera del primer soporte solido utilizando un metodo apropiado para el primer marcador liberable en particular que se emplee.
En una realizacion, los complejos de afinidad aptamero-diana unidos al soporte solido se tratan entonces con un agente que introduce un segundo marcador para el componente de molecula diana de los complejos de afinidad aptamero-diana. En una realizacion, la diana es una protelna o un peptido, y la diana esta biotinilada tratandola con NSH-PEO4-biotina. El segundo marcador que se introduce en la molecula diana puede ser el mismo o diferente del marcador de captura del aptamero. Si el segundo marcador es el mismo que el primer marcador, o el marcador de captura del aptamero, los sitios de captura libres del primer soporte solido se pueden bloquear antes del inicio de esta etapa de marcado. En esta realizacion a modo de ejemplo, el primer soporte solido se lava con biotina libre antes del inicio del marcado de la diana. Los metodos de marcado, y en particular, el marcado de dianas tales como peptidos y protelnas se describen en la Patente de EE. UU. N° 7.855.054. En otras realizaciones, el marcado de la diana se lleva a cabo en cualquier otro punto del ensayo antes del inicio de la particion de la Captura-2.
La particion de la Captura-1 se completa liberando los aptameros y los complejos de afinidad aptamero-diana del primer soporte solido. En una realizacion, el primer marcador liberable es un resto fotoescindible que se escinde por radiacion con una lampara UV en condiciones que escinden > 90 % del primer marcador liberable. En otras realizaciones la liberacion se consigue por el metodo apropiado para el resto liberable seleccionado en el primer marcador liberable. Los complejos de afinidad aptamero-diana puede eluirse y recolectar para su uso posterior en el ensayo o se puede poner en contacto con otro soporte solido para llevar a cabo el resto de etapas del ensayo.
En una realizacion, la mezcla puede someterse opcionalmente a un desaflo cinetico. El desaflo cinetico ayuda a reducir la union no especlfica entre aptameros y moleculas no diana. En una realizacion, se anaden 10 mM de sulfato de dextrano a los complejos de afinidad aptamero-diana, y la mezcla se incuba durante aproximadamente 15 minutos. Otros competidores incluyen pero no se limitan acidos nucleicos competidores. En otra realizacion, el desaflo cinetico se inicia llevando a cabo la elucion de la Captura-1 en presencia de 10 mM de sulfato de dextrano. En otras realizaciones, el desaflo cinetico se lleva a cabo tras la etapa de union en equilibrio y antes de la particion de la Captura-2. En otras realizaciones, el desaflo cinetico se lleva a cabo por dilucion.
En una realizacion, la particion de la Captura-2 se lleva a cabo para retirar el aptamero libre. Como se ha descrito anteriormente, en una realizacion, se puede anadir un segundo marcador que se utiliza en la particion de la Captura- 2 a la diana mientras el complejo de afinidad aptamero-diana sigue en contacto con el soporte solido utilizado en la particion de la Captura-1. En otras realizaciones, se puede anadir el segundo marcador a la diana en otro punto del ensayo antes del inicio de la particion de la Captura-2. La mezcla se pone en contacto con un soporte solido, teniendo el soporte solido un elemento de captura (segundo) adherido a su superficie que es capaz de unirse al
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marcador de captura de la diana (segundo marcador), preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido son perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin C1) contenidas en un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura (segundo elemento de captura) es la estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de los componentes separados de la mezcla. Los complejos de afinidad aptamero-diana contenidos en la mezcla se unen de esta manera al soporte solido por medio de la interaccion de union del marcador de captura de la diana (segundo) y el segundo elemento de captura del segundo soporte solido. El complejo de afinidad aptamero-diana se separa entonces del resto del a mezcla, por ejemplo, lavando el soporte con soluciones tampon, incluyendo tampones que comprenden disolventes organicos que incluyen pero no se limitan al glicerol.
Los aptameros se eluyen entonces selectivamente de los complejos aptamero-diana con tampones que comprenden sales caotropicas de entre el grupo que incluye pero no se limita a perclorato sodico y cloruro de litio- Los aptameros retenidos en las perlas de Captura -2 mediante la interaccion aptamero/aptamero no se eluyen por este tratamiento.
En otra realizacion, el aptamero liberado en la particion de la Captura-2 es detectado y es cuantificado opcionalmente por cualquiera de los metodos de deteccion de acido nucleico adecuado, tales como por ejemplo, hibridacion con una micromatriz de ADN, Q-PCR, espectrometrla de masas, ensayo Invader, secuenciacion de proxima generation, y similares. Estos metodos de deteccion se describen con mayor detalle posteriormente.
En una realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica agrupada que representa un grupo de control. En otra realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica que se obtiene de un individuo, recolectada en un primer momento, y la muestra de ensayo se puede obtener del mismo individuo pero recolectada en un segundo momento, facilitando de esta manera un estudio longitudinal de un individuo midiendo y evaluando cualquier cambio en la cantidad o concentration de una o mas moleculas diana en muestras biologicas multiples proporcionadas por el individuo con el tiempo.
Se puede utilizar cualquier de los metodos descritos en el presente documento para llevar a cabo un ensayo de analito unico o un analisis multiplexado de una muestra de ensayo. Cualquiera de los analisis multiplexados puede incluir el uso de dos, decenas, cientos o miles de aptameros para ensayar simultaneamente un numero igual de moleculas diana en una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica, por ejemplo. En estas realizaciones, se introduce una pluralidad de aptameros, cada uno de los cuales reconocen y opcionalmente se entrecruza con un analito diferente, en la muestra de ensayo y se lleva a cabo cualquiera de los ensayos que se han descrito anteriormente. Tras la liberation de los aptameros, se puede emplear cualquiera de los metodos de deteccion de acido nucleico multiplexado para medir los diferentes aptameros que se han liberado. En una realizacion, esto se puede conseguir por hibridacion con sondas complementarias que se disponen separadamente en una superficie solida. En otra realizacion, cada uno de los diferentes aptameros se puede detectar basandose en el peso molecular utilizando espectrometrla de masas. En otra realizacion mas, cada uno de los diferentes aptameros se puede detectar basandose en la movilidad electroforetica, tal como, por ejemplo, en electroforesis capilar, en un gel o por cromatografla llquida. En otra realizacion, se pueden utilizar sondas PCR unicas para cuantificar cada uno de los aptameros diferentes utilizando Q-PCR.
En cada uno de los ensayos que se desvelan en el presente documento, se puede utilizar un desaflo cinetico para aumentar la especificidad del ensayo y para reducir la union no especlfica. En una realizacion, que se puede emplear opcionalmente en cada uno de los ensayos descritos en el presente documento, se puede conseguir una reduction adicional de la union no especlfica por pre-incubacion de un competidor con la muestra de ensayo o por adicion de un competidor a la mezcla durante la union en equilibrio. En una realizacion se pre-incuban 4 mM de un oligonucleotido competidor Z-block (5'-(ACZZ)zAC-3', donde Z = 5-bencil-dUTP) durante aproximadamente 5 minutos con la mezcla de ensayo.
Kits
Otro aspecto de la presente divulgation se refiere a kits utiles para llevar a cabo convenientemente cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento para analizar las muestras de ensayo. Para aumentar la versatilidad de los metodos desvelados, se pueden proporcionar reactivos en una combination envasada, en el mismo envase o por separado, de manera que la relation de los reactivos proporcione una optimization sustancial del metodo y el ensayo. Los reactivos pueden estar en envases separados o distintos reactivos pueden combinarse en uno o mas envases dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos.
Un kit comprende, en una combinacion envasada, al menos un aptamero marcado y uno o mas soportes solidos, cada uno incluyendo al menos un agente de captura. El kit puede incluir tambien soluciones de lavado tales como un medio tampon acuoso para la dilution de la muestra as! como lavado de matriz, reactivos de preparation de muestras, y demas. El kit puede contener ademas reactivos utiles para introducir un segundo marcador, generalmente por medio de la modificacion o derivacion de la diana. Ademas, el kit puede contener reactivos adecuados para llevar a cabo el desaflo cinetico deseado durante el metodo analltico. Las cantidades relativas de los distintos reactivos en los kits pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones de reactivos que optimizan sustancialmente las reacciones que es necesario que se produzcan durante el ensayo y ademas para
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optimizar sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En circunstancias apropiadas, se pueden proporcionar uno o mas de los reactivos como un polvo seco, habitualmente liofilizado, que incluyen excipientes, que al disolverse proporcionaran la solucion de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para llevar a cabo un metodo o ensayo de acuerdo con la presente divulgacion. El kit puede incluir ademas una descripcion por escrito de un metodo de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.
En una realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene una afinidad especifica por una molecula diana y que comprende un marcador; y un soporte solido en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto en el, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse con el marcador del aptamero.
En otra realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene una afinidad especifica para una molecula diana y que comprende un marcador y una marca; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto en el, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse con el marcador del aptamero.
En otra realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene una afinidad especifica para una molecula diana y que comprende un marcador liberable y una marca; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto en el, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse con el marcador del aptamero.
Ademas, cualquiera de los kits descritos anteriormente puede contener reactivos y materiales para llevar a cabo un desafio cinetico durante el metodo de deteccion del kit.
Como se utiliza en el presente documento “Captura-1” se refiere a la particion de un complejo de afinidad aptamero- diana o complejo covalente aptamero-diana. El objetivo de la Captura-1 es retirar sustancialmente todos los componentes de la muestra de ensayo que no se asocia con el aptamero. Retirando la mayoria de dichos componentes se mejorara en general la eficacia de marcado de la diana retirando las moleculas no dianas de la etapa de marcado de la diana utilizada para la captura de Captura-2 y puede dar lugar a una senal de fondo menor en el ensayo. En una realizacion, se une un marcador al aptamero bien antes del ensayo, durante la preparacion del ensayo, o durante el ensayo adjuntando el marcador al aptamero. En na realizacion, el marcador es un marcador liberable. En una realizacion el marcador liberable comprende un enlazador escindible y un marcador. Come se ha descrito anteriormente, el aptamero marcado se puede capturar en un soporte solido en el que el soporte solido comprende un elemento de captura apropiado para el marcador. El soporte solido se puede lavar entonces como se ha descrito en el presente documento antes del equilibrado con la muestra de ensayo para retirar cualquier material no deseado (Captura-0).
Como se utiliza en el presente documento “Captura-2” se refiere a la particion de un complejo de afinidad aptamero- diana o complejo covalente aptamero-diana basandose en la captura de la molecula diana. El objetivo de la etapa de Captura-2 es retirar, el aptamero libre, o que no forma complejos de la muestra de ensayo antes de la deteccion y cuantificacion opcional. Retirar el aptamero libre de la muestra permite la deteccion de los complejos de afinidad aptamero-diana o covalente aptamero-diana por cualquier tecnica de deteccion de acido nucleico adecuada. Cuando se utiliza la Q-PCR para la deteccion y cuantificacion adicional, la retirada del aptamero libre es necesaria para la deteccion y cuantificacion exacta de la molecula diana.
En una realizacion, la molecula diana es una proteina o peptido y el aptamero libre se separa del complejo de afinidad (o covalente) aptamero-diana ( y el resto de la muestra de ensayo) utilizando reactivos que se pueden incorporar en las proteinas (y peptidos) y los complejos que incluyen proteinas (o peptidos), tales como, por ejemplo, un complejo de afinidad (o covalente) aptamero-diana. La proteina (o peptido) marcada y el complejo de afinidad (o covalente) aptamero-diana se pueden inmovilizar en un soporte solido, haciendo posible la particion de la proteina (o peptido) y el complejo de afinidad (o covalente) aptamero-diana del aptamero libre. Dicho marcado puede incluir, por ejemplo, un resto de biotina que se puede incorporar a la proteina o peptido.
En una realizacion, se fija un marcador de Captura-2 a la proteina (o peptido) o bien antes del ensayo, durante la preparacion del ensayo, o durante el ensayo por union quimica del marcador a las dianas. En una realizacion el marcador de Captura-2 es un marcador liberable. En una realizacion, el marcador liberable comprende un enlazador escindible y un marcador. En general no es necesario sin embargo, liberar la proteina (o peptido) del soporte solido de la Captura-2. Como se describe anteriormente, las dianas marcadas se pueden capturar en un segundo soporte solido en el que el soporte solido comprende un elemento de captura apropiado para el marcador de la diana. El soporte solido se lava entonces con distintas soluciones tampon que incluyen soluciones tampon que comprenden disolventes organicos y soluciones tampon que comprenden sales y/o detergentes que contienen sales y/o detergentes.
Tras el lavado del segundo soporte solido, los complejos de afinidad aptamero-diana se someten entonces a una
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etapa de disociacion en la que los complejos se destruyen para dar lugar a aptameros libres mientras que las moleculas diana en general se mantienen unidas al soporte solido por medio de la interaccion de union del elemento de captura y el marcador de captura de la diana. El aptamero se puede liberar del complejo de afinidad aptamero- diana por cualquier metodo que rompa la estructura del aptamero o la diana. Esto se puede conseguir por medio del lavado del soporte unido a los complejos de afinidad aptamero-diana en tampones altos en sales que disocian los complejos aptamero-diana unidos no covalentemente. Los aptameros libres eluldos se recolectan y es detectadon. En otra realizacion, se utiliza un pH alto o bajo para destruir los complejos de afinidad aptamero-diana. En otra realizacion se utilizan altas temperaturas para disociar los complejos de afinidad aptamero-diana. En otra realizacion, se puede utilizar una combinacion de cualquiera de los metodos anteriores. En otra realizacion, se utiliza la digestion proteolltica del resto proteico del complejo de afinidad aptamero-diana para liberar el componente aptamero.
En el caso de los complejos covalentes aptamero-diana, la liberation del aptamero para la cuantificacion posterior se consigue utilizando un enlazador escindible en la construction de aptamero. En otra realizacion, un enlazador escindible en el marcador de la diana dara como resultado la liberacion del complejo covalente aptamero-diana.
Como se utiliza en el presente documento, una “molecula competidora” y “competidor” se utilizan de manera intercambiable para referirse a cualquier molecula que puede formar un complejo no especlfico con una molecula no diana, por ejemplo, para evitar que vuelva a unir la molecula no diana no especlficamente a un aptamero. Las “moleculas competidoras” o “competidores” se refieren a mas de uno de dichos grupos de moleculas. Las moleculas competidores incluyen oligonucleotidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmon de cadena sencilla, y polidextrano (por ejemplo, sulfato de dextrano)), pollmeros de fosfodiester abasico, dNTP, y pirofosfato. En el caso de un desaflo cinetico que utilice un competidor, el competidor puede ser tambien una molecula que puede formar un complejo no especlfico con un aptamero libre o una protelna, por ejemplo, para evitar que el aptamero o protelna se vuelva a unir no especlficamente a una molecula no diana. Dichas moleculas competidores incluyen policationes (por ejemplo, espermina, espermidina, polilisina, y poliarginina) y aminoacidos (por ejemplo, arginina y lisina). Cuando se utiliza un competidor como desaflo cinetico se utiliza una concentration bastante alta con respecto a la concentration anticipada de protelna total o aptamero total presente en la muestra. En una realizacion se utiliza aproximadamente 10 mM de sulfato de dextrano como competidor en un desaflo cinetico. En una realizacion, el desaflo cinetico comprende la adicion de un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana, e incubando la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana durante un tiempo mayor o igual a aproximadamente 30 segundos, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 3 minutos, aproximadamente 4 minutos, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, y aproximadamente 60 minutos. En otra realizacion el desaflo cinetico comprende la adicion de un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana y la incubation de la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana durante un tiempo de manera que la relation del nivel medido de complejo de afinidad aptamero-diana con respecto al nivel medido del complejo no especlfico esta aumentada.
En algunas realizaciones, el desaflo cinetico se lleva a cabo diluyendo la muestra de ensayo con tampon de union o cualquier otra solution que no aumenta significativamente la tasa natural de disociacion de los complejos de afinidad aptamero-diana. La dilution puede ser aproximadamente de 2x, aproximadamente de 2x, aproximadamente de 4x, o aproximadamente de 5x o cualquier dilucion mayor. Las diluciones mayores proporcionan un desaflo cinetico mas eficaz reduciendo la concentracion de la protelna total y el aptamero tras la dilucion y, por lo tanto, la tasa de su re- asociacion. Si la dilucion se utiliza para introducir un desaflo cinetico, , la mezcla de muestra de ensayo posterior que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana se puede concentrar antes de posteriores procesamientos. Si es aplicable, esta concentracion se puede conseguir utilizando metodos descritos en el presente documento con respecto a la partition opcional de cualquier aptamero libre de la muestra de ensayo y/o la retirada opcional de otros componentes de la muestra de ensayo que puedan reaccionar con el agente marcado. Cuando se utiliza la dilucion como desaflo cinetico. la cantidad de dilucion se selecciona para ser lo suficientemente alta para ser practica, en vista de el volumen inicial de la muestra de ensayo y el deseo de recuperation del complejo de afinidad aptamero- diana del volumen final (diluido) sin incurrir en una perdida significativa del complejo. En una realizacion, el complejo de afinidad aptamero-diana se diluye y la mezcla se incuba durante un tiempo > aproximadamente 30 segundos, > aproximadamente 1 minuto, > aproximadamente 2 minutos, > aproximadamente 3 minutos, > aproximadamente 4 minutos, > aproximadamente 5 minutos, > aproximadamente 10 minutos, > aproximadamente 30 minutos, y > aproximadamente 60 minutos. En otra realizacion, el complejo de afinidad aptamero-diana se diluye y las mezclas que contienen el complejo de afinidad aptamero-diana se incuba por un tiempo de manera que la relacion del nivel medido de complejo de afinidad aptamero-diana respecto al nivel medido de complejo no especlfico esta aumentado.
En algunas realizaciones, se lleva a cabo el desaflo cinetico de tal manera que el efecto de la dilucion de la muestra y el efecto de un competidor se realizan simultaneamente. Por ejemplo, se puede diluir una muestra de ensayo con un gran volumen de competidor. Combinando estas dos estrategias de desaflo cinetico se puede proporcionar un desaflo cinetico mas eficaz que el que se puede obtener utilizando una estrategia. En una realizacion, la dilucion puede ser aproximadamente 2x, aproximadamente 3x, aproximadamente 4x, aproximadamente 5x, o cualquier dilucion mayor adecuada y el competidor es sulfato de dextrano aproximadamente 10 mM. En una realizacion, el desaflo cinetico comprende la dilucion de la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana, anadiendo
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un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana, e incubado la mezcla que contienen el complejo de afinidad aptamero-diana durante un tiempo mayor o igual a 30 segundo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 4 minutos, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, y aproximadamente 60 minutos. En otra realizacion, el desaflo cinetico comprende diluir la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana. anadiendo un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana e incubando la mezcla que contiene el complejo de afinidad aptamero-diana durante un tiempo tal que la relacion del nivel medido de complejo de afinidad aptamero- diana con respecto al nivel medido del complejo no especlfico esta aumentado.
Como se desvela en el presente documento, un aptamero puede comprender adicionalmente un “marcador”, lo que se refiere a un componente que proporciona un medio para unir o inmovilizar un aptamero (y cualquier molecula diana a la que esta unido) a un soporte solido. Un “marcador” es un resto que es capaz de asociarse con un “elemento de captura”. Los “marcadores” o “elementos de captura” se refieren a mas de uno de dichos grupos de componentes. El marcador se puede unir o incluirse en el aptamero por cualquier metodo adecuado. En general, el marcador permite que el aptamero se asocia, directa o indirectamente con un elemento de captura o receptor que esta anclado al soporte solido. El elemento de captura se elige normalmente (o se disena) para que sea altamente especlfico para esta interaccion con el marcador y para mantener esa asociacion durante las siguientes etapas de procesamiento o procedimientos. Un marcador puede facilitar la localizacion de un complejo de afinidad aptamero- diana (o complejo de afinidad covalente aptamero-diana) en una direccion definida espacialmente del soporte solido. Por lo tanto, diferentes marcadores, pueden facilitar la localizacion de diferentes complejos covalentes aptamero- diana en diferentes direcciones definidas espacialmente de un soporte. Un marcador puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico cerrado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un llpido, biotina, polihistidina, o cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinacion de los anteriores, o cualquier otra estructura con la cual se puede disenar o configurar un elemento de captura (o molecula enlazadora, como se describe posteriormente) para que se una o se asocie de otra manera con especificidad. En general, un marcador se configura de manera que no interactue intramolecularmente con si mismo o con el aptamero al que esta unido o del que es parte. Si se utiliza SELEX para identificar un aptamero, el marcador se puede anadir al aptamero pre- o post- SELEX. En una realizacion, el marcador se incluye en el extremo 5' del aptamero post-SELEX. En otra realizacion, el marcador esta incluido en el extremo 3' del aptamero post-SELEX. En otra realizacion mas, los marcadores se pueden incluir tanto en el extremo 3' como 50 de los aptameros en un proceso de modificacion post-SELEX. En otra realizacion, el marcador puede ser un segmento interno del aptamero.
En una realizacion, el marcador es un grupo biotina y el elemento de captura es una protelna de union a la biotina, tal como la avidina, estreptavidina, neutravidina, extravidina o traptavidina. Esta combinacion se puede utilizar convenientemente en distintas realizaciones, ya que la biotina se incorpora facilmente en los aptameros durante la slntesis y las perlas de estreptavidina estan disponibles facilmente.
En una realizacion el marcador es polihistidina y el elemento de captura es acido nitriloacetico (NTA) quelado con un ion metalico tal como nlquel, cobalto, hierro, o cualquier otro ion metalico capaz de formar un compuesto de coordinacion con poli-histidina cuando se quela con NTA.
En una realizacion, el marcador es un polinucleotido que se disena para hibridarse directamente con un elemento de captura que contienen una secuencia de polinucleotido complementaria. En este caso, se hace referencia al marcador a veces como “secuencia marcadora” y se hace referencia al elemento de captura como “sonda”. En esta realizacion, el marcador se configura en general y la reaccion de hibridacion se llevo a cabo en condiciones tales que el marcador no se hibrida con una sonda distinta de la sonda que es perfectamente complementaria al marcador. Esto permite el diseno de un formato de ensayo multiple ya que cada combinacion marcador/sonda puede tener secuencias unicas.
En algunas realizaciones, el marcador comprende nucleotidos que son una parte del propio aptamero. Por ejemplo, si se utiliza SELEX para identificar el aptamero, el aptamero generalmente incluye un extremo 5' fijo separado de un extremo 3' fijado por una secuencia de nucleotidos que varla dependiendo del aptamero, es decir, una region variable. En una realizacion, el marcador puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos en un extremo fijo del aptamero, tal como, por ejemplo, el extremo fijo completo o cualquier parte de un extremo fijo, que incluye nucleotidos que son internos al extremo fijado. En otra realizacion, el marcador puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos en la region variable del aptamero, tal como por ejemplo, la region variable completa o cualquier parte de la region variable. En una realizacion adicional, el marcador puede comprender cualquier numero de nucleotidos adecuado que se solapan con la region variable y uno de los extremos fijados, es decir, el marcador puede comprender una secuencia de nucleotidos que incluye cualquier parte (incluyendo todas) de la region variable y cualquier parte (incluyendo todas) de un extremo fijado.
En otra realizacion, un marcador se puede asociar directamente con una sonda y se une covalentemente a la sonda, ligando de esta manera covalentemente el aptamero a la superficie del soporte solido. En esta realizacion, el marcador y la sonda puede incluir grupos reactivos adecuados que, al asociarse el marcador con la sonda, son lo suficientemente proximos entre ellos para someterse a una reaccion qulmica que produce un enlace covalente. La
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reaccion puede producirse espontaneamente o puede necesitar una activacion, tal como, por ejemplo, foto- activacion o activacion quimica. En una realizacion, el marcador incluye un resto dieno y la sonda incluye un dienofilo, y da como resultado un enlace covalente a partir de una reaccion de conjugacion espontanea de Diels- Alder del dieno y el dienofilo. Se puede utilizar cualquier quimica complementaria adecuada, tal como, por ejemplo, la reaccion N-Mannich, formacion de disulfuro, reaccion de Curtius, condensation de Aldol, formation de base de Schiff y adicion de Michael.
En otra realizacion, el marcador se asocia indirectamente con una sonda, tal como, por ejemplo, por medio de una molecula enlazadora, como se describe adicionalmente posteriormente. En esta realizacion, el marcador puede incluir una secuencia de polinucleotido que es complementaria a una region o componente particular de una molecula enlazadora. El marcador se configura en general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de manera que el marcador no se hibrida con una secuencia de polinucleotido distinta de la secuencia de polinucleotido incluida en la molecula enlazadora.
Si el marcador incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, un marcador incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, el marcador incluye desde aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, el marcador incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Los diferentes marcadores que incluyen un polinucleotido pueden incluir o el mismo numero de nucleotidos o un numero diferente de nucleotidos.
En algunas realizaciones, el componente marcador es bi-funcional ya que incluye la funcionalidad para la interaction especifica con un elemento de captura en un soporte solido o “sonda” como se define posteriormente (componente de asociacion de la sonda), y funcionalidad para disociar la molecula a la que se une a partir del componente de asociacion de la sonda del marcador. El medio para disociar el componente de asociacion de la sondad del marcador incluye medios quimicos, medios fotoquimicos u otros medios que dependen del marcador particular que se emplee.
Como se utiliza en el presente documento, “elemento de captura”, “sonda” o “receptor” se refiere a una molecula que se configura para asociarse, o directa o indirectamente, con un marcador. Un “elemento de captura”, “sonda” o “receptor” es un grupo de copias de un tipo de molecula o un tipo de estructura multimolecular que es capaz de inmovilizar el resto que une el marcador a un soporte solido asociandose, bien directa o indirectamente, con el marcador. “Elementos de captura”, “sondas” o “receptores” se refieren a mas de uno de dichos grupos de moleculas. Un elemento de captura, sonda o receptor puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptidico, un acido nucleico cerrado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un lipido, biotina, polihistidina, o cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores, o cualquier otra estructura con la que se puede disenar o configurar un marcador (o molecula enlazadora) para unirse o asociarse de otra manera con especificidad. Un elemento de captura, sonda o receptor se puede unir a un soporte solido bien covalente o no covalentemente por cualquier metodo adecuado.
Aunque las expresiones “elemento de captura”, “sonda” y “receptor” se utilizan de manera intercambiable, sonda en general se refiere a una secuencia de polinucleotido. En una realizacion, la sonda incluye un polinucleotido que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia polinucleotidica marcadora. En esta realizacion, la secuencia de la sonda se configura en general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones en las que la sonda no se hibrida con una secuencia de nucleotidos distinta que la del marcador para la que la sonda incluye la secuencia complementaria (es decir, la sonda se configura en general y la hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibrida con un marcador o aptamero diferente).
En otra realizacion, la sonda se asocia indirectamente con un marcador, por ejemplo, por medio de una molecula enlazadora. En esta realizacion, la sonda puede incluir una secuencia de polinucleotido que es complementaria de una region o componente particular de una molecula enlazadora. La sonda se configura en general y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de tal manera que la sonda no se hibrida con una secuencia de polinucleotido distinta de la secuencia de polinucleotido incluida en la molecula enlazadora.
Si una sonda incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero de nucleotidos adecuado. En una realizacion, una sonda incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, una sonda incluye aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. n otra realizacion mas, una sonda incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Diferentes sondas que incluyen un polinucleotido puede incluir o el mismo numero o un numero diferente de nucleotidos.
En algunas realizaciones, la sonda de captura es bi-funcional en cuanto a que incluye funcionalidad para interaccion especifica con un marcador polinucleotidico, y funcionalidad para disociar la sonda del soporte solido de manera que la sonda y el aptamero se liberan simultaneamente. El medio para disociar la sonda del soporte solido incluye medios, quimicos, medios fotoquimicos u otros medios que dependen de la sonda de captura particular que se emplee.
Debido a la naturaleza reciproca de la interaccion entre una pareja particular de marcador y elemento de captura, un
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marcador de una realizacion se puede utilizar como elemento de captura en otra realizacion, y un elemento de captura en una realizacion se puede utilizar como marcador en otra realizacion. Por ejemplo, un aptamero con un marcador biotina se puede capturar con estreptavidina fijada a un soporte solido en una realizacion, mientras que un aptamero con un marcador estreptavidina puede capturarse con biotina fijada en un soporte solido en otra realizacion.
Como se utiliza en el presente documento, un enlazador es una estructura molecular que se utiliza para conectar dos grupos funcionales o estructuras moleculares. Como se utiliza en el presente documento, “enlazador espaciador” o mas simplemente “espaciador” se refiere a un grupo de atomos benignos que proporcionan una separacion o espaciado entre dos grupos funcionales diferentes en un aptamero. Como se utiliza en el presente documento, un elemento “liberable” o “escindible”, resto, o enlazador se refiere a una estructura molecular que se puede romper para producir dos componentes separados. Un elemento liberable (o escindible) puede comprender una unica molecula en la que se puede romper un enlace qulmico (al que se hace referencia en el presente documento como “enlazador escindible en llnea”), o puede comprender dos o mas moleculas en las que se puede romper o destruir la interaccion no covalente (al que se hace referencia en el presente documento como “enlazador de hibridacion”).
En algunas realizaciones, es necesario separar espacialmente ciertos grupos funcionales de otros con el fin de evitar la interferencia con las funcionalidades individuales. Por ejemplo, la presencia de un marcador, que absorba ciertas longitudes de onda de luz, proximo a un grupo fotoescindible puede interferir con la eficacia de fotoescision. Por lo tanto es deseable separar dichos grupos con un resto que no interfiera que proporcione una separacion espacial suficiente para recuperar la actividad completa de fotoescision, por ejemplo. En algunas realizaciones, un “enlazador espaciador” se ha introducido en un aptamero con ambas funcionalidades de marcador y fotoescision.
En una realizacion, se introducen enlazadores espaciadores en el aptamero durante la slntesis y as! puede estar comprendido por varios espaciadores fosforamidita, incluyendo pero no limitandose a cadenas de carbono alifaticas de longitudes de 3, 6, 9, 12 y 18 atomos de carbono, cadenas de polietilenglicoles de longitudes de 1, 3, y 9 unidades de etilenglicol, o un resto tetrahidrofurano (denominado dSpacer (Glenn Research) o cualquier combinacion de los anteriores o cualquier otra estructura o componente qulmico que se puede disenar o configurar para anadir una longitud a lo largo de una matriz fosfodiester. En otra realizacion, el enlazador espaciador incluye polinucleotidos, tales como poli dT, dA, dG, o dC o poli U, A, G, o C o cualquier combinacion de los anteriores. En otra realizacion, los espaciadores incluyen uno o mas restos abasicos de ribosa o desoxirribosa. Notese que dichas secuencias se disenan de manera que no interfieran con la estructura o funcion del aptamero.
Como se utiliza en el presente documento, un “enlazador de hibridacion” se refiere a un enlazador que comprende dos o mas moleculas en las que una interaccion no covalente se puede romper o alterar por medio de metodos qulmicos o flsicos. En algunas realizaciones, se utiliza un enlazador de hibridacion para unir un aptamero a un marcador, formando de esta manera un marcador liberable. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador de hibridacion en cualquiera de los ensayos descritos para crear una conexion liberable entre un aptamero y una biotina (por ejemplo, en los ensayos de afinidad y ensayos de entrecruzamiento) o una conexion liberable entre un aptamero y un grupo de fotoentrecruzamiento (por ejemplo, en ensayos de entrecruzamiento).
En una realizacion, un enlazador de hibridacion comprende dos acidos nucleicos que se hibridan para formar un enlace no covalente. En una realizacion, uno de los acidos nucleicos que forman el enlace de hibridacion puede ser una region del propio aptamero y el otro acido nucleico puede ser un acido nucleico que es complementario a esa region. La liberacion se puede conseguir por cualquier mecanismo adecuado para alterar los duplex de acido nucleico (mientras que mantiene la compatibilidad con el ensayo). En una realizacion, se utilizan 20 mM de NaOH para alterar el enlazador de hibridacion en el ensayo de captura de fotoentrecruzamiento doble. Una molecula de enlazador de hibridacion puede tener cualquier configuracion adecuada y puede incluir cualquier componente adecuado, que incluye uno o mas polinucleotidos, polipeptidos, acidos nucleicos peptldicos, acidos nucleicos cerrados, oligosacaridos, polisacaridos, anticuerpos, aficuerpos, mimeticos de anticuerpos o fragmentos, receptores, ligandos, llpidos, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinacion de los anteriores o cualquier otra estructura o componente qulmico que se pueda disenar o configurar para formar una estructura liberable.
En una realizacion, el marcador liberable consiste en al menos un polinucleotido que consiste en un numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye desde aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, un componente de polinucleotido de una molecula enlazadora incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Las moleculas enlazadores que se utilizan en cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento pueden incluir componentes polinucleotldicos que tienen o el mismo numero de nucleotidos o un numero diferente de nucleotidos.
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Un “soporte solido” se refiere a cualquier sustrato que tiene una superficie en el que se pueden fijar moleculas, directa o indirectamente, por medio de enlaces covalentes o no covalentes. El soporte solido puede incluir cualquier material de sustrato que sea capaz de proporcionar un soporte flsico para la captura de elementos o sondas que se unen a la superficie. El material es capaz en general de soportar condiciones relacionadas con la fijacion de los elementos de captura o sondas a la superficie y cualquier tratamiento, manipulacion o procesamiento posterior que se encuentra en la realizacion de un ensayo. Los materiales pueden ser de origen natural, sintetico, o una modificacion de material de origen natural. Los materiales del soporte solido adecuados pueden incluir silicio, un chip de placa de silicio, grafito, superficies especulares, laminados, membranas, ceramicas, plasticos (incluyendo pollmeros tales como, por ejemplo poli(cloruro de vinilo), copollmeros de ciclo-olefina, geles o perlas de agarosa, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), poli-tetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nailon, poli(butirato de vinilo)), germanio, arsenuro de galio, oro, plata, pellculas de Langmuir Blodgett, un chip de flujo, etc., que se utilizan por si mismos o en conjuncion con otros materiales. Se pueden considerar materiales rlgidos adicionales, tales como cristal, que incluya el silicio e incluye ademas, por ejemplo, cristal que esta disponible como Biocristal. Otros materiales que se pueden emplear incluyen materiales porosos, tales como, por ejemplo, perlas de cristal de poro controlado, Sepharose® reticulada o resinas de agarosa en perlas, o copollmeros de bis-acrilamida y azalactona reticulada. Otras perlas incluyen nanopartlculas, perlas de pollmero, perlas de nucleo solido, perlas paramagneticas o microperlas. Se contemplan tambien, cualquier otro material que se conocen en la tecnica que son capaces de tener uno o mas grupos funcionales, tales como cualquiera de los grupos amino, carboxilo, tiol o hidroxilo funcionales, por ejemplo, que se incorporan en su superficie.
El material que se utiliza para un soporte solido se puede tomar de cualquier variedad de configuraciones que varlan desde simple a compleja. El soporte solido puede tener cualquier tipo de forma, incluyendo una tira, placa, disco, barra, partlcula, perla, tubo, pocillo (de microtitulacion), y similares. El soporte solido puede ser poroso o no poroso, magnetico, paramagnetico o no magnetico, polidisperso o monodisperso, hidrofilo o hidrofobo. El soporte solido puede estar tambien en forma de un gel o pasta de partlculas empaquetadas estrechamente (como en una matriz de columna) o mas separadas.
En una realizacion, el soporte solido con un elemento de captura fijado se utiliza para capturar los complejos de afinidad de aptamero marcado-diana o complejos covalentes de aptamero-diana de una mezcla de ensayo. En un ejemplo particular, cuando el marcador es un resto de biotina, el soporte solido puede ser una perla o resina revestida de estreptavidina, tales como Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynabeads MyOne Streptavidin, Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen), Resina Agarosa Estreptavidina (Pierce), Resina Ultralink Streptavidin, perlas MagnaBind Streptavidin (ThermoFisher Scientific), BioMag Streptavidin, ProMag Streptavidin, Silica Streptavidin (Bangs Laboratories), Sepharose Streptavidin de altas prestaciones (GE Healthcare), Microsferas de Poliestireno Estreptavidina (Microsferas-Nanosferas), Partlculas de poliestireno revestidas de estreptavidina (Spherotech), o cualquier otra perla o resina revestida de estreptavidina que utiliza habitualmente un experto en la tecnica para capturar moleculas marcadas con biotina.
Como se ha descrito anteriormente, un objetivo de la presente invencion es convertir una serial proteica en una serial de aptamero. Como resultado, la cantidad de aptameros recolectados/detectados es indicativa de, y puede ser directamente proporcional a, la cantidad de moleculas diana unidas a la cantidad de moleculas diana de una muestra. Se pueden emplear varios esquemas de detection sin eluir el complejo de afinidad aptamero-diana o covalente aptamero-diana, del segundo soporte solido tras la partition en la Captura-2. Ademas de las siguientes realizaciones de metodos de deteccion, seran conocidos otros metodos de deteccion por un experto en la tecnica.
Muchos metodos de deteccion necesitan que un marcador explicito se incorpore en el aptamero antes de la deteccion. En estas realizaciones, pueden incorporarse marcadores, tales como colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes en los aptameros durante o tras la slntesis utilizando tecnicas convencionales para la slntesis de acidos nucleicos. Se pueden incorporar marcadores radioactivos o durante la slntesis o tras la slntesis utilizando reacciones enzimaticas convencionales con los reactivos apropiados. El marcado puede producirse tambien tras la particion y elucion en la Captura -2 utilizando tecnicas enzimaticas adecuadas. Por ejemplo, utilizando un cebador con los marcadores mencionados anteriormente, la PCR incorporara marcadores en el producto de amplification de los aptameros eluldos. Cuando se utiliza una tecnica en gel para la cuantificacion, se pueden incorporar marcadores de diferente tamano de masa utilizando tambien PCR. Estos marcadores de masa pueden incorporar tambien diferentes colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes para una capacidad de multiplexado adicional. Los marcadores se pueden anadir indirectamente a los aptameros utilizando un marcador especlfico incorporado en el aptamero, sea durante la slntesis o tras la slntesis, y entonces se anade una sonda que se asocia con el marcador y alberga el marcador. Los marcadores incluyen los que se han descrito anteriormente as! como enzimas que se utilizan en ensayos convencionales para lecturas colorimetricas, por ejemplo, Estas enzimas funcionan en combination con sustratos enzimaticos e incluyen enzimas tales como, por ejemplo, peroxidasa de rabano rusticano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Los marcadores pueden incluir tambien materiales o compuestos que son grupos funcionales electroqulmicos para la deteccion electroqulmica.
Por ejemplo, el aptamero puede marcarse, como se ha descrito anteriormente, con un isotopo radioactivo tal como 31P antes de poner en contacto la muestra de ensayo. Empleando cualquiera de los cuatro ensayos basicos, y
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variaciones de los mismos como se expuesto anteriormente, la deteccion de aptameros se puede conseguir simplemente por cuantificacion de la radioactividad en el segundo soporte solido al final del ensayo. Los recuentos de radiactividad seran directamente proporcionales a la cantidad de diana en la muestra de ensayo original. De manera similar, el marcado de un aptamero con un colorante fluorescente, como se ha descrito anteriormente, antes de poner en contacto con la muestra de ensayo permite una lectura de fluorescencia simple directamente en el segundo soporte solido. Un marcador quimioluminiscente o un punto cuantico se puede emplear de manera similar para la lectura directa en el segundo soporte solido, sin la necesidad de la elucion del aptamero.
Eluyendo el aptamero o liberando el complejo covalente fotoaptamero-diana del segundo soporte solido se pueden emplear esquemas de deteccion adicionales ademas de los que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, el aptamero, fotoaptamero o complejo covalente fotoaptamero-diana liberados se pueden procesar en un gel PAGE y detectarse y opcionalmente cuantificarse con una tincion de acido nucleico, tal como Oro SYBR. De manera alternativa, el aptamero, fotoaptamero o complejo covalente de fotoaptamero liberados se pueden detectar y cuantificar utilizando electroforesis en gel capilar (CGE) utilizando un marcador fluorescente incorporado en el aptamero como se describe anteriormente. Otro esquema de deteccion emplea PCR cuantitativa para detectar y cuantificar el aptamero eluldo utilizando verde SYBR, por ejemplo. De manea alternativa se puede emplear un ensayo de ADN Invader® para detectar y cuantificar el aptamero eluldo. Otro esquema de deteccion alternativo emplea secuenciacion de proxima generacion.
En otra realizacion, la cantidad o concentracion del complejo de afinidad aptamero-diana (o complejo covalente aptamero-diana) se determina utilizando una “baliza molecular” durante un procedimiento de replicacion (vease, por ejemplo, Tyagi et al., Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; U.S. Pat. No. 5.925.517). Una baliza molecular es una sonda de acido nucleico especlfica que se pliega en un bucle horquillado y contiene un fluoroforo en un extremo y un interruptor en el otro extremo de la estructura horquillada de manera que se genera una pequena senal o ninguna por el fluoroforo cuando la horquilla se forma. La secuencia del bucle es especlfica para una secuencia de polinucleotido diana y, al hibridarse con la secuencia de aptamero la horquilla se despliega y genera de esa manera una senal fluorescente.
Para la deteccion multiplexada de un pequeno numero de aptameros que aun estan unidos al segundo soporte solido se pueden emplear colorantes fluorescentes con diferentes espectros de excitacion/emision para detectar y cuantificar dos, o tres, o cinco, o hasta diez aptameros individuales. De manera similar se pueden emplear diferentes cuantos puntuales para las lecturas multiplexadas. Los cuantos puntuales se pueden introducir tras la particion de aptamero libre del segundo soporte solido. Utilizando secuencias de hibridacion especlficas de aptamero unidas a cuantos puntuales unicos, se pueden llevar a cabo lecturas multiplexadas para 2, 3, 5 y hasta 10 aptameros. Tambien se puede utilizar el marcado de diferentes aptameros con diferentes isotopos radioactivos que se pueden detectar individualmente, tales como, 32P, 125I, 3H, 13C, y 35S, para lecturas multiples limitadas.
Para la deteccion multiple de aptameros liberados del segundo soporte solido de la Catch-2, se puede utilizar un unico colorante fluorescente, incorporado en cada aptamero como se ha descrito anteriormente, con un metodo de cuantificacion que permite la identification de la secuencia de aptamero junto con la cuantificacion del nivel de aptamero. Los metodos incluyen pero no se limitan a hibridacion en chip de ADN, hibridacion en microperlas, secuenciacion de proxima generacion y analisis CGE.
En una realizacion, se utiliza una matriz de hibridacion ADN, o chip, para hibridar cada aptamero o fotoaptamero con una unica o serie de unicas sondas inmovilizadas en un portaobjetos o chip tal como las matrices Agilent, matrices BeadChip de Illumina, matrices NimbleGEn o matrices impresas a medida. Cada sonda unica es complementaria de una secuencia del aptamero. La secuencia complementaria puede ser un marcador de hibridacion unico incorporado en el aptamero, o una parte de la secuencia de aptamero, o la secuencia de aptamero completa. Los aptameros liberados del soporte solido Captura-2 se anaden a un tampon de hibridacion apropiado y se procesan utilizando metodos de hibridacion convencional. Por ejemplo, la solution de aptamero se incuba durante 12 horas con matriz de hibridacion ADN a aproximadamente 60 °C para asegurar la rigurosidad de la hibridacion. Las matrices se lavan y luego se exploran en un portaobjetos de escaner fluorescente, que produce una imagen de la intensidad de hibridacion de aptamero en cada actuation de la matriz. La segmentation de imagenes y la cuantificacion se consigue utilizando un software de procesamiento de imagenes, tal como ArrayVision. En una realizacion, los ensayos de aptameros multiplexados se pueden detectar utilizando hasta 25 aptameros, hasta 50 aptameros, hasta 100 aptameros, hasta 200 aptameros, hasta 500 aptameros, hasta 1000 aptameros, y hasta 10.000 aptameros.
En una realizacion se utilizan microperlas direccionables que tienen sondas ADN unicas complementarias a los aptameros como se ha descrito anteriormente para la hibridacion. Las microperlas se pueden direccionar con colorantes fluorescentes unicos, tales como tecnologla de perlas Luminex, o se utilizan marcadores de codigos de barras como en la tecnologla Illumina VeraCode, o transpondedores alimentados con laser. En una realizacion, los aptameros liberados de soporte de Captura-2 se anaden a un tampon de hibridacion apropiado y se procesan utilizando metodos de hibridacion de microperlas convencionales. Por ejemplo, la solucion de aptamero se incuba durante dos horas con un grupo de microperlas a aproximadamente 60 °C para asegurar la rigurosidad de la hibridacion. Las soluciones se procesan entonces en un instrumento Luminex que hace el recuento de los tipos individuales de perlas y cuantifica la senal fluorescente de aptamero. En otra realizacion, las perlas VeraCode se
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ponen en contacto con la solucion de aptamero y se hibridan durante dos horas a aproximadamente 60 °C y luego se depositan en una superficie enrejada y se exploran utilizando un portaobjetos de escaner para la identificacion y la cuantificacion de la fluorescencia. En otra realizacion, las microperlas transpondedoras se incuban con la muestra de aptameros a aproximadamente 60 °C y luego se cuantifican utilizando un dispositivo apropiado para las microperlas transpondedoras. En una realizacion, se pueden detectar multiples ensayos de aptamero por hibridacion de microperlas utilizando hasta 25 aptameros, hasta 50 aptameros, hasta 100 aptameros, hasta 200 aptameros, y hasta 500 aptameros.
La muestra que contiene los aptameros eluldos se pueden procesar para incorporar marcadores de masa unicos, junto con marcadores fluorescentes como se ha descrito anteriormente. Los aptameros marcados de masa se inyectan entonces en un instrumento CGE, esencialmente un secuenciador ADN, y los aptameros se identifican por sus masas unicas y se cuantifican utilizando la fluorescencia del colorante incorporado durante la reaccion de marcador. Un ejemplo ilustrativo de esta tecnica se ha desarrollado por Althea Technologies.
En muchos de los metodos descritos anteriormente, la solucion de los aptameros se puede amplificar y marcarse opcionalmente antes de la cuantificacion. Se puede utilizar una ampliacion por PCR convencional con la solucion de aptameros eluldos del soporte solido de Captura-2. Dicha amplification se puede utilizar antes de la hibridacion en la matriz ADN, hibridacion en microperlas, y lectura en CGE.
En otra realizacion, el complejo de afinidad aptamero-diana (o complejo covalente aptamero-diana) es detectado y/o cuantifica utilizando Q-PCR. Como se utiliza en el presente documento, “Q-PCR” se refiere a una reaccion PCR que se lleva a cabo de manera, y en tales condiciones controladas para que los resultados del ensayo sean cuantitativos, es decir, el ensayo es capaz de cuantificar la cantidad o concentration de aptamero presente en la muestra de ensayo.
En una realizacion, la cantidad o concentracion del complejo de afinidad aptamero-diana (o complejo covalente aptamero-diana) de la muestra de ensayo se determina utilizando PCR TaqMan®. Esta tecnica se basa en general en la actividad exonucleasa 5'-3' de la enzima replicadora de oligonucleotido para generar una senal de una secuencia dirigida. Se selecciona una sonda TaqMan basandose en la secuencia del aptamero que se va a cuantificar y generalmente incluye un fluoroforo en el extremo 5', tal como 6-carboxifluorescelna, por ejemplo, y un interruptor en el extremo 3', tal como, por ejemplo, una 6-carboxitetrametilfluorescelna para generar una senal segun se amplifica la secuencia del aptamero utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Segun la polimerasa copia la secuencia de aptamero, la actividad exonucleasa libera el fluoroforo de la sonda, que esta hibridado corriente abajo a partir de los cebadores PCR, generando de esta manera una senal. La senal aumenta segun se produce el producto replicativo. La cantidad del producto PCR depende tanto del numero de ciclos replicativos as! como la concentracion de partida del aptamero.
En otra realizacion, la cantidad o concentracion de un complejo de afinidad aptamero-diana (o el complejo covalente aptamero-diana) se determina utilizando un colorante fluorescente intercalado durante el proceso replicativo. El colorante intercalado, tal como por ejemplo, verde SYBR®, genera una gran senal fluorescente en presencia de ADN de doble cadena en comparacion con la senal fluorescente generada en presencia de ADN de cadena sencilla. Como el producto de ADN de doble cadena se forma durante la PCR, la senal producida por el colorante aumenta. La magnitud de la senal producida es dependiente tanto del numero de ciclos de PCR como de la concentracion inicial del aptamero.
En otra realizacion, el complejo de afinidad aptamero-diana (o complejo covalente aptamero-diana) se detecta y/o cuantifica utilizando espectrometrla de masas. Se pueden introducir marcadores de masas unicos utilizando las tecnicas enzimaticas descritas anteriormente. Para la lectura de la espectroscopia de masas, no se necesita un marcador de detection, mas bien se utiliza la propia masa para identificar y, utilizando tecnicas que se utilizan comunmente por los expertos en la tecnica, cuantificarse basandose en la localization y el area bajo los picos de masas generados durante el analisis de espectroscopia de masas. Un ejemplo que utiliza la espectrometrla de masas. Un ejemplo que utiliza la espectrometrla de masas es el sistema MassARRAY® desarrollado por Sequenom.
Se puede utilizar un programa de computadora para llevar a cabo uno o mas etapas de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento. Otro aspecto de la presente divulgation es un producto de programa de computadora que comprende un medio de almacenamiento lelble por computadora que tiene un programa de computadora almacenado en el, que cuando se carga en una computadora, ejecuta o ayuda a la realizacion de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento.
Un aspecto de la divulgacion es un producto de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, a saber, un resultado del ensayo, que se puede evaluar en el sitio del ensayo o puede enviarse a otro sitio para la evaluation y comunicacion a una parte interesada en una localizacion remota, si as! se desea. Como se utiliza en el presente documento “localizacion remota” se refiere a una localizacion que es flsicamente diferente que en la que se obtienen los resultados. En consecuencias, los resultados se pueden enviar a distintas estancias, un edificio diferente, una parte de la ciudad diferente, una ciudad diferente, y asl. Los datos se pueden transmitir por cualquier medio adecuado tal como, por ejemplo, un facslmil, correo, suministro nocturno, correo electronico, ftp, mensaje de
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voz, y similares.
“Comunicar” la information se refiere a la transmision de los datos que representan esa information como senales electricas en un canal de comunicacion adecuado (por ejemplo, una red publica o privada). “Enviar” un artlculo se refiere a cualquier medio para conseguir que el articulo desde una localization a la siguiente, sea por transporte flsico del artlculo o por otra manera (si es posible) e incluye, al menos en el caso de los datos, el transporte flsico de un medio que alberga los datos o comunicando los datos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invention como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Todo lo anterior describe la divulgation en referencia a distintas realizaciones y ejemplos, Ninguna realization particular, ejemplo, o elemento de una realizacion particular o ejemplo se considera como un elemento o caracterlstica crlticos, necesarios, o esenciales de cualquiera de las reivindicaciones.
Se apreciara que se pueden hacer distintas modificaciones y sustituciones a las realizaciones desveladas sin alejarse del alcance de la divulgacion como se expone en las reivindicaciones posteriores. La memoria descriptiva, que incluye las figuras y ejemplos, se tiene que considerar de manera ilustrativa, mas que restrictiva, y todas dichas modificaciones y sustituciones se consideran incluidas en el alcance de la divulgacion. En consecuencia, el alcance de la divulgacion se puede determinar por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales, mas que por los ejemplos. Por ejemplo, las etapas mencionadas en cualquiera de los metodos o procedimientos reivindicados se pueden ejecutar en cualquier orden factible y no se limitan a un orden que se presenta en cualquiera de las realizaciones, los ejemplos, o las reivindicaciones.
Ensayo de afinidad proteomica
Captura-0
Se anadieron 133 pl al 7,5 % de pasta de estreptavidina-agarosa en 1xSB17, Tw (40 mM de HEPES, 102 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCl2, 5 mM de KCl, un 0,05 % de Tween-20) a los pocillos de una placa de filtro (0,45 pM placas HV Millipore (Durapore n° de cat. MAHVN4550)). Se descongelo la mezcla de aptamero 1,1x apropiada (todos los aptameros contenlan un fluoroforo Cy3 y un resto de biotina fotoescindible en el extremo 5') seguido por agitado. La mezcla de aptamero 1,1x se hirvio entonces durante 10 min, se agito durante 30 s y se permitio que se enfriara a 20 °C en un bano de agua durante 20 min. El llquido de las placas de filtro que contenlan una pasta de estreptavidina agarosa se removio entonces por centrifugation (1000x g durante 1 minuto). Se anadieron 100 pl de la mezcla de aptameros a los pocillos de la placa de filtro (roboticamente). La mezcla se incubo a 25 °C durante 20 minutos en un aparato agitador a 850 rpm, protegida de la luz.
Lavados de Captura-0
Posteriormente a los 20 min de incubation la solution se retiro por medio de filtration al vaclo. Se anadieron 190 pl de 1x tampon de prelavado de aptamero CAPS (50 mM de CAPS, 1 mM de EDTA, un 0,05 % de Tw-20, pH 11,0) y la mezcla se incubo durante 1 minuto mientras se agitaba. La solucion de lavado CAPS se retiro entonces por medio de filtracion al vaclo. Entonces se repitio el lavado CAPS una vez. Se anadieron 190 pl de 1xSX17, Tw y la mezcla se incubo durante 1 minuto mientras se agitaba. El 1xSB17, Tw se retiro por medio de filtracion al vaclo. Se anadieron 190 pl adicionales de 1xSX17, Tw y la mezcla se incubo durante 1 min mientras se agitaba. El 1xSB17, Tw se retiro entonces por centrifugacion (1 min a 1000x g). Despues de retirar el 1xSB17, Tw, se anadieron 150 pl de tampon de almacenamiento de Captura-0 (10 mM de NaCl, 40 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, un 0,02 % de azida sodica, un 0,05 % de Tween-20) y la placa filtro se sello cuidadosamente solo en el perlmetro de la placa y se almaceno a 4 °C en oscuridad hasta su uso.
Preparacion de la muestra
Setenta y cinco pl de diluyente de muestra al 40 % se colocaron en placas en una placa de muestra al 40 % (la muestra al 40 % final contenla: 20 pM de Z-block, 1 mM de benzamidina, 1 mM de EGTA, 40 mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 5 mM de KCl, un 1 % de Tween-20). Se colocaron en pacas ciento noventa y cinco pl de 1xSB17, Tw en una laca de muestra al 1 %. Se colocaron en placas noventa pl de 1xSB17, Tw en una placa de dilution de 1 a 10. Se colocaron en placas ciento treinta y tres pl de 1xSB17, Tw una placa de muestra al 0,005 %. Las muestras se descongelaron durante 10 min en una estacion de descongelacion Rack en una incubadora a 25 °C, y luego se removieron y se centrifugaron a 1000x g durante minuto. Se retiraron las tapas de los tubos. Las muestras se mezclaron (5 veces con 50 pl) y se transfirieron 50 pl de muestra al 100 % a la placa de muestra al 40 % que contenla los diluyentes de muestra. Entonces se mezclo la muestra al 40 % en la placa de muestra pipeteando repetidamente (110 pl 10 veces). Entonces se transfirieron cinco pl de muestra al 40 % a la placa de muestra al 1 % que contenla 1xSB17, Tw. De nuevo esta muestra se mezclo pipeteando repetidas veces (120 pl 10 veces). Tras el
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mezclado, se transfirieron 10 |jl de la muestra al 1 % a la placa de dilucion de 1 a 10 que contenla 1xSB17, Tw que se mezclo pipeteando repetidas veces (75 jl 10 veces). Se transfirieron siete jl de la muestra al 0,1 % desde la placa de dilucion 1 a 10 a la placa de muestra al 0,005 % que contenla 1xSB17, Tw, y se mezclo pipeteando repetidas veces (110 jl 10 veces).
Preparacion de la placa antes del equilibrado
La solucion de almacenamiento de la Captura-0 se retiro de las placas de filtro por medio de filtracion al vaclo. Se anadieron entonces ciento noventa jl de 1xSB17, Tw seguido por retirada de las placas de filtro por medio de filtracion al vaclo. Se anadieron entonces 190 jl adicionales de 1xSB17, Tw a las placas de filtro.
Equilibrado
Se retiro el tampon 1xSB17, Tw de las placas de filtro por centrifugacion (1 min a 1000x g). Se anadieron 100 jl de la dilucion de muestra adecuada a las placas de filtro (tres placas de filtro, una por cada dilucion de muestra 40 %, 1 % o 0,005 %). Las placas de filtro se sellaron cuidadosamente solo en el perlmetro de la placa, evitando presurizar los pocillos. La presion causara el vertido durante el equilibrado. Entonces se incubaron durante 3,5 horas a 28 °C en el aparato termoagitador a 850 rpm, protegido de la luz.
Procesamiento de la placa de filtro
Tras el equilibrado las placas de filtro se colocaron en el colector de vaclo y la muestra se retiro por filtracion al vaclo. Se anadieron ciento noventa jl de biotina de lavado (100 jM de biotina en 1xSB17, Tw y se retiro el llquido se retiro por filtracion al vaclo. Entonces la muestra se lavo 5x con 190 jl de 1xSB17, Tw (filtracion al vaclo). Se anadieron cien jl de NHS-biotina 1 mM en 1xSB17, Tw (recien preparado) y se transfirieron las placas de filtro a una almohadilla absorbente y la mezcla se incubo durante 5 minutos con agitado. Se retiro el llquido por filtracion al vaclo. Se anadieron ciento veinticinco jl de glicina 20 mM en 1xSB17, Tw y el llquido se retiro por filtracion al vaclo. De nuevo se anadieron 125 jl de glicina 20 mM en 1xSB17, T2 y el llquido se retiro por filtracion al vaclo. Posteriormente las muestras se lavaron 6x con 190 jl de 1xSB17, Tw siendo retirado el llquido por filtracion al vaclo. Se anadieron entonces ochenta y cinco jl de tampon de fotoescision (2 jM de Z-block en 1xSB17, T2) a cada una de las placas de filtro.
Fotoescision
Las placas de filtro se transfirieron en almohadillas absorbentes y se radiaron durante 6 min con una lampara de UV BlackRay con agitado (800 rpm, 25 °C). Las placas se rotaron 180 grados y se radiaron durante 6 minutos adicionales bajo la fuente de luz de la BlackRay. La placa de filtro del 40 % se coloco sobre una placa vacla de 96 pocillos. La placa de filtro del 1 % se apilo encima de la placa filtro del 40 %, y la placa de filtro del 0,005 % se apilo sobre la placa de filtro del 1 %. El conjunto de placas se centrifugo durante 1 min a 1000x g. La placa de 96 pocillos con la muestra elulda se coloco en la plataforma robotica. Se coloco un 60 % de glicerol en 1xSB17, Tw de la incubadora a 37 °C en la plataforma robotica.
Captura-2
Durante la realizacion del ensayo se anadieron 50 jl de perlas MyOne SA 10 mg/ml (500 jg) a una placa de 96 pocillos Omnitube ABgene para la Captura-2 y se coloco en el Cytomat. La placa de perlas de 96 pocillos de la Captura-2 se suspendio durante 90 s, se coloco en el bloque magnetico durante 60 s y se retiro el sobrenadante. Todo el eluldo de la Captura-1 se transfirio a la placa de perlas de la Captura-2 y se incubo en un termoagitador Peltier (1350 rpm, 5 min, 25 °C). La placa se transfirio a un iman a 25 °C durante 2 minutos y se retiro el sobrenadante. Despues se anadieron 75 jl de 1xSB17, Tw y la muestra se incubo en un agitador Peltier a 1350 rpm durante 1 minuto a 37 °C. Despues se anadieron 75 jl de glicerol al 60 % en 1xSB17, Tw (calentado a 37 °C) y la muestra se incubo de nuevo en el agitador Peltier a 1350 rpm durante 1 minuto a 37 °C. La placa se transfirio a un iman calentado a 37 °C y se incubo durante 2 min seguido por la retirada del sobrenadante. Este ciclo de lavado a 37 °C con 1xSB17, Tw y glicerol se repitio dos veces mas. La muestra se lavo entonces para retirar el glicerol residual con 150 jl de 1xSB17, Tw en un agitador Peltier (1350 rpm, 1 minuto, 25 °C), seguido por 1 minuto a 25 °C en el bloque magnetico. El sobrenadante se retiro y se anadieron 150 jl de 1xSB17, Tw sustituido con 0,5 M de NaCl y se incubo a 1350 rpm durante 1 minuto (25 °C) seguido por 1 minuto a 25 °C en el bloque magnetico. El sobrenadante se retiro con 75 jl de tampon de elucion de perclorato (1,8 M de NaClO4, 40 mM de PIPES, 1 mM de EDTA, un 0,05 % de Triton X-100, 1x de controles de hibridacion, pH = 6,8) seguido por una incubacion de 10 minutos en un agitador Peltier (25 °C, 1350 rpm). A continuacion la placa se transfirio a un separador magnetico y se incubo durante 90 s, y el sobrenadante se recupero.
Hibridacion
Se anadieron roboticamente veinte jl de la muestra elulda a una placa vacla de 96 pocillos. Se anadieron roboticamente cinco jl 10x tampon de bloqueo Agilent que contenla un segundo grupo de controles de hibridacion a
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las muestras eluldas. Luego se anadieron manualmente 25 |jl de 2x de tampon de hibridacion HiRPM Agilent a los pocillos. Se cargaron 40 jl de la mezcla de hibridacion en la junta del portaobjetos Agilent. Se anadio la matriz 8 x 15 k en la junta de cubreobjetos y el sandwich se presiono con una pinza. El sandwich se incubo entonces rotandolo (20 rpm) durante 19 horas a 55 °C.
Lavado post-hibridacion
El procesamiento del portaobjetos post-hibridacion se llevo a cabo en un Procesador Little Dipper (SciGene, n° de cat. 1080-40-1). Se colocaron aproximadamente 750 jl de tampon de lavado 1 (tampon de lavado 1 oligo aCGH/ChIP- on-chip, Agilent Technologies) en una placa de tincion de cristal. Se colocaron aproximadamente 750 jl de tampon de lavado 1 (tampon de lavado 1 oligo aCGH/ChIP- on-chip, Agilent Technologies) en el Bano n° 1 del Procesador Little Dipper. Se colocaron aproximadamente 750 jl de tampon de lavado 2 (tampon de lavado 1 oligo aCGH/ChIP- on-chip, Agilent Technologies) calentado a 37 °C en el Bano n° 2 del procesador Little Dipper. Se ajusto la velocidad de agitado magnetica en ambos banos a 5. El control de temperatura del Bano n° 1 no se encendio, mientras que el control de temperatura para el Bano n° 2 se fijo en 37 °C. Se separaron secuencialmente hasta veinte ensamblajes de portaobjetos/junta en la primera placa de tincion que contenla el tampon de lavado 1 y los portaobjetos se colocaron en gradilla de portaobjetos mientas se sumerglan en el tampon de lavado 1. Una vez que se separaron todos los ensamblajes, la gradilla de portaobjetos se transfirio rapidamente al Bano n° 1 del Procesador Little Dipper y el protocolo de lavado automatico comenzo. El procesador Little Dipper incubo los portaobjetos durante 30 s en el Bano n° 1 a una velocidad de 250 seguido por una transferencia al Bano n° 2 a 37 °C que contenla el Lavado 2 Agilent (Tampon de Lavado 2 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies) y se incubo durante 300 s a una velocidad de 100. A continuacion el Procesador Little Dipper transfirio la gradilla de portaobjetos a la centrlfuga interna, donde los portaobjetos se centrifugaron durante 300 s a una velocidad de 690.
Formacion de imagenes de micromatriz
Se formaron imagenes de la micromatriz de los portaobjetos con un escaner de micromatrices (Agilent G2565CA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) en el canal Cy3 con una resolucion de 5 jm ajustado a 100 % PMT y la opcion XRD capacitada a 0,05. Las imagenes tiff resultantes se procesaron utilizando la caracterlstica del software de extraccion Aligent version 10.7.3.1 con el protocolo GE1_107_Sep09.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo que comprende:
    proporcionar un aptamero que esta inmovilizado en un primer soporte solido, teniendo el aptamero una afinidad de union especlfica por la molecula diana y albergando un primer marcador, que tiene una afinidad por un primer elemento de captura, comprendiendo el primer soporte solido un primer elemento de captura y estando el primer marcador asociado al primer elemento de captura para inmovilizar el aptamero sobre el primer soporte solido, habiendo sido lavado dicho primer soporte solido con una o mas soluciones que disocian los aptameros agregados;
    poner en contacto dicho aptamero inmovilizado con la muestra de ensayo, en donde se forma un complejo de afinidad aptamero-diana, si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo; retirar uno o mas componentes de la mezcla no asociados a dicho primer soporte solido;
    unir un segundo marcador con una afinidad por un segundo elemento de captura a dicha molecula diana en el complejo de afinidad aptamero-diana;
    liberar el complejo de afinidad aptamero-diana de dicho primer soporte solido;
    exponer el complejo de afinidad aptamero-diana liberado a un segundo soporte solido que comprende un segundo elemento de captura y permitir que el segundo marcador se asocie a dicho segundo elemento de captura;
    retirar cualquier componente de la mezcla no asociado a dicho soporte solido; y
    eluir los aptameros de dicho segundo soporte solido con una o mas soluciones que comprenden una sal caotropica que altera las interacciones aptamero/analito.
  2. 2. Un metodo para detectar la presencia de, o determinar la cantidad de, una molecula diana en una muestra, comprendiendo el metodo:
    proporcionar una pluralidad de aptameros inmovilizados, en donde cada uno de dichos aptameros es especlfico de una molecula diana, y en donde cada uno de dicha pluralidad de aptameros comprende un primer marcador de captura escindible, estando dichos aptameros inmovilizados en un soporte solido que tiene sondas adheridas a la superficie del mismo, uniendo las sondas al primer marcador de manera que los aptameros estan inmovilizados en el soporte solido por medio de la union del primer marcador y la sonda;
    poner en contacto los aptameros inmovilizados con una muestra que contiene moleculas diana para formar una mezcla que contienen complejos aptamero-molecula diana unidos al soporte solido;
    hacer la particion de los complejos aptamero-molecula diana unidos al soporte solido del resto de la mezcla; introducir un segundo marcador de captura en el componente de molecula diana de los complejos de aptamero- molecula diana;
    disociar los complejos aptamero-molecula diana de la superficie del soporte solido, escindiendo el primer marcador de captura escindible;
    proporcionar un segundo soporte solido, que tiene sondas adheridas a la superficie del soporte, en donde las sondas son capaces de unirse al segundo marcador de captura en las moleculas diana;
    poner en contacto los complejos aptamero-molecula diana disociados con el segundo soporte solido, de manera que los complejos aptamero-molecula diana se unan al segundo soporte por medio de la union del segundo marcador de captura y la sonda;
    eluir los aptameros de dicho segundo soporte solido con una o mas soluciones tampon, que comprenden una sal caotropica que altera las interacciones aptamero/analito pero soporta las interacciones aptamero/aptamero y la hibridacion ADN;
    disociar el aptamero-molecula diana; detectar los aptameros libres.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en donde dicho aptamero comprende al menos un nucleotido modificado en C-5.
  4. 4. El metodo de las reivindicaciones 1, 2 o 3 , en donde dicho aptamero comprende al menos una modification qulmica que comprende una sustitucion qulmica en una o mas posiciones, que se seleccionan independientemente de una position ribosa, de una position desoxirribosa, de una position fosfato y de una position de base, seleccionandose opcionalmente dicha modificacion qulmica de manera independiente de entre el grupo que consiste en una modificacion del azucar en la posicion 2', una 2' amino (2'-NH2), una 2'-fluoro (2'-F), una 2'-O-metil (2'-OMe), una modificacion de pirimidina en la posicion 5, una modificacion de purina en la posicion 8, una modificacion en una amina exoclclica de citosina, una sustitucion de 5-bromouracilo, una sustitucion de 5-bromodesoxiuridina, una sustitucion de 5-bromodesoxicitidina, una modificacion de matriz, una metilacion, un protector 3' y un protector 5'.
  5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas introducir un desaflo cinetico.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho complejo de afinidad aptamero-diana tiene una velocidad de disociacion baja.
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  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que la velocidad de disociacion de dicho complejo de afinidad aptamero- diana (t1/2) es:
    (a) mayor o igual a 30 minutos;
    (b) entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 240 minutos; o
    (c) se selecciona de entre el grupo que consiste en > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos y > 240 minutos.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que una o mas de dichas soluciones tampon comprenden un disolvente organico, opcionalmente el glicerol.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha sal caotropica se selecciona de entre el grupo que consiste en perclorato sodico, cloruro de litio, cloruro magnesico y cloruro sodico.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho aptamero es detectado y opcionalmente es cuantificado utilizando un metodo que se selecciona de entre el grupo que consiste en Q-PCR, MS, secuenciacion de proxima generacion e hibridacion, llevandose a cabo dicha Q-PCr opcionalmente utilizando TaqMan® PCR, un colorante fluorescente de intercalacion durante el proceso de la PCR o una baliza molecular durante el proceso de la PCR.
  11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el aptamero comprende un resto detectable, en donde dicho resto detectable se selecciona opcionalmente de entre el grupo que consiste en un colorante, un punto cuantico, un radiomarcador, un grupo funcional electroqulmico y una enzima mas un sustrato enzimatico detectable, siendo dicho colorante preferentemente un colorante fluorescente.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho aptamero es un acido nucleico de cadena sencilla o un acido nucleico de doble cadena.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dicho aptamero comprende ADN, ARN o ambos ADN y ARN.
  14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha molecula diana se selecciona de entre el grupo que consiste en una protelna, un peptido, un carbohidrato, un polisacarido, una glucoprotelna, una hormona, un receptor, un antlgeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un analogo de estado de transicion, un cofactor, un inhibidor, un farmaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, un tejido y una sustancia controlada, preferentemente en donde dicha molecula diana es una protelna o un peptido.
  15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha muestra de ensayo se selecciona de entre el grupo que consiste en una muestra biologica, una muestra medioambiental, una muestra qulmica, una muestra farmaceutica, una muestra de alimento, una muestra agricola y una muestra veterinaria, en donde opcionalmente la muestra biologica se selecciona de entre el grupo que consiste en sangre, sangre completa, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma, suero, esputo, aliento, orina, semen, saliva, llquido menlngeo, llquido amniotico, llquido glandular, llquido linfatico, aspirado de pezon, aspirado bronquial, llquido sinovial, aspirado articular, celulas, un extracto celular, heces, tejidos, un extracto tisular, una biopsia tisular y llquido cefalorraquldeo, preferentemente plasma o suero.
  16. 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho primer marcador y dicho segundo marcador, dicho primer elemento de captura y dicho segundo elemento de captura comprenden cada uno al menos un componente que se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico cerrado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un mimetico de anticuerpo, un receptor celular, un ligando, un llpido, biotina, avidina, estreptavidina, Extravidina, neutravidina, Traptavidina, un metal, histidina y cualquier parte de cualquiera de estas estructuras.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, comprendiendo el primer marcador un resto liberable, preferentemente en donde el resto liberable comprende un resto fotoescindible.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en donde dichos primer soporte solido y segundo soporte solido se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo que consiste en una perla de pollmero, una perla de agarosa, una perla de poliestireno, una perla de acrilamida, una perla de nucleo solido, una perla porosa, una perla paramagnetica, una perla de cristal, una perla de poro controlado, un pozo de microtitulacion, un sustrato de copollmero ciclo-olefina, una membrana, un sustrato plastico, nailon, una pellcula de Langmuir-Blodgett, cristal, un sustrato de germanio, un sustrato de silicio, un chip de placa de silicio, un chip de flujo, una microperla, una nanopartlcula, un sustrato de politetrafluoroetileno, un sustrato de poliestireno, un sustrato de arsenuro de galio, un sustrato de oro y un sustrato de plata.
  19. 19. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, que comprende ademas cuantificar dicha diana cuantificando dicho aptamero.
  20. 20. El metodo de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en donde la deteccion del aptamero comprende la hibridacion del aptamero con un tercer soporte solido, comprendiendo el tercer soporte solido una pluralidad de caracterlsticas dirigibles y comprendiendo al menos una de dichas caracterlsticas al menos un elemento de captura dispuesto sobre el, que es complementario de cualquier secuencia contenida en el aptamero y/o que comprende 5 ademas la etapa de deteccion de dicha molecula diana detectando la parte de aptamero de dicho complejo de afinidad aptamero-diana.
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