ES2617304T3

ES2617304T3 - Método para identificar, ampliar y retirar células madre adultas y células madre cancerosas

Info

Publication number: ES2617304T3
Application number: ES08793835.3T
Authority: ES
Inventors: Johannes Carolus Clevers; Nicholas Barker; Andrea Haegebarth; Marcus Lambertus Van De Wetering
Original assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
Current assignee: Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2028-08-08
Also published as: EP2190978A2; US20100275280A1; US20180221441A1; US20210228682A1; CA2696047A1; US10940180B2; CN101868534A; AU2008287605A1; WO2009022907A3; HRP20170326T1; EP2022848A1; DK2190978T3; CN104483485B; EP2190978B1; EP3190180A3; PT2190978T; PL2190978T3; US20170151308A9; CN101868534B; CN104483485A

Abstract

Un método para obtener células madre Lgr5+ que comprende - poner en contacto una suspensión de células aisladas de una muestra de tejido u órgano normal o de una muestra de tumor sólido o líquido con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5; y - identificar las células unidas a dicho compuesto aglutinante.

Description

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Metodo para identificar, ampliar y retirar celulas madre adultas y celulas madre cancerosas.

Descripcion

[0001] La invencion se refiere a los campos de la bioquimica, farmacia y oncologla. La invencion se refiere particularmente al uso de nuevos marcadores de celulas madre para el aislamiento de celulas madre. La invencion se refiere ademas a las celulas madre obtenidas y su uso en, por ejemplo, investigacion o tratamiento, por ejemplo, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de tejido danado o enfermo. La invencion se refiere ademas a medios adecuados para el tratamiento de cancer y aun mas especlficos para el tratamiento de celulas madre cancerosas.

Celulas madre adultas (revisado en 1)

[0002] Las celulas madre adultas se encuentran en muchos, si no todos, los organos de seres humanos y ratones adultos. Aunque pueda haber gran variacion en las caracterlsticas exactas de las celulas madre adultas en tejidos individuales, las celulas madre adultas comparten las siguientes caracterlsticas: Retienen un fenotipo indiferenciado; su descendencia puede diferenciarse hacia todos los linajes presentes en el tejido pertinente; conservan las capacidades de auto-mantenimiento a lo largo de la vida; y son capaces de regenerar el tejido pertinente despues de la lesion. Las celulas madre residen en un lugar especializado, el nicho de celulas madre. El nicho suministra tlpicamente los contactos y las senales apropiados celula a celula para mantener el caracter "de celula madre".

[0003] Algunos tejidos muestran un alto nivel de facturacion de estado estacionario. Buenos ejemplos son el sistema hematopoyetico, la piel y el epitelio intestinal. Se supone que las celulas madre en dichos tejidos contribuyen continuamente al proceso de auto-renovacion. Otros tejidos, como el cerebro, el miocardio o el musculo esqueletico, muestran muy poca o ninguna actividad proliferativa en situaciones de estado estacionario. Las celulas madre de tales tejidos son mas probablemente inactivas y solo se vuelven activas cuando se pierdan celulas diferenciadas, por ejemplo, tras una lesion.

[0004] Celulas madre de la medula osea han sido objeto de una intensa investigacion durante los ultimos 30 anos. El trabajo con otras celulas madre adultas se ha iniciado mas recientemente. Se ha logrado un buen avance con un numero limitado de estas, es decir, la celula madre epidermica, la celula madre del follculo piloso, las celulas madre neuronales y la celula madre de las glandulas mamarias. En una demostracion dramatica, se demostro que una unica celula madre de glandula mamaria regeneraba todo el epitelio mamario tras la introduccion en la almohadilla de grasa mamaria (2).

[0005] El estudio de las celulas madre tiene dos requisitos previos:

1) Debe ser posible reconocer y aislar celulas madre primarias vivas. La disponibilidad de marcadores especlficos (combinaciones de) es esencial. Como ejemplifican los estudios seminales en medula osea humana y de raton, las combinaciones de marcadores de superficie celular permiten la clasificacion de poblaciones de celulas fuertemente enriquecidas.

2) vitro de cultivos celulares in o en ensayos de trasplante in vivo posteriormente permiten la demostracion de generacion a largo plazo de todos los tipos de celulas diferenciadas. Tlpicamente, a partir de estos sistemas de ensayo, las celulas madre se re-aislan y se ensayan en serie para demostrar el tallo a largo plazo y la auto- renovacion.

[0006] Como un ejemplo no limitante de celulas madre adultas, las celulas madre intestinales se discuten en mas detalle.

Celulas madre intestinales

[0007] El epitelio intestinal es el tejido mas rapido de auto-renovacion en el adulto. Se cree que un punado de celulas madre se encuentra en la base de cada cripta intestinal para garantizar la renovacion continua e ilimitada. En comparacion con otros tejidos rapidamente auto-renovables, las celulas madre intestinales han permanecido bastante evasivas. No existen ensayos ex vivo o de trasplante para estas celulas, y todo el conocimiento de las celulas madre intestinales se deriva de un analisis histologico de las criptas in situ. Las celulas madre intestinales se dividen mas lentamente que sus proliferantes descendientes que llenan las posiciones ascendentes de la cripta. Si bien el consenso es que las celulas madre del colon se colocan en el fondo de las criptas, la localizacion de las celulas madre en el intestino delgado sigue siendo un tema polemico. Potten y otros han proporcionado evidencia que apoya una localizacion inmediatamente por encima del compartimiento de celulas de Paneth en la posicion +4, usando el ensayo de Retencion de ADN de Largo Plazo (revisado en 3.4). Los estudios de seguimiento de linaje han instigado a Bjerknes y Cheng a proponer que un tipo diferente de celula, la llamada celula de columna de base de cripta, puede representar la celula madre genuina. Estas celulas columnares de base de cripta se entremezclan con celulas Paneth en las posiciones mas bajas de las criptas (5).

[0008] Recientemente se han propuesto algunos marcadores de genes candidatos para las celulas madre

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intestinales: es decir, Musashi (6,7) y fosfo-PTEN (8). Nosotros y otros encontramos que el dominio de expresion Musashi contiene 30-50 celulas por cripta, muchas mas que celulas madre (vease mas abajo), mientras que el marcador fosfo-PTEN puede representar un artefacto (9).

[0009] El numero de celulas madre adultas en las criptas se ha estimado entre 1 y 6, segun el enfoque experimental utilizado (10). Sigue siendo un asunto de debate si el caracter de celula madre es un conjunto de propiedades que se autoperpetuan por division asimetrica a lo largo de los anos o si el fondo de la cripta actua como un nicho que confiere estas propiedades a los progenitores que residen en su interior. El estudio de pedigrles celulares en criptas individuales mediante el analisis de las etiquetas de metilacion (11) indica que las celulas madre se dividen estocasticamente de una manera asimetrica (es decir, una celula madre hija mas un progenitor diferenciador) o simetrica (es decir, dos celulas madre hijas o dos progenitores diferenciadores). Cabe senalar que, aunque la existencia de divisiones celulares asimetricas y simetricas se infiere de los estudios anteriores, no se ha observado hasta el momento ninguna prueba formal de distribucion asimetrica de determinantes durante la mitosis en el epitelio intestinal.

[0010] Cuando llegan a la tercera parte superior de las criptas colorrectales (o las vellosidades en el intestino delgado), progenitores comprometidos se diferencian en celulas absorbentes (colonocitos/enterocitos) o celulas de linaje de secrecion (celulas caliciformes, celulas enteroendocrinas, celulas de Paneth). A partir de este momento, las celulas diferenciadas continuan su migracion hacia las vellosidades en bandas coherentes que se extienden a lo largo del eje de cripta-vellosidad o se organizan en el epitelio superficial del colorectum en grupos de aspecto hexagonal. Como excepcion a esta regla, las celulas de Paneth migran hacia el fondo de la cripta en el intestino delgado (revisado en 12).

Celulas madre cancerosas (revisadas en 13, 14)

[0011] La hipotesis de las celulas madre cancerosas postula que una pequena reserva de celulas autosostenibles es exclusivamente capaz de auto-renovarse y mantener el tumor. Estas celulas madre cancerosas pueden expandir la piscina de celulas madre cancerosas, pero tambien generaran los tipos heterogeneos de celulas que constituyen la mayor parte del tumor. Las celulas madre cancerosas pueden ser relativamente refractarias a las terapias que se han desarrollado para erradicar las celulas que se dividen rapidamente que constituyen la mayor parte de un tumor. Las celulas madre cancerosas tambien pueden ser las celulas mas probables a metastatizarse. Por lo tanto, la hipotesis de la celula madre cancerosa requerirla que replanteemos la forma para diagnosticar y tratar los tumores. La terapia tendrla que dirigirse a la poblacion de celulas madre "minoritarias" que alimenta el crecimiento del tumor y la metastasis, en lugar de la mayor parte del tumor. La hipotesis de la celula madre cancerosa esta en el centro de un campo en rapida evolucion y puede dictar cambios en la forma en que los investigadores basicos y cllnicos ven el cancer.

[0012] En la decada de 1990, los estudios de John Dick y otros en la leucemia mielogena aguda (LMA) apoya la existencia de celulas madre cancerosas en esta enfermedad (15, 16). Los esfuerzos para definir la celula de origen en las neoplasias malignas hematopoyeticas fueron ayudadas por la disponibilidad de mapas de linaje hematopoyetico, y de marcadores de superficie celular para distintos tipos de celulas y linajes. Se demostro que las celulas madre AML putativas eran capaces de regenerar la AML humana en ratones NOD/SCID irradiados. La celula madre AML mostro un fenotipo CD34+ CD38-, similar a la de progenitores hematopoyeticos humanos normales, lo que sugiere una estrecha similitud entre las celulas madre de AML y las celulas madre normales.

[0013] Recientemente, las celulas madre cancerosas tambien han sido identificadas en una serie de tumores solidos. Clarke y sus colegas trasplantaron celulas fraccionadas de tumores de mama humanos en ratones NOD/SCID. Tan solo un centenar CD44+CD247celulas bajas podrlan establecer los tumores en los ratones, mientras que decenas de miles de celulas de diferentes fracciones no inducen tumores (17). Este ejemplo ha sido seguido por multiples otros estudios sobre tumores solidos. Por ejemplo, las celulas madre tumorales cerebrales que pueden producir tumores cerebrales trasplantables en serie en ratones NOD/SCID han sido aisladas de meduloblastomas humanos y glioblastomas utilizando el marcador CD133 encontrado tambien en celulas madre neurales normales (revisado en 18). La clasificacion de las celulas de poblacion lateral (SP) excluyendo el tinte de Hoechst y de CD44 permitio el aislamiento de celulas madre cancerosas en el cancer de prostata (revisado en 19).

[0014] Existe cierta confusion en la literatura en cuanto a la definition de una celula madre cancerosa. Aqul, seguimos el consenso alcanzado en un taller reciente AACR (14), el cual establece que el cancer de celulas madre "es una celula dentro de un tumor que posee la capacidad de auto-renovacion y para hacer que los linajes heterogeneas de celulas cancerosas que componen el tumor. Las celulas madre cancerosas solo pueden definirse experimentalmente por su capacidad para recapitular la generacion de un tumor de crecimiento continuo". Los terminos alternativos en la literatura incluyen la celula que inicia el tumor y la celula tumorigenica. Los ensayos para la actividad de las celulas madre cancerosas necesitan abordar el potencial de la autorrenovacion y de la propagacion del tumor. El ensayo de patron-oro actualmente es xeno-transplante en serie en ratones inmunodeficientes.

[0015] Como un ejemplo no limitante de celulas madre cancerosas, las celulas madre cancerosas de colon se tratan

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en mas detalle.

Celulas madre cancerosas de colon

[0016] ^Puede la hipotesis de las celulas madre cancerosas extrapolarse al cancer de colon humano? Dos estudios muy recientes implican que este es el caso. John Dick y sus colegas exploraron la utilidad de CD133 como un marcador para las celulas de cancer colorrectal (20). CD133 o prominina, es un marcador que se asocia con poblaciones made y progenitoras en multiples tejidos y canceres. Se encontro que CD133 se expreso en 5-20% de las celulas de cancer de colon humano. Los ensayos posteriores de xenoinjerto en serie demostraron que las celulas CD133+, pero no CD133-, podrlan iniciar la formacion de tumores en ratones inmunodeficientes. Se calculo que la frecuencia de celulas madre cancerosas en la poblacion aislada de CD133+ era ligeramente inferior al 0,5%. De la misma manera, De Maria y otros encontraron que las celulas CD133+ comprendlan menos del 2,5% de las celulas humanas de cancer de colon y tambien demostraron que estas celulas podrlan ser transplantadas en serie en ratones inmunodeficientes (21). Ademas, las celulas CD133+ se pueden mantener durante largos perlodos de tiempo en cultivo utilizando un medio exento de suero que contiene EGF y FGF2.

[0017] Estos estudios implican que el cancer de colon puede representar otro ejemplo de un tumor solido en el que un pequeno numero de celulas madre cancerosas es responsable del mantenimiento del tumor. La clasificacion para la expresion del marcador CD133 enriquece significativamente para la celula madre cancerosa, pero la mezcla celular resultante es lejos de ser pura. Por lo tanto, no esta claro cuales son las propiedades exactas de las celulas madre cancerosas dentro de la preparacion de celulas clasificadas, como su estado de ciclo celular, o su resistencia a la quimioterapia o a la radiacion.

[0018] US 2004/0058392 y EP 1 400 807 describe una lista de genes diana TVC que se definieron en la llnea celular de cancer de colon LS174T (22). En las aplicaciones, se especulo que estas moleculas expresadas en celulas de cancer de colon y en criptas intestinales representarlan marcadores de celulas madre. Varios de los marcadores codifican las protelnas de la superficie celular. Los inventores de los documentos US 2004/0058392 y EP 1 400 807 contemplaron que estas protelnas pueden usarse como marcadores para la selection de la abundante poblacion de celulas madre en el intestino. Sin embargo, resulto que la abrumadora mayorla de estas protelnas no son adecuadas como un marcador de seleccion de celulas madre, ya que no se expresan (especlficamente) por celulas madre. Por ejemplo, la protelna CD44 se expresa por todas las celulas criptas divisorias (23) como lo es cMyb (24) y GPX2 (25). La protelna c-Kit se expresa en celulas entero-endocrinas no divisorias (26). EphB2 se expresa por todas las celulas en division y EphB3 se expresa por las celulas Paneth no divisorias (27). BMP4 se expresa por las celulas del estroma en la vellosidad (28). Y Claudina1 se expresa casi omnipresente (29).

[0019] La presente invention se refiere a marcadores que identifican las celulas adultas y/o madre de tejido y celulas madre cancerosas. Las celulas madre adultas y/o de tejido identificadas son utiles en la reparation de tejido danado o enfermo. La presente invencion se refiere ademas a metodos que permiten el aislamiento de celulas madre de adultos y/o tejidos y/o celulas madre cancerosas. La invencion se refiere ademas a procedimientos ex vivo para el cultivo o mantenimiento o multiplication (aislada) de adultos y/o celulas madre de tejidos y/o celulas madre cancerosas. La invencion se refiere ademas a metodos que permiten la identification y eradication de marcadores de celulas madre cancerosas. Uno de los objetos de la presente invencion es proporcionar nuevos marcadores que sean utiles en un metodo para identificar celulas madre adultas y celulas madre cancerosas. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo adecuado para mantener/cultivar/multiplicar/expandir celulas madre adultas. Otro objeto de la presente invencion es erradicar celulas madre cancerosas. Las celulas madre adultas se aislan tlpicamente de tejido y por lo tanto se denominan tambien celulas madre de tejido.

[0020] Los receptores de superficie Lgr5 y Lgr6 marcan las celulas madre adultas en multiples tejidos, as! como las celulas madre cancerosas en multiples tipos de cancer. Los presentes inventores revelan que los patrones de expresion de las moleculas superficiales Lgr5 (tambien conocidas como Grp49) y Lgr6 independientemente marcan celulas madre adultas en multiples tejidos, as! como celulas madre cancerosas en multiples tipos de cancer. Los receptores de la hormona glicoprotelna, tales como los receptores de LH, FSH y TSH, pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a protelnas G (GPCR) grandes, pero son unicos en llevar un ectodominio rico en leucina importante para la union a ligando. Estos receptores acoplados a protelna G ricos en leucina y que contiene repetition en el genoma humano se denominan LGRs. El analisis filogenetico muestra que hay tres subgrupos LGR: los receptores conocidos de la hormona glicoproteica; LGR4 a 6; y un tercer subgrupo representado por lGR7 (30). Lgr5 y -6 son el objeto principal de esta invencion. Los ligandos para estos dos receptores no se describen en la literatura cientlfica; por lo tanto estos receptores se refieren a menudo como huerfanos. Las secuencias de los receptores humanos, de raton y de rata se muestran en la Figura 10. El LGR4 humano comprende 951 aminoacidos, 447 de los cuales son identicos a los aminoacidos correspondientes en Lgr5 y 485 de los cuales son identicos a los aminoacidos correspondientes en LGR6. El Lgr5 humano comprende 907 aminoacidos, 387 de los cuales son identicos a los aminoacidos correspondientes en LGR6. LGR6 consta de 967 aminoacidos. Una estructura predicha de estos receptores se da en la Figura 11. LGR4/GPR48 es el gen mejor estudiado de los tres. Segun la literatura cientlfica, se expresa ampliamente en multiples tejidos (31, 32) y no se asocia especlficamente con celulas madre. En modelos geneticos de raton, se ha descrito que son importantes para el crecimiento intrauterino (32), para la fertilidad masculina (33) y para el desarrollo renal (34). Lgr5/GPR49 ha sido eliminado. Los embriones mutantes

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mueren despues del nacimiento debido a un defecto en la lengua y la mandlbula inferior (35). Lgr5/GPR49 esta sobreexpresado en canceres hepaticos y de colon (22, 36, 37). LGR6 no ha sido estudiado mas alla de su clonacion inicial y el analisis de secuencias (30).

RESUMEN DE LA INVENCION

[0021] La invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5 + que comprenden

la puesta en contacto de una suspension de celulas aislada de una muestra de tejido u organo normal o de una muestra de tumor solido o llquido con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5; e

identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union.

[0022] La invencion tambien proporciona celulas madre Lgr5+ aisladas que se pueden obtener por un metodo de la invencion, en el que la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula adrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre de mama.

[0023] La invencion tambien proporciona una coleccion aislada de celulas madre que comprende mas de 50% de celulas madre positivas Lgr5 en las que la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula adrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre de mama.

[0024] La invencion tambien proporciona una celula madre aislada que comprende Lgr5 en su membrana celular, en la que la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula adrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre de mama.

[0025] La invencion tambien proporciona una celula madre aislada o una coleccion de celulas madre, en la que la celula madre contiene compuesto especlfico de union unido Lgr5, en el que dicho compuesto de union Lgr5 es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo derivado o anticuerpo capaz de union a Lgr5.

[0026] La invencion tambien proporciona celulas madre cancerosas Lgr5+ aisladas obtenibles por un metodo de la invencion.

[0027] La invencion tambien proporciona celulas madre cancerosas aisladas que comprenden Lgr5 embebido en su membrana celular.

[0028] La invencion tambien proporciona una coleccion de celulas madre cancerosas que comprenden Lgr5 incrustado en su membrana celular, en el que dicha recogida comprende al menos el 50% de celulas madre cancerosas capaces de recapitular la generacion de un tumor de crecimiento continuo.

[0029] La invencion tambien proporciona una coleccion de celulas madre de acuerdo con la invencion, para uso en un metodo de tratamiento.

[0030] La invencion tambien proporciona el uso de celulas madre de acuerdo con la invencion en la preparation de un medicamento para tratar el tejido danado o enfermo.

[0031] La invencion tambien proporciona una composition para uso en el tratamiento de dano en el tejido u organo que comprende celulas madre de acuerdo con la invencion, preferiblemente las celulas madre de tejido o de organos.

[0032] La invencion tambien proporciona un anticuerpo, derivado o fragmento que tiene afinidad por Lgr5, o un inhibidor de una transcription Lgr5 ARNm, para su uso en el diagnostico in vivo de la presencia y/o el contenido de las celulas madre cancerosas en un tumor.

[0033] La invencion tambien proporciona un metodo para determinar si una muestra comprende una celula madre cancerosa, que comprende:

- Poner en contacto una suspension de celulas aislada de un tejido normal, una muestra de organo o una muestra de tumor solido o llquido con un compuesto de union, donde el compuesto de union es un anticuerpo, derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5;

- Eliminar el compuesto de union no unido;

- Detectar cualquier complejo ligado; y

- Determinar la presencia de una celula madre cancerosa a partir de la presencia del complejo unido.

[0034] La invencion tambien proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo derivado o anticuerpo que tiene afinidad por Lgr5 para la identification de celulas madre en o para el aislamiento de celulas madre a partir de una muestra de tejido u organo

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[0035] La invention tambien proporciona el uso de Lgr5 como un marcador para el aislamiento de celulas madre de tejido o de organos de una muestra de tejido u organo.

[0036] La invencion tambien proporciona un metodo para mantener o cultivar celulas madre de tejido o de organos segun la invencion, que comprende la proportion a las celulas madre de tejido o de organos con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.

[0037] La invencion tambien proporciona el uso de celulas madre cancerosas aisladas de acuerdo con la invencion en la identification de compuestos que se pueden utilizar en el tratamiento de cancer.

[0038] La invencion tambien proporciona un metodo para poner a prueba el efecto de un compuesto posible de celulas madre contra el cancer que comprende la puesta en contacto de una coleccion de celulas madre cancerosas de acuerdo con la invencion in vitro con dicho posible compuesto de celulas madre contra el cancer y examinar si dichas celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor de crecimiento continuo.

[0039] La invencion tambien proporciona un metodo in vitro para determinar la efectividad de un tratamiento anticancer, que comprende la determination de la presencia de celulas madre cancerosas poniendo en contacto celulas de cancer con un compuesto de union Lgr5 in vitro antes y despues del tratamiento contra el cancer, en el que dicho compuesto de union a Lgr5 es un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.

DESCRIPCION DETALLADA

[0040] En una primera forma de realization, la invencion proporciona un metodo para obtener (o aislar) celulas madre Lgr5 + de adultos que comprende

- opcionalmente preparar una suspension celular de una muestra normal de tejido u organo

- poner en contacto una suspension de celulas aislada de una muestra de tejido u organo normal con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto aglutinante, y

- opcionalmente aislar las celulas madre de dicho compuesto aglutinante.

[0041] Un metodo de la invencion permite la obtencion (o aislamiento) de una coleccion de celulas que comprenden, preferiblemente que consiste en, al menos 50%, mas preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente por lo menos 90% de celulas madre, tales como entre 90% y 99% de celulas madre o entre 95% y 99% de celulas madre.

[0042] En algunas realizaciones, la coleccion de aislados de celulas madre comprende, y preferiblemente consta de, mas de 50%, mas preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferido al menos 90% de celulas madre, como entre 90% y 99% de celulas madre o entre 95% y 99% de celulas madre pluripotentes puras, que pueden retener un fenotipo indiferenciado. En algunas realizaciones, las celulas madre de la invencion conservan las capacidades de mantenimiento autonomo a lo largo de la vida; y son capaces de regenerar el tejido pertinente despues de la lesion. Sus descendientes, o celulas hijas no celulas madre pueden diferenciarse hacia todos los linajes presentes en el tejido pertinente. Dicha recogida de celulas puede aislarse a partir de una suspension de celulas que comprende celulas madre y celulas hijas de celulas no madre tales como celulas progenitoras hijas comprometidas o diferenciadas. Una celula madre adulta es preferiblemente una celula madre obtenida a partir de un tejido embrionario posterior. Preferiblemente un tejido post natal. En primates tales como un ser humano, se obtienen preferiblemente sujetos con al menos un ano de edad, preferiblemente un sujeto post-puberal. En una realizacion preferida de la invencion, dichas celulas madre son celulas madre adultas y/o celulas madre cancerosas.

[0043] Una ventaja importante de una coleccion de celulas madre que comprenden mas de 50% de celulas madre pluripotentes es que dicha poblacion comprende menos celulas que pueden actuar negativamente sobre la capacidad de automantenimiento de las celulas madre y/o la capacidad de diferenciacion de las celulas madre, En comparacion con una coleccion de celulas madre que comprenden menos de 50% de celulas madre pluripotentes puras. Estas celulas de action negativa comprenden celulas hija no de celulas madre u otras celulas no madre que se co-aislan con las celulas madre.

[0044] Otras ventajas de una poblacion pura o casi pura de celulas madre adultas son que el numero de celulas limitadas puede utilizarse como agente terapeutico para el tratamiento de enfermedades en las que se ha visto afectado el tejido correspondiente, del que la composicion es bien conocida.

[0045] Preferiblemente, dichas celulas madre son celulas madre de tejido, como por ejemplo las celulas intestinales madre, celulas madre de la piel o las celulas madre de la retina. La invencion proporciona preferiblemente un metodo para aislar celulas madre de tejido, comprendiendo dicho metodo las etapas descritas anteriormente. Dichas celulas madre no incluyen celulas madre embrionarias humanas. Cuando se alslan celulas madre adultas y/o de

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tejido, se prefiere comenzar con una coleccion de celulas del tejido especifico del que se va a aislar el tejido y/o la celula madre de un adulto. Tlpicamente, una celula madre de tejido y/o una celula madre de un adulto se compromete a formar celulas de dicho tejido, sin embargo, se puede manipular excepcionalmente una celula madre de tejido y/o de un adulto para producir celulas de otro tejido.

[0046] Las celulas madre son celulas primitivas que se encuentran en todos los organismos multicelulares. Conservan la capacidad de renovarse a traves de la division de celulas mitoticas y pueden diferenciarse en una amplia gama de tipos de celulas especializadas. Las tres grandes categorlas de celulas madre de mamlferos son: celulas embrionarias (derivadas de blastocistos), celulas madre adultas (que se encuentran en tejidos adultos) y celulas madre de sangre de cordon (que se encuentran en el cordon umbilical). La definicion de una celula madre requiere que sea al menos capaz de auto-renovacion (la capacidad de atravesar numerosos ciclos de division celular manteniendo al mismo tiempo el estado indiferenciado) y tiene una potencia ilimitada (la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de celula madura, es decir, totipotente, pluripotente, multipotente o unipotente).

[0047] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprenden

- opcionalmente preparar una suspension de celulas a partir de una muestra de tejido normal

- poner en contacto dicha suspension de celulas aislada de una muestra de tejido u organo normal con un anticuerpo, un derivado de anticuerpo

fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto aglutinante, y

- opcionalmente aislar las celulas madre de dicho compuesto aglutinante, en el que dichas celulas madre son celulas madre adultas, mas preferiblemente celulas madre adultas de mamlfero e incluso mas preferiblemente celulas madre adultas. Estas celulas madre adultas suelen actuar como un sistema de reparacion para el cuerpo y reparan celulas especializadas. Las celulas madre adultas se encuentran tanto en los ninos como en los adultos y la mayorla de las celulas madre adultas tienen restricciones de linaje (multipotentes) y se conocen por su origen tisular, por ejemplo, celulas madre de la piel o celulas madre de la retina.

[0048] Una muestra de tejido u organo se puede obtener a traves de cualquier metodo conocido, tal como una biopsia. Ademas, se puede obtener una muestra de tejido u organo a partir de cualquier posible tejido u organo, tal como, pero no limitado a, corazon, retina, mama, ovario, pulmon, cerebro, ojos, estomago, pancreas, hlgado, intestino que comprende colon y tejido rectal, piel, follculo piloso y medula suprarrenal,

[0049] La frase "un tejido normal o muestra de organo" se utiliza aqul para referirse a una muestra de tejido u organo que es sano, no transformado, no maligno, no canceroso o no tumorigenico, es decir, una muestra de tejido o de organo sano, no transformado, no malignante, no canceroso o no tumorigenico. Cualquier patologo, experto en la tecnica, puede determinar si un tejido es sano, no transformado, no maligno, no canceroso o no tumorigenico.

[0050] En una realizacion preferida, la muestra de tejido u organo utilizado es de origen humano de mamlfero. Aun mas preferentemente, el tejido es tejido adulto (es decir, tejido de un mamlfero transportado, es decir tejido no embrionario/fetal).

[0051] La medula osea y la sangre (espinal) pueden considerarse suspensiones de celulas naturales. A partir de organos solidos, se pueden obtener suspensiones celulares por ejemplo por interrupcion mecanica del tejido de organos en pequenos fragmentos. Estos fragmentos pueden opcionalmente segregarse adicionalmente en celulas individuales mediante productos qulmicos tales como EDTA y/o por digestion enzimatica con, por ejemplo, las preparaciones enzimaticas tripsina, dispasa, colagenasa o pancreatina. El procedimiento puede implicar el cultivo de tejidos o celulas antes, durante o despues de los procedimientos de disruption y/o digestion enzimatica.

[0052] Como no siempre es necesario aislar las celulas madre del compuesto de union utilizado, dicho paso se presenta como una caracterlstica opcional en la revindication. Cuando es necesario aislar las celulas madre del compuesto de union a Lgr5 y/o 6, esto puede realizarse por multiples metodos bien conocidos por el experto en la materia. Ejemplos adecuados son agitation (mecanica), digestion enzimatica, adicion de un compuesto de union en exceso o un derivado del mismo, elucion mediante cambio de concentration de pH o sal.

[0053] Ahora que los inventores han proporcionado pruebas de que Lgr5 o 6 son (unicos) marcadores de celulas madre, compuestos que son capaces de unirse a Lgr5 y/o 6 (es decir, compuestos de union Lgr5 o 6) se pueden utilizar para identificar, marca y aislar las celulas madre.

[0054] Un ejemplo adecuado de un compuesto de union Lgr5 o 6 es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 o 6, es decir, un anticuerpo o un derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5 o 6. Como Lgr5 y 6 son protelnas de superficie transmembrana, tal anticuerpo o un derivado o un fragmento del mismo tiene preferentemente afinidad por la parte de la protelna que se enfrenta externamente, es decir, se une a cualquier parte extracelular. En una realizacion preferida, dicho anticuerpo o un

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derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad por Lgr5 y/o 6.

[0055] Por lo tanto, en una realizacion preferida, la invention proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprenden

- poner en contacto una suspension celular aislada de una muestra de tejido u organo normal con un compuesto de union Lgr5 y opcionalmente Lgr6

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- opcionalmente aislar las celulas madre de dicho compuesto aglutinante,

En el que dicho compuesto de union Lgr5 y opcionalmente Lgr6 es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y opcionalmente Lgr6.

[0056] Los anticuerpos o sus derivados y/o sus fragmentos se pueden proporcionar por metodos que son bien conocidos para el experto en la tecnica e incluyen la tecnologla de hibridoma en ratones normales o transgenicos o en conejos, o la tecnologla de anticuerpos de presentation en fagos. En una realizacion, se usa inmunizacion genetica. Esta tecnica comprende la administration de una secuencia de acido nucleico, o un equivalente funcional de la misma, que codifica al menos un antlgeno de interes, a un animal no humano. El (los) antlgeno(s) codificado(s) esta(n) producido(s) por el animal, que estimula el sistema inmune del animal contra dicho(s) antlgeno(s). Por lo tanto, se produce una respuesta inmune contra dicho(s) antlgeno(s) en dicho animal. Posteriormente, las celulas T, las celulas B y/o los anticuerpos especlficos para un antlgeno de interes se obtienen preferiblemente de dicho animal. Dichas celulas T, celulas B y/o anticuerpos son opcionalmente procesadas adicionalmente. En una realizacion preferida, se utiliza una celula B obtenida de interes en tecnologla de hibridoma donde dicha celula B obtenida se fusiona con una celula tumoral para producir una celula productora de anticuerpos hlbridos.

[0057] Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos adecuados son scFv, Fab, o (Fab)2. Ejemplos de derivados adecuados son anticuerpos quimericos, nanocorpos, anticuerpos bifuncionales o anticuerpos humanizados.

[0058] En aun otra realizacion preferida, el anticuerpo usado es un anticuerpo monoclonal.

[0059] En una realizacion preferida adicional, un compuesto de union a Lgr5 y/o 6 comprende un anticuerpo o un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada como se representa en la Figura 27, y preferiblemente tambien comprende una molecula de cadena ligera de inmunoglobulina complementaria, por lo que las secuencias CDR se determinan segun Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," US Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health, 1987). Preferentemente, dicho derivado de anticuerpo o anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de CDR1 de cadena pesada y la secuencia de CDR2 de cadena pesada y la cadena pesada de secuencia CDR3 de una cadena pesada como se muestra en la Figura 27. Se encontro por los inventores que un anticuerpo o un anticuerpo derivado o un fragmento de anticuerpo, tal como, por ejemplo, un fragmento scFv, Fab, o (Fab)2, que comprende una cadena pesada CDR1, CDR2 y/o la secuencia CDR3 como se muestra en la Figura 27 constituye un compuesto de union de alta afinidad con una alta especificidad para sus protelnas diana.

[0060] En una realizacion preferida adicional, un compuesto de union Lgr5 y/o 6 comprende un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende una secuencia de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se muestra en la Figura 27, y preferiblemente tambien comprende una molecula de cadena pesada de inmunoglobulina complementaria, por lo que las secuencias de CDR se determinan de acuerdo con Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," US Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health, 1987). Preferiblemente, dicho derivado de anticuerpo o anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de cadena ligera CDR1 y la secuencia de cadena ligera CDR2 y la secuencia de cadena ligera CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 27. Se encontro por los inventores que un anticuerpo o un anticuerpo derivado o un fragmento de anticuerpo, tal como, por ejemplo, un fragmento scFv, Fab, o (Fab)2, que comprende una secuencia de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se muestra en la Figura 27 constituye un compuesto de union de alta afinidad con una alta especificidad para sus protelnas diana.

[0061] En una realizacion preferida, un compuesto de union Lgr5 y/o 6 comprende un anticuerpo como se muestra en la Tabla 4 o 5.

[0062] Un metodo de acuerdo con la invencion, en el que un anticuerpo tal como se representa en la Tabla 4 o 5 se utiliza es por lo tanto tambien proporciona la presente, as! como un metodo de acuerdo con la invencion, en el que se utiliza un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos una secuencia de CDR como se muestra en la Figura 27. Preferiblemente, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de CDR1 y CDR2 de una secuencia y una secuencia de CDR3 de una cadena ligera y/o cadena pesada representada en la figura 27.

[0063] En una realizacion especlfica, que comprende un compuesto de union a una cadena pesada y/o una cadena

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ligera de secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se muestra en la Figura 27, es un anticuerpo monoclonal de rata. En una realizacion preferida, un compuesto de union que comprende una cadena pesada y/o una secuencia de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se representa en la Figura 27, es un anticuerpo monoclonal quimerico, desinmunizado, o humanizado. Los metodos para generar un anticuerpo quimerico, desinmunizado, humanizado o monoclonal o derivado o fragmento del mismo que comprende una secuencia de cadena pesada y/o una cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se representa en la Figura 27, son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede ser generado que comprende una region variable de roedor que comprende la secuencia de CDR indicada fusionada a un no roedor, por ejemplo un ser humano, la region constante (Morrison et al 1984. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 81: 6851 a 6855). Los metodos para deinmunizacion de un compuesto de union que comprenden una cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada de secuencia y/o como se representa en la Figura 27 tambien se conocen para un experto, por ejemplo de Giovannoni, 2003. Neurology 61: S13- S17. Humanizacion de un anticuerpo no humano se consigue principalmente a traves de injerto de las regiones CDR de una region de entramado de inmunoglobulina humana tal como se muestra, por ejemplo, en US6548640, US5530101, y US5859205.

[0064] Un anticuerpo humano contra Lgr5 o 6 puede tambien ser generado en un animal provisto con secuencias humanas que codifican un gen de cadena pesada y/o cadena ligera de inmunoglobulina, tales como cepas transgenicas de ratones en los que se suprime la expresion de genes de anticuerpo de raton y se sustituyo efectivamente con expresion de genes de anticuerpos humanos. Los ejemplos son proporcionados por la tecnologla HuMAb®-Mouse de Medarex; la tecnologla TC Mouse™ de Kirin, y la tecnologla KM-Mouse®, un raton cruzado que combina las caracterlsticas de HuMAb-Mouse con el TC Mouse.

[0065] La descripcion describe ademas el uso de un compuesto de union de acuerdo con la invention para la identification o aislamiento de celulas madre a partir de una poblacion de celulas que comprende celulas madre y celulas progenitoras hija comprometidas o diferenciadas; por lo que las celulas madre aisladas comprenden celulas madre pluripotentes puras al menos 50%.

[0066] Otro ejemplo de un compuesto de union Lgr5 o 6 es un ligando Lgr5 o 6. Tal ligando Lgr5 o 6 se pueden utilizar sin modificar, se pueden producir y/o se utilizan como una protelna de fusion (es decir, una protelna de fusion de ligando) o se pueden acoplar a un segundo resto, por ejemplo, permitir la separation celular.

[0067] En una realizacion preferida, la divulgation, por tanto, describe un metodo para obtener (o aislar) las celulas madre que comprenden

- preparar, opcionalmente, una suspension de celulas de una muestra de tejido u organo normal,

- poner en contacto dicha suspension de celulas con un compuesto de union Lgr5 y/o 6

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- opcionalmente aislar las celulas madre a partir de dicho compuesto de union,

en el que dicho compuesto de union Lgr5 y/o 6 es un ligando Lgr5 o 6, por ejemplo una protelna de fusion de ligando.

[0068] La persona experta en la tecnica es capaz de producir una protelna de fusion de ligando Lgr5 o 6, por ejemplo a traves de tecnicas de biologla molecular estandar.

[0069] Un ejemplo adecuado de un Ligando Lgr5 o 6 es un miembro de la familia de peptidos de la insulina, tales como Insl5 o relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una cistelna protelna-nudo tales como noggin, gremlina1 o -2, Dan, o Cerberus. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de estos ligandos son conocidos y el experto en la materia es, pues, por ejemplo capaz de producir una protelna de fusion de ligando.

[0070] Preferiblemente, la segunda fraction de una protelna de fusion de ligando presenta una caracterlstica que permite una facil identificacion y localization de la protelna de fusion, por ejemplo una protelna (fragmento) tal como la cola de anticuerpo Fc o protelna estafilococica A o glutation-S-transferasa, una etiqueta corta de peptido antigenico como el Myc, FLAG o etiqueta HA o una etiqueta de histidina oligomerica, una etiqueta enzimatica, tales como fosfatasa alcalina, un marcador de protelna fluorescente tal como la protelna verde fluorescente. Restos qulmicos pequenos tambien se pueden acoplar con el ligando para la identificacion de celulas madre y/o aislamiento. Estos restos pueden ser reconocidos y unidos por anticuerpos especlficos, o pueden tener afinidad especlfica para que se utilice un material en la separacion de celulas, o puede ser por ejemplo fluorescente. En una realizacion aun mas preferida, la segunda parte de la protelna de fusion se une a un ligando Lgr5 o 6 a traves de un espaciador. Aun mas preferible, dicho separador comprende una secuencia de digestion enzimatica. Esto permite una facil separacion de la segunda fraccion y el ligando Lgr5 o 6.

[0071] Sin embargo, otro ejemplo de un compuesto de union Lgr5 o 6 es un pequeno compuesto que tiene afinidad por Lgr5 o 6.

[0072] En una realizacion preferida, la descripcion de este modo se describe un metodo para obtener (o aislar)

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celulas madre que comprenden

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- opcionalmente aislar las celulas madre a partir de dicho compuesto de union,

en el que dicho compuesto de union Lgr5 o 6 es una pequena molecula con afinidad por Lgr5 o 6. Un ejemplo adecuado es una molecula qulmica pequena o una molecula no qulmica pequena o una pequena protelna.

[0073] En una realization preferida, la afinidad de dicha molecula pequena para Lgr5 o 6 es una alta afinidad, es decir, una afinidad con Kd de al menos 10'7.

[0074] Como ya se ha senalado anteriormente, la invention proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprenden

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tejido u organo normal con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union, y

- opcionalmente aislar las celulas madre a partir de dicho compuesto de union,

en el que dichas celulas son preferiblemente celulas madre (adultas) (de tejido).

[0075] Los ejemplos no limitantes de celulas madre que se pueden obtener a traves de los metodos mencionados anteriormente son piel, intestinal, comprendiendo celulas madre de colon y rectal, ojo, retina, cerebro, mama, follculo piloso, pancreas, estomago, hlgado, pulmon, corazon, adrenal medula, o de ovario. No ha sido previamente posible obtener o aislar celulas madre de estomago, intestinales o de la retina. Por lo tanto, en una realizacion preferida, las celulas madre obtenidas o aisladas son celulas madre de estomago, intestinales o de la retina.

[0076] Dependiendo del adulto deseado y/o de celulas madre de tejido y la presencia o ausencia de Lgr5 y/o 6, un metodo de acuerdo con la invencion se puede realizar con al menos uno, al menos dos, al menos tres o incluso mas (diferentes) compuestos de union. La Tabla 1 proporciona una vision general de la presencia o ausencia de Lgr5 o 6 en diferentes tipos de celulas madre de tejidos y/o adultas. Con base en la Tabla 1 la persona experta en la tecnica es muy bien capaz de seleccionar uno o multiples marcadores de destino y uno o multiples compuestos de union correspondientes y para obtener o aislar celulas madre de un tejido normal en particular o de organos.

Tabla 1: La distribution de los marcadores de celulas madre adultas y/o de tejidos Lgr5 y 6

: marcador

: Lgr5 Lgr6

celula madre

cerebro: + +

rinon: - -

hlgado: + -

pulmon: - +

retina: + -

estomago: + -

intestino: + -

pancreas: + -

testlculo: - -

pecho: + +

follculo capilar: + +

corazon: - +

ovario: + -

medula suprarrenal: + -

piel: + +

vejiga: + -

hueso: + -

tejido conectivo: + +

oldo: + -

musculo: + -

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(continuacion)

prostata: + -

placenta: + -

utero: + +

medula osea: - +

ojo: - +

[0077] Si la persona experta en la tecnica quiere, por ejemplo, obtener celulas madre de mama, un compuesto de union de Lgr5 o 6 puede ser utilizado solo o en cualquier combinacion de los mismos, debido a que las celulas madre de mama comprenden ambos de dichos marcadores.

[0078] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprenden

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tejido u organo normal con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y opcionalmente un compuesto de union Lgr6

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre a partir de dicho compuesto de union,

donde

• dicho compuesto de union Lgr5 y opcionalmente Lgr6 es un compuesto de union Lgr5 y en el que dichas celulas madre son cerebro, hlgado, retina, estomago, intestino, pancreas, ovario, follculo piloso, medula adrenal, piel, vejiga, hueso, oldo, muscular, prostata, placenta o celulas madre mamarias; o

• dicho compuesto de union Lgr5 y opcionalmente Lgr6 es al menos un compuesto de union Lgr6 en combinacion con el compuesto de union Lgr5 en el que dichas celulas madre son cerebro, mama, piel, tejido conjuntivo, utero, o celulas madre del follculo piloso.

[0079] En otra realizacion mas preferida, la descripcion describe un metodo para obtener (o aislar) las celulas madre que comprenden

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

en el que dicha celula madre es cualquiera de las celulas madre identificadas en la Tabla 1 y en el que el compuesto de union Lgr5 y/o 6 utilizado corresponde a las celulas madre deseadas como se muestra en la Tabla 1, con la condicion de que en caso de que la celula madre es intestinal o celulas de follculo del pelo, el Compuesto de union Lgr5 o 6 no se dirigen unicamente a Lgr5 (es decir, no es un compuesto de union Lgr5 solo).

[0080] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprenden

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union, y

en el que se utiliza un compuesto de union.

[0081] En otra realizacion mas preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener (o aislar) las celulas madre que comprenden

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tejido u organo normal con un derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y opcionalmente un compuesto de union Lgr6

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union, y

en el que al menos dos compuestos de union diferentes se ponen en contacto con dicha suspension de celulas.

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Dichos dos compuestos de union diferentes pueden ser dirigidos contra uno y el mismo marcador (es decir, dirigidos a Lgr5). Por ejemplo se puede hacer uso de dos anticuerpos dirigidos a dos epltopos diferentes cuyos anticuerpos proporcion en conjunto (una preferiblemente esencialmente completa) captura de las celulas madre deseadas. Sin embargo, dichos dos compuestos de union diferentes tambien pueden ser dirigidos a dos marcadores de celulas madre diferentes (es decir, un compuesto de union Lgr5 y uno para Lgr6). Cada vez que se hace uso de dos o tres o incluso mas compuestos de union, dichos compuestos de union pueden ser de la misma clase de compuestos de union (por ejemplo, todos los anticuerpos son moleculas pequenas o protelnas de fusion ligando) o pueden ser de diferentes clases de compuestos de union (por ejemplo, un anticuerpo dirigido a Lgr5 y una protelna de fusion de ligando para la union a Lgr6).

[0082] En una realizacion preferida, al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr6 se ponen en contacto con una suspension de celulas.

[0083] Despues de permitir que los compuestos de union interaction con la suspension de celulas (para una cierta cantidad de tiempo o bajo diferentes condiciones tales como pH, temperatura, sal, etc.), la posterior identificacion de complejos unidos obtenidos se realiza. Esto por ejemplo se lleva a cabo por el uso de analisis de FACS. Clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) es un tipo especializado de citometrla de flujo. Se proporciona un metodo para la clasificacion de una mezcla heterogenea de celulas biologicas en dos o mas recipientes, una celula en un momento, en base a la dispersion de la luz especlfica y las caracterlsticas fluorescentes de cada celula. Es un instrumento cientlfico util, al proporcionar una grabacion rapida, objetiva y cuantitativa de las senales fluorescentes a partir de celulas individuales, as! como la separacion flsica de las celulas de interes particular.

[0084] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener (o aislar) las celulas madre que comprenden

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union, y

en el que un FACS se utiliza para identificar y clasificar las celulas que se unen a dicho compuesto de union.

[0085] Otras opciones para el aislamiento de celulas madre utiliza compuestos de union unidos a Lgr5 sobre las celulas madre en relacion con la clasificacion perla magnetica, separacion de celulas por columna de inmunoafinidad.

[0086] Para el analisis por FACS, el compuesto de union esta provisto de una etiqueta de fluorescencia, para su analisis por clasificacion de perla magnetica, el compuesto de union se proporciona con perlas magneticas (por ejemplo una perla magnetica recubierta de anticuerpo), por inmunoafinidad que se une a un soporte solido, para la expansion de las placas de cultivo de tejidos.

[0087] Ahora que sabemos que Lgr5 y/o 6 son marcadores de celulas madre adultas, este conocimiento puede ser utilizado tambien en relacion con el cultivo de celulas madre adultas. Los ligandos de Lgr5 y/o 6, as! como pequenas moleculas agonistas de Lgr5 y/o 6 se pueden utilizar como un estimulador para el crecimiento de celulas madre adultas normales (es decir, sanas, no transformadas, normales).

[0088] La invencion por lo tanto tambien proporciona un metodo para mantener o cultivar celulas madre de tejido o de organos, que comprende la proporcion de celulas madre de tejidos o de organos con un ligando Lgr5 o una pequena agonista molecula de Lgr5, y opcionalmente un ligando Lgr6 o una pequena agonista molecula de Lgr6, y en el que el ligando Lgr5 o pequena agonista molecula es un fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.

[0089] El termino "mantenimiento" se utiliza aqul para describir la situacion donde esencialmente no se cambia el numero de celulas madre. El termino "cultivo" se usa aqul para describir la situacion donde se aumenta la cantidad de celulas madre, es decir, donde se expanden las celulas al tiempo que conserva su fenotipo de celulas madre.

[0090] Despues de proporcionarse las celulas madre de tejidos u organos con un ligando Lgr5 y opcionalmente un ligando Lgr6, las celulas se incuban en cultivo de tejidos en circunstancias (temperatura, medio de cultivo, pH) que permiten el mantenimiento o expansion.

[0091] Las celulas madre se pueden obtener a traves de cualquier metodo adecuado, pero preferiblemente se obtienen por cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, es decir, un metodo para obtener (o aislar) celulas madre que comprenden

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- poner en contacto dicha suspension de celulas con un compuesto de union Lgr5

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre a partir de dicho compuesto de union.

[0092] En una realizacion preferida, la descripcion describe un metodo para mantener o cultivar celulas madre de tejido o de organos, que comprende la proporcion celulas madre de tejido con un Lgr5 y/o 6 de ligando o una pequena agonista molecula de Lgr5 y/o 6, en el que dicho ligando es un miembro de la familia de peptidos de insulina. Un ejemplo adecuado de un ligando Lgr5 o 6 es un miembro de la familia de peptidos de la insulina, tales como Insl5 o relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una protelna de cistelna-nudo tales como Noggin, Gremlina 1 o 2, Dan, o Cerberus.

[0093] En algunas realizaciones, las celulas madre (aisladas), o una coleccion de celulas madre aisladas,

preferiblemente de origen mamlfero y aun mas preferiblemente celulas madre humanas o celulas madre adultas humanas, en el que al menos el 50% de las celulas son Lgr5 o 6 positivas, celulas madre pluripotentes. Preferiblemente, al menos 60% de las celulas son Lgr5 o 6 positivos, celulas madre pluripotentes. Mas

preferiblemente, al menos 70% de las celulas son Lgr5 o 6 positivas, celulas madre pluripotentes. Mas

preferiblemente, al menos 80% de las celulas son Lgr5 o 6 positivas, celulas madre pluripotentes. Mas

preferiblemente, al menos 90% de las celulas son Lgr5 o 6 positivas, celulas madre pluripotentes. Lo mas

preferiblemente, al menos 95% de las celulas son Lgr5 o 6 positivas, celulas madre pluripotentes. La pureza de la coleccion se puede aumentar como se ha indicado anteriormente en este documento. En una realizacion preferida, la invencion proporciona celulas madre (aisladas) o una coleccion de celulas madre aisladas en la que dichas celulas madre contienen compuesto unido Lgr5 de union especlfico y opcionalmente compuesto de union Lgr6, en el que el compuesto de union Lgr5 especlfico es un anticuerpo de union Lgr5 especlfico como se describe en el presente documento anteriormente o un fragmento o derivado del mismo, y el compuesto de union Lgr6 opcional es opcionalmente un anticuerpo de union Lgr6 especlfico como se describe anteriormente en este documento o un fragmento o derivado del mismo. La invencion proporciona ademas un cultivo de celulas madre que comprende un anticuerpo de union especlfico para Lgr5 y/o Lgr6 o un fragmento especlfico de al menos 20 aminoacidos de dicho anticuerpo de union Lgr5 y/o Lgr6.

[0094] En una realizacion preferida, dichas celulas madre son, o dicho conjunto de celulas madre incluye, cerebro, hlgado, retina, estomago, intestino incluyendo el colon y rectal, ovario, medula adrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, celulas de la prostata, placenta, utero, de mama o madre que comprenden Lgr5 en su membrana celular.

[0095] Tambien se describen celulas madre, o una coleccion de celulas madre que comprenden, cerebro, pulmon, piel, mama, follculo piloso, tejido conectivo, utero, medula osea, ojos o celulas madre del corazon que comprenden Lgr6 en su membrana celular.

[0096] En una forma de realizacion preferida, dichas celulas madre son, o dicha coleccion de celulas madre comprende celulas madre de cerebro, mama, tejido o utero que comprenden Lgr5, as! como Lgr6 en su membrana celular.

[0097] En otra realizacion mas, la invencion proporciona celulas madre, o una coleccion de celulas madre en el que al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95% de las celulas son Lgr5, las celulas madre positivas Lgr6 positivas y, opcionalmente, obtenible por un metodo segun la invencion, es decir,

(i) un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ y/o

(ii) un metodo para mantener o cultivar celulas madre de tejido.

[0098] Las celulas madre, o la coleccion de celulas madre, aisladas de acuerdo con la invencion se pueden usar como un agente terapeutico para el tratamiento de enfermedades en las que se ha visto afectado el tejido correspondiente. Sin embargo, las celulas madre obtenidas son tambien muy utiles para otros fines.

[0099] En otra realizacion util, la invencion proporciona el uso de celulas madre, o una coleccion de celulas madre, tal como se obtiene por cualquiera de los metodos descritos aqul, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de tejido danado o enfermo.

[0100] Preferiblemente, dichas celulas madre son celulas madre humanas. Incluso mas preferiblemente, el aceptor es humano tambien. La Tabla 2 proporciona una vision general de las diferentes celulas madre y las enfermedades en las que se pueden utilizar terapeuticamente.

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Tabla 2. Las aplicaciones terapeuticas para uso de celulas madre Lgr5+ y/o Lgr6+

celulas madre: Aplicacion terapeutica

cerebro: El dano cerebral tal como el infarto y la lesion cerebral traumatica. Enfermedades degenerativas como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington

rinon: Insuficiencia renal cronica o aguda

higado: Insuficiencia hepatica cronica, por ejemplo debido a los danos por agentes infecciosos, productos quimicos incluyendo el alcohol o trastornos metabolicos

pulmon: EPOC, fibrosis

retina: Ceguera y degradaciones de vision debidas a defectos en la retina

estomago: Anemia perniciosa

Intestinal, colon, rectal y colorrectal: Enfermedad de Crohn, danos en el tejido, resultante de quimioterapia u otros agentes toxicos,

pancreas: Diabetes

testiculo: Esterilidad

mama: Reconstruccion mamaria

corazon: Enfermedades del corazon como la insuficiencia cardiaca congestiva

ovario: Esterilidad

Medula suprarrenal: Enfermedad de Addison

[0101] Por lo tanto, la invencion proporciona un uso de celulas madre, o una coleccion de celulas madre, tal como se obtiene por cualquiera de los metodos descritos aqui, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de tejidos danados o enfermos,

- en el que dichas celulas madre son celulas madre intestinales y en el que dicho tejido es el dano al epitelio intestinal, dano al higado o danos en el pancreas o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre de la retina y en el que el dano tisular es retina danada; este enfoque es util en el tratamiento de la ceguera debida a defectos en la retina; o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre del cerebro; o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre de mama; o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre de estomago; o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre del higado; o

- en el que dichas celulas madre son celulas madre de ovario; o

- en el que dichas celulas madre son celulas de cualquiera de las mencionadas en la Tabla 2 y la enfermedad a tratar, se menciona como la aplicacion terapeutica correspondiente en el cuadro 2, por ejemplo, las celulas madre son celulas madre de la retina y la enfermedad es ceguera debida a defectos en la retina.

[0102] La terapia genica, ademas, puede utilizarse en un metodo dirigido a la reparacion de tejido danado o enfermo. El uso puede, por ejemplo, estar hecho de un vehiculo de suministro de genes adenovirales o retrovirales para entregar la informacion genetica (como el ADN y/o ARN) a las celulas madre. Un experto en la materia puede reemplazar o reparar determinados genes especificos en la terapia genica. Por ejemplo, un gen normal se puede insertar en una ubicacion especifica dentro del genoma para reemplazar un gen no funcional. Este enfoque es comun. En otro ejemplo, un gen anormal podria ser cambiado por un gen normal a traves de recombinacion homologa o un gen anormal podria ser reparado a traves de mutacion inversa selectiva, que devuelve el gen a su funcion normal. Un ejemplo adicional esta alterando la regulacion (el grado en que un gen esta encendido o apagado) de un gen particular. Preferiblemente, las celulas madre ex vivo son tratadas por un enfoque de la terapia de genes y se transfieren posteriormente al mamifero (preferiblemente un ser humano) en necesidad de tratamiento.

[0103] Por lo tanto, la invencion tambien proporciona un metodo para modificar una secuencia genomica de una celula madre, que comprende la proporcion de una coleccion de celulas madre de acuerdo con un metodo de la invencion, contactando dicha coleccion con un acido nucleico para modificar una secuencia genomica, y el aislamiento de una celula madre en el que una secuencia genomica ha sido modificada. La invencion proporciona ademas un metodo para modificar una secuencia genomica de una celula de tejido que comprende la proporcion de una coleccion de celulas de tejido in vitro con una secuencia de acido nucleico para la modificacion de dicha secuencia genomica, que comprende ademas el aislamiento de una celula madre a partir de dicha coleccion de celulas de tejido de acuerdo con un metodo de la invencion.

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[0104] La invencion proporciona ademas, celulas madre genomicamente modificadas aisladas que pueden

obtenerse por un metodo de la invencion, y donde al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, mas

preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95% de las celulas son celulas madre pluripotentes que pueden retener un fenotipo indiferenciado. La invencion proporciona ademas, celulas madre genomicamente modificadas aisladas que pueden obtenerse por un metodo de la invencion, y donde al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, mas

preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95% de las celulas son celulas adultas y/o madre de tejido como se define aqul.

[0105] En otra realizacion util, la invencion proporciona el uso de celulas madre como se obtiene mediante

cualquiera de los metodos descritos aqul, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de tejido danado

o enfermo, que comprende ademas modificar geneticamente dichas celulas madre preferiblemente ex vivo y/o preferiblemente por un enfoque de terapia genica. La invencion proporciona ademas una composicion para el tratamiento de dano en el tejido u organo que comprende celulas madre aisladas genomicamente modificadas de acuerdo con la invencion.

[0106] En aun una realizacion alternativa, la invencion proporciona una composicion para el tratamiento del dano de tejido que comprende celulas madre de tejido puede obtenerse mediante un metodo de acuerdo con la invencion, es decir,

(i) un metodo para obtener celulas madre Lgr5+, y/o

(ii) un metodo para mantener o cultivar celulas madre de tejido.

[0107] Las celulas madre de la invencion son tambien muy utiles para fines de investigacion. Ejemplos de fines de investigacion adecuados son aun mas la identificacion de marcadores de celulas madre o el desarrollo de la terapia genica con las celulas madre de la invencion como una diana o cualquier otro proposito de la investigacion.

[0108] La descripcion describe ademas un uso de Lgr5 y/o 6 como un marcador para el aislamiento de celulas madre de tejido, as! como el uso de un compuesto de union Lgr5 y/o 6 para el aislamiento de celulas madre de tejido.

[0109] La invencion proporciona ademas una coleccion de celulas madre de acuerdo con la invencion para uso en un metodo para tratar a un individuo en necesidad del mismo que comprende la administracion a dicho individuo de una cantidad suficiente de celulas madre.

[0110] La descripcion describe ademas un animal recombinante que comprende un primer gen reportero bajo control de un promotor Lgr5 o Lgr6 tal que el producto del gen informador se expresa en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, una secuencia que codifica una protelna regulable estando en un enlace operable con el primer gen informador tal que la protelna regulable se co-expresa con el primer producto del gen informador en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, y un segundo gen indicador que se expresa tras la activacion de la protelna regulable.

[0111] Un animal recombinante permite la tincion de celulas madre de tejido o de organos con dicho primer reportero, y permite la tincion de celulas hija no de celulas madre tales como las celulas hija progenitoras comprometidas o diferenciados con el segundo producto del gen indicador despues de la activacion de la protelna regulable.

[0112] El gen reportero es un gen que codifica un producto que puede ser facilmente ensayado. Los genes indicadores se usan tlpicamente para determinar si una construction de acido nucleico particular se ha introducido con exito en una celula, organo o tejido y/o para detectar especlficamente la celula donde se ha introducido el gen indicador y se expresa. El producto de expresion es tlpicamente unico en el sentido de que las celulas no modificadas o celulas que no expresan el gen indicador no se detectan especlficamente. Un gen informador tambien se refiere como un gen marcador. Cuando se utilizan dos o mas genes indicadores, los diferentes genes indicadores no son normalmente iguales, en el sentido de que sus productos de expresion pueden ser facilmente distinguidos unos de otros. Asl, un primer y un segundo gen indicador tlpicamente no son los mismos. Una protelna regulable como se usa aqul es una protelna que, en la presencia de una senal, altera su funcion. Muchas protelnas diferentes regulables se han identificado y/o generadado artificialmente. Un ejemplo bien conocido es el sistema de tet-represor donde la presencia o ausencia de tetraciclina o un analogo del mismo regula la actividad de tet-operon mediante la regulation de la capacidad de union de la protelna tet-represora a la secuencia de union tet-represora. En este ejemplo la protelna tet-represora es la protelna regulable y la presencia o ausencia de tetraciclina es la senal. Aunque el sistema de tet-represor es bien conocido, existen muchas otras protelnas regulables.

[0113] Co expresion de dos o mas protelnas en una celula es actualmente muy comun. Las protelnas de fusion se pueden generar. Preferiblemente se usa un multi-cistron. Esto se logra actualmente tlpicamente usando al menos un asl llamado sitio de entrada ribosomal interno (IRES). Los metodos alternativos incluyen el uso de sitios de reinitiation y/o corte y empalme alternativo de un ARN que contiene dos o mas marcos de lectura abiertos.

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[0114] La descripcion tambien describe una celula madre recombinante que comprende un primer gen reportero bajo control de un promotor Lgr5 o Lgr6 tal que el producto del gen informador se expresa en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, una secuencia que codifica una protelna regulable esta en un enlace operable con el primer gen informador tal que la protelna regulable se co-expresa con dl primera producto del gen informador en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, y un segundo gen indicador que se expresa tras la activacion de la protelna regulable.

[0115] Dicha celula madre puede ser generada a partir de una celula madre aislada, o preferiblemente se alsla de un animal recombinante.

[0116] Dicha protelna regulable preferiblemente es CRE-ERT2, que puede ser activada mediante la administracion de un estrogeno o analogo del mismo, tales como el tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno. En esta realizacion preferida, la expresion del segundo gen informador es regulada por CRE-ERT2 activado a traves de la elimination de una secuencia de represor que evita la expresion del segundo gen reportero en el estado inactivo. Dicho primer producto de gen reportero puede ser una protelna fluorescente tal como la protelna verde fluorescente, o la protelna verde fluorescente mas preferida. En una realizacion preferida adicional, dicho segundo gen reportero comprende LacZ, que codifica beta-galactosidasa que puede identificarse mediante la provision de un sustrato adecuado tal como X- gal. Dicho segundo gen reportero se inserta preferiblemente en una region genomica que proporciona robusta expresion, prolongada del transgen despues de la activacion, tal como el locus ROSA si el animal transgenico es un raton.

[0117] La descripcion describe un animal recombinante que comprende los acidos nucleicos tal como se especifica en los ejemplos en el contexto del animal recombinante para el rastreo de las celulas madre descritas.

[0118] Dicho animal recombinante es preferiblemente un animal no humano, preferiblemente un mamlfero, mas preferiblemente un roedor. Mas preferiblemente una rata o un raton.

[0119] La descripcion describe ademas el uso de un animal recombinante o una celula madre recombinante para el rastreo de las celulas madre y los descendientes de una celula madre.

[0120] La descripcion tambien describe un metodo para la identification de los descendientes de una celula madre, que comprende la proportion de un animal recombinante o de celulas madre recombinante, la activacion de la protelna regulable, y la identificacion de las celulas que no expresan Lgr5 y/o 6 y el primer reportero, y expresan la segunda protelna reportera.

[0121] Los presentes inventores describen que la expresion de Lgr5 (tambien conocido como Grp49), as! como la expresion de Lgr6 no solo marcan las celulas madre adultas, pero tambien marcan las celulas madre cancerosas en multiples tumores diferentes.

[0122] En otra realizacion mas, la invention proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+ que comprenden

- preparar, opcionalmente, una suspension de celulas de una muestra de tumor solido o llquido

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tumor solido o llquido con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5

- la identificacion de las celulas unidas a dicho compuesto de union; y

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union.

[0123] Preferiblemente, dichas celulas madre cancerosas estan involucradas en el cancer intestinal, incluyendo cancer de colon, rectal y colorrectal, cancer de piel tal como el carcinoma de celulas basales, cancer de esofago, cancer de mama, cancer de prostata, el meduloblastoma y otros canceres de cerebro, cancer de hlgado, cancer de estomago, retina, cancer de cabeza y cuello, cancer testicular, follculo piloso, cancer de ovario, cancer adrenal medulla (feocromocitoma) o cancer de pulmon. Por lo tanto, en una realizacion preferida, dichas celulas madre cancerosas son celulas madre cancerosas intestinales, incluyendo las celulas madre cancerosas de colon, rectal y colorrectal, celulas madre cancerosas de piel, tales como las celulas basales. El carcinoma de celulas madre, celulas madre cancerosas de esofago, celulas madre cancerosas de mama, las celulas madre cancerosas de prostata, las celulas madre de meduloblastoma y otras celulas madre cancerosas de cerebro, celulas madre cancerosas de hlgado, celulas madre cancerosas de estomago, las celulas madre de la retina, las celulas madre de cancer de cabeza y cuello, celulas madre cancerosas testiculares, cancer de celulas madre del follculo piloso, celulas madre de cancer de ovario, celulas madre de feocromocitoma, o celulas madre cancerosas de pulmon.

[0124] Como se ha mencionado, hay cierta confusion en la literatura en cuanto a la definition de una celula madre cancerosa. En este documento, seguimos el consenso alcanzado en un taller reciente AACR (14), que establece que el cancer de celulas madre "es una celula dentro de un tumor que posee la capacidad de auto-renovacion y para causar los linajes heterogeneos de celulas cancerosas que componen celulas madre cancerosas de tumor. Solo asf puede definirse experimentalmente por su capacidad para recapitular la generacion de un tumor en continuo crecimiento". Los terminos alternativos en la literatura incluyen celulas iniciadoras de tumores y celulas

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tumorigenicas. Los ensayos para la actividad de las celulas madre cancerosas necesitan preferentemente abordar el potencial de auto-renovacion y la propagacion del tumor. El ensayo de patron oro actualmente es de serie xenotrasplante en ratones inmunodeficientes.

[0125] Una muestra de tumor solido es, por ejemplo obtenida a traves de la biopsia o tecnicas quirurgicas y una muestra de tumor llquido es por ejemplo obtenida a partir de una sangre, orina, llquido cefalorraquldeo o una muestra de linfa de un mamlfero, preferiblemente un ser humano

[0126] El tejido u organo del que se toman muestras es por ejemplo el colon, mama, prostata, cerebro, hlgado, estomago o pulmon.

[0127] Para obtener informacion con respecto a Lgr5 o 6, las partes anteriores de esta aplicacion pueden ser consideradas.

[0128] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+, o una coleccion de las celulas madre cancerosas, que comprende

- la identificacion de las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que dichas celulas madre cancerosas son de mamlfero, preferiblemente humanas, celulas madre cancerosas, y en el que la recogida de celulas madre cancerosas comprende al menos 50% celulas madre cancerosas, que son capaces de recapitular la generacion de un tumor en continuo crecimiento. En una realizacion preferida, dicha coleccion de celulas madre cancerosas comprende al menos 60% celulas madre cancerosas, preferiblemente al menos 70% de celulas madre cancerosas, mas preferiblemente 80% celulas madre cancerosas, mas preferiblemente 90% celulas madre cancerosas, mas preferiblemente 95% celulas madre cancerosas que son capaces de recapitular la generacion de un tumor en continuo crecimiento.

[0129] La medula osea y la sangre (espinal) pueden considerarse suspensiones de celulas naturales. De los tumores solidos, las suspensiones de celulas se pueden obtener por ejemplo mediante la rotura mecanica de tejidos de organos en pequenos fragmentos. Estos fragmentos pueden despues opcionalmente estar mas segregados en celulas individuales por los productos qulmicos tales como EDTA y/o por digestion enzimatica con, por ejemplo, las preparaciones de enzima dispasa, colagenasa o pancreatina. El procedimiento puede implicar tejido o cultivo de celulas antes, durante o despues de la interrupcion y/o procedimientos de digestion enzimatica.

[0130] Cuando una suspension celular ya esta disponible este paso del metodo se puede omitir (caracterlstica opcional).

[0131] Como no siempre es necesario aislar las celulas madre cancerosas a partir del compuesto de union utilizado, dicho paso se presenta como una caracterlstica opcional. Cuando es necesario aislar las celulas madre cancerosas del compuesto de union Lgr5 o 6, esto se puede realizar por varios metodos bien conocidos por personas expertas. Ejemplos adecuados son agitacion (mecanica), digestion enzimatica, adicion de exceso de compuesto de union o un derivado del mismo, delucion por cambio de pH o concentracion de sal.

[0132] Ahora que los inventores han demostrado que Lgr5 o 6 son marcadores de celulas madre cancerosas, los compuestos que son capaces de unirse a Lgr5 o 6 (es decir, compuestos de union Lgr5 o 6) se pueden utilizar para identificar, marcar y aislar las celulas madre cancerosas .

[0133] Un ejemplo adecuado de un compuesto de union Lgr5 o 6 es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 o 6, es decir, un anticuerpo o un derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5 o 6. Como Lgr5 y 6 son protelnas de superficie transmembranas, un anticuerpo tal o un derivado o un fragmento que tiene preferiblemente afinidad por la parte de la protelna que se orienta externamente, es decir, se une a cualquier parte extracelular de dicha protelna.

[0134] En una realizacion preferida, dicho anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad por Lgr5 y/o 6, es decir, una afinidad con una Kd de al menos 10-7. Preferiblemente, la afinidad es < 10-9. Sin embargo, afinidades de alrededor de 10-8 tambien se pueden utilizar.

[0135] Por lo tanto, en una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+ que comprenden

- poner en contacto una suspension celular con un compuesto de union Lgr5 y opcionalmente Lgr6

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

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- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que dicho compuesto de union Lgr5 y Lgr6 es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 o 6.

[0136] Los anticuerpos o sus derivados o sus fragmentos se pueden proporcionar por metodos que son bien conocidos para el experto en la tecnica e incluyen la tecnica del hibridoma, unica cadena de anticuerpos/tecnologla de visualizacion de fagos.

[0137] Como ejemplos no limitantes, la parte experimental describe anticuerpos Lgr5-especlficos y Lgr6-especlficos. Un metodo de acuerdo con la invencion, en el que un anticuerpo tal como se representa en la Tabla 4 o 5, se proporciona por lo tanto tambien en el presente documento, as! como un metodo de acuerdo con la invencion, en el que un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se utiliza que comprende al menos una secuencia CDR tal como se representa en la Figura 27. Preferiblemente, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de CDR1 y CDR2 de una secuencia y una secuencia de CDR3 de una cadena ligera y/o cadena pesada representada en la Figura 27.

[0138] Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos adecuados son scFv, Fab. Ejemplos de derivados adecuados son lEs quimericos anticuerpos, nanocuerpos, anticuerpos bifuncionales o anticuerpos humanizados. En aun otra realizacion preferida, el anticuerpo utilizado es un anticuerpo monoclonal.

[0139] Otro ejemplo de un compuesto de union Lgr5 o 6 de la divulgacion es un ligando Lgr5 o 6 que se puede utilizar sin modificar, pero tambien pueden producirse y/o emplearse como protelna de fusion o puede acoplarse a un segundo resto para permitir separation de celulas.

[0140] La divulgacion, por tanto, describe un metodo para obtener (o aislar) celulas madre cancerosas que comprenden

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que dicho compuesto de union Lgr5 o 6 es un Ligando Lgr5 o 6.

[0141] La persona experta en la tecnica es muy bien capaz de producir una protelna de fusion de ligando LGR5 o 6, por ejemplo a traves de tecnicas de biologla molecular estandar.

[0142] Un ejemplo adecuado de un Ligando Lgr5 o 6 es un miembro de la familia de peptidos de la insulina, tales como Insl5 o relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una protelna-cistelna-nudo tales como Noggin, Gremlina, Dan, o Cerberus. Basandose en las secuencias de nucleotidos y aminoacidos conocidos y publicados de estos ligandos, la preparation de una protelna de fusion esta dentro de las capacidades de la persona experta en la tecnica.

[0143] Preferiblemente, el segundo resto presenta una caracterlstica que permite una facil identification y localization de la protelna de fusion, por ejemplo una protelna (fragmento) tal como la cola de anticuerpo Fc o protelna estafilococica A o glutation-S-transferasa, una etiqueta de peptido antigenico corto tal como etiqueta Myc, FLAG o HA o una etiqueta de histidina oligomerica, una etiqueta enzimatica, tales como fosfatasa alcalina, una etiqueta de protelnas fluorescentes (como la protelna verde fluorescente). Restos qulmicos pequenos tambien se pueden acoplar con el ligando para la identificacion y/o aislamiento de celulas madre cancerosas. Estos restos pueden ser reconocidos y unidos por anticuerpos especlficos, o pueden tener afinidad especlfica para un material para ser utilizado en la separacion de celulas, o puede ser por ejemplo propiedades fluorescentes, radiactivas o magneticas. En una realizacion aun mas preferida, la segunda parte de la protelna de fusion se une a dicho ligando Lgr5 o 6 a traves de un espaciador. Aun mas preferible, dicho separador comprende una secuencia de digestion enzimatica. Esto permite una facil separacion de la segunda fraction y el ligando Lgr5 o 6.

[0144] Sin embargo, otro ejemplo de un compuesto de union Lgr5 o 6 es un pequeno compuesto que tiene afinidad por Lgr5 o 6.

[0145] La divulgacion de este modo se describe un metodo para obtener (o aislar) celulas madre cancerosas que comprenden

- identificar u obtener las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que dicho compuesto de union Lgr5 y/o 6 una pequena molecula con afinidad por Lgr5 y/o 6. Dicha molecula pequena es por ejemplo un peptido sintetico o un compuesto qulmico pequeno.

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[0146] En una realizacion preferida, la afinidad de dicha molecula pequena para Lgr5 o 6 es un alto, es decir, una afinidad con una Kd de al menos 10'7.

[0147] Tal molecula pequena esta acoplada opcionalmente a un segundo resto que presenta una caracterlstica que permite una facil identificacion y localization de la protelna de fusion, por ejemplo una protelna (fragmento) tal como la cola de anticuerpo Fc o protelna de estafilococos A o glutation-S-transferasa, una etiqueta de peptido antigenico corto como la etiqueta de Myc, FLAG o HA o una etiqueta de histidina oligomerica, una etiqueta enzimatica tal como la fosfatasa alcalina, un marcador de protelna fluorescente tal como la protelna fluorescente verde).

[0148] Dependiendo de la celula madre cancerosa deseada y la presencia ahora conocida o ausencia de Lgr5 o 6, un metodo de acuerdo con la invention puede utilizar al menos uno, al menos dos, al menos tres o incluso mas compuestos de union (diferentes). La Tabla 3 proporciona una vision general de la presencia o ausencia de Lgr5 o 6 en los diferentes tipos de tumores. Con base en esta Tabla por el experto en la tecnica es muy bien capaz de seleccionar uno o multiples marcadores de destino y uno o multiples compuestos de union correspondientes y por lo tanto capaces de obtener o aislar celulas madre cancerosas.

Tabla 3: La distribution de los marcadores de celulas madre Lgr5 y 6 en los tumores. Los datos se derivan de la comparacion de expresion de Lgr5 o Lgr6 en tejidos normales frente a tumorales por el analisis de microarrays

(GeneLogic) o por PCR cuantitativa.

: Marcador

LGR5: Lgr6

Celulas madre cancerosas

cerebro: + +

rinon: - -

hlgado: + -

pulmon: - +

retina: + -

estomago: + -

Colon/recto: + +

cabeza y cuello: + +

testlculo: + +

mama: + +

follculo capilar: + +

prostata: + +

ovario: + +

piel: + +

leucemia: + -

condrosarcoma: + +

musculo/tejido blando: + -

utero: + +

retinoblastoma: - +

[0149] Si la persona experta en la tecnica quiere obtener celulas madre cancerosas de mama, un compuesto de union de Lgr5 o 6 se puede utilizar solo o en cualquier combination de los mismos, debido a que las celulas madre cancerosas de mama comprenden ambos de dichos marcadores.

[0150] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+ que comprenden

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tumor solido o llquido con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y opcionalmente un compuesto de union Lgr6

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union,

donde

• dicho compuesto de union Lgr5 o 6 es un compuesto de union Lgr5 y en el que dichas celulas madre cancerosas son cerebro, hlgado, retina, estomago, colon, cabeza y/o cuello, testlculo, prostata, ovario, piel, follculo piloso, leucemia, condrosarcoma, musculo/tejido blando, celulas del utero, de mama o celulas madre no alcoholicas; o

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• dicho compuesto de union Lgr5 o 6 es al menos un compuesto de union Lgr6 en combinacion con al menos un compuesto de union Lgr5 y en el que dichas celulas madre cancerosas son cerebro, piel, cabeza y/o cuello, testlculo, mama, prostata, ovario, condrosarcoma, utero, o celulas madre del follculo piloso.

[0151] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+ que comprenden

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que se utiliza un compuesto de union.

[0152] En otra realizacion mas preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener (o aislar) celulas madre cancerosas que comprenden

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto, en el que al menos dos compuestos de union diferentes se ponen en contacto con dicha suspension de celulas. Dichos dos compuestos de union diferentes pueden ser dirigidos contra uno y el mismo marcador (dirigidos a Lgr5). Por ejemplo, se puede hacer uso de dos anticuerpos dirigidos a dos epltopos cuyos anticuerpos en conjunto proporcionan una captura (preferiblemente esencialmente completa) de las celulas madre deseadas. Sin embargo, dichos dos compuestos de union diferentes tambien pueden ser dirigidos a dos marcadores de celulas madre diferentes (por ejemplo a Lgr6 y Lgr5). Cada vez que se hace uso de dos o tres o incluso mas compuestos de union, dichos compuestos de union pueden ser de la misma clase de compuestos de union (por ejemplo, todos los anticuerpos son, moleculas pequenas o ligando (protelnas de fusion)) o puede ser de diferentes clases de compuestos de union (por ejemplo un anticuerpo dirigido a Lgr5 y una protelna de fusion de ligando para la union a Lgr6).

[0153] En una realizacion preferida, al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr6 ponen en contacto con una suspension de celulas.

[0154] Despues de dejar que los compuestos de union interactuan con la suspension de celulas (para una cierta cantidad de tiempo o bajo diferentes condiciones tales como pH, temperatura, sal, etc.), la posterior identificacion de los complejos unidos obtenidos se realiza. Esto, por ejemplo, se lleva a cabo por el uso de analisis de FACS. Clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) es un tipo especializado de citometrla de flujo. Se proporciona un metodo para la clasificacion de una mezcla heterogenea de celulas biologicas en dos o mas recipientes, una celula tras otra, en base a la dispersion de la luz especlfica y las caracterlsticas fluorescentes de cada celula. Es un instrumento cientlfico util, ya que proporciona una grabacion rapida, objetiva y cuantitativa de las senales fluorescentes a partir de celulas individuales, as! como la separation flsica de las celulas de interes particular.

[0155] En una realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+, o una coleccion de celulas madre cancerosas Lgr5+, que comprende

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto de union

- aislar, opcionalmente, las celulas madre cancerosas de dicho compuesto de union, en el que un FACS se utiliza para identificar y clasificar las celulas que se unen a un Compuesto de union Lgr5 y/o 6, y en el que dicha coleccion comprende al menos 50% de las celulas madre cancerosas que son capaces de recapitular la generation de un tumor en continuo crecimiento. Preferiblemente, dicha coleccion comprende al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95% de las celulas madre cancerosas que son capaces de recapitular la generacion de una en continuo crecimiento tumoral.

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[0156] Otras opciones para la identificacion de los complejos unidos son la clasificacion magnetica de perlas, separacion celular de columna de (inmuno)afinidad, o paneo de (inmuno)afinidad.

[0157] Para el analisis por FACS, el compuesto de union esta provisto preferiblemente de una etiqueta de fluorescencia, para su analisis por clasificacion de perla magnetica el compuesto de union esta provisto preferiblemente de perlas magneticas (por ejemplo una perla magnetica recubierta de anticuerpos).

[0158] En otra realization mas, la invention proporciona (una coleccion de) celulas madre cancerosas que comprenden Lgr5 y Lgr6 opcionalmente integradas en su membrana celular, en la que dicha coleccion comprende al menos 50% de las celulas madre cancerosas que son capaces de recapitular la generation de un tumor en continuo crecimiento. En una realizacion preferida, dicha coleccion comprende celulas madre cancerosas puras de al menos 60%, preferiblemente celulas madre cancerosas puras al menos 70%, mas preferiblemente celulas madre cancerosas puras al menos 80%, mas preferiblemente celulas madre cancerosas puras al menos 90%, mas preferiblemente al menos celulas madre cancerosas puras 95%. Mas preferiblemente dicha coleccion se compone de celulas madre (cancerosas) con la pureza indicada. Tal coleccion de celulas madre cancerosas es por ejemplo obtenida por un metodo como se describe aqul, es decir, un metodo para obtener celulas madre cancerosas Lgr5+.

[0159] Los ejemplos de celulas madre cancerosas que se pueden obtener a traves de los metodos mencionados anteriormente son celulas madre cancerosas de colon, recto, intestino, piel, retina, cerebro, mama, testlculo, follculo piloso, de estomago, de cabeza y/o cuello, hlgado, pulmon, prostata, esofago, medula adrenal, corazon o de ovario.

[0160] Si es necesario, dichas celulas madre cancerosas se mantienen o se multiplican (se expanden) por cultivo de dichas celulas en presencia de un Ligando Lgr5 y/o 6 bajo condiciones ambientales apropiadas (por ejemplo pH y temperatura). Un ejemplo adecuado de un ligando Lgr5 o 6 es un miembro de la familia de peptidos de la insulina, tales como Insl5 o relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una protelna-cistelna-nudo tales como Noggin, Gremlina, Dan, o Cerberus.

[0161] Por lo tanto, en otra realizacion, la description describe un metodo para mantener o el cultivo de celulas madre cancerosas, que comprende la proportion de celulas madre cancerosas con un ligando Lgr5 y/o 6 o una pequena molecula de union de Lgr5 o 6.

[0162] La invencion proporciona ademas un conjunto de celulas madre (aisladas) cancerosas de la invencion comprende ademas un compuesto de union Lgr5 y/o Lgr6 asociado con Lgr5 y/o Lgr6 expresado por dichas celulas madre cancerosas. La invencion proporciona ademas un cultivo de celulas madre (aisladas) cancerosas que comprenden un compuesto de union Lgr5 y/o Lgr6. Preferiblemente, dicho compuesto de union Lgr5 y/o Lgr6 es un anticuerpo de union Lgr5 y/o Lgr6 especlfico o un fragmento o derivado del mismo.

[0163] En una realizacion preferida, la descripcion describe una celula madre de tumor recombinante, aislado de acuerdo con un metodo de la invencion, que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor Lgr5 o Lgr6 tal que el producto del gen informador se expresa en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6. Una construction de gen informador, en el que el gen indicador esta unido operativamente a un promotor Lgr5 o Lgr6, se puede insertar en el genoma de un aislado de celulas madre de tumor. Alternativamente, dicha construccion de gen indicador se puede proporcionar, por ejemplo, a traves de la infection de una celula madre de tumor con un vector adenoviral que comprende la construccion del gen reportero. Metodos para la insertion de una construccion de gen informador en el genoma de una celula son conocidos para una persona experta, e incluyen la insercion aleatoria, por ejemplo mediante insercion de un retrovirus que comprende el constructo de gen indicador, o a traves de recombination homologa.

[0164] En una realizacion preferida adicional, la descripcion describe una celula madre recombinante que comprende un primer gen reportero bajo control de un promotor Lgr5 o Lgr6 tal que el producto del gen informador se expresa en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, una secuencia que codifica una protelna regulable estando en una union operativa con el primer gen informador tal que la protelna regulable es co-expresada con el primer producto del gen informador en celulas que expresan Lgr5 o Lgr6, y un segundo gen indicador que se expresa tras la activation de la protelna regulable.

[0165] Dicho primer producto genico reportero preferiblemente es una protelna fluorescente tal como la protelna verde fluorescente, o la protelna verde fluorescente mas preferida. Dicha protelna regulable preferiblemente es CRE-ERT2. El segundo gen informador comprende preferiblemente LacZ.

[0166] Celulas madre cancerosas aisladas (y, opcionalmente, cultivadas) son, por ejemplo utiles para el analisis adicional de tales celulas en, por ejemplo, biologla molecular bioqulmica o nivel marcador,.

[0167] Por otra parte, las celulas madre aisladas cancerosas tambien son muy utiles en la identificacion de compuestos que se pueden utilizar en el tratamiento del cancer, especialmente la terapia de celulas madre cancerosas. En base al conocimiento de que Lgr5 y/o 6 se insertan en la membrana celular de las celulas madre cancerosas, los compuestos capaces de inhibir, bloquear o unir Lgr5 y/o 6 pueden disenarse y prepararse. Tales

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compuestos posteriormente pueden ser puestos a prueba por su capacidad de matar o bloquean funcionalmente o inhiben celulas madre cancerosas que comprenden Lgr5 y/o 6 en sus membranas celulares.

[0168] Las celulas madre tumorales recombinantes son particularmente preferidas para la identificacion de compuestos, ya que su presencia puede ser facilmente monitorizada despues de la adicion de un compuesto. Dichas celulas madre tumorales recombinantes son adecuadas para su uso en ensayos de un alto rendimiento, donde multiples compuestos se ponen a prueba de una manera rentable.

[0169] En otra realizacion, la divulgacion de este modo describe un metodo para poner a prueba el efecto de un posible compuesto de celulas madre anti cancer comprende poner en contacto (tratar) un conjunto de celulas madre cancerosas de acuerdo con la invencion in vitro con dicho posible compuesto de celulas madre anti cancer y comprobar si dichas celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor en continuo crecimiento y en el que dicho posible compuesto de celulas madre cancerosas preferiblemente esta disenado como un inhibidor Lgr5 o 6 o como un compuesto de union Lgr5 o 6.

[0170] En aun otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para comprobar el efecto de un posible compuesto anti cancer de celulas madre comprende poner en contacto una coleccion de celulas madre cancerosas de acuerdo con la invencion in vitro con dicho posible compuesto de celulas madre anti cancer y comprobando si dichas celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor de crecimiento continuo, que comprende ademas la puesta en contacto de dicho posible compuesto de celulas madre anti cancer con un tejido de celulas madre de organos y seleccionar un compuesto que afecta especlficamente a las celulas madre tumorales.

[0171] Las celulas madre cancerosas utilizadas en este metodo comprenden Lgr5 y opcionalmente Lgr6 en su membrana celular o se pueden obtener por un metodo de la invencion.

[0172] Los compuestos a ensayarse puede por ejemplo obtenerse a partir de una biblioteca de compuestos (pequena) o pueden especlficamente disenarse en base al conocimiento (estructural) de Lgr5 o 6 o en el conocimiento (estructural) de un ligando (natural) de Lgr5 o 6.

[0173] Los compuestos de celulas madre anti cancer seran discutidos en mas detalle a continuacion.

[0174] En una realizacion adicional adicional, la descripcion describe un inhibidor Lgr5 o 6 o un compuesto de union Lgr5 o 6. Preferiblemente dicho inhibidor o compuesto de union es obtenible por un metodo para comprobar el efecto de un posible compuesto de celulas madre anti cancer comprende poner en contacto (tratar) un conjunto de celulas madre cancerosas de acuerdo con la invencion in vitro con dicho posible compuesto de celulas madre anti cancer y comprobando si dichas celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor en continuo crecimiento y en el que dicho posible compuesto de celulas madre cancerosas es preferiblemente, pero no necesariamente, disenado como un inhibidor Lgr5 o 6 o como un compuesto de union Lgr5 o 6.

[0175] Un primer ejemplo de un inhibidor Lgr5 o 6 es un inhibidor de la protelna Lgr5 o 6. Preferiblemente, dicho inhibidor de la protelna Lgr5 o 6 es un derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo o anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 o 6 y mas preferiblemente capaz de unirse a la parte de Lgr5 o 6 que se expone en el exterior de la celula madre cancerosa. En aun otra realizacion preferida, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a dicha protelna o Lgr5 y 6 y funcionalmente bloquea dicha protelna Lgr5 o 6 mediante la prevencion de la union de un ligando natural de Lgr5 o 6. En una realizacion, dicho anticuerpo o anticuerpo derivado o fragmento de anticuerpo comprende al menos una secuencia CDR como se muestra en la Figura 27. Preferiblemente, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de CDR1 y CDR2 de una secuencia y una secuencia de CDR3 de una cadena ligera y/o una cadena pesada representada en la Figura 27. En una realizacion adicional, dicho anticuerpo es un anticuerpo como se muestra en la Tabla 4 o 5.

[0176] Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos adecuados son scFv y Fab. Ejemplos de derivados adecuados son anticuerpos quimericos, nanocuerpos, anticuerpos bifuncionales, o anticuerpos humanizados.

[0177] En otra realizacion mas preferida, el anticuerpo utilizado es un anticuerpo monoclonal.

[0178] Otro ejemplo de un inhibidor de protelna Lgr5 o 6 es una molecula pequena que interfiere con la actividad biologica de Lgr5 o 6. Tal molecula pequena puede ser un compuesto qulmico, as! como una pequena protelna y es tlpicamente disenado sobre la base del analisis de estructura-funcion de Lgr5 o 6. El analisis puede comprender el analisis de estructura cristalina de Lgr5 o 6. Las bibliotecas de moleculas pequenas se pueden cribar o compuestos se pueden disenar y posteriormente examinarse. Un inhibidor de molecula pequena tambien puede ser disenado en base a la estructura de un ligando (natural) de Lgr5 o 6.

[0179] Sin embargo, otro ejemplo de un Inhibidor Lgr5 o 6 es un inhibidor de los transcripcion de ARNm de Lgr5 o 6. Un ejemplo de un inhibidor de transcrito de Lgr5 o 6 son moleculas antisentido. Farmacos antisentido son hebras complementarias de segmentos pequenos de ARNm. Tal molecula antisentido se une al ARNm de Lgr5 o 6 e inhibe

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(al menos en parte) la produccion de protelnas Lgr5 o 6. Otro ejemplo de un inhibidor de transcrito Lgr5 o 6 se refiere a moleculas de ARN de interferencia (ARNi), tales como moleculas de ARNsi.

[0180] Ademas de la opcion de que un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a Lgr5 o 6 y funcionalmente bloquea Lgr5 o 6 (como se describe arriba), dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo tambien se puede unir a Lgr5 o 6 sin bloquear funcionalmente la actividad Lgr5 o 6. Dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta acoplado preferiblemente a otro compuesto (es decir, otro resto) que es capaz de inhibir funcionalmente una celula madre cancerosa. Un ejemplo de otro compuesto es una toxina. Por lo tanto, la descripcion tambien describe un inhibidor de celulas madre cancerosas, en el que dicho inhibidor comprende una primera parte que es capaz de unirse a Lgr5 o 6 y una segunda parte que proporciona disfuncion de celulas madre cancerosas. Preferiblemente, dicha primera parte es un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a Lgr5 o 6 (preferiblemente sin influir en la funcion de Lgr5 o 6) y dicha segunda parte es una toxina. En esta realization LG5 o 6 se utiliza como un objetivo para entregar un compuesto citotoxico a una celula madre cancerosa.

[0181] Por lo tanto, la divulgation describe un compuesto de union que esta vinculado a un agente toxico o ligado a una enzima capaz de convertir un profarmaco en un agente toxico. Por ejemplo, el anticuerpo o derivado o fragmento del mismo esta unido a un agente toxico para formar un inmunoconjugado. Dicho agente toxico incluye un radioisotopo y un farmaco toxico que es ineficaz cuando se administra sistemicamente solo. Mediante la combination de la especificidad de la orientation de un compuesto de union a Lgr5 y/o 6 expresando celulas madre de tumor con el poder de matar de una molecula de efector toxico, inmunoconjugados permiten una discrimination sensible entre el objetivo y el tejido normal, dando como resultado menos efectos secundarios toxicos que la mayorla de los farmacos quimioterapeuticos convencionales. Ejemplos de profarmacos que se pueden dirigir a celulas madre tumorales de expresion Lgr5 o 6 que comprenden mostaza de acido benzoico por la que el anticuerpo esta conjugado con carboxipeptidasa G2; nitrogeno cefalosporina de mostaza-p-fenilenediamina por lo que el anticuerpo esta conjugado con beta-lactamasa; y cianofenilmetilbeta-D-gluco-acido piranosiduronico, por lo que el anticuerpo esta conjugado con beta-glucosidasa.

[0182] La descripcion describe ademas un uso de un compuesto de union como un medicamento para el tratamiento de cancer. En una realizacion preferida, dicho compuesto de union comprende un anticuerpo especlfico para Lgr5 y/o Lgr6 o un fragmento de union Lgr5 o 6 o derivado del mismo. En una realizacion preferida, dicho anticuerpo es un ser humano, humanizado o anticuerpo anti desinmunizado Lgr5 y/o Lgr6 como se describe en el presente documento. En una realizacion preferida, dicho compuesto de union es especlfico para Lgr5 humano y/o Lgr6 humano. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realizacion, dicho compuesto de union es un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende al menos una secuencia de CDR como se muestra en la Figura 27. Preferiblemente, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 y CDR3 una secuencia de una cadena ligera y/o una cadena pesada representada en la Figura 27. en una forma de realizacion adicional, dicho compuesto de union es un anticuerpo tal como se representa en la Tabla 4 o 5. En una realizacion preferida, un compuesto de union esta vinculado a un agente toxico o ligado a una enzima capaz de convertir un profarmaco en un agente toxico.

[0183] En otra realizacion, la descripcion describe un inhibidor de celulas madre cancerosas que comprende un ligando Lgr5 o 6 preferiblemente acoplado a otro compuesto (es decir, otro resto) que es capaz de inhibir funcionalmente una celula madre cancerosa. Un ejemplo de otro compuesto es una toxina. Ejemplos de un ligando Lgr5 o 6 son ligandos que son un miembro de la familia de peptidos de insulina. Ejemplos adecuados son Insl5 y Relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una protelna-cistelna-nudo tales como Noggin, Gremlina, Dan, o Cerberus. Por otra parte, un ligando natural puede ser modificado de tal manera que bloquea permanentemente actividad Lgr5 o 6.

[0184] Todo los inhibidores de protelna Lgr5 o 6 anteriores, los inhibidores de los transcription de ARNm de Lgr5 o 6, as! como los inhibidores de celulas madre cancerosas descritas son muy utiles para metodos de terapia de cancer terapeuticos.

[0185] En otra realizacion, la descripcion describe el uso de al menos un Inhibidor Lgr5 o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 o 6 como se describe en el presente documento (por ejemplo, un Inhibidor Lgr5 o 6 de la protelna o un inhibidor de las transcripciones de ARNm de Lgr5 o 6 o un inhibidor de celulas madre cancerosas) para la fabrication de un medicamento para el tratamiento del cancer.

[0186] Preferentemente, dichos inhibidores son obtenibles de acuerdo con un metodo de la invention, es decir, un metodo para comprobar el efecto de un posible compuesto de celulas madre anti cancer comprende la puesta en contacto (tratamiento) de un conjunto de celulas madre cancerosas de acuerdo con la invencion in vitro con dicho posible compuesto anti cancer de celulas madre y comprobando si dichas celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor en continuo crecimiento y en el que dicho posible compuesto de celulas madre cancerosas esta disenado preferiblemente como un Inhibidor Lgr5 o 6 o como un compuesto de union Lgr5 o 6. En una realizacion preferida, se hace uso de un Inhibidor Lgr5 o 6 o un compuesto de union Lgr5 o 6.

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[0187] La descripcion describe ademas un metodo para reducir o inhibir el potencial de mantenimiento de tumor de un tumor, que comprende la proportion de dicho tumor con un compuesto que esta disenado como un inhibidor Lgr5 y/o 6, o, preferiblemente, que es capaz de unirse a Lgr5 y/o 6.

[0188] Una terapia de celulas madre anti cancer es muy util para erradicar la parte del tumor que mantiene el tumor y esta implicada en el crecimiento invasivo y la metastasis. Aunque un enfoque de este tipo se considera una terapia de cancer muy eficaz, la mejora o aumento de los resultados se pueden obtener mediante la combination de la terapia de celulas madre anti cancer con la terapia convencional cancerosa.

[0189] En una realization preferida, la descripcion describe el uso de al menos un Inhibidor Lgr5 o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 o 6 como se describe en el presente documento (por ejemplo, un Inhibidor Lgr5 o 6 de la protelna o un inhibidor de las transcripciones de ARNm de Lgr5 o 6 o un inhibidor de celulas madre cancerosas) para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de cancer, que comprende ademas la terapia en general anti-cancer. Los ejemplos de dicha terapia anti cancer general (o convencional), son la radiation, la quimioterapia, la terapia basada en anticuerpos o tratamientos a base de moleculas pequenas. El tratamiento combinado da lugar a un enfoque de matar la poblacion de celulas madre cancerosas minoritarias, as! como la mayor parte del tumor.

[0190] En otra realizacion preferida, la descripcion describe el uso de al menos un Inhibidor Lgr5 o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 o 6 como se describe en el presente documento (por ejemplo, un Inhibidor Lgr5 o 6 de la protelna o un inhibidor de las transcripciones de ARNm de Lgr5 o 6 o un inhibidor de celulas madre cancerosas) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer, en el que las celulas madre cancerosas estan involucradas en el cancer intestinal, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, cancer de piel, cancer de esofago, cancer de mama, cancer de prostata, meduloblastoma cerebral u otro tipos de cancer, cancer de hlgado, cancer de estomago, cancer de follculo piloso, cancer de retina, feocromcitoma, cancer de cabeza y cuello, cancer testicular, cancer de ovario, carcinoma de celulas de basilea de la piel o cancer de pulmon. A este respecto, "involucrado" significa sostener y/o mantener y/o expandir.

[0191] Preferiblemente, el tratamiento con al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6 se inicia antes, despues o durante dicha terapia de cancer convencional.

[0192] Aunque el tratamiento con al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6 se considera eficaz, el tratamiento con multiples inhibidores y/o compuestos de union puede proporcionar mejores resultados. Esto es especialmente cierto si el cancer de celulas madre a tratarse comprende dos, tres o incluso mas protelnas diferentes LGR incrustadas en su membrana celular.

[0193] En una realizacion preferida, la descripcion describe el uso de al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6 como se describe en el presente documento (por ejemplo, un Inhibidor Lgr5 o 6 de la protelna o un inhibidor de la transcription de ARNm de Lgr5 o 6 o un inhibidor de celulas madre cancerosas) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer, en el que al menos dos Inhibidores LG5 y/o 6 o al menos dos compuestos de union Lgr5 y/o 6 o una combinacion de al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 de Lgr5 y al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6.

[0194] La divulgation de este modo describe el uso de al menos dos inhibidores Lgr5 y/o 6 o al menos dos compuestos de union Lgr5 y/o 6 o una combinacion de al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 y al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de celulas madre cancerosas. Un inhibidor y/o compuesto de union puede, pero no necesariamente se dirige a una y la misma protelna Lgr, por ejemplo, un compuesto de union y un inhibidor contra Lgr5. La mezcla de al menos dos inhibidores Lgr5 o 6 o al menos dos compuestos de union Lgr5 o 6 o una combinacion de al menos un inhibidor Lgr5 o 6 y al menos un Compuesto de union Lgr5 o 6 es, por ejemplo dirigido contra Lgr5 y 6. Este ultimo es especialmente util en un metodo para la obtencion de celulas madre cancerosas de cerebro, cabeza y cuello, testlculo, mama, prostata, piel, de ovario o follculo piloso.

[0195] Otro compuesto util que ya se ha descrito es un inhibidor de celulas madre que comprende un ligando Lgr5 y/o 6 preferiblemente acoplado a otro compuesto (es decir, otro resto) que es capaz de inhibir funcionalmente una celula madre cancerosa. Un ejemplo de otro compuesto es una toxina. Ejemplos de un ligando Lgr5 o 6 son ligandos que son un miembro de la familia de peptidos de insulina. Ejemplos adecuados son Insl5 y Relaxina3. Otro ejemplo adecuado es una protelna-cistelna-nudo tales como Noggin, Gremlina, Dan, o Cerberus. Tal compuesto tambien puede ser utilizado en una terapia de celulas madre cancerosas.

[0196] Por lo tanto, la divulgacion describe el uso de un compuesto que es capaz de unirse a un ligando de Lgr5 y/o 6 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de celulas madre cancerosas. Preferiblemente, dicho ligando esta acoplado a otro compuesto (es decir, otro resto) que es capaz de inhibir funcionalmente una celula madre cancerosa, tal como una toxina o una enzima capaz de convertir un profarmaco en un agente toxico. Incluso mas preferiblemente, tal tratamiento se combina con la terapia cancerosa, tal como la radiacion, la quimioterapia, la terapia basada en anticuerpos o tratamientos a base de moleculas pequenas.

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[0197] En otra realization, la description describe el uso de un compuesto que es capaz de unirse a un ligando de Lgr5 y/o 6 para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de celulas madre cancerosas. Preferiblemente, la union de dicho compuesto a un ligando Lgr5 y/o 6 es tal que dicho ligando ya no es capaz de unirse a Lgr5 y/o 6. Un ejemplo es un anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que captura un ligando (natural) de Lgr5 y/o 6 y por lo tanto impide la activation de Lgr5 y/o 6.

[0198] La description describe ademas una composition que comprende al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 o al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6 o por lo menos un ligando Lgr5 y/o 6 o al menos un compuesto capaz de unirse a un ligando Lgr5 y/o 6, preferiblemente como se describe anteriormente. Preferiblemente, dicha composition es una composition farmaceutica. Tal composition farmaceutica puede comprender, ademas, cualquier excipiente, estabilizador, activador, portador, permeabilizador, propulsor, desinfectante, diluyente y/o conservante farmaceuticamente aceptable. Una composition farmaceutica puede estar en cualquier forma deseada, por ejemplo un comprimido, fluido de infusion, capsula, jarabe, etc.

[0199] En una realization preferida adicional, una composition (farmaceutica) comprende al menos dos inhibidores Lgr5 y/o 6 o al menos dos compuestos de union Lgr5 y/o 6 o una combination de al menos un inhibidor Lgr5 y/o 6 y al menos un compuesto de union Lgr5 y/o 6.

[0200] Ahora que los inventores han divulgado que Lgr5 y/o 6 son marcadores de celulas madre cancerosas esto abre mas a fondo las posibilidades en el campo del diagnostico. Se puede por ejemplo utilizar un compuesto de union Lgr5 y/o 6 de union para determinar el contenido de celulas madre cancerosas de un tumor o para determinar la presencia o ausencia de celulas madre cancerosas en un fluido corporal tal como sangre. Preferiblemente, el compuesto de union tiene una elevada afinidad por Lgr5 o 6 (es decir, la Kd es de al menos 10-7). Compuestos de union adecuados son un ligando Lgr5 y/o 6, un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y/o 6, por ejemplo, un anticuerpo o derivado o fragmento que tiene afinidad por Lgr5 y/o 6.

[0201] La divulgation de este modo tambien describe un metodo para determinar el contenido de celulas madre cancerosas de un tumor, que comprende la puesta en contacto de dicho tumor con un compuesto de union Lgr5 y/o 6, eliminando el compuesto no unido de union y determinando si cualquier compuesto de union unido esta presente en dicho tumor.

[0202] En una realization preferida, dicho metodo es un metodo in vitro. Incluso mas preferiblemente, dicho compuesto de union esta marcado de manera que puede identificarse. Los marcadores adecuados son, por ejemplo una protelna (fragmento) tal como la cola de anticuerpo Fc o protelna estafilococica A o glutation-S-transferasa, una etiqueta de peptido antigenico corto tal como etiqueta de Myc, FLAG o HA o una etiqueta histidina oligomerica, una etiqueta enzimatica tal como fosfatasa alcalina, una etiqueta de protelna fluorescente (por ejemplo, protelna verde fluorescente). Sin embargo, tambien es posible utilizar un segundo compuesto que tiene afinidad por el compuesto de union y el etiquetado de dicho segundo compuesto con un marcador adecuado (es decir, un analisis indirecto).

[0203] Para la aplicacion in vivo, la description describe ademas el uso de un compuesto de union Lgr5 y/o 6 en la preparation de un diagnostico para el diagnostico de la presencia de celulas madre cancerosas y/o contenido en un tumor.

[0204] Dicha muestra es por ejemplo obtenida a partir de un fluido corporal o una muestra obtenida de un tumor solido.

[0205] En una realization preferida, la description describe un metodo para determinar el contenido de celulas madre cancerosas de un tumor, que comprende la puesta en contacto de dicho tumor con un compuesto de union Lgr5 y/o 6 y determinar si cualquier compuesto de union unido esta presente en dicho tumor. La description tambien describe el uso de un compuesto de union Lgr5 y/o 6 en la preparation de un diagnostico para el diagnostico de cancer de presencia de celulas madre y/o el contenido en una muestra, en el que dicho compuesto de union esta conjugado a una sustancia que permite obtener imagenes radiactivas, tomografla de emision de positrones (TEP), la resonancia magnetica (RM), o tomografla computarizada / de rayos X (TC).

[0206] La description describe ademas un metodo para determinar si un fluido corporal comprende una celula madre cancerosa, que comprende

- obtener opcionalmente una muestra de dicho fluido corporal

- poner en contacto dicho fluido corporal con un compuesto de union Lgr5 y/o 6

- eliminar el compuesto de union no unido

- detectar cualquier complejo unido que comprende un compuesto de union Lgr5 y/o 6, y la determination de la presencia de un cancer de celulas madre basado en la presencia de complejo unido detectado.

[0207] Compuestos de union adecuados son un ligando de Lgr5 y/o 6, un anticuerpo o un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y/o 6, es decir, un anticuerpo o derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5 y/o 6.

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[0208] El paso de retirar cualquier compuesto de union no unido se consigue por ejemplo por lavado con una solucion o tampon adecuado.

[0209] Los ejemplos de fluidos corporales son sangre, orina, llquido linfatico o lagrimas.

[0210] En una realizacion preferida, dicho metodo es un metodo in vitro.

[0211] Los marcadores adecuados se han mencionado anteriormente.

[0212] Los metodos de diagnostico descritos son tambien muy utiles para determinar si una terapia anti cancer lleva a la erradicacion de (al menos una parte) de las celulas madre cancerosas. Si por ejemplo se hace uso de la terapia general contra el cancer (o combinar el tratamiento con por ejemplo un inhibidor Lgr5 y/o 6), el efecto de dicha terapia en el cancer de celulas madre se puede determinar mediante la determinacion de la presencia o ausencia de celulas que llevan Lgr5 y/o 6.

[0213] En otra realizacion mas, la invencion proporciona un metodo para determinar la efectividad de un tratamiento anti cancer, que comprende la puesta en contacto de dicho cancer con una Lgr5 y opcionalmente un compuesto de union Lgr6, en el que dicho compuesto de union Lgr5 es un fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.

[0214] Dicho metodo se realiza in vitro.

[0215] La presencia de celulas madre cancerosas se determina antes del tratamiento y despues del tratamiento, y, opcionalmente, durante el tratamiento, de manera que pueda determinarse si el tratamiento aplicado resulta o no en una cantidad cambiada (preferiblemente disminuida) de la cantidad de celulas madre cancerosas.

[0216] La descripcion describe ademas un metodo para tratar a un individuo en necesidad del mismo que comprende la administracion de una cantidad eficaz de una composition farmaceutica descrita en el presente documento a dicho individuo y, opcionalmente, someter ademas dicho individuo a la terapia de cancer convencional tal como radiation o quimioterapia.

[0217] La invencion se explicara con mas detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

Leyendas de figuras

[0218]

Figura 1. Gpr49/Lgr5 es un gen diana de Wnt en una llnea celular de cancer de colon humano y se expresa en criptas del raton. a: analisis de transferencia Northern (panel superior); gel tenido con bromuro de etidio (panel inferior). Carril 1: Control de las celulas Ls174T-L8. Carril 2: Celulas LS174T despues de la inhibition inducida de via Wnt de doxiciclina de 24 horas como en 6 (Referencias 2). Se ha de tener en cuenta la fuerte regulation a la baja de la 4,4 kb Grp49 ARNm de de la inhibicion por via Wnt. Carril 3: ARN extralda de criptas intestinales aisladas de raton pequenas, que sufre inevitablemente de la degradation limitada que resulta en manchas. Carril 4: ARN extralda de vellosidades aisladas de raton. Notese la expresion especlfica de Grp49 en las criptas del raton. b/c Dos imagenes superpuestas de una hibridacion in situ realizada en el intestino delgado de un raton APCmin, ilustrando la expresion ubicua de Grp49 en partes inferiores de las criptas (ejemplos marcados con flechas blancas) y la expresion en el adenoma en el panel izquierdo (marcado por una llnea discontinua).

Figura 2. Expresion Gpr49/Lgr5 en el ciclo de las celulas columnares de base de cripta (CBC) del intestino delgado. a-c, hibridacion In-Situ se realizo con sondas especlficas para genes diana 3 Tcf que demuestran patrones de expresion que no se solapan en el epitelio de las criptas. a: Criptdina marca especlficamente las celulas de Paneth en la base cripta; b: las marcas de KIAA0007 de las celulas Ta situadas por encima de las celulas de Paneth c: Gpr49/Lgr5 se expresa especlficamente en las celulas 4-8 entremezcladas con las celulas de Paneth en la base cripta. Todos los controles fueron negativos sensoriales (no mostrados). d: celulas CBC (clrculos) son solo escasamente visibles en las secciones tenidas de heamatoxilin/eosina. e: celulas CBC (clrculo) son KI67 + f: Algunas celulas expresan el marcador de CBC-M fase fosfo-histidina H3 (en el clrculo). g: la incorporation de BrdU en las celulas CBC4 horas despues de una dosis unica de BrdU (en el clrculo). h: incorporation de BrdU en las celulas CBC despues del marcaje BrdU continuo de 24 horas (en el clrculo). Las barras negras: numero de celulas BrdU-positivas CBC por section de cripta despues de 4 horas o 24 horas. Barra blanca: Numero total de celulas CBC por seccion de cripta evaluada contando las celulas lacZ-positivas en ratones Gpr49-LacZ.

Figura 3. La expresion restringida de un gen reportero de Gpr49-LacZ en ratones adultos a: Generation de ratones que llevan lacZ integrada en el ultimo exon del gen Gpr49, la elimination de todas las regiones transmembranas de la protelna Gpr49 codificada. bh, Expresion de Gpr49lacZ en tejidos de raton adulto seleccionados. b/c: En el intestino delgado la expresion esta restringida a las celulas delgadas 6-8

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entremezcladas con las celulas de Paneth en la base cripta. d/e: En el colon, la expresion se limita a unas pocas celulas localizadas en la base cripta. f/g: Expresion en el estomago se limita a la base de las glandulas. h: En las glandulas mamarias, la expresion fue evidente solo en glandulas mas pequenas, de proliferacion activa, donde se restringe las celulas epiteliales basales. I: En la piel, la expresion se produce en la vaina radicular externa de los follculos pilosos en un dominio que se extiende desde el bulto a la papila dermica.

Figura 4. Expresion de EGFP en un raton knock-in Gpr49-EGFP-IRES-CreERT2 reproduce fielmente el patron de expresion Gpr49lacZ en el tracto intestinal. a: Generacion de ratones que expresan EGFP y CreERT2 de un solo mensaje bicistronico por genes knock-in en el primer exon de Gpr49. b, c, e: Imaginologla confocal GFP de contraste con el colorante de ADN rojo ToPro-3 confirma que la expresion de Gpr49 esta restringida a las celulas 6-8 delgadas intercaladas entre las celulas de Paneth en la base de la cripta del intestino delgado. b: Unidad de cripta-vellosidad completa; c: ampliacion de las regiones de las criptas; d: El analisis inmunohistoqulmico de la expresion de EGFP en las criptas intestinales. e: imageN2D de la reconstruccion 3D suministrado como pellcula suplementaria en la Fig. 7. f: formacion de imagenes confocales de expresion EGFP en el colon confirma la expresion de Gpr49 esta restringido a unas pocas celulas localizadas en la base cripta. g: la seccion de cryoEM cripta manchada para GFP con inmunoelectronica (barra de escala=1000 nm). La cuantificacion de la especificidad de su etiquetado: Las partlculas de oro se contaron mas de 255 pm2 de citosol de la celula CBC (l1l3 partlculas), 261 pm2 de citosol de celulas de Paneth (305 partlculas) y 257 pm2 de citosol de fibroblastos (263 partlculas) fuera de la cripta. De este modo citoplasma CBC tenia 4,36 partlculas de oro/pm2 en comparacion con las celulas de Paneth 1,17 partlculas de oro/pm2 y para el control de fibroblastos 1,02 partlculas de oro/pm2. C= lumen de cripta; P=celulas de Paneth; CBC= Celulas columnares de base cripta. h: seccion CryoEM sin etiqueta (barra de escala=2.000 nm), lo que subraya las caracteristicas ultraestructurales de las celulas CBC y su posicionamiento en relacion con las celulas de Paneth.

Figura 5. El seguimiento de linaje en el intestino delgado y el colon. a: El raton knock-in Gpr49-EGFP-IRES- CreERT2 cruzado con los ratones reportero Rosa26-LacZ 12 horas despues de la inyeccion de tamoxifeno b: frecuencia con la que las celulas azules aparecieron en posiciones especificas relativas a la parte inferior de cripta, de acuerdo con el esquema en el recuadro de la Figura 5b. La gran mayoria de las celulas marcadas Cre+ CBC-LacZ se produjo en posiciones entre las celulas de Paneth, mientras que solo el 10% de estas celulas se observaron en la posicion 4 directamente por encima de las celulas (linea azul). Los datos cuantitativos sobre la posicion de las celulas de la etiqueta de retention de ADN obtenidas a largo plazo en ratones despues de la irradiation de adultos (que marcan las celulas madre intestinales "4") han sido publicadas recientemente por Potten y cols.17. La comparacion de estos datos (linea roja) con la posicion de las celulas CBC que portan Cre activa. c-e: El analisis histologico de la actividad de LacZ en el intestino delgado 1 dia despues de la induction (c), 5 dias posteriores a la induccion (d) y 60 dias despues de la induccion (e). f-h: doble etiquetado de intestino tenido con LacZ usando PAS demuestra la presencia de celulas caliciformes (f; flechas blancas) y celulas de Paneth (g; flechas azules) en los clones azules inducidos. Etiquetado doble con sinaptofisina demuestra la presencia de celulas enteroendocrinas dentro de los clones inducidos azules (h; flechas negras). i-k Analisis histologico de la actividad LacZ en el colon 1 dia despues de la induccion (i), 5 dias despues de la induccion (j) y 60 dias despues de la induccion (k).

Figura 6. Estrategia para EGFP-IRES-CreERT2 casete knock-in en el locus de Gpr49 a: Estructura esquematica del gen de raton Gpr49

b: estrategia de transferencia de Southern para detectar celulas ES transfectadas con una construction knock-in en la orientation del inicio de transformation ATG en el exon I.

c: Cuatro clones de celulas ES de un total de 500 se califico como positivo para la banda BamHI recombinada funcionando a 4,3 kb. Despues de la reinspeccion de estos clones 4 ES, se seleccionaron los dos primeros (asteriscos) para inyeccion de blastocisto.

Figura 7. sensibilidad a la radiation relativa de celulas CBC, +4 celulas, y celulas TA. Los ratones adultos fueron irradiados con 1 Gy o 10 Gy y posteriormente se sacrificaron 6 horas mas tarde, en el pico de la apoptosis. A: celulas caspasa-3-positivas activas se visualizaron mediante tecnicas de inmunohistoqulmica (panel superior - flechas negras que destacan las celulas positivas +4 tras la irradiacion 1Gy; flechas blancas de panel bajo que destacan las celulas positivas despues de la irradiacion CBC 10Gy). b: La frecuencia de celulas positivas por cripta se determino contando tres clases: las celulas CBC (situadas entre las celulas de Paneth), +4 celulas (situadas directamente en de las celulas de Paneth) y celulas TA: localizadas en la posicion 5-15. Apoptosis maxima a +4 ya se alcanza a 1 Gy mientras que 10 Gy provoca significativamente mas apoptosis que irradiacion 1 Gy en las celulas CBC.

Figura 8. Analisis de montaje completo de la expresion de LacZ en el intestino delgado del raton knock-in Gpr49- EGFP-IRES-CreERT2 cruzado con ratones reporteros Rosa26-LacZ en los puntos de tiempo indicados despues de la inyeccion de tamoxifeno a:1 dia post-induction. b: 5 dias post-induction. c: 60 dias despues de la induccion.

Figura 9. Colocalizacion del marcador de proliferacion Ki67 y las celulas CBC GFP-positivas en las criptas

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intestinales de los ratones Gpr49-EGFP-CreERT2 (secciones de serie).

Figura 10. Secuencias de los receptores humanos, de ratones y de ratas.

Figura 11. Prediccion de estructura de LGR4, 5 y 6.

Figura 12. Expresion restringida de un gen reportero de Gpr49-LacZ en expresion de ratones adultos de Gpr49lacZ en tejidos de raton adulto seleccionados. Lgr5 se limita a poblaciones de celulas raras en el cerebro (glomerulos del bulbo olfatorio y varias otras regiones mal definidas) (A), el ojo (capa interna nuclear de la retina) (B), el hlgado (celulas que rodean a las trladas portales) (C) y la glandula adrenal (D)

Figura 13. Seguimiento de linaje en el estomago ratones Lgr5-EGFP-CreERT2 se cruzaron con ratones reporteros Rosa26R y actividad de la enzima Cre inducida celulas LGR5+ve por inyeccion IP de tamoxifeno. La actividad del gen reportero LacZ se limita inicialmente a las celulas Lgr5 (A), pero rapidamente se expande para incluir todo el epitelio en el estomago con el tiempo (B). Este "seguimiento de linaje" se mantiene durante largos perlodos de tiempo (B). Esto demuestra que todas las celulas epiteliales se derivan de la poblacion Lgr5+ve en este tejido, lo que demuestra que son celulas madre.

Figura 14. Seguimiento de linaje en la glandula mamaria de ratones Lgr5-EGFP-CreERT2 se cruzo con ratones reporteros Rosa26R y actividad de la enzima Cre inducida en las celulas Lgr5+ve por inyeccion IP de tamoxifeno. La actividad del gen reportero LacZ se limita inicialmente a las celulas Lgr5 (A), pero se expande para incluir el mioepitelio de glandulas de la leche recien formado en las mujeres en periodo de lactancia (B), lo que indica que Lgr5 esta marcando especlficamente celulas madre mioepiteliales en este organo.

Figura 15. Seguimiento de linaje en la glandula suprarrenal. Los ratones Lgr5-EGFP-CreERT2 se cruzaron con ratones reporteros Rosa26R y actividad de la enzima Cre inducida en celulas Lgr5+ve por inyeccion IP de tamoxifeno. La actividad del gen reportero LacZ se limita inicialmente a las celulas Lgr5 (A), pero se expande para incluir la medula de la glandula adrenal (B), lo que indica que Lgr5 esta marcando especlficamente celulas madre de medula suprarrenal.

Figura 16. Lgr6 se expresa en celulas de la zona de protuberancia superior del follculo del pelo del raton y en las celulas basales de la epidermis. Secciones de piel de ratones Lgr6-EGFP-IRES-CreERT2 de aprox. 26 dlas de edad (anagena temprana) y se tineron para el ADN nuclear (Topro) y EGFP se visualizaron utilizando microscopla confocal (CA). Durante anagen temprano Lgr6 se expresa en la protuberancia superior (A, C) y la epidermis basal (A, B).

Figura 17. La progenie de celulas Lgr6+ contribuye a todas las estructuras de los follculos pilosos (HF), la epidermis interfolicular (IFE) y las glandulas sebaceas (SG). Para el seguimiento de la progenie de celulas Lgr6+ de ratones Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/ROSA26-LacZ fueron inyectados con tamoxifeno (TM) en P20 cuando FCs estan en telogen (A). En P23 se detecto una primera tincion en el IFE y los fondos de cobertura (B) se detectaron. Analisis de progenie de tincion LacZ en P38 (1a fase anagena, C, D) y P52 (2° telogeno, E, F) revelo contribucion a todas las partes del HFs, IFEs y SGs.

Figura 18. La progenie de celulas Lgr6+ contribuye al mioepitelio del pulmon. Para el seguimiento de la progenie de celulas de ratones Lgr6+ Lgr6-EGFP-IRES-CreERT2/ROSA26-LacZ se inyecto con tamoxifeno (TM) en P20. Analisis de la tincion de progenie LacZ en P38 (magnificacion A, 10x, 20x y 40x de izquierda a derecha) y P52 (B, 10x, 20x y 40x de izquierda a derecha) revelo contribucion al mioepitelio subyacente a los bronquiolos del pulmon.

Figura 19. Bajas dosis de induccion oral con p-NF no inducen supresion mediada por Cre en las celulas madre de ratones AHCre. Montajes enteros intestinales tineros por p-galactosidasa a partir de ratones AhCre+ Rosa26R+. a: No activacion del gen reportero Rosa-lacZ se observa en los intestinos de ratones AhCre+ Rosa26R+ no inducidos. b: Expresion de lacZ facilmente visible a lo largo del intestino 2 dlas despues de una sola alimentacion forzada de 1 mg/kg p-naptoflavona, lo que indica la activacion mediada por Cre eficiente del reportero lacZ. Ninguna expresion de lacZ es visible en la base de cripta (panel inferior) que demuestra la ausencia de recombinacion mediada por Cre en la base de cripta. c: Ninguna unidad de cripta/vellosidades lacZ- positiva es visibles en todo el montaje en los intestinos 100 dlas despues de la induccion, lo que indica que este regimen de dosificacion muy rara vez causa la recombinacion dentro de las celulas madre intestinales.

Figura 20. La transformacion de las celulas no madre a traves de la perdida de APC no conduce de manera eficiente a la formacion de adenoma durante perlodos de tiempo extendidos. a-c: p-catenina IHC realizado en las secciones intestinales de AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/fl 3 dlas despues de una sola alimentacion forzada de 1,0 mg/kg p-naptoflavona. Los racimos de celulas transformadas con p-catenina nuclear se observaron frecuentemente en la vellosidad (a) y las regiones superiores de la cripta (b). Grupos p-cateninaaltasolo muy raramente se observaron en la base de cripta (c). Estas agrupaciones se resaltan con flechas negras. d: La cuantificacion de la ubicacion de los grupos de celulas altas p-catenina en secciones intestinales de AhCre+

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Rosa26R+ Apcfl/fl 4 dlas despues de una sola alimentacion forzada de 1,0 mg/kg p-naptoflavona. Diagramas de caja que muestran el numero de focos observado en la base de cripta, la cripta superior y la vellosidad en 1600 unidades de las criptas-vellosidades. Significativamente mas grupos se observaron en las regiones superiores de la cripta que cualquier otra region (p=0,04, Mann Whitney, n=3). Focos B-catenina nucleares se observaron muy pocas veces en la base cripta. e: p-catenina IHC se realiza en seccion intestinal de AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/FL 24 dlas a partir de una unica alimentacion forzada de 1,0 mg/kg p-naptoflavona. Aqul, p-catenina nuclear se ve en una pequena lesion 24 dlas despues de la induccion cre. f, g: p-catenina IHC se realiza en la seccion intestinal de AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/FL 167 dlas despues de una sola alimentacion forzada de 1,0 mg/kg p-naptoflavona que muestra un microfono roadenoma (f) y pequeno adenoma (g) con p-catenina nuclear. h: cuantificacion de la formacion de adenoma durante perlodos de tiempo extendidos en AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/fl despues de una sola alimentacion forzada de 1,0 mg/kg p-naptoflavona. El tamano de las lesiones se puntuo en montajes enteros intestinales de ratones AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/fl que hablan sido tenidos para lacZ para ayudar a visualizar las lesiones pequenas (al menos 3 ratones se utilizaron para cada punto de tiempo). Ningun adenoma se observo en los ratones hasta e incluyendo el dla 24 y solo habla Microadenoma muy rara en los ratones en el dla 24. Se observo que el adenoma ocasional en AhCre+ Rosa26R+ Apcfl/fl a 100 dlas (mas), sin embargo la mayorla de las lesiones se mantuvo microscopica, mostrando que la mayorla de las lesiones no estaban progresando a adenoma a pesar de un perlodo largo de latencia.

Figura 21. Celulas madre intestinales Lgr5+ve transformadas despues de la perdida de APC persisten y alimentan la rapida formacion de microadenomas p-catenina alta. a-i: Las consecuencias de la transformation de celulas madre intestinales Lgr5+ve y su destino subsiguiente se rastreo a traves de un periodo de ocho dlas utilizando p-catenina y GFP como marcadores de celulas transformadas y celulas madre Lgr5+ve respectivamente. a-c: Acumulacion del efector Wnt, p-catenina se observo por primera vez en celulas madre Lgr5+ve dispersas 3 dlas despues de la induccion de Cre en intestinos Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/APCfl/fl. Ejemplos representativos de celulas madre p-cateninaaltaLgr5+ve se clrculan. d-f: Cinco dlas despues de la induccion celulas madre Lgr5-GFP+ve transformadas permanecen (e,f: flechas negras) y se asocian con los racimos de celulas transformadas (p-catenina alta) dentro del compartimiento de TA. g-h: Ocho dlas despues de la induccion los racimos de celulas transformadas se han expandido para llenar el compartimiento de TA (h: clrculo rojo). Las celulas madre Lgr5-GFP+ve transformadas en la base de cripta persisten (h,i: flechas negras), pero su progenie transformada dentro del compartimiento de TA son Lgr5-GFP-ve. (h,i: clrculos rojos).

Figura 22. Las celulas madre de Lgr5+ve de transformacion selectiva despues de la perdida de eficiencia APC impulsa la formacion de adenoma en todo el intestino delgado. a-h: La aparicion y el desarrollo de los adenomas intestinales y la expresion del marcador de celulas madre Lgr5-GFP dentro de estos adenomas se siguio en un perlodo de 36 dlas usando GFP (f) y p-catenina (todos los demas) IHC.a-b: Multiples pequenos adenomas son facilmente visibles en todo el intestino 14 dlas despues de la transformacion de celulas madre Lgr5+ve. c-f: Multiples adenomas macroscopicos (> 100) se presentan despues de 24 dlas. La expresion de Lgr5-GFP en los adenomas se restringe a las celulas dispersas raras (f; un clrculo). g,h: A los 36 dlas, una gran proportion del intestino esta lleno de adenomas macroscopicos.

Figura 23. La presencia de celulas madre Lgr5+ en adenomas intestinales. Adenomas intestinales expresan altos niveles de p-catenina como resultado de la activation cronica de la via de Wnt (A). A diferencia de otros genes diana de Wnt que son altamente expresados durante todo el adenoma (no mostrado), la expresion del marcador de celulas madre intestinal Lgr5-GFP se restringe a celulas dispersas con morfologla caracterlstica de celulas madre: delgadas, celulas en forma de coma; se indica con la flecha negra (B). Especulamos que estas celulas Lgr5+ve dentro del adenoma son celulas madre dedicadas a mantener el crecimiento del adenoma (las llamadas celulas madre cancerosas).

Figura 24. Analisis FACS de la expresion LGR5 en celulas L8, que son derivados clonales de las celulas LS174T, que expresan Tcf4 (DNTcf4) dominante negativo sobre doxiciclina (DOX). DNTcf4 apaga via Wnt activa constitutiva. Despues de 48 horas de induccion DOX, se observa una reduction en los niveles de protelna hLgr5. Rat IgG se utiliza como control de isotipo negativo. 9G5 es un anticuerpo derivado de rata monoclonal dirigido contra hLgr5

Figura 25. Comparacion de las celulas madre Lgr5+ y de su descendencia directa. Celulas epiteliales GFP positivas desde suspensiones celulares preparadas a partir de las criptas recien aisladas de ratones Lgr5-EGFP- ires-CreERT2. El analisis FACS distinguio una poblacion GFP-alta (GFPhi) y GFP-baja (GFPlD), que tentativamente identificamos como celulas CBC y sus celulas hija de amplification de transito inmediata, respectivamente (A). Un ejemplo de un gen Wnt-sensible, Sox9, que muestra la expresion de alto nivel en las celulas de CBC, pero las celulas TA directamente por encima de las celulas de Paneth tambien expresan este gen en hibridaciones in situ, aunque a un nivel mucho mas bajo (B).

Figura 26. Tincion hLgr5 endogena de una llnea celular de cancer de colon humano (L8) usando varios anticuerpos monoclonales Lgr5-especlficos. Celulas L8 son un derivado clonal de la llnea celular LS174T parental. Tras la induccion de doxiciclina (DOX) las celulas L8 expresan una forma dominante negativa de Tcf-4 (DNTcf4). DNTcf4 bloquea eficazmente la actividad de la via Wnt constitutiva en estas celulas y en consecuencia apaga genes diana TVC. Despues de 48 horas de induccion de DOX se observa una importante reduccion en los

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niveles de protelna hLgr5. IgG de rata se utiliza como control de isotipo negativo.

Figura 27. Secuencias de cadena ligera + cadena pesada se analizaron utilizando el metodo KABAT. Las regiones CDR estan en negrita y en cursiva.

Ejemplos

Ejemplo 1

Parte experimental

Transferencia de Northern y la inhibicion inducida por via Wnt en LS174T

[0219]

clon L8: Como en van de Wetering, M. et al. El complejo de beta-catenina/TCF-4 impone un fenotipo progenitor de cripta en celulas de cancer colorrectal. Celula 111, 241-50 (2002). La sonda se extendio por el marco de lectura de raton Gpr49. Cripta y preparaciones epiteliales de vellosidades para el aislamiento de ARN se generaron a partir 0,5cm longitudes de intestino por 4 rondas sucesivas de incubacion en 30 mM EDTA pre- calentado a 37°C durante 10 minutos, seguido de agitacion vigorosa (10x) en PBS enfriado. Las fracciones 1 y 4, que comprenden predominantemente vellosidades y criptas respectivamente se utilizaron para el aislamiento de ARN.

Ratones: Ratones Gpr49-LacZ se generaron por recombinacion homologa en celulas ES dirigidas a un casete de Ires-LacZ al extremo 5' del ultimo exon, eliminando esencialmente la region que contiene todas las regiones TM y la creacion de un alelo nulo (Lexicon). Ratones Gpr49-EGFP-IRES-CreERT2 se generaron por recombinacion homologa en celulas ES dirigidas a un casete EGFP-IRES-CreERT2 a la ATG de Gpr49. Ratones reporteros Rosa26 Cre-lacZ se obtuvieron de Jackson Labs.

Induccion de tamoxifeno: Los ratones de al menos 8 semanas de edad se inyectaron una vez por via intraperitoneal con 200 pl de tamoxifeno en aceite de girasol a 10 mg/ml. Inyeccion BrdU: Los ratones fueron inyectados por via intraperitoneal a intervalos de cuatro horas con 200 pl de una solucion de BrdU en PBS a 5 mg/ml.

Microscopfa de Inmunoelectron: Los intestinos fueron disecados y fijados a perfusion en 4% PFA en 0,2 M PHEM-tampon, incrustados en la gelatina, crioseccionados con crioultratoma Leica FCS e inmunoetiquetados frente a gFp con anticuerpo anti-GFP de conejo policlonal. Las muestras se cortaron usando un cuchillo de diamante Cryotrim 90 a -100°C (Diatome, Suiza) y se cortaron secciones ultrafinas de 70 nm a -120°C, utilizando un cuchillo Cryoimmuno (Diatome, Suiza). Para las imagenes de EM de baja magnificacion las partlculas de oro de protelna A de 15 nm se mejoraron brevemente con plata (UMCU, Utrecht, Palses Bajos) con R-GENT SE-EM (Aurion, Palses Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La union no especlfica a granulos de celulas de Paneth se disminuyo por la aplicacion de la solucion de bloqueo (Aurion, Palses Bajos) antes del anticuerpo primario.

[0220] Preparation de muestras de tejidos para la inmunohistoqulmica, hibridacion in-situ y analisis de expresion LacZ: Se realizaron como se describio anteriormente en Muncan, V. et al. Rapid loss of intestinal crypts upon conditional deletion of the Wnt/Tcf-4 target gene c-Myc. Mol Cell Biol 26, 8418-26 (2006). Sondas in-situ que comprenden un fragmento N-terminal de 1 kb mGPR49 se generaron a partir del clon de imagen de secuencia verificada 30873333. Anticuerpos Ki67 se adquirieron de Monosan (Palses Bajos), H3 fosfato-histona de Campro Scientific (Palses Bajos), anti-sinaptofisina de Dako, anti BrdU de Roche. Anti-GFP de conejo policlonal se proporciono por Edwin Cuppen, Hubrecht Institute.

Generacion de suspension de celulas de tejido (tumor) humanos.

[0221] Mediante el uso de una cuchilla de afeitar, se mezcla tejido humano recien aisladao (tumor) en la medida posible. Esto se realiza en un medio libre de suero. Se coloca el tumor triturado en una pipeta de 25 ml. Se coloca la solucion en un tubo conico de 50 ml. Se incuba a 37°C durante 30 a 60 min despues de la adicion de colagenasa IV (200units/ml) (Sigma). La concentration final debe ser de 200 unidades/ml. Se pipeta hacia arriba y hacia abajo dos veces cada 10 min (aprox). Se pasa la solucion a traves de un filtro (tamano de poro de 45 micrometres; Becton Dickinson). Se lava el filtro con 4-5 ml de medio libre de suero. Se centrifuga la solucion @ 1500 rpm durante 10 min (4°C). Se resuspende el precipitado en cloruro de amonio hipotonico (aprox. 5 ml). Se deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente (esto dara lugar a lisis de celulas rojas de la sangre). A continuation, se anade un volumen igual de medio libre de suero y se centrifuga de nuevo. Se resuspende el granulo en medio libre de suero. Si es grumoso, se pasa a traves de otro filtro. Cuente con azul de tripano para ver el porcentaje de celulas muertas.

Ensayo de celulas madre cancerosas de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes

[0222] Los ratones se irradian subletalmente con 320 Rad. El procedimiento experimental consiste en inyectar suspensiones (colon) de celulas cancerosas humanas bajo la capsula renal de ratones NOD/SCID. Los ratones se

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manejan utilizando tecnicas esteriles y se anestesiaron con anestesia por inhalacion: isoflurano. Los ratones se colocan en una almohadilla de calefaccion durante el procedimiento.

[0223] Una cortadora se utiliza para afeitar el abdomen, preparandose despues secuencialmente con: (1) solucion basada en yodo y (2) solucion de etanol al 70%. El area se limpio despues con una gasa. El raton se coloca en su lado (lado izquierdo hacia arriba). Una incision en el flanco de 1 cm (aproximadamente) se hace con tijeras, justo por debajo del margen costal en el lado izquierdo. Se entrega el rinon en la herida. La suspension de celulas a ensayarse para la actividad de las celulas madre cancerosas se mezcla 1:1 (medio: Matrigel) en hielo. Utilizando una jeringa de tuberculina, se inyecta 25 microlitros de la suspension celular bajo la capsula renal. Se entrega el rinon nuevo en el abdomen. Si la actividad de celulas madre cancerosas esta presente en la suspension celular, un tumor va a crecer en las subsiguientes semanas/meses analizandose por la histologla y debe parecerse al tumor humano original.

[0224] El epitelio intestinal es el tejido mas rapido de auto-renovacion en los mamlferos adultos. Los modelos actuales indican que las celulas madre de 4-6 criptas residen en la posicion +4 inmediatamente por encima de las celulas de Paneth en el intestino delgado; celulas madre de colon permanecen sin definir. Gpr49/Lgr5 se selecciono de un grupo de genes diana intestinales Wnt para su expresion de cripta restringida. Dos alelos knock-in revelaron expresion exclusiva de Gpr49 en el ciclo, las celulas columnares en la base cripta. Ademas, Gpr49 se expreso en celulas raras en varios otros tejidos, incluyendo el estomago, pecho y follculo piloso. El uso de un alelo knock-in Cre inducible y cepa reportera Rosa26-LacZ, experimentos de seguimiento de linaje se realizaron en ratones adultos. La celula columnar de base de cripta Gpr49+ve (CBC) genero todos los linajes epiteliales durante un perlodo de 60 dlas, lo que implica que representa la celula madre del intestino delgado y el colon. El patron de expresion de Gpr49 muestra que marca las celulas en multiples tejidos adultos y canceres madre.

[0225] El epitelio de absorcion del intestino delgado se ordena en criptas y vellosidades1 (Referencias 2). En el raton, el epitelio del intestino delgado da la vuelta cada 3-5 dlas. La tasa masiva de la produccion de celulas en las criptas se equilibra con la apoptosis en las puntas de las vellosidades. Hasta la fecha, las celulas madre intestinales no han sido funcionalmente identificadas, debido a la falta de marcadores unicos y la ausencia de ensayos de celulas madre. El analisis de las quimeras de raton y clones somaticos inducidos por un mutageno23 (Referencias 2) y el estudio de la regeneracion despues de la lesion habrla permitido una definicion operativa de las caracterlsticas de celulas madre. Se cree que las celulas madre se ciclan de manera constante para producir las celulas de amplificacion de transito de proliferacion rapida (TA), capaces de diferenciarse hacia todos los linajes. Las celulas madre se autorenuevan durante toda la vida, y regenerar el epitelio despues de una lesion. El numero estimado de celulas madre es de entre 4 y 6 por cripta2 (Referencias 2). La retencion de etiquetas de ADN a largo plazo ha localizado provisionalmente las celulas madre en la "posicion" +4 directamente por encima de las celulas Paneth4 (Referencias 2). Tres tipos diferenciados de celulas (enterocitos, celulas caliciformes y celulas neuroendocrinas) forman a partir de celulas de TA en la union cripta-vellosidad y continuan su migracion en estiramiento de bandas coherentes a lo largo del eje cripta-vellosidad. Mientras que criptas son monoclonales, cada vellosidad recibe celulas de multiples criptas diferentes y es por lo tanto policlonal. El cuarto tipo de celula principal diferenciado, la celula de Paneth, reside en la parte inferior de cripta. El epitelio de colon contiene criptas, pero tiene una superficie plana en lugar de llevar vellosidades. Este epitelio se compone de dos grandes tipos de celulas diferenciadas: los colonocitos de absorcion y las celulas caliciformes1 (Referencias 2). Hasta la fecha, no hay celulas madre que han sido identificadas en el colon.

[0226] Dado que las senales Wnt constituyen la principal fuerza impulsora detras de la biologla de las criptas5 (Referencias 2), hipotetizamos que uno o mas de genes diana Wnt/TCF4 (TCF7L2) pueden expresarse especlficamente en las celulas madre. Hemos descrito previamente el programa de gen diana Wnt/TCF4 en celulas de cancer colorrectales y se encontro que se expresaba fisiologicamente en las criptas intestinales6,7 (Referencias 2). Cuando se estudio la expresion de aproximadamente 80 genes diana7 seleccionados Tcf4, la inmensa mayorla se expreso tanto en las celulas de Paneth como en las celulas TA. El gen Gpr49/Lgr5, sin embargo, se expreso de una manera unica. El gen Gpr49 se comporto como un gen diana de Wnt, ya que su expresion se extinguio en la inhibicion inducida de actividad de la via Wnt por TCF4 dominante negativo en la llnea celular LS174T de cancer colorrectal humano, un sistema de celulas descrito anteriormente6 (Referencias 2) (Fig. 1a, carril 1 frente a 2). De acuerdo con ello, el gen se expreso en las criptas, pero no las vellosidades, de raton intestino delgado (Fig1a, carril 3 frente a 4). Hibridacion in situ revelo la expresion en un numero limitado de celulas situadas en todos los fondos de las criptas, as! como en adenomas en el intestino delgado de un raton APCmin (Fig. 1b y c). Este patron de expresion, ampliado en la figura 2c, claramente diferente del obtenido con un gen especlfico de las celulas Paneth (Fig 2a) o un gen TA-especlfico (Fig 2b). El gen Gpr49 aparecio para marcar celulas pequenas intercaladas entre las celulas de Paneth, las celulas de ciclo columnar de base de cripta (CBC) (Fig. 2d-h; vease mas adelante).

[0227] Gpr49 codifica un receptor huerfano acoplado a protelna G (GPCR), que se caracteriza por un gran dominio extracelular rico en leucina. Esta estrechamente relacionado con GPCRs con ligandos de glicoprotelnas, tales como receptores TSH-, FSH y LH8 (Referencias 2). Gpr49 estaba en la lista original de los objetivos Tcf4 en el cancer colorrectal6, pero despues se sido observado que tambien se sobreexpresa en los carcinomas de ovario y hepatocelulares910 (Referencias 2). Con el fin de estudiar su expresion en detalle obtuvimos un alelo knock-in, en el que LacZ, precedido por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), se integra solo N-terminal al primer dominio

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de transmembrana esencialmente creando un alelo nulo (Fig. 3a).

[0228] Mientras que nuestro estudio estaba en marcha, Morita et al publicaron el Gpr49-/- fenotipo11 (Referencias 2). Una malformacion de la lengua y la mandlbula inferior provoca que mutantes nacidos traguen grandes cantidades de aire que conducen a su desaparicion poco despues del nacimiento. Se observo el mismo fenotipo en nuestros ratones. Es de destacar que criptas y las celulas madre intestinales se establecieron por primera vez varias semanas despues del nacimiento12 (Referencias 2). Los ratones de heterocigoto Gpr49-lacZ nos permitieron detallar la expresion de Gpr49. Antes del nacimiento, se observo un patron de expresion dinamico y complejo (Barker et al, en preparacion). Proximamente al nacimiento, la expresion de Gpr49 se disminuyo en casi todos los tejidos. En los ratones adultos se restringio a las celulas raras, dispersas en el ojo, el cerebro, follculo piloso, glandula mamaria, los organos reproductores, el estomago y el tracto intestinal (Fig 3, y no mostrado). En el intestino delgado, se observo la expresion de Gpr49 en celulas delgadas situadas entre las celulas de Paneth en el intestino delgado (Fig 3b y c), y en un numero similar de celulas en la parte inferior de las criptas del colon (Fig 3d y e). El recuento de celulas azules en pequenas criptas intestinales seccionadas a traves del lumen revelo la presencia de aproximadamente 3,5 de tales celulas por cripta en seccion (Fig 2i, barra blanca). Hace mas de 30 anos, Leblond y Cheng senalaron la presencia de celulas de ciclo entre las celulas de Paneth y se ha empleado el termino celulas "Columnares de Base de Cripta" (CBC)13 (Referencias 2). Sobre la base de su posicion y su presencia en los clones mutantes epiteliales a largo plazo, Cheng y Bjerknes214 (Referencias 2) y Gordon y otros15 (Referencias 2) han propuesto que estas celulas pueden albergar actividad de las celulas madre

[0229] Por la morfologla, la celulas delgadas CBC Gpr49+ve con su escasa citoplasma y nucleos planos, en forma de cuna que apuntan hacia el lumen de las criptas eran facilmente distinguibles de las celulas de Paneth adyacentes. De vez en cuando (una vez en aproximadamente cada diez criptas), estas celulas tambien expresan el marcador de fase M de fosfo-histona H3, lo que indica que las celulas estan en ciclo (Fig 2f). De hecho, un pulso de 4 horas de BrdU etiquetado aproximadamente 1 de estas celulas por cripta (Fig 2g y 2I, barra negra izquierda), mientras que un etiquetado de BrdU continuo de 24 horas resulto en mas de 3 celulas positivas por cripta (Fig 2h y i, barra negra derecha), cerca del numero total de celulas CBC por cripta (Fig 2i, barra blanca). Esta observacion implica que el tiempo medio de ciclo de las celulas es CBC en el orden de 1 dla. La colocalizacion directa del marcador de proliferacion Ki67 con Gpr49-LacZ confirmo ademas que las celulas CBC LacZ positivas son tlpicamente de ciclo (Fig 2e y Fig 9).

[0230] Con el fin de ser capaz de visualizar las celulas CBC vivas y estudiar su "troncalidad" potencial, generamos otro alelo knock-in, en el que hemos integrado un casete EGFP-ires-CreERT2 en el primer codon ATG de Gpr49 (Fig. 4a y Fig. 6). Ratones heterocigotos que llevan este alelo eran sanos y fertiles. El patron GFP observado en tejidos adultos fielmente recapitula el patron visto anteriormente con el alelo Gpr49-LacZ en el ojo, cerebro, follculo piloso, glandula mamaria, los organos reproductivos, el estomago y el tracto intestinal (no mostrado, y Fig 4). La formacion de imagenes confocal permite la visualizacion de las celulas Gpr49+ve por fluorescencia de GFP en el intestino delgado (Fig 4b, c, e) y colon (Fig 4f). La microscopla inmuno-electronica utilizando marcaje de inmunooro de las celulas CBC GFP-positivas y de las celulas de Paneth y fibroblastos ilustraron la anatomla unica ultraestructural de las celulas CBC (Fig 4g y h). Tlpicamente, las celulas CBC eran relativamente anchas en su base, contenlan un nucleo en forma de cuna plana y organulos escasos. Una extension delgada de citoplasma apical se apreto entre las celulas Paneth granulares de retlculo y ricas en endoplasmatico, extendidas al lumen de cripta y llevaron algunas microvellosidades apicales.

[0231] A continuacion, cruzamos el alelo knock-in EGFP-ires-CreERT2 con el Rosa26-lacZ reportero activable por Cre16 (vease la Fig 4a para la estrategia experimental). La inyeccion de tamoxifeno activa la enzima de fusion CreERT2 en celulas que expresan Gpr49. La escision mediada por Cre de la secuencia de control de carretera en el Rosa26-lacZ reportero debe despues irreversiblemente marcar las celulas Gpr49+ve. Por otra parte, mientras que la progenie potencial de estas celulas ya no expresa GFP, el LacZ reportero activado debe actuar como una marca genetica, lo que facilita el seguimiento de linaje.

[0232] La expresion de LacZ no se observo en los ratones no inducidos (no mostrados). Para cuantificar el numero total de celulas CBC por cripta donde la enzima Cre latente podrla activarse por el tamoxifeno, se trataron los ratones de 2-3 meses de edad con tamoxifeno y se sacrificaron los ratones 12 horas despues. Como es evidente en la Fig 5a, senales LacZ azules aparecieron en las posiciones tlpicas de CBC. Se determino la frecuencia donde las celulas azules aparecieron en posiciones especlficas en relacion con la parte inferior de cripta, segun el esquema en la Fig 5b. La gran mayorla de las celulas CBC marcadas LacZ de Cre+ve, ocurrieron en las posiciones entre las celulas de Paneth, mientras que solo el 10% de estas celulas se observaron en la posicion 4 directamente por encima de las celulas (Fig 5b, llnea azul). Los datos cuantitativos sobre la posicion de las celulas de la etiqueta de retencion de ADN obtenidas a largo plazo en ratones despues de la irradiacion de adultos (que marcan las celulas madre intestinales "4") se publicaron recientemente por Potten y otros17. La comparacion de estos datos (Fig 5b, llnea roja) con la posicion de las celulas CBC con Cre activable revelo que los dos marcadores identificaron poblaciones de celulas que en gran parte no se solapan.

[0233] Otra caracterlstica definitoria de la celula +4 es su exquisita sensibilidad a dosis bajas (<1Gy) de radiacion4. Para comparar la sensibilidad relativa a la radiacion entre celulas CBC y celulas +4, los ratones adultos fueron

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irradiados con 1 Gy o 10 Gy y posteriormente se sacrificaron 6 horas mas tarde, al pico de apoptosis. Celulas activas caspasa-3-positivas se visualizaron por inmunohistoqulmica (Fig 7a). La frecuencia de celulas positivas por cripta se determino contando las celulas apoptoticas en tres clases: las celulas CBC (definidas por su ubicacion entre las celulas de Paneth), celulas +4 (situadas directamente encima de las celulas de Paneth) y celulas TA: situadas en la posicion 5-15 (Fig. 7b). Apoptosis maxima en la posicion 4 ya se alcanzo a 1 Gy (a: panel superior, flechas negras) en concordancia con (Referencias 2), mientras que 10 Gy causo significativamente mas apoptosis de 1 Gy de irradiacion en CBC (a: panel inferior) y celulas TA, lo que confirma las diferentes identidades del CBC y celulas +4.

[0234] Los ratones adultos se sometieron a un pulso de Tamoxifeno y se sacrificaron a 1, 5, 12 (no mostrado) y 60 dlas despues de la induccion. Un dla despues de la induccion, se observaron celulas CBC ocasionales en las criptas del intestino delgado y el colon para expresar LacZ (Fig 5c y 5i, respectivamente). Como se demuestra por todo el montaje en el intestino delgado en la Fig 8, cintas paralelas de celulas surgidas desde las partes inferiores de las criptas y corrieron por el lado de las vellosidades adyacentes en momentos posteriores. La cinetica de formacion de banda no era uniforme. Algunas rayas ya llegaron a la punta de las vellosidades 5 dlas despues de la induccion, mientras que la tincion azul en las criptas de vez en cuando todavla se restringio a las criptas. A los 5 dlas despues de la induccion (Figura 5d), dicha expresion restringida en la cripta se ve muy raramente. Las celulas CBC eran capaces de mantenimiento a largo plazo del epitelio de auto-renovacion, ya que en los intestinos de 60 dlas (Fig 5e y Fig. 8) la frecuencia de las criptas y las cintas azules eran esencialmente identicas a las observadas a los 5-12 dlas post-induccion.

[0235] El doble etiquetado de intestino inducido por 60 dlass demostro la presencia de celulas caliciformes PAS- positivas (Fig 5f), celulas PAS-positivas de Paneth (Fig 5g) y celulas enteroendocrinas sinaptofisina-positivas (Fig 5h) en los clones LacZ-manchados procedentes de celulas CBC Gpr49+ve. El uso de marcado mutacional, Cheng y Bjerknes han informado de la existencia de diferentes tipos de clones de larga vida epiteliales, es decir, clones (enterocitos) columnares, clones (caliciformes) mucosos y clones mixtos2. Los clones observados en nuestro estudio eran exclusivamente de la variedad mixta. En clones azules, la frecuencia de celulas caliciformes (114 de 2043 celulas totales contadas), enterocitos (1846/2043) y celulas de Paneth (83/2043) eran comparables a la frecuencia de las celulas caliciformes (127 de cada 3691 celulas totales contadas) enterocitos, (3345/3691) y celulas de Paneth (127/3691) en el epitelio adyacente sin marcar. Como se ha senalado 2 (Referencias 2), el tercer tipo de celulas secretoras, la celula enteroendocrina, era demasiado rara para permitir la enumeracion precisa. En conjunto, llegamos a la conclusion de que el celulas CBC Gpr49+ve representan las verdaderas celulas madre del intestino delgado.

[0236] El analisis del colon produjo observaciones esencialmente identicas. Las celulas Gpr49+ve produjeron clones azules que emanan del fondo de cripta (Fig 5i). Estos clones contenlan colonocitos as! como las celulas caliciformes, y esencialmente se mantuvo sin cambios durante los 60 dlas de persecucion (Fig 5j, k). Una diferencia significativa con la situacion en el intestino delgado implico la cinetica de formacion del clon. A los 5 dlas, la tincion de azul en la mayorla de las criptas era todavla restringida al fondo y criptas completamente azules fueron observadas solo en raras ocasiones, lo que implica que las celulas madre de colon eran mas a menudo de reposo que sus contrapartes pequenas intestinales. En dlas posteriores, el numero relativo de criptas totalmente azules se aumento. Llegamos a la conclusion de que las celulas del colon Gpr49+ve cumplen los requisitos de celulas madre pluripotentes y capaces de mantener auto-renovacion epitelial durante largos perlodos de tiempo.

[0237] Nuestras observaciones proporcionan la caracterizacion definitiva de la celula madre intestinal por el seguimiento de linaje usando la expresion de un unico gen marcador, Gpr49. Las celulas pequenas Gpr49+ve intestinales generalmente no son de reposo, pero son de ciclo rapido, como se evidencia por la expresion de Ki67 y H3 fosfo-histona, la incorporacion de BrdU, y por la cinetica de la formacion de la cinta. Las celulas Gpr49+ve del intestino delgado aparecen dividiendo mas activamente que sus homologos del colon, probablemente reflejan las diferencias en la tasa de recambio epitelial entre los dos organos. Parece poco intuitivo ese ciclo de las celulas madre. Esto es, sin embargo, no sin precedentes. Las celulas madre germinales del testlculo Drosophila y ovario de la mosca, podrla decirse que las celulas madre adultas se entienden mejor en los animales, ciclan durante toda la vida de la mosca adulta18 (Referencias 2). Del mismo modo, un elegante estudio reciente demostro que las celulas madre adultas de la piel de los mamlferos son el ciclismo de forma continua19 (Referencias 2).

[0238] Las celulas en ciclo +4 han sido previamente propuestas por Potten y otros para representar a las celulas madre pequenas intestinales4 (Referencias 2), una nocion no se ha confirmado aqul. La nocion se basa en la observacion de que una etiqueta de ADN incorporada durante los perlodos de actividad de celulas madre altas se mantuvieron especlficamente en las celulas en la posicion 4. La retencion de etiquetas a largo plazo se utiliza a menudo como una estrategia indirecta para identificar las celulas madre12 (Referencias 2). Cabe senalar, sin embargo, que las celulas que se diferencian terminalmente conservan tambien las etiquetas de ADN y por lo tanto que la retencion de etiquetas debe interpretarse con precaucion. Estudios previos han propuesto otros marcadores de celulas madre intestinales. Musashi2021 (Referencias 2) y CD13322 (Referencias 2) en nuestras manos manchan hasta 30-50 celulas por cripta (no mostradas), que aparecen para abarcar las celulas CBC, as! como celulas de amplificacion temprana de transito. Li y otros han descrito diversos marcadores moleculares de las celulas +4, incluyendo fosfo-PTEN, fosfo-AKT y 14-3-3Z23 (Referencias 2). Nuestro estudio indica que la validez de estos marcadores de celulas madre putativas debe reconsiderarse.

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[0239] Parece bastante singular que las celulas madre adultas pueden identificarse en base a la expresion de un solo gen. Este fenomeno no puede limitarse al intestino, ya que observamos expresion Gpr49 muy restringida en una variedad de otros tejidos. En el follculo del pelo anagen, el gen Gpr49 se expresa en el area de protuberancia, as! como en la vaina externa de la ralz (Fig 3i). Mientras que las celulas madre quiescentes LTR residen exclusivamente en la protuberancia, celulas madre activadas migran a traves de la vaina externa de la ralz hacia las papilas basales24’26 (Referencias 2). De hecho, se informo recientemente que Gpr49 era el segundo gen mas altamente regulado hacia arriba segun la evaluacion de la expresion diferencial de poner en orden celulas madre aisladas del follculo piloso27 (Referencias 2). Por otra parte, experimentos de seguimiento de linaje preliminar en el follculo piloso apoyan la nocion de que celulas Gpr49+ve representan celulas madre (Barker, Clevers y Toftgard, no publicado). Aunque patrones de la proliferacion en las glandulas del estomago han indicado que las celulas madre epiteliales residen en el istmo, a medio camino entre la base de empaquetadura y la superficie epitelial28 (Referencias 2) encontramos Gpr49 expresada en partes inferiores de las glandulas (Fig 3f,g). Experimentos de seguimiento de linaje implican que las glandulas enteras se derivan de estas celulas (Barker y Clevers, no publicado). En la glandula mamaria, las celulas madre residen en la capa basal del epitelio 29 (Referencias 2), donde se observa la expresion de Gpr49 (Fig 3h). Gpr49 puede as! representar un marcador mas general de las celulas madre adultas. Si es verdad, los modelos de raton desarrollaron en el curso de este estudio permitiran el aislamiento, as! como la modificacion genetica especlfica de las celulas madre adultas vivas en una variedad de organos. Primero identificamos Gpr49 como un gen expresado en celulas de cancer de colon6 (Referencias 2). Se expresa en otros tipos de cancer9, (Referencias 2) y, como se describe en el presente estudio, tambien en adenomas de raton premalignas. Sobre la base de las observaciones reportadas aqul, ahora sabemos que Gpr49 puede marcar las celulas madre cancerosas ("celulas iniciadoras del tumor") en los adenocarcinomas colorrectales.

Ejemplo 2 Expresion tisular Lgr5 y evidencia de celulas madre Lgr5+ en estos tejidos

Materiales y metodos

[0240] Para detalles experimentales, nos referimos a los materiales y metodos tal como se utiliza en el ejemplo 1 Resultados y discusion

Expresion Lgr5 tambien se detecto en el cerebro, la retina, el hfgado y la glandula adrenal

[0241] Se estudio la expresion Lgr5 en multiples otros tejidos en los ratones portadores de lacZ integrados en el ultimo exon del gen Gpr49, la eliminacion de todas las regiones transmembranas de la protelna Gpr49 codificada. Se determino que, analogamente al colon y el intestino delgado, celulas Lgr5+ se detectaron en el cerebro, la retina, el hlgado y la glandula adrenal (Fig 12). En ratones adultos, Lgr5 se limita a poblaciones de celulas raras en el cerebro (glomerulos del bulbo olfatorio y varias otras regiones mal definidas), el ojo (capa nuclear interna de la retina), el hlgado (celulas que rodean a las trladas portales) y la glandula adrenal.

Seguimiento de linaje en el estomago, glandula mamaria y la glandula suprarrenal demuestra que Lgr5 esta marcando poblaciones de celulas madre en estos tejidos

[0242] Se utilizaron los ratones Lgr5KI/Rosa26-lacZ16 (Vease el ejemplo 1 para la estrategia experimental) para estudiar la presencia de celulas madre Lgr5+ en varios otros tejidos. La inyeccion de tamoxifeno activa la enzima de fusion CreERT2 en celulas que expresan Gpr49. La escision mediada por Cre de la secuencia de control en el reportero Rosa26-lacZ debe irreversiblemente marcar celulas Gpr49+ve. Por otra parte, mientras que la progenie de potencial de estas celulas GFP ya no se expresa, el reportero LacZ activado debe actuar como una marca genetica permanente, que se transmitira a cualquiera de los descendientes de celulas Lgr5+ve, lo que nos permite un seguimiento de su apariencia y destino in-vivo.

[0243] El seguimiento de linaje se inicio en los ratones Lgr5KI/Rosa26-lacZ jovenes y el epitelio del estomago analizo la actividad de LacZ despues de 6 meses. Las celulas Lgr5-lacZ positivas estan restringidas inicialmente a la base de las glandulas (Fig. 13a). Despues de 6 meses, varias glandulas enteramente lacZ-positivas son visibles en todo el estomago (Fig. 13b), que demuestran que las celulas Lgr5+ve son capaces de generar todos los tipos de celulas en el epitelio glandular durante largos perlodos de tiempo.

[0244] Experimentos de seguimiento de linaje se realizaron y el epitelio de la glandula mamaria se analizo para la actividad para LacZ durante un perlodo de 3 meses. Las elulas Lgr5-lacZ positivas estan restringidas inicialmente a las celulas epiteliales basales raras en las glandulas vlrgenes (Fig. 14a). Despues del embarazo, las celulas LacZ- positivas son visibles en el epitelio basal de las glandulas productoras de leche recien formadas (Fig. 14b). Esto demuestra que celulas Lgr5+ en la glandula mamaria son celulas madre mioepiteliales.

[0245] El seguimiento de linaje en las glandulas suprarrenales analizadas para la actividad LacZ durante un perlodo de 3 meses. Las celulas Lgr5-lacZ positivas estan restringidas inicialmente a la periferia de la glandula suprarrenal 5 dlas despues de la induction (Fig. 15a). Despues de 3 meses la mayorla de la medula suprarrenal es LacZ positiva (Fig 15b). Esto sigue siendo positivo durante un perlodo de 14 meses (no se muestra). Esto demuestra que las

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celulas Lgr5+ son las celulas madre de la medula suprarrenal.

Ejemplo 3 Expresion tisular Lgr6 y expresion Lgr6 en las celulas madre relacionadas Material y metodos

Ratones transgenicos y tratamientos.

[0246] Ratones Lgr6-EGFP-ires-CreERT2 fueron generados por recombinacion homologa en celulas madre embrionarias orientadas a un casete EGFP-IRES-CreERT2 a la ATG de Lgr6. Ratones Rosa26-lacZ reportero se obtuvieron del laboratorio Jackson. Los animales fueron alimentados ad libitum. La recombinasa Cre se activo en ratones Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/Rosa26-LacZ mediante la inyeccion de 200 pl de tamoxifeno (10 mg/ml disuelto en aceite de girasol) por via intraperitoneal.

Analisis confocal de la expresion de EGFP

[0247] Para imagenes confocales las muestras de piel se fijaron en formalina durante 15 minutos a TA y se introdujeron en 4% de agarosa de baja fusion. Secciones longitudinales de espesor entre 100 y 200 pm se prepararon usando un vibratoma. Secciones se permeabilizaron en PBS suplementado con 1% de BSA + 1% de DMSO + 0,1% TritonX, se tineron durante 30 minutos con TOPRO 1: 1000 dilucion (Molecular Probes) y se incluyeron utilizando Vectashield (Vector Labs). Las secciones fueron fotografiadas con un microscopio confocal Sp2 (Leica) y se procesaron utilizando software Volocity y Photoshop CS2.

Deteccion de la actividad beta-galactosidasa

[0248] Tejidos obtenidos recientemente se fijaron durante 2 horas en 1% de formaldehldo/0,2% de glutaraldehldo/0,02% NP40 en solucion PBS0 a 4°C en una plataforma de balanceo. Las muestras se lavaron 3 veces durante 20 min con tampon de enjuagado (2 mM MgCl2/0,02% NP40/PBS0) y se tineron para 36 a 48 h en una solucion que consiste en 1 mg/ml de X-gal, 5 mM ferrotiocianuro, 5 mM ferritiocianuro, 0,1% desoxicolato de sodio en tampon de enjuague. El sustrato se retiro y las muestras se lavaron dos veces en PBS0 durante 20 min a temperatura ambiente en una plataforma de balanceo. Los tejidos se fijaron durante la noche en 4% PFA en PBS0 a 4°C en la oscuridad en una plataforma de balanceo. El PFA se retiro y los tejidos se lavaron dos veces en PBS0 durante 20 min a temperatura ambiente. Las muestras se incluyeron en parafina, se seccionaron (4 pm) y se contratineron con rojo neutro.

Resultados y discusion

[0249] Para caracterizar la expresion de Lgr6 en la piel se utilizo un raton knock-in, en el que el promotor Lgr6 controla la expresion de EGFP y la protelna de fusion CreERT2, denominada Lgr6-EGFP-ires-CreERT2. En P25 cuando los follculos pilosos (HFS) estan en la fase de crecimiento (anagena), las celulas GFP-positivas fueron localizadas a las celulas de la zona de abultamiento superior/istmo del HF (Fig 16A, C) y las celulas basales de la epidermis interfollicular (IFE, Fig 16A, B). Este patron de expresion sugiere que la expresion Lgr6 marca una poblacion de celulas SC/poblacion celular de progenitores tempranos del follculo del pelo y la epidermis.

[0250] Para hacer frente a la cuestion de si las celulas Lgr6+ del anageno HF e IFE representan celulas madre funcionales, ratones de 20 dlas de edad Lgr6-EGFP-Ires-CreERT2/Rosa26-lacZ fueron inyectados con tamoxifeno. En P20 Lgr6 se expresa en la zona de protuberancia superior/istmo de la HF y las celulas basales del IFE (datos no mostrados). Tres dlas despues de la inyeccion de tamoxifeno, un patron disperso de celulas marcadas se podia ver en las FCs y el IFE (Fig. 17B). A los 18 dlas despues de la inyeccion la progenie de celulas Lgr6+ se podia ver en las FCs anagenas (Fig. 17C, D), asi como en el IFE y las glandulas sebaceas (SG) (Fig. 17C, D). En el siguiente celulas marcadas con telogeno se encontraron en la protuberancia y en el istmo (Fig. 17E, F) y el IFE y SGs (Fig. 17E, F). Esta observacion sugiere fuertemente que celulas Lgr6+ situadas en la zona de protuberancia/istmo de la HF y las IFE basales exhiben propiedades de celulas madre. En particular, Celulas Lgr6+ pueden contribuir a todos los apendices de la piel, es decir, creciente HFS, IFE y SG.

[0251] Parece bastante singular que las celulas madre adultas se pueden identificar sobre la base de la expresion de un unico gen, en este caso Lgr6. Este fenomeno no puede restringirse a la piel, ya que se observa la expresion altamente restringida de Lgr6 en una variedad de otros tejidos. Para hacer frente a la cuestion de si las celulas Lgr6+ representan celulas madre funcionales en cualesquiera otros tejidos de ratones de 20 dias de edad Lgr6-EGFP-ires- CreERT2/Rosa26-lacZ fueron inyectados con tamoxifeno. Tincion LacZ se realizo en 18 y 32 dias despues de la inyeccion de tamoxifeno para evaluar el seguimiento de linaje en una variedad de tejidos. Curiosamente, las celulas LacZ positivas estaban presentes en el mioepitelio subyacente a los bronquiolos del pulmon en ambos puntos de tiempo (Fig. 18). Por lo tanto, las celulas Lgr6+ contribuyen al mioepitelio del pulmon sugiriendo fuertemente que las celulas Lgr6+ ubicadas en el pulmon exhiben tambien las propiedades de celulas madre.

Ejemplo 4 El papel de celulas madre cancerosas Lgr5+ en adenoma

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[0252] La anatomla de la cripta intestinal es especialmente adecuada para estudiar las celulas madre adultas en su nicho. El epitelio del intestino delgado murino se renueva cada cinco dlas12 (referencias 5). Proliferacion vigorosa ocurre dentro del compartimiento de cripta. Recientemente hemos identificado celulas delgadas, no diferenciadas que expresan el gen Lgr5 situado en partes inferiores de las criptas como las celulas madre del intestino delgado y el colon. Cada pequena cripta intestinal contiene aproximadamente 6 celulas madre independientes, de larga vida que se entremezclan con las celulas de Paneth en el intestino delgado y con celulas caliciformes en el colon. Contra- intuitivamente, estas celulas no son inactivas, pero completan un ciclo celular cada dla3 (referencias 5). Leblond et al han llamado originalmente estas celulas morfologicamente celulas columnares de base de cripta (CBC)45 (referencias 5). Sus celulas hijas constituyen el compartimiento de cripta de amplificacion de transito facilmente distinguible (TA). Celulas TA se dividen cada 12-16 horas, lo que genera unas 300 celulas por cripta cada dla6 (referencias 5). Celulas TA recien formadas residen dentro de las criptas de aproximadamente 48-72 horas, sufriendo hasta 6 rondas de division celular durante la migracion hacia arriba6 (referencias 5). Cuando las celulas TA comprometidas llegan al cruce de cripta-vellosidad, se diferencian rapida e irreversiblemente. La proliferacion se equilibra con la apoptosis en el otro extremo de la cinta transportadora epitelial, la punta de la vellosidad. Solo las celulas de Paneth se escapan de este flujo; tienen un tiempo de residencia de 3-6 semanas en la base de cripta7-9 (referencias 5). El inicio de mutacion en neoplasias intestinales en componentes diana de raton y de hombre de la via Wnt, mas frecuentemente el regulador negativo Wnt APC1011 (referencias 5). Esto resulta en la activacion constitutiva de un programa de gen diana Wnt que impulsa la formacion de adenomas benignos o polipos12-15 (referencias 5). Sin embargo, no esta claro que tipo de celula sostiene la mutacion de iniciacion de cancer.

[0253] El raton A-H-Cre citocromo P450-impulsado por promotor permite la supresion condicional de alelos floxeados en el epitelio intestinal despues de la administracion del agente inductor, p-naptoflavona (p-NF). Es importante destacar que el alelo A-H-Cre es altamente activo en todos los tipos de celulas del epitelio, incluyendo las celulas madre16 (referencias 5). Hemos empleado previamente un alelo floxeado de APC17 (referencias 5) en combinacion con la llnea de raton A-H-Cre para demostrar que la perdida aguda de APC en todo el epitelio intestinal de adultos despues de la inyeccion IP de p-NF conduce a una transformation inmediata cuantitativa del epitelio16 (referencias 5), un proceso casi enteramente dependiente del gen diana Wnt aguas abajo c-MyC18 (referencias 5). Alta dosis oral p-NF induce mas deletion estocastica de APC, lo que resulta en la formacion de adenoma rapida a lo largo del intestino dentro de 3 semanas19 (referencias 5). Ambos de estos protocolos de induction de dosis altas efectuan la delecion en todos los compartimentos del epitelio, incluyendo las celulas madre en la base cripta.

[0254] Despues de haber validado el raton AHCre/APCflox/flox como un modelo inducible de cancer intestinal, hemos tratado de diseccionar el mecanismo de la formacion de adenoma mediante la identification de su celula de origen. Razonamos que la administracion oral de dosis bajas de p-NF restringirla su campo de action a las celulas en las vellosidades y las regiones superiores de las criptas. El ajuste cuidadoso de la dosis requerida revelo que despues de la administracion oral de 1 mg/kg p-NF, la eficiencia de la activacion de Cre en las celulas madre en la base de cripta era extremadamente baja, tal como se mide por la frecuencia insignificante del seguimiento de linaje a largo plazo iniciado en ratones AHCre/R26R que reciben esta dosis. Esta dosis era todavla muy eficiente en la induccion de la actividad de Cre en el compartimiento TA y de epitelio de vellosidades, tal como se detecto utilizando el raton Rosa26-LacZ20 (referencias 5) como un reportero Cre (Fig. 19a, b). En un experimento tlpico sobre el 70% de las vellosidades contenla celulas azules 2 dlas despues de la induccion, pero al dla 7 la tincion con azul ya no se pudo detectar. De acuerdo con esto, ningunas cintas de cripta/vellosidad se detectaron en el dla 100 despues de la induccion (Fig 19c).

[0255] Al utilizarse este regimen de dosificacion en AHCre/APCflox/flox/ratones R26R, se hicieron visibles multiples focos p-cateninaaltos/lesiones rapidamente a lo largo de la cripta superior y el epitelio de las vellosidades. Imagenes representativas tomadas en el dla 3 despues de la induccion se dan en la Fig 20. Focos mutantes APC evidentes por niveles altos de p-catenina ocurrieron predominantemente en los cruces de las criptas-vellosidades, pero tambien se observaron en las vellosidades (Fig 19d). Muy poco frecuentemente estas lesiones tambien se vieron cerca de la base de cripta.

[0256] La mayorla de las celulas APC-deficientes presentes en el epitelio de las vellosidades se perdieron despues de 4-5 dlas, presumiblemente por vertimiento. Las lesiones/focos lacZ-positivas APC deficientes restantes presentes dentro de las criptas no se expandieron durante un periodo de 24 dlas. Un ejemplo tlpico de una lesion de este tipo se da en la Figura 20e. Ningun adenoma macroscopico era visible en este paso. Sorprendentemente, estas pequenas lesiones persistieron durante un periodo de 180 dlas (Fig 20g), y solo en muy raras ocasiones progresaron a pequenos adenomas, los cuales no se expandieron mas alla de 2-3 vellosidades (Fig 20f, h). Esto estaba en marcado contraste con la formacion de alta frecuencia de adenomas grandes iniciados en ratones AHcre/APCflox/flox despues de altas dosis de induccion p-NF. Esto sugirio que la gran mayorla de los adenomas en estos ultimos ratones resultaron de la perdida de APC en celulas madre.

[0257] Con el fin de demostrar formalmente que la transformacion de las celulas madre intestinales es la principal via para la formacion de adenoma, empleamos nuestros ratones knock-in Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 como una llnea Cre especlfica de celulas madre para eliminar de manera inducible la APC floxeada. Con este fin, se generaron ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 x APCflox/flox. En estos ratones, la enzima Cre especlfica a celulas madre se activo

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con una sola inyeccion IP de tamoxifeno (Fig 21a). Cambios fenotlpicos posteriores en el intestino se siguieron durante un perlodo de 2 meses. La acumulacion de protelna p-catenina Wnt-efector se observo primero en celulas CBC aisladas en la base cripta despues de 3 dlas (Fig.21a). Estas celulas transformadas eran GFP-positivas, lo que confirma la delecion diana de APC en las celulas madre intestinales (Fig.21 b). Despues de 5 dlas, se observo que multiples criptas tenlan celulas madre transformadas en todo el intestino grueso (es decir, p-cateninaalta) en asociacion con racimos/bolsillos de celulas altamente proliferativas de celulas madre p-cateninaalta dentro del compartimento de transito de amplificacion (TA) (Fig.21c, d). Esto indicaba que las celulas madre transformadas por Wnt permanecen viables y generan rapidamente una poblacion en crecimiento de la progenie transformada mas arriba en las criptas. Ocho dlas despues de la induction de la delecion APC en las celulas madre, las "bolsas" de celulas transformadas hablan continuado su expansion dentro de las criptas y bolsas/evaginaciones del epitelio de las criptas y pequenas microadenomas dentro del estroma de las vellosidades asociadas se hicieron evidentes (Figura 21e). Las celulas con p-catenina acumulada no estaban presentes en el epitelio de las vellosidades en estos ratones, lo que demuestra que el aumento de la poblacion transformada se limita a las criptas intestinales. Estas observaciones son sorprendentemente una reminiscencia de un modelo de formation de adenoma, en el que celulas transformadas por Wnt que expresan altos niveles del gen diana Wnt EphB2 y -B3 se expanden dentro de la cripta hasta que entran en contacto con el epitelio de las vellosidades Ephrin-positivas2122 (referencias 5). Las fuerzas de repulsion resultantes en consecuencia dictan que el microadenoma solo puede seguir ampliando al invadir el estroma de las vellosidades donde se encuentran protegidas en el epitelio de vellosidades Ephrin positivas.

[0258] Las "bolsas" y microadenomas presentes en los ratones Lgr5KI/APCflox/flox inducidos en 8 dlas continuaron su expansion agresiva, como se evidencia por la presencia de multiples adenomas grandes en todo el intestino 36 dlas despues de iniciar la transformation de celulas madre (fig 21f).

[0259] Para investigar mas a fondo la jerarqula que existe entre las celulas madre APC-deficientes y su progenie transformada, se analizo la expresion de la protelna marcadora de celulas madre Lgr5-EGFP durante las diversas etapas de la formacion de adenoma en nuestro modelo. En las celulas madre no transformadas, la expresion Lgr5- EGFP se restringio a las celulas columnares de base de criptas (CBC) (Fig 22a). La expresion de este marcador de celulas madre se mantuvo despues de la transformacion inicial de las celulas madre despues de 3 dlas (Fig 22b) y tambien era claramente evidente en las "bolsas" de la progenie transformada recientemente expandida dentro de las criptas despues de 8 dlas (Fig 22c), lo que indica que al menos algun aspecto de "troncalidad" se confirio a estas celulas. Sin embargo, hubo una marcada regulation haca abajo de expresion Lgr5-EGFP en los adenomas mas grandes presentes en los intestinos de ratones inducidos de 36 dlas, a pesar de niveles de p-catenina uniformemente altos en todo el tumor (Fig 22d). La expresion Lgr5-EGFP estaba limitada a unas pocas celulas dispersas dentro de la masa tumoral (Fig. 23). Estas celulas GFP-positivas retuvieron la morfologla delgada, en forma de cuna caracterlstica de las celulas madre intestinales CBC. Por lo tanto, es tentador especular que la expresion Lgr5 en adenomas grandes esta marcando una poblacion rara de celulas madre responsables por estimular su crecimiento continuo. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la transformacion de las celulas madre a traves de la perdida de la APC es una ruta extremadamente eficiente hacia el inicio de la formacion de adenoma intestinal. La cinetica de este proceso sugiere que ninguna mutation adicional se requiere una vez que ambos alelos Apc se pierden en el epitelio intestinal, que es de conformidad con el tejido-tropismo de actividad supresora de tumores de APC.

Ejemplo 5 Generacion y uso de anticuerpos dirigidos contra Lgr5 y Lgr6 Materiales y metodos

[0260] Los anticuerpos monoclonales de rata fueron generados por Genovac (Freiburg, Alemania) por inyeccion intramuscular de las ratas con un plasmido de expresion que expresan cualquiera de Lgr5 o Lgr6 humano. Celulas B de rata se fusionan con celulas de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes se seleccionaron en celulas HEK293 que fueron transfectadas con plasmidos de expresion Lgr5 o Lgr6 humanos o de raton.

[0261] Las celulas L8 (DNTcf4-LS174T) se cultivaron con y sin doxiciclina durante 48 horas. Las celulas L8 son derivados clonales de celulas LS174T. En induccion de doxiciclina (DOX) las celulas L8 expresan una forma dominante negativa de Factor 4 de celulas T (DNTcf4; vease Roose et al, 1999, Science 285: 1923-1926.). DNTcf4 apaga via Wnt activa constitutiva. IgG de rata fue utilizado como control de isotipo negativo. Despues de 48 horas las celulas se lavan con PBS frlo y se ponen en suspension utilizando 5 mM EDTA. Todos los pasos siguientes se realizan a 4°C. Las celulas se bloquearon durante 30 min en PBS que contenla 2% de BSA. Reactivo de anticuerpo primario (1°) y secundario (2°) se incubaron posteriormente durante 1 hora, y se lavaron con hielo frlo PBS/2% BSA. Para la tincion de anticuerpo primario se utilizo sobrenadante de hibridoma sin diluir, segunda tincion de anticuerpos se realizo utilizando Qdot® 655 de conjugados de IgG anti-rata de cabra F(a-b')2 (H+L) (Molecular Probes/Invitrogen). Antes de analisis, yodo de propidio se anadio para excluir las celulas muertas en el analisis.

Resultados

[0262] La especificidad de algunos de los anticuerpos aislados se muestra en las Tablas 4 y 5, como se probo por analisis de FACS. 9G5 es un anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra hLgr5. Se determino el analisis de la

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expresion Lgr5 endogena en las celulas L8. Las celulas L8 son derivados clonales de celulas LS174T. Tras la induction de doxiciclina (DOX), las celulas L8 expresan Tcf4 dominante negativo (DNTcf4). DNTcf4 apaga via Wnt activa constitutiva. Esto se refleja en la Fig. 24, que muestra tincion FACS de las celulas L8 con el anticuerpo 9G5 o anticuerpo de control IgG. Despues de 48 horas de la induccion de DOX, se observo una reduction de los niveles endogenos de protelna hLgr5, como tambien se hace evidente a partir de la reduccion en los medios fluorescentes del pico para las celulas L8 tratadas con doxiciclina.

[0263] Este experimento tambien se llevo a cabo con anticuerpos Lgr5 especlficos 2F10, 10C1 y 6C10. Como se muestra en la Figura 26, se obtienen resultados similares con cualquiera de estos anticuerpos Lgr5 especlficos.

Tabla 4. Especificidad de los anticuerpos Lgr5. 9G5 reconoce Lgr5 tanto de raton como humano Las llneas celulares de cancer de colon; DLD1 y SW480, LIM1863 no muestran tincion especlfica para Lgr5. Estos anticuerpos dieron negativos para la reactividad cruzada frente a Lgr4, 6 de raton y Lgr4 y 6 humana.

: Sobreexpresion mLgr5- 293T Sobreexpresion hLgr5- 293T LS174 L8 (DNTcf4- LS174)

NR 1D9: - + + +

NR 2F10: - + + +

NR 4D11: - + + +

NR 6C10: - + + +

NR 9B3: - + + +

NR 3A4: - + + +

NR 5A7: - + + +

NR 6G2: - + + +

NR 9G5: + + + + + + + +

NR 2B8: - + + + + + +

NR 3B9: - + + + + + +

NR 5C8: - + + +

NR 7B11: - + + +

NR10C1: - + + +

NR 4D6: - + + +

NR 5E9: - + + +

NR 8F2: - + + + + + +

NR10F7: - + + +

Tabla 5 Especificidad de anticuerpos Lgr6. Los anticuerpos 1d8 y 3d8 reconocen Lgr6 y hLgr5 de raton ademas de Lgr6 humano. Las llneas celulares de cancer de colon; LS174, DLD1 y SW480 no muestran tincion especlfica para Lgr6. Estos anticuerpos dieron negativos para reactividad cruzada contra Lgr4, 5 de raton y Lgr4 humano.

Numero de clon: 1d8 3d8 6d8 2f4 2h10 5e10

Sobreexpresion hLgr5-293T: + + - - - - 10

Sobreexpresion mLgr6-293T: + + - - - -

Sobreexpresion hLgr6-293T: + + + + + + + + + + +

LS174: - - - - - -

L8 (LS174-DNTcf4): - - - - - -

Ejemplo 6 Analisis de expresion de celulas madre de colon y de intestino delgado comparadas con su progenie directa

Materiales y Metodos

Aislamiento de las celulas epiteliales positivas

[0264] Los intestinos delgados o colonos recien aislados se incisaron a lo largo de su longitud y las vellosidades (en el caso del intestino delgado) se eliminaron mediante raspado. El tejido se incubo a continuation en PBS/5 mM EDTA durante 5 minutos. La agitation suave elimino las vellosidades restantes y el tejido intestinal fue posteriormente incubado en PBS/EDTA durante 30 minutos a 4°C. La agitacion vigorosa produjo criptas libres que se incubaron en PBS suplementado con tripsina (10 mg/ml) y ADNasa (0,8 u/pl) durante 30 minutos a 37°C. Despues de la incubacion, las celulas se centrifugaron, se resuspendieron en SMEM (Invitrogen) y se filtraron a

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traves de una malla de 40 mM. Las celulas que expresan GFP se aislaron usando un clasificador de celulas MoFlo (DAKO).

Analisis de micromatriz

[0265] Se aislo ARN de las fracciones de celulas GFPhi y GFPlD de intestinos de ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2. Se marcaron 250 ng de ARN total utilizando un kit de bajo voltaje de entrada lineal de ARN (Agilent Technologies, Pato Alto, CA, EE.UU.). Los protocolos de etiquetado, hibridacion y lavado se realizaron de acuerdo con las directrices (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). ARNc marcado diferencialmente de celulas GFPhi y GFPlD de dos tipos diferentes (cada uno de los cuales combinaba tres ratones diferentes) se combinaron y se hibridaron en micromatrices de doble color de genoma de raton entero de agilente 4X44K (G4122F) en dos experimentos de intercambio de colorantes, resultando en cuatro matrices individuales. Todos los analisis de datos se realizaron utilizando ArrayAssist (Stratagene Inc, La Jolla, CA, EE.UU.) y Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE.UU.). Las intensidades de la senal cruda se corrigieron restando el fondo local. Los valores negativos fueron cambiados por un valor positivo cercano a cero (desviacion estandar del fondo local) para permitir el calculo de raciones entre intensidades para las caracterlsticas presentes solamente en una muestra (GFPhi o GFPlD). Los datos se filtraron si ambas intensidades (GFPhi o GFPlD) se cambiaban o si ambas intensidades eran menos de dos veces la senal de fondo y se normalizaban mediante un algoritmo de Loess. El analisis estadlstico se realizo mediante la ejecucion de una version de Excel de SAM (Analisis Significativo de Micromatrices) utilizando un complemento de Excel del software (Tusher PNAS 2001, Referencias 6) y "una clase" como el valor de respuesta. Se considero que los genes se enriqueclan significativamente en celulas GFPhi si tuvieran un valor q <0,1 y donde estuvieran presentes en al menos 3 de 4 matrices y el promedio de los cuatro matrices excedio una ratio log2 de 0,6.

Resultados

[0266] Con el fin de definir un perfil de expresion genica para celulas madre intestinales Lgr5+, se establecio un protocolo para clasificar las celulas epiteliales GFP-positivas a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de criptas recien aisladas de ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 (vease Metodos). Analisis FACS distinguio una poblacion GFP-alta (GFPhi) y una GFP-baja (GFPlD), identificada provisionalmente como celulas CBC y sus hijas de amplificacion de transito inmediatas, respectivamente (Figura 25]. Un unico intestino de raton rutinariamente produjo varios cientos de miles de celulas GFPhi y GFPlD. En la Figura 25a se proporciona un ejemplo de una poblacion casi pura de celulas que expresan Lgr5. Con el fin de identificar nuevos genes de celulas madre, muestras ARNm de las dos poblaciones se sometieron a perfiles de expresion genica comparativa. El gen que estaba mas altamente enriquecido en las celulas GFPhi era, satisfactoriamente, el propio gen Lgr5. Varios genes en la lista (Tabla 6) ya fueron identificados como genes diana intestinales Wnt previamente, por ejemplo, en el cancer de colon humano (van der Flier et al, 2007, Gastroenterology 132, 628-632), que valido aun mas la lista de genes. Aunque hibridaciones in situ en estos genes diana Wnt normalmente confirmo la expresion de un alto nivel en celulas cBc, celulas TA directamente por encima de las celulas de Paneth tambien expresaron estos genes, aunque a un nivel mucho mas bajo. A modo de ejemplo, la Figura 25B muestra la expresion de Sox9, un gen que responde a Wnt (Blache et al., 2004) crucial para la especificacion de celulas de Paneth (Bastide et al., 2007; Mori-Akiyama et al., 2007).

Discusion

[0267] En el intestino, un conjunto de celulas madre de ciclo largo de vida larga se define por la expresion de Lgr5, un receptor acoplado a G huerfano sensible a Wnt (Barker et al., 2007, Nature 449, 1003-1007). Estas celulas Lgr5 + han sido previamente observadas por Leblond y sus colegas, que las denominaron Celulas Criptograficas Base (CBC) y ya especularon que estas celulas CBC representan las celulas madre del epitelio intestinal (Cheng y Leblond, 1974, Am J Anat 141, 461 - 79). Aqul, definimos un perfil de expresion genica minima para estas celulas CBC mediante la explotacion de ratones knock-in Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 para la clasificacion, sobre la base de expresion GFP. Definimos un conjunto de genes expresados de forma diferente entre fracciones GFPhi y GFPlD. En base a imagenes confocales de criptas aisladas, identificamos provisionalmente estas celulas CBC y sus hijas, respectivamente. Lgr5 se encontro como el gen mas diferencial en este conjunto, lo que implica que su expresion esta fuertemente restringida a las celulas CBC. Muchos otros genes en la firma representaban genes previamente dependientes de Wnt identificados, p.ej. Ascl2, CD44, Ephb3, Sox9 y Sp5 (van der Flier et al, 2007, Gastroenterology 132, 628 - 632). Dada la Intima conexion entre la senalizacion de Wnt y la biologla de las celulas madre en muchos tejidos (Reya y Clevers, 2005, Nature 434, 843-850), esto no era sorprendente.

Tabla 6 Analisis de expresion de celulas madre y su progenie directa

[0268] Firma de intestino delgado (Tabla 6a) y celulas madre de colon (Tabla 6b) en base a la expresion de Lgr5. Las celulas epiteliales GFP-positivas de preparaciones de cripta pura de ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 se aislaron usando la clasificacion FACS. El analisis FACS distinguio dos poblaciones de celulas GFPhi y GFPlo, que corresponden a las celulas CBC y sus hijas de amplificacion de transito inmediatas, respectivamente. Con el fin de identificar nuevos genes de celulas madre, las muestras de ARNm de las dos poblaciones se sometieron a perfiles de expresion de genes comparativos mediante el analisis de micromatrices Agilent.

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Tabla 6a Comparacion celulas madre del intestino delgado con progenie directa

Nombre de gen: avg log2 ratio1 (gfpalto / gfpbajo)

Lgr5: 2,54

Ephb3: 1,38

Cd44: 1,15

Rnf43: 1,14

Sox9: 1,12

Slc12a2: 0,87

Ets2: 0,80

1Q valor <0,15

Tabla 6a Comparacion celulas madre del colon con progenie directa Nombre de gen avg log2 ratio1 (gfpalto / gfpbajo)

Lgr5: 2,98

Cd44: 1,47

Cdca7: 1,23

Ephb3: 1,11

Myb: 0,81

Myc: 0,77

1Q valor <0,05

Ejemplo 7 Determinacion de secuencia de cadenas ligeras y pesadas, incluyendo regiones CDR, de anticuerpos LGR5 especfficos/LGR6 especfficos

Materiales y metodos:

Secuencia de hibridomas

[0269] Los hibridomas se produjeron como se describe en la seccion de materiales y metodos del Ejemplo 5.

[0270] Las secuencias de hibridoma se determinaron a partir de llneas celulares NR de hibridoma clonales Lgr5 especlficas y/o Lgr6 especlficas 2F10 (vease la Tabla 4) y 6d8 y 2f4 (vease la Tabla 5). El ARN total se aislo usando el reactivo de Trizol y se genero ADNc usando la transcriptasa inversa sobrescrita (Promega). El ADNc se amplifico usando cebadores de PCR disenados para amplificar las secuencias de Fv-ADN del anticuerpo IgG en una PCR de "toque hacia abajo". Los fragmentos de PCR se clonaron en vectores de clonacion PJET1.2 (Fermentas) o PGEM-T (Promega) y posteriormente se secuenciaron usando cebadores especlficos de vector en un secuenciador ABI.

Anticuerpo IgG Fc-ADN cebadores PCR de secuencia:

[0271] Cebadores inversos de la cadena L Kappa; 25 oligos sintetizados individualmente, agrupados, representando 50 variantes:

MVK-1 GACATTGTT CT CACCCAGTCTCC

MVK-2 GACATTGTGCTSACCCAGTCTCC MVK-3 G ACATT GTG AT GACT CAGTCT CC

MVK-4 GACATTGTGCTMACTCAGTCTCC MVK-5 GACATTGTGYTRACACAGTCTCC MVK-6 GACATT GTRAT GAC ACAGTCTCC

MVK-7 GACATTMAGATRACCCAGTCTCC MVK-8 GACATT GCAGAT GAMCCAGTCT CC

MVK-9 GACATTCAGATGACDCAGT CTCC

MVK-10 GACATTCAGATGACACAGACTAC MVK-11 G ACATTC AG AT GATT CAGT CTCC MVK-12 GACATT GTT CTCAWCCAGT CTCC MVK-13 GACATTGTTCTCTCCCAGTCTCC MVK-14 GACATTGWGCTSACCCAATCTCC MVK-15 GACATTSTGATGACCCARTCTC MVK-16 GACATTKTGATGACCCARACTCC MVK-17 G ACATTGT GAT GACT CAG GCT AC

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MVK-18 GACATTGTGATGACBCAGGCTGC MVK-19 G AC ATT GT GATAACY CAGG AT G MVK-20 G AC ATT GT GAT GACCCAGTTTGC MVK-21 G ACATTGT GATGACAC AACCT GC

MVK-22 G AC ATT GT GAT GACCCAGATTC C MVK-23 GACATTTTGCTGACTCAGTCTCC MVK-24 GACATTGTAATGACCCAATCTCC MVK-25 GACATTGTGATGACCCACACTCC

[0272] Cebador delantero de cadena L Kappa: mck-IACACTCATTCCT GTT GAAGCTCTT GAC

[0273] Cebadores inversos de region variable de cadena H, 25 oligos individualmente sintetizados, representando

88 variantes:

MVH-1

MVH-2

MVH-3

MVH-4

MVH-5

MVH-7

MVH-B

MVH-9

MVH-10

MVH-11

MVH-12

MVH-13

MVH-14

MVH-15

MVH-16

MVH-17

MVH-18

MVH-19

MVH-20

MVH-21

MVH-22

MVH-23

MVH-24

MVH-25

GCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC

GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC

GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGG

GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGAC

GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGAC

GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGG

GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAATCTGG

GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRC

GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTGG

GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACAATCTGGACC

GCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGG

GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTG

GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTG

GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGG

GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGG

GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGG

GCCGGC CATGGCCGAGGT GCARCTT GTTGAGT CT GGTG

GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTAGAGTCTGGA

GCCGGC CATGGCCGAAGT GAARSTT GAGGAGT CT GG

GCCGGC CATGGCCGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGG

GCCGGC CATGGCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTGGCC

GCCGGC CATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCCTGG

GCCGGC CATGGCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTCTG

GCCGGC CATGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTCTGG

GCCGGC CATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTCTGG

[0274] Cebadores delanteros de cadena H:

MJH-REV1&2

MJH-REV2INT

MJH-REV3

MJH-REV4

GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG

GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACAGTGG

GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCAGAG

GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACCGAGG

Tecla de posicion variable: R (A/G); MAC); Y (T/C); W (A/T); S (G/C); K (G/T); H (A/T/C); B (G/C/T); V (G/A/C); D (G/A/T); N (G/A/T/C)

[0275] En este experimento, se utilizan oligos especlficos de raton. Para obtener resultados mas reproducibles, tambien se pueden usar oligos especlficos de rata.

Resultados

[0276] La secuencia de la cadena ligera del anticuerpo NR2F10 especifico para LGR5 (vease la Tabla 4) y las secuencias de cadena pesada de anticuerpos 6d8 y 2f4 especlficos para LGR6 (vease la Tabla 5) se representan en la Figura 27. Las regiones CDR se indican en negrita Y en cursiva. Las secuencias CDR se determinaron de acuerdo con Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. of Health and Human

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Services, National Institute of Health, 1987). Los anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que comprenden al menos una de estas secuencias CDR constituyen un compuesto de union de alta afinidad con una alta especificidad para sus protelnas diana LGR5 y/o LGR6.

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Claims

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Reivindicaciones

1. Un metodo para obtener celulas madre Lgr5+ que comprende

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de una muestra de tejido u organo normal o de una muestra de tumor solido o llquido con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5; y

- identificar las celulas unidas a dicho compuesto aglutinante.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de aislar las celulas madre.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que las celulas madre son intestinales, de retina, de cerebro, de mama, de follculo piloso, de stomago, de hlgado, de pulmon, de pancreas, de testlculos, de corazon o de celulas madre ovaricas.
4. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas madre son celulas madre de cancer.
5. El metodo segun la reivindicacion 4, en el que las celulas madre del cancer estan implicadas en cancer intestinal, incluyendo colon, cancer colorrectal, cancer de piel, cancer de esofago, cancer de mama, cancer de prostata, meduloblastoma y otros canceres cerebrales, cancer de hlgado, Cancer de retina, cancer de cabeza y cuello, cancer testicular, cancer de follculo piloso, cancer de ovario o cancer de pulmon.
6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se utiliza la Clasificacion de Celulas Activadas por Fluorescencia o la clasificacion de granulos magneticos para identificar y ordenar las celulas que se unen al anticuerpo, derivado o fragmento de Lgr5.
7. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos dos compuestos de union diferentes se ponen en contacto con la suspension celular.
8. El metodo segun la reivindicacion 7, en el que uno de los compuestos de union es un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y uno de los compuestos de union es un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr6.
9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas la etapa de aislar las celulas madre de dicho anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 y/o Lgr6.
10. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende ademas la etapa de mantener o cultivar las celulas madre de tejido u organo proporcionando las celulas madre de tejido u organo con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5 .
11. Celulas madre Lgr5+ aisladas obtenibles mediante un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 6 a 10, en la que la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula suprarrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre de mama.
12. Una coleccion aislada de celulas madre que comprende mas de 50% de celulas madre Lgr5 positivas, donde la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula suprarrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre de mama.
13. Una celula madre aislada que comprende Lgr5 en su membrana celular, en la que la celula madre es un intestino, cerebro, hlgado, retina, estomago, pancreas, ovario, medula suprarrenal, vejiga, hueso, tejido conectivo, oldo, musculo, prostata, placenta, utero o celulas madre del seno.
14. La celula madre o coleccion de celulas madre segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que es una celula madre del intestino delgado o colon o que es una celula madre rectal.
15. Una celula madre aislada o una coleccion de celulas madre, en la que la celula madre contiene un compuesto de union a Lgr5 especlfico, en el que dicho compuesto de union a Lgr5 es un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.
16. Celulas madre aisladas de Lgr5+ cancerlgenas obtenibles por un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

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17. Celulas madre de cancer aisladas que comprenden Lgr5 incorporada en su membrana celular.
18. Una colleccion de celulas madre cancerosas capaces de incluir Lgr5 en su membrana celular, donde dicha coleccion comprende al menos el 50% de celulas madre cancerosas capaces de recapitular la generacion de un tumor en crecimiento continuo.
19. Celulas madre aisladas segun cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 15 o la recogida de celulas madre segun cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 a 15, para uso en un metodo de tratamiento.
20. El uso de las celulas madre aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 15 o la recogida de celulas madre segun cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 a 15 en la preparacion de un medicamento para tratar tejido danado o enfermo.
21. Una composition para uso en el tratamiento del dano de tejidos o organos que comprende las celulas madre aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 15 o la recogida de celulas madre segun cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 a 15, preferiblemente celulas madre de tejido u organo.
22. Un anticuerpo, derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5, o un inhibidor de una transcription de ARNm de Lgr5, para uso en el diagnostico in vivo de la presencia y/o contenido de celulas madre de cancer en un tumor.
23. El anticuerpo, derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5 para uso segun la reivindicacion 22, en el que el anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene afinidad por Lgr5 se conjuga con una sustancia que permite la formation de imagenes radiactivas, la resonancia magnetica, o la radiografla/tomografla computarizada.
24. Un metodo para determinar si una muestra comprende una celula madre de cancer, que comprende:

- poner en contacto una suspension de celulas aisladas de un tejido normal, una muestra de organo o una muestra de tumor solido o llquido con un compuesto de union, donde el compuesto de union es un anticuerpo, derivado o fragmento del mismo que tiene afinidad por Lgr5;

- elimination del compuesto de union no unido;

- detectar cualquier complejo ligado; y

- determinar la presencia de una celula madre cancerosa de la presencia de complejo ligado.
25. El uso de un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene afinidad por Lgr5 para identificar celulas madre en o para aislar celulas madre de una muestra de tejido u organo.
26. El uso segun la reivindicacion 25, en el que las celulas madre son celulas madre de cancer.
27. El uso de Lgr5 como marcador para el aislamiento de tejidos u organos de celulas madre de una muestra

de tejido u organo.
28. Un metodo para mantener o cultivar las celulas madre de organos o tejidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 17 o la recogida de celulas madre segun cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 a 15 o 18, que comprende la proportion al tejido o celulas madre de organos con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.
29. Uso de las celulas madre de cancer aisladas segun la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17 o la recogida

de celulas madre de cancer segun la reivindicacion 18 en la identification de compuestos que pueden

usarse en el tratamiento del cancer.
30. Un metodo para comprobar el efecto de un posible compuesto de celulas madre anticancer que comprende la puesta en contacto de las celulas madre de cancer aisladas de acuerdo con la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17 o la recogida de celulas madre cancerosas segun la reivindicacion 18 in vitro con dicho posible compuesto de celulas madre anticancerlgenas y comprobar si dichas de celulas madre cancerosas tratadas son capaces de generar un tumor de crecimiento continuo.
31. Un metodo in vitro para determinar la efectividad de un tratamiento anticanceroso, que comprende la determinacion de la presencia de celulas madre cancerosas poniendo en contacto celulas de cancer con un compuesto de union a Lgr5 in vitro antes y despues del tratamiento anticancer, en el que dicho compuesto de union a Lgr5 es un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a Lgr5.