ES2535614T3

ES2535614T3 - Agentes de unión a Notch y antagonistas y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2535614T3
Application number: ES09794821.0T
Authority: ES
Inventors: Austin L. Gurney; Timothy Charles Hoey; Edward Thein Htun Van Der Horst; Aaron Ken Sato; Yuan Ching Liu; Maureen Fitch Bruhns; John A. Lewicki
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2029-07-08
Also published as: PT2307459E; DK2307459T3; EP2899211A1; US20120288496A1; CN102112490B; CO6612253A2; PL2307459T3; US9499613B2; US8425903B2; US8945547B2; HRP20150443T1; EA201170157A1; EP2924051A1; EA026109B1; IL210221A; ME02148B; EP2307459B1; MY155603A; DK2307051T3; EP2307051A2

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une de manera específica a Notch2 y Notch3 humano, que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSSGMS (SEC ID Nº: 5), una CDR2 de cadena pesada que comprende VIASSGSNTYYADSVKG (SEC ID Nº: 6), y una CDR3 de cadena pesada que comprende SIFYTT (SEC ID Nº: 51) o SEC ID Nº: 30; y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASQSVRSNYLA (SEC ID Nº: 8), una CDR2 de cadena ligera que comprende GASSRAT (SEC ID Nº: 9), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYSNFPI (SEC ID Nº: 10).

Description

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DESCRIPCIÓN

Agentes de unióna Notch y antagonistas y métodos de uso de los mismos

5 Campo de la Invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un agente que se une a un receptor Notch humano y a métodos para usar estas composiciones para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades. De manera más específica, la presente invención proporciona, por ejemplo, anticuerpos que se unen de manera

10 específica a una región de no unión a ligando del dominio extracelular de un receptor Notch humano y que inhiben el crecimiento tumoral. La presente invención proporciona además composiciones para uso en métodos para tratar cáncer, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une de manera específica a una región de no unión a ligando del dominio extracelular de una proteína de receptor Notch humano y que inhibe el crecimiento tumoral.

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Antecedentes de la Invención

La ruta de señalización Notch es uno de los varios reguladores críticos de la formación de patrones embriónicos, del mantenimiento de tejido post-embriónico, y de la biología de las células madre. De manera más específica, la 20 señalización Notch está comprendida en el proceso de inhibición lateral entre destinos celulares adyacentes y juega un papel importante en la determinación de destinos celulares durante las divisiones celulares asimétricas. Se asocia la señalización Notch no regulada con numerosos cánceres humanos donde puede alterar el destino de desarrollo de células tumorales para mantenerlas en un estado no diferenciado y proliferativo (Brennan y Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). De esta manera, la carcinogénesis puede proseguir al usurpar mecanismos homeostáticos que

25 controlan el desarrollo normal y reparación de tejido por poblaciones de células madre (Beachy et al., 2004, Nature 432:324).

El receptor Notch se identificó primero en mutantes de Drosofila con haploinsuficiencia que da por resultado muescas (notches, en inglés) en el margen del ala, donde la pérdida de función produce un fenotipo “neurogénico” 30 embriónico letal, donde las células de la epidermis cambian el destino a tejido neural (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). El receptor Notch es un receptor transmembrana de una sola pasada que contiene numerosas repeticiones en tándem tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) y tres repeticiones Notch/LIN-12 de alto contenido de cisteína dentro de un gran dominio extracelular (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; revisado en Artavanis et al., 1999, Science 284:770). Se

35 han identificado cuatro proteínas Notch mamíferas (Notch1, Notch2, Notch3, y Notch4), y las mutaciones en estos receptores dan por resultado de manera invariable anormalidades de desarrollo y patologías humanas que incluyen varios cánceres como se describe en detalle más adelante (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25).

40 Los receptores Notch se activan por los ligandos transmembrana de una sola pasada de la familia Delta, Serrada, Lag-2 (DSL). Existen cinco ligandos Notch conocidos en los mamíferos: tipo Delta 1 (DLL1), tipo Delta 3 (DLL3), tipo Delta 4 (DLL4), Dentado 1 (JAG1) y Dentado 2 (JAG2) caracterizados por un dominio DSL y repeticiones en tándem tipo EGF dentro del dominio extracelular. El dominio extracelular del receptor Notch interactúa con aquel de sus ligandos, normalmente en células adyacentes, que da por resultado dos escisiones proteolíticas de Notch, una

45 escisión extracelular mediada por una proteasa ADAM (Una Disintegrina y Metalopeptidasa) y una escisión dentro del dominio transmembrana mediada por gamma-secretasa. Esta última escisión genera el domino intracelular Notch (ICD), que entonces entra al núcleo donde activa el CBF1, supresor de sin pelo [Su(H)], familia Lag-2 (CSL) de factores de transcripción como los efectores principales de etapa posterior para incrementar la transcripción de factores de transcripción de hélice-asa-hélice, básicos, nucleares de la familia de peludo y mejorador de división

50 [E(sp1)] (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan y Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). Las rutas intracelulares alternativas que comprenden el dominio citoplásmico Deltex identificadas en Drosofila también pueden existir en mamíferos (Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33), y esta ruta dependiente de Deltex puede actuar para suprimir la expresión de los genes objetivo Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85).

55 Los receptores Notch mamíferos experimentan escisión para formar el receptor maduro y también después de la unión al ligando para activar la señalización de etapa posterior. Una proteasa tipo furina escinde los receptores Notch durante la maduración para generar heterodímeros de juxtamembrana que comprenden una subunidad extracelular no covalentemente asociada y una subunidad transmembrana mantenida conjuntamente en un estado

60 auto-inhibitorio. La unión a ligando alivia esta inhibición e induce la escisión del receptor Notch por una metaloproteasa tipo ADAM y una gamma-secretasa, esta última que libera el dominio intracelular (ICD) en el citoplasma, dejándolo transcolocarse al núcleo para activar la transcripción génica. La escisión por ADAM se presenta dentro del dominio de escisión de no unión a ligando dentro de la región reguladora negativa próxima de membrana.

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(59R1) Inhibe el crecimiento de tumores de mama PE13. Ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de mama PE13 se trataron con anticuerpo de control (cuadrados) o anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 (diamantes) después de que el volumen tumoral alcanzó un tamaño entre 65 a 200 mm3. Se midió el volumen tumoral medio (eje y, mm3) a través del tiempo (eje x, días después de la inyección celular). El tratamiento con anticuerpo 59R1 inhibió el crecimiento tumoral en comparación al control (* p < 0.05 después del día 57). (Figura 5F) AntiNotch2/3 (59R1) Inhibe el Crecimiento de Tumores de Mama T3. Ratones NOD/SCID inyectados con células de tumor de mama T3 se trataron con anticuerpo de control (barras sólidas) o anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 (barras abiertas) después de que el volumen tumoral alcanzó un tamaño entre 65 a 200 mm3. El volumen tumoral medio se midió en los días 18, 25, 39, y 42 después de la inyección de las células. El tratamiento con anticuerpo 59R1 inhibió el crecimiento tumoral en comparación al control (*** p < 0.001 en el día 42). Figura 6: Anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 retrasa la recurrencia de tumor de mama B51 después del tratamiento con paclitaxel. Figura 7: Anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 disminuye la frecuencia de células madre de cáncer en tumor de mama B51. Figura 8: En combinación con gemcitabina, el anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 inhibe el crecimiento de tumores pancreáticos PN4. Figura 9: anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de melanoma M4. Figura 10: Anticuerpo 59R1 anti-Notch2/3 inhibe el crecimiento de tumores de colon C28 solo y en combinación con irinotecano. Figura 11: Anticuerpo 59R1 tipo IgG2 inhibe de forma significativa el crecimiento tumoral de xenoinjertos establecidos de tumor humano in vivo. Los tumores establecidos de Colo-205 (Figura 11A), C8 (Figura 11B), PN8 (Figura 11C), B34 (Figura 11D), B39 (Figura 11E), B44 (Figura 11F), PE-13 (Figura 11G) y T1 (Figura 11H) (s.c, n=10 por grupo) se trataron a 15 mg/kg una vez a la semana con los anticuerpos indicados (1B711, anticuerpo de control LZ-1, cuadros negros; 59R1, triángulos negros; AVASTIN, círculos negros; AVASTIN + 59R1, diamantes negros). El volumen tumoral (eje x) se graficó con respecto al tiempo (eje y). En el modelo de xenoinjerto Colo-205, la terapia de combinación de 59R1 con AVASTIN fue significativamente más efectiva que ya sea el tratamiento con anticuerpo solo. En las Figuras 11B-11H, los asteriscos indican inhibición significativa del crecimiento tumoral en el día mostrado: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001, prueba t de Student; Símbolos, media; barras, SEM. Figura 12: Niveles de expresión relativa de genes seleccionados se regulan de forma significativa por tratamiento con 59R1 en varios modelos de tumor de xenoinjerto. Los niveles de expresión de HEYL (Figura 12A), Notch3 (Figura 12B), RGS5 (Figura 12C), ANGPT1 (Figura 12D) y ANGPT2 (Figura 12E) se probaron de manera individual por análisis TaqManMR de modelos de xenoinjerto anteriormente probados. De forma notable, la carencia de estrógeno (ne) anula el efecto de 59R1 al reducir la expresión de ANGPT1 y ANGPT2 en el estroma hospedero de ratones que tienen T1. Los círculos abiertos corresponden a tumores individuales analizados. Línea horizontal, media. Figura 13: El gen PTEN supresor tumoral se suprime en muchos de los tumores de mama en los cuales 59R1 mostró eficiencia anti-tumor. Se muestran el exón PTEN, la distribución de la sonda Affymetrix, y las supresiones en el gen PTEN en el cromosoma 10. Las barras gruesas y delgadas coloreadas en gris indican las supresiones homocigotas y heterocigotas de los fragmentos cromosómicos, respectivamente. Figura 14. Con relación de epítopos de anticuerpo 59R1. (Figura 14A) alineación de proteína de homólogos Notch humanos. La alineación se realizó por el Software Clone Manager. La repetición 10 de EGF de Notch1, Notch2, y Notch4 humano y el EGF equivalente en Notch3 humano, EGF9, es como se indica. El área en el cuadro indica una región que contiene uno o más aminoácidos que constituyen al menos parte del epítopo 59R1 como se define por la unión de FACS del anticuerpo IgG2 59R1 a un mutante hNotch2 H385N AL388-89 SN (Figura 14B) y a una construcción hNotch1 en la cual se ha mutado aa 382-386 para corresponder a la secuencia de hNotch2 (Figura 14C). (Figura 14B) el anticuerpo IgG2 59R1 se une a hNotch2, pero no a hNotch2 mutante en el cual se han mutado ciertos residuos de EGF 10 a residuos de hNotch1 (H385N AL 388-89 SN). (Figura 14C) el anticuerpo IgG2 59R1 no se une a hNotch1, sino que se une a un hNotch1 mutante en el cual se han mutado ciertos residuos de EGF 10 (aa 382-387) para corresponder a los residuos 385-389 de hNotcti2. Figura 15. Caracterización in vitro de 59R5. (Figura 15A) la Figura 15A muestra que el anticuerpo 59R5 es capaz de bloquear la señalización inducida por ligando de Notch2 y Notch3. Se transfectaron de manera transciente células tumorales PC3 con el receptor Notch humano o de ratón (hN2, Notch2 humano; mN2, Notch2 murino; hN3, Notch3 humano; mN3, Notch3 murino) y construcción indicadora inducible por GFP. Las células transfectadas se incubaron con diferentes concentraciones del anticuerpo 59R1 y 59R5 en la presencia de DLL4-Fc pasivamente inmovilizado. (Figura 15B) la Figura 15B muestra que 59R5 se une a un epítopo similar como 59R1. Células HEK 293 se transfectaron de manera transciente con vectores de expresión que codifican para Notch2 humano, Notch1 humano, o Notch1 humano con los residuos 382-386 mutados a los residuos correspondientes de Notch2 humano. También se co-transfectaron células con un plásmido que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) para marcar aquellas células que recibieron el plásmido transfectado. Las células se incubaron con 59R1 o 59R5 y anticuerpo secundario fluorescente luego se examinaron por FACS. Las regiones resaltadas por los cuadros sugieren que las células transfectadas con el vector de expresión Notch indicado fueron capaces de unirse a 59R1 o 59R5. Figura 16. El anticuerpo 59R5 de receptor Notch inhiben la formación y crecimiento tumoral in vivo. La Figura 16A muestra el tratamiento in vivo de células de tumor de mama de PE13 con el anticuerpo 59R5. La Figura 16B

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También se ha desarrollado un anticuerpo humano adicional 59R5. 59R5 tiene propiedades que son similares a 59R1, tal como afinidad similar de unión a Notch2 y Notch3 y similitudes o traslapes en sus epítopos (Ejemplo 13 y Figura 15B). Se ha mostrado que el anticuerpo 59R5 tiene actividad similar como 59R1 al bloquear la señalización de Notch2 y Notch3 (Ejemplo 13 y Figura 15A). El anticuerpo 59R5 también se ha mostrado que inhibe el

5 crecimiento tumoral in vivo en varios modelos en injerto, ya sea solos o en combinación con un segundo agente anticáncer. Ejemplos 14 y 15 Figuras 16A-16C y 17A-17B). Además, se encontró que el tratamiento con 59R5, al igual que 59R1, reduce la expresión de RGS5, Notch3, y HeyL en el estroma de varios tumores, y también se encontró que 59R5 regula la expresión de los genes humanos ID4, EDNRA, y EGLN3 en células tumorales a un grado similar como 59R1 (Ejemplo 16). Además, se mostró que 59R5 reduce la tumorigenicidad in vivo en un modelo de xenoinjerto al reducir la frecuencia de células madre de cáncer (Ejemplo 23 y 19D).

Definiciones

Un “antagonista” de un receptor Notch es un término que incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza

15 de manera parcial o completa una actividad biológica de la ruta Notch. Las moléculas antagonistas adecuadas incluyen de manera específica anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpo.

El término “anticuerpo” se usa para querer decir una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une de manera específica a un objetivo o diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de lo anterior, etcétera, a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tal como fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv), mutantes de Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos multiespecíficos tal como anticuerpos biespecíficos generados de al menos dos anticuerpos intactos, proteínas de fusión que comprenden una porción de

25 anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno en tanto que los anticuerpos exhiban la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), basadas en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada referidos como alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen diferentes y bien conocidas estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden estar expuestos o estar conjugados a otras moléculas tal como toxinas, radioisótopos, etcétera.

Como se usa en la presente, el término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y

35 se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena individual, y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un “anticuerpo de Fv” se refiere al fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno ya sea como dos cadenas, en las cuales un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera forma un dímero covalente, o como una cadena individual (scFv), en el cual un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera se enlazan covalentemente por un ligador peptídico flexible de modo que las dos cadenas se asocien en una estructura dimérica similar. En esta configuración, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cada dominio variable interactúan para definir la especificidad de unión a antígeno del

45 dímero de Fv. De manera alternativa, se puede usar un dominio variable individual (o la mitad de un Fv) para reconocer y unirse al antígeno, aunque en general con menor afinidad.

Un “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente se refiere a una población homogénea de anticuerpos comprendida en el reconocimiento altamente específico y en la unión de un determinante antigénico individual, o epítopo. Esto es en contraste a anticuerpos policlonales que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término “anticuerpo monoclonal” abarca anticuerpos monoclonales tanto intactos como de longitud completa así como fragmentos de anticuerpo (tal como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), mutantes de cadena individual (scFv), proteínas de fusión, que comprenden una porción de porción de anticuerpo, y cualquier otra molécula modificada de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno.

55 Adicionalmente “anticuerpo monoclonal” se refiere a los anticuerpos producidos por cualquiera de varias maneras que incluyen, pero no se limitan a, por hibridoma, por selección de fagos, por expresión recombinante y por animales transgénicos.

Como se usa en la presente, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) que son cadenas específicas de inmunoglobulina, inmunoglobulinas quiméricas, o fragmentos de los mismos que contiene secuencias no humanas mínimas. Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las cuales se reemplazan residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo ratón, rata, conejo, hámster, etcétera) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad, deseadas. En algunos casos, los residuos de la región menos variable 65 (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado se

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Como se usa en la presente, el término “sujeto” se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero no limitado a humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de manera indistinta en la presente en referencia

5 a un sujeto humano.

Los términos “célula madre de cáncer” o “célula madre de tumor” o “célula madre de tumor sólido” se usan de manera indistinta en la presente y se refieren a una población de células de un tumor sólido que: (1) tienen capacidad proliferativa extensa, (2) son capaces de división celular asimétrica para generar una o más clases de progenie diferenciada con potencial proliferativo o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simétricas para auto-renovación o auto-mantenimiento. Estas propiedades de las “células madre de cáncer” o “células madre de tumor” o “células madre de tumor sólido” confieren a estas células madre de cáncer la capacidad de formar tumores palpables que el trasplante en serie en un ratón inmunocomprometido en comparación a la mayoría de células tumorales que fallan en formar tumores. Las células madre de cáncer experimentan auto

15 renovación versus diferenciación de una manera caótica para formar tumores con tipos celulares anormales que pueden cambiar con el paso del tiempo conforme se presenten las mutaciones.

Los términos “célula de cáncer” o “célula tumoral” y equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células derivadas de un tumor incluyendo tanto células no tumorigénicas, que comprenden el volumen de la población de células tumorales y células madre tumorigénicas (células madre de cáncer).

Como se usa en la presente “tumorigénico” se refiere a las características funcionales de una célula madre de tumor sólido que incluye las propiedades de auto-renovación (que dan lugar a células madre de cáncer, tumorigénicas, adicionales) y proliferación para generar todas las otras células tumorales (que dan lugar a células tumorales

25 diferenciadas y de esta manera no tumorigénicas) que permiten que las células madre de tumor sólido formen un tumor.

Como se usa en la presente, la “tumorigenicidad” de un tumor se refiere a la capacidad de una muestra aleatoria de células del tumor para formar tumores palpables en el trasplante en serie en ratones inmunocomprometidos. Como se usa en la presente, los términos “marcador de cáncer de células madre” o “marcador de células madre de cáncer” o “marcador de células madre de tumor” o “marcador de células madre de tumor sólido” se refieren a un gen

o genes o una proteína, polipéptido, o péptido expresado por el gen o genes cuyo nivel de expresión, solo o en combinación con otros genes, se correlaciona con la presencia de células tumorigénicas de cáncer en comparación a células no tumorigénicas. La correlación puede referirse ya sea a una expresión incrementa o disminuida del gen

35 (por ejemplo, niveles incrementados o disminuidos ARNm o el péptido codificado por el gen).

Los términos “signatura de gen de células madre de cáncer” o “signatura de gen de células madre de tumor” o “signatura de células madre de cáncer” se usan de manera indistinta en la presente para referirse a signaturas génicas que comprenden genes diferencialmente expresados en las células madre de cáncer en comparación a otras células o poblaciones de células, por ejemplo tejido epitelial de mama normal. En algunas modalidades, las signaturas de gen de células madre de cáncer comprenden genes diferencialmente expresados en células madre de cáncer versus epitelio normal de mama por un cambio en veces, por ejemplo, por una expresión dos veces reducida y/o elevada, y además limitado por el uso de un análisis estadístico, tal como por ejemplo, el valor P de una prueba t a través de múltiples muestras. En otra modalidad, los genes diferencialmente expresados en células madre de

45 cáncer se dividen en signaturas de gen de células madre de cáncer basadas en la correlación de su expresión con un gen elegido en combinación con su por ciento o veces de cambio de expresión. Las signaturas de células madre de cáncer son predictivas tanto de forma retrospectiva como de manera prospectiva de un aspecto de variabilidad clínica, incluyendo pero no limitado a metástasis y muerte.

El término “prueba genética” como se usa en la presente, se refiere a procedimientos por los cuales se analiza la constitución genética de un paciente o una muestra de tumor de paciente. El análisis puede incluir detección de ADN, RNA, cromosomas, proteínas o metabolitos para detectar genotipos o cariotipos heredables o somáticos, relacionados a enfermedad, para propósitos clínicos.

55 Como se usa en la presente, los términos “biopsia” o “tejido de biopsia” se refieren a una muestra de tejido o fluido que se remueve de un sujeto para el propósito de determinar si la muestra contiene tejido canceroso. En algunas modalidades, el tejido o fluido de biopsia se obtiene debido a que se sospecha que un sujeto tiene cáncer. El tejido o fluido de biopsia entonces se examina para presencia o ausencia de cáncer.

Como se usa en la presente un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo de una composición farmacéutica tal como un anticuerpo, permite que el anticuerpo, por ejemplo, retenga su actividad biológica. Además, un “portador farmacéuticamente aceptable” no activa una respuesta inmunitaria en un sujeto receptor. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos normales, tal como solución salina amortiguada con fosfato, agua, y varias emulsiones de

65 aceites/agua. Algunos diluyentes para administración parenteral o en aerosol son solución salina amortiguada con fosfato o solución salina normal (0,9 %).

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derivada de una células modificada de este modo. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se sobreexpresan o expresan de otro modo de forma anormal, tal como, por ejemplo, expresan como fragmentos o variantes de empalme, que no se presentan de forma natural. Por el término “ácido nucleico recombinante” se quiere 5 decir en la presente ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, usando polimerasas y endonucleasas, en una forma normalmente no encontrada en la naturaleza. De esta manera, se logra el enlace operable de diferentes secuencias. De esta manera, un ácido nucleico aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro al ligar moléculas de ADN que normalmente no se unen, se consideran ambos recombinantes para los propósitos de esta invención. Se entiende que una vez que se produce un ácido nucleico recombinante y se introduce en una célula hospedera u organismo, se replicará de manera no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedera en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, estos ácidos nucleicos, una vez producidos de manera recombinante, aunque se replican de manera subsiguiente de forma no recombinante, aún se consideran recombinantes para los propósitos de la invención. De manera similar, una “proteína recombinante” es una proteína producida usando

15 técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se representa anteriormente.

Como se usa en la presente, el término “vector” se usa en referencia a moléculas de ácido nucleico que transfieren segmentos de ADN de una célula a otra. El término “vehículo” se usa algunas veces de manera indistinta con “vector”. Los vectores frecuentemente se derivan de plásmidos, bacteriófagos o virus vegetales o animales.

Como se usa en la presente, el término “expresión génica” se refiere al proceso de convertir información genética codificada en un gen en RNA (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt o ARNsn) a través de la “transcripción” del gen (por ejemplo, mediante la acción enzimática de una RNA-polimerasa), y para genes codificadores de proteína, en

25 proteína a través de la “traducción” del ARNm. Se puede regular la expresión génica en muchas etapas en el proceso. El “favorecimiento de la expresión” o “activación” se refiere a la regulación que incrementa la producción de productos de expresión génica (por ejemplo, RNA o proteínas), en tanto que la “reducción de la expresión”, o “represión” se refiere a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción) que están comprendidos en el favorecimiento de la expresión o reducción de la expresión frecuentemente se llaman “activadores” y “represores”, respectivamente.

Los términos “polipéptido” o “péptido” o “proteína” o “fragmento de proteína” se usan de manera indistinta en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son miméticos químicos artificiales de un correspondiente

35 aminoácido que se presenta de forma natural, así como a polímeros de aminoácidos que se presentan de manera natural y a polímeros de aminoácido que no se presentan de manera natural.

El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos que se presentan de manera natural y sintéticos, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se presentan de forma natural. Los aminoácidos que se presentan de forma natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican más adelante, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxi-glutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de forma natural, por ejemplo, un carbono alfa que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina,

45 norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil-sulfonio. Estos análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras peptídicas modificadas, que retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de forma natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido que se presenta de forma natural.

“Variantes modificadas de manera conservadora” aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Las “variantes de aminoácido” se refieren a secuencias de aminoácidos. Con respecto a secuencias particulares de ácido nucleico, las variantes modificadas de manera conservadorase refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica 55 para una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas o asociados (por ejemplo, naturalmente contiguas). Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos para el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición donde se especifique una alanina por un codón, el codón se puede alterar a otro de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones imperceptibles”, que son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica para un polipéptido también describe variaciones imperceptibles del ácido nucleico. Se reconoce que en ciertos contextos cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para producir una molécula 65 funcionalmente idéntica. Por consiguiente, las variaciones imperceptibles para un ácido nucleico que codifican para un polipéptido son implícitas para una secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con

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célula objetivo por activación de complemento y/o ADCC. Las células de interés se cultivan y marcan in vitro; el anticuerpo se añade al cultivo celular en combinación con ya sea células inmunitarias o de complemento en suero que se pueden activar por complejos de antígeno-anticuerpo. Se detecta la citolisis de las células objetivo, por ejemplo, por la liberación de la marca de las células lisadas. En realidad, se pueden examinar anticuerpos usando el

5 propio suero del paciente como una fuente de células inmunitarias y/o de complemento. El anticuerpo que es capaz de activar el complemento o de mediar la ADCC en la prueba in vitro entonces se puede usar de manera terapéutica en ese paciente particular.

Un agente de unión a Notch o antagonista es un anticuerpo que no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, un anticuerpo puede no tener actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o no tiene actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Un anticuerpo puede no unirse al receptor de Fc y/o factores complemento. Un anticuerpo puede no tener función efectora.

Antagonistas de un receptor Notch pueden activar la muerte celular directamente al inhibir la angiogénesis. La

15 angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos de los vasos preexistentes y es un proceso fundamental requerido para el crecimiento normal, por ejemplo, durante el desarrollo embriónico, curación de heridas, y en la respuesta a la ovulación. El crecimiento de tumores sólidos, mayores de 1-2 mm2 también requiere la angiogénesis para suministrar nutrientes y oxígeno sin lo cual mueren las células tumorales. De esta manera, un antagonista de un receptor Notch puede tener como objetivo células vasculares que expresan el receptor Notch incluyendo, por ejemplo, células endoteliales, células del músculo liso o componentes de la matriz extracelular requeridos para el montaje vascular. Un antagonista de un receptor Notch (por ejemplo, Notch2 y/o Notch3) puede tener como objetivo pericitos y/o células del músculo liso vascular o inhibir la señalización de factor de crecimiento requerida por el reclutamiento, montaje, mantenimiento o supervivencia de células vasculares. Un antagonista puede modular la función de pericitos y/o células del músculo liso vascular.

25 Los agentes de unión a Notch o antagonistas (por ejemplo, anticuerpos), ya sea solos o en combinación con un segundo agente terapéutico, pueden ser capaces de inhibir el crecimiento tumoral. Los agentes de unión a Notch o antagonistas pueden ser capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto de ratón y/o en un humano que tiene cáncer). Los agentes de unión a Notch o antagonistas, pueden ser capaces de inhibir el crecimiento tumoral por al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 90 % en un punto dado del tiempo en un modelo de xenoinjerto. Los agentes de unión a Notch, o antagonistas pueden impedir el crecimiento tumoral. Los agentes de unión a Notch, o antagonistas pueden inhibir la recurrencia tumoral.

35 Los agentes de unión a Notch pueden ser capaces de reducir la tumorigenicidad de un tumor. El agente o anticuerpo puede ser capaz de reducir la tumorigenicidad de un tumor que comprende células madre de cáncer en un modelo animal, tal como modelo de xenoinjerto de ratón. El número o frecuencia de células madre de cáncer en un tumor se puede reducir por al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, o aproximadamente 1000 veces (por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto). La reducción en la frecuencia de células madre de cáncer se puede determinar por ensayo de dilución limitante usando un modelo animal. Un ejemplo de un ensayo de dilución limitante usado para probar la eficiencia de un anticuerpo anti-Notch se proporciona en el Ejemplo 8, posterior. Los ejemplos adicionales y la guía con respecto al uso de los ensayos de dilución limitante, para determinar una reducción en el número o frecuencia de células madre de cáncer en un tumor, se pueden encontrar,

45 por ejemplo, en la publicación internacional Nº WO 2008/042236, Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2008/0064049, y 2009/0178305.

También se describen en el presente documento varios polipéptidos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En ciertos casos, el polipéptido está aislado. En ciertos casos alternativos, el polipéptido está sustancialmente puro.

Los polipéptidos pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden la secuencia de SEC ID Nº: 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56 o 57 (con o sin las secuencias de señal, indicadas), así como los polipéptidos que comprenden los polipéptidos codificados por los

55 polinucleótidos de SEC ID Nº: 1, 3, 15, 17, 47, 48, 58, 59 o 60 (con o sin las secuencias de señal, indicadas).

Un polipéptido que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera de 59R1 se proporciona en SEC ID Nº: 16 y/o SEC ID Nº: 18, respectivamente.

Un polipéptido que comprende la cadena pesada y/o la cadena ligera de 59R5 se proporciona en SEC ID Nº: 49 y/o SEC ID Nº: 18, respectivamente.

También se describe un polipéptido que comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende SEC ID Nº: 13 y/o una secuencia de cadena pesada variable que comprende SEC ID Nº: 14. También se describe un 65 polipéptido que comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende SEC ID Nº: 13 y/o una secuencia de cadena pesada variable que comprende SEC ID Nº: 50. También se describe un polipéptido que

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Por su puesto, el número de sustituciones de aminoácido hechas depende de muchos factores, que incluyen aquellos descritos anteriormente. En ciertas modalidades, el número de sustituciones para cualquier polipéptido determinado no será más de 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, o 3.

5 En ciertas modalidades, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan en una forma aislada, y a veces se purifican a homogeneidad.

Los polipéptidos incluyen los polipéptidos de SEC ID Nºs: 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53 54, 55,

10 56, o 57 así como polipéptidos que tienen al menos 90 % de similitud (en ciertos momentos al menos 90 % de identidad de secuencia) a los polipéptidos de SEC ID Nºs: 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53 54, 55, 56, o 57 y al menos 95 % de similitud (en ciertos momentos al menos 95 % de identidad de secuencia) a los polipéptidos de SEC ID Nºs: 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 49, 50, 52, 53 54, 55, 56, o 57 y en aún otros casos, el polipéptido que tiene al menos 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de similitud (en ciertos momentos 96 %, 97 %, 98 %, o 99

15 % de identidad de secuencia) a los polipéptidos de SEC ID Nºs: 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53 54, 55, 56, o 57. Como se conoce en la técnica, “similitud” entre dos polipéptidos se determina al comparar la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos conservados de aminoácidos de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido.

20 Se pueden emplear fragmentos o porciones de los polipéptidos para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa por síntesis peptídica; por lo tanto, los fragmentos se pueden emplear como compuestos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

25 En ciertas modalidades, un fragmento de las proteínas de esta invención es una porción o toda una proteína que es capaz de unirse a una proteína del receptor Notch. Este fragmento tiene una alta afinidad para el receptor Notch o un ligando de un receptor Notch. Ciertos fragmentos de las proteínas de fusión son fragmentos de proteína que comprenden al menos parte del dominio de unión a Notch del agente polipeptídico, o antagonista, fusionado al

30 menos parte de una región constante de una inmunoglobulina. La afinidad está normalmente en el intervalo de aproximadamente 10-11 a 10-12 M, aunque la afinidad puede variar considerablemente con fragmentos de diferentes tamaños, que varía desde 10-7 a 10-13 M. En algunas modalidades, el fragmento es de aproximadamente 10-110 aminoácidos de longitud y comprende el dominio de unión a Notch del agente polipeptídico, o antagonista, enlazado a al menos parte de una región constante de una inmunoglobulina.

35 Los polipéptidos y análogos se pueden modificar al adicionalmente para contener porciones químicas adicionales normalmente no parte de la proteína. Estas porciones derivatizadas pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica o la obstrucción de la proteína. Las porciones también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario indeseable de las proteínas y similares. Se puede encontrar una pista general de estas porciones en

40 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Los polipéptidos aislados descritos en la presente se pueden producir por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los métodos varían desde métodos de síntesis directa de proteínas, a construir una secuencia de ADN que codifica para secuencias aisladas de polipéptido y que expresan estas secuencias en un hospedero

45 transformado, adecuado.

En algunas modalidades de un método recombinante, se construye una secuencia de ADN al aislar o al sintetizar una secuencia de ADN que codifica para una proteína tipo silvestre y de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar por mutagénesis específica del sitio para proporcionar análogos funcionales de los mismos. Ver,

50 por ejemplo, Zoeller et al., 1984, Proc. Nat Acad. Sci. EUA 81:5662-5066 y Patente de los Estados Unidos Nº

4.588.585. Otro método para construir una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido de interés será por síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos se pueden diseñar basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que se favorecen en la célula hospedera en la cual se producirá el polipéptido recombinante de interés.

55 Se pueden aplicar métodos normales para sintetizar una secuencia aislada de polinucleótido que codifica para un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia completa de aminoácidos para construir un gen retro-traducido. Adicionalmente, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado, particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar y luego ligar varios

60 oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente salientes 5’ o 3’ para montaje complementario.

Una vez montadas (por síntesis, por mutagénesis dirigida al sitio, o por otro método), las secuencias mutantes de ADN que codifican para un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se

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1434141_at (Gucyla3): -2,49 2,87E-03 -1,74 1,07E-02 -4,18 1,49E-07 1,20 5,95E-01

1459713_s_at (Tmem16a): -1,90 1,90E-03 -1,70 1,01E-02 -7,28 9,89E-10 -2,14 1,79E-04

1420872_at (Gucylb3): -1,94 1,90E-02 -1,65 7,68E-03 -3,06 8,52E-10 -1,01 7,13E-01

1422789_at (Aldh1a2): -1,73 1,20E-02 -4,92 2,42E-08 -2,17 1,58E-04 -2,16 9,27E-04

1419302_at (Heyl): -3,28 5,61E-03 -1,12 2,36E-01 -1,77 5,72E-04 -1,07 2,39E-02

1451501_a_at (Ghr): -1,83 1,69E-02 -2,24 2,71E-04 -1,66 8,90E-04 -1,12 3,38E-01

1417714_x_at (Hba-a1/Hbaa2): -8,37 2,49E-02 -2,56 4,63E-04 -1,92 1,06E-02 1,42 9,24E-01

1428361_x_at (Hba-a1/Hbaa2): -8,91 1,93E-02 -2,42 1,08E-03 -1,73 4,27E-02 1,73 4,67E-01

1452590_a_at (Plac9): -1,61 1,07E-02 -1,64 1,22E-02 -1,62 6,17E-03 1,20 7,36E-01

1449632_s_at (Fkbp10): -1,72 1,69E-02 -1,57 1,12E-02 -1,63 1,80E-04 1,07 5,97E-01

1449280_at (Esm1): 2,07 1,06E-02 1,55 3,48E-02 1,56 4,35E-02 1,18 2,44E-01

1418829_a_at (Eno2): 1,79 2,92E-02 1,71 1,02E-02 1,54 5,43E-03 1,29 9,92E-02

Los niveles de expresión en el estroma de los modelos de xenoinjerto la Colo205, B29, B34, B44, PE13, T1 (sin tratamiento con estrógenos), T1 (con tratamiento con estrógenos), C8 y PN8 de genes seleccionados que se han identificado en el análisis de microarreglo como que están regulados por el tratamiento con 59R1 (heyl, notch3, rgs5,

5 angpt1 y angpt2) se analizaron adicionalmente por análisis TaqManMR. Los resultados se muestran en las Figuras 12A (heyl),12B (notch3), 12C (rgs5),12D (angpt1) y 12E (angpt2).

Los resultados del análisis TaqManMR confirman que notch3 y rgs5 son reducen en expresión en el estroma de cada uno de los varios tipos de tumor en respuesta al tratamiento con 59R1 (con relación al control) (Figuras 12B y C). 10 RGS5 es un marcador bien conocido de pericitos y células del músculo liso vascular (Berger et al., 2005, Blood, 105:1094-1101; Lovschall et al., 2007, Int. J. Dev. Biol., 51:715-721; Cho et al., 2003, FASEB J., 17:440-2). Se ha identificado Notch3 como que se coexpresa con RGS5 en pericitos durante la angiogénesis y que juega un papel importante en la regulación del destino de los pericitos y células del músculo liso vascular (Lovschall et al., 2007, Int.

J. Dev. Biol., 51:715-721; Domenga et al., 2004, Genes & Dev., 18:2730-2735; Sweeney et al., 2004, FASEB J., 15 18:1421-3; Morrow et al., 2005, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 289:C1188-C1196).

Además, también se confirmó que heyl se reduce en expresión en el estroma de cada uno de los modelos de xenoinjerto excepto B34 (Figura 12A). HeyL corresponde a la familia de Hey de factores de transcripción de etapa posterior de la señalización de Notch (Hey1, Hey2 y HeyL). La reducción de la expresión de heyl por 59R1 sugiere

20 que el anticuerpo 59R1 afecta directamente la señalización de Notch al reducir la expresión de heyl.

También se determinó que la angiopoyetina-1 (angpt1)y angiopoyetina-2 (angpt2) se reducen en expresión en el estroma de varios modelos de cáncer de mama (Figuras 12D y E). ANGPT1 y 2 (angiopoyetina 1 y 2) son ligandos para los receptores TIE 1 y 2. Los receptores TIE, al igual que VEGF, son moléculas cruciales señalización en el

25 proceso de neoangiogénesis (Jones et al., 2001, Nature Reviews, 2:257-267).

De manera notable, sin embargo, angpt1 y angpt2 se redujeron en expresión en el estroma del modelo T1 cuando se usó tratamiento con estrógeno (“T1 e”), condiciones bajo las cuales fue efectivo el tratamiento con 59R1 contra el crecimiento tumoral, pero no en el estroma del mismo modelo, en la ausencia de tratamiento con estrógeno (“T1 30 ne”), las condiciones bajo las cuales el tratamiento con 59R1 fue inefectivo contra el crecimiento tumoral (ver Ejemplo 9, anteriormente). De esta manera, el efecto de 59R1 en la reducción de la expresión de angiopoyetina 1 y angiopoyetina 2 en el estroma del tumor en T1 se anuló en la ausencia del tratamiento con estrógeno. Una posible explicación de este efecto es que, en la ausencia de tratamiento con estrógeno, los niveles de los factores de crecimiento, angiopoyetina 1 y angiopoyetina 2 en el estroma T1 no se elevaron de manera suficiente para

35 proporcionar disminuciones medibles en los niveles de expresión en el tratamiento con el anticuerpo 59R1. Se ha mostrado que el estrógeno tiene efectos significativos en el microambiente tumoral (Banka et al., 2006, Cancer Res. 66:3667-3672). Una posible explicación de estos datos es que el estrógeno conduce a una dependencia del tumor a la señalización de ANGPT2, que entonces conduce a sensibilidad al tratamiento con 59R1.

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