ES2618846T3

ES2618846T3 - Ácidos nucleicos con expresión aumentada

Info

Publication number: ES2618846T3
Application number: ES09740088.1T
Authority: ES
Inventors: Victoria Radnai; Stefan Evers; Johannes Bongaerts; Karl-Heinz Maurer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2029-10-09
Also published as: DE102008052529A1; DK2340306T3; EP2340306A1; WO2010046250A1; PL2340306T3; EP2340306B1

Abstract

Ácido nucleico no natural que comprende a) una primera secuencia promotora que comprende una secuencia de ácido nucleico, que es idéntica a la SEQ ID NO. 7 en al menos el 75 %, b) una segunda secuencia promotora que comprende una secuencia de ácido nucleico, que es idéntica a la SEQ ID NO. 6 en las posiciones 7 a 234 en al menos el 78,5 %, c) una secuencia de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido, caracterizado porque en la molécula de ácido nucleico, en orientación 5'→ 3', la segunda secuencia promotora se encuentra delante de la primera secuencia promotora.

Description

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adecuados pueden mencionarse Denilite® 1 y 2 de la empresa Novozymes. Ejemplos adicionales de oxidasas se divulgan como componentes para una perhidrólisis enzimática en las solicitudes de patente internacionales WO 98/45398 A1, WO 2005/056782 A2 así como WO 2004/058961 A1. La solicitud WO 2005/124012 describe un sistema blanqueante enzimático, combinado, que comprende una oxidasa y una perhidrolasa.

Los ácidos nucleicos, que codifican para enzimas preferidas de acuerdo con la invención, proceden originalmente o bien a partir de microorganismos, por ejemplo de los géneros Bacillus, Streptomyces, Humicola, Escherichia o Pseudomonas, y/o se obtuvieron de manera recombinante de acuerdo con procedimientos biotecnológicos en sí conocidos en microorganismos adecuados, por ejemplo en bacterias de los géneros Bacillus o en hongos filamentosos.

Con todos los objetos de la invención mencionados y formas de realización están relacionados como objetos de la invención adicionales vectores, células huésped, procedimientos de preparación correspondientes, en los que se emplean vectores o células huésped correspondientes así como usos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped correspondientes. Por lo tanto, las realizaciones anteriores se refieren de manera correspondiente a estos objetos de la invención.

Un objeto adicional de la invención es por lo tanto un vector que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la invención, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.

Por vectores se entienden en el sentido de la presente invención elementos compuestos por ácidos nucleicos, que contienen como región de ácido nucleico caracterizadora, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Estos pueden estabilizar la misma en una especie o una línea celular a través de varias generaciones o divisiones celulares como elemento genético estable. Los vectores son en particular, en el caso del uso en bacterias, plásmidos especiales, es decir, elementos genéticos circulares. En la ingeniería genética se diferencia por un lado entre aquellos vectores que sirven para el almacenamiento y por lo tanto, en cierta medida, también para el trabajo de ingeniería genética, los denominados vectores de clonación y, por otro lado, aquellos que cumplen la función de realizar el gen de interés en la célula huésped, es decir, permitir la expresión del polipéptido en cuestión. Estos vectores se denominan vectores de expresión.

En el contexto de la presente invención se clona un ácido nucleico de acuerdo con la invención de manera adecuada en un vector. A estos pueden pertenecer por ejemplo aquellos cuyo origen son plásmidos bacterianos, virus o bacteriófagos, o vectores o plásmidos principalmente sintéticos con elementos de distinto origen. Con los elementos genéticos adicionales presentes en cada caso pueden establecerse vectores en las células huésped en cuestión a lo largo de varias generaciones como unidades estables. A este respecto es insignificante en el sentido de la invención, si se encuentran de manera extracromosómica como unidades propias o se integran en un cromosoma o ADN cromosómico. Cuál de los numerosos sistemas conocidos del estado de la técnica se selecciona, depende del caso individual. Pueden ser decisivos por ejemplo el número de copias alcanzable, los sistemas de selección disponibles, entre ellos sobre todo resistencias a antibióticos, o la capacidad de cultivo de las células huésped capaces de absorber los vectores.

Los vectores de expresión comprenden secuencias parciales que son capaces de replicar células huésped que los contienen, preferentemente microorganismos, de manera especialmente preferente bacterias, y llevar a la expresión el gen allí contenido. La expresión se ve afectada en particular por los promotores que regulan la transcripción del gen. En principio, la expresión puede tener lugar mediante el promotor natural, localizado originalmente delante del gen que va a expresarse, pero también tras la fusión por ingeniería genética tanto mediante un promotor proporcionado sobre el vector de expresión de la célula huésped como mediante un promotor modificado o u otro totalmente distinto de otro organismo u otra célula huésped. En el presente caso se proporcionan al menos dos promotores ya mediante un ácido nucleico de acuerdo con la invención y se usan para la expresión de la secuencia de ácido nucleico c).

Los vectores de expresión pueden ser regulables a través de cambios de las condiciones de cultivo o la adición de determinados compuestos, tales como por ejemplo la densidad celular o factores especiales. Los vectores de expresión permiten que el polipéptido correspondiente se produzca de manera heteróloga, es decir, en otra célula o célula huésped distinta de la que puede obtenerse naturalmente. Las células pueden pertenecer a este respecto a distintos organismos o proceder de distintos organismos. También es posible una obtención homóloga del polipéptido a partir de una célula huésped que expresa naturalmente el gen a través de un vector de acuerdo con la invención. Esto puede presentar la ventaja de que se realizan reacciones de modificación naturales, relacionadas con la traducción, en el polipéptido que se genera de la misma manera que transcurriría también naturalmente.

A un sistema de expresión que puede emplearse pueden pertenecer así mismo genes adicionales, por ejemplo aquellos que se encuentran disponibles en otros vectores, y que influyen en la producción de los polipéptidos de acuerdo con la invención. En este sentido puede tratarse de productos génicos de modificación o de aquellos que se purificarán conjuntamente con el polipéptido que se codifica por la secuencia de ácido nucleico c), por ejemplo para influir en su función enzimática. A este respecto puede tratarse por ejemplo de otras proteínas o enzimas, de inhibidores o de aquellos elementos que influyen en la interacción con distintos sustratos.

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tipo se prefiere con respecto a un aislamiento del polipéptido de la célula huésped, es decir una preparación de producto a partir de la masa celular (masa seca), sin embargo requiere la provisión de uno o varios marcadores o mecanismos de secreción y/o sistemas de transporte adecuados. Sin secreción, el aislamiento del polipéptido puede tener lugar a partir de la célula huésped, es decir una purificación del polipéptido a partir de la masa celular. También para ello se conocen distintos procedimientos, tales como precipitación, por ejemplo, mediante sulfato de amonio o etanol, o la purificación cromatográfica.

Todas las circunstancias expuestas anteriormente pueden combinarse para dar procedimientos para preparar polipéptidos de acuerdo con la invención. A este respecto es concebible una pluralidad de posibilidades de combinación de etapas de procedimiento. El procedimiento óptimo debe determinarse para cada caso individual concreto. Así mismo, en los procedimientos mencionados, el ácido nucleico de acuerdo con la invención contenido en la célula huésped, en particular la secuencia de ácido nucleico (c), en un codón, preferentemente varios codones, puede haberse adaptado al uso de codones de la célula huésped.

Preferentemente, en el caso de un polipéptido producido de acuerdo con la invención se trata de una enzima. De manera especialmente preferente se trata de una enzima que se selecciona del grupo que consiste en proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, β-glucosidasa, carragenasa, oxidasa, oxidorreductasa, lipasa, o combinaciones de las mismas. De manera muy especialmente preferente, en el caso de la enzima se trata de una de las enzimas descritas anteriormente.

Las células huésped de acuerdo con la invención se usan ventajosamente en los procedimientos de acuerdo con la invención descritos, para preparar un polipéptido. Consecuentemente, es por consiguiente un objeto adicional de la invención el uso de una célula huésped descrita anteriormente para la preparación de un polipéptido. Dado que las células huésped de acuerdo con la invención comprenden un vector de acuerdo con la invención o un ácido nucleico de acuerdo con la invención, objetos adicionales de la invención son el uso de un vector descrito anteriormente para la preparación de un polipéptido o el uso de un ácido nucleico descrito anteriormente para la preparación de un polipéptido.

Todas las circunstancias, objetos y formas de realización, que se han descrito anteriormente, pueden emplearse también en estos objetos de la invención. Por lo tanto, en este punto se remite expresamente a la divulgación en el sitio correspondiente con la indicación de que esta divulgación también es válida para los usos de acuerdo con la invención (uso de la célula huésped o del vector o del ácido nucleico).

Los siguientes ejemplos explican la presente invención adicionalmente, sin limitarla a los mismos.

Ejemplos

Todas las etapas de trabajo de biología molecular siguen métodos convencionales, tal como están indicados por ejemplo en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis “Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laborstory Press, Nueva York, 1989, u obras pertinentes comparables. Las enzimas y juegos de construcción (kits) se emplearon según las instrucciones de los fabricantes respectivos.

Ejemplo 1: Producción fermentativa de una primera proteasa (variante mejorada en rendimiento de la proteasa alcalina de Bacillus lentus, que se divulga en el documento EP 0701605, denominada en adelante proteasa 1) con ayuda del promotor tándem PrpsB-PsubC

a) Construcción de plásmido de producción

Se sintetizó un fragmento de ADN de 240 pb (SEQ ID NO. 6), que comprende el promotor del gen 168 rpsB de Bacillus subtilis (posiciones 7 a 234) y se flanquea por los sitios de restricción Ndel y BamHI. La ligación del fragmento de ADN cortado con las endonucleasas de restricción Ndel y BamHI en el plásmido 1 cortado con las mismas endonucleasas de restricción dio como resultado el plásmido 1_PrpsB tal como se indica en la Figura 1. En este plásmido se encuentra el promotor de rpsB PrpsB directamente delante del promotor de subC PsubC, de modo que ambos promotores controlan la expresión de la proteasa 1 (véase 1). Como promotor de subC se usó el promotor denominado “ATCC 53926 alkaline protease gene promotor” según el documento WO 91/02792. Una cepa de Bacillus licheniformis se transformó con el plásmido plásmido 1_PrpsB, para obtener la cepa de protección de proteasa 1 “cepa 1”.

b) Producción fermentativa de la proteasa 1

La cepa 1 se empleó en un procedimiento de fermentación convencional. En comparación con la cepa de partida, que incluye únicamente plásmido 1 con el promotor de subC sin promotor de rpsB, el rendimiento aumenta en el fermentador de laboratorio de 2 l en un 24,1 % (valor medio de tres fermentaciones independientes).

Ejemplo 2: Producción fermentativa de una segunda proteasa (proteasa de Bacillus pumilus según el documento WO 2007/131656, denominada a continuación proteasa 2) con ayuda del promotor tándem PrpsB-PsubC

a) Construcción de plásmido de producción

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Claims

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