ES2620487T3

ES2620487T3 - Composiciones que comprenden semaforinas para uso en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2620487T3
Application number: ES14170744.8T
Authority: ES
Inventors: Gera Neufeld; Boaz Kigel; Ofra Kessler; Asya Varshavsky
Original assignee: Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences
Current assignee: Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2008-10-02
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2028-10-02
Also published as: WO2009050691A3; US20100247516A1; EP2210092B1; US9155781B2; US20130287726A1; EP2781223B1; AU2008313274A1; EP2781223A1; EP2210092A2; US8513194B2; US8088735B2; US20120101029A1; ES2505440T3; CA2702655A1; WO2009050691A2; IL225049A; EP2210092A4

Abstract

Una semaforina 3D que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% homóloga a ña secuencia cmp se indica en la SEQ ID NO: 29 para uso en el tratamiento del cáncer.

Description

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Asparagina: Asn N

Ácido aspártico: Asp D

Cisteína: Cys C

Glutamina: Gln Q

Ácido glutámico: Glu E

Glicina: Gly G

Histidina: His H

Isoleucina: Ile I

Leucina: Leu L

Lisina: Lys K

Metionina: Met M

Fenilalanina: Phe F

Prolina: Pro P

Serina: Ser S

Treonina: Thr T

Triptófano: Trp W

Tirosina: Tyr Y

Valina: Val V

Cualquier aminoácido de los anteriores: Xaa X

Tabla 2

Aminoácido no convencional: Código Aminoácido no convencional Código

Ácido α-aminobutírico: Abu L-N-metilalanina Nmala

α-Amino-α-metilbutirato: Mgabu L-N-metilarginina Nmarg

Carboxilato de aminociclopropano: Cpro L-N-metilasparagina Nmasn

Ácido L-N-metilaspártico: Nmasp

Ácido aminoisobutírico: Aib L-N-metilcisteína Nmcys

Carboxilato de aminonorbornilo: Norb L-N-metilglutamina Nmgin

Ácido L-N-metilglutámico: Nmglu

Ciclohexilalanina: Chexa L-N-metilhistidina Nmhis

Ciclopentilalanina: Cpen L-N-metilisoleucina Nmile

D-Alanina: Dal L-N-metil-leucina Nmleu

D-Arginina: Darg L-N-metil-lisina Nmlys

Ácido D-aspártico: Dasp L-N-metilmetionina Nmmet

D-Cisteína: Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle

D-Glutamina: Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva

Ácido D-glutámico: Dglu L-N-metilornitina Nmorn

D-Histidina: Dhis L-N-metilfenilanina Nmphe

D-Isoleucina: Dile L-N-metilprolina Nmpro

D-Leucina: Dleu L-N-metilserina Nmser

D-Lisina: Dlys L-N-metiltreonina Nmthr

D-Metionina: Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp

Aminoácido no convencional: Código Aminoácido no convencional Código

D-Ornitina: Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr

D-Fenilalanina: Dphe L-N-metilvalina Nmval

D-Prolina: Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg

D-Serina: Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug

D-Treonina: Dthr L-norleucina Nle

D-Triptófano: Dtrp L-norvalina Nva

D-Tirosina: Dtyr α-metilaminoisobutirato Maib

D-Valina: Dval α-metil-γ-aminobutirato Mgabu

D-α-metilanina: Dmala α-etilciclohexilalanina Mchexa

D-α-metilarginina: Dmarg α-metilciclopentilalanina Mcpen

D-α-metilasparagina: Dmasn α-metil-α-naftilalanina Manap

D-α-metilaspartato: Dmasp α-metilpenicilamina Mpen

D-α-metilcisteína: Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu

D-α-metilglutamina: Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg

D-α-metilhistidina: Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn

D-α-metilisoleucina: Dmile N-amino-α-metilbutirato Nmaabu

D-α-metil-leucina: Dmleu α-naftilalanina Anap

D-α-metil-lisina: Dmlys N-bencilglicina Nphe

D-α-metilmetionina: Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln

D-α-metilornitina: Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn

D-α-metilfenilalanina: Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu

D-α-metilprolina: Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp

D-α-metilserina: Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut

D-α-metiltreonina: Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep

D-α-metiltriptófano: Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex

D-α-metiltirosina: Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec

D-α-metilvalina: Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod

D-α-metilalanina: Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct

D-α-metilarginina: Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro

D-α-metilasparagina: Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund

D-α-metilaspartato: Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm

D-α-metilcisteína: Dnmcys N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe

D-N-metil-leucina: Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp

D-N-metil-lisina: Dnmlys N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu

N-metilciclohexilalanina: Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet

D-N-metilornitina: Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen

N-metilglicina: Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe

N-metilaminoisobutirato: Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina: Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina: Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina: Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr

D-N-metiltriptófano: Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nva

Aminoácido no convencional: Código Aminoácido no convencional Código

D-N-metiltirosina: Dnmtyr N-metil-α-naftilalanina Nmanap

D-N-metilvalina: Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen

Ácido γ-aminobutírico: Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr

L-t-butilglicina: Tbug N-(tiometil)glicina Ncys

L-etilglicina: Etg Penilcilamina Pen

L-homofenilalanina: Hphe L-α-metilalanina Mala

L-α-metilarginina: Marg L-α-metilasparagina Masn

L-α-metilaspartato: Masp L-α-metil-t-butilglicina Mtbug

L-α-metilcisteína: Mcys L-metiletilglicina Metg

L-α-metilglutamina: Mgln L-α-metilglutamato Mglu

L-α-metilhistidina: Mhis L-α-metilhomofenilalanina Mhphe

L-α-metilisoleucina: Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet

D-N-metilglutamina: Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg

D-N-metilglutamato: Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr

D-N-metilhistidina: Dnmhis N-(hidroxietil)glicina Nser

D-N-metilisoleucina: Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis

D-N-metil-leucina: Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp

D-N-metil-lisina: Dnmlys N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu

N-metilciclohexilalanina: Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet

D-N-metilornitina: Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen

N-metilglicina: Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe

N-metilaminoisobutirato: Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina: Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina: Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr

D-N-metiltriptófano: Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval

D-N-metiltirosina: Dnmtyr N-metil-α-naftilalanina Nmanap

D-N-metilvalina: Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen

Ácido γ-aminobutírico: Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr

L-t-butilglicina: Tbug N-(tiometil)glicina Ncys

L-etilglicina: Etg Penicilamina Pen

L-homofenilalanina: Hphe L-α-metilalanina Mala

L-α-metilarginina: Marg L-α-metilasparagina Masn

L-α-metilaspartato: Masp L-α-metil-t-butilglicina Mtbug

L-α-metilcisteína: Mcys L-metiletilglicina Metg

L-α-metilglutamina: Mgln L-α-metilglutamato Mglu

L-α-metilhistidina: Mhis L-α-metilhomofenilalanina Mhphe

L-α-metilisoleucina: Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet

L-α-metilleucina: Mleu L-α-metil-lisina Mlys

L-α-metilmetionina: Mmet L-α-metilnorleucina Mnle

L-α-metilnorvalina: Mnva L-α-metilornitina Morn

L-α-metilfenilalanina: Mphe L-α-metilprolina Mpro

L-α-metilserina: Mser L-α-metiltreonina Mthr

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Aminoácido no convencional: Código Aminoácido no convencional Código

L-α-metilvalina: Mtrp L-α-metiltirosina Mtyr

L-α-metilleucina: Mval Nnbhm L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe

N-(N-(2,2-difeniletil): N-(N-(3,3-difenilpropil)

carbamilmetil-glicina: Nnbhm carbamilmetil(1)glicina Nnbhe

1-carboxi-1-(2,2-difenil etilamino)ciclopropano: Nmbc

Tal y como se menciona más arriba en la presente memoria, la semaforina 3D para uso en la presente invención puede comprender una sustitución conservativa o no conservativa.

La terminología «sustitución conservativa», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia al reemplazo de un aminoácido presente en la secuencia nativa del péptido por un aminoácido que se produce de forma natural o no natural o un peptidomimético que tiene unas propiedades estéricas similares. Cuando la cadena lateral del aminoácido nativo a reemplazar es polar o hidrófoba, la sustitución conservativa debe ser con un aminoácido que se produce de forma natural, un aminoácido que no se produce de forma natural o con un resto peptidomimético que es también polar o hidrófobo (además de tener las mismas propiedades estéricas que la cadena lateral del aminoácido reemplazado).

Como los aminoácidos que se producen de forma natural se agrupan típicamente de acuerdo con sus propiedades, las sustituciones conservativas con aminoácidos que se producen de forma natural se pueden determinar con facilidad si se tiene en cuenta el hecho de que, de acuerdo con la invención, el reemplazo de los aminoácidos cargados por aminoácidos sin carga estéricamente similares se considera que son sustituciones conservativas.

Para producir sustituciones conservativas con aminoácidos que no se producen de forma natural, también es posible utilizar análogos de aminoácidos (aminoácidos sintéticos) bien conocidos en la técnica. Un peptidomimético del aminoácido que se produce de forma natural está bien documentado en la bibliografía conocida por el experto en la técnica.

Cuando afecta a las sustituciones conservativas, el aminoácido sustituyente debe tener en la cadena lateral el mismo grupo funcional que el aminoácido original o uno similar.

La frase «sustituciones no conservativas», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia al reemplazo del aminoácido que aparece en la secuencia original por otro aminoácido que se produce de forma natural o no natural, que tiene diferentes propiedades electroquímicas y/o estéricas. Así pues, la cadena lateral del aminoácido sustituyente puede ser significativamente mayor (o menor) que la cadena lateral del aminoácido nativo que se sustituye y/o puede tener grupos funcionales con propiedades electrónicas significativamente diferentes a las del aminoácido que se sustituye. Los ejemplos de sustituciones no conservativas de este tipo incluyen la sustitución de la alanina por fenilalanina o cicohexilmetilglicina, de la glicina por isoleucina o del ácido aspártico por -NH-CH[(CH2)5-COOH]-CO-. Las sustituciones no conservativas que caen dentro el alcance de la presente invención son las que siguen constituyendo un péptido cuyas propiedades son como las de la semaforina.

Tal y como se menciona, la semaforina 3D para uso en la presente invención pueden comprender sustituciones. De acuerdo con una realización, la semaforina se puede manipular genéticamente para que sea resistente a la escisión mediante las proproteína convertasas de tipo furina. Así pues, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la proproteína convertasa RFRR (SEQ ID n.º 39) se puede mutar en la secuencia KFKK (SEQ ID n.º 40). Esto se ha realizado en la semaforina 3B, con lo que los autores demostraron que esta mutación confería una resistencia parcial a las proproteína convertasas de las células cancerosas sin perturbar la actividad biológica de la semaforina 3B completa [Varshavsky A., Kessler O., Abramovitch S., Kigel B., Zaffryar S. et al. (2008) Cancer Res. 68: 69226931]. En las SEQ ID n.º 33-38 se presentan los ejemplos de secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de las semaforinas que son al menos parcialmente resistentes a las proproteína convertasas.

Tal y como se ha mencionado, los extremos amino y carboxilo de los péptidos de semaforina 3D para uso en la presente invención pueden estar protegidos por grupos funcionales. Los grupos funcionales adecuados se describen en Green y Wuts, «Protecting Groups in Organic Synthesis», John Wiley and Sons, capítulos 5 y 7, 1991. Los grupos protectores preferidos son los que facilitan el transporte del compuesto unido a éstos al interior de una célula, por ejemplo, al reducir la hidrofilia e incrementar la lipofilia de los compuestos.

Estos restos se pueden escindir in vivo, bien mediante hidrólisis o bien enzimáticamente, dentro de la célula. Los grupos protectores de hidroxilos incluyen grupos protectores éster, carbonato y carbamato. Los grupos protectores de amina incluyen grupos carbonilo alcoxi y ariloxi, tal y como se describe más arriba para los grupos protectores del extremo amino. Los grupos protectores de ácido carboxílico incluyen ésteres alifáticos, bencílicos y arílicos, tal y como se describe más arriba para los grupos protectores del extremo carboxilo. En una realización, el grupo de ácido carboxílico de la cadena lateral de uno o varios restos de ácido glutámico o de ácido aspártico de un péptido

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Así pues, al igual que para el tratamiento del cáncer, en la presente memoria se describe que las semaforinas también pueden tratar otros trastornos asociados a la angiogénesis.

Las enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyen, pero sin limitarse a ellas, enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias e infecciosas; cáncer dependiente de la angiogénesis, que incluye, por ejemplo tumores sólidos, tumores de transmisión hemática tales como leucemias y metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos; artrosis; psoriasis; eccema; angiopatías oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo del injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; artropatía hemofílica; angiofibroma; y granulación de las heridas. Además, las composiciones de esta invención se pueden utilizar para tratar enfermedades tales como, pero sin limitarse a ellas, adherencias intestinales, ateroesclerosis, esclerodermia, verrugas y cicatrices hipertróficas (a saber, queloides). Las composiciones de esta invención también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades en las que la angiogénesis es una consecuencia patológica, tal como linforreticulosis benigna (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), tuberculosis y lepra.

Las semaforinas o los polinucleótidos que las codifican se pueden administrar a un sujeto por sí solas o pueden formar parte de una composición farmacéutica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «composición farmacéutica» hace referencia a una preparación de uno o varios de los ingredientes activos descritos en la presente memoria con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En la presente memoria, la terminología «ingrediente activo» hace referencia a la semaforina responsable del efecto biológico.

De aquí en adelante, las frases «vehículo fisiológicamente aceptable» y «vehículo farmacéuticamente aceptable», que se pueden usar indistintamente, hacen referencia a un vehículo o un diluyente que no ocasiona ninguna irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. En estas frases se incluye un adyuvante.

En la presente memoria, la terminología «excipiente» hace referencia a un sustancia inerte que se añade a una composición farmacéutica para facilitar más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de los fármacos se puede encontrar en «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosa, especialmente trasnasal, intestinal o parenteral, entre ellas las inyecciones intramuscular, subcutánea e intramedular, así como la inyección intratecal, intraventricular directa, intracardiaca, p. ej., en la cavidad del ventrículo derecho o izquierdo, en la arteria coronaria común, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Las estrategias convencionales para la administración del fármaco al sistema nervioso central (SNC) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (p. ej., inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (p. ej., producción de una proteína quimérica de fusión que comprende un péptido transportador que tiene afinidad por una molécula de la superficie de las células endoteliales en combinación con un agente que es incapaz de cruzar la BHE por sí solo) en un intento de explotar una de las vías de transporte endógeno de la BHE; estrategias farmacológicas diseñadas para incrementar la liposolubilidad de un agente (p. ej., conjugación de agentes hidrosolubles a vehículos lipídicos o colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE mediante ruptura hiperosmótica (que se consigue con la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos inherentes asociados a un procedimiento quirúrgico invasivo, un límite del tamaño impuesto por una limitación inherente de los sistemas del transporte endógeno, unos efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables con la administración sistémica de una molécula quimérica que comprende un motivo vehicular que podría ser activo fuera del SNC, y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro en las que se ha roto la BHE, que las convierten en procedimientos de administración subóptimos.

Otra posibilidad sería que se pueda administrar la composición farmacéutica de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región del tejido de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., por medio métodos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

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adecuado, p. ej., una solución estéril en agua sin pirógenos, antes de ser usada.

La composición farmacéutica de la presente invención también se puede formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, p. ej., bases convencionales para supositorios tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de ingredientes activos (semaforinas) que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (p. ej., cáncer) o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está suficientemente dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica, en especial a la luz de la descripción detallada dada a conocer en la presente memoria.

Para cualquier preparación utilizada en los tratamientos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células e in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir una concentración o titulación deseadas. Tal información se puede utilizar para determinar de forma más exacta las dosis útiles en los humanos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente memoria se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos de células o en animales experimentales. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo de células e in vitro y de estudios con animales se pueden utilizar para formular un margen de dosis para ser utilizado en los humanos. La dosis puede variar según la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada: la formulación exacta, la vía de administración y la dosis las puede elegir cada médico en vista de la afección del paciente (véase, p. ej., Fingi et al., 1975, en «The Pharmacological Basis of Therapeutics», capítulo 1, pág. 1).

La cantidad y el intervalo de las dosis se pueden ajustar por separado para asegurar que la concentración del ingrediente activo es suficiente para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración eficaz mínima, CEM). La CEM variará en cada preparación, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro. Las dosis necesarias para conseguir la CEM dependerá de las características de cada individuo y de la vía de administración. Los ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones plasmáticas.

Según la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser única o múltiple, y el ciclo de tratamiento puede durar desde varios días a varias semanas o hasta que se logra la curación o se consigue disminuir el estado morboso.

La cantidad de una composición a administrar será por supuesto dependiente del sujeto a tratar, de la gravedad de la aflicción, de la vía de administración, del criterio del médico prescriptor, etc.

Las composiciones para uso en la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit autorizado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosis unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender una lámina de plástico o metal, tal como un envase alveolado o blíster. El envase o dispositivo dispensador puede venir acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispositivo dispensador también puede estar acondicionado con un aviso pegado en el contenedor en una forma prescrita por un organismo público que regula la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas, en donde dicho aviso recoge la autorización del organismo público para la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser de etiquetado autorizado por la Agencia del Medicamento de los EE.UU. (FDA, por su nombre en inglés) para fármacos con receta o de un prospecto autorizado. También se pueden preparar las composiciones que comprenden una preparación para uso en la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, colocadas en un contenedor adecuado y etiquetadas para el tratamiento de una afección indicada, como se describe con más detalle más arriba.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «aproximadamente» hace referencia a ± 10%.

La terminología «comprende», «que comprende», «incluye», «que incluye», «que tiene» y sus conjugados significan «que incluye pero no se limita a».

La terminología «que consiste en» significa «que incluye y se limita a».

La terminología «que consiste esencialmente en» significa que la composición puede incluir otros ingredientes, etapas y/o partes, pero sólo si los otros ingredientes, etapas y/o partes no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición que se reivindica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «procedimiento» hace referencia a maneras, medios, métodos y técnicas con los que llevar a término una tarea dada que incluye, pero sin limitarse a ellos, las maneras, medios, métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en las técnicas química, farmacológica, biológica,

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bioquímica y médica, o que éstos pueden fácilmente desarrollar a partir de las maneras, medios, métodos y técnicas conocidos.

A continuación se delinean diversas realizaciones y aspectos de la presente invención y tal como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los ejemplos que vienen a continuación que, junto las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante.

Por lo general, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» Sambrook et al., (1989); «Current Protocols in Molecular Biology», volúmenes I-III, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., «Recombinant DNA», Scientific American Books, New York; Birren et al., (eds.) «Genome Analysis: A Laboratory Manual Series», vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las presentadas en las patentes de los EE.UU. n.º 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; «Cell Biology; A Laboratory Handbook», volúmenes I-III Cellis, J. E., ed., (1994); «Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique» de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; «Current Protocols in Immunology», volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds.), «Basic and Clinical Immunology» (8.ª edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), «Selected Methods in Cellular Immunology», W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen exhaustivamente en las patentes y la bibliografía científica, véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.º 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219;

5.011.771 y 5.281.521; «Oligonucleotide Synthesis» Gait, M. J., ed. (1984); «Nucleic Acid Hybridization» Hames, B.

D. y Higgins S. J., eds. (1985); «Transcription and Translation» Hames, B. D.; y Higgins S. J., eds. (1984); «Animal Cell Culture» Freshney, R. I., ed. (1986); «Immobilized Cells and Enzymes» IRL Press, (1986); «A Practical Guide to Molecular Cloning» Perbal, B. (1984) y «Methods in Enzymology», vol. 1-317, Academic Press; «PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications», Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., «Strategies for Protein Purification and Characterization – A Laboratory Course Manual» CSHL Press (1996). Otras referencias generales se dan a conocer a lo largo de este documento. Los procedimientos de este documento se cree que se conocen bien en la técnica y se dan a conocer para la comodidad del lector.

Ejemplo 1 Las semaforinas de clase 3 inhiben el desarrollo de tumores procedentes de cáncer de mama al actuar selectivamente sobre las células tumorales que expresan el receptor

Material y métodos

Material: los anticuerpos dirigidos contra la acción β y contra las etiquetas de los epítopos myc y FLAG, así como las sustancias químicas, eran de Sigma (St. Louis, MI). Los medios y los sueros para el cultivo celular eran de Biological-Industries Inc. (Kibbutz BethHaemek, Israel). El Fugene® 6 se obtuvo de Roche Ltd (Suiza). Los anticuerpos dirigidos contra np1 y np2 se compraron a Santa Cruz Inc. (San Diego, CA). Los ADNc que codifican diferentes semaforinas se clonaron en el vector de expresión lentivírico NSPI-CMV-MCS-myc-His que contiene el promotor de SV40 que sirve para expresar el marcador de selección de la puromicina. Los anticuerpos dirigidos contra CD-31 eran de BD Biosciences Pharmingen. El kit de PCR inversa de ARN PerfectPure era de 5-Prime (Gaithersburg, MD).

Plásmidos de expresión: los ADNc de sema3A, sema3F y sema3E se subclonaron en el vector de expresión lentivírico NSPI-CMV-myc-his. El ADNc de sema3G se clonó del ARNm a partir de las HUVEC por RT-PCR. El ADNc de sema3D se clonó por RT-PCR a partir de las HUVEC tratadas con 30 ng/ml del VEGF durante 6 horas. Los ADNc que codifican la sema3D y la sema3G también se subclonaron en el vector de expresión NSPI. Los ADNc que contienen la etiqueta del epítopo myc se añadieron en fase delante del codón de parada de sema3D, sema3E, sema3F y sema3G. Se añadió una etiqueta del epítopo FLAG delante del codón de parada de sema3A según está descrito [Guttman-Raviv et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305].

Generación de lentivirus recombinantes e infección de la célula con los lentivirus: las células HEK293-T se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 100 mm (2,5 x 106 células por placa). Un día después de la inoculación, las células se transfectaron simultáneamente con el plásmido de expresión lentivírico adecuado (8 µg), con el vector de empaquetamiento pCMVdR8.91 (5 µg) y con un plásmido que codifica la envoltura de revestimiento del virus de la estomatitis vesicular pMD2-VSVG (2 µg), con el uso de Fugene® 6 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El medio acondicionado que contiene las partículas lentivíricas infecciosas se recogió 48 horas y 72 horas después de la transfección. Se añadió Polybrene® (8 µg/ml) al medio acondicionado y se incubó 8 horas con las células deseadas.

Líneas celulares: las células sin micoplasmas procedentes de cáncer de mama MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA

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MB-468 y MCF7 se obtuvieron de la ATCC. Las células se cultivaron en DMEM que contenía 4,5 mg/ml de glucosa complementado con STF al 10% y antibióticos. Las células HUVEC, PAE, HEK293 y HEK293-T se cultivaron como se describió previamente [Kessler O. et al., 2004, Cancer Res. 64: 1008-1015]. Las HUVEC se utilizaron entre los pases 3 y 7.

Ensayos de formación de tumores in vivo: las células que expresan las semaforinas o las células de control infectadas con los vectores lentivíricos vacíos se implantaron (5 x 106/ratón) en las almohadillas de grasa de la mama de ratonas hembra balb/c nu/nu de 4 a 6 semanas de edad (Harlan Laboratories). En la mayoría de los experimentos se utilizaron grupos de 9 animales/experimento. Se midieron los tumores dos veces por semana con un calibrador. Se determinó el volumen tumoral (V) con la fórmula V = 0,52 x A2 x B, en la que A es el diámetro corto y B es el largo. Cuando los tumores MDA-MB-231 alcanzaron un volumen medio de 200 a 300 mm3, se extirparon y se pesaron. Cada experimento se repitió al menos dos veces para confirmar los resultados. Se utilizaron microgránulos de estrógenos en los experimentos en los que se determinó el desarrollo de los tumores de células MCF-7 según está descrito previamente [Akiri G. et al., 2003, Cancer Res. 63: 1657-1666].

Inmunohistoquímica: los tumores se incluyeron en OCT y se congelaron en 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líquido. A continuación se laminaron en cortes gruesos de 30 µm con un criótomo. Los cortes se bloquearon con acetona fría, y se hicieron reaccionar con un anticuerpo dirigido contra el marcador endotelial CD-31, se tiñó para contrastar con hematoxilina, y se fotografió. Se fotografiaron 8 campos diferentes al microscopio procedentes de diferentes cortes de tres tumores diferentes. Estas fotografías se tomaron de áreas en donde la densidad de los vasos sanguíneos era más alta (método de puntos calientes) [Vermeulen, P. B., 1996, Eur. J. Cancer 32A: 24742484]. El área de los vasos sanguíneos en los campos con la misma superficie se cuantificó con el programa informático Image Pro Plus.

Transferencias Western: se prepararon lisados celulares y se determinó la concentración de proteínas según se describió previamente [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305]. Para determinar la concentración de las sema3 secretadas en los medios acondicionados de las diferentes líneas celulares, las células se inocularon en placas de 12 pocillos a una concentración de 2 x 105 células/pocillo. Las células se incubaron durante 48 horas en 0,4 ml del medio sin suero. Se analizaron alícuotas del mismol volumen mediante análisis por transferencia Western para detectar la presencia de las sema3 con anticuerpos dirigidos contra la etiqueta adecuada de los epítopos myc o FLAG, según se describió previamente [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305]. Ninguna de las semaforinas expresadas alteraron la tasa de proliferación ni la tasa supervivencia de las diferentes líneas celulares (no se muestran los datos).

Ensayo de proliferación: las células tumorales (104 células/pocillo) se inocularon por triplicado en placas de 24 pocillos. Las células adheridas se digirieron con tripsina y se contaron cada 24 horas durante 4 días con un contador Coulter. Los datos se representaron en un gráfico semilogarítmico en el que la pendiente de la curva representa la tasa de crecimiento de la línea celular.

Ensayo de adherencia: en los experimentos de adherencia celular se utilizaron placas de cultivo de 12 pocillos sin recubrir así como placas de 12 pocillos no adherentes revestidos con fibronectina (5 µl/ml). Las células tumorales (105 células/pocillo) se inocularon por triplicado en el medio de crecimiento. Las células se lavaron dos veces con PBS, se digirieron con tripsina para liberar las células adheridas y se contaron con un contador Coulter. Las células se contaron 5, 10, 20 y 45 minutos después de que se inocularan. Se calculó entonces el porcentaje de células adheridas respecto al número de células inoculadas y se representó en un gráfico. El tiempo requerido para que se adhieran el 50% de las células inoculadas se utilizó como una medición con la que comparar las propiedades de adherencia de las células de control y de las células que expresan la semaforina.

Ensayo de repulsión de las células endoteliales: se realizaron ensayos de repulsión de células esencialmente según está descrito [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305].

Ensayo de formación de colonias en agar blando: una primera capa de agar que contiene 2 ml de agar de bajo punto de fusión (Bio-Rad) al 0,5% disuelto en el medio de crecimiento se vertió en los pocillos de una placa de 6 pocillos para cultivo de células y se dejó polimerizar a 4 ºC durante 20 minutos. Una segunda capa (1 ml) que contenía agar de bajo punto de fusión al 0,3% disuelto en el medio de crecimiento que contiene las células (3 x 103/ml) se colocó en la parte superior de la primera capa y se dejó estar a 4 ºC durante 20 minutos. El medio de crecimiento (2 ml) se añadió en la parte superior de la segunda capa y las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 ºC durante 21 días con cambio del medio dos veces a la semana. Al final del experimento, las colonias se tiñeron durante 1 hora con violeta de genciana al 0,005%, y se incubaron con PBS durante una noche para retirar el exceso de violeta de genciana. Las colonias se fotografiaron, y las colonias con un diámetro de 150 µm o más se contaron con el programa morfométrico Image-Pro.

Análisis estadístico: el análisis estadístico se realizó con los datos sin emparejar con una prueba la t de Student de varianzas desiguales. Las barras de error representan el error estándar de la media. La significación estadística se presenta de la manera siguiente: * p < 0,05, ** p < 0,01 y *** p < 0,001.

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sema3F no (figuras 4A-C). Estos efectos son similares a los observados con respecto al efecto de estas semaforinas sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2A y 2C). En conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de las sema3 para inhibir la formación de tumores desde un tipo de células procedente de cáncer de mama depende de la identidad de los receptores de semaforinas que se expresan en las células del tumor en desarrollo, y además indica que las sema3 no deben ser capaces de inhibir la formación de tumores a partir de las células de cáncer de mama que no expresan los receptores de sema3.

Para comprobar esta predicción, se expresaron la sema3A y la sema3F en las células de cáncer de mama MDA-MB468, que no expresan ni np1 ni np2 ni PlexD1 (figuras 1A, C). Estas células forman tumores de crecimiento lento tras la inyección en las almohadillas de grasa de la mam de ratonas nu/nu balb/c. De acuerdo con la presente predicción, ni la expresión de la sema3A ni la expresión de la sema3F inhibieron significativamente la formación de tumores a partir de estas células (figuras 4E-F).

Los efectos de diferentes semaforinas de clase 3 sobre la angiogénesis tumoral: la sema3F fue caracterizada en varios estudios como un inhibidor de la angiogénesis tumoral y como un factor repulsivo para las células endoteliales, y también se halló que la sema3A era un inhibidor de la angiogénesis inducida por el VEGF y también un factor repelente para las células endoteliales, aunque no era un inhibidor de la angiogénesis tumoral. Para comparar las propiedades repelentes de las diferentes semaforinas de clase 3, las células HEK293 que expresan una cantidad parecida de semaforinas se inocularon sobre monocapas de células endoteliales procedentes de la vena umbilical humana (HUVEC, por su nombre en inglés) en densidades clonales. Las células HEK293 secretaban una concentración parecida de semaforina en su medio de crecimiento, según se determinó mediante el análisis por transferencia Western con anticuerpos dirigidos contra la etiqueta del epítopo myc que se fusionó en fase delante del codón de parada de los ADNc de las diferentes semaforinas (no se muestran los datos). Las células de control infectadas con el vector lentivírico vacío no repelieron las células endoteliales, pero las células que expresaban la sema3A, la sema3D y la sema3E repelieron las células endoteliales con eficacia (figura 5A). No obstante, la sema3F, y en particular la sema3G, agonistas de np2, repelieron las HUVEC con menos fuerza que los agonistas de np1 o la sema3E, agonista de PlexD1 (no se muestran los datos). Por lo tanto, las células que expresan la sema3F o bien la sema3G se inocularon encima de células endoteliales aórticas de cerdo (PAE, por su nombre en inglés) manipuladas genéticamente para que expresen a la vez np2 y plexA1. Como se esperaba, estas células fueron repelidas con mucha fuerza por la sema3F, pero también fueron repelidas con menos eficacia por la sema3G (figura 5B).

Para encontrar si las diferentes sema3 que se examinaron en el presente ejemplo inhibían la angiogénesis tumoral, se determinó la concentración de los vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaron a partir del control y de las células procedentes de cáncer de mama que expresan semaforinas. Ya que la sema3A inhibía casi completamente la formación de tumores a partir de las células MDA-MB-231, no fue posible determinar la concentración de los vasos sanguíneos en este caso. Sin embargo, la expresión de la sema3D, agonista de np1, en este tipo celular dio lugar a la formación de tumores que contenían concentraciones significativamente más bajas de vasos sanguíneos que en los tumores que se desarrollaron a partir de las células de control (figura 5C). La reducción de la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor no se correlacionaba con los tipos de receptores de semaforinas que se expresaban en las células cancerosas ya que la expresión de la sema3F y de la sema3G, agonistas de np2, también redujo significativamente la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor en los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-231 (figura 5C). Se observó una reducción cuantitativa similar de la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor independientemente de si se utilizaba la sema3D o la sema3G, incluso aunque la expresión de la sema3D inhibiera la formación de tumores con eficacia mientras que la sema3G no inhibía la formación de tumores (figuras 2A-L). En cambio, la expresión de la sema3E, una semaforina que inhibía el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2G-I) y que inhibía la invasión de los vasos sanguíneos en los metámeros durante el desarrollo temprano, no dio lugar a una disminución de la concentración de vasos sanguíneos asociados a tumores en los tumores procedentes de MDAMB-231 (figura 5C).

También se examinaron los efectos de la expresión de la sema3A y de la sema3F sobre la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor en las células MCF-7. Estos tumores se desarrollan en las almohadillas de grasa de la mama de las ratonas sólo en presencia de microgránulos de liberación lenta de estrógenos. La expresión de la sema3A en estas células redujo constante y significativamente la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor. Sin embargo, la expresión de la sema3F no (figura 5D).

En el caso de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435, se halló que la expresión de la sema3A y la sema3D reducía con fuerza la concentración de vasos sanguíneos en los tumores resultantes (figura 5E) incluso aunque el desarrollo de tumores desde estas células no estuviera inhibido por estas semaforinas (figuras 3A-I). No fue posible determinar la concentración de vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaron a partir de las células que expresan la sema3F o la sema3G ya que los tumores resultantes eran demasiado pequeños o inexistentes, como en el caso de la sema3G. La expresión de la sema3E produjo una disminución de la concentración de vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaban desde estas células, pero la disminución, aunque estadísticamente significativa, era pequeña.

En conjunto, estos experimentos indican que aunque la mayoría de las semaforinas serían capaces de inhibir la

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no era significativamente diferente de la de los tumores de control (figura 7D). Cuando la sema3A, agonista de np1, se coexpresaba en éstas con np1, las células que expresaban ambos genes revirtieron al comportamiento mostrado por las células originales y formaron tumores que dejaban de crecer cuando los tumores alcanzaban un volumen de 50 a 100 mm3, gracias a lo cual se elimina la ventaja de crecimiento conferida por la presencia de np1 (figuras 7A-C), pero no la conferida por la presencia de np2, que se puede inhibir con los agonistas de np2, tales como la sema3F o la sema3G (figuras 3A-I). El interesante señalar que la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435 que expresan la sema3A o la sema3A + np1 era similar y significativamente más baja que la de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435 que no expresan la sema3A (figura 7D), lo que indica de nuevo que la inhibición de la angiogénesis representa parte del mecanismo mediante el cual las semaforinas modulan la progresión tumoral, pero que puede no ser siempre suficiente inhibir la expansión tumoral.

Discusión

Los presentes resultados indican por primera vez que sema3A, sema3D, sema3E y sema3G inhiben la formación de tumores de diferentes líneas celulares procedentes de carcinomas de mama humanos. De debe destacar que ya se había descrito que la sema3E era un agente prometastásico, pero la actividad prometastásica estaba asociada a un producto de escisión generado por las proproteína convertasas de tipo furina y no por la proteína completa. En los presentes experimentos no había casi ninguna escisión de la sema3E en las células MDA-MB-231 ni en las células MDA-MB-435.

Muchos tipos de células neoplásicas expresan uno o más de np1, np2 o PlexD1, los receptores de semaforinas de clase 3. Los tipos de células procedentes de cáncer de mama que se emplearon en los presentes ejemplos para estudiar los efectos antineoplásicos de las diferentes semaforinas expresan diferentes combinaciones de receptores de semaforinas de clase 3 en su superficie celular. Ambas neuropilinas, así como varios tipos de plexinas, también se expresan en las células endoteliales, en donde desempeñan una función importante en la transducción de las señales angiogénicas inducidas por el VEGF, y participan en los efectos antiangiogénicos de las sema3. En el presente estudio, los presentes inventores han intentado evaluar la importancia relativa de los efectos antiangiogénicos frente a los efectos directos de las sema3 a la hora de determinar las propiedades antineoplásicas de las diferentes sema3. En conjunto, los presentes ejemplos indican que la expresión de un determinado receptor de semaforinas en las células neoplásicas es probablemente el factor más importante que determina si una semaforina de clase 3 dada funcionará como un inhibidor eficaz del desarrollo tumoral. Así pues, el desarrollo de los tumores a partir de las células MDA-MB-231 que expresan np1, pero no np2, se ve fuertemente inhibido por la sema3A y la sema3D, agonistas de np1, pero no por la sema3G, agonista de np2. Esta conclusión también está respaldada por los experimentos que han demostrado que en el caso de las células MDA-MB-435 que expresan np2, la sema3A no inhibe el desarrollo tumoral y la sema3D inhibe débilmente el desarrollo tumoral, mientras que la sema3G y la sema3F funcionan como inhibidores muy eficaces en el caso de estas células. Además, ni la sema3A ni la sema3F fueron capaces de inhibir el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-468 que no expresan neuropilinas.

La sema3E es única entre las sema3 ya que es la única semaforina que no se fija a las neuropilinas y que, en cambio, activa directamente la PlexD1. Tanto las células MDA-MB-231 como las MDA-MB-435 expresan PlexD1, aunque el nivel de expresión en las células MDA-MB-435 es significativamente más bajo que en las células MDAMB-231. La sema3E inhibió significativamente el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231, pero no del todo a partir de las células MDA-MB-435. Es posible que el nivel de expresión de PlexD1 de las células MDAMB-435 esté por debajo de un umbral crítico que no permite la inhibición del desarrollo de tumores debido a la sema3E. Así pues, este resultado quizás también se pueda considerar como uno que apoya el criterio general mencionado anteriormente. La PlexD1 puede formar complejos con las neuropilinas y, al menos en el caso de np1, esta interacción puede influir en la naturaleza de la respuesta biológica a la sema3E. Por lo tanto, es posible que, en las células MDA-MB-435, el efecto de la sema3E pueda estar inhibido por np2, mientras que, en las células MDAMB-231, np1 puede influir en la señalización de la sema3E de manera diferente, y dar lugar a diversas respuestas biológicas.

Los presentes inventores demostraron por primera vez que sema3D, sema3G, sema3A y sema3E funcionan como inhibidores de la angiogénesis tumoral, ya que su expresión en las células tumorales dio lugar a una reducción significativa de la densidad de vasos sanguíneos asociados al tumor. Estos resultados indican que, por norma, la expresión de las semaforinas tiende a reducir la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollan a partir de las células MDA-MB-231, MDA-MB-435 o MCF-7, incluso en el caso de que el desarrollo tumoral no se inhiba con la semaforina dada. Sin embargo, había unas pocas excepciones a esta regla. La densidad de los vasos sanguíneos en los tumores procedentes de las células MCF-7 que expresan la sema3F no se redujo en comparación con los tumores procedentes de las células MCF-7 de control. Sin embargo, el desarrollo de los tumores a partir de las células MCF-7 requiere estrógenos, unas hormonas que recientemente se encontró que inhiben la expresión de np2, el receptor de la sema3F, lo que puede explicar, quizás, la ausencia de efecto antiangiogénico en este caso. Además, se encontró que la expresión de la sema3E en las células MDA-MB-231 tampoco consiguió reducir la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores resultantes, a pesar de la inhibición significativa del crecimiento tumoral.

Claims

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