ES2869901T3 - Agentes inmunosupresores y su uso en terapia - Google Patents

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Abstract

Un agente o composición que contiene un agente, para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, en donde dicho agente comprende: (i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo de interacción con PCNA y un péptido de penetración celular (CPP), en donde el motivo de interacción con PCNA es X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 2) y en donde: X1 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K) e Histidina (H); X2 se selecciona de Triptófano (W), Fenilalanina (F) y Tirosina (Y); X3 se selecciona de Leucina (L), Isoleucina (I), Valina (V), Alanina (A), Metionina (M), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q) y Cisteína (C); X4 se selecciona de Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Alanina (A), Metionina (M), Glicina (G), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q), Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Cisteína (C); y X5 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Prolina (P); o (ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico de (i).

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes inmunosupresores y su uso en terapia
La presente invención se refiere a nuevos agentes, particularmente péptidos o miméticos de los mismos y a sus ácidos nucleicos codificantes, a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de dichos agentes, y a su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre. Los agentes pueden ser útiles solos o en combinación con otros compuestos terapéuticamente activos, tales como compuestos inmunosupresores, compuestos antiinflamatorios, compuestos antimicrobianos, etc. Tales compuestos pueden ser, por ejemplo, antagonistas o inhibidores de las vías de transducción de señales, particularmente las vías de señalización del receptor de tipo toll, tales como antagonistas del receptor toll y/o inhibidores de proteína cinasa. También se describen métodos terapéuticos que comprenden el uso de dichos agentes para los usos mencionados anteriormente. Los agentes también se pueden usar en la fabricación o preparación de medicamentos para las terapias mencionadas anteriormente.
Los péptidos APIM son un grupo de péptidos que interactúan con PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación) a través de un nuevo motivo de interacción con PCNA (Gilljam et al., 2009. Identification of a novel, widespread, and functionally important PCNA-binding motif, J. Cell Biol. 186(5), págs. 645-654). El motivo se ha denominado APIM (motivo de interacción con PCNA homólogo de AlkB 2 (hABH2)) desde que se identificó por primera vez como mediador de la interacción entre hABH2 y PCNA, pero como quedará claro a partir de la divulgación a continuación, ahora se han identificado motivos APIM en una amplia gama de proteínas. El motivo de unión a PCNA, que se encuentra en los péptidos APIM, normalmente se define usando la secuencia de consenso, [R/K]-[F/W/Y]-[L/I/V/A]-[L/I/WA]-[K/R] (SEQ ID NO:19).
El PCNA es un miembro de la familia de proteínas de abrazadera deslizante, que se sabe que están implicadas tanto en la replicación como en la reparación del ADN. La función principal del PCNA es proporcionar polimerasas replicativas con la alta procesividad necesaria para la duplicación del genoma. En las células vivas en fase S, el PCNA marcado con proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) forma focos distintos que representan sitios de replicación. Por lo tanto, se puede utilizar como marcador de fase S.
Numerosas proteínas implicadas en procesos celulares tales como reparación del ADN, ensamblaje de cromatina, remodelación epigenética y de cromatina, cohesión de la cromátida hermana, control del ciclo celular y supervivencia se localizan en las llamadas fábricas de replicación que contienen más de una docena de horquillas de replicación. Muchas de estas proteínas interactúan con PCNA y se ha demostrado que se localizan conjuntamente con PCNA en focos de replicación. Se cree particularmente que las proteínas que interactúan con PCNA están involucradas en la reparación y replicación del ADN y en la proliferación celular. Por lo tanto, varias proteínas interactúan con PCNA y se cree que muchas de estas interacciones están mediadas a través de una secuencia peptídica conservada que interactúa con PCNA llamada caja PIP (QxxL/I/MxxF/DF/Y [SEQ ID NO: 1205]), en la que x puede ser cualquier aminoácido. Sin embargo, los péptidos que contienen una caja PIP suelen ser extremadamente citotóxicos y, por lo tanto, no son adecuados para su uso en terapia.
Sin embargo, se ha demostrado que los péptidos APIM son útiles en terapia. Específicamente, se ha demostrado que los péptidos APIM son eficaces en la sensibilización de las células a agentes citotóxicos y citostáticos, en particular, a agentes que dañan el ADN (documento WO 2009/104001) y, de hecho, como agente citotóxico inductor de apoptosis por derecho propio (Muller et al., 2013. Targeting Proliferating Cell Nuclear Antigen and Its Protein Interactions Induces Apoptosis in Multiple Myeloma Cells, PLOS One, 8(7), e70430, págs. 1-12). Por lo tanto, se ha demostrado que los péptidos APIM son útiles en combinación con agentes citotóxicos y/o citostáticos en el tratamiento de un trastorno o afección donde es deseable inhibir el crecimiento de células, o en un tratamiento que implica terapia citostática, es decir, para prevenir o inhibir la proliferación no deseada de células.
Se ha demostrado que el PCNA es un regulador clave de la supervivencia de los neutrófilos y se ha propuesto el direccionamiento al PCNA en estas células para el tratamiento de enfermedades inflamatorias dependientes de neutrófilos (De Chiara et al., 2012, Frontiers in Immunology, Vol. 3, Artículo 311 y documento WO 2011/104309). Los neutrófilos producen diversas citocinas y se cree que desempeñan un papel importante en diversas afecciones (Cassatella et al., 1997, Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 832, págs. 233-242).
En el trabajo que condujo a la presente invención, se determinó que el PCNA está presente en el citosol en algunos tipos de células, particularmente células diferenciadas terminalmente, donde se cree que interactúa con una variedad de polipéptidos citosólicos en la regulación de la apoptosis, por ejemplo, a través de caspasas. Por consiguiente, no se esperaba que el PCNA estuviera presente en el citosol de células no proliferantes, particularmente células que no están diferenciadas terminalmente.
Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que los péptidos APIM tienen un efecto sobre las células que no proliferan. Además, los inventores han demostrado que los péptidos APIM interfieren con las interacciones proteicas entre proteínas implicadas en diversas vías de transducción de señales, particularmente las vías de transducción de señales del receptor de tipo toll. Tal como se muestra con más detalle en los ejemplos, los inventores determinaron que los péptidos APIM pueden reducir la liberación de citocinas proinflamatorias de las células inmunitarias que no proliferan, por ejemplo, células inmunitarias no diferenciadas terminalmente, tal como los monocitos, sin inducir apoptosis.
Los receptores tipo toll (TLR) forman una de las principales clases de receptores de reconocimiento de patrones transmembrana (PRR). En este sentido, las células del sistema inmunitario innato reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) a través de PRR. En los seres humanos, se han identificado diez TLR diferentes que reconocen una variedad de PAMP.
TLR1, 2, 4, 5 y 6 se localizan en la superficie celular y detectan principalmente componentes de la pared celular bacteriana, tales como el lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas. El LPS es reconocido por el TLR4. Los TLR3, 7, 8 y 9 se localizan en compartimentos unidos a la membrana intracelular, incluidos los endolisosomas, donde reconocen los ácidos nucleicos víricos y bacterianos. TLR3 reconoce el ARN bicatenario (ARNdc) de virus y el análogo sintético del ARNdc ácido poliinosínicopolicitidílico (polilC).
Una vez activado, los PRR inducen vías de transducción de señales intracelulares que dan como resultado la expresión y secreción de citocinas y quimiocinas, que funcionan para coordinar la respuesta inmunitaria en la defensa del hospedador contra patógenos microbianos.
Tras la unión del ligando, los TLR reclutan las principales proteínas adaptadoras MyD88 y/o TRIF y activan las vías de transducción de señales que desencadenan la expresión y secreción de citocinas necesarias para inducir una respuesta inmunitaria. La vía dependiente de MyD88 es utilizada por todos los TLR excepto TLR3. La activación de la vía MyD88 induce la producción de citocinas inflamatorias a través del factor de transcripción NF-kB y proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK). Tanto TLR3 como TLR4 reclutan el adaptador TRIF e inducen interferones de tipo I (IFN) a través del factor de transcripción IRF3. Además, TRIF activa NF-kB y MAPK.
La señalización de TLR también activa la vía fosfatidilinosítido 3-cinasa (PI3K)/Akt. Se ha sugerido que la actividad de PI3K/Akt es necesaria para la activación completa de IRF3 en la vía dependiente de TRIF durante la señalización de TLR3 y 4. Además de TLR3, los receptores citosólicos que incluyen RIG-1, MDA5 y PKR también reconocen el ARNdc y median las respuestas antivíricas a través de las vías de señalización similares a los TLR.
Por lo tanto, diversas vías de señalización están involucradas en la coordinación de las respuestas del sistema de defensa inmune celular innato, que es fundamental para sobrevivir a las exposiciones a microbios y parásitos. Este sistema también es relevante para el manejo de células desviadas después de infecciones víricas y en enfermedades autoinmunes. El sistema utiliza citocinas y quimiocinas para comunicar y coordinar las respuestas inmunitarias y estas señales son inmensamente importantes para controlar las respuestas locales y sistémicas. Sin embargo, las citocinas y quimiocinas se han relacionado con una variedad de enfermedades y trastornos, típicamente como resultado de niveles anómalos de estas moléculas, que pueden desencadenar respuestas indeseables in vivo. Por ejemplo, la secreción excesiva de citocinas, como en la llamada "tormenta de citocinas", puede tener efectos adversos graves sobre la salud.
Las citocinas y quimiocinas son péptidos, moléculas de señalización de proteínas o glucoproteínas que se utilizan ampliamente en la comunicación celular. Los términos citocina y quimiocina se usan indistintamente en el presente documento y abarcan familias grandes y diversas de moléculas que se producen ampliamente en todo el cuerpo. Si bien prácticamente todas las células nucleadas son capaces de producir citocinas y quimiocinas, las células inmunitarias son una fuente particularmente importante de citocinas y quimiocinas. Las células inmunitarias se pueden identificar y caracterizar, al menos hasta cierto punto, por la mezcla de citocinas y quimiocinas que segregan, ya que esto forma una parte crucial de su papel en el sistema inmunitario.
Los monocitos son un tipo de célula inmunitaria (leucocitos o glóbulos blancos) que son producidos por la médula ósea a partir de precursores de células madre hematopoyéticas llamados monoblastos. Los monocitos son células que no proliferan y que no se diferencian terminalmente. Por consiguiente, los monocitos se encuentran principalmente en la sangre y el bazo, y típicamente constituyen entre aproximadamente el 3-8 % de los leucocitos en la sangre. Estas células tienden a circular en el torrente sanguíneo durante aproximadamente uno a tres días antes de pasar a los tejidos de todo el cuerpo, donde se diferencian terminalmente en diferentes tipos de macrófagos, dependiendo de la ubicación anatómica.
Los monocitos presentan de forma característica el receptor de superficie celular CD14 y también pueden expresar y mostrar el receptor de superficie celular CD16. Estas células están particularmente asociadas con la liberación de citocinas proinflamatorias y quimiocinas como el TNFa, IL1RA, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, FGF básico, G-CSF, GM-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-p, CCL5 y VEGF, particularmente después de la estimulación por componentes de células microbianas (como LPS) y/o virus (como ácidos nucleicos bicatenarios). Los monocitos se encuentran a menudo en niveles muy altos en sujetos con infecciones graves, por ejemplo, en casos de síndrome séptico y septicemia, donde se cree que la sobreproducción de citocinas y quimiocinas contribuye a los síntomas y complicaciones asociados con estas afecciones, por ejemplo, síndrome de disfunción multiorgánica (es decir, fallo multiorgánico).
De hecho, la liberación incontrolada o excesiva de citocinas y/o quimiocinas (por ejemplo, hipercitocinemia) de las células inmunitarias en la sangre, tal como los monocitos, se asocia con una variedad de trastornos. Por ejemplo, se cree que la liberación excesiva de citocinas proinflamatorias y/o quimiocinas es la principal fuerza impulsora de enfermedad y muerte causada por infecciones por Plasmodium falciparum, es decir, malaria. Otras enfermedades inflamatorias, incluyendo infecciones bacterianas, fúngicas y algunas víricas (por ejemplo, la gripe, tal como la gripe porcina, la gripe aviar), puede resultar en una liberación excesiva de citocinas proinflamatorias y/o quimiocinas en sangre. Estas infecciones pueden ser locales o sistémicas. Además, los trasplantes de tejidos alogénicos pueden provocar una enfermedad de injerto contra huésped, en la que las células inmunitarias producen niveles excesivos de citocinas y quimiocinas, tales como TNFa.
Las terapias para trastornos causados por, o asociados con, la liberación excesiva de citocinas y quimiocinas se ha centrado típicamente en la inhibición de citocinas y quimiocinas particulares o pequeños grupos de citocinas y quimiocinas relacionadas. Por ejemplo, las terapias pueden utilizar proteínas de unión específicas, tales como anticuerpos o receptores solubles, para neutralizar las citocinas y quimiocinas liberadas e indeseables. Como alternativa, se pueden usar proteínas de unión o antagonistas de moléculas pequeñas para bloquear los receptores de citocinas y quimiocinas para prevenir la señalización aguas abajo. Sin embargo, puede ser necesaria una combinación de tales terapias para tratar un exceso de varias citocinas y quimiocinas, y la combinación de múltiples agentes terapéuticos puede ser costosa y puede tener efectos secundarios indeseables e impredecibles. Si bien se ha sugerido el uso de corticoesteroides en sujetos que padecen hipercitocinemia, existe evidencia limitada de que dichos tratamientos sean eficaces. Además, las terapias hasta la fecha se han centrado en el tratamiento de tejidos particulares, tales como los pulmones, por ejemplo, el tratamiento de la EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica) mediante, por ejemplo, la inhibición de G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos).
Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de terapias eficaces adecuadas para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones causadas por, o asociadas con, la liberación excesiva de citocinas y quimiocinas (por ejemplo, enfermedades infecciosas), que también tienen efectos secundarios mínimos.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los inventores han descubierto sorprendentemente que los péptidos APIM pueden reducir la liberación de citocinas y quimiocinas proinflamatorias de las células inmunitarias que no proliferan, por ejemplo, células inmunitarias no diferenciadas terminalmente, tal como los monocitos, sin inducir apoptosis. Por lo tanto, los inventores han determinado que los péptidos APIM pueden funcionar a través de un mecanismo general en células inmunitarias que no proliferan para inhibir (por ejemplo, reducir, disminuir, rebajar, etc.) la liberación de citocinas y/o quimiocinas de dichas células, por ejemplo, cuando las células han sido estimuladas con cualquiera de una variedad de componentes, por ejemplo, componentes de entidades infecciosas (microbianas, víricas y parasitarias), tales como LPS o ácido nucleico bicatenario.
Estos sorprendentes hallazgos han llevado a los inventores a proponer nuevos usos terapéuticos para los péptidos APIM, es decir, péptidos que comprenden un motivo de unión a PCNA, a saber, para su uso en el tratamiento de una afección o trastorno asociado con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre, particularmente afecciones o trastornos asociados con la liberación excesiva, indeseable o incontrolada de citocinas proinflamatorias de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, por ejemplo, una enfermedad infecciosa o infección o una enfermedad o afección agravada o causada por una infección.
Como alternativa a lo observado, los inventores proponen el uso de péptidos APIM para tratar o prevenir la liberación excesiva, indeseable o incontrolada de citocinas proinflamatorias de las células inmunes no proliferantes en la sangre de un sujeto, por ejemplo, un sujeto con una enfermedad infecciosa o infección o una enfermedad o afección agravada o causada por una infección.
En una realización, la invención proporciona un agente o una composición que contiene un agente, para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, en donde dicho agente comprende:
(i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo de interacción con PCNA y un péptido de penetración celular (c Pp ), en donde el motivo de interacción con PCNA es X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 2 ) y
en donde:
X1 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K) e Histidina (H);
X2 se selecciona de Triptófano (W), Fenilalanina (F) y Tirosina (Y);
X3 se selecciona de Leucina (L), Isoleucina (I), Valina (V), Alanina (A), Metionina (M), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q) y Cisteína (C);
X4 se selecciona de Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Alanina (A), Metionina (M), Glicina (G), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q), Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Cisteína (C); y
X5 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Prolina (P); o
(ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico de (i).
En algunas realizaciones, el agente tal como se define en el presente documento se puede usar en combinación con uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, otros agentes terapéuticamente activos, tales como compuestos inmunosupresores, compuestos antiinflamatorios, compuestos antimicrobianos, esteroides (por ejemplo, corticoesteroides), inhibidores de cinasa (tales como inhibidores de p38 MAPK, inhibidores de clase I de PI3K), etc., para potenciar el efecto del agente. Sin embargo, en algunas realizaciones, el agente, como se define en el presente documento, puede usarse solo, es decir, como el único agente activo en una composición y/o medicamento.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un agente o composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) tal como se define en el presente documento para su uso en combinación con uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, un agente terapéuticamente activo, en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de las células inmunes no proliferantes en la sangre.
El agente terapéuticamente activo puede ser, pero sin limitación, un compuesto inmunosupresor, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antimicrobiano, un esteroide (por ejemplo, un corticoesteroide) o un inhibidor de la cinasa (como un inhibidor de p38 MAPK o un inhibidor de PI3K de clase I).
El medicamento puede estar en forma de una única composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende tanto el agente como se definió en el presente documento como uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, agente terapéuticamente activo, o puede estar en forma de un kit o producto que los contiene para administración separada (por ejemplo, simultánea o secuencial).
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un producto o kit que contiene un agente como se definió en el presente documento junto con uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, un agente terapéuticamente activo, como una preparación combinada para uso separado, simultáneo o secuencial en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de células inmunitarias no proliferantes en sangre.
Un compuesto oligopeptídico (por ejemplo, un péptido) capaz de interactuar con PCNA tal como se desvela en el presente documento puede contener o comprender un motivo (o secuencia) peptídico que puede definirse generalmente como:
X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 1), en donde:
X1 es un aminoácido básico;
X2 es un aminoácido aromático;
X3 es un aminoácido sin carga que no es un aminoácido aromático, Glicina (G) y Prolina (P);
X4 es cualquier aminoácido que no sea Prolina (P), un aminoácido ácido o un aminoácido aromático; y
X5 es un aminoácido básico o Prolina (P).
Para que el compuesto oligopeptídico, que es capaz de interactuar con PCNA, o su ácido nucleico codificante, puede funcionar en los usos de la invención, el compuesto debe ser capaz de entrar en la célula, es decir, cruzar la membrana celular hacia el citosol (citoplasma) y, opcionalmente, hacia una o más ubicaciones celulares, por ejemplo, el núcleo. Esto se puede lograr generando un compuesto oligopeptídico que comprende un dominio que ayuda al tránsito del compuesto a través de la membrana celular, es decir, generar un péptido de fusión o péptido quimérico (un péptido formado a partir de dos o más dominios que normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza), que comprende un péptido de penetración celular (un péptido de captación o importación, o un dominio de transducción de péptidos). El péptido de fusión (un compuesto oligopeptídico) puede comprender opcionalmente secuencias adicionales para facilitar el direccionamiento del péptido (es decir, para dirigir el péptido) a una ubicación subcelular particular, por ejemplo, un péptido diana, péptido señal o péptido de tránsito.
Como el compuesto oligopeptídico comprende un motivo de interacción con PCNA y un péptido de penetración celular (CPP), será evidente que el compuesto comprende al menos 5 restos y el tamaño final del compuesto dependerá del tamaño y número de dominios que forman dicho compuesto, es decir, el motivo de interacción con PCNA y el CPP pueden verse como dominios del compuesto oligopeptídico. Por lo tanto, un dominio puede verse como una porción distinta (es decir, una secuencia dentro de la secuencia peptídica de longitud completa) del compuesto oligopeptídico al que se le puede asignar o atribuir una función o propiedad particular.
El compuesto oligopeptídico para su uso en la invención comprende al menos 2 dominios, es decir, el dominio motivo de interacción con PCNA y el CPP. Sin embargo, el compuesto oligopeptídico puede comprender dominios adicionales que pueden facilitar su función y/o estabilidad, por ejemplo, la capacidad del péptido para interactuar con su diana, es decir, PCNA o una proteína equivalente. Por lo tanto, el compuesto oligopeptídico puede comprender al menos 2, 3, 4 o 5 dominios, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 o más dominios. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender uno o más dominios enlazadores, es decir, un dominio que se intercala entre otros dos dominios, es decir, ocupa el espacio entre ellos y conecta dos dominios del compuesto oligopeptídico. En realizaciones adicionales, el compuesto oligopeptídico puede comprender un dominio que dirige el compuesto oligopeptídico a una ubicación celular o subcelular, por ejemplo, un péptido señal (también conocido como péptido diana o de tránsito), tal como una secuencia señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés). En otras realizaciones adicionales, el uno o más dominios enlazadores pueden tener una función adicional, es decir, un dominio enlazador también puede funcionar como un péptido señal, por ejemplo, un NLS. De forma alternativa, un dominio de péptido señal puede funcionar como un dominio enlazador en algunas realizaciones.
En una realización ilustrativa, el compuesto oligopeptídico puede comprender un dominio de motivo de interacción con PCNA, un CPP y un dominio enlazador. En una realización ilustrativa adicional, el compuesto oligopeptídico también puede comprender un dominio de secuencia señal de localización nuclear. En otra realización más, el dominio de secuencia señal de localización nuclear puede funcionar como un dominio enlazador.
Por lo tanto, se verá que en tales realizaciones, el agente de la invención puede tomar la forma de una construcción que contiene (es decir, que comprende) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo de interacción con PCNA como se define en el presente documento, junto con un CPP y dominios adicionales opcionalmente. Por consiguiente, en este aspecto se puede ver que la invención proporciona una construcción que comprende un compuesto oligopeptídico que es capaz de interactuar con PCNA.
Como se indicó anteriormente, se ha determinado que el motivo PCNA descrito en el presente documento media la interacción de un compuesto oligopeptídico (por ejemplo, un péptido) o proteína que contiene dicho motivo con PCNA. Por lo tanto, el compuesto se puede caracterizar en la medida en que debe ser capaz de interactuar con PCNA, es decir, los compuestos oligopeptídicos para usar en los usos de la invención deben ser moléculas de interacción con PCNA capacitadas y/o competentes. La proteína PCNA usada para determinar la capacidad y/o afinidad de la interacción compuesto oligopeptídico:PCNA puede ser de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, un PCNA de cualquier animal, en particular, un mamífero tal como un ser humano, roedores (por ejemplo, ratón o rata), caninos o cualquier otro animal no humano. En realizaciones preferidas, la interacción compuesto oligopeptídico:PCNA se determina, caracteriza o evalúa usando proteína PCNA humana.
La interacción puede ser directa o indirecta y puede implicar la unión directa del motivo a la proteína PCNA, o el motivo puede unirse indirectamente, por ejemplo, la unión puede estar mediada por otra molécula. Esta referencia a "interacción con PCNA" o "unión a PCNA" puede incluir, por lo tanto, cualquier forma de interacción y unión tanto directa como indirecta.
Cualquier referencia en el presente documento a un "motivo" debe entenderse que significa X1X2X3X4X5 como se define en el presente documento.
X1 se selecciona de lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
X2 se selecciona de fenilalanina (F), triptófano (W) y tirosina (Y). En algunas realizaciones, X2 puede seleccionarse de W e Y, F e Y, o F y W o en realizaciones específicas X2 puede ser F o W o Y.
La unión del motivo a PCNA puede mejorarse en determinadas realizaciones cuando X2 es W o Y. Por lo tanto, en una realización, X2 no es F. Sin embargo, como se indica anteriormente, en otras realizaciones puede ser F.
X3 se selecciona de leucina (L), isoleucina (I), valina (V), alanina (A), metionina (M), serina (S), treonina (T), glutamina (Q), asparagina (N) y cisteína (C). Más particularmente, X3 puede seleccionarse de L, I, V, A, M, S o T. Preferentemente, X3 no es N o Q y/o en determinadas realizaciones X3 no es M, S y/o T.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, X3 puede seleccionarse de L, I, A, V, M, S y T, y, preferentemente, de L, I, A, V, S y T.
En algunas realizaciones, X3 puede ser un aminoácido hidrófobo y más preferentemente uno alifático seleccionado de la lista anterior. Por lo tanto, en algunas realizaciones, X3 puede seleccionarse de L, I, A, V, M, y, preferentemente, de L, I, V y A.
X4 se selecciona de L, I, V, A, M, S, T, Q, N, H, K, R, G o C. En determinadas realizaciones, X4 no es C y/o N o Q. En determinadas realizaciones, X4 no es H y, preferentemente, X4 no es R, K o H. En otras realizaciones adicionales, X4 no es S o T. Por lo tanto, en algunas realizaciones, X4 puede seleccionarse de L, V, I, A, M, S, T y G, y, preferentemente, de L, V, A, I, S y T.
En otras realizaciones, X4 puede ser un aminoácido hidrófobo, y más preferentemente un aminoácido alifático seleccionado de la lista anterior o G. Por lo tanto, en algunas realizaciones, X4 puede seleccionarse de L, I, A, V, M y G, y, preferentemente, de L, V, I y A.
X5 se selecciona de K, R, H y P.
Por lo tanto, en algunas realizaciones X5 es un aminoácido básico seleccionado de K, R y H.
Por lo tanto, en algunas realizaciones X3 y/o X4 es un aminoácido polar seleccionado de la lista anterior. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, solo uno de X3 y X4 es un aminoácido polar seleccionado de la lista anterior. En algunas realizaciones X4 y/o X5 es un aminoácido básico seleccionado de la lista anterior. Por consiguiente, en determinadas formas de realización X5 es un aminoácido básico seleccionado de la lista anterior.
Un aminoácido funcionalmente equivalente puede definirse como un aminoácido que puede usarse como sustituto en un péptido o proteína de un aminoácido convencional sin afectar significativamente la función del péptido o proteína (o un aminoácido que no se esperaría que afectase o alterase significativamente la función del péptido o proteína), por ejemplo, un aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares a las del aminoácido convencional. Por lo tanto, se puede considerar que un aminoácido funcionalmente equivalente tiene la estructura básica de un aminoácido estándar, con un grupo R no estándar o no convencional que es estructural y/o químicamente similar al grupo R estándar. Preferentemente, el grupo R es estructuralmente similar al grupo R estándar del aminoácido que se sustituye.
Un aminoácido convencional o estándar es un aminoácido que se usa in vivo para producir un polipéptido o molécula proteica, es decir, un aminoácido proteinogénico. En otras palabras, un aminoácido con un grupo R estándar o convencional o un aminoácido que posee una cadena lateral que está codificada por el código genético estándar, es decir, "aminoácidos codificados".
Por lo tanto, el compuesto oligopeptídico para usar en la invención comprende el motivo [R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q/C]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K/C]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 2), en donde dicho compuesto oligopeptídico es capaz de interactuar con PCNA.
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 3).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 4).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 5).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T/R/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 6).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 7).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 8).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 9).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[L/I/V/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 10).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[L/I/V/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 11).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/I/V/A/M/G]-[K/R] (SEQ ID NO: 12).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/A/V/M/T]-[L/I/V/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 13).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[L/V/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 14).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/F]-[L/V/I/A/T]-[L/V/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 15).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A]-[L/V/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 16).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[RHW/F/YHL/V/I/A/THL/WA/S/T/MHK] (SEQ ID NO: 17).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/KHF/YHL/V/I/AHL/V/A/I/MHK/R] (SEQ ID NO: 18).
En otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[F/W/Y]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO: 19).
En aún otra realización, el motivo puede definirse como:
[R/K]-[W/Y]-[L/V/I/A/S/T]-[L/V/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 20).
En aún otra realización, el motivo puede definirse como:
[K]-[F/Y/W]-[L/V/I/A/T]-[L/V/A/I/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, X1 y X2 son RW, RF, KF, KW, RY o KY.
En algunas realizaciones, X3 y X4 son LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK o IR. En algunas realizaciones, X3 y X4 son LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ o VM. En algunas realizaciones, X3 y X4 son LV, IV, SV, LS, AV, LG, LA, IR, LR, VR, AR, IK, LK, VK o AK. En realizaciones particularmente preferidas, X3 y X4 son LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS o LT, preferentemente LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA o AI. Por lo tanto, en algunas realizaciones, X3 y X4 no son AG, AC, CC, NN, QQ, NQ, QN, TS, SS, ST o TT.
En algunas realizaciones, X2 y X3 no son FS ni FT.
En algunas realizaciones X5 es K.
Por lo tanto, en una realización preferida, el compuesto oligopeptídico tiene o comprende la secuencia RWLVK (SEQ ID NO: 28). En otras realizaciones preferidas, el compuesto oligopeptídico tiene o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera o más de: RWLLK (SEQ ID NO: 22); RFLLK (SEQ ID NO: 23); RYLLK (SEQ ID NO: 24); RWLLR (SEQ ID NO: 25); RFLLR (SEQ ID NO: 26); RYLLR (SEQ ID NO: 27); RWLVK (SEQ ID NO: 28); RFLVK (SEQ ID NO: 29); RYLVK (SEQ ID NO: 30); RWLVR (SEQ ID NO: 31); RFLVR (SEQ ID NO: 32); RYLVR (SEQ ID NO: 33); RWIVK (SEQ ID NO: 34); RFIVK (SEQ ID NO: 35); RYIVK (SEQ ID NO: 36); RWIVR (SEQ ID NO: 37); RFIVR (SEQ ID NO: 38); RYIVR (SEQ ID NO: 39); RWLSK (SEQ ID NO: 40); RFLSK (SEQ ID NO: 41); RYLSK (SEQ ID NO: 42); RWLSR (SEQ ID NO: 43); RFLSR (SEQ ID NO: 44); RYLSR (SEQ ID NO: 45); RWISK (SEQ ID NO: 46); RFISK (SEQ ID NO: 47); RYISK (SEQ ID NO: 48); RWISR (SEQ ID NO: 49); RFISR (SEQ ID NO: 50); RYISR (SEQ ID NO: 51); RWSVK (SEQ ID NO: 52); RFSVK (SEQ ID NO: 53); RYSVK (SEQ ID NO: 54); RWSVR (SEQ ID NO: 55); RFSVR (SEQ ID NO: 56); RYSVR (SEQ ID NO: 57); RWAVK (SEQ ID NO: 58); RFAVK (SEQ ID NO: 59); RYAVK (SEQ ID NO: 60); RWAVR (SEQ ID NO: 61); RFAVR (SEQ ID NO: 62); RYAVR (SEQ ID NO: 63); RWLGR (SEQ ID NO: 64); RFLGR (SEQ ID NO: 65); RYLGR (SEQ ID NO: 66); RWLGK (SEQ ID NO: 67); RFLGK (SEQ ID NO: 68); RYLGK (SEQ ID NO: 69); RWLAR (SEQ ID NO: 70); RFLAR (SEQ ID NO: 71); RYLAR (SEQ ID NO: 72); RWLAK (SEQ ID NO: 73); RFLAK (SEQ ID NO: 74); RYLAK (SEQ ID NO: 75); RWLTK (SEQ ID NO: 76); RFLTK (SEQ ID NO: 77); RYLTK (SEQ ID NO: 78); RWLTR (SEQ ID NO: 79); RFLTR (SEQ ID NO: 80); RYLTR (SEQ ID NO: 81); RWITK (SEQ ID NO: 82); RFITK (SEQ ID NO: 83); RYITK (SEQ ID NO: 84); RWITR (SEQ ID NO: 85); RFITR (SEQ ID NO: 86); RYITR (SEQ ID NO: 87); RWTVK (SEQ ID NO: 88); RFTVK (SEQ ID NO: 89); RYTVK (SEQ ID NO: 90); RWTVR (SEQ ID NO: 91); RFTVR (SEQ ID NO: 92); RYTVR (SEQ ID NO: 93); RWIRK (SEQ ID NO: 94); RFIRK (SEQ ID NO: 95); RYIRK (SEQ ID NO: 96); RWIRR (SEQ ID NO: 97); RFIRR (SEQ ID NO: 98); RYIRR (SEQ ID NO: 99); RWLRK (SEQ ID NO: 100); RFLRK (SEQ ID NO: 101); RYLRK (SEQ ID NO: 102); RWLRR (SEQ ID NO: 103); RFLRR (SEQ ID NO: 104); RYLRR (SEQ ID NO: 105); KWLLK (SEQ ID NO: 106); KFLLK (SEQ ID NO: 107); KYLLK (SEQ ID NO: 108); KWLLR (SEQ ID NO: 109); KFLLR (SEQ ID NO: 110); KYLLR (SEQ ID NO: 111); KWLVK (SEQ ID NO: 112); KFLVK (SEQ ID NO: 113); KYLVK (SEQ ID NO: 114); KWLVR (SEQ ID NO: 115); KFLVR (SEQ ID NO: 116); KYLVR (SEQ ID NO: 117); KWIVK (SEQ ID NO: 118); KFIVK (SEQ ID NO: 119); KYIVK (SEQ ID NO: 120); KWIVR (SEQ ID NO: 121); KFIVR (SEQ ID NO: 122); KYIVR (SEQ ID NO: 123); KWLSK (SEQ ID NO: 124); KFLSK (SEQ ID NO: 125); KYLSK (SEQ ID NO: 126); KWLSR (SEQ ID NO: 127); KFLSR (SEQ ID NO: 128); KYLSR (SEQ ID NO: 129); KWISK (SEQ ID NO: 130); KFISK (SEQ ID NO: 131); KYISK (SEQ ID NO: 132); KWISR (SEQ ID NO: 133); KFISR (SEQ ID NO: 134); KYISR (SEQ ID NO: 135); KWSVK (SEQ ID NO: 136); KFSVK (SEQ ID NO: 137); KYSVK (SEQ ID NO: 138); KWSVR (SEQ ID NO: 139); KFSVR (SEQ ID NO: 140); KYSVR (SEQ ID NO: 141); KWAVK (SEQ ID NO: 142); KFAVK (SEQ ID NO: 143); KYAVK (SEQ ID NO: 144); KWAVR (SEQ ID NO: 145); KFAVR (SEQ ID NO: 146); KYAVR (SEQ ID NO: 147); KWLGR (SEQ ID NO: 148); KFLGR (SEQ ID NO: 149); KYLGR (SEQ ID NO: 150); KWLGK (SEQ ID NO: 151); KFLGK (SEQ ID NO: 152); KYLGK (SEQ ID NO: 153); KWLAR (SEQ ID NO: 154); KFLAR (SEQ ID NO: 155); KYLAR (SEQ ID NO: 156); KWLAK (SEQ ID NO: 157); KFLAK (SEQ ID NO: 158); KYLAK (SEQ ID NO: 159); KWLTK (SEQ ID NO: 160); KFLTK (SEQ ID NO: 161); KYLTK (SEQ ID NO: 162); KWLTR (SEQ ID NO: 163); KFLTR (SEQ ID NO: 164); KYLTR (SEQ ID NO: 165); KWITK (SEQ ID NO: 166); KFITK (SEQ ID NO: 167); KYITK (SEQ ID NO: 168); KWITR (SEQ ID NO: 169); KFITR (SEQ ID NO: 170); KYITR (SEQ ID NO: 171); KWTVK (SEQ ID NO: 172); KFTVK (SEQ ID NO: 173); KYTVK (SEQ ID NO: 174); KWTVR (SEQ ID NO: 175); KFTVR (SEQ ID NO: 176); KYTVR (SEQ ID NO: 177); KWLRK (SEQ ID NO: 178); KFLRK (SEQ ID NO: 179); KYLRK (SEQ ID NO: 180); KWLRR (SEQ ID NO: 181); KFLRR (SEQ ID NO: 182); KYLRR (SEQ ID NO: 183); KWIRK (SEQ ID NO: 184); KFIRK (SEQ ID NO: 185); KYIRK (SEQ ID NO: 186); KWIRR (SEQ ID NO: 187); KFIRR (SEQ ID NO: 188); KYIRR (SEQ ID NO: 189); RWVVK (SEQ ID NO: 190); RFVVK (SEQ ID NO: 191); RYVVK (SEQ ID NO: 192); RWVVR (SEQ ID NO: 193); RFVVR (SEQ ID NO: 194); RYVVR (SEQ ID NO: 195); KWVVK (SEQ ID NO: 196); KFVVK (SEQ ID NO: 197); KYVVK (SEQ ID NO: 198); KWVVR (SEQ ID NO: 199); KFVVR (SEQ ID NO: 200); KYVVR (SEQ ID NO: 201); RWALK (SEQ ID NO: 202); RFALK (SEQ ID NO: 203); RYALK (SEQ ID NO: 204); RWALR (SEQ ID NO: 205); RFALR (SEQ ID NO: 206); RYALR (SEQ ID NO: 207); KWALK (SEQ ID NO: 208); KFALK (SEQ ID NO: 209); KYALK (SEQ ID NO: 210); KWALR (SEQ ID NO: 211); KFALR (SEQ ID NO: 212); KYALR (SEQ ID NO: 213); RWVLK (SEQ ID NO: 214); RFVLK (SEQ ID NO: 215); RYVLK (SEQ ID NO: 216); RWVLR (SEQ ID NO: 217); RFVLR (SEQ ID NO: 218); RYVLR (SEQ ID NO: 219); KWVLK (SEQ ID NO: 220); KFVLK (SEQ ID NO: 221); KYVLK (SEQ ID NO: 222); KWVLR (SEQ ID NO: 223); KFVLR (SEQ ID NO: 224); KYVLR (SEQ ID NO: 225); RWILK (SEQ ID NO: 226); RFILK (SEQ ID NO: 227); RYILK (SEQ ID NO: 228); RWILR (SEQ ID NO: 229); RFILR (SEQ ID NO: 230); RYILR (SEQ ID NO: 231); KWILK (SEQ ID NO: 232); KFILK (SEQ ID NO: 233); KYILK (SEQ ID NO: 234); KWILR (SEQ ID NO: 235); KFILR (SEQ ID NO: 236); KYILR (SEQ ID NO: 237); RWVIK (SEQ ID NO: 238); RFVIK (SEQ ID NO: 239); RYVIK (SEQ ID NO: 240); RWVIR (SEQ ID NO: 241); RFVIR (SEQ ID NO: 242); RYVIR (SEQ ID NO: 243); KWVIK (SEQ ID NO: 244); KFVIK (SEQ ID NO: 245); KYVIK (SEQ ID NO: 246); KWVIR (SEQ ID NO: 247); KFVIR (SEQ ID NO: 248); KYVIR (SEQ ID NO: 249); RWIIK (SEQ ID NO: 250); RFIIK (SEQ ID NO: 251); RYIIK (SEQ ID NO: 252); RWIIR (SEQ ID NO: 253); RFIIR (SEQ ID NO: 254); RYIIR (SEQ ID NO: 255); KWIIK (SEQ ID NO: 256); KFIIK (SEQ ID NO: 257); KYIIK (SEQ ID NO: 258); KWIIR (SEQ ID NO: 259); KFIIR (SEQ ID NO: 260); KYIIR (SEQ ID NO: 261); RWLIK (SEQ ID NO: 262); RFLIK (SEQ ID NO: 263); RYLIK (SEQ ID NO: 264); RWLIR (SEQ ID NO: 265); RFLIR (SEQ ID NO: 266); RYLIR (SEQ ID NO: 267); KWLIK (SEQ ID NO: 268); KFLIK (SEQ ID NO: 269); KYLIK (SEQ ID NO: 270); KWLIR (SEQ ID NO: 271); KFLIR (SEQ ID NO: 272); KYLIR (SEQ ID NO: 273); RWIAK (SEQ ID NO: 274); RFIAK (SEQ ID NO: 275); RYIAK (SEQ ID NO: 276); RWIAR (SEQ ID NO: 277); RFIAR (SEQ ID NO: 278); RYIAR (SEQ ID NO: 279); KWIAK (SEQ ID NO: 280); KFIAK (SEQ ID NO: 281); KYIAK (SEQ ID NO: 282); KWIAR (SEQ ID NO: 283); KFIAR (SEQ ID NO: 284); KYIAR (SEQ ID NO: 285); RWVAK (SEQ ID NO: 286); RFVAK (SEQ ID NO: 287); RYVAK (SEQ ID NO: 288); RWVAR (SEQ ID NO: 289); RFVAR (SEQ ID NO: 290); RYVAR (SEQ ID NO: 291); KWVAK (SEQ ID NO: 292); KFVAK (SEQ ID NO: 293); KYVAK (SEQ ID NO: 294); KWVAR (SEQ ID NO: 295); KFVAR (SEQ ID NO: 296); KYVAR (SEQ ID NO: 297); y RWLVP (SEQ ID NO: 1209).
Estas secuencias específicas se enumeran a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. En algunas realizaciones preferidas, el compuesto oligopeptídico tiene o comprende la secuencia RWLVK (SEQ ID NO: 28) o KFIVK (SEQ ID NO: 119) o RWLVP (SEQ ID NO: 1209).
Si bien los motivos que interactúan con PCNA enumerados anteriormente son motivos preferidos de la invención, en algunas realizaciones se puede excluir uno cualquiera o más de estos motivos, por ejemplo, se pueden excluir 1 cualquiera, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o más motivos, tal como 25, 30, 40, 50 o más motivos o cualquier número entero en este intervalo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico no tiene o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 22-297 y 1209.
Los motivos particulares que interactúan con PCNA que pueden excluirse o rechazarse incluyen uno cualquiera o más de los siguientes: KYMVR (SEQ ID NO: 298), KFLAK (SEQ ID NO: 158), KWLIK (SEQ ID NO: 268), KFLIK (SEQ ID NO: 269), KWLIOrn (SEQ ID NO: 299), KWLIDbu (SEQ ID NO: 300) y KWQLR (SEQ ID NO: 301).
El compuesto oligopeptídico es, preferentemente, un compuesto aislado, por ejemplo, un péptido aislado y más preferentemente el compuesto oligopeptídico es un compuesto sintético, por ejemplo, un péptido sintético. La molécula de ácido nucleico que codifica el compuesto oligopeptídico es, preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada y, lo más preferentemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico sintética. En otras palabras, el compuesto oligopeptídico y su molécula de ácido nucleico codificante son no naturales, es decir, moléculas de origen no natural.
La tecnología de péptidos de penetración celular (CPP, por sus siglas en inglés) se ha desarrollado enormemente en los últimos años y se conoce y se describe en la materia una amplia variedad de péptidos de penetración celular y, de hecho, se encuentra disponible comercialmente una gama de dichos péptidos. Los péptidos de penetración celular pueden variar mucho en tamaño, secuencia y carga y, de hecho, en su mecanismo de función (que actualmente no se conoce para algunos péptidos y no se aclara completamente para otros), pero comparten la capacidad común de translocarse a través de la membrana plasmática y administrar una fracción unida o asociada (la llamada "carga") en el citoplasma de una célula. Por lo tanto, los CPP son vectores de administración basados en péptidos.
Aunque los CPP no se caracterizan por un único motivo estructural o funcional, existen herramientas para identificar los CPP y el experto en la materia puede determinar fácilmente si una secuencia peptídica puede funcionar para facilitar la captación del péptido del que forma un dominio, es decir, si un dominio puede funcionar como un péptido de captación (importación), por ejemplo, un CPP. Por ejemplo, Hansen et al (Predicting cell-penetrating peptides, Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, págs. 572-579), proporciona una revisión de los métodos para la predicción de CPP basados en el uso de análisis de componentes principales ("predictores z") y los algoritmos correspondientes basados en el trabajo original de Hallbrink et al (Prediction of Cell-Penetrating Peptides, International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2005, 11(4), págs. 249-259). En resumen, la metodología funciona mediante le cálculo de las puntuaciones z de un péptido candidato basándose en un valor numérico y un intervalo asociado. Si las puntuaciones z caen dentro del intervalo de puntuaciones z de CPP conocidas, los péptidos examinados se clasifican como CPP. Se demostró que el método tiene una alta precisión (aproximadamente un 95 % de predicción de los CPP conocidos).
Posteriormente se han desarrollado métodos adicionales para la predicción de CPP (véase, por ejemplo, Sanders et al., Prediction of Cell Penetrating Peptides by Support Vector Machines, PLOS Computational Biology, 2011,7(7), págs.
1-12) y está disponible una base de datos de CPP (Gautam et al., CPPSite: a curated database of cell penetrating peptides, Database, 2012, ID de artículo bas015 y http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.php). Por consiguiente, cualquier CPP adecuado puede encontrar utilidad en la invención y, como se analiza más adelante, ya se han identificado y probado una variedad de CPP y podrían formar la base para determinar e identificar nuevos CPP. Los CPP pueden proceder de proteínas de origen natural que son capaces de translocarse a través de las membranas celulares, tal como la proteína con la caja homeótica Antennapedia de Drosophila (un factor de transcripción), proteínas virales tales como el factor de transcripción TAT del VIH-1 y la proteína de la cápside VP22 de1HSV-1, y/o pueden proceder sintéticamente, por ejemplo, de proteínas quiméricas o polipéptidos sintéticos tales como la poliarginina. Como se indica anteriormente, no existe un único mecanismo responsable del efecto de transducción y, por tanto, el diseño de los CPP puede basarse en diferentes estructuras y secuencias. Los péptidos de penetración celular también se revisan en Jarver et al. 2006 (Biochimica et Biophysica Acta 1758, páginas 260-263) y la Tabla 1 a continuación enumera varios péptidos representativos. El documento US 6.645.501 describe además carios péptidos de penetración celular que podrían usarse.
TABLA 1
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(continuación)
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Los CPP procedentes de Antennapedia (clase Antp) representan una clase de particular interés, basada en la secuencia de Penetratina de 16 aminoácidos como se muestra en la Tabla 1, que corresponde al tercer bucle de la proteína antennapedia y se demostró que es responsable de la translocación de la proteína. La penetratina se ha desarrollado extensamente como vehículo de administración, particularmente, incluso para uso farmacéutico, y se ha propuesto y descrito una amplia gama de derivados y secuencias modificadas de Penetratina. Se puede hacer referencia en particular a los documentos WO 91/1891, WO 00/1417, WO 00/29427, WO 2004/069279 y US 6.080.724. Por lo tanto, la secuencia de 16 aminoácidos de Penetratina se puede modificar y/o truncar, o el péptido se puede modificar químicamente o pueden prepararse análogos retro, inverso o retroinverso mientras se conserva la actividad de penetración celular.
Otro grupo de péptidos de penetración celular que pueden usarse de manera ventajosa se basan en la secuencia de HIV-TAT y HIV-TAT y fragmentos de las misma representan una clase preferida de CPP para usar de acuerdo con la presente invención. En el documento US 5.656.122 se describen varios CPP basados en TAT. Un ejemplo de péptido HIV-TAT como se usa en los Ejemplos siguientes es RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 335) pero se apreciará fácilmente que se pueden usar fragmentos TAT más largos o más cortos.
Como se mencionó anteriormente, ninguna característica estructural particular o motivos de secuencia son comunes a todos los CPP. Sin embargo, se pueden identificar varias clases de CPP mediante características particulares, tales como, por ejemplo, péptidos que son anfipáticos y con carga neta positiva. Otros grupos de CPP pueden tener una estructura que exhiba un alto contenido de hélice a. Otro grupo pueden ser los péptidos caracterizados por un alto contenido de aminoácidos básicos. Por lo tanto, los CPP pueden ser o pueden comprender oligómeros de aminoácidos básicos tales como arginina, por ejemplo, de 5 a 20, de 6 a 15 o de 6 a 12 restos R, por ejemplo, R7 (SEQ ID NO: 334), R8 (SEQ ID NO: 336) o R11 (SEQ ID NO: 337) o QSR8 (SEQ ID NO: 338).
Los péptidos anfipáticos ricos en prolina son otra clase de CPP y dichos péptidos caracterizados por la presencia de anillos de pirrolidina de prolina se describen en Pujals et al. 2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, páginas 473­ 484.
Otros CPP desarrollados con éxito incluyen pVEC (Elmquist et al. 2003 Biol. Chem 384, páginas 387-393; Holm et al.
2005 Febs Lett. 579, páginas 5217-5222) y péptidos procedentes de calcitonina (Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, páginas 51-54).
Los CPP disponibles comercialmente incluyen Chariot, basado en el péptido Pep-1 (Active Motif, Francia), los vectores Syn-B basados en el péptido de protegrina PG-1 (Syntem, Francia) y Express-si Delivery basado en el péptido MPG de Genospectra, EE. UU.
Otros CPP incluyen los péptidos R41, R8, M918 e YTA-4 (SEQ ID NO: 1210-1213, respectivamente) desvelados en Eriksson et al. 2013, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 57(8), págs. 3704-3712.
En algunas realizaciones, los CPP pueden ser péptidos cíclicos, tales como los desvelados en Oh et al., 2014, Mol. Pharmaceutics, vol. 11, págs. 3528-3536. En particular, los CPP pueden ser CPP cíclicos anfifílicos, que contienen particularmente restos de triptófano y arginina. En algunas realizaciones, los CPP pueden ser péptidos de poliarginina cíclicos y pueden modificarse mediante la adición de una fracción de acilo graso, por ejemplo, octanoilo, dodecanoilo, hexadecanoilo, N-acetil-L-triptofanil-12-aminododecanoilo, etc. Los CPP cíclicos adecuados para usar en la invención se presentan en las SEQ ID NO: 1214-1220.
Además de los CPP comunicados y disponibles públicamente, se pueden diseñar y sintetizar péptidos CPP nuevos o derivados en base a criterios conocidos o indicados (por ejemplo, secuencias de CPP conocidas o características tales como contenido de aminoácidos básicos, contenido de hélices a, etc., como se analizó anteriormente). Además, los péptidos diseñados aleatoriamente u otros péptidos pueden seleccionarse para la actividad de CPP, por ejemplo, acoplando o uniendo dicho péptido que contiene una molécula indicadora, por ejemplo, una etiqueta o marcador detectable, tal como un marcador fluorescente para la carga deseada (por ejemplo, un compuesto oligopeptídico como se describe en el presente documento) y probarse para ver si la construcción se transloca a través de la membrana celular, por ejemplo, añadiendo estos péptidos a células vivas seguido de un examen de importación celular, por ejemplo, utilizando microscopía confocal.
De hecho, aunque generalmente se da el caso de que un CPP penetrará o entrará prácticamente en cualquier tipo de célula, en algunos casos se puede observar que la administración exitosa o eficaz puede depender, o puede variar, de la naturaleza precisa de la carga (por ejemplo, la secuencia peptídica de carga) y/o el CPP utilizado. Estaría dentro de la habilidad rutinaria del experto en la materia determinar las secuencias y combinaciones óptimas de péptidos, etc., y probar y/o modificar la secuencia o estructura de la carga y/o el CPP, etc.
Por lo tanto, a modo de resumen, la persona experta conocerá las secuencias de péptidos adecuadas que pueden facilitar la captación del compuesto oligopeptídico, pero, a modo de ejemplo, las secuencias pueden incluir Penetratin™, un péptido de 16 aminoácidos correspondiente a la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia, marcadores ricos en R tales como R6-Penetratina (en el que se añadieron restos de arginina al extremo N de la Penetratina) y derivados de la proteína Tat del VIH tales como GRKKRRQRRRPPQQ (SEQ ID NO: 339). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el dominio que facilita la captación celular del compuesto oligopeptídico es un CPP y puede seleccionarse de cualquiera de:
(i) un péptido de la clase antennapedia;
(ii) un péptido de la clase protegrina;
(iii) un péptido de la clase HIV-TAT;
(iv) un péptido de clase anfipática seleccionado de un péptido anfipático y con carga neta positiva, un péptido anfipático rico en prolina, un péptido basado en el péptido Pep-1 y un péptido basado en el péptido MPG;
(v) un péptido que exhibe un alto contenido de hélice a;
(vi) un péptido que comprende oligómeros de aminoácidos básicos;
(vii) pVEC;
(viii) un péptido procedente de calcitonina; y (ix) un CPP cíclico anfifílico.
En algunas realizaciones, el dominio que facilita la captación celular del compuesto oligopeptídico es un CPP y puede seleccionarse de una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 302-1162 o un fragmento y/o derivado de la misma. Los detalles y propiedades de los CPP identificados en las SEQ ID NO: 340-1162 se pueden encontrar en http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/index.php, CPPSite: una base de datos de péptidos de penetración celular. En algunas realizaciones, el dominio que facilita la captación celular del compuesto oligopeptídico es la SEQ ID NO: 337.
En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico también comprende uno o más dominios que proporcionan una secuencia señal (diana o de tránsito). En algunas realizaciones, la secuencia señal puede dirigir el compuesto oligopeptídico a un tipo celular específico. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender un péptido señal que localiza el compuesto en un compartimento intracelular específico, por ejemplo, el núcleo. En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico se dirige al citosol, que se puede lograr sin un péptido señal adicional, es decir, el péptido de absorción (importación), por ejemplo, CPP, puede ser suficiente para dirigir o localizar el compuesto oligopeptídico en el citosol de una célula.
Por lo tanto, la secuencia señal o el dominio de la secuencia señal puede verse como cualquier secuencia que actúe para localizar, o alternativamente poner, para dirigir, translocar o transportar, el compuesto oligopeptídico a cualquier ubicación deseada, por ejemplo, a cualquier tipo de célula o ubicación subcelular deseada, por ejemplo, el núcleo. Tal como se ha mencionado anteriormente, el compuesto oligopeptídico (o construcciones) para su uso en la invención puede comprender una o más secuencias señal (es decir, uno o más dominios que funcionan como secuencias señal), por ejemplo, un péptido señal que dirige el compuesto (o construcción) a un compartimento subcelular particular, tal como el núcleo. Las señales de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) son de nuevo bien conocidas en la materia y se describen ampliamente en la bibliografía. Por ejemplo, está disponible una base de datos de búsqueda de NLS conocidas y previstas, véase, por ejemplo, Cokol et al (Finding nuclear localization signals, EMBO Reports, 2000, 1(5), págs. 411-415). La base de datos PSORT II, http://psort.hgc.jp/ se puede utilizar para la predicción de la localización nuclear de proteínas basada en NLS. Por consiguiente, cualquier NLS funcional o conocida puede encontrar utilidad en la invención.
Una NLS puede variar en longitud y/o secuencia y se ha descrito una amplia gama de secuencias específicas de NLS. En general, sin embargo, se ha encontrado que los péptidos que comprenden aminoácidos cargados positivamente (en particular lisina (K), arginina (R) y/o histidina (H)) pueden funcionar como una NLS. Por lo tanto, una NLS ilustrativa puede ser un péptido de, por ejemplo, 4-20, más particularmente, 4-15, 4-12, 4-10 o 4-8 aminoácidos, en donde al menos 4 aminoácidos (y, más particularmente, al menos un 60, 70, 75, 80, 85 o 90 % de los restos de aminoácidos en el péptido NLS) son aminoácidos cargados positivamente, preferentemente seleccionados entre K, R o H. Dicha NLS ilustrativa puede, por ejemplo, tener o comprender la secuencia RKRH (SEQ ID NO: 1163).
Las señales de localización nuclear, que incluyen tanto las secuencias de NLS reales determinadas experimentalmente como las previstas o propuestas, y las estrategias para identificar las NLS también se describen en Lange et al., J. Biol. Chem. 2007, 282(8), 5101-5105; Makkerh et al., Current Biology 1996, 6(8), 1025-1027; Leslie et al., Methods 2006, 39, 291-308; y Lusk et al. Nature Reviews MCB 2007, 8, 414-420.
Una NLS clásica consiste en uno (monopartito) o dos (bipartito) tramos de aminoácidos básicos. Una NLS monopartita puede ser ejemplificada por la n Ls del antígeno T grande de SV40 (121PKKKRKV132 [SEQ ID NO: 1164]) y una NLS bipartita por la NLS nucleoplasmina (155KRPAATKKAGQAKKKK170 [SEQ ID NO: 1165]). Se ha propuesto la secuencia consenso de NLS monopartita K-[K/R]-X-[K/R] (SEQ ID NO: 1166) y, en consecuencia, en una realización, una NLS de acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir en dicha secuencia consenso (donde X es cualquier aminoácido).
Una NLS bipartita representativa de acuerdo con la invención puede tener la secuencia KR-[X]5-20-KKKK (SEQ ID NO: 1167), por ejemplo, KR-X10-KKKK (SEQ ID NO: 1168) (donde X es cualquier aminoácido).
Un ejemplo alternativo de NLS bipartita puede tomar la forma RKRH-[X]2-10-KK (SEQ ID NO: 1169) por ejemplo, RKRH-X2-KK (SEQ ID NO: 1170), por ejemplo, RKRH-II-KK (SEQ ID NO: 1171).
La NLS de la oncoproteína c-myc difiere de las NLS clásicas en que solo 3 de los 9 restos de aminoácidos son básicos (PAAKRVKLD [SEQ ID NO: 1172]), lo que indica que una NLS no necesita necesariamente ajustarse a las secuencias consenso o clásicas dadas anteriormente. Makkerh et al. (mencionado anteriormente) describen secuencias NLS en las que un grupo de aminoácidos básicos (por ejemplo, KKKK [SEQ ID NO: 1173]) está flanqueado por restos neutros y ácidos, por ejemplo PAAKKKKLD (SEQ ID NO: 1174).
Otras posibles secuencias de NLS que se pueden dar a modo de ejemplo incluyen: PKKKRKVL (SEQ ID NO: 1175), KKKRK (SEQ ID NO: 1176), KKKRVK (SEQ ID NO: 1177), KKKRKVL (SEQ ID NO: 1178) y RKKRKVL (SEQ ID NO: 1179). Se puede utilizar cualquier NLS que sea un derivado de un NLS conocido, por ejemplo, NLS de SV40, nucleoplasmina, UNG2 o c-myc.
Se puede probar una secuencia NLS supuesta, propuesta o prevista para determinar la actividad de NLS usando principios y ensayos conocidos y descritos en la materia. Por ejemplo, una secuencia NLS candidata puede unirse a la carga deseada (en este caso, un compuesto oligopeptídico como se define en el presente documento) y la construcción puede proporcionarse con una molécula informadora detectable (por ejemplo, una etiqueta o marcador que puede visualizarse, por ejemplo, un marcador fluorescente) y ponerse en contacto con una célula de prueba. Entonces puede determinarse la distribución de la construcción en la célula.
Por lo tanto, a modo de resumen, el experto en la materia conocerá las secuencias señal adecuadas, pero a modo de ejemplo se mencionan en el presente documento los siguientes Ejemplos de secuencias de localización nuclear que incluyen el derivado de la proteína SV40 KKKRK (SEQ ID NO: 1176).
Por lo tanto, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia señal (es decir, un dominio que comprende un péptido señal) que localiza o dirige el compuesto oligopeptídico a una ubicación subcelular, tal como una NLS y puede seleccionarse entre una cualquiera de:
(i) un péptido de 4-20 aminoácidos, en donde al menos 4 aminoácidos son aminoácidos cargados positivamente, preferentemente seleccionados entre K, R o H; y/o
(ii) una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1163-1179 o un fragmento y/o derivado de la misma.
En algunas realizaciones, la secuencia señal de localización nuclear comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1163-1179 o un fragmento y/o derivado de la misma, preferentemente donde dicho fragmento y/o derivado comprende al menos 4 aminoácidos cargados positivamente, preferentemente seleccionados de cualquiera de K, R o H.
En algunas realizaciones, un compuesto oligopeptídico o una construcción de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos tres dominios, que incluyen (i) un dominio de motivo APIM como se define en el presente documento, (ii) un dominio enlazador, que puede comprender en algunas realizaciones una secuencia de señal de localización nuclear, y (iii) un dominio de secuencia de señal de penetración celular.
Los elementos o componentes (dominios) separados de una construcción según la presente invención pueden estar contenidos o presentados en cualquier orden, pero preferentemente en los órdenes indicados anteriormente (por ejemplo, compuesto oligopeptídico APIM-CPP o compuesto oligopeptídico APIM-enlazador-CPP).
En algunas realizaciones, el motivo APIM se ubica en o hacia el extremo N del péptido. Por ejemplo, el motivo APIM puede describirse como N-terminal para el CPP y opcionalmente N-terminal para la secuencia del enlazador, si está presente.
En una realización preferida, el compuesto oligopeptídico comprende un motivo de interacción con PCNA como se establece en la SEQ ID NO: 28, una secuencia de señal de localización nuclear como se indica en la SEQ ID NO: 1176 y una secuencia de señal de penetración celular como se indica en la SEQ ID NO: 337.
Además, en algunas realizaciones, un compuesto oligopeptídico o una construcción de acuerdo con la invención puede contener más de un motivo de interacción con PCNA. Por lo tanto, de forma alternativa, un agente para usar en la presente invención puede contener o codificar un compuesto oligopeptídico que comprende más de un motivo de interacción con PCNA. Una construcción o compuesto oligopeptídico puede contener, por ejemplo, 1-10, por ejemplo, 1- 6 o 1-4 o 1-3 o uno o dos motivos. Dentro de una construcción que también contiene una secuencia señal, dichos motivos pueden estar espaciados o ubicados según se elija, por ejemplo, pueden estar agrupados o separados mediante elementos de secuencia señal, por ejemplo, motivo-motivo-CPP, motivo-enlazador-motivo-CPP; o motivoenlazador-motivo-motivo-CPP; o motivo-motivo-enlazador-CPP, etc.
Como se hace referencia en el presente documento, un "fragmento" puede comprender al menos un 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de los aminoácidos de la secuencia de la que procede. Dicho fragmento puede obtenerse de una parte central o N-terminal o C-terminal de la secuencia. Si bien el tamaño del fragmento dependerá del tamaño de la secuencia original, en algunas realizaciones los fragmentos pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más restos de aminoácidos más cortos que la secuencia de la que proceden, por ejemplo, 1-10, 2- 9, 3-8, 4-7 restos de aminoácidos más cortos que la secuencia de la que proceden.
Como se hace referencia en el presente documento, un "derivado" de una secuencia es al menos un 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a la secuencia con la que se compara.
La identidad de secuencia puede determinarse, por ejemplo, utilizando el banco de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT que utiliza FASTA pep-cmp con un pamfactor variable, y la penalización por creación de huecos establecida en 12,0 y la penalización por extensión de huecos establecida en 4,0, y una ventana de 2 aminoácidos. Preferentemente, dicha comparación se realiza en toda la longitud de la secuencia, pero puede realizarse en una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 200, 100, 50, 20 o 10 aminoácidos contiguos.
Preferentemente, dichos polipéptidos relacionados con la identidad de secuencia, es decir, derivados, son funcionalmente equivalentes a los péptidos que se exponen en las SEQ ID NO enumeradas. De forma similar, los péptidos con secuencias como se establece en las SEQ ID NO. pueden modificarse sin afectar la secuencia del polipéptido como se describe a continuación.
Además, los "fragmentos", como se describen en el presente documento, pueden ser equivalentes funcionales. Preferentemente, estos fragmentos satisfacen las condiciones de identidad (en relación con una región comparable) mencionadas en el presente documento.
Como se indica en el presente documento, para lograr la "equivalencia funcional", el péptido puede mostrar cierta eficacia reducida en la realización de la función en relación con la molécula original (es decir, la molécula de la que procede, por ejemplo, mediante sustitución de aminoácidos), pero preferentemente es tan eficaz o es más eficaz. Por lo tanto, la equivalencia funcional puede relacionarse con un péptido que sea eficaz para localizar o dirigir el compuesto oligopeptídico al tipo de célula o ubicación celular, por ejemplo, para facilitar la captación del péptido como se describió anteriormente. Esto puede probarse mediante la comparación de los efectos del péptido derivado con respecto al péptido del que procede de una manera cualitativa o cuantitativa, por ejemplo, mediante la realización de los análisis in vitro descritos anteriormente. Cuando los resultados cuantitativos son posibles, el derivado es al menos un 30, 50, 70 o 90 % tan eficaz como el péptido original.
Los péptidos funcionalmente equivalentes que se relacionan con el péptido original, o proceden de él, pueden obtenerse modificando la secuencia de aminoácidos original mediante sustitución, adición y/o eliminación de uno o varios aminoácidos (siempre que satisfagan los requisitos de identidad de secuencia mencionados anteriormente), pero sin destruir la función de la molécula. Preferentemente, la secuencia original tiene menos de 20 sustituciones, adiciones o eliminaciones, por ejemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2, o 1 de dichas modificaciones. Dichos péptidos pueden estar codificados por "moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes" que pueden generarse mediante una sustitución, adición y/o eliminación apropiada de una o más bases.
Los dominios (que pueden verse como componentes, elementos o partes separadas) de un compuesto oligopeptídico o construcción, como se describe en el presente documento, pueden unirse o enlazarse entre sí de cualquier manera deseada o conveniente de acuerdo con técnicas bien conocidas en la materia. Por lo tanto, los dominios se pueden enlazar o conjugar químicamente, por ejemplo, usando tecnologías de acoplamiento químico conocidas o el compuesto o las construcciones pueden formarse como un todo único usando técnicas de ingeniería genética, por ejemplo, técnicas para formar proteínas de fusión, o simplemente pueden sintetizarse como un todo, por ejemplo, utilizando técnicas de síntesis de péptidos.
Los dominios pueden enlazarse directamente entre sí o pueden enlazarse indirectamente por medio de una o más secuencias enlazadoras (o espaciadoras). Por lo tanto, una secuencia enlazadora puede espaciar o separar dos o más dominios individuales (es decir, partes, por ejemplo, elementos de motivo separados) en una construcción o compuesto oligopeptídico. La naturaleza precisa de la secuencia enlazadora no es crítica y puede ser de longitud y/o secuencia variable, por ejemplo, puede tener 0-40, más particularmente 0-20, 0-15, 0-12, 0-10, 0-8, o 0-6, 0-4 o 0-3 restos, por ejemplo, 1, 2 o 3 o más restos. A modo de ejemplo representativo, la secuencia enlazadora, en caso de estar presente, puede tener 1-15, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6 o 1-4 restos, etc. La naturaleza de los restos no es crítica y pueden ser, por ejemplo, cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido neutro o un aminoácido alifático, o alternativamente pueden ser hidrófobos, o polares o cargados o formadores de estructura, por ejemplo, prolina. Se ha demostrado la utilidad de una variedad de secuencias enlazadoras diferentes, que incluyen secuencias cortas (por ejemplo, 1-6) de aminoácidos neutros y/o alifáticos.
Las secuencias enlazadoras ilustrativas incluyen, por tanto, cualquier resto de aminoácido, por ejemplo, A, I, L, V, G, R, Q, T o W, o un di-, tritetrapenta- o hexapéptido compuesto por tales restos.
Como enlazadores representativos pueden mencionarse I, II, IL, R, W, WW, WWW, RIL, RIW, GAQ, GAW, VAT, IILVI (SEQ ID NO: 1180), IILVIII (SEQ ID NO: 1181), etc.
Los enlazadores entre diferentes dominios (componentes, elementos o partes) pueden ser iguales o diferentes. Tal como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones el enlazador puede comprender o consistir en una NLS. Como alternativa a lo observado, en algunas realizaciones, una NLS, cuando está presente, puede funcionar como péptido señal y como enlazador. Por lo tanto, el compuesto oligopeptídico puede comprender un péptido señal (por ejemplo, una NLS) y un enlazador.
Los compuestos representativos (o más particularmente las construcciones) para usar en los métodos y usos de la invención incluyen:
MDRWLVKRILVATK (SEQ ID NO: 1182),
MDRWLVKRILKKKRKVATKG (SEQ ID NO: 1183),
MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1184), MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1185),
MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG (SEQ ID NO: 1186),
MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1187),
MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1188),
MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1189),
MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1190), MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1191), MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1192), MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1193),
MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1194),
MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1195),
MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1196),
Ac-MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1197),
Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1198),
Ac-MDRFLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1199),
Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK (SEQ ID NO: 1200),
Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1201), MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK (SEQ ID NO: 1202), MDRWSVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1203)
MDRWAVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1204) o
MDRWLVPWKKKRKIRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1208).
En una realización particularmente preferente, el compuesto oligopeptídico comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1198, 1203, 1204 o 1208.
Los compuestos oligopeptídicos mostrados anteriormente comprenden aminoácidos N-terminales que no forman parte de los dominios que son esenciales para que los compuestos tengan actividad en los usos de la invención, es decir, una secuencia "MD". Algunos de los péptidos también comprenden una modificación N-terminal, por ejemplo, grupos acetilo. Estos aminoácidos y modificaciones adicionales pueden facilitar la producción de los compuestos oligopeptídicos, por ejemplo, in vitro o in vivo, y/o ayudar a proteger los compuestos de la degradación in vivo. Será evidente que los compuestos oligopeptídicos no requieren estos aminoácidos o modificaciones adicionales para su actividad. Por consiguiente, otras secuencias representativas de acuerdo con la invención incluyen cualquiera de las SEQ ID NO: 1182 a 1204 o 1208, omitiendo los grupos N-terminales "MD" y/o "Ac". En otras realizaciones, un resto K o G C-terminal puede omitirse adicional o alternativamente. Además, no se esperaría que la presencia de aminoácidos o modificaciones adicionales en cualquiera de los extremos altere o inhiba la función de los compuestos oligopeptídicos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender una secuencia N-terminal, por ejemplo, una secuencia en el extremo N que no comprende un dominio definido anteriormente, por ejemplo, la llamada secuencia flanqueante N-terminal. En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender una secuencia C-terminal, por ejemplo, una secuencia en el extremo C que no comprende un dominio definido anteriormente, por ejemplo, la llamada secuencia flanqueante C-terminal. En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender una secuencia flanqueante N-terminal y C-terminal.
Una secuencia flanqueante puede comprender de aproximadamente 1-150 aminoácidos, tal como 1-120, 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-35, 1-30, etc. Por lo tanto, una secuencia flanqueante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos, por ejemplo, 1-40, 2-39, 3-38, 4­ 37, 5-36, 6-35, 7-34, 8-33, 9-32, 10-31, 11-30, 12-29, 13-28, 14-27, 15-26 aminoácidos o cualquier combinación de los mismos.
Los compuestos oligopeptídicos que tienen secuencias como se establece en las SEQ ID NO. 1182-1204 y 1208 comprenden dominios (es decir, componentes) separados que forman las construcciones (es decir, secuencia que contiene motivo, enlazador/NLS, CPP, etc.) Por lo tanto, se verá que las SEQ ID NO. 1182-1204 y 1208 representan construcciones que comprenden al menos una secuencia que contiene un motivo, un enlazador/NLS y un CPP, en algunos casos enlazados mediante secuencias enlazadoras que pueden variar en secuencia, como se ha especificado. Se utilizan secuencias NLS basadas en las secuencias NLS de SV40 o UNG2, y secuencias CPP basadas en Penetratina, HIV-TAT o un péptido rico en R.
El código de una letra de aminoácido estándar se usa en el presente documento, por lo que K significa lisina (Lys), I significa isoleucina (Ile) y así sucesivamente.
El compuesto oligopeptídico puede comprender aminoácidos no convencionales o no estándar. Los dominios distintos del motivo de interacción con PCNA en el compuesto oligopeptídico pueden incorporar aminoácidos no estándar. En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede comprender uno o más, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos no convencionales, es decir, aminoácidos que poseen una cadena lateral que no está codificada por el código genético estándar, denominados en el presente documento "aminoácidos no codificados" (véase, por ejemplo, la Tabla 2 ). Estos pueden seleccionarse de aminoácidos que se forman a través de procesos metabólicos como ornitina o taurina, y/o aminoácidos modificados artificialmente como 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), (terc)-(B)util(o)xi(c)arbonilo (Boc), aminoácidos protegidos con 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), o aminoácidos que tienen el grupo benciloxicarbonilo (Z). Cuando están presentes tales aminoácidos no codificados, no se encuentran dentro del motivo. En algunas realizaciones, los aminoácidos no codificados están presentes en más de un dominio del compuesto oligopeptídico.
La estabilidad in vitro y/o in vivo del compuesto oligopeptídico puede mejorarse o potenciarse mediante el uso de medios estabilizantes o protectores conocidos en la materia, por ejemplo, la adición de grupos protectores o estabilizadores, incorporación de derivados o análogos de aminoácidos o modificación química de los aminoácidos. Dichos grupos protectores o estabilizadores pueden, por ejemplo, añadirse en el extremo N y/o C. Un ejemplo de dicho grupo es un grupo acetilo y son conocidos en la materia otros grupos protectores o grupos que pueden estabilizar un péptido.
Los compuestos oligopeptídicos para usar en la invención comprenderán típicamente solo aminoácidos que tienen la configuración L, pero pueden estar presentes uno o más aminoácidos que tienen la configuración D. En algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico contiene al menos 1, 2, 3, 4 o 5 D-aminoácidos y se encuentran preferentemente en el motivo, pero en otra realización, los D-aminoácidos están presentes solo fuera del motivo. En otras realizaciones adicionales, se pueden encontrar D-aminoácidos en más de un dominio del compuesto oligopeptídico. El compuesto oligopeptídico puede ser lineal o cíclico.
Los compuestos oligopeptídicos retroinvertidos comprenden D-aminoácidos en orden inverso (opuesto) a la secuencia del compuesto original o de referencia. Por lo tanto, un análogo retroinvertido tiene términos inversos y orden inverso de, por ejemplo, enlaces peptídicos, mientras mantiene aproximadamente la topología de las cadenas laterales como en la secuencia original o de referencia.
El compuesto oligopeptídico puede incluir secuencias retroinvertidas parciales, es decir, un dominio o parte de un dominio puede comprender una secuencia retroinvertida.
Por "compuesto oligopeptídico" se entiende un compuesto que está compuesto de aminoácidos o subunidades equivalentes, que están unidas entre sí mediante enlaces peptídicos o equivalentes. Por lo tanto, la expresión "compuesto oligopeptídico" incluye péptidos y peptidomiméticos.
Por "subunidad equivalente" se entiende una subunidad que es estructural y funcionalmente similar a un aminoácido. La fracción de la cadena principal de la subunidad puede diferir de un aminoácido estándar, por ejemplo, puede incorporar uno o más átomos de nitrógeno en lugar de uno o más átomos de carbono. En realizaciones preferidas, la subunidad comprende una cadena principal de aminoácidos estándar, es decir, la cadena principal de un aminoácido estándar o codificado. En otras palabras, preferentemente la subunidad es un aminoácido. Sin embargo, la subunidad de aminoácidos puede comprender un grupo R no estándar (no codificado).
Por "peptidomimético" se entiende un compuesto que es funcionalmente equivalente o similar a un péptido y que puede adoptar una estructura tridimensional similar a sus homólogos peptídicos, pero que no se compone únicamente de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Una clase preferida de peptidomiméticos son los peptoides, es decir, glicinas N-sustituidas. Los peptoides están estrechamente relacionados con sus homólogos peptídicos naturales, pero difieren químicamente en que sus cadenas laterales están unidas a átomos de nitrógeno a lo largo de la cadena principal de la molécula, en lugar de a los carbonos a como están en los aminoácidos.
Los peptidomiméticos, en particular las moléculas no peptídicas, pueden generarse a través de varios procesos, que incluyen diseño de fármacos basados en la conformación, cribado, diseño de bibliotecas enfocadas y química médica clásica. No solo pueden usarse oligómeros de aminoácidos no naturales u otros componentes básicos orgánicos, sino también pueden usarse hidratos de carbono, compuestos heterocíclicos o macrocíclicos o cualquier molécula orgánica que comprenda elementos estructurales y una conformación que proporcione una superficie electrostática molecular que imita las mismas propiedades de la conformación 3-dimensional del péptido mediante métodos conocidos en la materia.
Por lo tanto, los peptidomiméticos pueden tener poca o ninguna semejanza con una cadena principal peptídica. Los peptidomiméticos pueden comprender una forma no peptídica completamente sintética (por ejemplo, basada en una cadena principal de hidratos de carbono con sustituyentes apropiados) o pueden conservar uno o más elementos del péptido en el que se basan, por ejemplo, derivatizando uno o más aminoácidos o reemplazando uno o más aminoácidos con componentes alternativos no peptídicos. Las plantillas similares a péptidos incluyen pseudopéptidos y péptidos cíclicos. Los elementos estructurales considerados redundantes para la función del péptido pueden minimizarse para conservar una función de armazón solamente o eliminarse cuando sea apropiado.
Los peptidomiméticos pueden conservar uno o más elementos peptídicos, es decir, más de un aminoácido, aunque dichos aminoácidos pueden reemplazarse con un análogo estructural o no estándar de los mismos. Los aminoácidos conservados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse (por ejemplo, marcarse, glucosilarse o metilarse) siempre que se conserven las propiedades funcionales del compuesto oligopeptídico. Los peptidomiméticos se denominan "derivables de" una determinada secuencia polipeptídica. Con esto se quiere decir que el peptidomimético se diseña con referencia a la secuencia peptídica definida anteriormente, de manera que conservan las características estructurales del péptido que son esenciales para su función. Estas pueden ser las cadenas laterales particulares del péptido o el potencial de enlace de hidrógeno de la estructura. Dichas características pueden ser proporcionadas por componentes no peptídicos o uno o más de los restos de aminoácidos o los enlaces que unen dichos restos de aminoácidos del polipéptido pueden modificarse para mejorar determinadas funciones del péptido tal como la estabilidad o la resistencia a proteasas, mientras que conservan las características estructurales del péptido que son esenciales para su función.
Ejemplos de aminoácidos análogos estructurales o no estándar que pueden usarse son D aminoácidos, isósteros de amida (tales como N-metilamida, amida retroinvertida, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenamino, metilentio o alcano), L-N metilaminoácidos, D-a metilaminoácidos, D-N-metilaminoácidos. Ejemplos de aminoácidos no convencionales, es decir, no codificados se enumeran en la Tabla 2.
TABLA 2
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código
ácido a-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg aminociclopropano-carboxilato Cpro L-N-metilasparagina Nmasn ácido L-N-metilaspártico Nmasp ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys aminonorbornil- Norb L-N-metilglutamina Nmgln carboxilato ácido L-N-metilglutámico Nmglu ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis ciclopentilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile
D-alanina Dal L-N-metilleucina Nmleu
D-arginina Darg L-N-metilisina Nmlys ácido D-aspártico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle
D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva ácido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nmorn
D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro
D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr
D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp
D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr
D-fenilalanina DPhe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg
D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina DThr L-norleucina Nle
D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva
D-tirosina Dtyr a-metil-aminoisobutirato Maib
D-valina Dval a-metil-Y-aminobutirato Mgabu
D-a-metilalanina Dmala a-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilciclopentilalanina Mcpen
D-a-metilasparagina Dmasn a-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metilpenicilamina Mpen
D-a-metilcisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu
D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg
D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn
(continuación)
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbutirato Nmaabu D-a-metilleucina Dmleu a-naftilalanina Anap D-a-metillisina Dmlys N-bencilglicina Nphe D-a-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-a-metilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-a-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-a-metiltriptófano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metiltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm D-N-metilcisteina Dnmcys N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metillhistidina Dnmhis N-(hidroxietil))glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-metilleucina Dnmleu N-(3-indolilietil)glicina Nhtrp D-N-metilisina Dnmlys N-metil-Y-aminobutirato Nmgabu N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-metilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilserina Dnmser N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptófano Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metilanaftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido Y-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicilamina Pen L-homofenilalanina Hphe L-a-metilalanina Mala L-a-metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-t-butilglicina Mtbug L-a-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L-a-metilhistidina Mhis L-a-metilhomofenilalanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-a-metilleucina Mleu L-a-metillisina Mlys L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Morn L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metilprolina Mpro L-a-metilserina Mser L-a-metiltreonina Mthr L-a-metiltriptófano Mtrp L-a-metiltirosina Mtyr L-a-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe (continuación)
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil) Nnbhm N-(N-(3,3-difenilpropil) carbamilmetil) Nnbhe glicina glicina
1-carboxi-1 -(2,2-difenil- Nmbc L-O-metil serina Omser etilamino)ciclopropano L-O-metil homoserina Omhse
En realizaciones preferidas, el compuesto oligopeptídico es un péptido. En realizaciones particularmente preferidas, el compuesto oligopeptídico es un péptido que consiste en L-aminoácidos. En una realización preferida adicional más, el compuesto oligopeptídico es un péptido que consiste en L-aminoácidos estándar o codificados.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el compuesto oligopeptídico puede comprender aminoácidos no estándar. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el compuesto oligopeptídico puede incorporar diaminoácidos y/o p-aminoácidos. Sin embargo, en realizaciones preferidas, al menos el dominio de motivo APIM, consisten en a-aminoácidos. Lo más preferentemente, el compuesto oligopeptídico, es decir, todos los dominios y opcionalmente todas las secuencias flanqueantes, consisten en a-aminoácidos.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el compuesto oligopeptídico definido en el presente documento comprende más de 5 subunidades, pero la longitud de la construcción dependerá del tamaño de la secuencia del CPP y del número y tamaño de otros dominios, por ejemplo, dominios enlazadores, secuencias flanqueantes, etc., si está presente. Por lo tanto, el prefijo "oligo" se usa para designar un número relativamente pequeño de subunidades tales como aminoácidos, es decir, menos de 200, preferentemente menos de 150, 100, 90, 80, 70, 60 o 50 subunidades. Por tanto, el compuesto oligopeptídico de la invención puede comprender más de 5 pero no más de 200 subunidades. Preferentemente, comprende al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 subunidades. Definido alternativamente, comprende no más de 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31 o 30 subunidades. Los intervalos de subunidades representativas incluyen, por lo tanto, 12-50, 12-45, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18, etc., siendo 12­ 30 y 12-40 preferidos.
La naturaleza de las subunidades del compuesto oligopeptídico fuera del dominio del motivo APIM y la secuencia del péptido de captación no es crítica, por lo que las subunidades fuera del motivo pueden ser, por ejemplo, las que se encuentran en una proteína nativa que comprende el motivo, tales como hABH2, o pueden ser restos de alanina o cualquier otro resto adecuado.
Los peptidomiméticos normalmente tienen una semivida más larga dentro del cuerpo del paciente, por lo que pueden ser preferidos en realizaciones donde se desea un efecto más duradero. Esto puede ayudar a reducir la frecuencia con la que se debe volver a administrar la composición. Sin embargo, por razones de bioseguridad, puede preferirse una semivida más corta en otras realizaciones; en esas realizaciones se prefieren los péptidos.
El compuesto oligopeptídico puede formar parte de una unidad mayor, por ejemplo, puede fusionarse a un polipéptido para formar una proteína de fusión recombinante o unirse a un armazón para formar un aptámero peptídico. Por lo tanto, las proteínas de fusión o aptámeros que incorporan el compuesto oligopeptídico también pueden encontrar utilidad en los usos y métodos de la invención, es decir, en algunas realizaciones el agente puede ser una proteína de fusión o aptámero que comprende el compuesto oligopeptídico definido anteriormente.
Otros aspectos más incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden el agente definido en el presente documento, por ejemplo, que comprende el compuesto oligopeptídico, proteína de fusión o aptámero, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable, en donde dicha composición es para uso en la invención de usos que se define a continuación.
En un aspecto adicional, una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene o comprende (por ejemplo) la SEQ iD NO: 2, como se ha definido anteriormente, se proporciona para su uso en los usos de la invención. Como alternativa a lo observado, el agente para usar en la invención puede ser una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene o comprende (por ejemplo) la SEQ ID NO: 2, tal como se ha definido anteriormente. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un compuesto oligopeptídico o una construcción (por ejemplo, un péptido) como se definió anteriormente, que comprende un dominio de motivo de interacción con PCNA (motivo APIM) como se define anteriormente y un péptido que penetra en la célula. También se proporciona el complemento de dicha molécula de ácido nucleico para su uso en la invención. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico también puede codificar una o más secuencias de enlace y/o señal, tal como se ha definido anteriormente.
La molécula de ácido nucleico de la invención comprende al menos 15 nucleótidos, preferentemente al menos 36 nucleótidos y preferentemente no más de 800 nucleótidos, más preferentemente no más de 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75 o 50 nucleótidos. La molécula de ácido nucleico es preferentemente una molécula aislada o sintética.
Un aspecto adicional se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en el presente documento para utilizar en los usos definidos a continuación. Preferentemente, el vector comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia que codifica un péptido como se define anteriormente. El vector también puede contener elementos adicionales que se encuentran normalmente en un vector tal como un origen de replicación, un marcador seleccionable tal como resistencia a antibióticos, y/o un sitio de clonación múltiple. El vector puede ser además un vector de expresión y puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, elementos reguladores o de control de la transcripción y/o traducción para la expresión de las moléculas de ácido nucleico. Dichos elementos de control, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores, terminadores, etc. son bien conocidos y se describen ampliamente en la materia.
El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un genoma vírico (o parte del mismo), preferentemente el genoma vírico es de un virus seleccionado de un retrovirus, un adenovirus y un virus asociado a adenovirus. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el vector puede administrarse en forma de un virus que comprende un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un compuesto oligopeptídico descrito anteriormente. Como alternativa a lo observado, en algunas realizaciones el vector puede ser un virus.
Tal como se ha mencionado anteriormente, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende un agente como se define en el presente documento para utilizar en los usos de la invención. Por consiguiente, dicha composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede comprender un compuesto oligopeptídico (que incluye una proteína de fusión o aptámero) y/o una molécula de ácido nucleico como se define en el presente documento y/o un vector como se define en el presente documento, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacológicamente (o farmacéuticamente) aceptable.
El excipiente puede incluir cualquier excipiente conocido en la materia, por ejemplo, cualquier vehículo o diluyente o cualquier otro ingrediente o agente tal como tampón, antioxidante, quelante, aglutinante, recubrimiento, disgregante, carga, aromatizante, color, agente de deslizamiento, lubricante, conservante, absorbente y/o edulcorante, etc.
El excipiente puede seleccionarse de, por ejemplo, ácido láctico, dextrosa, metabisulfato de sodio, alcohol bencílico, polietilenglicol, propilenglicol, celulosa microcristalina, lactosa, almidón, quitosano, almidón pregelatinizado, carbonato de calcio, sulfato de calcio, dextratos, dextrina, dextrosa, fosfato de calcio dibásico dihidratado, fosfato de calcio tribásico, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, maltodextrina, manitol, celulosa en polvo, cloruro de sodio, sorbitol y/o talco.
La composición farmacéutica se puede proporcionar en cualquier forma conocida en la materia, por ejemplo, en forma de un comprimido, cápsula, comprimido recubierto, líquido, suspensión, pastilla, sobrecito, implante, inhalador, polvo, microgránulo, emulsión, liofilización, efervescentes, pulverización, pomada balsámica, emulsión, bálsamo, emplasto o cualquier mezcla de las mismas. Puede proporcionarse, por ejemplo, como preparación resistente a los fluidos gástricos y/o en forma de acción sostenida. Puede ser una forma adecuada para administración oral, parenteral, tópica, rectal, genital, subcutánea, transuretral, transdérmica, intranasal, intraperitoneal, intramuscular y/o intravenosa y/o administración por inhalación.
En una realización representativa, la composición farmacéutica puede estar en una forma adecuada para la administración liposomal, por lo que se proporcionan preferentemente liposomas que contienen la composición farmacéutica. Cuando se usan liposomas, puede que no sea necesario incluir un excipiente adicional, por lo que también se proporcionan liposomas que contienen un agente, por ejemplo, el compuesto oligopeptídico, como se define en el presente documento, para usar en los usos de la invención.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los agentes definidos en el presente documento, es decir, compuestos oligopeptídicos y moléculas de ácido nucleico, y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos agentes presentan propiedades terapéuticas en el tratamiento de diversas afecciones o trastornos, particularmente trastornos asociados con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre y enfermedades infecciosas o trastornos o afecciones exacerbadas o causadas por una infección.
Como se denomina en el presente documento, un "trastorno", "enfermedad" o "afección" se refiere a una alteración patológica subyacente en un organismo (sujeto) sintomático o asintomático en relación con un organismo (sujeto) normal, que puede ser resultado, por ejemplo, de la infección y/o una imperfección genética adquirida o congénita. Tal como se establece en los Ejemplos, los inventores han determinado que los compuestos oligopeptídicos que comprenden un motivo de interacción con PCNA pueden reducir la liberación de citocinas en sangre, particularmente de las células inmunitarias que no proliferan en la sangre, por ejemplo, monocitos. Las citocinas pueden liberarse a la sangre mediante la estimulación con una variedad de sustancias y sustancias artificiales/sintéticas. Por ejemplo, LPS y poli I:C se pueden utilizar para simular o representar infecciones bacterianas y víricas, respectivamente. Los niveles excesivos de citocinas proinflamatorias están asociados con una variedad de enfermedades, por ejemplo, enfermedades infecciosas, y se espera que los agentes definidos en este documento puedan ser eficaces en el tratamiento o la prevención de dichos trastornos. Por ejemplo, se cree que los síntomas y complicaciones asociados con el síndrome séptico surgen de la sobreproducción de citocinas proinflamatorias en sangre. La introducción o administración de los agentes desvelados en el presente documento, por ejemplo, por vía intravenosa, se esperaría que tratara o previniera el síndrome séptico reduciendo o inhibiendo la liberación de dichas citocinas en sangre. Por lo tanto, se puede esperar que los agentes descritos en el presente documento encuentren utilidad en el tratamiento o la prevención de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la liberación incontrolada, indeseable o excesiva de citocinas (por ejemplo, hipercitocinemia) de las células inmunitarias en la sangre, por ejemplo, la liberación particularmente incontrolada, indeseable o excesiva de una o más citocinas proinflamatorias.
Los inventores han demostrado que algunas de las proteínas implicadas en las vías de transducción de señales del receptor tipo toll, que, como se discutió anteriormente, están involucrados en la regulación de las respuestas inmunes, comprenden un motivo de interacción con PCNA. Por consiguiente, se cree que los compuestos oligopeptídicos desvelados en el presente documento pueden interferir con la interacción de dichas proteínas con PCNA, por ejemplo, en células no proliferantes en sangre, inhibiendo así la liberación de citocinas proinflamatorias a la sangre. Por consiguiente, los compuestos oligopeptídicos desvelados en el presente documento encuentran una utilidad particular en el tratamiento o la prevención de una afección o trastorno asociado con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre, particularmente afecciones o trastornos asociados con la liberación excesiva, indeseable o incontrolada de citocinas proinflamatorias de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, por ejemplo, una enfermedad infecciosa o infección o una enfermedad o afección agravada o causada por una infección.
En otras palabras, los compuestos oligopeptídicos desvelados en el presente documento encuentran una utilidad particular en el tratamiento o prevención de citocinas proinflamatorias excesivas, indeseables o incontroladas de células inmunes no proliferantes en la sangre de un sujeto, por ejemplo, un sujeto con una enfermedad infecciosa o infección o una enfermedad o afección agravada o causada por una infección.
Aunque no se desea ceñirse a la teoría, se cree que el efecto de los péptidos APIM sobre la liberación de citocinas puede depender de la fuerza de la interacción entre el péptido APIM y su(s) diana(s) polipeptídica(s). Por lo tanto, ya que diferentes péptidos APIM pueden interactuar con polipéptidos diana con diferentes afinidades, se cree que la dosis de cualquier péptido APIM se puede determinar de forma independiente. Sin embargo, la dosis de cualquier péptido APIM se puede determinar de forma rutinaria. En general, una dosis adecuada puede definirse como una dosis que no induce apoptosis, es decir, una dosis que no induce apoptosis, que puede deducirse analizando la concentración mínima de compuesto oligopeptídico necesaria para inducir la apoptosis en una célula, por ejemplo, usando un ensayo in vitro convencional.
Dado que las aplicaciones y utilidades terapéuticas de la presente invención pueden implicar generalmente la inhibición de la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, cualquier célula inmunitaria no proliferante en sangre puede ser direccionada en las terapias y utilidades descritas y abarcadas en el presente documento. Tales células inmunitarias que no proliferan pueden incluir células sanas o enfermas, y particularmente células que están implicadas en la liberación de citocinas. Por ejemplo, tales células pueden incluir en particular monocitos, por ejemplo, células que presentan el receptor de superficie celular CD14 y/o el receptor de superficie celular CD16.
Las células a las que se dirigirá en las terapias y utilidades descritas y abarcadas en el presente documento están particularmente asociadas con la liberación de citocinas y quimiocinas proinflamatorias. Por lo tanto, en algunas realizaciones, además, o como alternativa, a los receptores de la superficie celular mostrados, las células inmunitarias que no proliferan, por ejemplo, los monocitos, se pueden caracterizar o definir por su capacidad para liberar (por ejemplo, secretar) cualquiera o más de las citocinas o quimiocinas seleccionadas de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, iL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, FGF básico, G-CSF, GM-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-p, CCL5 y VEGF.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, las células inmunitarias que no proliferan son monocitos, particularmente monocitos que presentan el receptor de superficie celular CD14 y/o el receptor de superficie celular CD16. En algunas realizaciones, las células inmunes que no proliferan son monocitos que son capaces de liberar (por ejemplo, monocitos que secretan o liberan) cualquiera o más de las citocinas o quimiocinas seleccionadas de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, FGF básico, G-CSF, GM-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-p, CCL5 y VEGF.
El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier efecto o etapa (o intervención) beneficiosa en el manejo de una afección o trastorno clínico y, por lo tanto, incluye tratamientos tanto terapéuticos como profilácticos. El tratamiento puede incluir reducir, aliviar, mejorar, ralentizar el desarrollo o eliminar la afección o uno o más síntomas de la misma, que se está tratando, en relación con la afección o síntoma antes del tratamiento, o mejorar de alguna manera el estado clínico del sujeto. Un tratamiento puede incluir cualquier etapa o intervención clínica que contribuya a, o sea parte de, un programa o régimen de tratamiento. Un tratamiento profiláctico puede incluir retrasar, limitar, reducir o prevenir la afección o la aparición de la afección, o uno o más síntomas de la misma, por ejemplo en relación con la afección o síntoma antes del tratamiento profiláctico. La profilaxis, por lo tanto, incluye explícitamente tanto la prevención absoluta de la aparición o el desarrollo de la afección, o sus síntomas, como cualquier retraso en el inicio o desarrollo de la afección o síntoma, o la reducción o limitación en el desarrollo o progresión de la afección o síntoma.
El tratamiento de acuerdo con algunos aspectos de la invención incluye, por tanto, reducir o disminuir los niveles o cantidades de una o más citocinas liberadas en la sangre por las células inmunitarias que no proliferan, por ejemplo, en respuesta a una infección, tal como una infección microbiana, vírica o parasitaria. El tratamiento también incluye la prevención o inhibición de la liberación a la sangre de una o más citocinas de células inmunitarias que no proliferan, por ejemplo, la prevención o inhibición de la liberación de citocinas por encima de un nivel o cantidad que se considera dentro de un intervalo normal. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invención, se puede considerar que el tratamiento mantiene el nivel o la cantidad de una o más citocinas en sangre dentro de un intervalo normal. Un intervalo normal puede depender del sujeto que se esté tratando. Por lo tanto, por ejemplo, un intervalo normal puede ser la cantidad o nivel de dichas una o más citocinas en un sujeto sano. Como alternativa, un intervalo normal puede ser el nivel o cantidad promedio o típico de dichas una o más citocinas en sujetos que padecen una enfermedad o afección particular como se define en el presente documento, por ejemplo, una infección. Por lo tanto, el tratamiento puede implicar reducir o disminuir un nivel o cantidad excesiva, no deseada o por encima de lo normal de una o más citocinas que se han liberado a la sangre a partir de células inmunitarias no proliferativas. El tratamiento también puede abarcar la prevención o inhibición de la liberación de cantidades o niveles no deseados, excesivos o por encima de lo normal de una o más citocinas de células inmunitarias no proliferantes en sangre. El término "tratamiento" no implica necesariamente la curación o la abolición o eliminación completa de la liberación de citocinas no deseada, excesiva o por encima de lo normal de las células inmunitarias que no proliferan en la sangre.
La expresión "trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de células inmunitarias no proliferantes en sangre" se usa ampliamente en el presente documento para incluir cualquier trastorno o afección que implique cantidades o niveles aumentados, no deseados, no buscados o excesivos de citocinas en sangre como resultado de la liberación de citocinas de células inmunitarias que no proliferan. Por lo tanto, no solo se incluyen las afecciones en las que los niveles de una o más citocinas en sangre aumentan, por ejemplo, en relación con los niveles de citocinas normales o saludables, o los niveles de citocinas en ausencia de la afección en cuestión (por ejemplo, en comparación o en relación con un sujeto sano o de control, o en comparación o en relación con los niveles de citocinas tomados de tejido sano o no afectado en el mismo sujeto ), pero también condiciones en las que el nivel de citocinas no aumenta (o no aumenta de forma grande o significativamente) por encima de lo normal, pero en las que el nivel de citocinas que se produce es no deseado o no buscado, ya sea en general o en un contexto particular. Esto puede incluir, por ejemplo, una liberación no deseada o no buscada de citocinas que puede tener lugar en una respuesta "normal", por ejemplo, una respuesta inmunitaria o una respuesta inflamatoria, etc. (en otras palabras, una respuesta "normal" que puede tener lugar en un contexto particular (por ejemplo, normal), pero que, no obstante, puede ser no deseado). Dicha respuesta de liberación de citocinas no deseada puede ser, por ejemplo, la liberación de citocinas que da como resultado una respuesta inflamatoria no deseada o una respuesta inmunitaria no deseada, tal como una respuesta autoinmune, una reacción alérgica, rechazo de un órgano o tejido trasplantado, etc.
El trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre se caracteriza como hipercitocinemia, que puede verse como una liberación no deseada o excesiva, o un aumento en el nivel o la cantidad, de una o más citocinas en sangre. En algunas realizaciones, la hipercitocinemia puede ser una liberación global de citocinas, que comprende la liberación no deseada (por ejemplo, incontrolada, excesiva o por encima de lo normal) o aumento de múltiples citocinas, por ejemplo, un aumento en el nivel de al menos 2 citocinas definidas en el presente documento, tal como un aumento de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más citocinas como se define en el presente documento. Una liberación o aumento de múltiples citocinas puede denominarse "tormenta de citocinas". Por consiguiente, el trastorno o afección a tratar es una afección que da como resultado, por ejemplo, puede conducir a, la hipercitocinemia, tal como una tormenta de citocinas, por ejemplo, síndrome séptico o malaria. En otras realizaciones, la hipercitocinemia está asociada con la liberación de citocinas específicas en sangre, por ejemplo, un aumento de una citocina particular. Por ejemplo, la liberación excesiva o aumentada de interferón-p (lNF-p) en respuesta a una infección vírica, por ejemplo, una infección vírica aguda o persistente (crónica), en última instancia, puede conducir a una serie de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico, anemia y otras enfermedades autoinmunes.
El agente descrito en el presente documento se usa como agente terapéutico directo, por ejemplo, para tratar un trastorno o afección asociada con la hipercitocinemia, es decir, para facilitar la reducción de los niveles o cantidades de dichas una o más citocinas no deseadas o excesivas (por encima de lo normal) en un sujeto en el que un trastorno o afección ya ha progresado a hipercitocinemia. Por lo tanto, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de las células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede verse como un trastorno o afección que da como resultado (puede llevar a) hipercitocinemia. Visto como una alternativa, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede verse como hipercitocinemia resultante de un trastorno o afección asociado, por ejemplo, hipercitocinemia resultante de una infección.
Una liberación no deseada o excesiva (por ejemplo, incontrolada o por encima de lo normal) o un aumento en el nivel o la cantidad de una o más citocinas en sangre puede definirse como un aumento de una o más citocinas en al menos un 10 % en relación con los niveles normales. Tal como se ha mencionado anteriormente, se pueden definir niveles normales, por ejemplo, en relación con los niveles en la sangre de un sujeto sano o los niveles en otro tejido del sujeto a tratar. En algunas realizaciones, los niveles normales pueden definirse en relación con los niveles promedio o típicos en un sujeto con el trastorno o afección que se va a tratar o prevenir, por ejemplo, los niveles promedio o típicos en un sujeto en una etapa temprana del trastorno o afección, es decir, una afección en la que la progresión de la afección dará como resultado una liberación indeseable de una o más citocinas. En algunas realizaciones, la liberación o el aumento no deseado o excesivo puede ser un aumento de al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 %, por ejemplo, al menos un 60, 70, 80, 90 o 100 %. En otras realizaciones adicionales, puede ser un aumento de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces de los niveles normales, tales como al menos 15, 20, 30, 40, 50 o 100 veces los niveles normales. Será evidente que el intervalo del aumento será, hasta cierto punto, dependiente de la naturaleza de una o más citocinas en cuestión. Por lo tanto, los valores anteriores pueden aplicarse a una sola citocina o el aumento puede medirse como un promedio del aumento total, es decir, donde se incrementa más de una citocina.
Una reducción de niveles o cantidades no deseados o excesivos (por ejemplo, incontrolados o por encima de lo normal) de una o más citocinas en sangre se puede definir como una disminución de una o más citocinas en al menos un 10 %, por ejemplo, en relación con los niveles previos al tratamiento. En algunas realizaciones, los niveles o cantidades no deseados o excesivos pueden reducirse en al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 %, por ejemplo, al menos un 60, 70, 80, 90 o 100 %. En otras realizaciones adicionales, puede ser una disminución de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces las cantidades o niveles antes del tratamiento, tales como al menos 15, 20, 30, 40, 50 o 100 veces de disminución. En algunas realizaciones, la disminución puede ser una reducción de la cantidad o nivel dentro de aproximadamente el 25 % o menos del nivel normal, en donde el nivel normal es como se definió anteriormente. Por lo tanto, la disminución puede ser una reducción dentro de aproximadamente el 20, 15, 10, 5 % o menos del nivel normal. Será evidente que el intervalo de disminución o reducción será, hasta cierto punto, dependiente de la naturaleza de una o más citocinas en cuestión. Por lo tanto, los valores anteriores se pueden aplicar a una sola citocina o la disminución o reducción se puede medir como un promedio de la disminución total, es decir, cuando se reduce el nivel o la cantidad de más de una citocina.
En algunas realizaciones, el agente o composición da como resultado una reducción de citocinas y/o quimiocinas seleccionadas de una cualquiera o más de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, FGF básico, G-CSF, GM-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-p, CCL5 y VEGF. En algunas realizaciones, el agente o composición da como resultado una reducción de una o más de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-17, G-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3 y CCL4 (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección bacteriana). En realizaciones adicionales, el agente o composición da como resultado una reducción de una o más de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-17, G-CSF e INFy (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección bacteriana). En algunas realizaciones más particulares, el agente o composición da como resultado una reducción de una o más de IFNy, IL-1RA, IL-2, 4 y 9 (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección bacteriana). En otras realizaciones adicionales más, el agente o composición da como resultado una reducción de una o más de TNFa, IL-1 p, IL-8 (CXCL8), CXCL10, CCL2, CCL3 y CCL4 (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección vírica). En algunas realizaciones, el agente o composición da como resultado una reducción de una o más de TNFa, IL-8 (CXCL8), CXCL10, CCL2, CCL3 y CCL4 (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección vírica). En algunas realizaciones más particulares, el agente o composición da como resultado una reducción de uno o más de IL-1 RA, CCL2, 3 y 4 (por ejemplo, en una enfermedad o afección asociada con una infección vírica).
La identificación, la caracterización, el diagnóstico y/o la progresión del trastorno o afección a tratar y/o la eficacia del tratamiento puede facilitarse mediante la medición de una o más citocinas en la sangre. Se conocen bien en la técnica diversos ensayos para medir citocinas y están disponibles comercialmente kits convencionales. Los métodos típicos se basan en inmunoensayos, por ejemplo, ELISA, RIA, etc., y se pueden realizar utilizando una variedad de muestras de sangre, tal como suero, plasma o sangre entera.
Por lo tanto, en una realización general, la invención, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias no proliferantes en la sangre es una enfermedad inflamatoria (por ejemplo, artritis inflamatoria, artritis psoriásica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal) o una enfermedad autoinmune (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por consiguiente, se puede ver que la invención proporciona un agente o composición tal como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con una enfermedad inflamatoria o autoinmune.
En algunas realizaciones más particulares de la invención, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre es una infección o enfermedad infecciosa. Por lo tanto, la invención puede proporcionar un agente o composición tal como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con una infección o enfermedad infecciosa.
Una "infección" o "enfermedad infecciosa" puede definirse como una enfermedad, afección o trastorno causado por la invasión de un sujeto, por ejemplo, uno o más órganos o tejidos de dicho sujeto, por uno o más organismos causantes de enfermedades y su posterior multiplicación. En algunos casos, una infección o enfermedad infecciosa puede caracterizarse por la reacción del sujeto (por ejemplo, órgano o tejidos de dicho sujeto) a dichos organismos y, en algunos casos, a las toxinas producidas por dichos organismos. Una infección o enfermedad infecciosa puede ser una infección microbiana, vírica o parasitaria y puede ser local o sistémica. Una infección microbiana puede ser cualquier infección bacteriana o fúngica, es decir, causada por una bacteria u hongo. En realizaciones particularmente preferidas, la enfermedad, la afección o el trastorno causado por una infección vírica no es una enfermedad hiperproliferativa inducida por virus, como verrugas y enfermedades inducidas por EBV (por ejemplo, mononucleosis infecciosa), formación de cicatrices y similares.
En algunas realizaciones, la enfermedad o infección infecciosa puede ser una infección o enfermedad bacteriana. Los ejemplos de bacterias que causan infecciones o enfermedades infecciosas descritas en el presente documento pueden ser Gram positivas o Gram negativas, o no sensibles a la prueba Gram. Pueden ser bacterias aerobias o anaerobias. Por ejemplo, las bacterias pueden ser de cualquiera de los géneros Achromobacter, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Borrelia, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Edwardsiella, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Helicobacter, Kingella, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Mobiluncus, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Salmonella, Shewenella, Shigella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Treponem y Yersinia, tal como Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Chlamydia, Clostridium, Helicobacter, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Legionella, Listeria, Mycobacterium, Proteus, Klebsiella, Fusobacterium u otra bacteria entérica o coliforme.
Por lo tanto, por ejemplo, la infección o la enfermedad infecciosa puede ser causada por bacterias Gram positivas tales como, M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, cepa b Cg de M. bovis, subcepas BCG, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subespecie paratuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, y Enterococcus species.
En otras realizaciones, la infección o la enfermedad infecciosa puede ser causada por una bacteria Gram negativa tal como Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Chlamydi trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia coli, E. hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, y Cowdria ruminantium.
Por lo tanto, un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede ser el resultado de, por ejemplo, causada por, una infección bacteriana o enfermedad infecciosa, tal como síndrome séptico.
En algunas realizaciones, una infección bacteriana puede estar asociada con un trastorno o afección particular, es decir, los sujetos que padecen un trastorno o afección particular pueden ser particularmente susceptibles a una o más infecciones bacterianas. Por ejemplo, es común que los sujetos con fibrosis quística padezcan infecciones crónicas de Pseudomonas. Por lo tanto, se puede ver que la invención se extiende a un agente o composición como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia exacerbada o causada por una infección, por ejemplo, neumonía bacteriana, fibrosis quística, úlceras gástricas, meningitis bacteriana, legionelosis (enfermedad del legionario), legionelosis (fiebre de Pontiac), pertusis (tosferina), salmonelosis, tuberculosis, etc.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, una afección o enfermedad causada por una infección es el síndrome séptico, que es una afección que es resultado de una infección grave. Por consiguiente, se puede ver que la invención proporciona un agente o composición tal como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con síndrome séptico.
En algunas realizaciones, una afección o enfermedad agravada por una infección es la fibrosis quística, que es una afección que se asocia comúnmente con una infección crónica de Pseudomonas. Por consiguiente, se puede ver que la invención proporciona un agente o composición tal como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de un sujeto con fibrosis quística, por ejemplo, padece una infección, es decir, aliviar uno o más síntomas de un sujeto que padece fibrosis quística).
En algunas realizaciones, la enfermedad o infección infecciosa puede ser una infección o enfermedad fúngica. En algunos aspectos de la invención, el hongo puede ser un moho o una levadura, preferentemente una levadura. El hongo se puede seleccionar de uno o más de un Dermatophyte, Aspergillus sp. (tal como Aspergillus fumigatus, Aspergillus nigricans o flavescens), Zygomycota sp., Fusarium sp., Trichophyton sp,. Basidiobolus ranarum, Piedraia sp. (tal como Piedraia hortae), Blastomyces dermatitidis, Candida sp. (tal como Candida albicans), Chrysosporium, Coccidioides sp. (tal como Coccidioides immitis y Coccidioides posadasii), Conidiobolus sp. (tal como Conidiobolus coronatus y Conidiobolus incongruus), Cryptococcus sp. (tal como Cryptococcus gattii y Cryptococcus neoformans), Histoplasma sp. (tal como Histoplasma farciminosum y Histoplasma capsulatum), Exserohilum rostratum, Cladosporium sp., Saccharomyces sp., Lacazia loboi, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Diheterospora zeaspora, Absidia corymbifera, Apophysomyces elegans, Mucor indicus, Rhizomucor pusillus, Rhizopus oryzae, Cunninghamella bertholletiae, Cokeromyces recurvatus, Saksenaea vasiformis, Syncephalastrum racemosum, y Conidiobolus sp. (tal como Conidiobolus coronatus y Conidiobolus incongruus).
Como ejemplo representativo, los hongos que causan infecciones o enfermedades infecciosas incluyen hongos del género Candida, Aspergillus, Pneumocystis, Penicillium y Fusarium. Las especies de hongos representativas incluyen, aunque no de forma limitativa, Candida albicans, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Histoplama capsulatum, Aspergillus fumigatus, Coccidiodes immitis, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermitidis, Pneomocystis carnii, Penicillium marneffi y Alternaria alternate. etc.
Una variedad de condiciones ambientales y fisiológicas pueden contribuir al desarrollo de enfermedades e infecciones fúngicas. Las infecciones por hongos (micosis) comúnmente comienzan en los pulmones o en la piel, por ejemplo, una infección por hongos (una micosis) puede resultar de la inhalación de esporas de hongos o la colonización localizada de la piel puede iniciar infecciones persistentes. Por lo tanto, una enfermedad o afección agravada o causada por una infección por hongos (micosis) puede estar en cualquier tejido u órgano del sujeto a tratar, tal como los pulmones (incluyendo el tracto respiratorio), la piel (incluidas las heridas), la boca, el oído, el ojo, etc. Por lo tanto, la infección fúngica puede ser una infección respiratoria, infección de la piel, infección de oído, infección de ojo, etc.
Por lo tanto, un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede ser el resultado de, por ejemplo, causada por, una infección fúngica o enfermedad infecciosa, causada por uno o más de los hongos (u hongos de uno o más de los géneros) descritos anteriormente.
Por lo tanto, de manera más general, un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede ser el resultado de, o agravarse por, una infección microbiana, tal como un microbio seleccionado de uno o más de los géneros Actinebacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Serratia, Yersinia, Peptostreptococcus, Bacteriodes, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Klebsiella, Candida, Proteus, Burkholderia, Fusobacterium y Mycobacterium, por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Legionella pneumophila, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia y Streptococcus pyogenes.
En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa o la infección puede ser una infección o enfermedad vírica. Los ejemplos de virus que causan infecciones o enfermedades infecciosas incluyen el lisavirus del murciélago australiano, virus Banna, virus del bosque de Barmah, virus Bunyamwera, bunyavirus La Crosse, bunyavirus de liebre con raquetas de nieve, herpesvirus de Cercopithecina, virus del chikungunya, Virus de la fiebre hemorrágica Crimea-Congo, virus del dengue, virus Dhori, virus Dugbe, virus de Duvenhage, virus de la encefalitis equina del este, virus del ébola, ecovirus, virus de la encefalomiocarditis, lissavirus de murciélago europeo, virus Hantaan, virus Hendra, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis delta, herpesvirus humano 1, adenovirus humano, astrovirus humano, coronavirus humano, citomegalovirus humano, enterovirus humano 68-70, herpesvirus humano 2, herpesvirus humano 6, herpesvirus humano 7, herpesvirus humano 8, virus de la inmunodeficiencia humana, parainfluenza humana, parvovirus humano B19, virus respiratorio sincicial humano, rinovirus humano, coronavirus humano del SARS, virus linfotrópico T humano, torovirus humano, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, virus de Isfahán, poliomavirus JC, virus de la encefalitis japonesa, arenavirus de Junin, poliomavirus KI, virus de Kunjin, virus del murciélago de Lagos, marburgvirus del lago Victoria, virus Langat, virus Lassa, virus de Lordsdale, virus de la encefalomielitis ovina, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Machupo, virus de Mayaro, virus del sarampión, virus de la encefalomiocarditis de Mengo, virus de Mokola, virus del molusco contagioso, virus de la viruela del mono, virus de las paperas, virus de la encefalitis del valle del Murray, virus de Nueva York, virus Nipah, virus de Norwalk, virus O'nyong-nyong, virus orf, virus Oropouche, virus Pichinde, poliovirus, flebovirus punta toro, virus Puumala, virus de la rabia, virus de la fiebre del Valle del Rift, virus del río Ross, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, virus de la rubeola, virus de Sagiyama, virus siciliano de fiebre por flebótomos, virus de Sapporo, virus del bosque de Semliki, virus de Seúl, virus Sindbis, virus de Southampton, virus de la encefalitis de San Luis, virus powassan transmitido por garrapatas, virus de Toscana, virus Uukuniemi, virus varicela zóster, virus variola, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la estomatitis vesicular, virus de la encefalitis equina occidental, virus del Nilo Occidental y virus de la fiebre amarilla.
Como ejemplo representativo, los virus que causan infecciones o enfermedades infecciosas descritas en el presente documento pueden seleccionarse particularmente de uno o más de los virus del dengue, virus del ébola, ecovirus, virus de la encefalomiocarditis, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis delta, herpesvirus humano 1, adenovirus humano, astrovirus humano, coronavirus humano, citomegalovirus humano, enterovirus humano 68-70, herpesvirus humano 2, herpesvirus humano 6, herpesvirus humano 7, herpesvirus humano 8, virus de la inmunodeficiencia humana, parainfluenza humana, parvovirus humano B19, virus respiratorio sincicial humano, rinovirus humano, coronavirus humano del SARS, virus linfotrópico T humano, torovirus humano, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, virus de la encefalitis japonesa, virus del sarampión, virus de las paperas, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, virus de la rubeola, virus del Nilo Occidental y virus de la fiebre amarilla.
Sin embargo, tal como se ha mencionado anteriormente, en realizaciones particularmente preferidas, la infección vírica no es una infección que cause o resulte en una enfermedad hiperproliferativa inducida por virus, como verrugas y enfermedades inducidas por EBV (por ejemplo, mononucleosis infecciosa), formación de cicatrices y similares.
Por lo tanto, un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede ser el resultado de, por ejemplo, causada por, una infección vírica o enfermedad infecciosa, tal como el SIDA/VIH, el dengue, sarampión, paperas, rubeola, gripe y hepatitis.
Por consiguiente, se puede ver que la invención proporciona un agente o composición tal como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con una infección vírica, por ejemplo, SIDA/VIH, el dengue, sarampión, paperas, rubeola, gripe o hepatitis.
En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa o la infección puede ser una infección o enfermedad parasitaria. Ejemplos de parásitos que causan infecciones o enfermedades infecciosas incluyen infecciones por Plasmodium sp., tal como Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, Plasmodium vivax, Plasmodium berghei y Plasmodium yoelii, protozoos como las especies de Toxoplasma, por ejemplo Toxoplasma gondii, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, especies de Leishmania como Leishmania major, Schistosoma tal como Schistosoma mansoni y Entamoeba histolytica.
Por lo tanto, un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas a partir de células inmunitarias que no proliferan en la sangre puede ser el resultado de, por ejemplo, causada por, una infección parasitaria o enfermedad infecciosa, tal como malaria, toxoplasmosis, tripanosomiasis y esquistosomiasis.
En realizaciones adicionales, una afección o enfermedad causada por una infección es una infección parasitaria, tal como malaria, que es una afección que es resultado de una infección parasitaria, por ejemplo, infección por Plasmodium, tal como infección por Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, Plasmodium vivax, Plasmodium berghei o Plasmodium yoelii. Por consiguiente, se puede ver que la invención proporciona un agente o composición tal como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con una infección parasitaria, por ejemplo, malaria, toxoplasmosis, tripanosomiasis o esquistosomiasis.
En otras realizaciones adicionales más, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre es la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), es decir, una respuesta inmunitaria asociada con el trasplante de células, tejidos u órganos a un receptor de un donante genéticamente no idéntico de la misma especie. El trasplante se puede considerar como un aloinjerto, trasplante alogénico u homoinjerto. En algunas realizaciones de la invención, el trasplante puede ser un trasplante de células madre y/o de médula ósea. Por consiguiente, el agente o composición puede usarse en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con una enfermedad de injerto contra huésped.
En otras realizaciones adicionales más, el trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de las células inmunitarias que no proliferan en la sangre es un traumatismo, por ejemplo, traumatismo causado por una lesión (es decir, una herida física o lesión, tal como una fractura o un golpe, por ejemplo, un politraumatismo (que afecta a varios sitios), un traumatismo craneal, un traumatismo torácico, un traumatismo abdominal o en las extremidades) o cirugía. En algunos casos, la lesión o herida resultante de un traumatismo puede ser una quemadura. Una quemadura puede ser causada por calor, electricidad, sustancias químicas, fricción o radiación. En algunas realizaciones, la quemadura es una quemadura de segundo grado o de espesor parcial (que comprende el daño de algunas de las capas subyacentes de la piel). En algunas realizaciones, la quemadura es una quemadura de espesor total o de tercer grado (que comprende un daño que se extiende a todas las capas de la piel). En algunas realizaciones, la quemadura es de cuarto grado, que además implica lesiones en tejidos más profundos, como músculos o huesos.
Por consiguiente, el agente o composición puede usarse en el tratamiento de hipercitocinemia en un sujeto con trauma (por ejemplo, causado por lesión o cirugía).
En algunos sujetos, la hipercitocinemia, que puede ser el resultado de una enfermedad o afección como se describe en el presente documento, tal como el síndrome séptico, malaria, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), etc., puede provocar o aumentar el riesgo de síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO), que también se conoce como insuficiencia orgánica múltiple (IOM) o insuficiencia orgánica multisistémica (IOMS). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un agente o composición como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto con SDMO.
Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, el agente o composición como se define en el presente documento se usa en combinación con uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, un compuesto inmunosupresor, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antimicrobiano o un esteroide (por ejemplo, un corticoesteroide) o un inhibidor de la cinasa (como un inhibidor de p38 MAPK o un inhibidor de PI3K de clase I), con el fin de potenciar o complementar el efecto del agente o composición definido en el presente documento, por ejemplo, para tratar síntomas de la enfermedad o afección que no se ven afectados directamente por el agente o la composición de la invención. Sin embargo, en algunas realizaciones, el agente, como se define en el presente documento, puede usarse solo, es decir, como el único agente activo en una composición y/o medicamento.
En algunas realizaciones, el agente activo adicional es un compuesto inmunosupresor. Los compuestos inmunosupresores adecuados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de glucocorticoides, ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina y mitramicina.
En algunas realizaciones, el agente activo adicional es un compuesto antiinflamatorio. Los compuestos antiinflamatorios adecuados incluyen, entre otros, uno o más de diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, celecoxib, ácido mefenámico, etoricoxib, indometacina y aspirina.
En algunas realizaciones, el agente activo adicional es un compuesto antibiótico. Los compuestos antibióticos adecuados incluyen, pero sin limitación, una o más aminocumarinas (tales como novobiocina, albamicina, cumermicina y clorobiocina), aminoglucósidos (tales como amikacina, apramicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, paromomicina y espectinomicina), ansamicinas (tales como geldanamicina, herbimicina, rifaximina y estreptomicina), carbapenems (tales como ertapenem, doripenem, cilastatina ('imipenem') y meropenem), cefalosporinas (tales como cefadroxil, cefazolina, cefalotina ("Cefalotina"), cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, ceftarolina fosamil y ceftobiprol) Glucopéptidos (tales como teicoplanina, vancomicina y telavancina), lincosamidas (tales como clindamicina y lincomicina), lipopéptidos (tal como daptomicina), macrólidos (tales como azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina y espiramicina), monobactams (tal como aztreonam), nitrofuranos (tales como furazolidona y nitrofurantoína), oxazolidononas (tales como linezolida, posizolida, radezolida y torezolida), penicilinas (tales como amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, temocilina y ticarcilina), combinaciones de penicilinas (tales como amoxicilina/clavulanato, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam y ticarcilina/clavulanato), poliéteres (tal como monensina), polipéptidos (tales como bacitracina, colistina y polimixina B), quinolonas (como ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, esparfloxacinao y temafloxacino); sulfonamidas (tales como mafenida, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de plata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, sulfametoxazol (cotrimoxazol, TMP-SMX, "Trimetoprim") y sulfonamidocrisoidina), tetraciclinas (tales como demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina y tetraciclina) y otros (tales como clofazimina, dapsona, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazid, pirazinamida, rifampicina ('rifampina'), rifabutina, rifapentina, estreptomicina, arsfenamina, cloranfenicol, fosfomicina, ácido fusídico, metronidazol, mupirocina, platensimicina, quinupristina (dalfopristina), tianfenicol, tigeciclina, tinidazol y trimetoprim).
En algunas realizaciones, el agente activo adicional es un compuesto antifúngico. Los compuestos antifúngicos (antimicóticos) adecuados incluyen, pero sin limitación, uno cualquiera o más de los antifúngicos poliénicos (tales como anfotericina B, candicidina, filipina, hamicina, natamicina, nistatina y rimocidina), imidazoles (tales como bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, ketoconazol, miconazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol y tioconazol), triazoles (tales como albaconazol, fluconazol, isavuconazol, itraconazol, posaconazol, ravuconazol, terconazol y voriconazol), tiazoles (tal como abafungina), alilaminas (tales como amorolfin, butenafina, naftifina y terbinafina), equinocandinas (tales como anidulafungina, caspofungina y micafungina) y otros tales como ácido benzoico, ciclopirox, flucitosina o 5-fluorocitosina, griseofulvina, haloprogina, poligodial, tolnaftato, ácido undecilénico y cristal violeta.
En algunas realizaciones, el agente activo adicional es un inhibidor de cinasa. Los inhibidores de cinasa adecuados incluyen, entre otros, uno o más inhibidores de p38 MAPK (tales como VX-702, SB203580, VX-745, LY2228820, BIRB 796 (Doramapimod), PH-797804 y TAK-715) e inhibidores de PI3K de clase I (como AS-605240, BYL719, CAL-101, GDC-0941 (sal de bismesilato), GDC-0941 (base libre), GSK2636771, IC-87114, IPI-145, LY294002, NVP-BKM120 (Buparlisib), PIK-75, TG100-115 y TGX-221).
Tal como se ha analizado anteriormente, una dosis adecuada puede definirse como una dosis que no induce apoptosis, es decir, una dosis no inductora de apoptosis. En algunas realizaciones, una dosis adecuada puede definirse como una "dosis baja" o una "cantidad baja" del agente (por ejemplo, compuesto oligopeptídico, que puede verse como una dosis o cantidad que no es suficiente para causar o inducir apoptosis directa o indirectamente. Como alternativa a lo observado, una "dosis baja" o "cantidad baja" del agente es una dosis o cantidad que es una dosis o cantidad eficaz para reducir o inhibir la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre.
Por consiguiente, una dosis o cantidad alta puede verse como una dosis o cantidad eficaz que es suficiente para causar o inducir apoptosis directa o indirectamente (es decir, dosis citotóxicas o dosis que dan como resultado una sensibilidad aumentada a otros agentes citotóxicos o citostáticos).
La dosis o cantidad eficaz de agente puede depender de las características del péptido, por ejemplo, la fuerza de la interacción entre el motivo de interacción con PCNA y el dominio de unión de la proteína o proteínas diana. Además, la dosis o cantidad eficaz del agente puede depender de la naturaleza del compuesto utilizado (es decir, péptido, molécula de ácido nucleico, etc.), el modo de administración, el curso del tratamiento, la edad y el peso del paciente, la indicación médica, el cuerpo o el área del cuerpo a tratar, y puede variarse o ajustarse según se elija. Sin embargo, en general, una dosis o cantidad baja puede dar como resultado un intervalo de concentración activo de aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,50, 1,75, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 a 10 j M, por ejemplo, de 0,01 a 10 j M, por ejemplo, de 0,05 a 7,5 j M, tal como de 0,1 a 7,5 j M, por ejemplo, de 0,5 a 5 j M. Una dosis o cantidad alta puede dar como resultado un intervalo de concentración activo de aproximadamente 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 a 50 j M, por ejemplo, de 1,0 a 50 j M, por ejemplo, de 2,0 a 40 j M, tal como de 3,0 a 30 j M, por ejemplo, de 5,0 a 25 j M. Dichas concentraciones se determinan por referencia a la cantidad del propio compuesto y, por lo tanto, deben hacerse las concesiones apropiadas para tener en cuenta la pureza de la composición.
El sujeto es un animal (es decir, cualquier animal humano o no humano), preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano.
El experto en la materia conocerá bien los métodos adecuados para introducir los agentes tal como se definen en el presente documento en las células. A modo de ejemplo, algunos métodos adecuados se analizan brevemente a continuación. Tal como se ha analizado con detalle anteriormente, se pueden usar métodos de administración mediados por péptidos, en particular péptidos penetrantes de células (CPP), que como se discutió anteriormente, son secuencias cortas, en algunos casos policatiónicas, que pueden facilitar la captación celular de péptidos, proteínas o moléculas de nucleótidos que contienen CPP o a las que se unen las CPP, por ejemplo mejorando la captación en endosomas de células de mamífero. Tal como se ha mencionado anteriormente, el compuesto oligopeptídico definido en el presente documento comprende un CPP. Sin embargo, pueden ser útiles mecanismos adicionales para facilitar la absorción de los agentes de la invención, particularmente para agentes que comprenden o consisten en moléculas de ácido nucleico. La microencapsulación proporciona una manera simple y rentable de encerrar materiales bioactivos dentro de una membrana polimérica semipermeable con el propósito de proteger los materiales bioactivos y liberar las sustancias encerradas o sus productos de manera controlada. En la internalización fotoquímica (PCI) tanto la molécula de interés como un compuesto fotosensibilizante son absorbidos por la célula en un lisosoma o endosoma. A continuación, las células se exponen a la luz de longitudes de onda adecuadas para activar el compuesto fotosensibilizante, haciendo que el compuesto fotosensibilizante rompa la membrana del lisosoma o endosoma, liberando así la molécula de interés en el citosol de la célula.
Otros métodos incluyen microinyección, fusión mediada por fantasmas de glóbulos rojos, fusión de liposomas, lisis osmótica de pinosomas, carga de raspado, electroporación, transfección mediada por fosfato de calcio y virus y el uso de vehículos copoliméricos.
El quitosano y derivados de quitosano solubles en agua, en particular glicol quitosano, están emergiendo como los vehículos de medicamentos de elección debido a su biocompatibilidad y biodegradabilidad in vivo. Un ejemplo preferido es el glicol quitosano modificado hidrofóbicamente con ácido 5 p-colánico.
A continuación se describirá en detalle la invención con referencia a los siguientes ejemplos y figuras no limitantes en los que:
La Figura 1 muestra que ATX-101 (SEQ ID NO: 1198, que contiene el motivo APIM, RWLVK (SEQ ID NO: 28)) afecta las vías MAPK y PI3K/Akt en líneas celulares de mieloma múltiple, en donde: (A) muestra el crecimiento celular (ensayo MTT) de células JJN-3 sin tratar (♦) y después de la adición de ATX-101 6 j M (▲), LY2940025 j M (inhibidor de PI3K de clase I) y SB20358 10 j M (inhibidor de MAPK p38) (•) (panel izquierdo y derecho, respectivamente), y combinación de ATX-101 e inhibidor de cinasa (□). Los datos provienen de un experimento representativo de cada tres; y (B) muestra la cuantificación de cinasa p70 S6 Thr389, Akt Ser473, fosforilación de ERK1 Thr202/Tyr204 y ERK2 Thr185/Tyr187 en células JJN-3 después de 4, 8 y 24 h de tratamiento con ATX-101 6 j M mediante análisis por transferencia de Western. Los niveles de cinasa fosforilada se corrigieron para las diferencias de carga (p-tubulina) y se normalizaron a las células de control no tratadas. Los datos provienen de tres experimentos independientes (media ± DT).
La Figura 2 muestra que ATX-101 reduce la secreción de citocinas de monocitos después de la estimulación TLR, en donde: (A) y (B) muestran el análisis multiplexado de niveles de citocinas producidos por monocitos de sangre periférica después de 4 h de tratamiento con ATX-101 4 j M en combinación con 10 ng/ml de LPS (A) y estimulación de 40 jg/m l de polilC (B). Los niveles de citocinas medidos se normalizaron a los niveles de citocinas de monocitos estimulados con ligando TLR solo. Un aumento de dos veces o más en el nivel de citocinas después de la estimulación de TLR se definió como inducción de citocinas. Los datos son de tres donantes (media ± DT); (C) muestra un ELISA de los niveles de IFN-p producidos por monocitos de sangre periférica de cinco donantes. Los monocitos aislados se estimularon con 10 ng/ml de LPS y 40 jg/m l de polilC solo y en combinación con ATX-101 4 j M durante 4 h. El donante 1 se trató con ATX-101 6 j M. # Bajo el intervalo lineal; a sobre el intervalo lineal; y (D) muestra una imagen de fluorescencia confocal de PCNA teñido con inmunofluorescencia (verde) en monocitos de sangre periférica recién aislados. Se utilizó DRAQ5 para la tinción nuclear (rojo). Barra, 5 jm .
La Figura 3 muestra que ATX-101 reduce la fosforilación de Akt en monocitos, en donde: (A) muestra un análisis por transferencia de Western de la fosforilación de Akt Ser473 en monocitos de sangre periférica estimulados con 10 ng/ml de LPS y 40 |jg/ml de polilC solo y en combinación con ATX-101 4 jM durante 4 h. El panel superior muestra la cuantificación de Akt fosforilada corregida por diferencias de carga (p-tubulina) y normalizada a células de control no tratadas. Los datos provienen de un donante representativo de cada tres; y (B-E) muestran un análisis multiplexado de niveles de citocinas producidos por monocitos de sangre periférica estimulados con 10 ng/ml de LPS (B y D, mismo donante) y 40 jg/m l de polilC (C y E, mismo donante) después de 4 h. (B y C) Los monocitos estimulados se trataron con ATX-101 4 jM , SB203580 10 jM (inhibidor de p38 MAPK) y una combinación de ATX-101 y SB203580. (D y E) Se trataron monocitos estimulados con ATX-101 4 jM y LY2940025 y 10 jM (inhibidor de PI3K de clase I), y una combinación de ATX-101 y LY294002. Los niveles de citocinas medidos se normalizaron a los niveles de citocinas de monocitos estimulados con ligando TLR solo. Un aumento de dos veces o más en el nivel de citocinas después de la estimulación de TLR se definió como inducción de citocinas. # El valor es demasiado bajo para ser visible en el diagrama de columnas; La medición de a-citocinas estaba fuera del intervalo. Los datos provienen de experimentos representativos de dos.
La Figura 4 muestra que ATX-101 reduce la fosforilación de Akt y los niveles de proteína PACT en las células HaCaT, en donde: (A) muestra la cuantificación de la fosforilación de Akt Ser473 y los niveles de proteína PACT en células HaCaT tratadas con ATX-101 12 jM , 2 jg/m l de polilC y combinación de ATX-101 y polilC durante 4 h mediante análisis por transferencia de Western. Los niveles de proteína se corrigieron para las diferencias de carga (p-tubulina) y se normalizaron a las células de control no tratadas. Los datos provienen de tres experimentos independientes (media ± DT); y (B) muestra una imagen de fluorescencia confocal de PCNA teñido con inmunofluorescencia en células HaCaT. Barra, 5 jm .
La Figura 5 muestra que ATX-101 reduce la secreción de citocinas de monocitos después de la estimulación TLR, en donde: (A) y (B) muestran el análisis multiplexado de niveles de citocinas producidos por monocitos de sangre periférica después de 4 h de tratamiento con ATX-101 4 jM en combinación con 10 ng/ml de PAM3Cys (A) y estimulación de 10 jg/m l de R848 (B). Los niveles de citocinas medidos se normalizaron a los niveles de citocinas de monocitos estimulados con ligando TLR solo. Un aumento de dos veces o más en el nivel de citocinas después de la estimulación de TLR se definió como inducción de citocinas. La medición de a-citocinas estaba fuera del intervalo. Los datos provienen de uno de cada dos experimentos.
La Figura 6 muestra que ATX-A (SEQ ID NO: 1206, que contiene el motivo RALVK (SEQ ID NO: 1207), que no es capaz de interactuar con PCNA) reduce la secreción de citocinas de monocitos de manera menos eficiente después de la estimulación de TLR, en donde el análisis multiplexado de los niveles de citocinas inducidos por LPS y polilC producidos por monocitos de sangre periférica después de 4 h de tratamiento con ATX-101 4 jM o ATX-A 4 jM en combinación con 10 ng/ml de LPS y 40 jg/m l de polilC (izquierda y panel derecho, respectivamente). Los niveles de citocinas medidos se normalizaron a los niveles de citocinas de monocitos estimulados con ligando TLR solo. Los datos son de un donante. Los presentes inventores obtuvieron resultados similares para la secreción de IL-6 en otros dos donantes.
La Figura 7 muestra que el inhibidor de Akt SC66 reduce la secreción de citocinas de los monocitos a los niveles basales o por debajo de ellos después de la estimulación de TLR, en donde el análisis multiplexado de los niveles de citocinas producidos por monocitos de sangre periférica después de 4 h de tratamiento con ATX-101 4 jM y 1 jg/m l de SC66 en combinación con 10 ng/ml de LPS (panel izquierdo) y estimulación con 40 jg/m l de polilC (panel derecho). Los niveles de citocinas medidos se normalizaron a los niveles de citocinas de monocitos estimulados con ligando TLR solo. Un aumento de dos veces o más en el nivel de citocinas después de la estimulación de TLR se definió como inducción de citocinas. # El valor es demasiado bajo para ser visible en el diagrama de columnas; La medición de a-citocinas estaba fuera del intervalo. Los datos provienen de uno de cada dos experimentos.
La Figura 8 muestra un gráfico que muestra los resultados del análisis FRET. Las mediciones de FRET normalizada (Nfret) se muestran entre EYFP (proteína fluorescente amarilla)/ECFP (proteína fluorescente cian) (carril 1, actividad de fondo debido a la dimerización de los marcadores). en los otros carriles se muestran EYFP-motivo APIM/ECFP-PCNA para varios motivos.
Ejemplos
Antecedentes de los experimentos
Los inventores han determinado que más de 20 cinasas de señalización diferentes, principalmente citoplasmáticas, contienen una secuencia APIM, lo que sugieren que interactúan con PCNA. Estos incluyen tres miembros directos de la vía PI3K/Akt (p110-a, p110-Y y PI3K-C2p) y varias cinasas que afectan directa o indirectamente a las vías MAPK (ERK8, MK2, m K5, MSt 4 y TAO2). Hasta ahora, el PCNA no se ha relacionado con la transducción de señales. Los inventores han determinado que el PCNA juega un papel en las vías de transducción de señales aguas abajo de los TLR. Los inventores han establecido que las vías de transducción de señales pueden alterarse dirigiendo compuestos oligopeptídicos de PCNA que comprenden un motivo APIM. Se cree que estos compuestos compiten con PCNA por las proteínas que interactúan con PCNA. Los efectos de los compuestos oligopeptídicos que comprenden un motivo APIM en las vías de transducción de señales se han establecido usando un péptido ATX-101 que contiene APIM penetrante en células ilustrativo (SEQ ID NO: 1198, que contiene el motivo AP iM, RWLVK (SEQ iD NO: 28)).
Los inventores han descubierto sorprendentemente que el tratamiento con ATX-101 redujo la secreción de citocinas de los monocitos de sangre periférica después de la estimulación con diferentes ligandos de TLR y redujo la fosforilación de Akt. Estos datos indican que la focalización en PCNA afecta a las vías de transducción de señales, incluidas las vías PI3K/Akt y MAPK, probablemente por inhibición de la unión a PCNA de las proteínas de señalización que contienen la secuencia APIM. Estos datos sugieren un papel regulador del PCNA en la transducción de señales y los péptidos que contienen APIM serán útiles en el tratamiento o prevención de un trastorno o afección asociada con la liberación de citocinas de células inmunitarias no proliferantes en sangre, tal como un trastorno o afección resultante de, o asociado con, la hipercitocinemia.
Materiales y métodos
Líneas celulares
Las líneas celulares de mieloma múltiple JJN-3 (obsequio de J. Ball, Universidad de Birmingham, Reino Unido) se cultivaron en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) suplementado con un FCS al 10 %, glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), 2,5 pg/ml de anfotericina B (Sigma-Aldrich) y 100 pg/ml de gentamicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células HaCaT (queratinocitos transformados espontáneamente) se cultivaron en DMEM (Sigma-Aldrich) que contenía FCS, glutamina, anfotericina B y gentamicina. Todas las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %.
Aislamiento y estimulación de monocitos de sangre periférica
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de capas leucocíticas A+ (Banco de sangre, Hospital Universitario St. Olav, Trondheim, Noruega) mediante centrifugación en gradiente de densidad (Lymphoprep; Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega). Se sembraron células mononucleadas a 4 millones de células/ml en RPMI 1640 sin suero suplementado con glutamina y gentamicina. Después de 60-90 min, la población de células adherentes se lavó antes de cultivarla en medio con suero humano inactivado por calor al 10 % (Blood Bank, Hospital Universitario St. Olav). ATX-101 (4 pM [Innovagen, Lund, Suecia]), ATX-A (4 pM, [Innovagen]) (ATX-A se representa en la SEQ ID NO: 1206 y contiene el motivo RALVK (SEQ ID NO: 1207), que no es capaz de interactuar con PCNA), inhibidor de p38 (SB203580, 10 pM, [Sigma-Aldrich]), Inhibidor de PI3K (LY294002, 5 y 10 pM, [Sigma-Aldrich]) e inhibidor de Akt (inhibidor de Akt XVIII SC66, 1 pg/ml, [Sigma-Aldrich]) se agregaron en medio sin suero y se incubaron durante 5 min antes de LPS (10 ng/ml, [Sigma-Aldrich]), polilC (40 pg/ml, [GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido]), PAM3Cys (10 ng/ml, [Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.]) o R848 (10 pg/ml, [Invivogen]) se añadieron en medio que contenía suero. Las células se incubaron durante 4 h antes de recolectar y congelar los sobrenadantes antes de un análisis de citocinas adicional mediante el ensayo 27-plexado (ensayo Bio-Plex ProTM Human cytokine 27-plex).
Preparación de extractos celulares y análisis por transferencia de western
Las células mononucleadas se sembraron y estimularon como se describió anteriormente. Las células JJN-3 se trataron con ATX-101 (6 pM) durante 4 h. Las células HaCaT se trataron con ATX-101 (12 pM), polilC (2 pg/ml) y LPS (100 ng/ml) durante 4 h. Se recolectaron las células, el sedimento celular se resuspendió en 1x volumen de células empaquetadas de tampón 1 (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, KCl 200 mM) y se diluyó en el mismo volumen (tampón de volumen de células empaquetadas 1) de tampón 2 (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, KCI 200 mM, EGTA 10 mM, MgCh 10 mM, glicerol al 40 %, n P40 al 0,5 %, DTT 1 mM, cócteles 1 y 3 de inhibidor de la fosfatasa al 1 % [Sigma-Aldrich], inhibidor de proteasa completo sin EDTA al 2 % [Roche, Oslo, Noruega] y 2 pl/ml de Omnicleave [Epicenter Technologies, Madison, WI, EE.UU.]). Después de la incubación durante 1,5 h a 4 °C, los extractos celulares se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min. Los sobrenadantes se recogieron y separaron en geles de Bis-Tris-HCl al 10 % (NuPAGE, Invitrogen). Después de la electroforesis en gel, las membranas de fluoruro de polivinilideno (Immobilion, Millipore, Oslo, Noruega) se bloquearon en tampón de bloqueo Odyssey al 50 % (LI-COR Bioscience, Cambridge, Reino Unido) en TBS. Los anticuerpos primarios contra (a) P-Akt (monoclonal, Cell Signaling, Beverly, MA, EE.UU.), PACT (monoclonal, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EE. UU.), P-p70 S6 cinasa (monoclonal, Cell Signaling), P-ERK1/2 (monoclonal, Cell Signaling) y p-tubulina (policlonal, Abcam, Cambridge, Reino Unido), así como los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, a-680RD de conejo en cabra y a-800CW de ratón en cabra (LI-COR) se diluyeron en tampón de bloqueo Odyssey al 20 % en TBST (TBS con Tween 20 al 0,1 %). Las proteínas se visualizaron con el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR) y se cuantificaron utilizando Odyssey Image Studio V2. Los niveles de proteína se compararon con el nivel de proteína en células no tratadas, que se estableció en 100 %. Se utilizó p-tubulina como referencia para la normalización de los datos.
Inmunofluorescencia e imagen confocal
Se cultivaron células HaCaT y monocitos de sangre periférica en placas con fondo de vidrio y se tiñeron como se describe usando un anticuerpo a-PCNA (PC10, Santa Cruz biotechnology Inc.; 1:1000) y a-Alexa flúor 532 de ratón en cabra (Invitrogen). Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 antes de la obtención de imágenes de acuerdo con el manual del fabricante (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.). Las imágenes fluorescentes se adquirieron utilizando un microscopio de barrido láser Zeiss LSM 510 Meta equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochromate 63 x/1,4 en FCS al 2 % en PBS a temperatura ambiente utilizando el programa informático Zeiss LSM 510. Las células teñidas se excitaron a A = 543 nm y se detectaron en A> = 560-615 para Alexa flúor 532. DRAQ5 se excitó a A = 633 nm y se detectó a A> 650 nm. El espesor del corte fue de 1 pm. Todas las imágenes se adquirieron con barridos consecutivos. No se realizó ningún procesamiento de imágenes, excepto los ajustes de contraste e intensidad. ELISA de IFN-p
Los monocitos se estimularon como se describió anteriormente. El IFN-p se midió en los sobrenadantes con el kit ELISA de suero de IFN-p VeriKine-HST-MHuman (Pestka Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes adaptaciones: la cantidad de sobrenadante se duplicó de 50 a 100 pl; el tampón de muestra se redujo de 50 a 25 pl; y la solución de anticuerpo se redujo de 50 a 25 pl (diluyente de ensayo reductor, manteniendo el mismo volumen de concentrado de anticuerpo y aditivo diluyente). Se midió la DO a 450 nm.
Ensayo de supervivencia celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se añadieron ATX-101, inhibidores de cinasa (SB203580 y BIRB0796) y polilC solos o en combinación a las concentraciones indicadas. Las células se expusieron continuamente y se recolectaron todos los días durante los siguientes cuatro días utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio) (Gilljam et al., 2009, citado anteriormente). Se utilizó el promedio de al menos 4 pocillos para calcular la supervivencia celular.
Ejemplo 1: El direccionamiento a PCNA con péptidos que contienen APIM afecta a la transducción de señales en células de mieloma múltiple
Las células de mieloma múltiple secretan citocinas y responden a varios factores estimulantes del crecimiento de su microambiente tumoral en bucles de retroalimentación positiva que apoyan el crecimiento de las células de mieloma. Las vías MAPK y PI3K/Akt se han sugerido como posibles dianas terapéuticas en el mieloma múltiple, solas y en combinación porque estas vías con frecuencia están desreguladas y existe una interrelación extensa entre estas vías. Además, estas vías son importantes para la producción de citocinas.
Los presentes inventores descubrieron que ATX-101 aumentó el efecto inhibidor del crecimiento de MAPK p38 y los inhibidores de PI3K de clase I en la línea celular de mieloma múltiple JJN-3 (Figura 1A). Además, ATX-101 aumentó los efectos inhibidores del crecimiento de los inhibidores de ERK5 y MAPK cinasa 1 (MEK1) y mejoró los efectos citotóxicos del melfalán en combinación con estos inhibidores, así como el inhibidor p38 en otra línea celular de mieloma múltiple (RPMI-8226). Para dilucidar aún más si ATX-101 afectó directamente a las vías MAPK y PI3K, los presentes inventores analizaron los niveles de fosforilación de cinasas aguas abajo en células JJN-3 en diferentes puntos de tiempo después de la adición de ATX-101. La fosforilación de Akt y la cinasa p70 S6 (aguas abajo de mTOR) disminuyeron ambas mediante el tratamiento con ATX-101. En contraste, se detectó un aumento transitorio en la fosforilación de ERK1/2 tras el tratamiento con ATX-101 (Figura 1B).
Estos resultados indican que ATX-101 afecta a importantes vías de transducción de señales en células de mieloma múltiple, incluidas las vías PI3K/Akt/mTOR y MAp K.
Ejemplo 2: El direccionamiento a PCNA con péptidos que contienen APIM reduce la secreción de citocinas de los monocitos después de la estimulación de TLR
A continuación, los presentes inventores investigaron si ATX-101 podría afectar la secreción de citocinas de los monocitos primarios, que está parcialmente regulado por las vías PI3K/Akt y MAPK. Los presentes inventores estimularon monocitos de sangre periférica con diferentes ligandos de TLR para inducir la producción de citocinas y midieron la concentración de 27 citocinas en los sobrenadantes de cultivos celulares. La secreción de citocinas inducidas por LPS se redujo eficazmente mediante la adición de ATX-101 (Figura 2A). De forma similar, el tratamiento con ATX-101 redujo la secreción de CXCL10, CCL2, CCL3 y CCL4 después de la estimulación de TLR3 con polilC (Figura 2B). Los presentes inventores descubrieron una reducción similar en la secreción de citocinas inducida por el ligando TLR7/8 R848 y el ligando TLR2 PAM3Cys (Figura 5). Estos resultados muestran que el direccionamiento a PCNA con péptidos que contienen APIM afecta a la producción de citocinas. Es probable que el mecanismo sea la inhibición de múltiples interacciones cinasa-PCNA, afectando a las vías de señalización aguas abajo de las proteínas adaptadoras de TLR porque el tratamiento con ATX-101 redujo la secreción de citocinas aguas abajo de los TLR dependientes tanto de MyD88 como de TRIF.
El tratamiento con ATX-101 disminuyó la secreción de CXCL10 inducida por polilC y también la producción de nivel basal de esta citocina a partir de monocitos aislados (Figura 2A y B). Los presentes inventores midieron los niveles de IFN-p en sobrenadantes de monocitos estimulados con LPS y polilC porque la inducción de la expresión de CXCL10 es un evento secundario y requiere la secreción inicial de IFN-p. De acuerdo con la secreción reducida de CXCL10, el tratamiento con ATX-101 también disminuyó la secreción de IFN-p, apoyando que ATX-101 afecta a la señalización aguas abajo del adaptador de TLR TRIF (Figura 2C). De manera importante, el tratamiento con ATX-101 a la concentración utilizada no indujo apoptosis en los monocitos. Además, una versión mutante de ATX-101, ATX-A que no se une a PCNA, fue incapaz o menos eficaz para disminuir la secreción de citocinas en comparación con ATX-101 (Figura 6). Por lo tanto, estos resultados indican que ATX-101 afecta a la secreción de citocinas al dirigirse específicamente a PCNA. Los monocitos contienen cantidades sustanciales de PCNA en el citoplasma en comparación con, por ejemplo, las células HeLa (Figura 2D). En conjunto, estos datos muestran que el PCNA puede tener un papel regulador en la respuesta inmunitaria innata.
Ejemplo 3: La reducción de la fosforilación de Akt por péptidos que contienen APIM probablemente esté afectando a la producción de citocinas en monocitos estimulados por TLR
La activación de NF-kB, las MAPK y la vía PI3K/Akt son características importantes después de la activación de TLR, y los resultados de los presentes inventores indican que ATX-101 afecta a dos de estas vías en la línea celular de mieloma múltiple JJN-3 (Figura 1). Para examinar si ATX-101 afectó a la vía PI3K/Akt en monocitos similar a las células JJN-3, los presentes inventores analizaron los niveles de fosforilación de Akt en monocitos. La fosforilación de Akt inducida por LPS y polilC, así como el nivel de fosforilación de Akt basal, se redujo mediante el tratamiento con ATX-101 (Figura 3A). Para investigar más a fondo si ATX-101 redujo o aumentó el efecto de inhibidores específicos de PI3K, Akt y p38 MAPK con respecto a la producción de citocinas similar al crecimiento celular reducido observado en las células JJN-3 (Figura 1A), los presentes inventores midieron la secreción de citocinas de monocitos estimulados con LPS y polilC en presencia de inhibidores de cinasa solos y en combinación con ATX-101.
Tanto ATX-101 como un inhibidor de MAPK p38 redujeron la secreción de citocinas de los monocitos estimulados, y la combinación de ATX-101 e inhibidor dio como resultado una mayor reducción de la mayoría de las citocinas (Figura 3B y C). Por otro lado, el inhibidor de PI3K LY294002 tuvo menos efecto sobre la secreción de citocinas inducida sola y en combinación con ATX-101, pero aun así, la combinación mostró una reducción en la secreción de algunas citocinas (por ejemplo, IFNy, IL-1 Ra , IL-2, 4 y 9 después de LPS e IL-1 RA, CCL2, 3 y 4 después de la estimulación con polilC) (Figura 3D y E). La inhibición directa de Akt, la cinasa central más abajo en la vía Pl3K redujo la secreción de todas las citocinas a los niveles basales o por debajo de ellos, indicando un papel vital en la regulación de citocinas (Figura 7); sin embargo, esta fuerte respuesta de agente único del inhibidor (en ausencia de apoptosis) no permitió el examen de su combinación con ATX-101. En resumen, estos resultados verifican que tanto la vía de MAPK p38 como la vía de PI3K/Akt son importantes para la secreción de citocinas de los monocitos, e indican que la focalización de PCNA con péptidos APIM potencia el efecto de inhibir estas vías. Por lo tanto, los resultados se muestran en la Figura 1, es decir, mayor inhibición del crecimiento celular por ATX-101 solo y en combinación con inhibidores de la vía MAPK y PI3K y reducción de la activación de Akt después del tratamiento con ATX-101 en células JJN-3, se correlacionan con una producción reducida de citocinas y una activación reducida de Akt en los monocitos. Estos datos respaldan aún más que PCNA tiene un papel regulador en la transducción de señales, afectando tanto al crecimiento celular como a la producción de citocinas.
Ejemplo 4: Los péptidos que contienen APIM reducen la fosforilación de Akt y los niveles de proteína PACT en los queratinocitos HaCaT
Para respaldar aún más el posible papel regulador de PCNA en la respuesta celular a los agonistas de TLR, los presentes inventores usaron la línea de células de queratinocitos humanos HaCaT que expresa TLR3 funcional y responde al tratamiento con polilC. Los presentes inventores examinaron los niveles de fosforilación de Akt en células HaCaT y descubrieron que el tratamiento con ATX-101 reducía la fosforilación de Akt en células estimuladas y no estimuladas de forma similar a las células JJN-3 y los monocitos (Figura 4A). Los queratinocitos humanos responden a polilC a través de los conocidos receptores de detección de ARNdc TLR3, PKR, RIG-I y MDA5. La proteína PACT que contiene APIM de unión a ARNdc es un activador de PKR y RIG-I. Por lo tanto, PACT puede interactuar con PCNA y esta interacción puede tener un papel regulador en la respuesta a polilC en células HaCaT. Por lo tanto, los presentes inventores examinaron los niveles de proteína PACT en células HaCaT tratadas con polilC y ATX-101, y una combinación de ambos.
La adición de ATX-101 a las células no estimuladas no tuvo un efecto claro sobre el nivel de proteína PACT, pero la adición de ATX-101 redujo aún más el nivel de proteína de PACT en células estimuladas con polilC (Figura 4A). El péptido mutante ATX-A tuvo menos efecto sobre la fosforilación de Akt y los niveles de proteína PACT que ATX-101 de manera similar a lo que observaron para la secreción de citocinas. Por lo tanto, estos datos indican que los péptidos APIM afectan a la vía PI3K/Akt así como los niveles de proteína PACT en respuesta a polilC en células HaCaT. Los presentes inventores hipotetizaron que los péptidos APIM interfieren con varias vías de transducción de señales al dirigirse a las interacciones de PCNA con proteínas de señalización citoplasmática como PACT. El PCNA se detecta principalmente en el núcleo de las células HaCaT, pero algunas células también contienen PCNA en el citoplasma (Figura 4B).
Discusión
Los presentes inventores muestran que el direccionamiento a PCNA con un péptido que contiene APIM, por ejemplo, ATX-101, afecta a la respuesta celular a los agonistas de TLR, apoyando un papel del PCNA en las respuestas al estrés celular. El tratamiento con ATX-101 redujo la secreción de citocinas de los monocitos y disminuyó la fosforilación de Akt en monocitos y células HaCaT estimuladas con diferentes ligandos de TLR. La secuencia de APIM se encuentra en más de 200 proteínas, incluidas varias cinasas de señalización que se ha descrito que actúan en la señalización de TLR. Por lo tanto, es probable que ATX-101 afecte a varias vías de transducción de señales.
Nuestros datos indican que ATX-101 regula negativamente la vía PI3K/Akt, un regulador conocido de la producción de citocinas como se muestra usando el inhibidor de Akt SC66. Por lo tanto, la activación reducida de Akt probablemente contribuye a la disminución de la secreción de citocinas de los monocitos estimulados por TLR tras el tratamiento con ATX-101.
En sus experimentos, los presentes inventores no observaron una fuerte inducción de IL-12 por los ligandos de TLR probados; sin embargo, el tratamiento con ATX-101 redujo el nivel basal de IL-12 (Figura 2A y Figura 5). Por lo tanto, ATX-101 también puede afectar a la secreción de citocinas al interferir con la señalización de PI.
Los datos de los presentes inventores sugieren que ATX-101 no redujo la secreción de citocinas por su péptido que penetra en las células, sino más bien el direccionamiento a PCNA a través de la secuencia APIM porque el ATX-A mutante con un solo cambio de aminoácido en APIM redujo la secreción de citocinas mucho menos que ATX-101. Los pequeños efectos observados de ATX-A probablemente se deben a que ATX-A todavía tiene una débil capacidad de unión a PCNA.
Inicialmente, los presentes inventores descubrieron que ATX-101 interfería con las vías de transducción de señales, incluida la vía PI3K/Akt en la línea celular de mieloma múltiple JJN-3 independientemente de la estimulación de TLR. Por tanto, el efecto mediado por ATX-101 sobre las vías de transducción de señales no se limita a la señalización TLR. El objetivo celular de ATX-101 es PCNA y, por lo tanto, los datos de los presentes inventores sugieren una nueva función reguladora de PCNA en las vías de señalización probablemente actuando como plataforma de unión citoplasmática. Por lo tanto, las interacciones de PCNA mediadas por APIM juegan un papel en la respuesta de estrés celular a los patógenos y los patrones moleculares asociados al daño reconocidos por los TLR. ATX-101 reduce la secreción de citocinas de los monocitos en dosis que no inducen apoptosis.
Ejemplo 5: Caracterización informática del motivo consenso APIM
Los inventores han realizado análisis de secuencia para determinar cuánta variación se produce de forma natural dentro del motivo APIM, es decir, en secuencias nativas en varias especies. Como el PCNA está altamente conservado en organismos eucariotas, se espera que la variación de secuencia del motivo APIM en ortólogos de polipéptidos, que se cree que interactúan con PCNA, sea representativa de la variación que se puede usar en los compuestos oligopeptídicos de la invención, es decir, variación de aminoácidos dentro del motivo APIM en algunas posiciones, particularmente X3 y X4, puede permitirse sin perder afinidad con PCNA.
Los inventores utilizaron 657 secuencias polipeptídicas humanas identificadas que comprenden el motivo [K/R]-[F/W/Y]-[A/L/V/I]-[A/L/V/I]-[K/R] (SEQ ID NO:19) de unas 21.673 secuencias polipeptídicas posibles. De las 657 secuencias identificadas, se excluyeron 291 porque se disponía de información insignificante sobre la función de los polipéptidos. Se consideró que los 366 restantes eran polipéptidos que probablemente interactuarían con PCNA y estas secuencias se utilizaron para identificar ortólogos en: Bos taurus (288 ortólogos); Rattus norvegicus (286 ortólogos); Mus musculus (312 ortólogos); Gallus gallus (236 ortólogos); Xenopus tropicalis (200 ortólogos); Danio rerio (189 ortólogos); Caenrhabditis elegans (102 ortólogos); Drosophila melanogaster (136 ortólogos); y Saccharomyces cerevisiae (65 ortólogos). La alineación de los dominios de los ortólogos que componen el motivo APIM sugirió que el motivo puede definirse como:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q/C]-[L/I/V/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K/C]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 2),
en donde las combinaciones específicas de aminoácidos en las posiciones 3 y 4 que se identificaron en los ortólogos incluyen:
LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, Al, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK y IR. Combinaciones particularmente comunes son LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS y LT, siendo las más comunes LL, LA, LV, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA y el AI.
Por lo tanto, la definición más amplia del motivo APIM procedió de este análisis, y se podría esperar razonablemente que todos los polipéptidos que comprenden un motivo APIM de acuerdo con esta definición interaccionen con, es decir, se unan a, PCNa .
Ejemplo 6: Caracterización in vivo del motivo consenso APIM
Este trabajo descrito en este Ejemplo investiga la interacción entre péptidos APIM y PCNA.
En células vivas en fase S, el PCNA marcado con proteína verde fluorescente (EGFP) forma focos distintos que representan sitios de replicación y, por lo tanto, se puede utilizar como marcador de fase S.
El PCNA marcado con proteína fluorescente cian (ECFP) se expresó conjuntamente con varias construcciones de péptidos APIM fusionados con proteína fluorescente amarilla (EYFP). Para examinar el grado de proximidad de los péptidos APIM y PCNA, se midió la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés).
Se examinaron células HeLa vivas 16-24 horas después de la transfección transitoria (mediante Fugene 6 (Roche Inc.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante) de las construcciones de fusión ECFP y EYFP. Las imágenes fluorescentes se obtuvieron utilizando un microscopio de barrido láser Zeiss LSM 510 Meta equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochromate 63x/1.4. La proteína fluorescente cian mejorada (ECFp , por sus siglas en inglés) se excitó a A = 458 nm y se detectó a A = 470-500 nm y la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, por sus siglas en inglés) se excitó a A = 514 nm y se detectó a A = 530-600 nm, utilizando exploraciones consecutivas. El espesor del corte fue de 1 pm.
La transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) ocurre si los marcadores (EYFP y ECFP) están separados por menos de 100 A (10 nm). Se detectaron FRET usando el método de emisión sensibilizada, que mide la emisión del aceptor (EYFP) tras la excitación del donante (ECFP). Se tuvo FRET cuando la intensidad de la luz emitida por EYFP después de la excitación del fluorocromo ECFP era más fuerte que la luz emitida por las proteínas ECFP o marcadas con EYFP solas, después de la excitación con los láseres EYFP y ECFP respectivamente (filtrado), dada por la ecuación: FRET= I2 - I1 (Id 2/Id i ) - I3 (U2/U3) es >0. FRET se normalizó para los niveles de expresión usando la ecuación: Nf r e t = FRET/ (I1 x I3)10 La Nf r e t se calculó a partir de las intensidades medias (I) dentro de una región de interés (ROI) que contenía más de 25 píxeles donde todos los píxeles tenían intensidades por debajo de 250 y las intensidades medias estaban entre 100 y 200 tanto para las construcciones donante como aceptora. Se midieron los canales 1 (ECFP) y 3 (EYFP) como se describe anteriormente para la formación de imágenes, y el canal 2 (FRET) se excitó con A = 458 nm y se detectó a A = 530-600 nm. Id 1, d 2, d3 e Ia 1, a 2, a 3 se determinaron para las células transfectadas con construcciones ECFP y EYFP solamente, con los mismos ajustes y las mismas intensidades de fluorescencia que las células transfectadas conjuntamente (Ii e I3). ECFP-PCNA y EYFP-PCNA se incluyeron como controles positivos y, debido a la dimerización de los marcadores expresados conjuntamente, las proteínas ECFP y EYFP expresadas a partir de vectores vacíos se incluyeron como controles negativos en todos los experimentos.
La Figura 8 muestra que podría detectarse una señal FRET significativa para todas las variantes probadas, lo que verifica que una variedad de péptidos dentro de la definición del motivo APIM descrita en el presente documento (y que ocurren en polipéptidos que se espera que interactúen con PCNA) son capaces de interactuar con PCNA y, por lo tanto, se esperaría que encontrara utilidad en el método y usos descritos en el presente documento, es decir, como péptidos inmunosupresores, por ejemplo, para inhibir o prevenir la liberación de citocinas para células inmunitarias que no proliferan en la sangre y tratar o prevenir trastornos o afecciones asociadas con las mismas.
Ejemplo 7: Identificación de proteínas citosólicas implicadas en la señalización celular que interactúan con PCNA
Varias proteínas citosólicas contienen APIM, lo que sugiere que pueden interactuar con PCNA. Con el fin de investigar adicionalmente el mecanismo, el inventor realizó experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) de PCNA en extractos de células HaCaT reticuladas usando una baja concentración de formaldehído para preservar los complejos de proteínas en su conformación in vivo. El eluato se separó en un gel y los trozos de gel se sometieron a digestión tríptica y Orbitrap-MS. Se usó un anticuerpo simulado específico para TOM20 en un ensayo de co-IP de control. Proteínas relevantes detectadas por MS en el ensayo de interacción (pull down) de PCNA, pero no en el ensayo de interacción de simulación, se enumeran en la Tabla 3.
Las proteínas que contienen APIM detectadas incluyen MST4 y PLK3, que participan en la regulación de ERK y Akt respectivamente. También se detectó proteína PACT. Estas proteínas están involucradas en las vías de expresión de citocinas y quimiocinas. PCNA también eliminó la proteína BRE que contiene APIM, una proteína que forma parte del complejo BRCA-1 en los núcleos y del complejo BRISK en el citosol, que recientemente se descubrió que participan en la regulación de la apoptosis inducida por TNF. Una proteína de caja PIP interesante identificada fue la TAB2, que participa en la retroalimentación positiva en un complejo de cinasa en la señalización de NFkB. En conjunto, se detectaron 20 proteínas que contenían APIM y 23 proteínas que contenían cajas PIP exclusivamente en la extracción de PCNA en ausencia de estrés celular.
Un anticuerpo simulado idealmente debería dirigirse a una proteína no relacionada. Sin embargo, como PCNA tiene muchos miembros de interacción y probablemente actúa como un centro de señalización en el citoplasma, es difícil obtener un anticuerpo simulado ideal. De hecho, la proteína simulada elegida aquí (TOM20) fue detectada en el ensayo de interacción de PCNA por MS (puntuación Mascot de 32,53, no detectada por Sequest; no se muestran los datos). La Tabla 4 incluye varias proteínas interesantes que no se encuentran exclusivamente, pero están enriquecidas, en el ensayo de interacción de PCNA en comparación con el ensayo de interacción simulado, basado en el número de péptidos detectados y la puntuación Mascot/Sequest. Estos incluyen varias proteínas en las vías MAPK, incluyendo TAO3, MAPKK3, Er K i /2 y las proteínas MK2 y Ta OI que contienen APIM. Aktl y p38 alfa también se enriquecieron en el ensayo de interacción de PCNA, sin embargo, estas proteínas se detectaron en trozos de gel correspondientes a diferentes pesos moleculares del ensayo de interacción de a-PCNA y a-simulacro, lo que sugiere que la regulación por PTM es importante para su localización en complejos de PCNA. El PACT de proteína APIM se detectó a partir de la pieza de gel con el peso molecular (PM) esperado de PACT en la extracción de PCNA solamente (Tabla 3). Se descubrió PACT tanto en PCNA como en simulacro de extracción (menos en simulacro) y en una pieza de gel con un peso molecular de 5 a 10 kDa superior al previsto (Tabla 4). El aumento en el peso de la molécula sugiere que PACT puede estar regulado por PTM, por ejemplo, poliubiquitinación que conduce a la degradación. La estimulación de las células HaCat con polilC y ATX-101, y la combinación, condujo a una degradación rápida (4 h) de PACT (Figura 4A). En conjunto, los datos sugieren que PCNA y PACT están en un complejo común, interactuando directamente a través de APIM. En la Tabla 5 se muestra una lista completa de proteínas que contienen un motivo APIM o caja PIP identificado en el ensayo de interacción.
T l
Figure imgf000036_0003
T l 4
Figure imgf000036_0001
Tabla 5
Figure imgf000036_0002
(continuación)
Figure imgf000037_0001
Ejemplo 8: Determinación del nivel de apoptosis en células inmunitarias no proliferantes (monocitos) de la sangre cuando se tratan con péptidos que contienen APIM
Se usó tinción con anexina para determinar la viabilidad celular y las células se contaron usando citometría de flujo. Se aislaron linfocitos de sangre periférica de capas leucocíticas A+ (Blood Bank, St. Olav's University Hospital) mediante centrifugación en gradiente de densidad (Lymphoprep; Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega). La fracción de células adherentes después de 90 minutos de incubación, denominados monocitos, se lavaron dos veces con HANKS y se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM, 100 mg/ml de gentamicina y HS al 25 % inactivado por calor durante la noche. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con diferentes concentraciones de péptidos que contienen APIM ATX-101 (SEQ ID NO: 1198) y ATX-P (MDRWLVPWKKKRKIRRRRRRRRRR, SEQ ID NO: 1208). Como controles se utilizaron un tratamiento con péptido R11 y sin péptido. Después de 4 horas, las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en tampón según lo recomendado por el fabricante del kit Annexin V-Pacific Blue

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un agente o composición que contiene un agente, para su uso en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de las células inmunitarias no proliferantes en la sangre, en donde dicho agente comprende:
(i) un compuesto oligopeptídico que comprende un motivo de interacción con PCNA y un péptido de penetración celular (c Pp ), en donde el motivo de interacción con PCNA es X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 2 ) y
en donde:
X1 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K) e Histidina (H);
X2 se selecciona de Triptófano (W), Fenilalanina (F) y Tirosina (Y);
X3 se selecciona de Leucina (L), Isoleucina (I), Valina (V), Alanina (A), Metionina (M), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q) y Cisteína (C);
X4 se selecciona de Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Alanina (A), Metionina (M), Glicina (G), Serina (S), Treonina (T), Asparagina (N), Glutamina (Q), Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Cisteína (C); y
X5 se selecciona de Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H) y Prolina (P); o
(ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el compuesto oligopeptídico de (i).
2. El agente o la composición para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho agente o composición se proporciona como una preparación combinada con uno o más agentes activos adicionales para el uso o la administración separada, simultánea o secuencial.
3. Un kit o producto que contiene un agente o composición para su uso como se define en la reivindicación 1 y uno o más agentes activos adicionales como preparación combinada para el uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de la hipercitocinemia en un sujeto resultante de la liberación de citocinas de células inmunitarias no proliferantes en sangre.
4. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas células inmunitarias no proliferantes presentan el receptor de superficie celular CD14 y/o el receptor de superficie celular CD16, en donde preferentemente dichas células inmunitarias que no proliferan son monocitos.
5. El agente, composición, kit o producto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde los uno o más agentes activos adicionales son un inhibidor de cinasa, un compuesto inmunosupresor, un compuesto antiinflamatorio, compuesto antimicrobiano o un esteroide.
6. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho sujeto tiene:
(A) una infección o enfermedad infecciosa y opcionalmente dicho sujeto también tiene fibrosis quística, preferentemente en donde la infección o enfermedad infecciosa es:
(a) una infección microbiana o una enfermedad infecciosa microbiana, en donde, además, preferentemente la infección microbiana o enfermedad infecciosa microbiana es:
(i) una infección bacteriana o una enfermedad infecciosa bacteriana, tal como síndrome séptico, meningitis bacteriana, neumonía bacteriana, úlceras gástricas, legionelosis, tosferina, salmonelosis o tuberculosis; o (ii) una infección fúngica o una enfermedad infecciosa fúngica;
(b) una infección vírica o una enfermedad infecciosa vírica, tal como el SIDA/VIH,
el dengue, sarampión, paperas, rubeola, gripe o hepatitis; o
(c) una infección parasitaria o una enfermedad infecciosa parasitaria, tal como malaria, toxoplasmosis, tripanosomiasis o esquistosomiasis;
(B) una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune; o
(c) traumatismo, en donde, preferentemente, dicho traumatismo es causado por una lesión o cirugía, en donde, además, preferentemente dicho traumatismo causado por una lesión es un politraumatismo, un traumatismo craneal, un traumatismo torácico, un traumatismo abdominal o un traumatismo en las extremidades y/o quemaduras.
7. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho sujeto tiene la enfermedad de injerto contra huésped (EICH).
8. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente o la composición da como resultado una reducción de una o más citocinas o quimiocinas seleccionadas de uno cualquiera o más de TNFa, IL1RA, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, CCL11, FGF básico, G-CSF, GM-CSF, INFy, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, PDGF-p, CCL5 y VEGF.
9. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde X3 y/o X4 es serina (S) o treonina (T).
10. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el motivo de interacción con PCNA comprende una secuencia seleccionada de:
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T/N/Q]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 3);
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H/P] (SEQ ID NO: 4);
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/N/Q/R/H/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 5);
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T/R/K]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 6);
[R/K/H]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R/H] (SEQ ID NO: 7);
[R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 8);
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 9);
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[V/L/I/A/M/G/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 10);
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/T]-[V/L/I/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 11);
[R/K]-[VV/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/I/A/M/G]-[K/R] (SEQ ID NO: 12);
[R/K]-[W/F]-[L/I/A/V/M/T]-[V/L/I/A/M/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 13);
[R/K]-[W/F]-[L/I/V/A/M/S/T]-[V/L/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 14);
[R/K]-[W/F]-[L/V/I/A/T]-[V/L/A/I/S/T]-[K/R] (SEQ ID NO: 15);
[R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A]-[V/L/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 16);
[R]-[W/F/Y]-[L/V/I/A/T]-[V/L/A/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 17);
[R/K]-[F/Y]-[L/V/I/A]-[V/L/A/I/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 18);
[R/K]-[W/F/Y]-[L/I/V/A]-[V/L/I/A]-[K/R] (SEQ ID NO: 19);
[R/K]-[W/Y]-[L/V/I/A/S/T]-[V/L/A/S/T/M]-[K/R] (SEQ ID NO: 20); o
[K]-[F/Y/W]-[I/L/V/A/T]-[V/L/A/I/S/T/M]-[K] (SEQ ID NO: 21).
11. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el motivo de interacción con PCNA comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 297 o 1209.
12. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde:
(a) X1 y X2 son RW, RF, KF, KW, RY o KY; y/o
(b) X3 y X4 son LV, LL, LA, AL, VL, VI, LI, IL, VV, VA, IV, II, AV, IA, AI, AM, LM, LS, LT, IS, MV, TV, AA, IM, LN, LQ, VM, TL, SL, IT, VT, LG, MA, ML, NL, QL, QI, TI, SI, AS, VS, SV, CA, IG, LR, VR, TK o IR; y/o
(c) X3 y X4 no son AG, AC, CC, NN, QQ, NQ, QN, TS, SS, ST o TT.
13. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el CPP se selecciona de uno cualquiera de:
(i) un péptido de la clase antennapedia;
(ii) un péptido de la clase protegrina;
(iii) un péptido de la clase HIV-TAT;
(iv) un péptido de clase anfipática seleccionado de un péptido anfipático y con carga neta positiva, un péptido anfipático rico en prolina, un péptido basado en el péptido Pep-1 y un péptido basado en el péptido MPG;
(v) un péptido que exhibe un alto contenido de hélice a;
(vi) un péptido que comprende oligómeros de aminoácidos básicos;
(vii) pVEC;
(viii) un péptido procedente de calcitonina; y (ix) un CPP cíclico anfifílico,
preferentemente en donde el CPP se selecciona de una cualquiera de las SEQ ID NO: 337, 302 a 336, 338 a 1162, o 1210 a 1220 o un fragmento y/o derivado de las mismas y/o en donde el agente comprende además un dominio enlazador, preferentemente en donde el dominio enlazador comprende una secuencia señal de localización nuclear, más preferentemente en donde el dominio enlazador o secuencia señal de localización nuclear comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de:
(i) un péptido de 4-20 aminoácidos, en donde al menos 4 aminoácidos son aminoácidos cargados positivamente, preferentemente seleccionados entre K, R o H; y/o
(ii) una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1176, 1163 a 1175 o 1177 a 1181 o un fragmento y/o derivado de las mismas,
preferentemente en donde el dominio enlazador o la secuencia señal de localización nuclear comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1163-1181 o un fragmento y/o derivado de la misma, preferentemente donde dicho fragmento y/o derivado comprende al menos 4 aminoácidos cargados positivamente, preferentemente seleccionados entre K, R o H.
14. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el agente comprende un motivo de interacción con PCNA como se establece en la SEQ ID NO: 28, un enlazador o secuencia señal de localización nuclear como se establece en la SEQ ID NO: 1176 y una secuencia señal de penetración celular como se establece en la SEQ ID NO: 337 y/o en donde el agente comprende una secuencia como se establece en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1198, 1182 a 1197, 1199 a 1204 o 1208.
15. El agente, composición, kit o producto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el agente comprende una secuencia tal como se establece en la SEQ iD NO: 1198, 1203, 1204 o 1208.
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