ES2620789T3 - Inmunización de aves por administración de vacunas con vectores no replicantes - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora conectada operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, para su uso en la vacunación profiláctica de un embrión aviar mediante la introducción y la expresión de uno o más antígenos o inmunógenos de la influenza aviar en dicho embrión aviar.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunización de aves por administración de vacunas con vectores no replicantes
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a los campos de la inmunología y la tecnología de vacunas. Más específicamente, la invención se refiere a un vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso 5 en la vacunación profiláctica en un embrión de ave como se reivindica en la reivindicación 1. La invención también proporciona una composición inmunogénica para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar como se reivindica en la reivindicación 7 y un adenovirus humano recombinante para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar como se reivindica en la reivindicación 12.
Antecedentes de la invención 10
La influenza aviar (IA) es un patógeno grave que infecta aves, otros animales, y seres humanos. Desde 1997, ha habido varios casos de transmisión del virus de la IA en seres humanos (Subbarao et al., 1998; Ungchusak et al., 2005). La evidencia también muestra que la recombinación genética entre los virus de la influenza aviar y humana ha ocurrido en múltiples ocasiones en la historia médica (Kawaoka et al., 1989). Puesto que aves y seres humanos están en contacto cercano, se cree que la generación de nuevas cepas de virus de la IA que puedan cruzar la 15 barrera de la especie a la población humana seguirá siendo un problema de salud pública.
La vacunación masiva de aves parece ser el enfoque más prometedor para prevenir la diseminación del virus de la IA y para reducir el riesgo de pandemias humanas. La vacunación de aves con vacunas de virus completos inactivados se ha llevado a cabo en algunos países en los últimos años. Estas vacunas de la IA se preparan a partir de fluido amnio-alantoideo cosechado de huevos infectados, y, posteriormente, son inactivadas con formalina o β-20 propiolactona (Tollis y Di Trani, 2002). Sin embargo, la aparición impredecible de nuevas cepas de virus de IA, la evolución de los virus de IA a una forma altamente letal para embriones de pollo (Wood et al., 2002), y la posible diseminación de cepas de IA letales por bioterroristas hacen que el rápido desarrollo y el suministro oportuno de vacunas seguras y eficaces para la IA sea una tarea fundamental, aunque muy difícil. Además, no es posible discriminar los pollos infectados en el campo de los previamente vacunados con virus de IA inactivados de las 25 mismas cepas (Normile, 2004).
Un virus de la viruela aviar recombinante experimental que codifica la hemaglutinina (HA) de un virus de la IA ha protegido pollos contra una exposición al virus de la IA H5N2 después de la punción en la membrana del ala, aunque la respuestas serológica a la inhibición de la hemaglutinación (IH) fue insignificante (Beard et al., 1992). Los pollos a los que se inoculó a través de la membrana del ala un virus vaccinia recombinante vivo que expresaba HA también 30 desarrollaron inmunidad protectora frente a una exposición letal al virus IA con bajos niveles detectados de anticuerpo IH en suero (Chambers et al., 1988). Aunque los productos aislados de IA de aves acuáticas que tienen un tropismo por el tracto digestivo se han inoculado en pollos como una vacuna oral para la IA (Crawford et al., 1998), no se espera que esos productos aislados vayan a ser ampliamente eficaces contra nuevas cepas de virus de IA, debido a la evolución inherentemente dinámica de este tipo de virus. 35
Las aves también han sido inmunizadas por medio de inyección subcutánea de las proteínas HA expresadas a partir de vectores de baculovirus (Crawford et al., 1999), y la inoculación de un plásmido de expresión que codifica HA en la piel utilizando una pistola de genes (Fynan et al., 1993). Estas vacunas de IA son capaces de proteger a las aves de la exhibición de los signos clínicos y de muerte, y de reducir la replicación intestinal y respiratoria de un virus de exposición que contiene HA homólogas. También hay pruebas de que puede ser eficaz una vacuna para IA en 40 aerosol de bajo coste que expresa HA a partir de un vector de virus de la enfermedad de Newcastle (Swayne, 2003) o un virus de la influenza recombinante que contiene una cadena principal de virus de la influenza no patógeno (Lee et al., 2004; Webby et al., 2004).
La mayoría de las vacunas contra IA anteriores se basan en una administración parenteral laboriosa. Las vacunas contra IA orales y en aerosol adolecen de incongruencias en el suministro de dosis uniformes a las aves individuales 45 durante la inoculación en masa. Los vectores de replicación utilizados en algunas vacunas también plantean un riesgo biológico al introducir formas microbianas no naturales en el entorno. La vacuna contra el virus de la influenza recombinado podría incluso generar redistribuciones nocivas mediante recombinación entre un virus de la influenza redistribuido y un virus de IA salvaje que circula al mismo tiempo en el entorno (Hilleman, 2002).
Existen varias razones notables para la utilización de vectores de adenovirus recombinante ("Ad") como vacuna 50 anteriormente. Los vectores Ad son capaces de transducir células tanto mitóticas como postmitóticas in situ. Además, la preparación de soluciones de partida de Ad que contienen títulos elevados de virus (es decir, más de 1012 ufp [unidades formadoras de placas] por ml) son fáciles de generar, lo que hace posible transducir células in situ a una elevada multiplicidad de infección (MOI). Los vectores de Ad también tienen un registro de seguridad comprobado, en función de su uso a largo plazo como vacuna. Adicionalmente, el virus Ad es capaz de inducir altos 55 niveles de expresión de genes (al menos como una ráfaga inicial), y los vectores de Ad de replicación defectuosa pueden ser fácilmente biomodificados genéticamente, fabricados y almacenados utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica.
Las vacunas basadas en Ad son más potentes que las vacunas de ADN debido a la alta afinidad de los vectores de Ad por receptores específicos y a su capacidad para escapar de la vía endosomal (Curiel, 1994). Los vectores de Ad pueden transducir parte de un embrión de pollo a través de la unión de su fibra al receptor de coxsackie y adenovirus (CAR) encontrado en la superficie de las células de pollo (Tan et al., 2001). Además, al menos uno de los componentes de Ad, la hexona, es altamente inmunogénico y puede conferir actividad coadyuvante a los antígenos 5 exógenos (Molinier-Frenkel et al., 2002).
Las vacunas basadas en Ad imitan los efectos de las infecciones naturales en su capacidad para inducir respuestas de las células T restringidas a la clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), sin embargo, eliminan la posibilidad de reversión a la virulencia de nuevo porque sólo un subfragmento del genoma del patógeno se expresa a partir del vector. Esta "expresión selectiva" puede resolver el problema de diferenciación de los animales 10 vacunados pero no infectados de sus contrapartes infectadas, ya que los marcadores específicos del patógeno no codificado por el vector se pueden utilizar para discriminar los dos eventos. En particular, no se requiere la propagación del patógeno para la generación de vacunas vectorizadas porque los genes de los antígenos relevantes pueden ser amplificados y clonados directamente a partir de muestras de campo (Rajakumar et al., 1990). Esto es particularmente importante para la producción de cepas de IA altamente virulentas, tales como H5N1, ya que esta 15 cepa es demasiado peligrosa y difícil de propagar (Wood et al., 2002). Además de los criterios anteriores, las consideraciones comerciales tienen un gran peso en la industria avícola. La vacuna de IA actual cuesta por si sola alrededor de 7 centavos de dólar por ave, sin contar la mano de obra de la inyección en las aves corredoras (Normile, 2004).
Los vectores derivados del serotipo 5 de Ad humano (Ad5) defectuosos para E1/E3 de replicación incompetente han 20 sido ampliamente estudiados en los mamíferos (Graham y Prevec, 1995). A pesar de que los pollos hayan sido inmunizados mediante inyección subcutánea o intradérmica de un vector viral huérfano letal de embrión de pollo Ad aviar (CELO) que codifica un antígeno (Francois et al., 2004), el vector CELO tiene una baja tasa de cumplimiento y podría ser potencialmente dañino debido a su capacidad para replicar en células de pollo. Puesto que CELO no posee regiones E1, E3, y E4 identificables (Chiocca et al., 1996), no se encuentra disponible un vector CELO de 25 replicación incompetente como portador para la inmunización en este momento. La presente invención aborda esta necesidad al proporcionar medios seguros y eficaces como se reivindica en la presente memoria para el suministro de genes para proteger a las aves en una amplia variedad de entornos de enfermedad, y por lo tanto prevenir la transmisión de patógenos aviares a seres humanos.
El documento WO 03/070920 describe métodos para incluir una respuesta inmunitaria sistémica para proporcionar 30 una inmunización genética no invasiva o una respuesta terapéutica en un animal, proporcionando un polinucleótido que codifica una proteína de interés.
El documento AU 2005201381, describe un método de inmunización genética no invasivo en un animal y/o métodos de inducción de una respuesta inmunitaria sistémica o terapéutica en un animal, los productos de los mismos y los usos de los métodos y los productos de los mismos. Los métodos pueden incluir el contacto de la piel del animal con 35 un vector en una cantidad eficaz para inducir la respuesta del sistema inmunitario o terapéutica en animales.
La presentación por Gao et al. de Molecular Therapy, Academic Press, San Diego, Vol. 11, 2005, página 27 describe una vacuna protectora para una rápida respuesta a la pandemia de la influenza aviar.
Compendio de la invención
Ahora se ha mostrado sorprendentemente que el su ministro intramuscular y in ovo de vacunas vectorizadas de 40 adenovirus humanos puede inmunizar rápidamente, de forma segura, y efectiva aves. La inmunización masiva de aves contra varios patógenos aviares es crucial para evitar enormes pérdidas económicas, y para impedir la transmisión de patógenos aviares, tales como el virus de la influenza aviar, a la población humana. El suministro de vacunas o composiciones inmunogénicas in ovo con un inyector mecanizado es un método no laborioso para la inmunización en masa de aves de una manera oportuna. A diferencia de otras vacunas aviares in ovo, la producción 45 de vacunas vectorizadas de humanos o composiciones inmunogénicas no requiere la propagación de agentes patógenos letales y no implica la transmisión de antígenos o inmunógenos por un vector que sea capaz de replicar en aves. Además, la inmunización por este tipo de vacuna o composición inmunogénica permite la diferenciación entre animales vacunados y animales infectados naturalmente.
En un aspecto, la invención proporciona un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que 50 comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora conectada operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, para su uso en la vacunación profiláctica de un embrión aviar mediante la introducción y expresión de uno o más antígenos o inmunógenos de la influenza aviar en un embrión aviar.
Preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva 55 de uno o más virus aviares.
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar.
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz o neuraminidasa.
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se selecciona del grupo que consiste en el subtipo de hemaglutinina 3, 5, 7, ó 9.
La introducción en un embrión aviar se puede producir preferiblemente por medio de suministro in ovo. 5
Otro aspecto más de la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora unida operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar provocando una respuesta inmunogénica en un sujeto aviar, en donde el sujeto aviar está infectado in ovo con una cantidad 10 inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora conectada operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, en donde los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se expresan a un nivel suficiente para provocar una respuesta inmunogénica a los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés en el sujeto 15 aviar.
Preferiblemente, los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés derivan de virus de la influenza aviar, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, reovirus aviar, avipox, viruela aviar, viruela del canario, viruela del pichón, viruela de la perdiz, y viruela de la paloma, poliomavirus aviar, virus de la enfermedad de 20 Newcastle, pneumovirus aviar, virus de la rinotraqueitis aviar, virus de la reticuloendoteliosis aviar, retrovirus aviares, virus endógeno aviar, virus de la eritroblastosis aviar, virus de la hepatitis aviar, virus de la anemia aviar, virus de la enteritis aviar, virus de la enfermedad de Pacheco, virus de la leucemia aviar, parvovirus aviar, rotavirus aviar, virus de la leucosis aviar, virus del fibrosarcoma musculoaponeurótico aviar, virus de la mieloblastosis aviar, virus asociado a la mielocitomatosis aviar, virus de la mielocitomatosis aviar, virus del sarcoma aviar, o virus de la 25 necrosis del bazo aviar.
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva de virus de la influenza aviar.
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz o neuraminidasa. 30
Más preferiblemente, la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se selecciona del grupo que consiste el subtipo de hemaglutinina 3, 5, 7, ó 9.
El aspecto puede comprender adicionalmente la administración de una vacuna adicional.
En este aspecto, la infección se produce por medio de suministro in ovo.
Otro aspecto de la invención proporciona un adenovirus recombinante humano que contiene y expresa una molécula 35 de ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno de un patógeno del sujeto aviar para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar mediante la inoculación en un sujeto aviar, que comprende la administración in ovo de un adenovirus recombinante humano que contiene y expresa una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno de un patógeno del sujeto aviar.
Preferiblemente, el adenovirus humano comprende secuencias derivadas de serotipo 5 de adenovirus. 40
Preferiblemente, el adenovirus humano comprende secuencias derivadas de adenovirus de replicación defectuosa, adenovirus no replicantes, adenovirus de replicación competente, o adenovirus de tipo salvaje.
Preferiblemente, el antígeno de un patógeno del ave deriva de virus de la influenza aviar, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, reovirus aviar, avipox, viruela aviar, viruela del canario, viruela del pichón, 45 viruela de la codorniz y viruela de la paloma, poliomavirus aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, pneumovirus aviar, virus de la rinotraqueitis aviar, virus de la reticuloendoteliosis aviar, retrovirus aviares, virus endógeno aviar, virus de la eritroblastosis aviar, virus de la hepatitis aviar, virus de la anemia aviar, virus de la enteritis aviar, virus de la enfermedad de Pacheco, virus de la leucemia aviar, parvovirus aviar, rotavirus aviar, virus de la leucosis aviar, virus del fibrosarcoma musculoaponeurótico aviar, virus de la mieloblastosis aviar, virus asociado a la mieloblastosis 50 aviar, virus de la mielocitomatosis aviar, virus del sarcoma aviar, o virus de la necrosis del bazo aviar.
Más preferiblemente, el antígeno de un patógeno del ave deriva de virus de la influenza aviar.
Más preferiblemente, los antígenos o inmunógenos de la influenza aviar se seleccionan del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz o neuraminidasa. Más preferiblemente, los antígenos o inmunógenos de la
influenza aviar se seleccionan del grupo que consiste en los subtipos de hemaglutinina 3, 5, 7, ó 9.
El aspecto puede comprender adicionalmente la administración de una vacuna adicional.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente Descripción Detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero sin pretender que limite la invención a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con las Figuras adjuntas, en las que: 5
La Figura 1 es un gráfico que representa la inmunización de pollos por medio de inyección intramuscular e in ovo del vector de adenovirus recombinante que expresa HA de influenza aviar. El Grupo 1 representa huevos embrionados de pollo de 9 días de edad y el Grupo 2 representa huevos de pollo embrionados de 18 días de edad, respectivamente, en un volumen de 200 µl a una dosis de 5x1010 ufp por huevo. En el Grupo 3, el vector de adenovirus recombinante que expresa la HA de influenza aviar se inyectó por vía intramuscular a tres pollos de 4 10 semanas de edad, en un volumen de 100 µl a una dosis de 2,5x1010 ufp por animal.
La Figura 2 es un gráfico que representa los títulos de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (puntos) detectados en pollos SPF de 28 días de edad vacunados con AdTW68.H5 in ovo solamente los días 10 o 18 de incubación, y pollos que fueron vacunados in ovo los días 10 o 18 de la incubación y recibieron un refuerzo por vía nasal el día 15 después de la eclosión. Barra, media geométrica del log2 [título de IH]. No se detectaron títulos de IH 15 en los pollos de control no sometidos a tratamiento previamente (datos no mostrados).
La Figura 3 es un gráfico que representa los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación en pollos SPF los días 23 y 29 después de la eclosión, ya sea vacunados in ovo solamente (7 pollos) el día 18 de embrionación ya sea vacunados in ovo y con un refuerzo por vía intranasal el día 15 después de la eclosión (12 pollos) con AdTW68.H5. D23 y D29, títulos de IH los días 23 y 29 después de la eclosión, respectivamente; puntos, log2 [título de IH] en aves 20 individuales; barra, media geométrica del log2 [título de IH]. No se detectaron títulos de IH en 11 pollos de control no sometidos a tratamiento previo los días 23 y 29 después de la eclosión (datos no mostrados).
La Figura 4 es un gráfico que representa la vacunación in ovo de embriones de pollo Leghorn blancos de 18 días. La vacunación in ovo se realizó utilizando 10n pv de AdTW68.H5 (in ovo). En un grupo separado, las aves vacunadas in ovo recibieron un refuerzo el día 15 después de la eclosión por instilación intranasal de AdTW68.H5 25 con la misma dosis (in ovo + refuerzo nasal). Los embriones que no habían sido sometidos a tratamiento previo, sin vacunación sirvieron como controles negativos (Control). A los 34 días de edad los pollos fueron sensibilizados por vía intranasal a través de la hendidura de la coana con una dosis letal de la cepa del virus de la IA A/Ck/Queretaro/14588-19/95 altamente patógena (H5N2). Los cambios estadísticamente significativos en la supervivencia se determinaron durante todo el estudio mediante el ensayo Logrank (Prism 4.03, GraphPad 30 Software). La vacunación in ovo con AdTW68.H5 con o sin aplicaciones nasales de refuerzo protegieron de manera significativa a los pollos (100%) frente a una sensibilización letal con virus IA, en comparación con los controles no vacunados (P <0,001).
La Figura 5 es un gráfico que representa ARN viral A/Ck/Queretaro/14588-19/95 cuantificado mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (16) en muestras de orofaringe de los pollos vacunados y de control después de la 35 sensibilización intranasal con este virus IA altamente patógeno. Los pollos fueron vacunados como se describe en la descripción de la Fig. 3. Las muestras se recogieron a los 2, 4, y 7 días de la infección. El día 7 se alcanzó una diferencia significativa (P <0,05) en la carga viral entre los controles vacunados y no vacunados.
La Figura 6 es un gráfico que representa la vacunación in ovo el día 18 realizada por inoculación del vector AdTW68.H5 a una dosis de 3X108 ifu. El vector de Ad5 se purificó por medio de membrana Sartobind Q5 (Sartorius 40 North America, Inc., Edgewood, NY) y se resuspendió en tampón A195 (Evans, 2004). Se analizaron los anticuerpos IH en suero antes de la sensibilización el D25. El signo menos (-) indica aves que sucumbieron a la sensibilización; el signo más (+) indica aves que sobrevivieron a la sensibilización. Los supervivientes tenían una actividad IH significativamente elevada en suero antes de la sensibilización (P <0,001) en comparación con aquellos que murieron (prueba de la t no pareada; Prism 4.03). Las aves de control no sometidas a tratamiento previo AU y las 45 aves inmunizadas por el vector de control AdCMV-tetC no produjeron títulos de anticuerpos IH medibles.
La Figura 7 es un gráfico que representa la vacunación in ovo el día 18 realizada por inoculación del vector AdTW68.H5 a una dosis de 3X10 ifu. El vector Ad5 se purificó por medio de membrana Sartobind Q5 (Sartorius North America, Inc., Edgewood, NY) y se resuspendió en tampón A1 95 (Evans, 2004). Las aves de control e inmunizadas fueron sensibilizadas por medio de administración intranasal de 105 DIE50 del virus IA H5N1 50 A/Swan/Mongolia//244L/2005 el D31.
Descripción detallada de la invención
En esta descripción, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de los Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye", y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente en" asimismo tienen el significado 55 atribuido en la ley de Patentes de los Estados Unidos y el término es abierto, permitiendo la presencia de más de lo
que se cita siempre que las características básicas o novedosas de lo que se cita no cambien por la presencia de más de lo que se cita, pero excluye realizaciones de la técnica anterior. El término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido desoxirribonucleico o ribonucleico en forma de hebra sencilla o doble.
El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con cadenas principales sintéticas, véase, p. 5 ej., Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; y Samstag, 1996.
Según se utiliza en la presente memoria, "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otro modo in vitro (p. ej., "polinucleótido recombinante"), a métodos de utilización de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") 10 codificado por un polinucleótido recombinante. Los "medios recombinantes" también abarcan la ligación de ácidos nucleicos que tienen diversas regiones codificantes o dominios o secuencias promotoras de diferentes fuentes en un casete de expresión o vector para la expresión, p. ej., la expresión inducible o constitutiva de secuencias codificantes de polipéptidos en los vectores para su utilización en la invención.
El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico está en una 15 célula o un virus en el que no se encuentra normalmente en la naturaleza; o, comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí que se encuentran normalmente en la naturaleza, o está modificado recombinantemente de manera que su nivel de expresión, o relación física con otros ácidos nucleicos u otras moléculas en una célula, o estructura, no se encuentra normalmente en la naturaleza. Un término similar utilizado en este contexto es "exógeno". Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo es producido típicamente de 20 forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas de una manera que no se encuentra en la naturaleza; p. ej., un gen humano conectado operablemente a una secuencia promotora insertada en un vector basado en adenovirus para su uso en la invención. Como ejemplo, un ácido nucleico heterólogo de interés puede codificar un producto génico inmunogénico, en donde el adenovirus se administra terapéuticamente o profilácticamente como una vacuna o una composición de vacuna. Las secuencias heterólogas pueden comprender 25 varias combinaciones de promotores y secuencias, cuyos ejemplos se describen en detalle en la presente memoria.
Un "antígeno" es una sustancia que es reconocida por el sistema inmunitario e induce una respuesta inmunitaria. Un término similar utilizado en este contexto es "inmunógeno". Un "sujeto aviar" en el contexto de la presente invención se refiere a todos y cada uno de los miembros domésticos y salvajes de la clase Aves, que incluyen, pero no se limitan a, Neognathae y Palaeognathae. El orden Neognathae incluye, entre otros, Anseriformes, Apodiformes, 30 Buceroformes, Caprimulgiformes, Charadriiformes, Ciconiiformes, Coliiformes, Columbiformes, Coraciifomes, Cuculiformes, Falconiformes, Galbuliformes, Galliformes, Gaviiformes, Gruiformes, Musofagiformes, Opisthocomiformes, Passeriformes, Pelecaniformes, Phoenicopteriformes, Piciformes, Podicipediformes, Procellariifomes, Psittaciformes, Sphenisciformes, Strigiformes, Trochiliformes, Trogoniformes, Turniciformes, y Upupiformes. El orden Palaeognathae incluye, entre otros, Apterygiformes, Casuariiformes, Dinornithiformes, 35 Rheiformes, Struthioniformes, y Tiniamiformes. Los sujetos aviares pueden comprender aves adultas, pollos de aves, y embriones/huevos de aves.
"Expresión" de un ácido nucleico o gen abarca no sólo la expresión del gen celular, sino también la transcripción y la traducción del ácido nucleico o los ácidos nucleicos en los sistemas de clonación y en cualquier otro contexto.
Según se utiliza en la presente memoria, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de 40 una entidad de un entorno a otro. A modo de ejemplo, algunos vectores utilizados en técnicas de ADN recombinante permiten que entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo), sean transferidas a una célula diana. La presente invención comprende vectores recombinantes que pueden incluir vectores virales, vectores bacterianos, vectores de protozoos, vectores de ADN, o recombinantes de los mismos. 45
Con respecto al ADN exógeno para la expresión en un vector (p. ej., que codifica un epítopo y/o un antígeno y/o un agente terapéutico de interés) y los documentos que proporcionan semejante ADN exógeno, así como con respecto a la expresión de los factores de transcripción y/o traducción para potenciar la expresión de moléculas de ácido nucleico, y en cuanto a términos tales como "epítopo de interés", "agente terapéutico", "respuesta inmunitaria", "respuesta inmunológica", "respuesta inmunitaria protectora", "composición inmunológica", "composición 50 inmunogénica" , y "composición de vacuna", entre otros, se hace referencia a la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.990.091 presentada el 23 de noviembre, de 1999 y los documentos WO 98/00166 y WO 99/60164, y los documentos citados en ellos y los documentos de registro en el enjuiciamiento de esa patente y esas solicitudes PCT. Así, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.990.091 y los documentos WO 98/00166 y WO 99/60164 y los documentos citados en ellos y los documentos de registro en el enjuiciamiento de esa patente y esas solicitudes 55 PCT y otros documentos citados en ellos, pueden consultarse en la práctica de esta invención; y, todas las moléculas de ácido nucleico exógeno, promotores, y vectores citados en los mismos se pueden utilizar en la práctica de esta invención. A este respecto, también se hace mención a las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.706.693; 6.716.823; 6.348.450; las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos con los Núms. de Serie 10/424,409; 10/052,323; 10/116,963; 10/346,021; y el documento WO 99/08713, publicado el 25 de Febrero, de 60
1999, de PCT/US98/16739.
Según se utilizan en la presente memoria, los términos "composición inmunogénica" y "composición inmunológica" y "composición inmunogénica o inmunológica" abarcan cualquier composición que provoca una respuesta inmunitaria contra el antígeno o inmunógeno de interés expresado a partir de vectores adenovirales y virus para su uso en la invención; por ejemplo, después de la administración a un sujeto, provoca una respuesta inmunitaria contra el 5 inmunógeno o antígeno elegido como diana de interés. Los términos "composición vacunal" y "vacuna" y "composición de vacuna" abarcan cualquier composición que induce una respuesta inmunitaria protectora contra el antígeno o los antígenos de interés, o que protege eficazmente contra el antígeno; por ejemplo, después de la administración o inyección al sujeto, provoca una respuesta inmunitaria protectora contra el antígeno o inmunógeno elegido como diana o proporciona una protección eficaz contra el antígeno o inmunógeno expresados a partir de los 10 vectores de adenovirus de la invención para su uso en la invención. El término "composición veterinaria" significa cualquier composición que comprende un vector para uso veterinario que expresa una proteína terapéutica como, por ejemplo, la eritropoyetina (EPO) o una proteína inmunomoduladora, tal como, por ejemplo, el interferón (IFN). Del mismo modo, el término "composición farmacéutica" significa cualquier composición que comprende un vector para expresar una proteína terapéutica. 15
Una "cantidad inmunológicamente eficaz" es una cantidad o concentración del vector recombinante que codifica el gen de interés, que, cuando se administra a un sujeto, produce una respuesta inmunitaria al producto génico de interés.
Una "forma recombinante circulante" se refiere a virus recombinantes que se han sometido a una redistribución genética entre dos o más subtipos o cepas. Otros términos utilizados en el contexto de la presente invención son 20 "forma híbrida", "forma recombinada", y "forma de genoma redistribuido".
"Productos aislados clínicos" se refiere, por ejemplo, a las cepas de virus de laboratorio utilizadas con frecuencia que se aíslan de los sujetos infectados y se restablecen en células de laboratorio o sujetos con cepas maestras de virus donantes de alto crecimiento adaptadas al laboratorio.
"Productos aislados de campo" se refiere a los virus que se aíslan de los sujetos infectados o del medio ambiente. 25
Los aspectos anteriores de la invención se aplican apropiadamente para prevenir enfermedades como vacunación profiláctica.
Los vectores recombinantes para su uso en la presente invención se pueden administrar a un sujeto ya sea solos o como parte de una composición inmunológica o inmunogénica. Los vectores recombinantes de la descripción también se pueden utilizar para suministrar o administrar una o más proteínas a un sujeto de interés por medio de la 30 expresión in vivo de una o varias proteínas.
Se observa que los productos inmunológicos y/o anticuerpos y/o productos expresados obtenidos de acuerdo con esta descripción pueden ser expresados in vitro y utilizados de una manera en la que tales productos inmunológicos y/o productos expresados y/o anticuerpos se utilizan típicamente, y que las células que expresan tales productos inmunológicos y/o productos expresados y/o anticuerpos se pueden emplear en aplicaciones in vitro y/o ex vivo, p. 35 ej., tales usos y aplicaciones pueden incluir diagnósticos, análisis, terapia ex vivo (p. ej., en donde las células que expresan el producto génico y/o la respuesta inmunológica se expanden in vitro y se reintroducen en el anfitrión o animal), etc., véanse la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.990.091, los documentos WO 99/60164 y WO 98/00166 y los documentos citados en los mismos. Adicionalmente, los anticuerpos o productos génicos expresados que se aíslan a partir de los métodos de la presente memoria, o que se aíslan de células expandidas in vitro 40 siguiendo los métodos de administración de la presente memoria, se pueden administrar en composiciones, de un modo similar a la administración de epítopos de subunidades o antígenos o productos terapéuticos o anticuerpos para inducir la inmunidad, estimular una respuesta terapéutica y/o estimular la inmunidad pasiva.
Se pretende que el término "adenovirus humano" según se utiliza en la presente memoria abarque todos los adenovirus humanos de la familia Adenoviridae, que incluyen miembros de los géneros de Mastadeno virus. Hasta la 45 fecha, se han identificado más de cincuenta y un serotipos humanos de adenovirus (véase, p. ej., Fields et al., Virology 2, Cap. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)). El adenovirus puede ser del serogrupo A, B, C, D, E o F. El adenovirus humano puede ser de serotipo 1 (Ad1), serotipo 2 (Ad2), serotipo 3 (Ad3), serotipo 4 (Ad4), serotipo 6 (Ad6), serotipo 7 (Ad7), serotipo 8 (Ad8), serotipo 9 (Ad9), serotipo 10 (Ad10), serotipo 11 (Ad11), serotipo 12 (Ad12), serotipo 13 (Ad13), serotipo 14 (Ad14), serotipo 15 (Ad15) serotipo 16 (Ad16), serotipo 17 (Ad17), serotipo 50 18 (Ad18), serotipo 19 (Ad19), serotipo 19a (Ad19a), serotipo 19p (Ad19p), serotipo 20 (Ad20), serotipo 21 (Ad21), serotipo 22 (Ad22), serotipo 23 (Ad23), serotipo 24 (Ad24), serotipo 25 (Ad25), serotipo 26 (Ad26), serotipo 27 (Ad27), serotipo 28 (Ad28), serotipo 29 (Ad29), serotipo 30 (Ad30), serotipo 31 (Ad31), serotipo 32 (Ad32), serotipo 33 (Ad33), serotipo 34 (Ad34), serotipo 35 (Ad35), serotipo 36 (Ad36), serotipo 37 (Ad37), serotipo 38 (Ad38), serotipo 39 (Ad39), serotipo 40 (Ad40), serotipo 41 (Ad41), serotipo 42 (Ad42), serotipo 43 (Ad43), serotipo 44 55 (Ad44), serotipo 45 (Ad45), serotipo 46 (Ad46), serotipo 47 (Ad47), serotipo 48 (Ad48), serotipo 49 (Ad49), serotipo 50 (Ad50), serotipo 51 (Ad51), o preferiblemente, serotipo 5 (Ad5), pero no se limitan a estos ejemplos.
También se contemplan en la presente invención los vectores recombinantes, composiciones inmunogénicas, y los
adenovirus recombinantes para el uso reivindicado que pueden comprender partículas subvirales de más de un serotipo de adenovirus. Por ejemplo, se sabe que los vectores de adenovirus pueden mostrar un tropismo alterado para tejidos o tipos de células específicos (Havenga, MJ. E. et al., 2002), y por lo tanto, la mezcla y combinación de diferentes cápsides adenovirales, es decir, proteínas de la fibra, o pentónicas de diferentes serotipos adenovirales pueden resultar ventajosas. La modificación de las cápsides adenovirales, incluyendo la fibra y la pentona puede dar 5 como resultado un vector adenoviral con un tropismo que es diferente del de adenovirus sin modificar. Los vectores de adenovirus que son modificados y optimizados en su capacidad para infectar células diana pueden permitir una reducción significativa de la dosis terapéutica o profiláctica, dando como resultado la reducción de la toxicidad local y diseminada.
El adenovirus es un ADN virus sin envoltura. Los vectores derivados de adenovirus tienen una serie de 10 características que los hacen particularmente útiles para la transferencia génica. Según se utiliza en la presente memoria, un "vector de adenovirus recombinante" es un vector de adenovirus que lleva una o más secuencias de nucleótidos heterólogas (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de nucleótidos heterólogas). Por ejemplo, la biología de los adenovirus está caracterizada en detalle, el adenovirus no está asociado con ninguna patología humana grave, el virus es extremadamente eficiente en la introducción de su ADN en la célula anfitriona, el virus 15 puede infectar una amplia variedad de células y tiene una amplia gama de anfitriones, el virus puede ser producido en grandes cantidades con relativa facilidad, y el virus se puede volver de replicación deficiente y/o no replicante por medio de deleciones en la región temprana 1 ( "E1") del genoma viral.
El genoma de adenovirus es una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases ("pb") con una proteína terminal de 55 kDa unida covalentemente al extremo 5' de cada hebra. El ADN de Ad 20 contiene Repeticiones Terminales Invertidas ("ITR") idénticas de aproximadamente 100 pb, dependiendo la longitud exacta del serotipo. Los orígenes de replicación virales están localizados dentro de las ITR exactamente en los extremos del genoma. La síntesis de ADN se produce en dos etapas. En primer lugar, la replicación procede por desplazamiento de la hebra, generando una molécula dúplex hija y una hebra parental desplazada. La hebra desplazada es de hebra sencilla y puede formar una "franja" intermedia, que permite el inicio de la replicación y la 25 generación de una molécula dúplex hija. Alternativamente, la replicación puede proceder de ambos extremos del genoma simultáneamente, obviando el requerimiento de formar la estructura de la franja.
Durante el ciclo de infección productiva, los genes virales se expresan en dos fases: la fase temprana, que es el período hasta la replicación del ADN viral, y la fase tardía, que coincide con el inicio de la replicación del ADN viral. Durante la fase temprana, sólo se expresan los productos génicos tempranos, codificados por las regiones E1, E2, 30 E3 y E4, que llevan a cabo una serie de funciones que preparan la célula para la síntesis de proteínas estructurales virales (Berk, AJ., 1986). Durante la fase tardía, se expresan los productos génicos virales tardíos además de los productos de genes tempranos y la síntesis de ADN y proteínas de la célula anfitriona se desactiva. En consecuencia, la célula se dedica a la producción de ADN viral y de proteínas estructurales virales (Tooze, J., 1981).
La región E1 del adenovirus es la primera región del adenovirus expresada después de la infección de la célula 35 diana. Esta región consiste en dos unidades transcripcionales, los genes de E1A y E1B, ambos los cuales son necesarios para la transformación oncogénica de cultivos primarios (embrionarios) de roedor. Las principales funciones de los productos génicos de E1A son la inducción de las células quiescentes para que entren en el ciclo celular y reanuden la síntesis de ADN celular, y la activación transcripcional del gen de E1B y las otras regiones tempranas (E2, E3 y E4) del genoma viral. La transfección de las células primarias con el gen de E1A solo puede 40 inducir la proliferación ilimitada (inmortalización), pero no da lugar a la transformación completa. Sin embargo, la expresión de E1A, en la mayoría de los casos, da como resultado la inducción de la muerte celular programada (apoptosis), y sólo ocasionalmente se obtiene la inmortalización (Jochemsen et al., 1987). La co-expresión del gen de E1B es necesaria para evitar la inducción de la apoptosis y para que se produzca la transformación morfológica completa. En líneas celulares inmortales establecidas, la expresión de alto nivel de E1A puede causar la 45 transformación completa en ausencia de E1B (Roberts, B. E. et al., 1985).
Las proteínas codificadas E1B ayudan a E1A en la reorientación de las funciones celulares para permitir la replicación viral. Las proteínas E1B de 55 kD y E4 de 33 kD, que forman un complejo que se localiza esencialmente en el núcleo, funcionan en la inhibición de la síntesis de proteínas del anfitrión y facilitan la expresión de los genes virales. Su influencia principal es establecer un transporte selectivo de los ARNm virales desde el núcleo hasta el 50 citoplasma, de forma concomitante con el inicio de la fase tardía de la infección. La proteína E1B de 21 kD es importante para el control temporal correcto del ciclo de infección productivo, evitando de ese modo la muerte prematura de la célula anfitriona antes de que el ciclo de vida del virus se haya completado. Los virus mutantes incapaces de expresar el producto génico de E1B de 21 kD presentan un ciclo de infección acortado que está acompañado de una degradación excesiva del ADN cromosómico de la célula anfitriona (fenotipo deg) y un efecto 55 citopático intensificado (fenotipo cyt; Telling et al., 1994). Los fenotipos deg y cyt son suprimidos cuando además se muta el gen de E1A, indicando que estos fenotipos son una función de E1A (White, E. et al., 1988). Además, la proteína E1B de 21 kDa disminuye la velocidad mediante la cual E1A pone en marcha los otros genes virales. Todavía no se conoce por medio de qué mecanismos la E1B de 21 kD inactiva estas funciones dependientes de E1A. 60
En contraste, por ejemplo, con los retrovirus, los adenovirus no se integran en el genoma de la célula anfitriona, son
capaces de infectar células que no están en división, y son capaces de transferir eficazmente genes recombinantes in vivo (Brody et al., 1994). Estas características hacen de los adenovirus atractivos candidatos para la transferencia génica in vivo, por ejemplo, de un antígeno o inmunógeno de interés a células, tejidos o sujetos que lo necesiten.
Se prefieren los vectores de adenovirus que contienen deleciones múltiples tanto para aumentar la capacidad de carga del vector como para reducir la probabilidad de recombinación para generar adenovirus de replicación 5 competente (RCA). Cuando el adenovirus contiene múltiples deleciones, no es necesario que cada una de las deleciones, si está presente sola, de lugar a un adenovirus de replicación defectuosa y/o no replicante. Siempre que una de las deleciones convierta el adenovirus en uno de replicación defectuosa o no replicante, se pueden incluir deleciones adicionales para otros fines, p. ej., para aumentar la capacidad de carga del genoma del adenovirus para secuencias de nucleótidos heterólogas. Preferiblemente, más de una de las deleciones evita la expresión de una 10 proteína funcional y convierte el adenovirus en un adenovirus de replicación defectuosa y/o no replicante y/o atenuado. Más preferiblemente, todas las deleciones son deleciones que convertirían el adenovirus en un adenovirus de replicación defectuosa y/o no replicante y/o atenuado. Sin embargo, la invención también abarca adenovirus y vectores de adenovirus para su uso que son adenovirus de replicación competente y/o de tipo salvaje, es decir, comprende todos los genes adenovirales necesarios para la infección y replicación en un sujeto. 15
Las realizaciones de la invención que emplean adenovirus recombinantes pueden incluir vectores de adenovirus con E1 defectuosa o suprimida, E3 defectuosa o suprimida, o E4 defectuosa o suprimida o vectores de adenovirus que comprenden deleciones de E1 y E3, o E1 y E4, o E3 y E4, o E1, E3, y E4, o el vector de adenovirus "vaciado" ("gutless") en el que se han eliminado todos los genes virales. Los vectores de adenovirus pueden comprender mutaciones en los genes de E1, E3, E4, o deleciones en estos o todos los genes adenovirales. La mutación en E1 20 aumenta el margen de seguridad del vector porque se dice que los adenovirus con E1 defectuosa mutantes son de replicación defectuosa y/o no replicante en células no permisivas, y están, por lo menos, muy atenuados. La mutación en E3 mejora la inmunogenicidad del antígeno al alterar el mecanismo por el cual el adenovirus regula a la baja moléculas de clase I del MHC. La mutación en E4 reduce la inmunogenicidad del vector de adenovirus mediante la supresión de la expresión génica tardía, por lo que puede permitir una revacunación repetida utilizando 25 el mismo vector. La presente invención comprende vectores de adenovirus de cualquier serotipo o serogrupo que tienen deleciones o mutaciones de E1, o E3, E4 o, o E1 y E3, o E1 y E4. La deleción o mutación de estos genes adenovirales da como resultado el deterioro o la pérdida sustancialmente completa de la actividad de estas proteínas.
El vector de adenovirus "vaciado" es otro tipo de vector en la familia de vectores de adenovirus. Su replicación 30 requiere un virus auxiliar y una línea celular 293 humana especial que expresa tanto EIA como Cre, una condición que no existe en el ambiente natural; el vector es privado de todos los genes virales, por lo tanto el vector como portador de vacuna es no inmunogénico y puede ser inoculado varias veces para la re-vacunación. El vector de adenovirus "vaciado" también contiene espacio de 36 kb para el alojamiento de uno o varios antígenos o inmunógenos de interés, permitiendo así la co-administración de un gran número de antígenos o inmunógenos a las 35 células.
Otros sistemas de vectores de adenovirus conocidos en la técnica incluyen el sistema AdEasy (He et al., 1998) y el sistema AdEasier posteriormente modificado (Zeng et al., 2001), que fueron desarrollados para generar vectores de Ad recombinantes en células 293 rápidamente permitiendo que se produjera la recombinación homóloga entre los vectores donadores y los vectores auxiliares de Ad en células de Escherichia coli, tales como células BJ5183, 40 durante la noche. pAdEasy comprende secuencias estructurales de adenovirus que, cuando se suministran en trans con un vector donador tal como pShuttle-CMV que expresa un antígeno o un inmunógeno de interés, da como resultado el empaquetamiento del antígeno o inmunógeno (p. ej., inmunógenos y/o antígenos) en una cápside adenoviral. La secuencia de pAdEasy es bien conocida en la técnica y está públicamente y comercialmente disponible a través de Stratagene. 45
La presente invención se puede generar utilizando el sistema de AdHigh (Solicitud de Patente de los Estados Unidos Provisional Núm. de Serie 60/683,638). AdHigh es un método seguro, rápido y eficaz de generación de altos títulos de adenovirus recombinante sin el riesgo de la generación de RCA, que puede ser perjudicial o fatal para los sujetos aviares. Además, los RCA pueden ser patógenos para los seres humanos y no es deseable que estén presentes en la cadena alimentaria. El sistema AdHigh utiliza plásmidos lanzadera modificados, tales como pAdHigh, para 50 promover la producción de adenovirus libres de RCA en las células permisivas, tales como células PER.C6 después de generar recombinantes con un plásmido de cadena principal de adenovirus en células de E. coli. Estos plásmidos lanzadera contienen policonectores o sitios de clonación múltiple para la inserción fácil de inmunógenos o antígenos aviares tales como, por ejemplo, inmunógenos o antígenos de la influenza aviar. La recombinación de los plásmidos lanzadera adenovirales junto con un plásmido auxiliar adenoviral como pAdEasy en células bacterianas (es decir, 55 BJ5183) se puede implementar fácilmente para producir los adenovirus humanos recombinantes que expresan antígenos o inmunógenos aviares para el uso de la invención. Los métodos de producción de vectores recombinantes mediante la clonación y el análisis de restricción son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Se pueden insertar motivos de secuencia específica tales como el motivo RGD en el bucle de H-I de un vector de adenovirus para aumentar su infectividad. Se ha demostrado que esta secuencia es esencial para la interacción de 60 ciertas proteínas de la matriz extracelular y de adherencia con una superfamilia de receptores de la superficie celular
denominadas integrinas. La inserción del motivo RGD puede ser ventajosamente útil en sujetos inmunocomprometidos. Se construye un recombinante de adenovirus por clonación de un antígeno o inmunógeno específico o fragmentos de los mismos en cualquiera de los vectores de adenovirus, tales como los descritos anteriormente. El adenovirus recombinante se utiliza para transducir células de un vertebrado utilizado como agente de inmunización. (Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 10/424.409). 5
Los vectores de adenovirus para su uso en la presente invención son útiles para el suministro de ácidos nucleicos que expresan antígenos o inmunógenos aviares a células in vivo. En particular, los vectores de la invención se pueden emplear ventajosamente para suministrar o transferir ácidos nucleicos a embriones aviares o a sujetos aviares por medio de la administración in ovo. Los ácidos nucleicos de interés incluyen ácidos nucleicos que codifican los péptidos o proteínas inmunogénicos (para vacunas). 10
Preferiblemente, los codones que codifican el antígeno o inmunógeno de interés son codones "optimizados", es decir, los codones son aquellos que aparecen con frecuencia, es decir, son genes aviares altamente expresados, en lugar de los codones que se utilizan con frecuencia, por ejemplo, influenza. Semejante uso de codones proporciona la expresión eficaz del antígeno o inmunógeno en células humanas o de aves. En otras realizaciones, por ejemplo, cuando el antígeno o inmunógeno de interés se expresa en bacterias, levaduras u otro sistema de expresión, el 15 patrón de uso de codones se altera para representar el sesgo de codones para genes altamente expresados en el organismo en el que está siendo expresado el antígeno o inmunógeno. Los patrones de uso de codones se conocen en la bibliografía para genes altamente expresados de muchas especies (p. ej., Nakamura et al., 1996; Wang et al., 1998; McEwan et al., 1998).
En general, los vectores de adenovirus se pueden utilizar para infectar una célula en cultivo para expresar un 20 producto génico deseado, p. ej., para producir una proteína o péptido de interés. Preferiblemente, la proteína o péptido se secreta al medio y se puede purificar a partir del mismo utilizando mecanismos rutinarios conocidos en la técnica, así como los proporcionados en la presente memoria. Las secuencias de péptido señal que dirigen la secreción extracelular de proteínas son conocidas en la técnica y las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas pueden ser conectadas operablemente a la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido o proteína de 25 interés por medio de mecanismos rutinarios conocidos en la técnica. Alternativamente, las células pueden ser lisadas y la proteína recombinante expresada puede ser purificada a partir del producto lisado celular. Preferiblemente, la célula es una célula animal, más preferiblemente una célula aviar o de mamífero. También se prefieren las células que son competentes para la transducción por adenovirus.
Tales células incluyen células PER.C6, células 911, y células HEK293. La descripción también comprende el uso de 30 células de ave, tales como, pero no limitadas a, fibroblastos de embriones aviares, tales como células DF-I, células madre de ave, tales como las descritas en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.872.561; 6.642042; 6.280.970; y 6.255.108, linfoblastos de ave, células epiteliales de ave, entre otras, tales como la cepa celular derivada de embrión de pollo CHCC-OU2 (Ogura, H. et al., 1987; Publicación de Patente Japonesa Núm. 9-173059), la cepa de células derivadas de codorniz QT-35 (Publicación de Patente Japonesa Núm. 9-98778). Cualquier célula 35 de ave que sea competente para la infección, transfección, o cualquier tipo de transferencia de genes puede ser utilizada en la práctica de la descripción.
Un medio de cultivo para el cultivo de células anfitrionas incluye un medio comúnmente utilizado para el cultivo de tejidos, tal como base de Earle M199, MEM de Eagle (E-MEM), MEM de Dulbecco (DMEM), SC-UCM1 02, UP-SFM (GIBCO BRL), EX-CELL302 (Nichirei), EX-CELL293-S (Nichirei), TFBM-01 (Nichirei), ASF 104, entre otros. Los 40 medios de cultivo adecuados para tipos de células específicos se pueden encontrar en la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) o en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Los medios de cultivo se pueden complementar con aminoácidos tales como L-glutamina, sales, agentes anti-fúngicos o antibacterianos tales como Fungizone®, penicilina-estreptomicina, suero animal, y similares. El medio de cultivo celular puede estar opcionalmente libre de suero. 45
La presente invención también proporciona vectores para su uso como vacunas como se reivindica en las reivindicaciones independientes 1 y 7. El inmunógeno o antígeno se pueden presentar en la cápside del adenovirus, de forma alternativa, el antígeno se puede expresar a partir de un antígeno o inmunógeno introducidos en un genoma de adenovirus recombinante y portado por los adenovirus de la invención. El vector de adenovirus puede proporcionar cualquier antígeno o inmunógeno de interés. Los ejemplos de inmunógenos se detallan en la presente 50 memoria.
Los antígenos o inmunógenos están preferiblemente asociados operablemente con las secuencias de control de la expresión apropiadas. Los vectores de expresión incluyen secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación (que puede tener origen bacteriano, p. ej., derivados de vectores bacterianos tales como pBR322, u orígene eucariótico, p. ej., secuencias de replicación autónoma (ARS)), un promotor, un potenciador, y 55 sitios de procesamiento de información necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación, señales de empaquetamiento, y secuencias terminadoras de la transcripción.
Por ejemplo, los vectores de adenovirus recombinantes para su uso en la invención pueden contener señales de control de la transcripción/traducción y señales de poliadenilación (p. ej., señales de poliadenilación derivadas de la
hormona de crecimiento bovina, señal de poliadenilación de SV40) apropiadas, asociadas operablemente con la secuencia o las secuencias de antígenos o inmunógenos que se deben suministrar a la célula diana. Se puede utilizar una variedad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y de la expresión específica del tejido deseados. El promotor puede ser constitutivo o inducible (p. ej., el promotor de la metalotioneína), dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor puede ser nativo o foráneo y puede ser una secuencia 5 natural o sintética. Por foráneo, se quiere significar que la región de inicio de la transcripción no se encuentra en el anfitrión de tipo salvaje en el que se introduce la región de inicio de la transcripción. El promotor se elige de modo que funcione en la célula o las células o el tejido o los tejidos diana de interés. En la presente invención se contemplan promotores específicos del cerebro, específicos del hígado, y específicos del músculo (incluyendo específicos de la musculatura esquelética, del corazón, de la musculatura lisa y/o del diafragma). También se 10 prefieren los promotores de mamíferos y aves.
El promotor puede ser ventajosamente un promotor "temprano". Los promotores "tempranos" son conocidos en la técnica y se definen como promotores que dirigen la expresión de un gen que se expresa rápida y transitoriamente en ausencia de la síntesis de proteínas de novo. El promotor también puede ser un promotor "fuerte" o "débil". Los términos "promotor fuerte" y "promotor débil" se conocen en la técnica y pueden ser definidos por la frecuencia 15 relativa de inicio de la transcripción (veces por minuto) en el promotor. Un promotor "fuerte" o "débil" también puede ser definido por su afinidad por la ARN polimerasa.
Más preferiblemente, los antígenos o inmunógenos están asociados operablemente, por ejemplo, con un promotor inmediato temprano principal de citomegalovirus humano (CMV), un promotor del virus de simios 40 (SV40), un promotor de β-actina, un promotor de albúmina, un promotor del Factor de elongación 1-α (EF1-α), un promotor de 20 PγK, un promotor de MFG, o un promotor del virus del sarcoma de Rous. Otras secuencias de control de la expresión incluyen promotores derivados de genes de inmunoglobulina, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del herpes, etcétera. También se puede utilizar cualquier promotor viral de mamífero en la práctica de la invención, además de cualquier promotor viral aviar. Entre los promotores de aves de origen viral, se pueden utilizar los promotores de genes tempranos inmediatos (es decir, ICP4, ICP27) del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), 25 tempranos (es decir, timidina quinasa, ADN helicasa, ribonucleótido reductasa) o tardíos (es decir, gB, gD, gC, gK) del virus de la enfermedad de Marek, (es decir, gB, gC, pp38, ρρ14, ICP4, Meq) o del virus del herpes de los pavos (p. ej., gB, gC, ICP4) en los vectores para el uso en la presente invención. Además, está dentro de la competencia del experto en la técnica seleccionar un promotor adecuado que exprese el antígeno o inmunógeno de interés a niveles suficientemente altos con el fin de inducir o provocar una respuesta inmunogénica al antígeno o inmunógeno, 30 sin experimentación indebida.
Se ha especulado que la conducción de la transcripción de nucleótidos heterólogos con el promotor de CMV puede dar lugar a regulación a la baja de la expresión en animales inmunocompetentes (véase, p. ej., Guo et al., 1996). En consecuencia, también se prefiere asociar operablemente las secuencias de antígeno o inmunógeno, por ejemplo, con un promotor de CMV modificado que no dé como resultado esta regulación a la baja de la expresión del 35 antígeno o inmunógeno.
Los vectores para su uso en la invención también pueden comprender un policonector o un sitio de clonación múltiple ("MCS"), que ventajosamente pueden estar situado aguas abajo de un promotor. El policonector proporciona un sitio para la inserción de las moléculas de antígeno o inmunógeno que están "en marco" con la secuencia promotora, dando como resultado la "conexión operativa" de la secuencia del promotor al antígeno o inmunógeno de 40 interés. Los sitios de clonación múltiple y los policonectores son bien conocidos para los expertos en la técnica. Según se utiliza en la presente memoria, el término "conectado operablemente" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida.
Dependiendo del vector, pueden estar presentes marcadores seleccionables que codifican resistencia a los antibióticos cuando se utilizan para la amplificación in vitro y la purificación del vector recombinante, y, en el contexto 45 de los sistemas adenovirales AdEasy, AdEasier, y AdHigh disponibles en el mercado, para controlar la recombinación homóloga entre un vector donador y un vector auxiliar adenoviral. Los sistemas AdEasy, AdEasier, y AdHigh facilitan la recombinación homóloga entre un vector donador y un vector auxiliar adenoviral en las secuencias ITR. Cada vector comprende un gen de resistencia a antibiótico diferente, y por selección dual, se pueden seleccionar los recombinantes que expresan el vector recombinado. Los ejemplos de tales genes de 50 resistencia a antibióticos que se pueden incorporar a los vectores para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, ampicilina, tetraciclina, neomicina, zeocina, kanamicina, bleomicina, higromicina, cloranfenicol, entre otros.
En realizaciones en las que hay más de un antígeno o inmunógeno, las secuencias de antígeno o inmunógeno pueden estar asociadas operativamente con un único promotor aguas arriba y una o más secuencias del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) (p. ej., la secuencia IRES de EMC de picornavirus). 55
En realizaciones de la invención en la que se transcribirán la secuencia o las secuencias del antígeno o inmunógeno y a continuación se traducirán en las células diana, se requieren generalmente señales de inicio específicas para una traducción eficaz de las secuencias de codificación de proteínas insertadas. Estas secuencias de control de la traducción exógenas, que pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes, pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. 60
Se puede utilizar cualquier antígeno o inmunógeno aviar derivado de un patógeno aviar en los vectores recombinantes para su uso en la invención. Los antígenos o inmunógenos preferidos incluyen, pero no se limitan a, antígenos o inmunógenos derivados del virus de la influenza aviar, tales como antígenos o inmunógenos de hemaglutinina, neuraminidasa, matriz, y nucleoproteína, antígenos del virus de la enfermedad infecciosa de la bursa tales como VP1, VP1s1, VP1s2, VP2 (Heine, HG et al., 1991; Dormitorio, T. V. et al., 1997; y Cao, Y.C. et al., 1998), 5 VP2S, VP3, VP4, VP4S y VP5, antígenos del virus de la enfermedad de Marek como la timidina quinasa, gA, gB, gC, gD, gE, gH, gl, y gL (Coussens et al., 1988); Ross et al. 1989); Ross et al., 1991); Publicación Internacional Núm. WO 90/02803 (1990); Brunovskis y Velicer, 1995); y Yoshida et al., 1994), Herpesvirus tales como antígenos del virus de la laringotraqueitis infecciosa incluyendo gA, gB, gD, gE, gl, y gG (Veits, J. et al., 2003), antígenos del virus de la bronquitis infecciosa aviar, tales como la glicoproteína de la espícula, proteína M integrante de membrana, 10 proteína E pequeña de la membrana, y poliproteína (Casais, R. et al., 2003), antígenos de reovirus aviar tales como las proteínas de la cápside, sigma NS, sigma A, sigma B, y sigma C (Spandidos, D. A. et al., 1976), poxvirus incluyendo antígenos de avipox, virus de la viruela aviar, de la viruela del canario, de viruela del pichón, de la viruela de la codorniz, y de la viruela de la paloma tales como la timidina quinasa, antígenos de poliomavirus aviar tales como VP1, VP2, VP3, y VP4 (Rott, O. et al., 1988), antígenos del virus de la enfermedad de Newcastle, tales como 15 las proteínas HN, P, NP, M, F y L (revisado en Alexander, DJ., 1990), antígenos de pneumovirus aviar SH, F, G y N (Seal, B. S., 2000), antígenos del virus de la rinotraqueitis aviar tales como la glicoproteína, matriz, fusión y nucleocápside (Cook, J.K., 1990), antígenos de virus de la reticuloendoteliosis aviar tales como p29, envoltura, gag, proteasa y polimerasa (Dornburg, R. 1995), retrovirus aviares incluyendo los antígenos del virus del carcinoma aviar gag, pol y env, gag, pol, env, cápside, y proteasa de virus endógeno aviar (Rovigatti, U.G. et al., 1983), gag, erbA, 20 erbB del virus de la eritroblastosis aviar (Graf, T. et al., 1983), proteína del núcleo, pol, y proteína de la superficie del virus de la hepatitis aviar (Cova, L. et al., 1993), VP1, VP2, VP3 del virus de la anemia aviar (Rosenberger, J.K. et al., 1998), antígenos de la polimerasa, proteína 52K, pentona, Ilia, y proteínas del núcleo del virus de la enteritis aviar (Pitcovski, J. et al., 1988), proteína IE, glicoproteína K, helicasa, glicoproteína N, VP11-12, glicoproteína H, timidina quinasa, glicoproteína B, y fosfoproteína nuclear del virus de la enfermedad de Pacheco (Kaleta E.F., 1990), 25 antígenos de la envoltura, gag, y polimerasa del virus de la leucemia aviar (Graf, T. et al., 1978), antígenos de parvovirus aviar, rotavirus aviar como NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, y VP7 (Mori, Y. et al., 2003; Borgan, M. A. et al., 2003), antígenos del virus de la leucosis aviar tales como la envoltura, gag, y la polimerasa (Bieth, E. et al., 1992); virus del fibrosarcoma musculoaponeurótico aviar (Kawai, S. et al., 1992), antígenos pi 5, p27, envoltura, gag, y polimerasa, nucleocápside, y gs-b del virus de la mieloblastosis aviar (Joliot, V. 30 et al., 1993), virus asociado a la mieloblastosis aviar (Perbal, B., 1995), virus de la mielocitomatosis aviar (Petropoulos, C.J., 1997), antígenos del virus de sarcoma aviar tales como pi 9 y envoltura (Neckameyer, W.S. et al., 1985), y gag, envoltura, y polimerasa del virus de la necrosis del bazo aviar (Purchase, H.G. et al., 1975).
Otros inmunógenos/antígenos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen antígenos bacterianos aviares de cepas de Pasteurella multocida, tales como la proteína capsular de 39 kDa (AIi, H.A. et al., 35 2004; Rimler, R.B. 2001), proteína de la membrana externa de 16 kDa (Kasten, R.W., et al., 1995), lipopolisacárido (Baert, K. et al., 2005), Escherichia coli, tales como fimbrias tipo 1, fimbrias P, y rizadas (Roland, K. et al., 2004); adhesina de pilus Fl, adhesina de pilus P, proteína receptora de aerobactina, y lipopolisacárido (Kariyawasam, S. et al., 2002), Mycoplasma gallisepticum, tal como el antígeno de la membrana principal pMGA (también conocido como P67, Jan, G. et al., 2001; Noormohammadi, A.H. et al., 2002a), TM-I (Saito, S. et al., 1993), adhesina (Barbour, E.K. 40 et al., 1989), P52 (Jan, G. et al., 2001) antígeno de aglutinación en placas con suero (SPA) (Ahmad, I. et al., 1988), Mycoplasma gallinaceum, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallopavonis, Mycoplasma synoviae, incluyendo antígenos tales como antígeno de membrana principal MSPB (Noormohammadi, A. H. et al., 2002b) y proteína de 165 kDa (Ben Abdelmoumen, B. et al., 1999), Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma iowae, Mycoplasma pullorum, Micoplasma imitaus, Salmonella enteritidis tal como flagelina, porinas, OmpA, y fimbrias SEF21 y SEF14 (Ochoa-45 Reparaz, J. et al., 2004), serovariedades de Salmonella enterica tales como Gallinarum y Typhimurium que expresan, por ejemplo, SEF 14 y SEF21 (Li, W. et al., 2004), Campylobacter jejuni, tal como flagelina, antígeno de 67 kDa, proteínas Cj aA, Cj aC, y Cj aD (Widders, P. R. et al., 1998; Wyszynska, A. et al., 2004), Haemophilus paragallinarum tales como los antígenos de tipo hemaglutinina de los serogrupos A, B, y C (Yamaguchi, T. et al., 1988), Riemerella anatipestifer, tales como antígenos de bacterina (Higgins, D. A. et al., 2000), cepas de Chlamydia 50 psittaci tales como las serovariedades A y 6B y que expresan, por ejemplo, la proteína de la membrana externa principal (MOMP) (Vanrompay, D. et al., 1999), Erysipelothrix rhusiopathiae incluyendo el antígeno de la proteína de 66-64 kDa (Timoney, J. F. et al., 1993), Erysipelothrix iusidiosa tal como bacterina (Bigland, C.H. y Matsumoto, J.J., 1975), Brucella abortus, tales como los antígenos P39 y bacterioferrina (Al-Mariri, A. et al., 2001), Borrelia anserina tal como la proteína de la superficie externa principal de 22 kilodalton (Sambri, V. et al., 1999), proteína de 55 membrana externa P66 (Bunikis, J. et al., 1998), y OspC (Marconi, T. R. et al., 1993), Alcaligenes faecalis, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, entre muchos otros.
La invención también comprende el uso de inmunógenos/antígenos derivados de antígenos de protozoos aviares, tales como, pero no limitados a Eimeria acervulina tal como antígeno 3-IE (Lillehoj, H.S. et al., 2005; Ding, X. et al., 2004), antígenos de complejo apical (Constantinoiu, C.C. et al., 2004), y lactato deshidrogenasa (Schaap, D. et al., 60 2004), Eimeria maxima tales como las proteínas antigénicas gam56 y gam82 (Belli, S. I. et al., 2004) de 56 y 82 kDa (Belli, S. I. et al., 2002), y EmTFP250 (Witcombe, D. M. et al., 2004), Eimeria necatrix tal como la proteína de 35 kD (Tajima, O. et al., 2003), Eimeria tenella tales como los productos génicos de TA4 y SO7 (Wu, S.Q. et al., 2004; Pogonka, T. et al., 2003) y proteína de la pared de ooquistes de 12 kDa (Karim, MJ. et al., 1996), Eimeria
vermiformis, Eimeria adenoeides, Leucocytozoon caulleryi tales como el antígeno de la membrana externa R7 (Ito, A., et al., 2005), Plasmodium relictum, Plasmodium gallinaceum tal como la proteína CSP (Grim, K.C. et al., 2004) y los antígenos proteicos de 17 y 32 kDa (Langer, R. C. et al., 2002), y Plasmodium elongatum, entre otros.
Una realización preferida de la invención utiliza antígenos o inmunógenos virales de la influenza aviar. La invención también proporciona un vector recombinante para su uso como se ha reivindicado que expresa varios antígenos o 5 inmunógenos aviares, tales como, por ejemplo, una vacuna multivalente o composición inmunogénica que puede proteger las aves contra múltiples enfermedades de las aves con una sola inyección. El virus de la influenza aviar se han transmitido a los seres humanos, cerdos, caballos, e incluso mamíferos marinos, y han sido los principales contribuyentes a la aparición de pandemias de influenza en seres humanos. Los virus de la influenza, que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae, se clasifican como A, B, y C basándose en las diferencias antigénicas en 10 su nucleoproteína (NP) y proteína de la matriz (M1). Los virus de la influenza aviar AU se clasifican como de tipo A. La subtipificación adicional se basa en la antigenicidad de dos glicoproteínas de la superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Actualmente, se han identificado 15 subtipos de HA y 9 subtipos de NA entre los virus de influenza A (Murphy, B. R. et al., 1996; Rohm, C. et al., 1996b). Las secuencias de aminoácidos de la región HA1, que es responsable de la antigenicidad de la HA, difieren de subtipo a subtipo en 30% o más (Rohm, C. et al., 15 1996b). Aunque se encuentran virus con todos los subtipos de HA y NA en las especies de aves, los subtipos virales de virus de la influenza de mamíferos son limitados.
Los virus de la influenza aviar A se definen por su virulencia; tipos altamente virulentos que pueden causar plagas en la volatería, y tipos no virulentos que por lo general causan únicamente una enfermedad leve o una infección asintomática. En casos raros, sin embargo, los virus con baja patogenicidad en el laboratorio ocasionan brotes de 20 enfermedades graves en el campo. No obstante, la morbilidad y la mortalidad asociadas con estos virus tienden a ser mucho más bajas que las causadas por los virus letales.
Los virus de la influenza aviar altamente virulentos han causado brotes en la volatería en Australia (1976 [H7] (Bashiruddin, J.B. et al., 1992); 1985 [H7] (Cross, G.M., 1987; Nestorowicz, A. et al., 1987), 1992 [ H7] (Perdue, MX et al., 1997), 1995 [H7], y 1997 [H7]), Inglaterra (1979 [H7] (Wood, G. W., et al., 1993) y 1991 [H5] (Alexander, DJ et 25 al., 1993), Estados Unidos (1983 a 1984 [H5] (Eckroade, RJ. et al., 1987), Irlanda (1983 a 1984 [H5]) (Kawaoka, Y. et al., 1987), Alemania (1979 [H7] (Rohm, C. et al., 1996a), México (1994 a 1995 [H5] (García, M. et al., 1996; Horimoto, T. et al., 1995), Pakistán (1995 [H7] (Perdue, MX. et al., 1997), Italia (1997 [H5]), y Hong Kong (1997 [H5] (Claas, EJ. et al., 1988). Sin desear estar limitado por ninguna teoría, se cree que todos los virus de la influenza aviar A patógena son de subtipo H5 o H7, aunque la razón de esta especificidad de subtipo sigue siendo 30 desconocida. No parece haber ninguna asociación de los subtipos de NA con los virus virulentos. Dos subtipos adicionales, H4 [A/Chicken/Alabama/7395/75 (H4N8)] (Johnson, D.C. et al., 1976) y H10 [A/Chicken/Germany/N/49 (H10N7)], han sido aislados de pollos durante graves brotes de tipo plaga en la volatería.
Las estructuras de los virus de la influenza A son bastante similares (Lamb, R. A. et al., 1996). Por medio de microscopía electrónica, los virus son pleomórficos, incluyendo viriones que son más o menos esféricos 35 (aproximadamente 120 nm de diámetro) y filamentosos. Dos tipos distintos de espículas (de aproximadamente 16 nm de longitud), que corresponden a las moléculas de HA y NA, residen en la superficie de los viriones. Estas dos glicoproteínas se anclan a la envoltura lipídica derivada de la membrana plasmática de las células anfitrionas mediante secuencias cortas de aminoácidos hidrófobos (región transmembrana). La HA es una glicoproteína de tipo I, que contiene un ectodominio N-terminal y un ancla C-terminal, mientras que NA es una glicoproteína de tipo II, que 40 contiene un ancla N-proximal y un ectodominio C-terminal. La HA permite que el virión se ancle a los sialiloligosacáridos de la superficie celular (Paulson, J.C., 1985) y es responsable de su actividad hemaglutinante (Hirst, G.K., 1941). La HA da lugar a anticuerpos neutralizantes del virus que son importantes en la protección contra la infección. La NA es una sialidasa (Gottschalk, A., 1957) que impide la agregación del virión mediante la eliminación de ácido siálico de la superficie celular y del virión (el radical principal en los sialiloligosacáridos 45 reconocidos por HA) (Paulson, J. C, 1985). Los anticuerpos para NA también son importantes en la protección de los anfitriones (Webster, R. G., et al., 1988).
Además de la HA y la NA, se encuentra integrado en los viriones un número limitado de proteínas M1 (Zebedee, S. L. et al., 1988). Éstas forman tetrámeros, tienen actividad de canal iónico H1, y, cuando son activadas por el pH bajo en los endosomas, acidulan el interior del virión, lo que facilita su descapsidación (Pinto, L.H. et al., 1992). Se piensa 50 que la proteína M1 que se encuentra dentro de la envoltura funciona en el montaje y la gemación. Ocho segmentos de moléculas de ARN de hebra sencilla (efectora negativa, o complementaria al ARNm) están contenidos dentro de la envoltura viral, en asociación con NP y tres subunidades de la polimerasa viral (PB1, PB2, y PA), que en conjunto forman un complejo de ribonucleoproteína (RNP) que participa en la replicación y la transcripción del ARN. Se piensa que la proteína NS2, que ahora se sabe que existe en viriones (Richardson, J.C. et al., 1991; Yasuda, J. et 55 al., 1993), desempeña un papel en la exportación de la RNP desde el núcleo (O'Neill, R.E. et al., 1998) a través de la interacción con la proteína M1 (Ward, A.C. et al., 1995). La proteína NS1, la única proteína no estructural del virus de la influenza A, tiene múltiples funciones, incluyendo la regulación del corte y empalme y la exportación nuclear de los ARNm celulares, así como la estimulación de la traducción (Lamb, R. A. et al., 1996). Se cree que su función principal es contrarrestar la actividad del interferón del anfitrión, ya que un virus con NS1 inactivada era viable a 60 pesar de que crecía con menos eficacia que el virus parental en las células no carentes de interferón (Garcia-Sastre, A. et al., 1988).
Los inmunógenos o antígenos de la influenza aviar útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, HA, NA, así como M1, NS2, y NS1. Los inmunógenos o antígenos de la influenza aviar particularmente preferidos son HA y NA. Los inmunógenos o antígenos de la influenza aviar pueden derivar de cualquier cepa conocida de IA, incluyendo todas las cepas aviares de la influenza A, productos aislados clínicos, productos aislados de campo, y recombinaciones de los mismos. Los ejemplos de tales cepas y subtipos incluyen, pero no se limitan a, H10N4, 5 H10N5, H10N7, H10N8, H10N9, H11N1, H11N13, H11N2, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N8, H13N2, H13N3, H13N6, H13N7, H14N5, H14N6, H15N8, H15N9, H16N3, H1N1, H1N2, H1N3, H1N6, H2N1, H2N2, H2N3, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N5, H7N7, H7N8, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, 10 H9N7, H9N8, y H9N9. La invención también se refiere al uso de inmunógenos o antígenos de la influenza aviar mutados o alterados de otro modo que reflejan, entre otras cosas, la deriva antigénica y el cambio antigénico.
La antigenicidad de los virus de la influenza cambia gradualmente por medio de mutaciones puntuales (deriva antigénica) o drásticamente por medio de recombinación genética (cambio antigénico) (Murphy, B. R. et al., 1996). Se piensa que la presión inmunológica en HA y NA dirige la deriva antigénica. El cambio antigénico puede estar 15 causado por una transmisión directa de virus de la influenza no humanos a los seres humanos o de la redistribución de los genes a partir de dos virus de influenza diferentes que han infectado una sola célula (Webster, R.G. et al., 1982). Teóricamente, se pueden producir 256 combinaciones diferentes de ARN a partir del barajado de los ocho segmentos genómicos diferentes del virus. La redistribución genética está bien documentada tanto in vitro como in vivo en condiciones de laboratorio (Webster, R. G. et al., 1975). Más importante aún, las infecciones mixtas se 20 producen con relativa frecuencia en la naturaleza y pueden conducir a una redistribución genética, dando como resultado nuevos productos aislados de campo, formas híbridas, o formas redistribuidas (Bean, WJ. et al., 1980; Hinshaw, V.S. et al., 1980; Young, J.F., et al., 1979). La re-emergencia de un virus previamente circulante es otro mecanismo por el cual se puede producir el cambio antigénico.
Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de inmunógenos o antígenos de la influenza aviar que han sido 25 sometidos a deriva antigénica o cambio antigénico, incluyendo productos aislados clínicos de la influenza aviar, productos aislados de campo o del medio ambiente de la influenza aviar, formas híbridas, y formas redistribuidas de la influenza aviar. Además, la invención comprende el uso de más de un inmunógeno o de antígeno de la influenza aviar en los vectores y métodos descritos en la presente memoria, suministrados ya sea en vectores recombinantes separados, ya sea juntos en un vector recombinante con el fin de proporcionar una vacuna de la influenza aviar 30 multivalente o una composición inmunogénica que estimula o modula la respuesta inmunogénica a una o más cepas y/o híbridos de la influenza aviar.
Muchas especies de aves domésticas y salvajes están infectadas con el virus de la influenza. Estas incluyen pollos, pavos, patos, gallinas de guinea, gansos domésticos, codornices, faisanes, perdices, pájaros myna, paseriformes, psitácidos, periquitos, gaviotas, aves costeras, aves marinas y emú (Easterday, B.C. et al., 1997; Webster, R.G. et 35 al., 1988). Algunas aves infectadas muestran síntomas de influenza, mientras que otras no lo hacen. Entre las especies de aves domésticas, los pavos son los más frecuentemente implicados en brotes de influenza; los pollos también han estado implicados pero con menos frecuencia. Los virus de la influenza A aviar producen una gran variedad de síndromes en las aves, que van desde infecciones respiratorias de las vías altas de asintomáticas a leves o desde la pérdida de la producción de huevos a enfermedad sistémica rápidamente fatal (Eckroade, RJ. et al., 40 1987). La gravedad de la enfermedad depende de múltiples factores, incluyendo la virulencia del virus, el estado inmunitario y la dieta del anfitrión, las infecciones bacterianas concomitantes, y las tensiones impuestas en el anfitrión. Dependiendo de su patogenicidad en pollos y pavos, los virus de la influenza A aviar se clasifican como virulentos (capaces de causar una plaga en la volatería) o avirulentos (que causa una enfermedad leve o asintomática). Incluso cuando resultan altamente patógenos para una especie aviar, los virus de la influenza A 45 pueden no ser patógenos para otra especie aviar (Alexander, DJ. et al., 1986). Por ejemplo, los patos son típicamente resistentes a los virus que son letales en los pollos. Como otro ejemplo, A/Turkey/Ireland/1378/85 (H5N8), que mata fácilmente pollos y pavos, no causa síntomas de enfermedad en patos, a pesar de que puede ser detectada en una variedad de órganos internos y en la sangre de aves infectadas (Kawaoka, Y. et al., 1987).
Los virus de la influenza son secretados desde el tracto intestinal en las heces de las aves infectadas (Kida, H., et 50 al., 1980; Webster, R. G. et al., 1978). Los modos de transmisión pueden ser directos o indirectos; incluyendo el contacto con aerosoles y otros materiales contaminados por el virus. Dado que las aves infectadas excretan grandes cantidades de virus en sus heces, muchos elementos diferentes pueden ser contaminados (p. ej., alimento, agua, equipo y jaulas) y contribuir a la difusión del virus. La transmisión por el agua puede proporcionar un mecanismo para la perpetuación año a año de los virus de la influenza aviar en los hábitats naturales de las aves acuáticas. Los 55 signos y síntomas típicos manifestados por las aves comerciales, tales como la volatería infectada con virus de la influenza aviar altamente patógenos incluyen la disminución de la producción de huevos, signos respiratorios, estertores, lagrimeo excesivo, sinusitis, cianosis en la piel sin plumas (especialmente las crestas y barbillas), edema de la cabeza y cara, plumas erizadas, diarrea y trastornos del sistema nervioso.
El número de características que presentan depende de la especie y la edad del ave, de la cepa del virus y de las 60 infecciones bacterianas concomitantes (Easterday, B.C. et al., 1997; Webster, R. G. et al., 1988). De vez en cuando, un ave morirá sin mostrar ningún signo de enfermedad (Alexander, DJ. et al., 1993; Wood, G. W., et al., 1994). Las
lesiones macroscópicas e histológicas en los pollos inoculados con virus altamente patógenos son bastante similares, pero muestran cierta variación con la cepa (Alexander, DJ. et al., 1986; Mo, LP. et al., 1997; Swayne, D. E. et al., 1997). Algunas de las diferencias entre los casos referidos pueden reflejar diferencias en las condiciones experimentales, incluyendo la vía de inoculación, la raza y edad de los pollos, y la dosis de virus. La inflamación del endotelio microvascular, la congestión sistémica, las hemorragias multifocales, la infiltración de células 5 mononucleares perivasculares, y la trombosis se observan comúnmente en pollos infectados con virus altamente virulentos. Tales virus replican de manera eficaz en el endotelio vascular y las células parenquimatosas perivasculares, una propiedad que puede ser importante para la difusión viral y la infección sistémica (Kobayashi, Y. et al., 1996; Suarez, D. L. et al., 1998). Los antígenos virales también se pueden encontrar en los miocitos cardíacos necróticos además de las células de otros órganos con cambios necróticos e inflamatorios (Kobayashi, Y. et al., 10 1996).
La presente descripción también se refiere a métodos de expresión de uno o más antígenos o inmunógenos en una célula. Como etapa preliminar en el laboratorio, el antígeno o inmunógeno pueden ser reemplazados en cambio por una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica proteínas y péptidos que incluyen aquellas proteínas indicadoras codificantes (p. ej., una enzima). Las proteínas indicadoras son conocidas en la técnica e incluyen, pero 15 no se limitan a, los genes de la Proteína Verde Fluorescente, la β-galactosidasa, la β-glucuronidasa, la luciferasa, la fosfatasa alcalina, y la cloranfenicol acetiltransferasa. Muchas de estas proteínas indicadoras y los métodos para su detección se incluyen como una parte de muchos kits de diagnóstico disponibles comercialmente. El antígeno o inmunógeno de interés pueden codificar un ácido nucleico antisentido, ARN de interferencia pequeños (ARNip), una ribozima, u otros ARN no traducidos, tales como ARN "guía" (Gorman et al., 1998), y similares. 20
Los vectores recombinantes para su uso en la invención también comprenden el uso de proteínas terapéuticas o moléculas coadyuvantes que pueden modular la respuesta inmunitaria tras el suministro de vectores recombinantes o composiciones inmunogénicas. Tales proteínas terapéuticas o moléculas coadyuvantes pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas inmunomoduladoras tales como interleuquinas, interferón, y moléculas co-estimuladoras. Las citoquinas aviares que son conocidas en la técnica por modular respuestas inmunitarias en un sujeto aviar son 25 interferón-α (IFN α) de pollo (Karaca, K. et al., 1998; Schijns, V.E. et al., 2000), interferón-γ (IFN γ) de pollo, interleuquina-1β (ChIL-1β) de pollo (Karaca, K. et al., 1998), interleuquina-2 (ChIL-2) de pollo (Hilton, L.S. et al., 2002), y factor de crecimiento mielomonocítico (cMGF1) de pollo (York, JJ. et al., 1996; Djeraba, A. et al., 2002). Las moléculas inmunomoduladoras pueden ser co-administradas con las composiciones inmunogénicas de la invención, o alternativamente, el ácido nucleico de la molécula o las moléculas inmunomoduladoras puede ser co-expresado 30 junto con los inmunógenos o antígenos aviares en los vectores recombinantes para su uso en la invención.
La expresión en el sujeto de la secuencia heteróloga, es decir, los inmunógenos de la influenza aviar, puede dar como resultado una respuesta inmunitaria en el sujeto a los productos de expresión del antígeno o inmunógeno. Por lo tanto, los vectores recombinantes de la presente descripción se pueden utilizar en una composición inmunológica o vacuna para proporcionar un medio para inducir una respuesta inmunitaria, que puede, pero no necesita ser, 35 protectora. Las técnicas de biología molecular utilizadas en el contexto de la invención son descritas por Sambrook et al. (2001).
Incuso más alternativamente o adicionalmente, en las composiciones inmunogénicas o inmunológicas para el uso incluido en la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica los antígenos o inmunógenos puede tener una deleción de la porción que codifica un dominio transmembrana. Incluso más alternativamente o adicionalmente, 40 la composición de vector o inmunogénica puede contener y expresar además en una célula anfitriona, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal tPA heteróloga tal como tPA humana o aviar y/o un intrón estabilizador, tal como el intrón II del gen de la ß-globina de conejo.
La presente descripción también proporciona un método de suministro y/o administración de una secuencia de nucleótidos heteróloga a una célula in vitro o in vivo. De acuerdo con este método, una célula se infecta con un 45 vector de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la presente invención (como se describe en detalle en la presente memoria). La célula puede ser infectada con el vector de adenovirus por el proceso natural de la transducción viral. Alternativamente, el vector puede ser introducido en la célula por cualquier otro método conocido en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ponerse en contacto con un vector de adenovirus elegido como diana (como se describe a continuación) y absorberse por un mecanismo alternativo, p. ej., mediante endocitosis 50 mediada por receptor. Como otro ejemplo, el vector puede ser dirigido a una proteína de la superficie celular internalizante utilizando un anticuerpo u otra proteína de unión.
Se puede administrar un vector a un sujeto aviar en una cantidad para lograr las cantidades indicadas para las composiciones de producto génico (p. ej., epítopo, antígeno, agente terapéutico, y/o anticuerpo). Por supuesto, la invención prevé dosis por debajo y por encima de las ilustradas en la presente memoria, y para cualquier 55 composición que se vaya a administrar a un sujeto aviar, incluyendo los componentes de la misma, y para cualquier método particular de administración, se prefiere determinar: la toxicidad, por ejemplo mediante la determinación de la dosis letal (DL) y la DL50 en un modelo aviar adecuado; y, la dosificación de la composición o las composiciones, la concentración de los componentes en la misma y el momento de administración de la composición o las composiciones, que provocan una respuesta adecuada, por ejemplo titulaciones de los sueros y análisis de los 60 mismos, p. ej., mediante ELISA y/o análisis de seroneutralización. Tales determinaciones no requieren
experimentación excesiva desde el conocimiento del experto en la técnica, de esta descripción y de los documentos citados en la presente memoria.
Los ejemplos de composiciones de la descripción incluyen preparaciones líquidas para la administración en orificios, o en la mucosa, p. ej., oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., tales como suspensiones, soluciones, pulverizaciones, jarabes o elixires; y, preparaciones para la administración parenteral, epicutánea, subcutánea (es 5 decir, a través del cuello inferior), intradérmica, intraperitoneal, intramuscular (es decir, a través de punción en la membrana del ala, la punta del ala, la musculatura pectoral y del muslo), intranasal, o intravenosa (p. ej., administración inyectable) tales como suspensiones o emulsiones estériles. Se hace referencia a la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.716.823 presentada el 6 de abril de 2004; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.706.693 presentada el 16 de marzo de 2004; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.348.450 presentada el 19 de febrero 10 de 2002; Solicitudes de los Estados Unidos Núms. de Serie 10/052.323 y 10.116.963; y 10/346.021, que describen la inmunización y el suministro de composiciones inmunogénicas o de vacuna a través de un modo no invasivo de suministro, es decir, administración epicutánea e intranasal. Otros métodos de administración y suministro a aves incluyen la administración de los vectores recombinantes o composiciones inmunogénicas en el agua potable o el alimento, en donde la dosis de la vacuna se puede seleccionar entre 101 y 104 por animal. 15
Para las inyecciones intramusculares, la administración se puede producir a través del pecho (pectorales), la pata (muslo superior/musculatura del flanco lateral), membrana del ala (patagio), bajo las alas (axila), y la punta del ala. La longitud y el diámetro (calibre) de la aguja utilizada debe ser tal que permita el suministro de la vacuna al centro del músculo elegido.
Un método de administración particularmente preferido es el suministro in ovo (Gildersleeve, R.P., 1993a; 20 Gildersleeve, R.P. et al., 1993b; Sharma, J.M., 1985; Sharma, J.M. et al., 1984). El suministro in ovo está emergiendo como un método prometedor para la inmunización en masa de aves ya que la administración de una dosis uniforme de vacunas por medio de un inyector robótico ahorra tanto mano de obra como tiempo (Johnston et al., 1997; Oshop et al., 2002). Hasta la fecha, más de 80% de los pollos de engorde comerciales de los Estados Unidos son tratados in ovo con un inyector mecanizado contra la enfermedad de Marek (Wakenell et al., 2002). Este 25 método también se utiliza cada vez más para administrar las vacunas contra la bursitis infecciosa aviar (IBD) y la enfermedad de Newcastle (ND). Las respuestas inmunitarias también se han originado en los pollos por medio de suministro in ovo de vacunas de ADN (Kapczynski et al., 2003; Oshop et al., 2003) y una vacuna vectorizada de alfavirus replicante (Schultz-Cherry et al., 2000). En comparación con sus contrapartes de replicación, el ADN, y los vectores virales, las vacunas y las composiciones inmunogénicas in ovo son menos propensos a matar o dañar el 30 embrión y los vectores de Ad, en particular, tienen una tasa de cumplimiento más alta debido a su incompetencia para replicar in ovo.
Los sistemas, aparatos y dispositivos mecanizados, tales como los disponibles comercialmente como INOVOJECT®, inyectan cuidadosamente compuestos, vacunas y composiciones inmunogénicas en volúmenes calibrados con precisión, sin causar un trauma en el embrión en desarrollo, lo que reduce la manipulación del polluelo, mejorando 35 de la manejabilidad de la incubación a través de la automatización, y reduciendo los costes de producción en vivo. INOVOJECT® y otros sistemas, dispositivos o aparatos mecanizados, funcionan haciendo bajar suavemente un cabezal de inyección sobre la parte superior del huevo y perforando con un punzón hueco de pequeño diámetro una pequeña abertura en la cáscara. Una aguja desciende a través de un tubo a una profundidad controlada (por lo general 2,54 cm), se suministra un pequeño volumen, pre-determinado de la vacuna, composición inmunogénica, o 40 compuesto al embrión, y luego se retira la aguja y se limpia con un lavado de esterilización. Los métodos de la vacuna in ovo y de la administración de genes se pueden encontrar en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.458.630; RE 35973; 6.668.753; 6.601.534; 6.506.385; 6.395.961; 6.286.455; 6.244.214; 6.240.877; 6.032.612; 5.784.992; 5.699.751; 5.438.954; 5.339.766; 5.176.101; 5.136.979; 5.056.464; 4.903.635; 4.681.063; Solicitudes de los Estados Unidos con los Núm. de Serie 10/686.762, presentada el 16 de octubre de 2003; 10/216.427, presentada 45 el 9 agosto de 2002; 10/074/714, presentada el 13 de febrero de 2002; y 10/043,025, presentada el 9 de enero de 2002. En consecuencia, la descripción contempla un dispositivo o aparato para el suministro o la administración in ovo de vectores recombinantes, vacunas o composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria. El dispositivo o aparato pueden comprender opcionalmente los vectores de adenovirus humanos recombinantes o composiciones inmunogénicas para su uso en la presente invención, es decir, pueden ser pre-cargados con los 50 vectores o las composiciones inmunogénicas para la administración in ovo en un ave.
La invención también comprende la administración secuencial de composiciones de la invención o la realización secuencial de los métodos de la presente memoria, p. ej., la administración periódica de composiciones de la invención, tal como en el curso de la terapia o tratamiento para una afección y/o administración de refuerzo de composiciones inmunológicas y/o en regímenes de cebado-refuerzo; y, el tiempo y forma para las administraciones 55 secuenciales se pueden determinar sin experimentación indebida. Adicionalmente, la descripción comprende composiciones y métodos para elaborar y utilizar vectores, incluidos los métodos para la producción de productos génicos y/o productos inmunológicos y/o anticuerpos in vivo y/o in vitro y/o ex vivo (p. ej., siendo los dos últimos, por ejemplo, después del aislamiento del mismo a partir de las células de un anfitrión al que se ha realizado una administración de acuerdo con la invención, p. ej., después de la expansión opcional de tales células), y los usos de 60 tales genes y/o productos inmunológicos y/o anticuerpos, incluyendo diagnósticos, análisis, terapias, tratamientos, y similares.
Las composiciones de vectores se formulan mezclando el vector con un portador o diluyente adecuados; y, el producto génico y/o el producto inmunológico y/o las composiciones de anticuerpos se formulan igualmente mezclando el gen y/o el productos inmunológico y/o el anticuerpo con un portador o diluyente adecuados; véanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.990.091, los documentos WO 99/60164, WO 98/00166, documentos citados en los mismos, y otros documentos citados en la presente memoria, y otras enseñanzas de la presente 5 memoria (por ejemplo, con respecto a los portadores, diluyentes y similares).
En tales composiciones, los vectores recombinantes pueden estar mezclados con un portador, diluyente, o excipiente aceptables adecuados desde el punto de vista veterinario o farmacéutico tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, 10 coadyuvantes, gelificantes o aditivos aumentadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada.
Se ha sabido que el DMSO aumenta la potencia de las composiciones de vacuna e inmunogénicas, en particular en lo que respecta al suministro in ovo de vectores o composiciones inmunogénicas que comprenden vectores. Se cree que el DMSO aumenta la potencia de las vacunas mediante el aumento de la permeabilidad de las membranas 15 celulares (Oshop et al., 2003). Se pueden utilizar en la formulación de vacunas o composiciones inmunogénicas otros agentes o aditivos que son capaces de permeabilizar las células, reducir la viscosidad del líquido amniótico, y presentar una tasa de cumplimiento superior en comparación con el DMSO, especialmente cuando se administran mediante suministro in ovo. Se ha demostrado que la absorción de una variedad de proteínas, tales como la insulina, la leptina, y la somatotropina, es mejorada por tensioactivos tales como tetradecil-maltósido (TDM) sin efectos 20 secundarios apreciables, después de la administración intranasal (Arnold, et al., 2004). Por consiguiente, la presente invención comprende el uso de TDM en las composiciones para el uso descrito en la presente memoria.
Las formulaciones que contienen TDM al 0,125% pueden causar alteraciones moderadas en la morfología celular, mientras que las concentraciones más altas de TDM (es decir, 0,5%) pueden inducir transitoriamente cambios morfológicos más extensos. Se cree que el TDM mejora el suministro del vector en un entorno in ovo debido al moco 25 nasal viscoso en los mamíferos y al líquido amniótico de los huevos embrionados de aves. El perfil de seguridad del TDM como describen Arnold, et al., (2004) también es particularmente ventajoso para promover la salud de aves inmunizadas y el cumplimiento para la introducción en la cadena alimentaria.
La cantidad de vector que se va a administrar variará para el sujeto y la afección que se vaya a tratar y variará de uno o unos pocos a unos pocos cientos o miles de microgramos de peso corporal por día y preferiblemente la dosis 30 de vacuna o composición inmunogénica elegida estará preferiblemente entre 101 - 106 unidades formadoras de placas (UFP), preferiblemente de 102-105 UFP por ave. Para la inyección, las vacunas que contienen el título anterior deben ser diluidas con un líquido farmacéuticamente o veterinariamente aceptable tal como solución salina fisiológica hasta un volumen final de aproximadamente 0,1 ml o 0,01 ml en el caso de administración a la membrana del ala. Los vectores y métodos de la presente descripción permiten la vacunación in ovo y la vacunación de 35 polluelos de 1 día, así como la vacunación de polluelos de mayor edad y adultos.
Un vector puede ser administrado de manera no invasiva a un sujeto aviar en una cantidad para lograr las cantidades indicadas para las composiciones de producto génico (p. ej., epítopo, antígeno, agente terapéutico, y/o anticuerpo). Por supuesto, la invención prevé dosis por debajo y por encima de las ilustradas en la presente memoria, y para cualquier composición que se vaya a administrar a un sujeto aviar, incluyendo los componentes de 40 la misma, y para cualquier método particular de administración, se prefiere determinar: la toxicidad, por ejemplo mediante la determinación de la dosis letal (DL) y DL50 en un modelo aviar adecuado; y, la dosificación de la composición o las composiciones, la concentración de los componentes en la misma y el momento de administración de la composición o las composiciones, que provocan una respuesta adecuada, por ejemplo mediante titulaciones de los sueros y análisis de los mismos, p. ej., mediante ELISA y/o análisis de seroneutralización. Tales 45 determinaciones no requieren experimentación excesiva a partir del conocimiento del experto en la técnica, de esta descripción y de los documentos citados en la presente memoria.
Los vectores recombinantes se pueden administrar en una cantidad adecuada para obtener la expresión in vivo correspondiente a las dosis descritas en la presente memoria y/o en los documentos citados en la presente memoria. Por ejemplo, los intervalos adecuados para las suspensiones virales se pueden determinar empíricamente. 50 Si se expresa más de un producto génico en más de un recombinante, cada recombinante puede ser administrado en estas cantidades; o, cada recombinante puede ser administrado de tal manera que haya, en la combinación, una suma de recombinantes que comprenden estas cantidades.
En las composiciones de vectores o plásmidos para su uso y empleo en la invención, las dosis pueden ser como se describe en los documentos citados en la presente memoria o como se describe en la presente memoria o como en 55 los documentos referidos o citados en los documentos citados en la presente memoria. Ventajosamente, la dosis debe ser una cantidad suficiente de plásmido para provocar una respuesta análoga a composiciones en donde el antígeno o los antígenos están presentes directamente; o para tener una expresión análoga a las dosis en dichas composiciones; o para tener una expresión análoga a la expresión obtenida in vivo por las composiciones recombinantes. 60
Sin embargo, la dosificación de la composición o las composiciones, la concentración de los componentes de la misma y el momento de administración de la composición o las composiciones, que provocan una respuesta inmunológica adecuada, se pueden determinar por métodos tales como mediante titulaciones de anticuerpos en sueros, p. ej., mediante ELISA y/o análisis de ensayo de seroneutralización. Tales determinaciones no requieren experimentación excesiva desde el conocimiento del experto en la técnica, de esta descripción y de los documentos 5 citados en la presente memoria. Y, el tiempo para las administraciones secuenciales se puede determinar igualmente con métodos verificables a partir de esta descripción, y del conocimiento en la técnica, sin experimentación excesiva.
Las composiciones inmunogénicas o inmunológicas para su uso contemplado por la invención también pueden contener un coadyuvante. Los coadyuvantes adecuados incluyen fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; Patente 10 de los Estados Unidos Núm. 6.017.537) y/o polímero de ácido acrílico o ácido metacrílico y/o un copolímero de anhídrido maleico y de un derivado de alquenilo. Los polímeros de ácido acrílico o ácido metacrílico pueden ser entrecruzados, p. ej., con poli(alqueniléteres) de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el término "carbómero" (Pharmeuropa, vol. 8, No. 2, Junio de 1996). Una experto en la técnica también puede ser remitido a la Patente de los Estados Unidos Núm. 2.909.462, que comenta tales polímeros acrílicos entrecruzados 15 con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos 3 grupos hidroxilo: en una realización, un compuesto polihidroxilado contiene no más de 8 grupos hidroxilo; en otra realización, los átomos de hidrógeno de al menos 3 hidroxilos se reemplazan por radicales alifáticos insaturados que contienen al menos 2 átomos de carbono; en otras realizaciones, los radicales contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono, p. ej., vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener a su vez otros 20 sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol® (Noveon Inc., Ohio, USA) son particularmente adecuados para su uso como coadyuvantes. Están entrecruzados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol, con respecto a ello, se hace mención de los productos Carbopol® 974P, 934P, y 971P.
En cuanto a los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, se hace mención de los productos EMA® (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, que pueden ser lineales o entrecruzados, 25 por ejemplo entrecruzados con diviniléter. También, se puede hacer referencia a la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.713.068 and Regelson, W. et al., 1960).
Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.713.068 también se pueden utilizar en las composiciones para el uso en la presente invención. Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano-amonio; 30 documento WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994), para formar DMRIE-DOPE.
Una vacuna recombinante o composición inmunogénica o inmunológica también se pueden formular en forma de una emulsión de aceite-en-agua. La emulsión de aceite-en-agua puede basarse, por ejemplo, en aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea Europea); aceite de isoprenoides tales como escualeno, escualeno, EICOSANE™ o 35 tetratetracontano; aceite resultante de la oligomerización de uno o varios alquenos, p. ej., isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol (dicaprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, p. ej., ésteres de ácido isoesteárico. El aceite ventajosamente se usa combinado con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como ésteres 40 de sorbitán, manidas (p. ej., oleato de manitol anhidro), glicerol, poliglicerol, propilenglicol, y ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, tales como los productos Pluronic®, p. ej., L121. El coadyuvante puede ser una mezcla de uno o varios emulsionantes, agente formador de micelas, y aceite tal como el que está disponible bajo el nombre Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA). 45
El adenovirus recombinante, o el vector adenoviral recombinante que expresa uno o más antígenos o inmunógenos de interés, p. ej., el vector de acuerdo con esta descripción, se pueden preservar y/o conservar y almacenar ya sea en forma líquida, a aproximadamente 5°C, ya sea en forma liofilizada o secada por congelación, en presencia de un estabilizador. El secado por congelación puede ser de acuerdo con procedimientos de secado por congelación convencionales bien conocidos. Los estabilizadores farmacéuticamente aceptables pueden ser SPGA (sacarosa 50 fosfato glutamato albúmina. Bovarnick, et al., 1950), carbohidratos (p. ej., sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov, T. et al., 1983; Israeli, E. et al., 1993), proteínas tales como peptona, albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como leche desnatada (Mills, CK. et al., 1988; Wolff, E. et al., 1990), y tampones (p. ej., tampón fosfato, tampón fosfato de metal alcalino). Se pueden utilizar un coadyuvante y/o un vehículo o excipiente para hacer solubles las preparaciones secadas por congelación. 55
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de un vector de Ad que codifica la HA de A/Panama/2007/99
La cepa de virus de la influenza A/Panama/2007/99 (H3N2) (SEQ ID NO: 1, 2), seleccionada para la producción de vacunas en 2003-2004, fue proporcionada por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC). El gen de la
hemaglutinina (HA) se clonó mediante transcripción inversa del ARN de influenza, seguido de la amplificación del gen de HA con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores de la Tabla 1.
Tabla 1: Cebadores utilizados en la construcción de vectores de Ad
Cebador
Secuencia
5' HA
5'-CACACAGGTACCGCCATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC-3' (SEQ ID NO: 9)
3' HA
5'-CACACAGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3' (SEQ ID NO: 10)
Estos cebadores contienen secuencias que se reasocian con los extremos 5' y 3' del gen de la HA de 5 A/Panama/2007/99, así como las secuencias correspondientes a un sitio de unión al ribosoma de eucariotas (Kozak, 1986) inmediatamente aguas arriba del codón ATG de inicio de HA y sitios KpnI para la clonación subsiguiente. Se insertó el fragmento KpnI que contenía el gen de la HA completo en el sitio KpnI de pShuttle-CMV (He et al., 1998) (proporcionado por T. He) en la orientación correcta bajo el control transcripcional del promotor temprano de citomegalovirus humano (CMV). Se generó un vector Ad5 defectuoso para E1/E3 que codificaba la HA de 10 A/Panama/2007/99 (AdPNM2007/99.H3) en células 293 humanas utilizando un sistema de recombinación simplificado como se ha descrito (Zeng et al., 2001).
El vector AdPNM2007/99.H3 se validó mediante la secuenciación de ambas uniones 5' y 3' entre el inserto de HA y el vector. Se obtuvieron anticuerpos IH contra A/Panama/2007/99 en ratones después de la administración intranasal de AdPNM2007/99.H3. 15
Ejemplo 2. Inmunización de pollos por medio de inyección in ovo e intramuscular de un vector de Ad recombinante.
No se ha informado hasta ahora sobre la inmunización de pollos mediante la inoculación de una vacuna vectorizada de Ad humano. Puesto que Ad5 no se encuentra naturalmente en las aves, se creyó que este vector era incapaz de infectar y/o replicar en células de pollo de manera eficaz. Sorprendentemente, se consiguieron títulos de IH en suero de 512 en los 3 pollos dos semanas después de la inyección intramuscular de AdPNM2007/99.H3 (Figura 1). 20
Cuando se inyectaron vectores AdPNM2007/99.H3 en huevos de gallina embrionados de 9 días de edad y 18 días de edad, se lograron títulos de IH en suero de 8 y 16 en la primera, y se lograron títulos de IH de <4, 4, y 8 en las dos últimas semanas después de la eclosión. Los resultados sugieren que el vector de Ad5 humano defectuoso para E1/E3 se puede utilizar como un portador de vacuna en las aves debido a su competencia para transducir y su incapacidad para replicar en células de aves. Los títulos de IH relativamente bajos inducidos por la vacunación in 25 ovo pueden ser atribuidos, entre otras cosas, a la dosis y la edad de los embriones. El vector de Ad5 puede haber transducido parte del embrión de pollo a través de la unión de su fibra al receptor de coxsackievirus y adenovirus (CAR) encontrado sobre la superficie de las células de pollo (Tan et al., 2001). Se puede provocar una respuesta inmunitaria en pollos después de la transducción de sólo un pequeño número de células, porque Ad es un vector potente capaz de proteger el ADN del vector alterando los endosomas después de la internalización (Curiel, 1994). 30 Además, al menos uno de los componentes del Ad, la hexona, es altamente inmunogénico y confiere actividad coadyuvante a los antígenos exógenos (Molinier-Frenkel et al., 2002).
El vector AdPNM2007/99.H3 se inyectó en el amnios de huevos de pollo embrionados de 9 días de edad (Grupo 1) y 18 días de edad (Grupo 2), respectivamente, en un volumen de 200 µl a una dosis de 5X1010 ufp por huevo. Hubo 6 huevos por grupo; sin embargo, sólo 2 aves eclosionaron en el Grupo 1 y 3 aves en el Grupo 2. Los títulos de IH en 35 suero se determinaron como se ha descrito (Van Kampen et al., 2005) 2 semanas después de la eclosión. En el Grupo 3, el vector AdPNM2007/99.H3 se inyectó por vía intramuscular en tres pollos de 4 semanas de edad, en un volumen de 100 µl a una dosis de 2,5 x 1010 ufp por animal. Los títulos de IH se determinaron dos semanas después de la inmunización.
En el Grupo 1 (inmunización in ovo de embriones de 9 días de edad), se lograron títulos de IH de 8 y 16; en el Grupo 40 2 (inmunización in ovo de los embriones de 18 días de edad), se lograron títulos de IH de <4 (asignados arbitrariamente a un título de 2), 4, y 8; y en el Grupo 3 (inmunización intramuscular de pollos de 4 semanas de edad) se alcanzaron títulos de IH de 512 en las tres aves. La Figura 1 muestra los títulos de IH en la escala log2. Los cuadrados corresponden a los títulos de IH en aves individuales en el Grupo 1; mientras que los triángulos corresponden a los títulos de IH en aves individuales en el Grupo 2. Los círculos corresponden a los títulos de IH en 45 aves individuales en el Grupo 3.
Ejemplo 3. Construcción de un vector de Ad que codifica el gen de H de A/Turkey/Wisconsin/68 TAdTW68.H5)
El molde de ADN de H de A/Turkey/WI/68 (SEQ ID NO: 3, 4) que codifica la H de la cepa del virus de la IA, fue
proporcionado por el USDA Southeast Poultry Research Laboratory, Athens GA, y se amplificó por PCR utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 2.
Tabla 2: Cebadores utilizados en la construcción de vectores de Ad
Cebador
Secuencia
5' HA
5'CACACAAAGCTTGCCGCCATGGAAAGAATAGTGATTGC3' (SEQ ID NO: 10)
3' HA
5'CACACAGGATCCATCTGAACTCACAATCCTAGATGC3' (SEQ ID NO: 11)
Estos cebadores contienen secuencias que se reasocian con los extremos 5' y 3' del gen H de 5 A/Turkey/Wisconsin/68, un sitio de unión al ribosoma de eucariotas (Kozak, 1986) inmediatamente aguas arriba del codón ATG de inicio de H, y los sitios de restricción únicos para la clonación subsiguiente. El fragmento que contenía el gen H completo se insertó en el sitio HindIII-BamHI del plásmido lanzadera p Ad Apt (proporcionado por Crucell, Leiden, Países Bajos) en la orientación correcta bajo el control transcripcional del promotor temprano de citomegalovirus humano (CMV). A continuación se generó un vector de Ad defectuoso para E1/E3 libre de RCA que 10 codificaba el gen de H de A/Turkey/Wisconsin/68 (AdTW68.H5) en células PER.C6 humanas (proporcionadas por Crucell) por medio de co-transfección de pAdApt-TW68.H5 con el plásmido de cadena principal de Ad5 pAdEasyl (He et al., 1998) como se ha descrito (Shi et al., 2001). El vector AdTW68.H5 fue validado por la secuenciación de las uniones tanto 5' como 3' entre el inserto de H y la cadena principal del vector.
Se pueden producir vacunas de IA in ovo vectorizadas de Ad rápidamente y administrar en masa a poblaciones de 15 pollos en el contexto de un perfil de seguridad excelente en respuesta a una pandemia de IA emergente. La producción a gran escala de vectores de Ad5 libres de RCA en la línea celular PER.C6 bien caracterizada en biorreactores de suspensión libre de suero (Lewis, 2006), junto con la purificación mediada por cromatografía (Konz, 2005) y tampones que no requieren congeladores para el almacenamiento a largo plazo (Evans, 2004) debe reducir en gran medida los costes de producción de vectores de Ad5. El uso de células cultivadas en lugar de huevos 20 embrionados como un sustrato para la producción de vacunas contra la IA es importante, sobre todo durante un brote de IA cuando los huevos fértiles pueden ser escasos. Esta vacuna contra la IA vectorizada de Ad5 está en consonancia con una estrategia DIVA porque el vector solamente codifica la HA del virus. Por lo tanto, el análisis de anticuerpos para IH en suero junto con la medición de la nucleoproteína anti-IA por medio de análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas permitiría la rápida determinación de la exposición a la vacuna contra IA o virus. 25
Aunque se puede desarrollar una vacuna contra IA en aerosol mediante la expresión de la HA a partir de un vector de virus de la enfermedad de Newcastle (Swayne, 2003) o un virus de influenza redistribuido que contiene una cadena principal de virus de influenza no patogénica (Lee, 2004), la vacuna contra IA in ovo vectorizada con Ad5 libre de RCA proporciona una plataforma única capaz de detener las infecciones por virus HPAI en aves inmunizadas a través del suministro automático de una dosis uniforme de la vacuna contra IA no replicante que sea 30 compatible con una estrategia DIVA. A diferencia de vectores recombinantes replicantes que están asociados con el riesgo de generar reversiones y permiten la propagación de organismos modificados genéticamente en especies tanto diana como no diana en el medio ambiente, los vectores de Ad5 libres de RCA no se propagarán en el campo. En contraste con la vacuna de virus de IA redistribuidos que pueden generar más redistribuciones no deseadas con un virus de influenza salvaje circulante al mismo tiempo (Hilleman, 2002), no es posible que el genoma de ADN de 35 Ad5 experimente una redistribución con el genoma de ARN segmentado de un virus de influenza.
Ejemplo 4. Inoculación in ovo de AdTW68.H5
Se llevó a cabo la inoculación in ovo como se ha descrito (Senne, 1998; Sharma et al., 1982). Antes de la inoculación todos los embriones se observaron al trasluz para determinar la viabilidad, y el sitio de inoculación se marcó y se desinfectó con una solución de alcohol etílico del 70% que contenía yodo al 3,5%. Se hizo un agujero en 40 la cáscara con un taladro rotatorio equipado con una punta afilada. La inoculación se realizó por la vía amnios-alantoidea mediante el uso de jeringas de 1 ml. Después de la inoculación, el agujero fue sellado con parafina derretida.
Ejemplo 5. Serología después de la inoculación de AdTW68.H5
La cepa A/Turkey/WI/68 de IA se pasó a huevos de pollo embrionados SPF para lograr un título de 10 dosis 45 infecciosas de 50%/ml para embriones. Los fluidos amnioalantoicos se analizaron para determinar la actividad de hemaglutinación. Se determinaron los títulos de anticuerpos en muestras de suero individuales por inhibición de la hemaglutinación utilizando 4 unidades de hemaglutinación del virus de IA como se ha descrito (Swayne et al., 1998, Thayer et al., 1998).
Ejemplo 6. Muestreo y cuantificación de los genomas de IA
Se suspendieron muestras orofaríngeas de aves individuales en 1,0 ml de medio de infusión de cerebro corazón (Difco, Detroit, Mich.) y se almacenaron a -70ºC. El ARN se extrajo utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). La RT-PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con cebadores específicos para el ARN de la matriz del virus de influenza de tipo A, como se ha descrito previamente (Spackman, 2002). El ARN viral se interpoló a partir de los umbrales de 5 ciclo mediante el uso de las curvas convencionales generadas a partir de cantidades conocidas de ARN de A/Ck/Queretaro/14588-19/95 de control (1010 a 1060 DIE50/mL).
Ejemplo 7. Inmunización de pollos por inoculación in ovo de AdTW68.H5 seguido de refuerzo después de la eclosión
La inmunización de pollos por inoculación se completó mediante la administración de 300 µl de AdTW68.H5 que contenía 1011 partículas virales/ml (pv/ml) en huevos embrionados SPF los días 10 o 18 de embrionación. Los 10 polluelos eclosionados de cada grupo fueron divididos equitativamente en dos grupos: la mitad de los pollos fueron revacunados a través de la vía nasal con la misma dosis de AdTW68.H5 el día 15 después de la eclosión, y los pollos restantes no recibieron una aplicación de refuerzo después de la eclosión.
Los títulos de anticuerpos de IH detectados en sueros obtenidos el día 28 después de la eclosión de estos grupos de aves se muestran en la Fig. 2. Los polluelos vacunados in ovo el día 10 de embrionación mostraron títulos de IH que 15 variaban entre 2 y 7 log2 (media de 4,2); los pollos vacunados el día 10 de embrionación con la aplicación de refuerzo después de la eclosión mostraron títulos de IH que variaban entre 2 y 9 log2 (media de 5,5); los polluelos vacunados al día 18 de embrionación mostraron títulos que variaban entre 2 y 9 log2 (media de 5,5); y los pollos vacunados el día 18 de embrionación y reforzados a los 15 días de la eclosión mostraron valores de IH entre 2 y 8 log2 (media de 5,7). En general, la administración in ovo de esta vacuna de IA vectorizada de Ad humano indujo una 20 fuerte respuesta inmunitaria contra la IA en pollos, mientras que la instilación intranasal de esta vacuna vectorizada a pollos, como ha demostrado recientemente (Gao, 2006), es ineficaz.
Ejemplo 8. La inoculación in ovo de AdTW68.H5 protege contra la sensibilización letal con la cepa de influenza aviar altamente patogénica HPAI A/Ck/Queretaro/19/95 (H5N2*)
Se inmunizaron 19 embriones de pollo SPF por vía in ovo el día 18 de la incubación con la misma dosis de 25 AdTW68.H5 que se describe en el Ejemplo 7. Los pollos eclosionados fueron identificados individualmente por una banda en el ala. Un grupo de 12 pollos se reforzó por vía nasal el día 15 después de la eclosión y los 7 pollos restantes no fueron reforzados. Se obtuvieron muestras de sangre de cada ave con banda en el ala a los 23 y 29 días de edad y se sometieron a ensayo mediante IH para anticuerpos contra la cepa de la influenza aviar A/Turkey/Wisconsin/68. En general, los títulos de anticuerpos IH detectados en estas aves (Fig. 3) fueron similares a 30 los valores obtenidos en la prueba anterior (Fig. 2). La mayoría de las aves alcanzó títulos > 5 log2. Los polluelos inoculados solamente in ovo alcanzaron títulos entre 5 y 9 log2 el día 23 después de la eclosión (Figura 3). Esos pollos mantuvieron o aumentaron sus títulos de anticuerpos alrededor del día 29 después de la eclosión. La vacunación in ovo combinada con el refuerzo intranasal mostró títulos de anticuerpos que variaban entre 3 y 9 log2 alrededor del día 23 después de la eclosión (Figura 3). Del mismo modo que en el grupo anterior, la mayoría de los 35 polluelos había aumentado sus títulos en escalones de 1 o 2 log2 alrededor del día 29 después de la eclosión.
La sensibilización se realizó en las instalaciones de bioseguridad de nivel 3+ por medio de inoculación orofaríngea con 105 dosis infectivas de embrión (DIE50) de HPAI A/Ck/Queretaro/19/95 (H5N2) (Horimoto, 1995, García, 1998). El gen de H de esta cepa de sensibilización tiene una identidad de nucleótidos de 90,1% y una similitud de aminoácidos deducida de 94,4% con la H de la cepa de IA A/Tk/WI/68 utilizada en la vacuna vectorizada de Ad 40 (Accesos GenBank U79448 y U79456) (SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8).
Un total de 30 pollos, incluyendo 7 polluelos vacunados in ovo y 12 polluelos vacunados in ovo y, posteriormente, reforzados por vía intranasal el día 15 después de la eclosión, así como 11 controles no vacunados, fueron sensibilizados el día 34 después de la eclosión.
Las aves sensibilizadas se observaron diariamente para determinar la morbilidad y mortalidad durante todo el 45 período experimental de 14 días. Los signos clínicos de IA, incluyendo hinchazón de las crestas y las barbillas, conjuntivitis, anorexia e hipotermia, se observaron dos días después de la sensibilización en 10 de 11 aves de control. Dos días más tarde, la mayoría de los supervivientes en el grupo de control mostró necrosis de la cresta, hinchazón de la barbilla, diarrea, deshidratación, letargo y hemorragias subcutáneas de la caña de la pata. No se desarrollaron signos de la enfermedad en ninguna de las aves vacunadas. Todas las aves vacunadas con 50 AdTW68.H5 (19/19) (in ovo solamente e in ovo + refuerzo nasal) sobrevivieron a la sensibilización (Fig. 4).
Los genomas virales de A/Chicken/Querétaro/19/95 en aves sensibilizadas fueron determinados cuantitativamente mediante reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR) en hisopos orofaríngeos recopilados los días 2, 4, y 7 después de la sensibilización. Hubo una diferencia significativa (PO.05) en la concentración de genomas virales de IA entre los pollos vacunados y no vacunados 7 días después de la 55 sensibilización (Fig. 5). La ausencia de ARN viral detectable en las aves inmunizadas proporciona evidencia de que la vacunación in ovo logró una respuesta inmunitaria capaz de controlar la propagación del virus de la IA en el plazo de una semana.
Estos resultados muestran en conjunto que los pollos inmunizados in ovo con vectores de Ad humanos libres de RCA que codifican genes de H de diferentes virus de la influenza (origen humano y aviar) desarrollaban títulos de anticuerpos de IH contra el virus de IA homólogo, y eran protegidos frente a la sensibilización letal con una cepa de virus de IA altamente patogénica del mismo tipo de H.
Ejemplo 9. La inoculación in ovo de AdTW68.H5 protege contra la sensibilización letal con la cepa de la influenza 5 aviar altamente patogénica A/Swan/Mongolia/244L/2005 (H5N1)
Para determinar si la vacuna de IA vectorizada con AdTW68.H5 puede conferir protección contra una cepa del virus HPAI H5N1 IAAP reciente, se vacunaron 31 pollos in ovo con el vector AdTW68.H5 a una dosis de 2X108 ifu. Los grupos de control incluyeron 10 pollos vacunados con un vector de Ad5 (AdCMV-tetC) que codificaba un antígeno irrelevante (fragmento C de la toxina del tétanos) (Shi et al., 2001) y 10 pollos que no fueron expuestos a vectores de 10 Ad5.
El D31, los pollos de control e inmunizados fueron sensibilizados con el virus de la IA H5N1 aviar A/Swan/Mongolia/244L/2005 (la HA de esta cepa de sensibilización tiene una similitud de la secuencia de aminoácidos de HA deducida de 89% con la HA de la cepa A/Turkey/Wisconsin/68). Como se muestra en la Fig. 6, la inmunización in ovo indujo anticuerpos dentro de un intervalo de 1 y 6 log2 el D25. Ninguna de las aves no 15 vacunadas (10/10) e inmunizadas con AdCMV-tetC (10/10) produjo anticuerpos IH medibles y todas murieron a causa de la IA en el plazo de 9 días después de la sensibilización, mientras que 68% (21/31) de las aves vacunadas con AdTW68.H5 sobrevivieron sin signos clínicos 10 días después de la sensibilización (Fig. 7). Notablemente, 7 aves en el grupo inmunizado con títulos de IH de > 3 log2 (Fig. 6) murieron por este virus de IA H5N1 altamente letal. Es probable que la tasa de supervivencia contra este virus de IA H5N1 se pueda mejorar mediante vacunación in 20 ovo con un vector de Ad5 que codifique una HA con una antigenicidad más próxima.
Estos resultados demuestran que los pollos inmunizados in ovo con un vector de Ad5 humano libre de RCA que codifica HA H5 aviar podría provocar inmunidad protectora contra los virus HPAI. Habiendo descrito de este modo en detalle las realizaciones preferidas de la presente invención, se debe entender que la invención definida por las reivindicaciones adjuntas no debe ser limitada por los detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya 25 que son posibles muchas variaciones evidentes de la misma sin apartarse del espíritu o alcance de la misma.
REFERENCIAS
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Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora conectada operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, para su uso en la vacunación profiláctica de un embrión aviar mediante 5 la introducción y la expresión de uno o más antígenos o inmunógenos de la influenza aviar en dicho embrión aviar.
  2. 2. El vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva de uno o más virus aviares.
  3. 3. El vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en 10 donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar.
  4. 4. El vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz, y 15 neuraminidasa.
  5. 5. El vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en el subtipo 3, 5, 7, y 9 de hemaglutinina.
  6. 6. El vector de expresión de adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en 20 donde dicha introducción en dicho embrión aviar se lleva a cabo por medio del suministro in ovo.
  7. 7. Una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión de adenovirus humano recombinante que comprende y expresa una secuencia de ADN adenoviral, y una secuencia promotora conectada operablemente a una secuencia foránea que codifica uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés, para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar mediante la obtención de una respuesta inmunogénica en dicho sujeto 25 aviar, en donde el sujeto aviar está infectado in ovo con una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha composición inmunogénica y en donde los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés se expresan a un nivel suficiente para provocar una respuesta inmunogénica a los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés en el sujeto aviar.
  8. 8. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia foránea que 30 codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, reovirus aviar, avipox, viruela aviar, viruela del canario, viruela del pichón, viruela de la codorniz, y viruela de la paloma, poliomavirus aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, pneumovirus aviar, virus de la rinotraqueitis aviar, virus de la reticuloendoteliosis aviar, retrovirus aviares, virus 35 endógeno aviar, virus de la eritroblastosis aviar, virus de la hepatitis aviar, virus de la anemia aviar, virus de la enteritis aviar, virus de la enfermedad de Pacheco, virus de la leucemia aviar, parvovirus aviar, rotavirus aviar, virus de la leucosis aviar, virus de fibrosarcoma musculoaponeurótico aviar, virus de la mieloblastosis aviar, virus asociado a la mieloblastosis aviar, virus de la mielocitomatosis aviar, virus del sarcoma aviar, o virus de la necrosis del bazo aviar. 40
  9. 9. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar.
  10. 10. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz y neuraminidasa. 45
  11. 11. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia foránea que codifica los uno o más antígenos o inmunógenos aviares de interés deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en el subtipo 3, 5, 7, y 9 de hemaglutinina.
  12. 12. Un adenovirus humano recombinante que contiene y expresa una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno de un patógeno de un sujeto aviar para su uso en la vacunación profiláctica de un sujeto aviar 50 mediante la inoculación a dicho sujeto aviar, en donde dicho adenovirus es administrado in ovo.
  13. 13. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus humano comprende secuencias derivadas del serotipo 5 de adenovirus.
  14. 14. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus
    humano comprende secuencias derivadas de adenovirus de replicación defectuosa, adenovirus no replicantes, adenovirus de replicación competente, o adenovirus de tipo salvaje.
  15. 15. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antígeno de un patógeno de un sujeto aviar deriva de virus de la influenza aviar, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus aviar, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la bronquitis 5 infecciosa aviar, reovirus aviar, avipox, viruela aviar, viruela del canario, viruela del pichón, viruela de la codorniz, y viruela de la paloma, poliomavirus aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, metapneumovirus aviar, virus de la rinotraqueitis aviar, virus de la reticuloendoteliosis aviar, retrovirus aviares, virus endógeno aviar, virus de la eritroblastosis aviar, virus de la hepatitis aviar, virus de la anemia aviar, virus de la enteritis aviar, virus de la enfermedad de Pacheco, virus de la leucemia aviar, parvovirus aviar, rotavirus aviar, virus de la leucosis aviar, virus 10 del fibrosarcoma musculoaponeurótico aviar, virus de la mieloblastosis aviar, virus asociado a la mieloblastosis aviar, virus de la mielocitomatosis aviar, virus del sarcoma aviar, o virus de la necrosis del bazo aviar.
  16. 16. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el antígeno de un patógeno de un sujeto aviar deriva del virus de la influenza aviar.
  17. 17. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el antígeno de 15 un patógeno de un sujeto aviar deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en hemaglutinina, nucleoproteína, matriz y neuraminidasa.
  18. 18. El adenovirus humano recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el antígeno de un patógeno de un sujeto aviar deriva del virus de la influenza aviar y se selecciona del grupo que consiste en el subtipo 3, 5, 7, y 9 de hemaglutinina. 20
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