JPH10510433A - 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 実質的にすべてＳｐのまたは実質的にすべてＲｐのホスホロチオエート糖間結合のいずれかにより一緒に結合したヌクレオシドユニットを含む配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、酵素的または化学合成により製造される。

Description

【発明の詳細な説明】 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド関連出願のクロスリファレンス 本出願は、１９９４年８月２９日に出願された、米国特許出願０８／２９７， ７０３の一部継続出願であり、これは、１９９１年１０月１６日に出願され、取 り下げられた米国特許出願０７／７７７，００７の継続出願である。本出願はま た、１９９３年５月５日に出願された米国特許出願０８／０５８，０２３の一部 継続出願であり、これは、１９９１年１０月１５日に出願された米国特許出願０ ７／７７７，６７０（米国特許５，２１２，２９５として１９９３年５月１８日 に発行）の分割出願であり、これは、米国特許出願０７／７７７，００７の一部 継続出願である。上述の各特許出願は、本発明の譲受人にともに譲渡されており 、各出願の全開示を本明細書の一部としてここに引用する。発明の分野 本発明は、糖間結合により結合したヌクレオシドを含む配列特異的ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチド、およびそれらの合成および使用に関する。より詳 細には、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドをつなぐ糖間結合は、実質 的に純粋なすべてＳｐのまたはすべてＲｐのキラルホスホロチオエート結合であ る。そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的または酵素的合成により製造され る。これらは、診断、治療および研究試薬として特によく適している。発明の背景 オリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする ことが知られている。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの塩基の 標的ＲＮＡまたはＤＮＡの塩基への配列特異的塩基対水素結合である。そのよう な塩基対は互いに相補的であるといわれる。 オリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイブリダイゼーションの程度の決定に おいては、オリゴヌクレオチドが相補的核酸と結合する相対的能力を、特定のハ イブリダイゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することが できる。融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせ ん形（ハイブリダイズしている）対コイル形（ハイブリダイズしていない）が５ ０％の比率で存在する温度（℃）を表す。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイ ブリダイゼーション複合体の形成および崩壊（融解）を判定することにより測定 される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッキングは、ＵＶ吸収 の減少（淡色化）を伴う。したがって、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。 Ｔｍがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度はより大きくなる。 オリゴヌクレオチドを用いて、細胞内酵素ＲＮａｓｅ Ｈを用いる標的ＲＮＡ の酵素的切断を行うことができる。そのようなＲＮａｓｅ Ｈ切断のメカニズム は、２’−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡにハイブリ ダイズすることを必要とする。得られるＤＮＡ−ＲＮＡデュープレックスはＲＮ ａｓｅ Ｈ酵素を活性化し、活性化された酵素はＲＮＡ鎖を切断する。ＲＮＡ鎖 の切断は、標的ＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドはこのタイプのメカニズムにより作用する。しかし、ＤＮＡオリゴヌク レオチドがＲＮａｓｅ Ｈの細胞性活性化に有用であるためには、オリゴヌクレ オチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化に十分な時間細胞内で生き残るため、ヌクレア ーゼに対して適度に安定でなければならない。非細胞的な用途、例えばオリゴヌ クレオチドの研究試薬としての使用においては、そのようなヌクレアーゼ安定性 は必要ではないだろう。 Ｗａｌｄｅｒらのいくつかの刊行物は、ＲＮａｓｅ Ｈとオリゴヌクレオチド との相互作用を記載する。特に興味深いものは以下のものである：（１）Ｄａｇ ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９ ０，１８，４７５１；（２）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９１，１，１１；（ ３）Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，６ ４７２；および（４）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１，１９，１８０５。これらの刊行物によれば、未 修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合と修飾ホスホロチオエートヌクレオシ ド間結合との両方を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞性ＲＮａｓｅ Ｈ の基質である。これらは基質であるため、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの 切断を活性化する。しかし、著者はさらに、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ ｓ）胚において、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方が エキソヌクレアーゼ分解をも受けることに注目している。そのようなヌクレアー ゼ分解は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に枯渇 させるため、有害である。 文献（１）、（２）および（４）に記載されるように、なおＲＮａｓｅ Ｈ活 性化を与えたままオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解に対して安定化させる ために、ホスホルアミデート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル 結合の区域の間に配置されたホスホジエステル結合ヌクレオチドの短い区域を有 する２’−デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホスホルアミデート含有 オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対して安定化されていたため、文 献（４）においては、著者はそれぞれのホスホルアミデート結合が、ホスホルア ミデート含有オリゴヌクレオチドの測定Ｔｍ値において１．６℃の低下をもたら したことに注目している。このようなＴｍ値の低下は、オリゴヌクレオチドとそ の標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションの減少を示している。 診断、研究試薬、および治療剤としてのオリゴヌクレオチドの適用には、オリ ゴヌクレオチドが細胞膜を越えて移送されることまたは細胞により取り込まれる こと、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに適切にハイブリダイズすること、および続いて 核酸機能を停止または破壊することが必要である。これらの必須の機能は、部分 的には、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期の安定性に依存す る。さらに、これらの機能は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌク レオチドの特異性に依存する。 オリゴヌクレオチドのこれらの目的に関する深刻な欠陥は、細胞内および細胞 外に存在しうる偏在する種々のヌクレアーゼによる酵素的分解に対して感受性で あることである。未修飾の、”野生型”オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに より急速に分解されるため、治療剤としては有用ではない。したがって、ヌクレ アーゼ耐性を付与するためのオリゴヌクレオチドの修飾は、オリゴヌクレオチド 治療および診断の開発をめざす研究の主要な焦点であった。 オリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼ耐性を増強させることは、一般に 糖−リン酸主鎖において、特にリン原子上で行われてきた。ホスホロチオエート は、ヌクレアーゼに耐性を示すことが報告されている。さらに、ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドは一般に、天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチド より化学的により安定である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、 水性媒体中での溶解性を示す。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド −ＲＮＡヘテロデュープレックスは、外来ＲＮａｓｅ Ｈのための基質として働 くことができる。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、高い熱力 学的安定性を示す。しかし、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡまたはＤＮＡに確 実性をもって結合する能力は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡへのハイブリダイゼーシ ョンにとって重要であるが、オリゴヌクレオチドのリン原子における修飾は、種 々の程度のヌクレアーゼ耐性を示すものの、一般に劣ったハイブリダイゼーショ ン特性という欠点を有する［Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎ ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔ ｏｎ，ＦＬ，１９８９］。 この劣ったハイブリダイゼーションの理由は、リン原子のプロキラルな性質で あろう。修飾されたリンのオリゴヌクレオチドの内部リン原子における修飾は、 ＲｐおよびＳｐ立体異性体を生ずる。 現在までに得られた、得られる分子が非対称の置換基を有する修飾リンオリゴ ヌクレオチドは、２ⁿ個（ｎはオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート糖間 結合の数と等しい）の異性体を有するラセミ混合物であった。したがって、１４ 個の非対称中心を含む１５−ｍeｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、 ２¹⁴すなわち１６，３８４個のジアステレオマーを含む。この観点から、ラセミ 混合物においては、少ないパーセントのオリゴヌクレオチドのみが、十分な親和 性をもって標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするようである 。 キラル的に純粋な糖間結合を有する化学的に合成されたホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、これまでのところ、１つまたは２つのジアステレオマー性 糖間結合のみを有する分子に限定されている。キラル的に純粋な糖間結合を有す るオリゴヌクレオチドの合成は、自動化合成によってはまだ達成されていないた め、配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの化学的に合成されたラ セミ混合物に導入されたキラル性の効果は最近まで評価されなかった。これは、 自動化合成の間にイオウが非立体特異的に取り込まれるためである。例えば、Ｓ ｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３２６：２６３（ １９８５）は、ラセミ糖間結合を有するある種のオリゴヌクレオチドホスホロチ オエートを合成したが、１つまたは最大でも２つのジアステレオマー性リン糖間 結合を有するある種の小さいオリゴマーのジアステレオマーを解明することがで きたのみである。 しかし、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：５８８３（１９９１）］は続いてオリゴヌクレオチドの自動化立体制御合 成を報告した。上述の文献に記載される方法は、５価のホスホロチオイル中心に おける、塩基により触媒される求核置換を利用する。 酵素的方法を用いる、すべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートの合 成は、何人かの著者により研究されてきた［Ｂｕｒｇｅｒｓ ａｎｄ Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５４：６８８９ （１９７９）；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６ ：７６８９（１９８２）；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｆｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，２０：１２４５（１９８１）；およびＥｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｊｏｖｉ ｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２：４５４６（１９８３）］。Ｂｒｏｄｙら（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：２５７０（１９８２）］、およびＲｏｍａｎ ｉｕｋおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：７６８４ （１９８２）］は、ポリＴｐＡおよびポリＡｐＴホスホロチオエートを酵素的に 合成した。ＢｕｒｇｅｒｓおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：４７９８（１９７８）］は、ポリＵｐＡホ スホロチオエートを酵素的に合成した。Ｃｒｕｓｅら［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ，１９２：８９１（１９８６）］は、３つのジアステレオマー性ＲｐのＧｐＣホ スホロチオエートダイマーを天然のホスホジエステル結合により結合させてヘキ サマーとした。 オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対的能力は、特定のハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形（ハイブリダイズしていない）が５０％で存在する温度（℃）を表す。Ｔ ｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成および崩壊（融解 ）を判定することにより測定される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基 のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴う。したがって、ＵＶ吸収の 減少はより高いＴｍを示す。Ｔｍがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度 はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い不安定化 効果を有する。 予備的報告［Ｓｔｅｃ，Ｊ．Ｗ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｅｔｉｎ ｇ ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｊｕｎｅ １８−２１，１９８９］においては、天然 のホスホジエステル結合により結合した２つのチミジンメチルホスホネート４量 体ジアステレオマーから、糖間結合に１つを除いてすべて修飾リン酸結合を有す るチミジンホモポリマー８量体（”１つ以外”）のＲｐ立体コンフィギュレーシ ョンまたは”１つ以外”Ｓｐ立体コンフィギュレーションが形成された。１つを 除きすべてＲｐの糖間結合を有するＲｐ”１つ以外”メチルホスホネート配列非 特異的チミジンホモ８量体、すなわち（ｄＴ）₈は、１５量体デオキシアデノシ ンホモポリマー、すなわち（ｄＡ）₁₅と、”１つを除く”Ｓｐコンフィギュレー ションメチルホスホネート結合を有する同様のチミジンホモポリマー、すなわち １つを除きすべてＳｐの糖間結合を有するｄ（Ｔ）₁₅とｄ（Ａ）₁₅により形成さ れたハイブリッド（Ｔｍ＜Ｏ℃）よりも、熱力学的により安定なハイブリッド（ Ｔｍ ３８℃）を形成したことに注目されたい。天然のホスホジエステル結合を 有する（ｄＴ）₈、すなわちオクタチミジル酸とｄ（Ａ）₁₅との間のハイブリッ ドは、１４℃のＴｍを有することが報告されている。 より最近では、Ｕｅｄａら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９：５４７（１９９１）］は、翻訳系において用いるための、Ｒｐジアステ レ オマー性ホスホロチオエート結合を断続的に取り込んだｍＲＮＡを酵素的に合成 した。Ｕｅｄａらは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのための１７のプロモーターおよ び１つの停止部位を有するＴ７コリファンＤＮＡを用いた。Ｔ７ＲＮＡポリメラ ーゼによるインビトロ合成は、数百から数万個のヌクレオチドを有するｍＲＮＡ を生成した。 主鎖キラル性はまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロ デュープレックスのＲＮａｓｅ Ｈ活性に対する感受性に影響を与えるであろう 。ＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドヘテロデュープレックス 中のＲＮＡ成分の切断を引き起こすことが示唆されているため、ＲＮａｓｅ Ｈ のためのテンプレートとして働く能力は著しい治療的意味を有する。Ｒｐおよび Ｓｐ糖間結合のラセミ混合物を含むオリゴヌクレオチドについては、すべてのホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈの基質として同等に機能 しうるか否かはわかっていない。種々の触媒反応について、核酸のホスホジエス テル主鎖の加水分解は、立体特異的メカニズム（インラインメカニズム）および コンフィギュレーションの反転により進行する。したがって、ラセミ混合物には 、最大のハイブリダイゼーション効率および翻訳の停止のための正しいキラル性 を含むオリゴヌクレオチドは少ないパーセンテージでのみ存在するであろう。す なわち、ヘテロデュープレックス中でＲＮａｓｅ Ｈのための基質として働くこ とができるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのパーセンテージを増加させ ることは、アンチセンス療法のためのより有効な化合物につながるであろう。 ハイブリダイゼーションの確実性を増強させるために、実質的にキラル的に純 粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが非常に望まれて いる。さらに、そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロ チオエートオリゴヌクレオチドは、より有効な治療化合物につながるであろう。 しかし、これまでのところ、そのような分子の合成にはほとんど成功していない 。したがって、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを合成する簡単な方法が非常に望まれている。 オリゴヌクレオチド治療の開発においてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐 性およびハイブリダイゼーションの確実性が非常に重要であることが認識されて きた。ヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドはまた、研究試薬および診 断薬としても望まれている。発明の概要 本発明にしたがえば、すべてのヌクレオシドユニットが実質的にすべてＳｐの ホスホロチオエート糖間結合または実質的にすべてＲｐのホスホロチオエート糖 間結合のいずれかにより一緒に連結されているホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが提供される。好ましくは、本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの配列の少なくとも一部に相補的である。 さらに、本発明にしたがえば、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配 列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成する化学的および酵素的 方法が提供される。ここで、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実 質的にすべてＲｐのまたは実質的にすべてＳｐの糖間結合のいずれかにより一緒 に連結された、少なくとも１０ヌクレオシドユニットからなる。好ましくは、ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合に より連結された約１０から約５０ヌクレオシドユニットからなる。より好ましく は、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な 糖間結合により連結された約１５から約３０ヌクレオシドユニットからなる。最 も好ましくは、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合により連結された約１７から２１ヌクレオシドユニットから なる。前記方法は、配列プライマー、テンプレート、および過剰量の４つすべて のキラル的に純粋なヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）を組 み合わせることを含む。前記方法はさらに、ポリメラーゼの付加およびそれに続 く相補的オリゴヌクレオチドからのプライマーの切断により、相補的オリゴヌク レオチドを合成することを含む。さらに、前記方法は、前記相補的オリゴヌクレ オチドを前記テンプレートから解離させることを含む。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを合成する本発明の方法の別の態様においては、配列プライマ ー、テンプレートおよびヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート） のラセミ混合物を組み合わせる。実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有し、テ ンプレートに相補的であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ポリメラ ーゼおよび選択された金属イオンを添加することにより合成する。このようにし て合成されたオリゴヌクレオチドを、テンプレートおよびプライマーから解離さ せる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、標的ＲＮＡおよびＤＮＡとともに形成されたヘテロデュープレックス の熱力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を引き出すのに有用である。 さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの活性を調節するのに有用であ る。発明の詳細な記載 オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合中のリン原子は、”プロキラル” であるということができる。ホスホジエステル結合の非結合酸素原子が置換また は修飾されると、キラルな糖−リン酸結合が生成する。得られる糖間結合は、Ｓ ｐ糖間結合またはＲｐ糖間結合のいずれかである。天然のホスホジエステル結合 の非結合酸素原子をイオウで置換してホスホロチオエート結合を得ると、キラル 中心が生成し、ＳｐおよびＲｐジアステレオマーが生ずる。糖主鎖中のリン原子 の実質的にすべてがＳｐまたはＲｐである分子は、本明細書においてキラル的に 純粋であると称される。 リボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（ＮＴＰαＳ） および２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェー ト）（ｄＮＴＰαＳ）は、ＬｕｄｗｉｇおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，６３１（１９８９）］の方法論を用いて、ＳｐおよびＲｐのラセミ 混合物として合成された。この例示的合成スキームにおいては、非保護ヌクレオ シドを、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン と反応させ、これは５’−ヒドロキシル基をホスフィチル化する。続くピロホス フェートとの反応により、イオウに対して反応性である環状トリホスフェート誘 導体が生成し、ＲｐおよびＳｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェ ート）、すなわち、α−チオトリホスフェートの混合物が得られる。生成物を、 例えば、ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーにより精製し、ＮＭＲ分 光分析法を用いて（特徴的なＲｐまたはＳｐ化学シフトにより）同定することが できる。 以下の実施例で示されるように、純粋なＲｐおよびＳｐヌクレオシド−５’− Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ジアステレオマーは、例えば、逆相ＨＰＬＣ クロマトグラフィーを用いて製造規模で容易に単離することができる。このよう なＨＰＬＣで単離されたヌクレオチドジアステレオマーは、そのようなＲｐおよ びＳｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ジアステレオマー の市販試料との分析ＨＰＬＣ比較により、さらに特性決定することができる。 配列特異的な天然のオリゴヌクレオチド、すなわち天然のホスホジエステルオ リゴヌクレオチドの酵素的合成は、テンプレートおよびプライマーの存在下で適 当なヌクレアーゼを用いることにより行うことができる。同様に、キラル的に混 合された糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのラセミ混合 物を合成することができる。本発明にしたがえば、そのような酵素的合成は、配 列特異的テンプレートおよびプライマーの存在下に、鏡像異性体に関して純粋な すべてＳｐのまたはすべてＲｐのヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフ ェート）を適当なヌクレアーゼの基質として用いることにより、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド の合成を含むようにさらに発展させることができる。例えば、市販のＤＮＡポリ メラーゼであるシークエナーゼ^TM（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ． ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いることにより、ホスホジエステルオリゴヌ クレオチドテンプレートおよびラセミ体のホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いてホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成することが できる。このポリメラーゼを用いることにより、ホスホジエステルおよびホスホ ロチオエートプライマーの両方を伸長することができる。 酵素的に合成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの収量は、テンプ レートおよびプライマーを繰り返し添加することにより、ポリメラーゼを繰り返 し添加することにより、ヌクレオシド三リン酸を繰り返し添加することにより、 またはこれらのいくつかまたはすべてを組み合わせることにより最適化すること ができる。例えば、テンプレートおよびプライマーの繰り返し添加により、酵素 的カスケードによる収量は最大化する。さらなる最適化は、テンプレートとプラ イマーとを系の緩衝液中で一緒にプレハイブリダイゼーションし、つづいて冷却 し、ヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼを加えることにより行うことがで きる。 適当なポリメラーゼを選択して、ＤＮＡまたはＲＮＡホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドを生成することができる。このようなポリメラーゼとしては、Ｔ ７ＤＮＡポリメラーゼ、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、例えば上記に論及したシ ークエナーゼ^TM、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリクレノーフラ グメントポリメラーゼ、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ポリメラーゼ、Ｔ４バク テリオファージポリメラーゼ、修飾Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、必ずしもこれ らに制限されない。 酵素的合成は、リン原子のキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの 反転を伴って進行する。すなわち、すべてＳｐのα−チオトリホスフェートの使 用により、実質的にすべてＲｐのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じ 、すべてＲｐのα−チオトリホスフェートの使用により、実質的にすべてＳｐの ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じる。本発明の別の態様においては 、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、金属イオンを反応溶液中で用いて 一方または他方のキラルα−チオトリホスフェートを優先的に取り込むことを促 進することにより、ヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）の ラセミ混合物から合成することができる。上述したように、ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ合成は、前駆体ヌクレオシド−α−チオトリ ホスフェートのキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの反転を伴って 達成される。理論に拘束されることを望むものではないが、すべてＲｐのコンフ ィギュレーションの最適化は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼを用いる反応 緩衝液中に高濃度のマグネシウムイオンを加えることにより達成することができ ると考えられる。同様に、再度理論に拘束されることを望むものではないが、す べてＳｐのコンフィギュレーションは、反応緩衝液中において高いマンガンイオ ン濃度を用いることによって得られると考えられる。 本発明にしたがえば、”実質的にすべての”とは、少なくとも７５％の糖間結 合がキラル的に純粋であるすべてのオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。 より好ましくは、約８５％から約１００％のキラル的に純粋な糖間結合を有する オリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋である。最も好ましくは、約９ ５％から約１００％のキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオチドは 、実質的にキラル的に純粋である。 本発明の分脈において、用語”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”は、 天然に生ずる塩基、糖およびホスホロチオエート結合から形成されるホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドを含む。天然に生ずる塩基には、アデニン、グアニ ン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。天然の糖には、β−Ｄ−リボ フラノシルおよびβ−Ｄ−２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルが含ま れる。”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”はまた、ヌクレオシド−５’ −Ｏ−（１−チオトリホスフェート）類似体が適当なポリメラーゼのための基質 である程度まで、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチドユニッ ト中に取り込まれた修飾された塩基または修飾された糖を含む。本発明のオリゴ ヌクレオチドの修飾された塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル 、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２ −プロピルおよび他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシ ン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、シュードウラ シル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオー ルアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび 他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオール グアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他 の８−置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、他のアザおよびデアザチ ミジン、他のアザおよびデアザシトシン、他のアザおよびデアザアデニン、他の アザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフ ルオロシトシンが含まれる。糖成分は、デオキシリボースであってもリボースで あってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、修飾された核塩基または本 発明の精神に合致する他の修飾、特に、治療、診断または研究試薬としての使用 を容易に するため、そのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾を有する核塩基を含んでいて もよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および研究試薬として使用 することができる。これらは、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを適当な薬 学的に許容しうる希釈剤または担体に加えることにより、医薬組成物中で使用す ることができる。これらはさらに、蛋白質の望ましくない生成により特徴づけら れる疾患を有する生物を治療するために用いることができる。生物を、望ましく ない蛋白質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリダイズしうる配列を有 する本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。 治療組成物の処方およびその続いての投与は、当業者の技術の範囲内であると 考えられる。一般に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者に本発 明にしたがうオリゴヌクレオチドを、通常は薬学的に許容しうる担体中で、処置 される患者の年齢および疾患状態の重篤度に依存して、体重１ｋｇあたり０．０ １μｇから１００ｇの範囲の用量で投与する。さらに、治療計画は、特定の疾患 の特性、その重篤度、および患者の全体的状態に依存して変わるであろう期間継 続し、１日に１回から数年に１回まで拡張することができる。処置後、患者をそ の状態の変化についておよび疾患状態の症状の緩和について監視する。患者が現 在の用量レベルに有意に応答しない場合には、オリゴヌクレオチドの用量を増加 することができ、または疾患状態の症状の緩和が観察された場合、または疾患状 態が除去された場合には、用量を低下させることができる。 場合により、他の伝統的な治療モダリティーと組み合わせて、本発明のオリゴ ヌクレオチドで患者を処置することがより有効であろう。 用量は、治癒が行われるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、数日 から数ヶ月の処置過程で、治療すべき病状の重篤度および応答性に依存する。最 適用量スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定から計算することがで きる。当業者は、最適用量、投与法および反復率を容易に決定することができる 。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し、一般 に、インビトロおよび動物モデルのインビボで有効であることが見いだされたＥ Ｃ₅₀に基づいて見積もることができる。一般に、用量は体重１ｋｇあたり０．０ １μｇから１００ｇであり、１日に１回またはそれ以上、１週間に１回、１ヶ月 に 一回または１年に１回、または数年に１回、与えられる。 治療の成功に続き、疾患状態の再発を防ぐため、オリゴヌクレオチドを体重１ ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇ、１日に１回またはそれ以上から数年に１ 回の範囲の維持用量で患者に投与する維持療法を行うことが望ましいであろう。 本発明の医薬組成物は、局所または全身の処置が望まれているか、および処置 されるべき領域に依存して、多くの方法により投与することができる。投与は、 局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、または非経口で行う ことができる。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、 または髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）または脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒ ｉｃｕｌａr）投与が含まれる。 局所投与のための処方には、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、 ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の 医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要かまたは望ましいで あろう。被覆されたコンドーム、手袋等もまた有用であろう。 経口投与のための組成物には散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤 または液剤、カプセル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香 剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。 髄腔内または脳室内投与のための組成物には、緩衝液、希釈剤およびその他の 適切な添加剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 非経口投与のための処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を 含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション 、ヌクレアーゼ耐性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性に及ぼすそれらの影響に関して、 天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびラセミ体ホスホロチオエート ヌクレオチドの両方と比較することができる。同様に、実質的にキラル的に純粋 な糖間結合を有する純粋なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、インビボ 試験系において治療の有効性を増加させる能力について評価することができる。 そのような治療の有効性の増加には、薬物動態学または代謝、毒性学、配剤（す なわち吸収および分布）、および種比較等の特性が含まれる。 すべてＲｐのまたはすべてＳｐの糖間結合を有するホモポリマーは、安定性お よび他の特性の最初の研究には有用であった。しかし、これらのオリゴヌクレオ チドは、標的分子に特異的ではないため、治療的にはほとんど用途はない。標的 核酸に特異的にハイブリダイズするためには、特異的配列を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドが必要である。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡおよびＤＮＡとのヘテロデュープレックスの熱 力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を付与するのに有用である。 放射性標識を用いて、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドの同定を助けることができる。自動化合成機で合成 されたラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、合成機から 得られた水素ホスホネートオリゴマーの酸化反応のために［³⁵Ｓ］（放射性標識 された元素イオウ）を用いることができる。酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの標識は、［α−³²Ｐ］ＡＴＰおよびリガーゼにより、 またはポリメラーゼ反応において［α−³⁵Ｓ］ＡＴＰを用いて行うことができる 。また、放射性標識ヌクレオシドトリホスフェートを、プローブおよび配列決定 分析において用いることができる。オートラジオグラムは標準的な方法で作成さ れる。 本発明のテンプレートは、疾患増強性蛋白質の合成を指令する核酸配列の領域 であることが最も好ましい。前記テンプレートオリゴヌクレオチドの領域に対し て塩基対を形成する短いオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによるオリゴヌク レオチド合成の出発点を形成するプライマーとして作用する。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、ヌクレアーゼ切断、例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断に感受性で ある部位をその上に有するように選択されたプライマーを用いて合成することが できる。前記切断部位は、前記プライマーの３’末端に位置していてもよい。適 当な制限エンドヌクレアーゼによる前記部位における切断により、最初の５’末 端ヌクレオシドを前記プライマーから得るオリゴヌクレオチドが得られる。本発 明の前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドは、酵素的 手段により付加されたヌクレオシドキラルチオトリホスフェートである。 選択されたプライマーとともに適当な制限ヌクレアーゼを選択することにより 、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの種々の５’−末端ヌクレオシ ドをホスホロチオエートヌクレオチドの５’末端に適切に配置させることができ る。すなわち、互い違いの切断によりプライマーからの１つのヌクレオシドが新 たに合成された本発明の配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの最 初の５’ヌクレオシドとなる限り、任意のエンドヌクレアーゼ認識部位を設計す ることができる。このことにより、本発明の酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの５’末端において各種のヌクレオシドが生成する。 所望の配列の適当なテンプレート上での前記プライマーの酵素的伸長を完了し たら、適当なヌクレアーゼを用いることにより、本発明のホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを前記プライマーから脱離させることができる。例えば、所望 のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの５’末端にグアノシンヌクレオシド を取り込ませるために、３’末端に配列ＣＴＧＣＡＧを有するプライマーを用い ることができる。次に、Ｐｓｔ１制限ヌクレアーゼを用いることにより、Ａ−Ｇ 結合を切断することができる。したがって、このＡ−Ｇ結合のグアノシンヌクレ オシド成分は、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレ オシドとして取り込まれることができる。他の制限エンドヌクレアーゼとしては 、制限されないが、ＢａｍＨ１、ＳｍａｌおよびＨｉｎＤ ＩＩＩ制限エンドヌ クレアーゼがある。 前記テンプレートとなお会合したオリゴヌクレオチドは、前記テンプレートか ら解離させ、次に、例えば、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィーに よって精製することができる。例えば、適当な精製は、ＳｅｐＰａｃ（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）クロマトグラフィーと組み合わせた標準的 なポリアクリルアミド／尿素ゲル電気泳動を用いて行うことができる。使用しう る他の有用なクロマトグラフィー技術は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーである。 本発明のキラルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、Ｓｔｅｃ ｅ ｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１９９ １）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖｏ ｌｕｍｅ ２０，ｐ．２８５，１９９３］に記載されるように、１，３，２−オ キサチアホスホラン中間体を介して化学的に合成することができる。 本発明の方法にしたがって合成される実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有 するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、多くの方法によって分析するこ とができる。例えば、得られる実質的にキラル的に純粋なすべてＳｐのまたはす べてＲｐの糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド のコンフィギュレーション分析は、［³¹Ｐ］ＮＭＲ化学シフトを用いて判定する ことができる。このような化学シフトは、ホスホロチオエートジヌクレオチドの Ｒｐエピマーを同定するのに使用されている（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３１−６３５（１９８９）］。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列の正確さは、Ｓ１ヌク レアーゼに対するヘテロデュープレックスの感受性を使用して判定することがで きる。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列は、ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を〔α−³²Ｐ〕コルジセピントリホスフェ ート（すなわち、３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート）で標識 することによって、さらに確証を高めることができる。得られたオリゴヌクレオ チドを酵素的分解に供することもできる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが相補的鎖に結合する相対的能力は、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形（ハイブリダイズしていない）が５０％の比率で存在する摂氏温度を意味 している。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成およ び崩壊（融解）を測定することによって測定される。ハイブリダイゼーションの 間に生ずる塩基のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴う。結果的に 、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。Ｔｍが高くなればなるほど、鎖の結合 強 度はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い不安定 化効果を有する。したがって、オリゴヌクレオチドのその標的ＲＮＡへの最適の 結合を得るためには、塩基対ができるだけ最適に近い正確さであることが望まし い。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはさらに、種々のエキソヌク レアーゼおよびエンドヌクレアーゼの分解能力に対する抵抗性に関して評価する ことができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼで処理し 、次に、例えばポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、そ して適切な染色剤〔例えばＳｔａｉｎｓ Ａｌｌ^TM（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃ ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）〕を使用して染色することによって分析すること ができる。分解生成物は、レーザー・デンシトメトリーを使用して定量化するこ とができる。 ウシ胎児血清およびヒト血清を使用して、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対する核酸分解（ｎｕｃｌｅ ｏｌｙｔｉｃ）活性を評価することができる。例えば、実質的にすべてＲｐの糖 間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをこのような仕方で評価 することができる。３’または５’末端がキャップされた分子（１キャップ当た り１つまたはいくつかのホスホロチオエート結合を有する）の組み合わせに関す る試験を使用して、最も大きなヌクレアーゼ安定性を生じる組み合わせを求める ことができる。キャッピングは、精製されたＲｐモノマーを使用して配列のキャ ップ部分を化学的に合成し、次いで前記キャップをＤＮＡ合成機上のオリゴヌク レオチド中に取り込ませることによって行うことができる。キャッピングに関す る分析により、核酸分解安定性に及ぼすキラル性の重要性および、最大の安定性 を得るのに必要とされる結合の数を決定することができる。 ＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性に対するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド− ＲＮＡヘテロデュープレックスの感受性も評価することができる。ホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドを、種々のハイブリダイゼーション温度で、放射性標 識した標的ｍＲＮＡ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを介して合成）と共にイン キュベートすることができる。次に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ａｎｄ Ｈｕｎｔ［Ｎ ｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，６４３３（１９８６））に記載の方法にしたがって 、ヘテロデュープレックスをＥ．ｃｏｌｉからのＲＮａｓｅ Ｈとともに３７℃ でインキュベートすることができる。次に、生成物をノザンブロット分析法によ りＲＮａｓｅ Ｈ活性に関して評価することができる。この方法においては、生 成物を１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ニトロセルロ ースに移す。次に、標的ｍＲＮＡに相補的なランダムプライマー〔³²Ｐ〕−標識 ｃＤＮＡを用いてフィルターを探索し、オートラジオグラフィーによって定量化 する。各種のホスホロチオエート類似体を比較することにより、ＲＮＡと複合体 を形成したときにＲＮａｓｅ Ｈに対する基質として作用しうる能力に及ぼすキ ラル性の影響を調べることができる。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈおよび哺乳動物ＲＮＡｓｅ Ｈの触媒作用に対 するヘテロデュープレックスの感受性の比較を行うことができる。ヘテロデュー プレックスを、翻訳の条件下にてラビットの網状赤血球溶解物中でインキュベー トし、内在ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの触媒切断に関して、ノザンブロット 分析によりアッセイすることができる。このことにより、哺乳動物ＲＮＡｓｅ Ｈ活性に及ぼすキラル性の影響を調べることができる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドはまた、細胞培養のモデルシステムにおける遺伝子発現の阻害に関して評 価することができる。実質的に純粋なキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドが遺伝子発現のより強力なまたはより特異的な 阻害剤であるか否かを調べるために、レポーター遺伝子を標的とするよう設計さ れた、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドを合成し、遺伝子発現の細胞培養モデルにおいて試験することができ る。ベクターｐＳＶ２ＣＡＴを用いて遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を 調べることが前に記載されている［Ｈｅｎｔｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：６３４２（１９８８）］ 。このベクターは、ＳＶ４０プロモーターの調節制御下の細菌クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。ＣＡＴ ｍＲＮＡの翻訳開 始に相補的な配列の、すべてＲｐの糖間結合を有する１５−ｍｅｒホスホロチオ エ ートオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＳＶ２ＣＡＴをＨｅＬａ細胞にトランスフ ェクトし、次にすべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドで細胞を４８時間処理して、細胞内のＣＡＴ活性をアッセイすることがで きる。次に、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートの 遺伝子発現の阻害における活性を、ジアステレオマー性糖間結合を有する化学的 に合成したランダムホスホロチオエート、および同じ配列の天然ホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと直接比較することができる。 ベクターｐＳＶ２ＡＰＡＰ［Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５７４９（１９８７）］ は、哺乳動物胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＰＡＰ）を含む。これはまた 、遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を測定するためのレポーターとして使 用することもできる。ＰＡＰは、イントロンおよび他のＲＮＡプロセシング信号 を含む細菌遺伝子ではなく哺乳動物遺伝子であるという点において、レポーター 遺伝子としてはＣＡＴを凌ぐ利点を有する。現時点では、ＰＡＰの発現は、天然 の哺乳動物遺伝子の発現における事象をより近似して模倣すると考えられている 。ＣＡＴ ｍＲＮＡに関して前述したような、実質的にキラル的に純粋な糖間結 合を有する１５−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、類似の配列 を有する化学合成したラセミ体ホスホロチオエートおよび天然のホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと平行して調べることができる。ＰＡＰおよびＣＡＴレポ ーター構築物を、遺伝子発現に及ぼす非特異的影響を調べるための繰り返し実験 における対照として用いる。 さらに、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、インビボでＲＮＡ翻訳の阻害剤として作用するその能力につ いて評価することができる。種々の治療分野が本発明のオリゴヌクレオチドによ るそのような操作の標的とすることができる。１つの治療分野はＣ型肝炎ウイル ス（ＨＣＶ）により引き起こされる肝炎である。以下のホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、ＨＣＶ肝炎の治療に適用を有する：オリゴ＃２５９、CCTTTC GCGACCCAACACTA（配列番号１）、オリゴ＃２６０、GCCTTTCGCGACCCAACACT（配列 番号２）、オリゴ２７０、GTACCACAAGGCCTTTCGCG（配列番号３）、オリゴ ＃３３０、GTGCTCATGGTGCACGGTCT（配列番号４）およびオリゴ＃３４０、TTTAGG ATTCGTGCTCATGG（配列番号５）。別の治療分野は、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ− １）により媒介される炎症性疾患である。炎症性疾患の治療に適用を有するオリ ゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ−２３０２、GCCCAAGCTGGCATCCGTCA（配列番号６ ）が含まれる。別の治療分野には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により引き 起こされる感染が含まれる。ＩＳＩＳ−２９２２は、ＣＭＶ網膜炎の治療に適用 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GCGTTTGCTCTTCTTC TTGCG（配列番号７）を有する。別の治療分野には、蛋白質キナーゼＣ−α（Ｐ ＫＣ−α）により媒介される癌が含まれる。ＩＳＩＳ−３５２１は、そのような 癌の治療に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GT TCTCGCTGGTGAGTTTCA（配列番号８）を有する。さらに別の治療分野には、Ｃ−ｒ ａｆキナーゼ媒介性癌が含まれる。ＩＳＩＳ−５１３２は、そのような癌の治療 に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TCCCGCCTGT GACATGCATT（配列番号９）を有する。さらに別の治療分野は、Ｈａ−ｒａｓまた はＫｉ−ｒａｓにより媒介される癌を含む。以下のホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドは、そのような癌の治療に適用を有する：ＩＳＩＳ−２５０３、TCCG TCATCGCTCCTCAGGG（配列番号１０）、ＩＳＩＳ−２５７０、CCACACCGACGGCGCCC （配列番号１１）、およびＩＳＩＳ−６９５７、CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG（配列番 号１２）。別の治療分野にはＨＩＶにより媒介されるＡＩＤＳおよび他の関連す る感染が含まれる。ＩＳＩＳ−５３２０は、ＡＩＤＳの治療に適用を有するホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TTGGGGTT（配列番号１７）を有 する。上述の配列において、オリゴヌクレオチドの個々のヌクレオチドユニット は左から右へ５’から３’方向に表記される。 本発明の分脈において、”ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオチ ドユニット間の水素結合を意味し、これはワトソン−クリック、フーグスティー ンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミ ンとは、水素結合の形成によって対合する相補的核塩基である。本明細書におい て用いる場合、”相補的”とは、２つのヌクレオチドユニット間の配列相補性を も表す。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドユニットが ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドユニットと水素結合するこ とができる場合、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとはその位置におい て互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとそのＤＮＡまたはＲ ＮＡとは、それぞれの分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合しうる ヌクレオチドユニットにより占められる場合、互いに相補的である。すなわち、 ”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補的”とは、オリゴヌクレオチド と標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間に安定かつ特異的な結合が生ずるような十分な 程度の相補性を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドが特異的 にハイブリダイズしうるためには、その標的ＤＮＡ配列に１００％相補的である 必要はないことが理解されるであろう。オリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡまたは ＤＮＡ分子への結合が標的ＲＮＡまたはＤＮＡの正常な機能を妨害し、かつ特異 的結合が望まれる条件、例えば、インビボアッセイまたは治療処置の場合には生 理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で 、オリゴヌクレオチドの非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な 程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズするこ とができる。 特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の米国特許出願（本発明の譲受人 に譲渡されている）中に明記されているように、治療において、診断として、お よび研究のために用いることができる。これらの出願は次の表題を有する：Ｃｏ ｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎ ｇ ＲＮＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、１９９０年１月１１日出願の第４６３，３５８ 号；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒｓ ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、１９８９年１２月４日出願の 第４４５，１９６号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、１９９０年２月２６日出願の第４８５，２９７号；Ｒｅａｇｅｎｔ ｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ Ｍｉｍｉｃｒｙ、１９９０年３月 ２１日出願の第４９７，０９０号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｕ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、，１９９０年４月３ ０日出願の第５１６，９６９号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，１９９０年８月１６日出願の第５６８，３ ６６号；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａ ｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ、１９９０年５月１１日出 願の第５２１，９０７号；Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｙｒｉｍ ｉｄｉｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、１９９０年７ 月２７日出願の第５５８，８０６号；Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ Ｃｏｎ ｊｕｇａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９０年７月２７日出 願の第５５８，６６３号；Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９０年５月４日出願の第５１８ ，９２９号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ、１９９０年８月１４日出願の第５６７，２８６号 ；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ、１９９ ０年８月１４日出願の第５６７，２８７号；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ ｎｄｉｄａ、１９９０年８月１６日出願の第５６８，６７２号；およびＡｎｔｉ ｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、１９９０年１２月３日出願のＰＣＴ／ＵＳ９０ ／０７０６７号。これらの特許出願は、オリゴヌクレオチドの相互作用によりＲ ＮＡおよびＤＮＡの活性の改良された調節を行うことのできる多くの手段を開示 している。上記特許出願中に開示される特定の配列を本発明とともに使用しうる 点において、上記米国特許出願の開示内容を本明細書の一部としてここに引用す る。 以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。実施例１ すべてＳｐのまたはすべてＲｐの５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ヌク レオシドの単離 ５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）デオキシヌクレオシドおよびリボヌ クレオシドは、ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ，Ｒｕｎｃｏｎ，ＵＫ）を充填したカラムを用い、溶媒Ａ（５ｍＭのテトラブチ ルアンモニウムイオンを含む３０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）および溶媒 Ｂ（５ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウムのメタノール溶液）のアイソクラチ ック混合物で溶出するＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に より単離される。あるいは、２０分間で０％から１５％のアセトニトリルの直線 濃度勾配変化を含む１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５、 を用いると効果的な分離が達成される。 そのようなＨＰＬＣで分離したエナンチオマーの純度を確認するため、ＨＰＬ Ｃで分離されたＳｐおよびＲｐデオキシヌクレオチドエナンチオマーを、Ｅ．Ｉ ．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから市販品として入手可能なデオ キシヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）類と比較する。実施例２ ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの実質的にすべてＲｐの糖間結 合を有するホスホロチオエート伸長物の合成 ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーのすべてＲｐのホ スホロチオエート伸長物の酵素的合成は、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼＩ，シー クエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃ ｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて行う。このＴ７ＤＮＡポリメラー ゼを用いて、２１ｍｅｒの天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドにハイブ リダイズした１８ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーを伸 長させる。３０ピコモル（ｐｍｏｌ）のプライマーおよびテンプレートを含む１ Ｘシークエナーゼ^TM反応緩衝液（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）（最終用量１０μｌ）を９５℃で５分間加熱し 、室温までゆっくり冷却する。１８０ｐｍｏｌのデオキシ５’−［α−³⁵Ｓ］シ チジントリホスフェートおよびシークエナーゼ^TM酵素（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を加え、３７℃で２０分 間インキュベートする。生成物を、２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿 素変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析す る。生成物のオートラジオグラフをプライマー／テンプレートなしの対照反応と 比較する。最終生成物を、例えば、酵素的分解によりさらに特性決定する。その ような分解の１つは、ヘビ毒ホスファターゼ分解である。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩを用いて合成したジヌクレオシドモノホスホロチオエートのヘビ 毒ホスファターゼ分解は、ジヌクレオシドがＲｐコンフィギュレーションである ことを示す。実施例３ 実質的に純粋なＲｐ糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド CGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）の合成 配列特異的なすべてＲｐのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模な 酵素的合成は、５５ｍｅｒの天然ホスホジエステルテンプレートおよび４１ｍｅ ｒの天然ホスホジエステルプライマーを用いて行った。テンプレート配列は： GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTTGAG （配列番号１４）であった。プライマー配列は、 CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC （配列番号１５）であった。テンプレートは所望の特異的配列 CGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）に相補的な配列を有するように選択された。 ５×から１×に希釈されたシークエナーゼ^TM緩衝液（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用した。テンプレート およびプライマーを両方とも２０ｎＭの濃度で４０μＬのこの緩衝液に加えた。 テンプレートおよびプライマーを９５℃で５分間ハイブリダイズさせ、室温まで 冷却した。緩衝液を冷却後、緩衝液を７ｍＭＤＴＴに調整した。次に、２０μＬ の１：８希釈シークエナーゼ^TM酵素および各々３２０μＭのＳｐのＧＴＰαＳ， ＣＴＰαＳ，ＡＴＰαＳおよびＴＴＰαＳを加えた。反応溶液はＨ₂Ｏにより１ ４０μＬに調整した。反応液を３７℃で１８時間インキュベートした。反応溶液 を常法通り等量のフェノールで２回抽出し、常法通り−２０℃で２．５容量の１ ００％エタノールで処理することにより沈殿させ、ペレット化し、５００μＬの ７０％エタノールで洗浄し、再びペレット化して乾燥した。沈殿を３０分間２０ μＬのＨ₂Ｏに懸濁し、次に４０μＬのＨ₂Ｏ中１ｍＭ ＣａＣｌ₂，２５ｍＭト リスＨＣｌ，ｐＨ８．０に調整した。この溶液を９５℃に５分間維持し、急冷し た（すなわち、氷で非常に急速に冷却した）。４．６μＭ ＤＮａｓｅ Ｉを加 え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、合成されたオリゴヌクレ オチドからテンプレートおよびプライマーを除去した。反応混合物をフェノール で２回抽出し、上記のごとくエタノールで沈殿させた。沈殿をＨ₂Ｏに再懸濁し 、ＳｅｐＰａｋ^TMクロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）と組み合わせた２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動を用い て精製した。 別の合成法においては、ＰｓｔＩ制限ヌクレアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、プライ マー結合ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを制限部位で切断した。所望の ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）は、 ＳｅｐＰａｋ^TMクロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍ Ａ）と組み合わせたポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動を用いて精製し た。反応を通しての反復テンプレート−プライマー付加により影響される酵素的 カスケードを用いて、収率を最適化した。カスケード増加合成により２０ｍｌの 反応液から７５ Ａ₂₆₀単位のすべてＲｐのコンフィギュレーションホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）を得た。実施例４ 自動化ＤＮＡ合成を用いての、糖間結合のラセミ体混合物を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、常法により水素ホスホネート化学を用いる自動化ＤＮ Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０Ｂ）で合成し た［Ａｇｒａｗａｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ． Ｓ．Ａ．，８５：７０７９（１９８８）］。最終カップリング工程後、結合オリ ゴマーを二硫化炭素／トリエチルアミン／ピリジン中イオウで酸化することによ りホスホロチオエート結合を発生させた。イオウ酸化後、水酸化アンモニウムに よる標準脱保護法を使用して支持体からオリゴヌクレオチドを解離させ、塩基保 護基を除去した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ ド精製カラム（ＯＰＣ；ＡＢＩ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）クロマトグラフ ィーおよびＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣを用 いて）により精製した。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドは、続いてエタノール で沈殿させ、２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素上のゲル電気泳動または分析用Ｈ ＰＬＣにより最終純度を評価した。オリゴヌクレオチド配列の確実性は、ピリジ ン／水中でのヨウ素酸化および標準配列決定法により評価した。これらのオリゴ ヌクレオチドは、各々のリン結合において全ての可能なＲｐおよびＳｐ異性体の 組合せの混合物を含む。実施例５ 熱力学的および速度論的ハイブリダイゼーション分析のためのＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼを用いる相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の合成 天然ホスホジエステル結合の短い相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、 ＡＢＩモデル３８０ＢＤＮＡ合成機による標準自動化合成を利用して実施した。 正しい長さのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製し、標準技術により配列 決定した。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ハイブリダイゼーション分析のための短 い相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。短いＲＮＡを合成するのに必要 とされる多くのサイクルの開始のために高濃度で多量のＴ７ ＲＮＡポリメラー ゼが必要であった。この必要性のため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼ発現ベクター、ＢＬ２１／ｐＡＲ１２１９を含む大腸菌株（Ｂ ｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ， ＮＹから入手された）から得た。２Ｌの細胞からの単離により約３００，０００ から５００，０００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが得られた。吸光度値＝１． ２Ａ₆₀₀。これを短い（１０−３０ヌクレオチド）ＲＮＡ種の合成のため十分に 濃縮した。合成のため、ＡＢＩ合成機（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ）を用いてＴ７プロモーター、および相補的標的配列およびＴ７プロモーターハ イブリダイゼーション配列を含むテンプレートを合成した。テンプレートおよび プロモーターをＨＰＬＣにより精製し、酵素的合成のために正しい化学種が存 在することを確実にした。合成された生成物を２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ 尿素ゲル上で精製し、常法により配列決定した。実施例６ 熱変性 オリゴヌクレオチド（本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは その他のもの）は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドとともに、各 々のオリゴヌクレオチドに対し４μＭの標準濃度で１００ｍＭのイオン強度緩衝 液（８９．８ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０，０．２ ｍＭ ＥＤＴＡ）中でインキュベートした。試料を９０℃に加熱し、Ｇｕｉｌｆ ｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて最初の 吸光度を測定した。次に試料を徐々に１５℃まで冷却し、熱変性過程の間２６０ ｎｍで吸光度の変化をモニターした。温度を１度ずつ上げて吸光度を読み、融解 曲線の一次導関数をとって変性プロフィールを分析した。データはまたＴｍおよ びデルタＧを決定するため２相線形回帰分析を用いて分析した。これらの試験の 結果は表１に示されている。 実施例７ 放射性標識オリゴヌクレオチドの合成 種々のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの結合ストリンジェンシーを定 量するため、フィルター結合アッセイを利用した。すなわち、これらがＤＮＡま たはＲＮＡとハイブリダイズして、ヘテロデュープレックスを形成する傾向を定 量した。これらのアッセイは放射性標識オリゴヌクレオチドを必要とする。 すべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓ ｐモノマーから精製された［³⁵Ｓ］−モノマーから酵素的方法により合成した。 キラル混合糖間結合を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの自動合成の ために、水素ホスホネートを含むオリゴヌクレオチドを合成し、次にピリジン／ 二硫化炭素混合物中で元素状［³⁵Ｓ］存在下で硫化した。得られた放射性標識ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドはＯＰＣクロマトグラフィーおよびＨＰ ＬＣにより精製することができる。標的ｍＲＮＡをニトロセルロースフィルター に適用し、８０℃で２時間焼き、ブロッキングし、続いて放射性標識ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。結合ストリンジェンシー は、温度を高くした後または溶出緩衝液（例えばトリスＮａＣｌ緩衝液）のイオ ン強度を増加させた後にフィルターから溶出された放射性標識オリゴヌクレオチ ドを定量することにより評価した。溶出されたオリゴヌクレオチドはまた、アイ ソクラチックリン酸緩衝液を利用したアニオン交換ＨＰＬＣプロトコールにおけ るそれらの移動度によっても評価した。結果を、糖間結合のラセミ体混合物を有 するように製造された標準オリゴヌクレオチドの移動度と比較した。実施例８ ヌクレアーゼ消化 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地中でのホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドのヌクレアーゼ分解速度の決定は、１０％熱不活性化ＦＣＳを含むダ ルベッコ改良必須培地（ＤＭＥＭ）中で実施した。培地に添加する前に５５℃で １時間ＦＣＳの熱不活性化を実施した。ラセミ体およびキラル的に純粋な糖間結 合を有するオリゴヌクレオチドについて、別々にヌクレアーゼ消化に対する耐性 を試験した。各々６６μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを別々に培地に添加し、 表２に示した時間間隔で３７℃でインキュベートした。１５μｌのアリコートを とり、１５μｌの９Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），０． １Ｍホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡに加えた。アリコートをボルテックスにより混 合し、−２０℃で保存した。２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素スラブゲル上 でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。電気泳動後“Ｓ ｔａｉｎｓ Ａｌｌ”（Ｓｉｇｍａ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ Ｏ）を用いてゲルを染色した。脱染色後、ゲルをＵｌｔｒａＳｃａｎ ＸＬ装置 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ ，Ｓｗｅｄｅｕ）を用いたレーザーデンシトメトリーにより分析した。積分を実 施し、データはインキュベーション前の完全長（ｎ）からｎ−１へのパーセント 減少値として表した。Ｒｐのキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオ チド配列CGACTATGCAAGTAC（配列番号６）についての結果を表２に示す。 表２から明らかなように、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドは、ラセミ体糖間結合を有するホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドよりもより高いヌクレアーゼ消化耐性を示した。実施例９ ＲＮａｓｅ Ｈ分析 ラセミ体の、および実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオ エートのＲＮａｓｅ Ｈに対する感受性を分析した。オリゴヌクレオチド（ＲＮ Ａに対し２倍モル過剰）および５μｇ（３．１ｋｂ）のインビトロで合成された ｍＲＮＡ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて）を５μｌのＲＮａｓ ｅ Ｈハイブリダイゼーション緩衝液中６０℃にて３０分間インキュベートした 。試料を徐々に室温まで冷却し、次に３．７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，２０ユニット のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ），１４２ｍＭ ＤＴＴ，１ ５０ｍＭ ＫＣｌおよび３ｍＭ ＭｇＣｌ₂に調節した。試料は３７℃で３０分 間 インキュベートした。次に試料をフェノール抽出、エタノール沈殿させ、１．２ ％アガロースゲルでの電気泳動、続いてのエチジウムブロミド染色により分析し た。ＲＮＡ試料のおおよその長さを決定するため、試料と同時にマーカーをゲル に流した。実施例１０ ＨＣＶにより引き起こされる肝炎に罹患した患者を、それぞれ実施例３または 実施例１９の方法にしたがって合成した、オリゴ＃２５９（配列番号１）、オリ ゴ＃２６０（配列番号２）、オリゴ２７０（配列番号３）、オリゴ＃３３０（配 列番号４）またはオリゴ３４０（配列番号５）で処置する。１−１０００μｇ／ ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例１１ ＩＣＡＭ−１により媒介される炎症性疾患に罹患した患者をＩＳＩＳ−２３０ ２、すなわち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列GCCCAAGCTG GCATCCGTCA（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１００ ０μｇ／ｋg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ま せ、静脈内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて 反復することができる。実施例１２ サイトメガロウイルスにより引き起こされる網膜炎に罹患した患者を、ＩＳＩ Ｓ−２９２２、すなわち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列 GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG（配列番号７）を有するオリゴヌクレオチドで処置する 、１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体 中に取り込ませ、硝子内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）投与する。処置は、 感染が除去されるまで必要に応じて反復することができる。実施例１３ ＰＫＣ−α−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳＩＳ−３５２１、すなわち実施 例３または実施例１９にしたがって合成され、配列GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA（配 列番号８）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ｋｇ体 重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内また は筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することが できる。実施例１４ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳＩＳ−５１３２、すな わち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列TCCCGCCTGTGACATGCA TT（配列番号９）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例１５ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、それぞれ実施例３または実 施例１９にしたがって合成したＩＳＩＳ−２５０３（配列番号１０）、ＩＳＩＳ −２５７０（配列番号１１）またはＩＳＩＳ−６９５７（配列番号１２）を有す るオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレ オチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉内投与する 。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することができる。 それぞれ実施例１６、１７および１８の化合物１、２および３は、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１９ ９１）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖ ｏｌｕｍｅ２０、ｐ．２８５，１９９３）の方法にしたがって合成した。実施例１６ ２−クロロ−１，３，２−オキサチアホスホラン（１）の合成 ピリジン（１ｍｏｌ）、ベンゼン（４００ｍＬ）、２−メルカプトエタノール （０．５ｍｏｌ）および三塩化リン（０．５ｍｏｌ）の混合物を室温で３０分間 撹拌する。塩化ピリジニウムを濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させ、粗生成物を減 圧下の蒸留により精製する。７０−７２℃／２０ｍｍＨｇで沸騰する画分を回収 し、³¹Ｐ ＮＭＲにより特性決定する。実施例１７ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−１，３，２−オキサチアホスホラン（２）の合 成 化合物１（０．２ｍｏｌ）をｎ−ペンタン（３００ｍＬ）に溶解し、ジイソプ ロピルアミン（０．４ｍｏｌ）を滴加する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し 、その後ジイソプロピルアミン塩酸塩を濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させて、粗 生成物を真空蒸留により精製する。生成物２は、７０℃／０．１ｍｍＨｇで沸騰 する画分として得られ、これを³¹Ｐ ＮＭＲおよび質量分析により特性決定する 。実施例１８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−［２−チオノ−１，３，２ −オキサチアホスホラン］（３）の合成 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１０ｍｍｏｌ）および１Ｈ−テトラ ゾール（１１ｍｍｏｌ）を真空乾燥し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解する 。化合物２（１１ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応混合物を室温で２時間撹拌する 。乾燥元素イオウ（１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌し 、放置する。次に未反応イオウを濾別し、濾液を減圧下に濃縮する。残渣をクロ ロホルム（３ｍＬ）に溶解し、シリカゲル（２３０−４００メッシュ）カラムク ロマトグラフィーにより精製し、最初にクロロホルム、次にクロロホルム：メタ ノール（９７：３）で溶出する。シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによ り化合物３の別々のジアステレオマー種を得る。化合物３を酢酸エチルに溶解し 、シリカゲル６０Ｈカラムに負荷する。酢酸エチルを溶出溶媒として用い、溶出 はＨＰＴＬＣ（シリカゲル６０、展開溶媒として酢酸エチル）によりモニターす る。化合物３の分離されたジアステレオマーを含む画分を減圧下に濃縮し、残渣 を³¹Ｐ ＮＭＲおよびＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５μＭ 、溶出剤として酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により特性決定する。早い溶出画 分はＳｐジアステレオマーに対応し、遅い溶出画分はＲｐジアステレオマーであ る。実施例１９ 固相自動化合成における５’−ＯＨヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋な 化合物３との反応の立体特異的制御 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モ デル３８０Ｂ自動化ＤＮＡ合成機を用いて、Ｓｔｅｃらの方法にしたがった。５ ’−ＯＨヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋なヌクレオシドオキサチアホ スホラン、例えば化合物３との間の反応は、触媒として１，８−ジアザビシクロ （５．４．０）ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）の使用を必要とする。自動化ＤＮ Ａ合成においてオリゴヌクレオチドを支持体マトリックスに結合するために用い られる市販のリンカーはＤＢＵに対して不安定であるため、リンカーにおける修 飾が必要である。オキサチアホスホラン法によるオリゴヌクレオチド合成のため の適当なリンカーは、ＤＢＵに耐性であり、濃水酸化アンモニウムにより室温で １時間以内に加水分解することができる”コハク酸−サルコシニル”リンカーで ある。 （Ａ）”コハク酸−サルコシニル”リンカーを用いる、固体マトリックスに結合 した５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシドの合成 （１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−サルコシン（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉ ｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１．６ｍｍｏｌ）を長鎖アルキル アミン−ＣＰＧ（ＬＣＡ−ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（２ ｇ）に加え、真空下に乾燥した。無水ＤＭＦ（５ｍＬ）、ピリジン（０．５ｍＬ ）およびＤＣＣ（２．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１２時間振盪し た。次に溶媒を濾別し、支持体をメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１： １：１、３ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。支持体をピリジン中のピペリジンの１０％ 溶液１０ｍＬで処理することにより、Ｎ−Ｆｍｏｃ保護基を除去した。Ｎ−サル コシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧをメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１： １、３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、真空下に乾燥した。 （２）５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシドを、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ピ リジン（０．２ｍＬ）およびＤＣＣ（５０ｍｇ）の存在下に、（１）に記載のよ うにして得たサルコシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧに加えた。反応混合物を室温で１２ 時間振盪し、次にメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ２ ０ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、支持体をＮ−メチルイミダゾール：ＴＨＦ（１ｍ Ｌ）および無水酢酸／ルチジン（１ｍＬ）で１５分間処理した。次に、支持体を メタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ１０ｍＬ）、続いて アセトニトリル（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、次に真空下に乾燥した。 （Ｂ）次に、ジアステレオマー的に純粋な活性化ヌクレオシドを、３００倍モル 過剰のＤＢＵの存在下に、サルコシニルＬＣＡ−ＣＰＧ支持体に結合したオリゴ ヌクレオチドの上に加えた。活性化ヌクレオシドのジアステレオマーは、カップ リング反応において用いる前に、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｈ 、溶出溶媒として酢酸エチルを用いる、溶出はＨＰＴＬＣ（シリカゲル６０、展 開溶媒として酢酸エチル）によりモニターした］で精製した。合成プロトコルは 表３に示される。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのジアステレオマー純度は、³¹Ｐ Ｎ ＭＲにより、ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５ＡＭ、溶出剤 として酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により、酵素的に、または電気泳動法によ り判定することができる。実施例２０ ヒト患者における疾患状態の治療 本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の疾患状態の治療に用いることができる 。特定の疾患状態であると診断された患者の治療は、薬学的に許容される処方中 の有効用量のオリゴヌクレオチドを適当な経路で患者に投与することを含む。有 効なオリゴヌクレオチド用量は、治療すべき疾患状態、疾患状態の重篤度および 治療される患者の年齢に依存する。オリゴヌクレオチドの有効用量はそのＩＣ₅₀ に基づいて決定することができ、これは当業者には日常的な方法である。あるい は、オリゴマーの有効用量は、薬物動態学ソフトウエアプログラムＴｏｐＦｉｔ を用いることにより決定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの用量 は、疾患状態の進行に依存して、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ（子供用）から １００ｇ（成人用）まで様々である。同様に、投与の頻度は、疾患状態の進行に 依存し、１日１回またはそれ以上から、２０年に１度まで様々であろう。 オリゴヌクレオチド投与の経路は、治療すべき疾患状態による。例えば、炎症 性疾患について処置される患者へのオリゴヌクレオチドの投与は、経口または直 腸経路で行うことができる。ＡＩＤＳに苦しむ患者の処置の場合には、オリゴヌ クレオチド投与の最も有効な方法は、経口経路または皮下注射によるものであろ う。癌、例えば乳癌は、皮下注射により処置することができ、一方、結腸癌はオ リゴヌクレオチドの経口または直腸投与により処置することができる。中枢神経 系の疾患または疾病は、オリゴヌクレオチドを患者の脊柱または脳に送達するた めに、髄腔内または脳室内投与により最もよく処置されるであろう。 オリゴヌクレオチド投与に続き、患者を疾患状態に伴う症状の緩和についてモ ニターすることができる。次に、疾患状態の重篤度および処置に対する反応性に より、用量を調節（増加または減少）することができる。 本発明のオリゴヌクレオチドを他の伝統的治療と組み合わせて投与することが 好ましいであろう。オリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳに苦しむ患者の治療のため のＡＺＴ、炎症性疾患、例えば潰瘍性大腸炎の治療のためのスルファサラジン（ ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、および結腸癌の治療のための５−フルオロウラ シル等の薬剤と組み合わせて投与することができるが、これらに限定されない。 また、疾患状態について治療が成功した患者に維持療法を投与することが望ま しいであろう。維持投与計画の一部としてのオリゴヌクレオチド投与の用量およ び頻度は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇで、１日１回またはそれ 以上から数年に１回まで様々である。実施例２１ オリゴヌクレオチドの脳室内投与 薬剤を患者の脳に直接送達するための脳室内薬剤投与は、脳を苦しめる疾患を 有する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与のモードを 行うために、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者の脳の脳室内に導入し、 これを腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｃ ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続する［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ，４４：１６９８（１９８４）］。ポンプを用いてオリゴヌクレオチドを注 入し、外部プログラミング装置の補助によって正確な用量調節および用量スケジ ュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は１８−２０ｍＬであり、注入速度は ０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ／ｈの範囲であろう。毎日から毎月の投与の頻度およ び投与すべき薬剤の体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲の用量に 依存して、ポンプ貯蔵器は、３−１０週間間隔で補充することができる。ポンプ の補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に穿剌することにより行われる。実施例２２ オリゴヌクレオチドの髄腔内投与 患者の脊柱に薬剤を導入するための髄腔内薬剤投与は、中枢神経系の疾患を有 する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与の経路を行う ためには、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者のＬ３−４腰椎脊柱空間中 に移植し、これを上部腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプに接続する［Ｔ ｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２ （１９９３）およびＣａｎｃｅｒ，４１：１２７０（１９９３）］。ポンプを用 いてオリゴヌクレオチドを注入し、外部プログラミング装置の補助によって正確 な用量調節および用量スケジュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は１８− ２０ｍＬであり、注入速度は０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ／ｈの範囲であろう。毎 日から毎月の投与の頻度および投与すべき薬剤の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ から１００ｇの範囲の用量に依存して、ポンプ貯蔵器は、３−１０週間間隔で補 充することができる。ポンプの補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に１回 穿剌することにより行われる。実施例２３ ＡＩＤＳに罹患した患者を、ＩＳＩＳ−５３２０、すなわち実施例３または実 施例１９にしたがって合成し、配列TTGGGGTT（配列番号１７）を有するオリゴヌ クレオチドで処置する。体重１ｋｇあたり１−１０００μｇのオリゴヌクレオチ ドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、硝子内投与する。処置は、感染が 除去されるまで必要に応じて反復することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／４６８，４４７ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６８，５６９ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６９，８５１ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７０，１２９ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７１，９６６ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７１，９６７ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または 配列番号１７により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも７５％は、Ｓｐ ホスホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 ２．ヌクレオシドユニットのすべてがＳｐホスホロチオエート３’−５’結合に より一緒に結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ３．請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。 ４．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または 配列番号１７により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも７５％は、Ｒｐ ホスホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 ５．ヌクレオシドユニットのすべてがＲｐホスホロチオエート３’−５’結合に より一緒に結合されている、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。 ６．請求項４記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。