ES2621161T3 - Familia de micro-ARN que modula la fibrosis y usos de la misma - Google Patents

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ES2621161T3 ES08797006.7T ES08797006T ES2621161T3 ES 2621161 T3 ES2621161 T3 ES 2621161T3 ES 08797006 T ES08797006 T ES 08797006T ES 2621161 T3 ES2621161 T3 ES 2621161T3
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Eric Olson
Eva Van Rooij
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The University of Texas at Austin
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The University of Texas System
The University of Texas at Austin
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Abstract

Un agonista de miR-29a-c para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de fibrosis tisular en un sujeto que lo necesita, en el que el agonista de miR-29a-c es un polinucleótido que comprende un pri-miARN, pre-miARN, o secuencia madura de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c.

Description

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DESCRIPCION
Familia de micro-ARN que modula la fibrosis y usos de la misma Referenda cruzada a solicitudes relacionadas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a los campos de la biologfa del desarrollo y la biologfa molecular. Mas particularmente, se refiere a la regulacion genica y la fisiologfa celular en fibroblastos por parte de la familia miR-29. Esta familia de miARN desempena un papel importante en el deposito de colageno, particularmente en el deposito de colageno mediada por fibroblastos.
Antecedentes de la invencion
La cardiopatfa y sus manifestaciones, incluyendo la cardiopatfa coronaria, el infarto de miocardio, la insuficiencia cardiaca congestiva y la hipertrofia cardiaca, representan un riesgo sanitario evidente e importante en Estados Unidos hoy en dfa. El coste de diagnosticar, tratar y mantener a los pacientes que padecen estas enfermedades esta en el rango de los miles de millones de dolares. Dos manifestaciones particularmente graves de la cardiopatfa son el infarto de miocardio y la hipertrofia cardiaca. Con respecto al infarto de miocardio, normalmente se produce una oclusion coronaria trombocftica aguda en una arteria coronaria como resultado de la aterosclerosis y provoca la muerte de celulas miocardicas. Dado que los cardiomiocitos, las celulas del musculo cardiaco, estan diferenciados de manera terminal y generalmente no pueden experimentar division celular, se reemplazan generalmente por tejido cicatricial cuando mueren durante el transcurso de un infarto de miocardio agudo. El tejido cicatricial no es contractil, no puede contribuir a la funcion cardiaca y, a menudo, desempena un papel perjudicial en la funcion cardiaca al expandirse durante la contraccion cardiaca, o al aumentar el tamano y el radio eficaz del ventrfculo, por ejemplo, volviendose hipertrofico. Aunque se requiere un deposito de colageno inicial para la curacion del infarto y para prevenir la ruptura cardiaca, la produccion continua de colageno por fibroblastos induce fibrosis intersticial que rodea a los miocitos en la zona limftrofe del infarto y el miocardio remoto del corazon infartado. Esta fibrosis induce rigidez, disfuncion diastolica e hipertrofia de cardiomiocitos debido al aumento del estres y tambien puede conducir a arritmias.
La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazon a practicamente todas las formas de enfermedad cardiaca, incluyendo las que surgen de la hipertension, la carga mecanica, el infarto de miocardio, las arritmias cardiacas, los trastornos endocrinos y las mutaciones geneticas en genes de protefnas contractiles cardiacas. Aunque la respuesta hipertrofica es, inicialmente, un mecanismo compensatorio que aumenta el gasto cardiaco, la hipertrofia sostenida puede provocar cardiomiopatfa dilatada (CPD), insuficiencia cardiaca y muerte subita. En Estados Unidos, aproximadamente medio millon de individuos reciben un diagnostico de insuficiencia cardiaca cada ano, con una tasa de mortalidad que se aproxima al 50 %. Las causas y los efectos de la hipertrofia cardiaca se han documentado extensamente, pero el mecanismo molecular subyacente no se ha dilucidado. La comprension de estos mecanismos es un problema importante en la prevencion y el tratamiento de la enfermedad cardiaca y sera crucial como modalidad terapeutica en el diseno de nuevos farmacos que tengan especfficamente como diana la hipertrofia cardiaca y la insuficiencia cardiaca.
El tratamiento con agentes farmacologicos representa el mecanismo primario para reducir o eliminar las manifestaciones de la insuficiencia cardiaca. Los diureticos constituyen la primera lfnea de tratamiento para insuficiencia cardiaca leve a moderada. Si los diureticos no son eficaces, pueden usarse agentes vasodilatadores, tales como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo, enalopril y lisinopril) o terapia con agentes inotropicos (es decir, un farmaco que mejora el gasto cardiaco aumentando la fuerza de contraccion del musculo miocardico). Desafortunadamente, muchas de estas terapias convencionales tienen numerosos efectos adversos y estan contraindicadas en algunos pacientes. Por tanto, los agentes farmacologicos usados actualmente tienen deficiencias graves en poblaciones de pacientes particulares. La disponibilidad de nuevos agentes que sean seguros y eficaces beneficiarfa sin duda a los pacientes que, o bien no pueden usar las modalidades farmacologicas actualmente disponibles, o bien no reciben un alivio adecuado con estas modalidades.
Los miocitos cardiacos estan rodeados normalmente por una fina red de fibras de colageno. En respuesta a estres patologico, los fibroblastos cardiacos y las protefnas de la matriz extracelular se acumulan de manera desproporcionada y excesiva. La fibrosis miocardica, una caracterfstica de todas las formas de hipertrofia patologica, conduce a rigidez mecanica, que contribuye a la disfuncion contractil (Abraham et al., 2002). Otra caracterfstica distintiva de la hipertrofia patologica y de la insuficiencia cardiaca es la reactivacion de un conjunto de genes cardiacos fetales, incluyendo los que codifican para el peptido natriuretico auricular (ANP), el peptido natriuretico de tipo B (BNP) y las isoformas fetales de protefnas contractiles, tales como la cadena pesada de miosina p (MHC) y actina a esqueleticas. Estos genes se reprimen normalmente tras el nacimiento y se reemplazan por la expresion de un conjunto de genes cardiacos adultos (McKinsey y Olson, 2005). Las consecuencias de la expresion genica fetal sobre la remodelacion y funcion cardiaca (por ejemplo, fibrosis) no se entienden completamente. Sin embargo, la regulacion por incremento de p-MHC, una ATPasa lenta, y la regulacion por disminucion de a-MHC, una ATPasa de
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contraccion rapida, en respuesta al estres, se han implicado en la disminucion de la funcion cardiaca (Bartel, 2004) y se sabe que el BNP desempena un papel dominante en la fibrosis cardiaca.
Ademas de la fibrosis cardiaca, hay varios trastornos o estados que estan asociados a la fibrosis de diversos tejidos. La fibrosis hepatica congenita, una enfermedad autosomica recesiva, es una enfermedad genetica poco comun que afecta tanto al hfgado como a los rinones. La enfermedad se caracteriza por anomalfas hepaticas, tales como hepatomegalia, hipertension portal y tejido conjuntivo de tipo fibroso que se extiende por todo el hfgado (fibrosis hepatica). La fibrosis pulmonar, o cicatrizacion del pulmon, resulta del reemplazo gradual de los sacos aereos pulmonares normales por tejido fibrotico. Cuando se forma la cicatriz, el tejido se vuelve mas grueso, provocando una perdida irreversible de la capacidad del tejido para transferir oxfgeno al torrente sangufneo. La teorfa mas actual es que el proceso fibrotico que se produce en el tejido pulmonar es una reaccion (predispuesta por la genetica) a una lesion microscopica en el pulmon. Aunque la causa exacta sigue sin conocerse, se ha relacionado con contaminantes ocupacionales y ambientales inhalados, tabaquismo, enfermedades tales como esclerodermia, artritis reumatoide, lupus y sarcoidosis, determinados medicamentos y radioterapia.
La esclerodermia es una enfermedad cronica caracterizada por depositos excesivos de colageno en la piel u otros organos. El tipo localizado de la enfermedad, aunque incapacitante, tiende a no ser mortal. El tipo sistemico o esclerosis sistemica, que es el tipo generalizado de la enfermedad, puede ser mortal como resultado de un dano cardiaco, renal, pulmonar o intestinal. La esclerodermia afecta a la piel y, en casos mas graves, puede afectar a los vasos sangufneos y a los organos internos.
La fibrosis muscular esqueletica es un fenomeno que se produce frecuentemente en musculo enfermo o danado. Se caracteriza por el crecimiento excesivo del tejido fibroso que habitualmente resulta del intento del organismo de recuperarse de la lesion. La fibrosis altera la funcion muscular y provoca debilidad. El grado de perdida de funcion muscular aumenta generalmente con la extension de la fibrosis. Las vfctimas de distrofias musculares, particularmente de la distrofia muscular de Becker (DMB) y de la manifestacion alelica mas gravemente penetrante, la distrofia muscular de Duchenne (DMD), padecen frecuentemente fibrosis muscular esqueletica creciente a medida que avanza la enfermedad. Se sabe que otras afecciones tales como atrofia por denervacion producen fibrosis muscular esqueletica, asf como enfermedades neuromusculares, tales como polineuritis aguda, poliomielitis, enfermedad de Werdig/Hoffman, esclerosis lateral amiotrofica (enfermedad de Lou Gehrig) y enfermedad de atrofia bulbar progresiva.
Recientemente se ha implicado a los microARN en varios procesos biologicos, incluyendo la regulacion del calendario de desarrollo, la apoptosis, el metabolismo de las grasas y la diferenciacion de celulas hematopoyeticas, entre otros. Los microARN (miR) son ARN pequenos, que no codifican para protefnas de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud que se obtienen a partir de genes de miARN individuales, de intrones de genes que codifican para protefnas o de transcritos policistronicos que codifican a menudo para multiples miARN estrechamente relacionados. Vease la revision de Carrington et al. (2003). Los miR actuan como represores de ARNm diana promoviendo su degradacion, cuando sus secuencias son perfectamente complementarias, o inhibiendo la traduccion, cuando sus secuencias contienen apareamientos erroneos.
Los miARN se transcriben por la ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III; vease Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology vol. 3:411-419) y surgen de transcritos iniciales, denominados transcritos de miARN primarios (pri-miARN), que generalmente tienen varios miles de bases de longitud. Los pri-miARN se procesan en el nucleo por la ARNasa Drosha para dar precursores con forma de horquilla de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nucleotidos (pre-miARN). Tras el transporte al citoplasma, el pre-miARN en horquilla se procesa adicionalmente por Dicer para producir un miARN bicatenario. La hebra de miARN madura se incorpora entonces al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), en donde se asocia a sus ARNm diana mediante complementariedad de pares de bases. En los casos relativamente poco comunes en los que una base de miARN se aparea perfectamente con una diana de ARNm, promueve la degradacion del ARNm. Mas comunmente, los miARN forman heteroduplex imperfectos con ARNm diana, afectando a la estabilidad del ARNm o inhibiendo la traduccion del ARNm.
La parte del extremo 5' de un miARN que abarca las bases 2-8, denominada la region “simiente”, es especialmente importante para el reconocimiento de la diana (Krenz y Robbins, 2004; Kiriazis y Krania, 2000). La secuencia de la simiente, junto con la conservacion filogenetica de la secuencia diana, constituyen la base de muchos modelos de prediccion de dianas actuales. Aunque se dispone de enfoques computacionales cada vez mas sofisticados para predecir los miARN y sus dianas, la prediccion de dianas sigue siendo un desaffo importante y requiere validacion experimental. La atribucion de las funciones de los miARN a la regulacion de dianas de ARNm especfficas se complica aun mas por la capacidad de los miARN individuales de producir apareamiento de bases con cientos de posibles dianas de ARNm de alta y baja afinidad y por el direccionamiento de multiples miARN a ARNm individuales.
El documento WO 2008/043521 se refiere a un micro-ARN para el diagnostico y tratamiento de cardiopatfas.
El documento WO 2008/016924 se refiere a la identificacion de un micro-ARN que activa la expresion de cadena pesada de miosina beta.
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El documento WO 2007/070483 se refiere a micro-ARN que regulan la proliferacion y diferenciacion de celulas musculares.
Mott JL et al. (Oncogene, vol. 26, n.° 42, 12 de abril de 2007, paginas 6133-6140) se refiere a la regulacion por mir- 29 de la apoptosis y expresion de protefna Mcl-1.
A. He et al. (Molecular Endocrinology, vol. 21, n.° 11, 24 de julio de 2007, paginas 2785-2794) se refiere a la sobreexpresion de micro-acido ribonucleico 29, altamente regulado por incremento en ratas diabeticas, que provoca resistencia a la insulina en adipocitos 3T3-L1.
El documento WO 2005/013901 se refiere a compuestos oligomericos y composiciones para su uso en la modulacion de ARN no codificantes pequenos.
La mejora de la comprension de las funciones de los miARN revelara, sin duda, redes regulatorias que contribuyen al normal desarrollo, diferenciacion, comunicacion inter e intracelular, ciclo celular, angiogenesis, apoptosis, y muchos otros procesos celulares. Recientemente, los inventores informaron de un microARN especffico cardiaco, miR-208, que esta codificado por un intron del gen de cadena pesada de miosina a (MHC) y que es necesario para la regulacion por incremento de la expresion de p-MHC en respuesta al estres cardiaco y para la represion de genes de musculo esqueletico rapido en el corazon (vease la solicitud WO2008/016924 en tramitacion junto con la presente). La presente invencion amplfa la implicacion de microARN en el corazon, asf como en otros tejidos.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define, entre otros, mediante los siguientes puntos:
1. Un agonista de miR-29a-c para su uso en un metodo para el tratamiento o la prevencion de fibrosis tisular en un sujeto que lo necesita, en el que el agonista de miR-29a-c es un polinucleotido que comprende un pri-miARN, pre- miARN o secuencia madura de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c.
2. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 para su uso segun el punto 1, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
3. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 o 2 para su uso segun el punto 1 o 2, en el que el polinucleotido se expresa a partir de un vector de expresion.
4. El agonista de miR-29a-c segun el punto 3 para su uso segun el punto 3, en el que el vector de expresion es un vector de expresion viral.
5. El agonista de miR-29a-c segun el punto 4 para su uso segun el punto 4, en el que el vector de expresion viral es un vector de expresion adenoviral.
6. El agonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 1-5 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 1-5, en el que el agonista se formula para administracion parenteral, oral, transdermica, intradermica, intramuscular, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, de liberacion sostenida, liberacion controlada, liberacion retardada, por supositorio, por inhalacion, por cateter o sublingual o para inyeccion directa en el tejido cardiaco.
7. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 para su uso segun el punto 1, en el que dicha fibrosis tisular es fibrosis cardiaca, esclerodermia, fibrosis muscular esqueletica, fibrosis hepatica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar o fibrosis diabetica.
8. El agonista de miR-29a-c segun el punto 3 para su uso segun el punto 3, en el que el polinucleotido esta unido operativamente a un promotor especffico de fibroblastos.
9. El agonista de miR-29a-c segun cualquiera de los puntos 1 a 3 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 13, en el que el polinucleotido es bicatenario.
10. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 o 2 para su uso segun el punto 1 o 2, en el que el polinucleotido esta conjugado con colesterol.
11. El agonista de miR-29a-c segun el punto 2 para su uso segun el punto 2, en el que el polinucleotido tiene de 18 a 25 nucleotidos de longitud.
12. El agonista de miR-29a-c segun el punto 2 para su uso segun el punto 2, en el que el polinucleotido tiene de 70 a 200 nucleotidos de longitud.
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13. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 o 2 para su uso segun el punto 1 o 2, en el que el polinucleotido comprende una o mas modificaciones qufmicas.
14. El agonista de miR-29a-c segun el punto 13 para su uso segun el punto 13, en el que las modificaciones qufmicas se seleccionan del grupo que consiste en acidos nucleicos bloqueados, modificaciones de azucares y modificaciones de la estructura principal.
15. El agonista de miR-29a-c segun el punto 1 o 2 para su uso segun el punto 1 o 2, en el que el polinucleotido se formula en un vehfculo de administracion de nanopartfculas.
16. Un antagonista de miR-29a-c para su uso en un metodo para tratar tejido que comprende una herida, dano qufmico, dano por calor o dano por frfo, en el que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
17. El antagonista segun el punto 16 para su uso segun el punto 16, en el que el oligonucleotido antisentido se formula para inyeccion en el tejido, inyeccion en la vasculatura que alimenta al tejido o aplicacion topica.
18. El antagonista de miR-29a-c segun el punto 17 para su uso segun el punto 17, en el que la formulacion topica es una pomada, una crema, un gel, un unguento o un balsamo.
19. Un antagonista de miR-29a-c para su uso en la prevencion de infarto de miocardio convirtiendo una o mas placas blandas en tejido fibrotico, en el que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
20. El antagonista de miR-29a-c segun el punto 19 para su uso segun el punto 19, en el que dicho oligonucleotido antisentido se formula para administracion por cateter o como recubrimiento para una endoprotesis o un balon.
21. El antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20, en el que dicho oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
22. El antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20, en el que dicho oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria al 100% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
23. El antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 20, en el que el oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 95% a una secuencia de pre-miR-29a, pre-miR-29b o pre-miR-29c.
24. El antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 23 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 23, en el que dicho oligonucleotido antisentido tiene de 15 a 50 nucleotidos de longitud.
25. Un antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 23 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 23, en el que el oligonucleotido antisentido tiene de 19 a 25 nucleotidos de longitud.
26. El antagonista de miR-29a-c segun uno cualquiera de los puntos 16 a 25 para su uso segun uno cualquiera de los puntos 16 a 25, en el que el oligonucleotido antisentido comprende al menos una modificacion de un azucar y/o de la estructura principal.
27. El antagonista de miR-29a-c segun el punto 26 para su uso segun el punto 26, en el que dicha modificacion de al menos un azucar es una modificacion 2'-O-alquilo o una modificacion de un acido nucleico bloqueado.
28. El antagonista de miR-29a-c segun el punto 26 para su uso segun el punto 26, en el que la modificacion de la estructura principal es una union fosforotioato.
29. Un dispositivo medico usado en cirugfa vascular recubierto con al menos un antagonista de miR-29a-c, en el que dicho antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido o antagomir que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c, y en el que el recubrimiento comprende ademas un compuesto anti-reestenosis seleccionado de paclitaxel, rapamicina, tacrolimus, zotarolimus, everolimus, docetaxel y pimecrolimus.
30. El dispositivo medico del punto 29, en el que el dispositivo medico es una endoprotesis o un balon.
31. El dispositivo medico del punto 29 o 30, en el que el antagonista es un oligonucleotido antisentido o antagomir
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que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
32. El dispositivo medico del punto 29 o 30, en el que el antagonista es un oligonucleotido antisentido o antagomir que comprende una secuencia que es complementaria al 100% a una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
33. El dispositivo medico de uno cualquiera de los puntos 29-32, en el que el antagonista es un oligonucleotido antisentido que comprende al menos una modificacion de un azucar y/o de la estructura principal.
34. El dispositivo medico de uno cualquiera de los puntos 29-33, en el que el oligonucleotido antisentido o antagomir tiene de 19 a 25 nucleotidos de longitud.
35. Una formulacion cosmetica que comprende un antagonista de miR-29a-c, en la que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
36. Un uso cosmetico de un antagonista de miR-29a-c en una formulacion cosmetica para aplicaciones cosmeticas de fotoenvejecimiento debido a dano solar de la piel, arrugas o marcas de estiramiento, en el que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que la familia miR-29, que se regula por disminucion en el corazon en respuesta al estres, regula el deposito de colageno y el desarrollo de fibrosis, incluyendo fibrosis cardiaca. La regulacion por incremento de la expresion o funcion de miR-29a-c da como resultado la disminucion de expresion de genes de colageno y fibrina que conducen a fibrosis cardiaca reducida. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo de tratamiento de la fibrosis cardiaca, la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende identificar un sujeto que tiene fibrosis cardiaca, hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca; y administrar a dicho sujeto un agonista de la expresion o funcion de miR-29a-c. En una realizacion segun los puntos anteriores, el agonista de miR-29a-c es un polinucleotido que comprende la secuencia madura de miR-29a, miR-29b, miR-29c, o combinaciones de los mismos. El agonista de miR-29a-c puede administrarse mediante administracion parenteral (por ejemplo, intravenosa o subcutanea), oral, transdermica, de liberacion sostenida, liberacion controlada, liberacion retardada, por supositorio, por cateter o sublingual. En otro caso, el metodo comprende ademas administrar al sujeto una segunda terapia. La segunda terapia se selecciona del grupo que consiste en un betabloqueante, un ionotropo, un diuretico, ACE-I, un antagonista de AII, BNP, un bloqueante de Ca++, un antagonista del receptor de endotelina y un inhibidor de HDAC.
La presente memoria descriptiva tambien proporciona un metodo de prevencion de la hipertrofia patologica o la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende identificar un sujeto en riesgo de desarrollar hipertrofia cardiaca patologica o insuficiencia cardiaca; y promover la expresion o actividad de miR-29a-c en celulas cardiacas de dicho sujeto. En una realizacion, la promocion de la expresion o actividad de miR-29a-c comprende administrar a las celulas cardiacas de un agonista de miR-29a-c o un vector de expresion que codifica para miR-29a- c. En otra realizacion, el sujeto en riesgo presenta uno o mas factores de riesgo seleccionados del grupo que consiste en hipertension no controlada prolongada, enfermedad valvular no corregida, angina cronica, infarto de miocardio reciente, predisposicion congenita a cardiopatfa e hipertrofia patologica. En otra realizacion, al sujeto en riesgo se le ha diagnosticado una predisposicion genetica a hipertrofia cardiaca. En todavfa otra realizacion, el sujeto en riesgo tiene antecedentes familiares de hipertrofia cardiaca
La presente memoria descriptiva tambien describe un mamffero transgenico, no humano, cuyas celulas no pueden expresar un miR-29a, miR29b y/o miR29c funcional. En otra realizacion, la invencion proporciona un mamffero transgenico, no humano, cuyas celulas comprenden una region que codifica para miR-29a-c bajo el control de un promotor heterologo activo en las celulas de dicho mamffero no humano. El mamffero transgenico puede ser un raton.
En un caso, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo de tratamiento del infarto de miocardio en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas de dicho sujeto. En otro caso, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo de prevencion de la hipertrofia cardiaca y la cardiomiopatfa dilatada en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas de dicho sujeto. En otro caso, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo de inhibicion de la progresion de la hipertrofia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas de dicho sujeto.
La presente memoria descriptiva tambien contempla un metodo de tratamiento o prevencion de una fibrosis tisular en un sujeto que comprende identificar un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener fibrosis tisular; y aumentar la expresion y/o actividad de miR-29a-c en las celulas de fibroblastos o de musculo esqueletico del sujeto. La fibrosis tisular puede ser fibrosis cardiaca, esclerodermia, fibrosis muscular esqueletica, fibrosis hepatica, fibrosis renal,
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fibrosis pulmonar o fibrosis diabetica. En algunos casos, aumentar la expresion y/o actividad de miR-29a-c comprende administrar un agonista de miR-29a-c al sujeto. Un agonista de miR-29a-c puede ser un polinucleotido que comprende la secuencia de una secuencia madura de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c. El agonista de miR-29a-c tambien puede ser un vector de expresion que codifica para miR-29a, miR-29b y/o miR-29c. En un caso, el metodo comprende ademas administrar una terapia antifibrotica distinta de miR-29a-c al sujeto.
La presente memoria descriptiva tambien proporciona un metodo para identificar un modulador de miR-29a-c que comprende poner en contacto una celula con un compuesto candidato; evaluar la actividad o expresion de miR-29a- c; y comparar la actividad o expresion en la etapa (b) con la actividad o expresion de miR-29a-c en ausencia del compuesto candidato, en el que una diferencia entre las actividades o expresiones medidas de miR-29a-c indica que el compuesto candidato es un modulador de miR-29. La celula puede ponerse en contacto con el compuesto candidato in vitro o in vivo. Los compuestos candidatos adecuados incluyen protefnas, peptidos, polipeptidos, polinucleotidos, oligonucleotidos o moleculas pequenas.
La presente invencion tambien abarca una composicion farmaceutica que comprende un agonista o antagonista de miR-29a-c. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica puede formularse para administracion por inyeccion o topica. La formulacion para administracion topica puede ser un gel, una crema, una locion o una pomada.
La presente memoria descriptiva proporciona un metodo de induccion del deposito de colageno en un tejido que comprende poner en contacto dicho tejido con un antagonista de miR-29a-c. El antagonista puede ser un antagonista de miR-29a, miR-29b o miR-29c. El antagonista puede ser un antagomir de miR-29a-c, un oligonucleotido antisentido que tiene como diana una secuencia de miR-29a-c madura o una molecula de ARN inhibidor, tal como un ARNip o ARNhp, que comprende una secuencia identica a una secuencia de miR-29a-c madura, o un ribozima u otro acido nucleico inhibidor. En un caso, el metodo comprende ademas poner en contacto dicho tejido con un segundo agente. El segundo agente puede ser vitamina A topica, vitamina C topica o vitamina E. En otro caso, el metodo comprende ademas someter dicho tejido a un segundo tratamiento, tal como una exfoliacion qufmica, tratamiento con laser, dermoaplanamiento o dermoabrasion. En otro caso, el tejido esta en un sujeto que padece sfndrome de Ehler-Danlos o deficiencia de vitamina C.
Breve descripcion de los dibujos
La invencion puede entenderse mejor mediante la referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de las realizaciones especfficas presentadas en el presente documento.
Figuras 1A-B. miR-208 esta codificado por el gen de a-MHC y se expresa especfficamente en el corazon. (Figura 1A) miR-208 se codifica dentro de un intron del gen de a-MHC. Los asteriscos indican conservacion de la secuencia (SEQ ID NO: 1-5). (Figura 1B) Deteccion de transcritos de miR-208 mediante analisis de tipo Northern de tejidos de raton adulto. ARNm U6 sirve como control de carga.
Figuras 2A-B. Regulacion de a- y p-MHC. (Figura 2A) Regulacion del cambio de clase por hormona tiroidea y TRE. (Figura 2B) Modelo para estres/hipotiroidismo en el cambio de contractilidad de fibras musculares de rapida a lenta.
Figura 3. Deteccion de miR-208 en corazon humano. Se detectaron transcritos para a-MHC y miR-208 mediante transferencia de tipo Northern de tejido cardiaco de seis individuos normales y seis individuos con cardiomiopatfa idiopatica. Existe una estrecha correlacion entre el nivel de expresion de a-MHC y pre-miR-208, mientras que se mantiene la expresion de miR-208 maduro tras haberse regulado por disminucion este ultimo.
Figuras 4A-B. Generacion de ratones mutantes para miR-208. (Figura 4A) Estrategia para generar ratones mutantes para miR-208 mediante recombinacion homologa. Se reemplazo la secuencia de pre-miARN (ubicada dentro del intron 29 del gen de a-MHC de raton en la mayorfa de los transcritos) por un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP. Se elimino el casete de neomicina en la lfnea germinal de raton cruzando ratones heterocigotos con ratones transgenicos que albergan el transgen CAG-Cre. (Figura 4B) Deteccion de transcritos de miR-208 mediante analisis de tipo Northern de corazones de ratones de tipo natural y mutantes para miR-208.
Figura 5. Analisis de tipo Western de los niveles de protefna a-MHC y p-MHC en corazones de ratones neonatos de los genotipos indicados. Se analizaron dos ratones de cada genotipo. Se detecto GAPDH como control de carga.
Figura 6. Ratones MiR-208'/_ muestran hipertrofia cardiaca reducida en respuesta a sobrecarga de presion. Secciones histologicas de corazones de ratones de tipo natural y miR-208'/' tenidas con tincion tricromica de Masson. La ausencia de miR-208 disminuye la hipertrofia y la fibrosis observadas en ratones de tipo natural sometidos a bandeo aortico toracico (TAB) durante 21 dfas. La barra de escala es igual a 2 mm para el panel superior y a 20 pm para el panel inferior.
Figura 7. Ratones MiR-208'/_ muestran hipertrofia cardiaca reducida en respuesta a activacion con calcineurina.
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Secciones histologicas de corazones de ratones de 6 semanas de edad que expresan un transgen de calcineurina (CnA-Tg) y corazones de miR-208'/'; CnA-Tg tenidas con tincion tricromica de Masson. La ausencia de miR-208 disminuye la hipertrofia y la fibrosis observadas en ratones CnA-Tg. Barra de escala = 2 mm para el panel superior, 20 pm para el panel inferior.
Figura 8. Ratones Mir-208'/_ no pueden regular por incremento p-MHC en respuesta a TAB y activacion con calcineurina.
Figura 9. Analisis de tipo Western de los niveles de protefna a- y p-MHC en animales adultos de tipo natural y transgenicos para miR-208. Se detecto GAPDH como control de carga.
Figura 10. Ratones miR-208'/' no pueden regular por incremento p-MHC en respuesta a hipotiroidismo con tratamiento con PTU.
Figura 11. Diagrama esquematico del papel de miR-208 en el control de la expresion de p-MHC.
Figura 12. Diagrama esquematico del papel de miR-208 en la regulacion de p-MHC y la expresion de genes de musculo esqueletico rapido por medio de Thrap1.
Figura 13. Mecanismos de accion de microARN durante la hipertrofia cardiaca.
Figuras 14A-C. Expresion de miARN durante la remodelacion e hipertrofia cardiaca. (Figura 14A) Secciones tenidas con H&E de corazones representativos de ratones tras simulacion y TAB durante 21 dfas y de ratones con CnA Tg. La barra de escala es igual a 2 mm. (Figura 14B) Diagramas de Venn que muestran el numero de microARN cuya expresion cambiaba para cada tipo de corazon. (Figura 14C) Transferencia de tipo Northern de microARN cuya expresion cambiaba durante la hipertrofia. Se detecto ARN U6 como control de carga.
Figura 15. La expresion de miR-29a-c se regula por disminucion en respuesta al estres cardiaco. A la izquierda se muestran corazones de ratones de tipo natural (WT) y ratones con hipertrofia y fibrosis inducida por un transgen de calcineurina (CnA) o TAB. El nivel relativo de expresion de miR-29a-c de cada tipo de corazon se muestra a la derecha.
Figura 16. Analisis de microarrays de corazones de ratones desactivados para miR-208 en comparacion con ratones de tipo natural. Se realizo el analisis de microarrays sobre ARNm aislado de corazones de tipo natural y nulos para miR-208 a las 6 semanas de edad. El miARN que experimenta mayor regulacion por disminucion, despues de miR- 208, es miR-499.
Figura 17. La familia miR-29 experimenta una drastica regulacion por incremento en corazones nulos para miR-208.
Figura 18. La familia miR-29 tiene como diana los ARNm que codifican para colagenos y otros componentes de la matriz extracelular implicados en la fibrosis. Basandose en su alta homologfa de secuencia, la familia miR-29 consiste en 4 miembros; miR-29a, miR29b-1 y -2 y miR-29c. Se muestran las secuencias de los miARN maduros (SEQ ID NO: 18-20). Las secuencias maduras de miR-29b-1 y miR-29b-2 son identicas. De forma conjunta, esta familia se dirige contra muchos componentes de la matriz extracelular implicados en la fibrosis.
Figura 19. Modelo para el control de la fibrosis cardiaca mediante la familia miR-208 y miR-29. En un corazon normal, miR-208 inhibe la expresion de miR-29a-c. En ausencia de miR-208, la expresion de miR-29a-c esta regulada por incremento, impidiendo la expresion de matriz extracelular y fibrosis en respuesta al estres. Las funciones de miR-208, miR-499 y miR-29 estan interconectadas. La perdida de miR-208 puede ser cardioprotectora al impedir la expresion de miR-499 y regular por incremento la expresion de miR-29a-c, con el consecuente bloqueo de la fibrosis.
Figuras 20A-D. miR-29a-c regula la expresion de protefnas de la matriz extracelular. (Figura 20A) Posibles sitios de union para miR-29a-c en regiones UTR 3' de genes fibroticos clave. (Figura 20B) El analisis por PCR en tiempo real de genes diana predichos tanto en la zona limftrofe como en el miocardio remoto 3 dfas despues de un infarto de miocardio muestra una disminucion en miR-29a-c que se correlaciona con un aumento en los colagenos (COL1A1, COL1A2 y COL3A1) y fibrilina (FBN1), mientras que no hubo ningun cambio significativo en la elastina (ELN1). (Figura 20C) El analisis de transferencia de tipo Northern sobre celulas COS transfectadas con cantidades crecientes del plasmido de expresion de CMV que codifica para el cluster miR-29b-1/miR-29a muestra sobreexpresion eficaz de miR-29a-b. La banda superior corresponde al pre-miARN, mientras que la banda inferior corresponde al miARN maduro. (Figura 20D) Experimentos con luciferasa usando las secuencias de UTR endogenas de los genes diana predichos, que muestran que miR-29a-c reprime la expresion de luciferasa en respuesta a cantidades crecientes de miR-29a-c, mientras que esta disminucion estaba ausente cuando se usa un miR no relacionado, miR-206.
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Figuras 21A-B. Expresion de miR-29a-c sensible a TGFp. (Figura 21A) El analisis por PCR en tiempo real indica que los tres miembros de la familia miR-29 experimentan regulacion por disminucion en fibroblastos en respuesta a TGFp. (Figura 21B) Analisis de tipo Northern que muestra que la expresion de miR-29a-c se regula por incremento en animales mutantes para miR-208, lo que coincide con un aumento en la expresion de BNP, tal como se determina mediante PCR en tiempo real.
Figuras 22A-G. La inhibicion de miR-29a-c induce fibrosis in vivo. (Figura 22A) Estructura qufmica de anti-miR-29a-c y miR-29a-c con apareamiento erroneo (mm). (Figura 22B) Analisis de transferencia de tipo Northern que muestra la inactivacion especffica de tejido tras 3 dfas en respuesta a la inyeccion intravenosa de 80 mg/kg de anti-miR-29a-c o de miR-29a-c mm o un volumen comparable de solucion salina. (Figura 22C) El analisis por PCR en tiempo real de extractos hepaticos indica un aumento pronunciado en la expresion de colageno en respuesta a la inactivacion de miR-29a-c, mientras que este efecto estaba ausente tras la inyeccion de solucion salina o de miR-29a-c mm. (Figura 22D) La recogida de tejido, tres semanas despues de la inyeccion intravenosa con 80 mg/kg en dos dfas consecutivos de oligonucleotido anti-miR-29a-c o miR-29a-c mm o de un volumen comparable de solucion salina, indica una inactivacion severa de miR-29a-c en corazon, hfgado y rinon, mientras que los niveles de miR-29a-c en pulmones parecen no verse afectados. (Figura 22E) El analisis por PCR en tiempo real de extractos de corazon indica un aumento en la expresion de colageno cardiaco en respuesta a la inactivacion de miR-29a-c. (Figura 22F) Analisis por PCR en tiempo real que indica un aumento en la expresion de miR-29b en fibroblastos dos dfas despues del tratamiento que imita a miR-29b, mientras que los niveles de miR-29a no cambiaron y los niveles de miR-29c solo aumentaron ligeramente. (Figura 22G) La sobrexpresion de miR-29b en fibroblastos reprime la expresion de genes de colageno, tal como se determina mediante analisis por PCR en tiempo real.
Figura 23. Expresion de miembros de la familia miR-29 en diversos tejidos en respuesta a la inactivacion de miR- 29b. La inactivacion de todos los miembros de miR-29 en los diferentes tejidos indica que miR-29b muestra una reduccion de 50 % en el corazon en respuesta a anti-miR-29b, mientras que miR-29a y -c solo muestran cambios marginales. Sin embargo, la inactivacion de miR-29b en hfgado y rinon en respuesta a anti-miR-29b es casi completa, mientras que miR-29a y -c tambien parecen reducirse en estos tejidos en respuesta a anti-miR-29b.
Descripcion detallada de realizaciones ilustrativas
Los musculos esqueletico y cardiaco responden a una variedad de estfmulos fisiopatologicos tales como carga de trabajo, senalizacion de hormonas tiroideas y lesiones modulando la expresion de isoformas de miosina, que regulan la eficiencia de la contraccion. Recientemente, los inventores informaron de un microARN especffico cardiaco, miR- 208, que esta codificado por un intron del gen de cadena pesada de a-miosina (MHC) y que es necesario para la regulacion por incremento de la expresion de p-MHC en respuesta al estres cardiaco y para la represion de genes de musculo esqueletico rapido en el corazon (vease la solicitud WO2008/016924 en tramitacion junto con la presente).
En el presente documento, los inventores amplfan su trabajo anterior y muestran que miR-208 tambien regula por disminucion una familia de miARN relacionados, miR-29a-c. Dado que miR-29a-c se expresan de manera ubicua, y estan implicados en la regulacion del deposito de colageno, las estrategias para regular por incremento la expresion de miR-29a-c tienen aplicaciones en la prevencion de una variedad de fibrosis tisulares incluyendo fibrosis cardiaca, asf como fibrosis del musculo esqueletico, de hfgado, pulmonar, diabetica y renal. La regulacion de miR-29a-c en celulas cardiacas, tales como fibroblastos cardiacos, puede usarse para tratar o prevenir la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un sujeto. Por tanto, un aspecto de la invencion es el agonismo de la expresion o actividad de miR-29a-c, opcionalmente en combinacion con la inhibicion de miR-208. El agonismo puede implicar la introduccion de miR-29a-c exogeno en el corazon u otros tejidos de interes, ya sea directamente usando acido nucleico desnudo o mediante un vehfculo de suministro tal como un lfpido/liposoma/nanopartfcula, o a traves de expresion genica, por ejemplo usando vectores adenovirales u otros medios de expresion ectopica para reducir la fibrosis. Tambien se contempla la activacion de la funcion antifibrotica de miR-29a-c a traves de “moleculas pequenas” farmaceuticas, asf como cribados para identificar tales compuestos.
El aumento de colageno que resulta tras la represion de la expresion de miR-29a-c, por ejemplo, tras un infarto de miocardio (IM) y otras formas de estres, puede indicar otro papel para miR-29a-c. Otro punto de interes del trabajo de los inventores es la fibrosis cardiaca, y un examen de un subconjunto de genes reguladores clave, concretamente colageno I, III, elastina y fibrilina, mostro un aumento notable tanto en colagenos como en fibrilina en respuesta a la regulacion por disminucion de miR-29a-c, mientras que no se produjo aumento en elastina. Asf, la represion terapeutica de miR-29a-c para aumentar el deposito de colageno representa una opcion unica para tratar estados caracterizados por la perdida de colageno, tales como aplicaciones cosmeticas como y cicatrizacion.
MicroARN 29 (miR-29) es una familia de microARN que consiste en 4 miembros conocidos, miR-29a, b1 y 2 (identicos) y c. Mientras que miR 29b-1 y 29a provienen del mismo transcrito que se origina a partir del cromosoma 7 en humanos y del cromosoma 6 en ratones, el cluster de miARN que contiene miR29b-2 y miR29c se transcribe a partir del cromosoma 1 en ambas especies. Las secuencias de miARN maduras para cada uno de los miembros de la familia miR-29 humana se enumeran a continuacion:
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hsa-miR-29b-1 y b-2 uagcaccauuugaaaucaguguu (SEQ ID NO: 19)
hsa-miR-29c uagcaccauuugaaaucgguua (SEQ ID NO: 20)
Estos microARN forman una familia basada en su homologfa de secuencia (Yu et al; 2006). Dado que solo existen diferencias menores entre los miembros de la familia, y que los miembros tienen una region simiente conservada al 100% (que ayuda a definir la determinacion de la diana), es probable que tengan las mismas dianas de ARNm (figura 18) y que reduzcan la expresion genica de estos genes diana especfficos. La determinacion de la diana para la familia miR-29 revelo que la familia miR-29 muestra una alta preferencia por genes implicados en la formacion de colageno, asf como por otras protefnas de la matriz extracelular, tales como elastina (ELN), fibrilina 1 (FBN1), colageno tipo I a1 y a2 (COL1A1, COL1A2), colageno tipo III a1 (COL3A1), metalopeptidasas e integrinas. En respuesta al estres patologico, los fibroblastos cardiacos y las protefnas de la matriz extracelular se acumulan de manera desproporcionada y excesiva. La fibrosis miocardica, una caracterfstica de todas las formas de hipertrofia patologica, conduce a rigidez mecanica, que contribuye a la disfuncion contractil (Berk et al., 2007). Puesto que la familia miR-29 se regula por disminucion durante este proceso de remodelacion, es probable que esta familia desempene un papel activo en la modulacion del deposito de colageno y, de ese modo, regule la fibrosis cardiaca y la contractibilidad cardiaca, lo que secundariamente puede inducir hipertrofia y remodelacion patologica.
Tal como se comento anteriormente, miR-208 parece regular la expresion de miR-29, ya que miR-29 experimenta una regulacion por incremento significativa en los corazones de ratones que carecen de ambas copias de miR-208 (vease el ejemplo 1). Por tanto, la modulacion de miR-208 puede afectar a la expresion de miR-29, asf como a la expresion de genes diana de miR-29. MiR-208 es un miARN intronico que se ubica dentro de un intron del gen de a- MHC. La ubicacion precisa del intron depende de la especie particular y del transcrito especffico. Por ejemplo, en humanos, miR-208 se codifica dentro del intron n.° 28 del gen de a-MHC, mientras que en ratones, se codifica dentro del intron n.° 29. Las secuencias codificantes de pre-miARN para miR-208 en humano, raton, rata y canido se proporcionan en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, respectivamente. La secuencia de miR-208 madura se proporciona en SEQ ID NO: 5. Al igual que a-MHC, miR-208 se expresa unicamente en el corazon (figura 1).
Pre-miR-208 humano (SEQ ID NO: 14)
acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a Pre-miR-208 de raton (SEQ ID NO: 15)
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a Pre-miR-208 de rata (SEQ ID NO: 16)
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a Pre-miR-208 de canido (SEQ ID NO: 17)
acgcatgagc ttttggctcg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a
Usando el algoritmo de PicTar para la identificacion de dianas de miARN (Krek et al., 2005), los inventores identificaron la protefna 1 asociada a receptor de hormona tiroidea (THRAP1) como diana predicha para miR-208. Las secuencias de UTR 3' de THRAP1 de humano, chimpance, raton, rata, canido, pollo, pez globo y pez cebra se proporcionan en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID No: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente.
UTR 3' de THRAP1 humana (SEQ ID NO: 6)
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aaaguugcag uaggguugc UTR 3' de THRAP1 de chimpance (SEQ ID NO: 7)
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc UTR 3' de THRAP1 de raton (SEQ ID NO: 8)
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc
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uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc UTR 3' de THRAP1 de canido (SEQ ID NO: 10)
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc UTR 3' de THRAP1 de pollo (SEQ ID NO: 11)
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc UTR 3' de THRAP1 de pez globo (SEQ ID NO: 12)
uuccugcuuu aagcaauugg uugaaaauau auguauguaa uggucuuaau uaaaaaaaca aacuaagaca aa UTR 3' de THRAP1 de pez cebra (SEQ ID NO: 13)
uuccugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuucauuac aaaaacgaac caucaaacg
La presente memoria descriptiva proporciona un metodo de tratamiento de la fibrosis cardiaca, la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende identificar un sujeto que tiene fibrosis cardiaca, hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca; y administrar al sujeto un agonista de la funcion o expresion de miR-29. El agonista de miR-29 puede ser un agonista de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c.
En una realizacion, los agonistas de miR-29a-c pueden ser polinucleotidos que comprenden la secuencia de miR- 29a-c madura. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otra realizacion, el agonista de miR-29a-c puede ser un polinucleotido que comprende la secuencia de pri-miARN o pre-miARN para miR-29a, miR-29b y/o miR-29c. El polinucleotido que comprende la secuencia madura de miR-29a-c, pre-miR-29ac o pri-miR-29a-c puede ser monocatenario o bicatenario. Los polinucleotidos pueden contener una o mas modificaciones qufmicas, tales como acidos nucleicos bloqueados, acidos nucleicos peptfdicos, modificaciones de azucares, tales como 2'-O-alquilo (por ejemplo, 2'-O-metilo, 2'-O- metoxietilo), modificaciones 2'-fluoro y 4'-tio, y modificaciones de la estructura principal, tales como una o mas uniones fosforotioato, morfolino o fosfonocarboxilato. En una realizacion, el polinucleotido que comprende una secuencia de miR-29a-c esta conjugado con colesterol. Fuera del alcance de la invencion, el agonista de miR-29a-c puede ser un agente distinto de miR-29a-c que actua aumentando, complementando o reemplazando la funcion de miR-29a-c.
En otra realizacion, el agonista de miR-29a-c puede expresarse in vivo a partir de un vector. Un “vector” es una composicion de materia que puede usarse para suministrar un acido nucleico de interes al interior de una celula. Se conocen numerosos vectores en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a, polinucleotidos lineales, polinucleotidos asociados a compuestos ionicos o anfffilos, plasmidos y virus. Por tanto, el termino “vector” incluye un plasmido o un virus de replicacion autonoma. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales y similares. Un constructo de expresion puede replicarse en una celula viva, o puede producirse de manera sintetica. Para los fines de esta solicitud, los terminos “constructo de expresion”, “vector de expresion” y “vector” se usan de manera intercambiable para demostrar la aplicacion de la invencion en un sentido general e ilustrativo, y no pretenden limitar la invencion.
En una realizacion, un vector de expresion para expresar miR-29a-c comprende un promotor “unido operativamente” a un polinucleotido que codifica para miR-29a, miR-29b, miR-29c, o combinaciones de los mismos. En otra realizacion, el polinucleotido puede codificar para el cluster miR-29b-1/miR-29a. En otra realizacion, el polinucleotido puede codificar para el cluster miR-29b-2/miR-29c. La frase “unido operativamente” o “bajo control transcripcional”, tal como se usa en el presente documento, significa que el promotor se encuentra en la ubicacion y orientacion correctas en relacion con un polinucleotido para controlar el inicio de la transcripcion por ARN polimerasa y la expresion del polinucleotido. El polinucleotido que codifica para miR-29a-c puede codificar para la secuencia primaria de microARN-29a-c (pri-miR-29a-c), la secuencia precursora de microARN-29a-c (pre-miR-229a-c) o la secuencia de miR-29a-c madura. En otra realizacion, el vector de expresion comprende un polinucleotido unido operativamente a un promotor, en el que dicho polinucleotido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18. En otra realizacion, el vector de expresion comprende un polinucleotido unido operativamente a un promotor, en el que dicho polinucleotido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19. En todavfa otra realizacion, el vector de expresion comprende un polinucleotido unido operativamente a un promotor, en el que dicho polinucleotido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20. El polinucleotido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 puede ser de aproximadamente 18 a aproximadamente 2000 nucleotidos de longitud, de aproximadamente 70 a aproximadamente 200 nucleotidos de longitud, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleotidos de longitud o de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud.
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A lo largo de toda esta solicitud, el termino “constructo de expresion” pretende incluir cualquier tipo de const ructo genetico que contenga un acido nucleico que codifica para un producto genico en el que una parte de o toda la secuencia codificante de acido nucleico puede transcribirse. Generalmente, el acido nucleico que codifica para un producto genico esta bajo el control transcripcional de un promotor. Un “promotor” se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintetica de la celula, o por la maquinaria sintetica introducida, necesaria para iniciar la transcripcion especffica de un gen.
El termino promotor se usara en el presente documento para referirse a un grupo de modulos de control transcripcional que se agrupan alrededor del sitio de iniciacion para una ARN polimerasa. Gran parte de los conocimientos sobre como se organizan los promotores procede de los analisis de varios promotores virales, incluyendo los de timidina cinasa (tk) de VHS y las unidades de transcripcion temprana de SV40. Estos estudios, junto con el trabajo mas reciente, han mostrado que los promotores se componen de modulos funcionales discretos, cada uno de los cuales consiste en aproximadamente 7-20 pb de ADN, y contienen uno o mas sitios de reconocimiento para protefnas activadoras o represoras transcripcionales.
Al menos un modulo de cada promotor funciona situando el sitio de inicio para la sfntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido de esto es la caja TATA; no obstante, en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tales como el promotor para el gen de desoxinucleotidil transferasa terminal de mamfferos y el promotor para los genes tardfos de SV40, un elemento discreto superpuesto al propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de iniciacion.
Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de iniciacion transcripcional. Normalmente, estos se localizan en la region situada a 30-110 pb en el sentido 5' del sitio de inicio, aunque tambien se ha demostrado recientemente que varios promotores contienen elementos funcionales en el sentido 3' del sitio de inicio. Frecuentemente, la separacion entre elementos promotores es flexible, de modo que la funcion promotora se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven unos en relacion entre otros. En el promotor de tk, la separacion entre elementos promotores puede aumentarse hasta una diferencia de 50 pb antes de que la actividad comience a descender. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o de manera independiente para activar la transcripcion.
En otras realizaciones, el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano de SV40, la repeticion terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el promotor de insulina de rata, el promotor de ARN pol III y el promotor de gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa se pueden usar para obtener una expresion de alto nivel del polinucleotido de interes. Tambien se contempla el uso de otros promotores virales o celulares de mamfferos o de bacteriofagos que se conocen bien en la tecnica para conseguir la expresion de un polinucleotido de interes, siempre que los niveles de expresion sean suficientes para un fin dado.
Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, puede optimizarse el nivel y el patron de la expresion del polinucleotido de interes tras la transfeccion o la transformacion. Adicionalmente, la seleccion de un promotor que se regula en respuesta a senales fisiologicas especfficas puede permitir la expresion inducible del producto genico. Las tablas 1 y 2 enumeran varios elementos reguladores que pueden emplearse, en el contexto de la presente invencion, para regular la expresion del gen de interes. Esta lista no pretende ser exhaustiva de todos los elementos posibles implicados en la promocion de la expresion genica sino servir, meramente, a modo de ejemplo de los mismos.
Los potenciadores son elementos geneticos que aumentan la transcripcion de un promotor localizado en una posicion distante de la misma molecula de ADN. Los potenciadores se organizan de manera similar a los promotores. Es decir, se componen de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o mas protefnas transcripcionales.
La distincion basica entre potenciadores y promotores es funcional. Una region potenciadora como un todo debe poder estimular la transcripcion a una distancia; esto no necesita ser cierto para una region promotora o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o mas elementos que dirijan la iniciacion de la sfntesis de ARN a un sitio particular y en una orientacion particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y los potenciadores a menudo se superponen y son contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organizacion modular muy similar.
A continuacion se proporciona una lista de promotores virales, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles que podrfan usarse en combinacion con el acido nucleico que codifica para un gen de interes en un constructo de expresion (tabla 1 y tabla 2). Ademas, tambien puede usarse cualquier combinacion de promotor/potenciador (segun la base de datos de promotores eucariotas EPDB) para dirigir la expresion del gen. Las celulas eucariotas pueden soportar la transcripcion citoplasmatica de determinados promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, bien como parte del complejo de suministro o bien como un constructo de expresion genetica adicional. En una realizacion preferida, el polinucleotido que codifica para miR-29a-c o para el antagonista miR-29a-c esta unido operativamente a un promotor especffico de fibroblastos.
TABLA 1 Promotor y/o Potenciador
Promotor/Potenciador
Referencias
Cadena pesada de inmunoglobulina
Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990
Cadena ligera de inmunoglobulina
Queen et al., 1983; Picard et al., 1984
Receptor de celulas T
Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990
HLA DQ a y/o DQ 3
Sullivan et al., 1987
Interferon 3
Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988
Interleucina-2
Greene et al., 1989
Receptor de interleucina-2
Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
MHC de clase II 5
Koch et al., 1989
MHC de clase II HLA-DRa
Sherman et al., 1989
3-Actina
Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989
Creatina cinasa de musculo (MCK)
Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989
Prealbumina (transtiretina)
Costa et al., 1988
Elastasa I
Ornitz et al., 1987
Metalotionefna (MTII)
Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989
Colagenasa
Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987a
Albumina
Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990
a-Fetoprotefna
Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989
t-Globina
Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990
3-Globina
Trudel et al., 1987
c-fos
Cohen et al., 1987
c-HA-ras
Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985
Insulina
Edlund et al., 1985
Molecula de adhesion celular neuronal (NCAM)
Hirsh et al., 1990
ai-Antitripsina
Latimer et al., 1990
Histona H2B (TH2B)
Hwang et al., 1990
Colageno de raton y/o tipo I
Ripe et al., 1989
Protefnas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78)
Chang et al., 1989
Hormona de crecimiento de rata
Larsen et al., 1986
Amiloide A serico (SAA) humano
Edbrooke et al., 1989
Troponina I (TN I)
Yutzey et al., 1989
Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)
Pech et al., 1989
Distrofia muscular de Duchenne
Klamut et al., 1990
SV40
Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988
Polioma
Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell y/o Villarreal, 1988
Retrovirus
Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989
Virus del papiloma
Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y/o Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stefens et al., 1987
Virus de la hepatitis B
Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988
Virus de la inmunodeficiencia humana
Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989
Citomegalovirus (CMV)
Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986
Virus de la leucemia del mono gibon
Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989
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TABLA 2 Elementos inducibles
Elemento
Inductor Referencias
MT II
Ester de forbol (TFA) Metales pesados Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
VTMR (virus de tumor mamario de raton)
Glucocorticoides Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988
Interferon p
poli(rI)x poli(rc) Tavernier et al., 1983
Adenovirus 5 E2
E1A Imperiale et al., 1984
Colagenasa
Ester de forbol (TPA) Angel et al., 1987a
Estromelisina
Ester de forbol (TPA) Angel et al., 1987b
SV40
Ester de forbol (TPA) Angel et al., 1987b
Gen MX murino
Interferon, virus de la enfermedad de Newcastle Hug et al., 1988
Gen GRP78
A23187 Resendez et al., 1988
a-2-Macroglobulina
IL-6 Kunz et al., 1989
Vimentina
Suero Rittling et al., 1989
Gen H-2kP de MHC de clase I
Interferon Blanar et al., 1989
HSP70
E1A, antfgeno largo T de SV40 Tailor et al., 1989, 1990a, 1990b
Proliferina
Ester de forbol-TPA Mordacq et al., 1989
Factor de necrosis tumoral
PMA Hensel et al., 1989
Gen a de hormona estimulante del tiroides
Hormona tiroidea Chatterjee et al., 1989
Cuando se emplea un inserto de ADNc, normalmente se deseara incluir una senal de poliadenilacion para efectuar una poliadenilacion apropiada del transcrito genico. La naturaleza de la senal de poliadenilacion no se cree que sea crucial para la practica exitosa de la invencion, y puede emplearse cualquier secuencia de este tipo, tales como senales de poliadenilacion de la hormona de crecimiento humana y de SV40. Tambien se contempla un terminador como elemento del cassette de expresion. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensaje y minimizar la lectura a traves del cassette para dar otras secuencias.
En determinadas realizaciones de la invencion, pueden identificarse celulas que contienen constructos de acido nucleico de la presente invencion in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el constructo de expresion. Tales marcadores conferirfan un cambio identificable a la celula, permitiendo una facil identificacion de las celulas que contienen el constructo de expresion. Habitualmente, la inclusion de un marcador de seleccion de farmaco sirve de ayuda en la clonacion y en la seleccion de transformantes; por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables utiles. Alternativamente, pueden emplearse enzimas tales como cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple. Tambien pueden emplearse marcadores inmunologicos. El marcador seleccionable empleado no se cree que sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultaneamente con el acido nucleico que codifica para un producto genico. Un experto en la tecnica conoce bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables.
Los vectores de expresion en las celulas pueden introducirse de diversas maneras. En determinadas realizaciones de la invencion, el constructo de expresion comprende un virus o un constructo disenado por ingenierfa obtenido a partir de un genoma viral. La capacidad de determinados virus para introducirse en celulas por medio de endocitosis mediada por receptor, integrarse en el genoma de la celula huesped y expresar genes virales de manera estable y eficiente ha hecho que sean candidatos atractivos para la transferencia de genes foraneos al interior de celulas de mamfferos (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986).
Uno de los metodos preferidos para el suministro in vivo implica el uso de un vector de expresion de adenovirus. “Vector de expresion de adenovirus” pretende incluir aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento del constructo y (b) expresar un polinucleotido que se ha clonado en el mismo. El vector de expresion comprende una forma geneticamente modificada disenada por ingenierfa genetica del adenovirus. El conocimiento de la organizacion genetica del adenovirus, un virus de ADN bicatenario, lineal y de 36 kB, permite la sustitucion de grandes trozos de ADN adenoviral por secuencias foraneas de hasta 7 kB (Grunhaus y Horwitz, 1992). Al contrario que el retrovirus, la infeccion adenoviral de celulas huesped no da como resultado la integracion cromosomica, ya que el ADN adenoviral puede replicarse de una manera episomal sin
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genotoxicidad potencial. Ademas, los adenovirus son estables estructuralmente, y no se ha detectado transposicion del genoma tras una amplificacion extensa. El adenovirus puede infectar practicamente a todas las celulas epiteliales, independientemente de su fase de ciclo celular.
El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como vector de transferencia genica debido a su genoma de tamano medio, facilidad de manipulacion, alto tftulo, amplio intervalo de celulas diana y alta infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen 100-200 repeticiones invertidas (ITR) de pares de bases, que son elementos cis necesarios para la replicacion y el empaquetamiento del ADN viral.
Aparte del requisito de que el vector de adenovirus sea de replicacion defectuosa, o al menos condicionalmente defectuosa, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la practica exitosa de la invencion. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 serotipos o subgrupos A-F diferentes conocidos. El adenovirus de tipo 5 de subgrupo C es el material de partida preferido para obtener el vector de adenovirus de replicacion defectuosa condicional para su uso en la presente invencion. Esto se debe a que el adenovirus de tipo 5 es un adenovirus humano sobre el que se tiene mucha informacion bioqufmica y genetica y a que, historicamente, se ha usado en la mayorfa de las construcciones que emplean adenovirus como vector.
Tal como se menciono anteriormente, el vector tfpico segun la presente invencion es de replicacion defectuosa y no tendra una region E1 de adenovirus. Por tanto, lo mas conveniente sera introducir el polinucleotido que codifica para el gen de interes en la posicion de la que se han retirado las secuencias que codifican para E1. Sin embargo, la posicion de insercion del constructo en las secuencias de adenovirus no es crftica para la invencion. El polinucleotido que codifica para el gen de interes tambien puede insertarse en lugar de la region E3 delecionada en los vectores de reemplazo de E3, tal como describen Karlsson et al. (1986), o en la region E4 en la que una lfnea celular auxiliar o virus auxiliar complementa el defecto de E4.
Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresion genica eucariota (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) y en el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1991). Recientemente, los estudios en animales sugirieron que el adenovirus recombinante podrfa usarse para terapia genica (Stratford- Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Los estudios de administracion de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilacion traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyeccion muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas perifericas (Herz y Gerard, 1993) e inoculacion estereotactica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).
Los vectores retrovirales tambien son adecuados para expresar los polinucleotidos de la invencion en celulas. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizados por su capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en celulas infectadas mediante un procedimiento de transcripcion inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra entonces de manera estable en cromosomas celulares como provirus y dirige la sfntesis de protefnas virales. La integracion da como resultado la retencion de las secuencias genicas virales en la celula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes (gag, pol y env) que codifican para protefnas de la capsida, la enzima polimerasa y los componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia encontrada en el sentido 5' del gen gag contiene una serial para el empaquetamiento del genoma en viriones. Estan presentes dos secuencias de repeticiones terminales largas (RTL) en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Estas contienen secuencias potenciadoras y promotoras fuertes y tambien son necesarias para la integracion en el genoma de la celula huesped (Coffin, 1990).
Para construir un vector retroviral, un acido nucleico que codifica para un gen de interes se inserta en el genoma viral en lugar de determinadas secuencias virales para producir un virus que es de replicacion defectuosa. Para producir viriones, se construye una lfnea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env, pero sin la RTL y los componentes de empaquetamiento (Mann et al., 1983). Cuando un plasmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la RTL retroviral y secuencias de empaquetamiento se introducen en esta lfnea celular (mediante precipitacion con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que el transcrito de ARN del plasmido recombinante se empaquete en partfculas virales, que despues se secretan a los medios de cultivo (Nicolas y Rubinstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). A continuacion, se recoge el medio que contiene los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentran y se usan para transferencia genica. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de celulas. Sin embargo, la integracion y la expresion estable requieren la division de celulas huesped (Paskind et al., 1975).
En la presente invencion pueden emplearse otros vectores virales como constructos de expresion. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como vacinnia virus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), virus adenoasociado (VAA) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984) y virus del herpes. Ofrecen varias caracterfsticas atractivas para diversas celulas de mamfferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Para afectar a la expresion de constructos genicos sentido o antisentido, el constructo de expresion debe suministrarse a una celula. Este suministro puede lograrse in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar lfneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de determinados estados patologicos. Un
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mecanismo para el suministro es por medio de infeccion viral, en donde el constructo de expresion se encapsida en una partfcula viral infecciosa.
La presente invencion tambien contempla varios metodos no virales para la transferencia de constructos de expresion a celulas de mairnferos cultivadas. Estos incluyen precipitacion con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporacion (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyeccion directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979) y complejos de lipofectamina-ADN, sonicacion celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeo de genes usando microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990) y transfeccion mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas tecnicas pueden adaptarse satisfactoriamente para su uso in vivo o ex vivo.
Una vez que el constructo de expresion se ha suministrado a la celula, el acido nucleico que codifica para el gen de interes puede situarse y expresarse en sitios diferentes. En determinadas realizaciones, el acido nucleico que codifica para el gen puede integrarse de manera estable en el genoma de la celula. Esta integracion puede realizarse en la orientacion y ubicacion analogas por medio de recombinacion homologa (reemplazo genico) o puede integrarse en una ubicacion aleatoria, no espedfica (aumento genico). En aun otras realizaciones adicionales, el acido nucleico puede mantenerse de manera estable en la celula como un segmento episomal separado de ADN. Tales segmentos de acido nucleico o “episomas” codifican para secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicacion independientes de o sincronizadas con el ciclo de la celula huesped. Como se suministra el constructo de expresion a una celula y donde permanece en la celula el acido nucleico dependen del tipo de constructo de expresion empleado.
En aun otra realizacion de la invencion, el constructo de expresion puede consistir simplemente en ADN recombinante desnudo o plasmidos. La transferencia del constructo puede realizarse mediante cualquiera de los metodos mencionados anteriormente que permeabilizan ffsica o qmmicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero puede aplicarse tambien al uso in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectaron satisfactoriamente ADN poliomavirus en forma de precipitados de fosfato de calcio en el tugado y el bazo de ratones adultos y recien nacidos, demostrando la replicacion viral activa y la infeccion aguda. Benvenisty y Neshif (1986) tambien demostraron que la inyeccion intraperitoneal directa de plasmidos precipitados con fosfato de calcio da como resultado la expresion de los genes transfectados. Se preve que el ADN que codifica para un gen de interes tambien pueda transferirse de manera similar in vivo y expresar el producto genico.
En todavfa otra realizacion de la invencion, la transferencia de un constructo de expresion de ADN desnudo a celulas puede implicar el bombardeo de partfculas. Este metodo depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos con ADN a una alta velocidad que les permita perforar las membranas celulares e introducirse en celulas sin destruirlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partfculas pequenas. Un dispositivo de este tipo se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente electrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biologicamente inertes, tales como perlas de tungsteno u oro.
Los organos seleccionados, incluyendo el tugado, la piel y el tejido muscular de ratas y ratones, se han bombardeado in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir una exposicion quirurgica del tejido o las celulas, para eliminar cualquier tejido intermedio entre la pistola y el organo diana, es decir, tratamiento ex vivo. De nuevo, el ADN que codifica para un gen particular puede suministrarse por medio de este metodo e incorporarse todavfa en la presente invencion.
En una realizacion adicional de la invencion, el constructo de expresion puede atraparse en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfohpidos y un medio interno acuoso. Los liposomas multilamelares tienen multiples capas de lfpidos separadas por un medio acuoso. Se forman espontaneamente cuando se suspenden fosfohpidos en un exceso de disolucion acuosa. Los componentes lipfdicos sufren autotransposicion antes de la formacion de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipfdicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). Tambien se contemplan complejos de lipofectamina-ADN.
El suministro de acido nucleico mediado por liposomas y la expresion de ADN foraneo in vitro han sido muy satisfactorios. Wong et al., (1980) demostraron la viabilidad del suministro mediado por liposomas y la expresion de ADN foraneo en embriones de pollo, celulas HeLa y celulas de hepatoma cultivados. Nicolau et al., (1987) realizaron de manera satisfactoria la transferencia genica mediada por liposoma en ratas tras inyeccion intravenosa.
En determinadas realizaciones de la invencion, el liposoma puede complejarse con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusion con la membrana celular y promueve la entrada en la celula de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede complejarse o emplearse conjuntamente con protemas cromosomicas no histonicas nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). En aun realizaciones adicionales, el liposoma puede complejarse o emplearse conjuntamente tanto con HVJ como con HMG-1. Tales constructos de expresion se han empleado satisfactoriamente en la transferencia y expresion de acido nucleico in vitro e in vivo, por lo que son aplicables para la presente invencion. Cuando se emplea un promotor
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bacteriano en el constructo de ADN, tambien sera deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.
Otros constructos de expresion que pueden emplearse para suministrar un acido nucleico que codifica para un gen particular a las celulas son los vehfculos de suministro mediado por receptor. Estos se aprovechan de la captacion selectiva de macromoleculas mediante endocitosis mediada por receptor en casi todas las celulas eucariotas. Debido a la distribucion especffica de tipo celular de diversos receptores, el suministro puede ser altamente especffico (Wu y Wu, 1993).
Generalmente, los vehfculos de direccionamiento genico mediado por receptor consisten en dos componentes: un ligando especffico de receptor celular y un agente de union a ADN. Se han usado varios ligandos para la transferencia genica mediada por receptor. Los ligandos mas extensamente caracterizados son asialo-orosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1990). Recientemente, se ha usado una neoglicoprotefna sintetica, que reconoce el mismo receptor que ASOR, como vehfculo de suministro de genes (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y tambien se ha usado el factor de crecimiento epidermico (FCE) para suministrar genes a celulas de carcinoma escamoso (Myers, EPO 0273085).
En otras realizaciones, el vehfculo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. (1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialgangliosido galactosa-terminal, incorporado en liposomas y observaron un aumento en la captacion del gen de la insulina por los hepatocitos. Por tanto, es viable que un acido nucleico que codifica para un gen particular tambien pueda suministrarse especfficamente a un tipo de celula por cualquiera de los numerosos sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo, puede usarse el factor de crecimiento epidermico (FCE) como receptor para el suministro mediado de un acido nucleico a celulas que presentan regulacion por incremento del receptor de FCE. Puede usarse manosa como diana para el receptor de manosa sobre celulas hepaticas. Ademas, pueden usarse de manera similar anticuerpos frente a CD5 (leucemia linfocftica cronica), CD22 (linfoma), CD25 (leucemia de celulas T) y MAA (melanoma) como fracciones de direccionamiento.
En un ejemplo particular, el oligonucleotido puede administrarse en combinacion con un lfpido cationico. Ejemplos de lfpidos cationicos incluyen, pero no se limitan a, lipofectina, DOTMA, DOPE y DOTAP. La publicacion del documento Wo/0071096 describe diferentes formulaciones, tales como una formulacion derivada de DOTAP:colesterol o colesterol que puede usarse eficazmente para terapia genica. Otras divulgaciones tambien analizan diferentes formulaciones lipfdicas o liposomicas, incluyendo nanopartfculas y metodos de administracion; estas incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses con n.° de publicacion 2003/0203865, 20020150626, 20030032615 y 20040048787, que se incorporan especfficamente por referencia al alcance de las formulaciones y otros aspectos relacionados de la administracion y el suministro de acidos nucleicos que divulgan. Tambien se divulgan metodos usados para formar partfculas en las patentes estadounidenses n.° 5.844.107, 5.877.302, 6.008.336, 6.077.835, 5.972.901,6.200.801 y 5.972.900, que se incorporan por referencia a esos aspectos.
En determinadas realizaciones, la transferencia genica puede realizarse mas facilmente en condiciones ex vivo. “Terapia genica ex vivo” se refiere al aislamiento de celulas de un animal, el suministro de un acido nucleico a las celulas in vitro y, a continuacion, al retorno de las celulas modificadas de nuevo al animal. Esto puede implicar la extirpacion quirurgica de tejidos/organos de un animal o el cultivo primario de celulas y tejidos.
En algunas realizaciones de la invencion, es deseable inhibir la expresion o actividad de miR-29a-c para aumentar el deposito de colageno. Por ejemplo, en una realizacion, la invencion proporciona un metodo de induccion del deposito de colageno en un tejido que comprende poner en contacto dicho tejido con un antagonista de miR-29a-c. El antagonista o inhibidor de la funcion de miR-29a-c puede dirigirse a miR-29a, miR-29b y/o a miR-29c.
La funcion de los miARN puede inhibirse mediante la administracion de antagomires. Inicialmente descritos por Krutzfeldt y colaboradores (Krutzfeldt et al., 2005), los “antagomires” son ribonucleotidos monocatenarios, modificados qufmicamente que son al menos parcialmente complementarios a la secuencia de miARN. Los antagomires pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, tales como modificaciones de 2'-O-metil- azucar. En algunas realizaciones, los antagomires comprenden solo nucleotidos modificados. Los antagomires tambien pueden comprender una o mas uniones de fosforotioato que dan como resultado una estructura principal de fosforotioato parcial o completa. Para facilitar el suministro in vivo y la estabilidad, el antagomir puede unirse a un resto de colesterol en su extremo 3'. Los antagomires adecuados para inhibir los miARN pueden ser de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud. “Parcialmente complementario” se refiere a una secuencia que es complementaria en al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de polinucleotido diana. Los antagomires pueden ser complementarios en al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de miARN madura. En algunas realizaciones, el antagomir puede ser sustancialmente complementario a una secuencia de miARN madura, que es complementario en al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia diana de polinucleotido. En otras realizaciones, los antagomires son complementarios al 100% a la
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secuencia de miARN madura.
En una realizacion, el antagonista de miR-29a-c es un antagomir. El antagomir puede comprender una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a la secuencia de miARN madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c. En otra realizacion, el antagomir comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a la secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otra realizacion, el antagomir comprende una secuencia que es complementaria al 100% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
La inhibicion de la funcion de microARN tambien puede conseguirse administrando oligonucleotidos antisentido que tienen como diana las secuencias maduras de miR-29a, miR-29b o miR-29c. Los oligonucleotidos antisentido pueden ser ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos. Preferiblemente, los oligonucleotidos antisentido tienen al menos una modificacion qufmica. Los oligonucleotidos antisentido pueden comprender uno o mas “acidos nucleicos bloqueados”. “Acidos nucleicos bloqueados” (ANB) son ribonucleotidos modificados que contienen un puente extra entre los carbonos 2' y 4' del resto de azucar ribosa que da como resultado una conformacion “bloqueada” que confiere una mayor estabilidad termica a los oligonucleotidos que contienen ANB. Alternativamente, los oligonucleotidos antisentido pueden comprender acidos nucleicos peptfdicos (ANP), que contienen una estructura principal basada en peptido en vez de una estructura principal de azucar-fosfato. Otras modificaciones qufmicas que pueden contener los oligonucleotidos antisentido incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de azucares, tales como 2'-O-alquilo (por ejemplo, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo), modificaciones 2'-fluoro y 4'-tio, y modificaciones de la estructura principal, tales como una o mas uniones fosforotioato, morfolino o fosfonocarboxilato (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 6.693.187 y 7.067.641, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). En algunas realizaciones, oligonucleotidos antisentido adecuados son “gapmeros” de 2' - O-metoxietilo que contienen ribonucleotidos con una modificacion 2'-O-metoxietilo en los extremos 5' y 3' con al menos diez desoxirribonucleotidos en el centro. Estos “gapmeros” son capaces de activar mecanismos de degradacion dependientes de RNasa H de dianas de ARN. Se conocen en la tecnica otras modificaciones de oligonucleotidos antisentido para potenciar la estabilidad y mejorar la eficacia, tales como las descritas en la patente estadounidense n.° 6.838.283 y son adecuadas para su uso en los metodos de la invencion. Los oligonucleotidos antisentido preferibles que son utiles para inhibir la actividad de los microARN tienen de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud. Los oligonucleotidos antisentido pueden comprender una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de miARN madura, por ejemplo, complementaria en al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de miARN madura. En algunas realizaciones, el oligonucleotido antisentido puede ser sustancialmente complementario a una secuencia de miARN madura, que es complementaria en al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de polinucleotido diana. En una realizacion, el oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria al 100% a una secuencia de miARN madura.
En otra realizacion de la invencion, el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido modificado qufmicamente. El oligonucleotido antisentido modificado qufmicamente puede comprender una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a la secuencia de miARN madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c. En aun otra realizacion, el oligonucleotido antisentido qufmicamente modificado comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a la secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otra realizacion, el oligonucleotido antisentido qufmicamente modificado comprende una secuencia que es complementaria al 100% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
Los oligonucleotidos antisentido pueden comprender una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de miARN precursora (pre-miARN) para miR-29a-c. En algunas realizaciones, el oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia localizada fuera de la region en tallo-bucle de la secuencia de pre-miR-29a, pre-miR-29b o pre-miR-29c.
Otra estrategia para inhibir la funcion de miR-29a-c es administrar una molecula de ARN inhibidor que tiene identidad de secuencia al menos parcial con respecto a las secuencias maduras de miR-29a, miR-29b y miR-29c. La molecula de ARN inhibidor puede ser un ARN bicatenario de interferencia pequeno (ARNip) o una molecula de ARN de horquilla corta (ARNhp) que comprende una estructura en tallo-bucle. Las regiones bicatenarias de la molecula de ARN inhibidor pueden comprender una secuencia que es al menos parcialmente identica, por ejemplo, identica en aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%, a la secuencia de miARN madura. En algunas realizaciones, las regiones bicatenarias del ARN inhibidor comprenden una secuencia que es al menos sustancialmente identica a la secuencia de miARN madura. “Sustancialmente identica” se refiere a una secuencia que es identica en aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de polinucleotido diana. En otras realizaciones, las regiones bicatenarias de la molecula de ARN inhibidor pueden ser identicas al 100% a la secuencia de miARN diana.
En una realizacion, un antagonista de miR-29a-c es una molecula de ARN inhibidor que comprende una region bicatenaria, en la que la region bicatenaria comprende una secuencia que tiene una identidad del 100% con la secuencia madura de miR-29a (SEQ ID NO: 18), miR-29b (SEQ ID NO: 19) o miR-29c (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, antagonistas de miR-29a-c son moleculas de ARN inhibidor que comprenden una region bicatenaria, en la que dicha region bicatenaria comprende una secuencia con una identidad de al menos aproximadamente el
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75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia madura de miR-29a, miR- 29b o miR-29c.
En otra realizacion, una molecula de ARN inhibidor puede ser una ribozima. Una ribozima es un ARN catalftico que hidroliza enlaces fosfodiester de moleculas de ARN. La ribozima puede disenarse para que tengan como diana uno o mas de miR-29a, miR-29b y miR-29c, dando como resultado su hidrolisis.
En determinadas realizaciones se emplean vectores de expresion para expresar un antagonista de miR-29a-c (por ejemplo, antagomires, oligonucleotidos antisentido y moleculas de ARN inhibidor). En una realizacion, un vector de expresion para expresar un antagonista de miR-29a-c comprende un promotor unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un oligonucleotido antisentido, en el que la secuencia del oligonucleotido antisentido expresado es al menos parcialmente complementaria a la secuencia madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c. En aun otra realizacion, un vector de expresion para expresar un inhibidor de miR-29a-c comprende uno o mas promotores unidos operativamente a un polinucleotido que codifica para un ARNhp o ARNip, en el que el ARNhp o ARNip expresado comprende una secuencia que es identica, parcialmente identica o sustancialmente identica a la secuencia madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c. “Parcialmente identica” se refiere a una secuencia que es identica en al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de polinucleotido diana. “Sustancialmente identica” se refiere a una secuencia que es identica en al menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de polinucleotido diana.
La gestion medica actual de la hipertrofia cardiaca en el entorno de un trastorno cardiovascular incluye el uso de al menos dos tipos de farmacos: los inhibidores del sistema renina-angiotensina y agentes bloqueantes p-adrenergicos (Bristow, 1999). Los agentes terapeuticos para tratar la hipertrofia patologica en el entorno de la insuficiencia cardiaca incluyen inhibidores de enzima convertidora de angiotensina II (ACE) y agentes bloqueantes de receptores p-adrenergicos (Eichhorn y Bristow, 1996). Otros agentes farmaceuticos que se han divulgado para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca incluyen antagonistas del receptor de angiotensina II (patente estadounidense n.° 5.604.251) y antagonistas de neuropeptido Y (WO 98/33791). A pesar de los compuestos farmaceuticos disponibles actualmente, la prevencion y el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, y posterior insuficiencia cardiaca, siguen siendo un desaffo terapeutico.
El tratamiento no farmacologico se usa principalmente como complemento al tratamiento farmacologico. Un medio de tratamiento no farmacologico implica la reduccion del sodio en la dieta. Ademas, el tratamiento no farmacologico tambien supone la eliminacion de determinados farmacos precipitantes, incluyendo agentes inotropicos negativos (por ejemplo, determinados bloqueantes de los canales de calcio y farmacos antirrftmicos como disopiramida), cardiotoxinas (por ejemplo, anfetaminas) y expansores del volumen plasmatico (por ejemplo, agentes antiinflamatorios no esteroideos y glucocorticoides).
La presente memoria descriptiva proporciona un metodo de tratamiento de la fibrosis cardiaca, la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende identificar un sujeto que tiene fibrosis cardiaca, hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca; y administrar al sujeto un agonista de la funcion o expresion de miR-29. Preferiblemente, la administracion de un agonista de miR-29 da como resultado la mejora de uno o mas sfntomas de fibrosis cardiaca patologica, hipertrofia o insuficiencia cardiaca en el sujeto, o el retraso en la transicion de hipertrofia cardiaca a insuficiencia cardiaca. El uno o mas sfntomas mejorados pueden ser una mayor capacidad de ejercicio, un mayor volumen de eyeccion cardiaca, una menor presion diastolica final del ventrfculo izquierdo, una menor presion de enclavamiento capilar pulmonar, un mayor rendimiento cardiaco, o fndice cardiaco, menores presiones arteriales pulmonares, menores dimensiones sistolicas y diastolicas finales del ventrfculo izquierdo, una menor fibrosis cardiaca, un menor deposito de colageno en el musculo cardiaco, un menor estres de la pared ventricular izquierda y derecha, una menor tension de pared, una mayor calidad de vida y una menor morbilidad o mortalidad relacionada con la enfermedad. Ademas, el uso de agonistas de miR-29a-c puede prevenir la aparicion de hipertrofia cardiaca y sus sfntomas asociados, ya sea directamente o indirectamente.
En otro caso, se proporciona un metodo de prevencion de la hipertrofia patologica o la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende identificar un sujeto en riesgo de desarrollar hipertrofia cardiaca patologica o insuficiencia cardiaca; y promover la expresion o actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto. Las celulas cardiacas incluyen miocitos cardiacos, fibroblastos, celulas de musculo liso, celulas endoteliales y cualquier otro tipo de celula encontrada normalmente en el tejido cardiaco. El agonista de miR-29a-c puede ser un agonista de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c. El sujeto en riesgo puede presentar uno o mas de una lista de factores de riesgo que comprenden fibrosis cardiaca, baja expresion de miR-29, hipertension no controlada prolongada, enfermedad valvular no corregida, angina de pecho cronica, infarto de miocardio reciente, predisposicion congenita a cardiopatfa y/o a hipertrofia patologica, y/o con un diagnostico de predisposicion genetica a hipertrofia cardiaca, y/o que puede tener antecedentes familiares de hipertrofia cardiaca.
En otro caso, se proporciona un metodo de tratamiento del infarto de miocardio en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto. En otro caso, la invencion proporciona un metodo de prevencion de la hipertrofia cardiaca y la cardiomiopatfa dilatada en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del
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sujeto. En otro caso, la invencion proporciona un metodo de inhibicion de la progresion de la hipertrofia cardiaca en un sujeto que lo necesita que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto. Otro aspecto es un metodo de aumento de la tolerancia al ejercicio en un sujeto con insuficiencia cardiaca o hipertrofia cardiaca que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto. Otro aspecto es un metodo de reduccion de la hospitalizacion en un sujeto con insuficiencia cardiaca o hipertrofia cardiaca que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto. En algunos aspectos, la memoria descriptiva proporciona metodos para mejorar la calidad de vida y disminuir la morbilidad o mortalidad en un sujeto con insuficiencia cardiaca o hipertrofia cardiaca que comprende promover la expresion o la actividad de miR-29a-c en las celulas cardiacas del sujeto.
Los regfmenes de tratamiento variarfan dependiendo de la situacion clfnica. Sin embargo, el mantenimiento a largo plazo podrfa parecer apropiado en la mayorfa de las circunstancias. Tambien puede ser deseable tratar la hipertrofia con agonistas de miR-29ac de forma intermitente, tal como en un breve periodo durante la progresion de la enfermedad.
Ademas, la familia miR-29 esta implicada en la regulacion de la fibrosis cardiaca. Puesto que esta familia miR esta enriquecida con fibroblastos en comparacion con miocitos, es probable que los miocitos secreten un factor, posiblemente BNP, que regule por incremento la familia miR-29 en celulas de fibroblastos y, por tanto, proteja frente al desarrollo de la fibrosis cardiaca. Este factor es muy alto en ratones KO para miR-208, lo que se correlaciona con la regulacion por incremento miR-29a-c y la represion de la fibrosis. Los niveles de miR-29a-c son elevados en la cardiopatfa normal, probablemente por un efecto protector que limita el deposito de colageno. Por tanto, se contempla el uso particular de miR-29a-c y agonistas del mismo en la represion de la fibrosis cardiaca y el deposito de colageno en los tejidos cardiacos. Un mecanismo comparable para la activacion de la familia miR-29 puede ser aplicable tambien en la fibrosis muscular esqueletica. El miR-29a-c regula la expresion de varios genes de la matriz extracelular, tales como fibrilina 1 (FBN1), colageno tipo I al (COL1A1), colageno tipo I a2 (COL1A2) y colageno tipo III a1 (COL3A1) (vease el ejemplo 4). Por consiguiente, la presente memoria descriptiva tambien proporciona metodos de regulacion de uno o mas genes de la matriz extracelular en una celula.
En un caso, el metodo comprende poner en contacto la celula con un agonista de miR-29 a-c. En otro caso, el metodo comprende poner en contacto la celula con un antagonista de miR-29a-c. En todavfa otro caso, el uno o mas genes de la matriz extracelular incluyen fibrilina 1 (FBN1), colageno tipo I a1 (COL1A1), colageno tipo I a2 (COL1A2) y colageno tipo III a1 (COL3A1). En algunos casos, el uno o mas genes de la matriz extracelular se regulan por incremento tras el contacto de la celula con un antagonista de miR-29a-c. En otros casos, el uno o mas genes de la matriz extracelular se regulan por disminucion tras el contacto de la celula con un agonista de miR-29a-c.
Los inventores han demostrado que la expresion de miR-29a-c disminuyo en fibroblastos cardiacos expuestos a TGFp, lo que sugiere que la disminucion de miR-29a-c tras el infarto de miocardio podrfa estar regulada por TGFp (ejemplo 5). De manera interesante, se ha demostrado que peptidos natriureticos como el peptido natriuretico de tipo B (BNP) inhiben la expresion genica regulada por TGFp relacionada con la fibrosis y la conversion de miofibroblastos (Kapoun et al., 2004). A este respecto, los inventores informaron previamente que los ratones que carecfan del miARN especffico cardiaco, miR-208, eran resistentes a la fibrosis cardiaca y a la remodelacion y presentaron expresion aumentada de BNP a nivel inicial (van Rooij et al., 2007). Puesto que se sabe que BNP antagoniza los efectos de TGFp, los inventores sugieren que los niveles aumentados de BNP en estos ratones podrfan potenciar la expresion de miR-29a-c. De hecho, se observo un aumento dependiente de la dosis de la expresion de miR-29a-c tras la eliminacion de miR-208, que coincidfa con un aumento del nivel de expresion de BNP (ejemplo 5). Estos datos indican que TGFp induce la expresion de genes relacionados con colageno en fibroblastos al menos parcialmente a traves de la disminucion del nivel de miR-29a-c, que puede inhibirse por BNP secretado por cardiomiocitos. Por tanto, la presente invencion proporciona un metodo de aumento de la expresion y/o la actividad de miR-29ac en un sujeto mediante la administracion de al menos un inhibidor de TGFp. Los inhibidores de TGFp pueden incluir anticuerpos anti-TGFp, moleculas antisentido de TGFp y moleculas pequenas que inhiben la actividad de TGFp tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.509.318, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Los inhibidores de TGFp tambien pueden usarse conjuntamente con agonistas de miR-29a-c como terapia de combinacion para tratar la fibrosis cardiaca, la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca en un sujeto. Los inhibidores de TGFp tambien pueden coadministrarse con agonistas de miR- 29a-c para tratar o prevenir la fibrosis tisular en un sujeto.
Ademas de desempenar un papel importante en el control de la fibrosis en el corazon, la expresion ubicua de la familia miR-29 sugiere que tambien puede desempenar un papel en otras indicaciones fibroticas, tales como las que implican el rinon, el hfgado y los pulmones. Tambien se observa fibrosis secundaria a diabetes. Los pacientes diabeticos de tipo 1 y tipo 2 tienen un mayor riesgo de cardiomiopatfa. La cardiomiopatfa en la diabetes se asociada a un conjunto de caracterfsticas, incluyendo cumplimiento diastolico disminuido, fibrosis intersticial e hipertrofia de miocitos.
La presente memoria descriptiva tambien proporciona un metodo de tratamiento o prevencion de la fibrosis tisular en un sujeto. En un caso, el metodo comprende identificar un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener fibrosis tisular; y
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aumentar la expresion y/o actividad de miR-29a-c en el musculo esqueletico o las celulas de fibroblastos del sujeto. En una realizacion, la fibrosis tisular es fibrosis cardiaca, esclerodermia (localizada o sistemica), fibrosis muscular esqueletica, fibrosis hepatica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar o fibrosis diabetica. En algunas realizaciones, aumentar la expresion y/o actividad de miR-29a-c comprende administrar un agonista de miR-29a-c al sujeto. En otras realizaciones, aumentar la expresion y/o actividad de miR-29a-c comprende administrar al sujeto un vector de expresion que codifica para miR-29a-c. En otra realizacion, el metodo comprende adicionalmente administrar al sujeto una terapia fibrotica distinta de miR-29a-c.
La presente memoria descriptiva abarca metodos de tratamiento de la fibrosis tisular asociada a uno o mas estados o trastornos en un sujeto que lo necesita. En un caso, el metodo comprende administrar al sujeto un agonista de miR-29a-c. En otro caso, el metodo comprende administrar al sujeto un vector de expresion que codifica para miR- 29a-c. El uno o mas estados o trastornos asociados a la fibrosis tisular pueden incluir, pero no se limitan a, fibrosis hepatica congenita (FHC); fibrosis tubulointersticial renal; fibrosis pulmonar asociada a un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus y sarcoidosis); fibrosis intersticial asociada a cardiomiopatfa diabetica; fibrosis muscular esqueletica asociada a distrofias musculares (por ejemplo, distrofia muscular de Becker y distrofia muscular de Duchenne), atrofias de denervacion y enfermedades neuromusculares (por ejemplo, polineuritis aguda, poliomelitis, enfermedad de Werdig/Hoffman, esclerosis lateral amiotrofica y enfermedad de atrofia bulbar progresiva).
La presente memoria descriptiva tambien contempla metodos de tratamiento de patologfas/deficiencias que se caracterizan por la perdida, la carencia o la infraproduccion de colageno. El uso de un antagonista de miR-29a- cpermite aumentar la expresion de colageno para reemplazar el colageno que falta o complementar el colageno existente cuando se necesite. Por tanto, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo de induccion del deposito de colageno en un tejido que comprende poner en contacto dicho tejido con un antagonista de miR-29a-c. El antagonista puede dirigirse a miR-29a, miR-29b y/o a miR-29c. En un caso, el antagonista comprende una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO: 18. En otro caso, el antagonista comprende una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO: 19. En otro caso, el antagonista comprende una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO: 20. El antagonista puede ser un antagomir de miR-29a-c, un oligonucleotido antisentido que tiene como diana un secuencia de miR-29a-c madura, o una molecula de ARN inhibidor, tal como un ARNip o un ARNhp, que comprende una secuencia identica a una secuencia de miR-29a-c madura, una ribozima o cualquier otro acido nucleico inhibidor. El antagonista puede unirse o conjugarse a agentes que facilitan la introduccion del antagonista en celulas o tejidos. Los diversos estados y trastornos en los que serfa beneficioso un aumento en el deposito de colageno y que pueden tratarse administrando un antagonista de miR-29a-c incluyen, pero no se limitan a, sfndrome de Ehlers-Danlos (SED); deficiencia de vitamina C (tambien conocido como escorbuto); envejecimiento de la piel (por ejemplo, envejecimiento natural y fotoenvejecimiento debido a dano solar); y marcas de estiramiento (estrfas).
El sfndrome de Ehlers-Danlos (SED) es un grupo de trastornos geneticos poco comunes que afectan a humanos y animales domesticos provocados por un defecto en la sfntesis de colageno. Dependiendo de la mutacion individual, la gravedad de la enfermedad puede variar desde leve hasta potencialmente mortal. Las mutaciones en los genes ADAMTS2, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1, COL5A2, PLOD1 y TNXB provocan SED. Las mutaciones en estos genes alteran habitualmente la estructura, la produccion o el procesamiento del colageno o de las protefnas que interaccionan con colageno. Un defecto en el colageno puede debilitar el tejido conjuntivo en la piel, los huesos, vasos sangufneos y organos, dando como resultado las caracterfsticas del trastorno. Por tanto, el deposito de colageno inducido por los antagonistas de miR-29a-c de la invencion actuarfa reponiendo el nivel de colageno normal en pacientes con SED y aliviando los sfntomas de la enfermedad. De forma similar, la administracion de un antagonista de miR-29a-c beneficiarfa a los sujetos que padecen deficiencia de vitamina C o escorbuto. La deficiencia de vitamina C es una enfermedad que resulta de la ingesta insuficiente de vitamina C, que es necesaria para la sfntesis normal de colageno en humanos.
El deposito de colageno en los tejidos que resulta de la administracion de un antagonista de miR-29a-c tambien podrfa ser util en diversas aplicaciones cosmeticas. Los efectos del envejecimiento de la piel producidos por los procesos de envejecimiento natural o el fotodano que resulta de la sobreexposicion al sol podrfan reducirse administrando un antagonista de miR-29a-c a un sujeto que lo necesita. La administracion de antagonistas de miR- 29a-c tambien puede facilitar la desaparicion de marcas de estiramiento. Las marcas de estiramiento son una forma de cicatrizacion cutanea que estan provocadas por el desgarro de la dermis. Las marcas de estiramiento son el resultado del estiramiento rapido de la piel asociado a un crecimiento rapido (comun en la pubertad) o a un aumento de peso (por ejemplo, embarazo).
El tejido al que pueden aplicarse los metodos de la invencion incluye tejido facial, tal como tejido de la frente, labio, mejilla, barbilla, ceja, parpado, bajo el ojo o cerca de la boca, tejido de la mano, tejido del cuello, tejido del brazo, tejido de la pierna, tejido de la barriga o tejido del pecho. En algunas realizaciones, el tejido puede comprender una herida, un injerto de piel, tejido cicatricial, arrugas, piel laxa, dano solar, dano qufmico, dano por calor, dano por frfo y/o marcas de estiramiento.
En el aspecto cosmetico de la invencion, la puesta en contacto del tejido con el antagonista de miR-29a-c comprende la inyeccion en dicho tejido, la inyeccion en la vasculatura que alimenta a dicho tejido o la aplicacion
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topica. La aplicacion topica puede ser una pomada, una crema, un gel, un unguento o un balsamo. En otra realizacion de este aspecto, el metodo comprende adicionalmente el uso de un aposito o banda de presion. El antagonista de miR-29a-c puede ponerse en contacto con dicho tejido mas de una vez. En algunas realizaciones, el antagonista se pone en contacto con dicho tejido 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o100 veces. En otras realizaciones, el antagonista se pone en contacto con dicho tejido durante 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, durante 1, 2, 3 o 4 semanas, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 meses o durante 1, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 anos.
En todavfa otra realizacion de este aspecto, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto dicho tejido con un segundo agente. El segundo agente puede incluir, pero no se limita a, vitamina A topica, vitamina C topica o vitamina E. En otra realizacion de este aspecto, el metodo comprende adicionalmente someter dicho tejido a un segundo tratamiento. El segundo tratamiento puede comprender una exfoliacion qufmica, tratamiento con laser, dermoaplanamiento o dermoabrasion. En otra realizacion de este aspecto, el tejido esta en un sujeto que padece sfndrome de Ehler-Danlos o deficiencia de vitamina C.
La presente memoria descriptiva tambien contempla el uso de antagonistas de miR-29a-c como agentes profibroticos para convertir las placas blandas de la vasculatura en tejido fibrotico para prevenir el infarto de miocardio. Las placas blandas son una acumulacion de lfpidos que contienen predominantemente colesterol que se encuentran bajo el revestimiento endotelial de la pared arterial. Recientemente se reconocio que estas placas blandas son propensas a la ruptura dando como resultado la formacion de un coagulo sangufneo, que puede bloquear potencialmente el flujo de sangre a traves de la arteria y provocar un ataque al corazon (es decir, infarto de miocardio). A menudo, estas placas blandas son responsables de provocar que un sujeto sano sin sfntomas padezca un ataque al corazon aparentemente inesperado. Tras la ruptura de una placa blanda, la pared del vaso cicatriza y la placa blanda se convierte en una placa dura, que raras veces provoca problemas adicionales. Por tanto, las estrategias para convertir las placas blandas en tejido fibrotico evitarfan la ruptura de las placas blandas y posiblemente la induccion de un infarto de miocardio.
Tal como se describio en detalle anteriormente, la inhibicion de miR-29a-c conduce a un aumento en el deposito de colageno y la formacion de tejido fibrotico. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo para aumentar la formacion de tejido fibrotico en la pared de un vaso que comprende suministrar un antagonista de miR-29a-c a uno o mas sitios de placas blandas en la pared del vaso, en donde la placa blanda se convierte en tejido fibrotico tras el suministro del antagonista de miR-29a-c. Las placas blandas pueden identificarse por metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, ultrasonidos intravasculares y tomograffa computarizada (Sahara et al. (2004) European Heart Journal, Vol. 25: 2026-2033; Budhoff (2006) J. Am. Coll. Cardiol., vol. 48: 319321; Hausleiter et al. (2006) J. Am. Coll. Cardiol., vol. 48: 312-318). Cualquiera de los antagonistas de miR-29a-c descritos en el presente documento es adecuado para su uso en el metodo.
El antagonista de miR-29a-c puede suministrarse al uno o mas sitios de placas blandas mediante inyeccion directa o usando un cateter o un dispositivo que afsla la circulacion coronaria. En una realizacion, el antagonista de miR-29a-c se suministra al uno o mas sitios de placas blandas mediante un dispositivo medico usado en cirugfa vascular, tal como una endoprotesis o un balon. El antagonista de miR-29 puede recubrirse sobre una endoprotesis de metal para formar una endoprotesis que eluye farmacos. Una endoprotesis que eluye farmacos es un armazon que mantiene abiertas arterias enfermas o estrechadas y libera un compuesto para prevenir la proliferacion y/o la inflamacion celular. Los antagonistas de miR-29ac pueden aplicarse a una endoprotesis de metal incrustada en un polfmero fino para la liberacion del miR-29a-c a lo largo del tiempo. Se conocen en la tecnica metodos de recubrimiento de endoprotesis con compuestos terapeuticos. Veanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.144.422; la patente estadounidense n.° 7.055.237; y el documento WO 2004/004602. En algunas realizaciones, el miR-29a-c puede usarse en combinacion con otros compuestos contra la reestenosis para producir una formulacion para su incorporacion en balones y endoprotesis que eluyen farmacos. Los compuestos adecuados para su uso en combinacion con los antagonistas de miR-29a-c incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, rapamicina (sirolimus), tacrolimus, zotarolimus, everolimus, docetaxel, pimecrolimus y derivados de los mismos.
La presente memoria descriptiva tambien contempla metodos para recuperar o eliminar un agonista de miR-29a-c tras el tratamiento. En una realizacion, el metodo comprende la sobreexpresion de las regiones de sitios de union para miR-29a-c en fibroblastos usando un promotor especffico de fibroblastos. Las regiones de sitios de union contienen preferiblemente una secuencia de la region simiente para miR-29a-c. En algunos casos, el sitio de union puede contener una secuencia de la UTR 3' de una o mas dianas de miR-29ac, tales como COL1A1, COL1A2, COL1A3 y/o FBN1. En otro caso, un antagonista de miR-29a-c puede administrarse tras un agonista de miR-29a-c para atenuar o detener la funcion del microARN. En otro caso, la presente memoria descriptiva proporciona un metodo para recuperar o eliminar los antagonistas de miR-29a-c tras el tratamiento. El metodo puede comprender la sobreexpresion de sitios de union para los antagonistas de miR-29a-c en fibroblastos u otro tejido en el que se administro un antagonista de miR-29a-c.
Terapia combinada
En otro caso, se preve el uso de un agonista de miR-29a-c en combinacion con otras modalidades terapeuticas para
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tratar la hipertrofia cardiaca, la insuficiencia cardiaca y el infarto de miocardio. Por tanto, tambien se proporcionan al sujeto otras terapias cardiacas farmaceuticas “convencionales” en combinacion con el agonista de miR-29a-c. Ejemplos de otras terapias incluyen, sin limitacion, los denominados “betabloqueantes”, antihipertensivos, cardiotonicos, antitromboticos, vasodilatores, antagonistas de hormonas, inotropicos, diureticos, antagonistas de receptores de endotelina, bloqueantes de los canales de calcio, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores de ACE, antagonistas de angiotensina tipo 2 y bloqueantes/inhibidores de citocina e inhibidores de HDAC.
Pueden conseguirse combinaciones poniendo en contacto las celulas cardiacas con una unica composicion o formulacion farmacologica que incluye un agonista de miR-29a-c y un agente farmaceutico convencional, o poniendo en contacto la celula con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en la que una composicion incluye un agonista de miR-29a-c y la otra incluye el agente farmaceutico convencional. Alternativamente, la terapia que usa un agonista de miR-29a-c puede preceder o seguir a la administracion del(de los) otro(s) agente(s) en intervalos que oscilan desde minutos hasta semanas. En los casos en los que el agente farmaceutico convencional y el agonista de miR-29a-c se aplican por separado a la celula, se garantizarfa generalmente que no transcurra un periodo de tiempo significativo entre el momento de suministro de cada uno de ellos, de manera que el agente farmaceutico y el agonista de miR-29a-c puedan seguir ejerciendo un efecto combinado ventajoso sobre la celula. En tales casos, se contempla que la celula se pondrfa normalmente en contacto con ambas modalidades en un plazo de aproximadamente 12-24 horas entre si y, mas preferiblemente, en un plazo de aproximadamente 6-12 horas entre si, siendo lo mas preferido que el tiempo de retraso sea de tan solo aproximadamente 12 horas. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser deseable prolongar significativamente el periodo de tiempo para el tratamiento, con intervalos de varios dfas (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.
Tambien puede concebirse que sean deseables mas de una administracion del agonista de miR-29a-c o del otro agente farmaceutico. A este respecto, pueden emplearse diversas combinaciones. A modo de ilustracion, donde el agonista de miR-29a-c es “A” y el otro agente es “B”, las siguientes permutaciones basadas en 3 y 4 administraciones totales se incluyen a modo de ejemplo:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
Asimismo, se contemplan otras combinaciones.
Los expertos en la tecnica conocen bien los agentes terapeuticos farmacologicos y los metodos de administracion, las dosificaciones, etc. (veanse, por ejemplo, “Physicians Desk Reference”, “The Pharmacological Basis of Therapeutics” de Klaassen, “Remington's Pharmaceutical Sciences” y “The Merck Index, Eleventh Edition”, incorporados en el presente documento por referencia en las partes relevantes), y pueden combinarse con la invencion a la vista de las divulgaciones del presente documento. Puede ser necesaria alguna variacion en la dosificacion dependiendo del estado del sujeto que esta sometiendose a tratamiento. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual, y tales determinaciones individuales estan dentro del conocimiento de los expertos en la tecnica.
Ejemplos no limitativos de un agente terapeutico farmacologico que puede usare en la presente invencion incluyen un agente antihiperlipoproteinemico, un agente antiarteriosclerotico, un agente antitrombotico/fibrinolftico, un coagulante sangufneo, un agente antiarrftmico, un agente antihipertensivo, un vasopresor, un agente de tratamiento para insuficiencia cardiaca congestiva, un agente antianginoso, un agente antibacteriano o una combinacion de los mismos.
Ademas, debe indicarse que cualquiera de los siguientes puede usarse para desarrollar nuevos conjuntos de genes diana de terapia cardiaca de forma similar a como se usan p-bloqueantes en los presentes ejemplos (vease a continuacion). Aunque se espera que muchos de estos genes puedan solaparse, es probable que puedan desarrollarse nuevas dianas genicas.
En determinadas realizaciones, la administracion de un agente que disminuye la concentracion de uno o mas lipoprotefnas y/o lfpidos sangufneos, conocido en el presente documento como “antihiperlipoproteinemico”, puede combinarse con una terapia cardiovascular segun la presente invencion, particularmente en el tratamiento de la aterosclerosis y los engrosamientos o bloqueos de tejidos vasculares. En determinadas realizaciones, un agente antihiperlipoproteinemico puede comprender un derivado de acido ariloxialcanoico/ffbrico, una resina / secuestrante de acidos biliares, un inhibidor de HMG CoA reductasa, un derivado de acido nicotfnico, una hormona tiroidea o analogo de hormona tiroidea, un agente miscelaneo o una combinacion de los mismos.
Ejemplos no limitativos de derivados de acido ariloxialcanoico/ffbrico incluyen beclobrato, enzafibrato, binifibrato, ciprofibrato, clinofibrato, clofibrato (atromida-S), acido cloffbrico, etofibrato, fenofibrato, gemfibrozilo (Lopid),
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nicofibrato, pirifibrato, ronifibrato, simfibrato y teofibrato.
Ejemplos no limitativos de resinas / secuestrantes de acidos biliares incluyen colestiramina (Cholybar, Questran), colestipol (Colestid) y polidexida.
Ejemplos no limitativos de inhibidores de HMG CoA reductasa incluyen lovastatina (Mevacor), pravastatina (Pravochol) o simvastatina (Zocor).
Ejemplos no limitativos de derivados de acido nicotfnico incluyen nicotinato, acepimox, niceritrol, nicoclonato, nicomol y acido oxiniacico.
Ejemplos no limitativos de hormonas tiroideas y analogos de las mismas incluyen etoroxato, acido tiropropico y tiroxina.
Ejemplos no limitativos de antihiperlipoproteinemicos miscelaneos incluyen acifran, azacosterol, benfluorex, p- benzalbutiramida, carnitina, sulfato de condroitina, clomestrona, detaxtran, sulfato de dextrano solido, acido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico, eritadenina, furazabol, meglutol, melinamida, mitatrienodiol, ornitina, y-orizanol, pantetina, tetraacetato de pentaeritritol, a-fenilbutiramida, pirozadil, probucol (Lorelco), p-sitosterol, sal de piperazina de acido sultosflico, tiadenol, triparanol y xenbucina. Ejemplos no limitativos de un antiarteriosclerotico incluyen carbamato de piridinol.
En determinados casos, la administracion de un agente que ayuda en la eliminacion o prevencion de los coagulos sangufneos puede combinarse con la administracion de un modulador, particularmente en el tratamiento de la aterosclerosis y los bloqueos de la vasculatura (por ejemplo, arterial). Ejemplos no limitativos de agentes antitromboticos y/o fibrinolfticos incluyen anticoagulantes, antagonistas de anticoagulantes, agentes antiplaquetarios, agentes trombolfticos, antagonistas de agentes trombolfticos o combinaciones de los mismos.
En determinados casos, son preferibles los agentes antitromboticos que pueden administrarse por via oral, tales como, por ejemplo, aspirina y wafarina (Coumadin).
Ejemplos no limitativos de anticoagulantes incluyen acenocoumarol, ancrod, anisindiona, bromindiona, clorindiona, coumetarol, ciclocumarol, sulfato de dextrano sodico, dicumarol, difenadiona, biscoumacetato de etilo, etilidendicoumarol, fluindiona, heparina, hirudina, liapolato sodico, oxazidiona, polisulfato de pentosano, fenindiona, fenprocoumon, fosvitina, picotamida, tioclomarol y warfarina.
Ejemplos no limitativos de agentes antiplaquetarios incluyen aspirina, un dextrano, dipiridamol (Persantin), heparina, sulfinpiranona (Anturane) y ticlopidina (Ticlid).
Ejemplos no limitativos de agentes trombolfticos incluyen activador de plasminogeno tisular (Activase), plasmina, prourocinasa, urocinasa (Abbokinase), estreptocinasa (Streptase), anistreplasa/APSAC (Eminase).
En determinadas realizaciones en las que un sujeto esta padeciendo hemorragia o un aumento de la probabilidad de padecer hemorragia, puede usarse un agente que puede potenciar la coagulacion sangufnea. Ejemplos no limitativos de agentes que promueven la coagulacion sangufnea incluyen antagonistas de agentes trombolfticos y antagonistas de anticoagulantes.
Ejemplos no limitativos de antagonistas de anticoagulantes incluyen protamina y vitamina K1.
Ejemplos no limitativos de antagonistas de agentes trombolfticos incluyen acido amiocaproico (Amicar) y acido tranexamico (Amstat). Ejemplos no limitativos de antitromboticos incluyen anagrelida, argatroban, cilstazol, daltroban, defibrotida, enoxaparina, fraxiparina, indobufeno, lamoparan, ozagrel, picotamida, plafibrida, tedelparina, ticlopidina y triflusal.
Ejemplos no limitativos de agentes antiarrftmicos incluyen agentes antiarrftmicos de clase I (bloqueantes de los canales de sodio), agentes antiarrftmicos de clase II (bloqueantes beta-adrenergicos), agentes antiarrftmicos de clase III (farmacos que prolongan la repolarizacion), agentes antiarrftmicos de clase IV (bloqueantes de los canales de calcio) y agentes antiarrftmicos miscelaneos.
Ejemplos no limitativos de bloqueantes de los canales de sodio incluyen agentes antiarrftmicos de clase IA, clase IB y clase IC. Ejemplos no limitativos de agentes antiarrftmicos de clase IA incluyen disopiramida (Norpace), procainamida (Pronestyl) y quinidina (Quinidex). Ejemplos no limitativos de agentes antiarrftmicos de clase IB incluyen lidocafna (xilocafna), tocainida (Tonocard) y mexiletina (Mexitil). Ejemplos no limitativos de agentes antiarrftmicos de clase IC incluyen encainida (Enkaid) y flecainida (Tambocor).
Ejemplos no limitativos de un p-bloqueante, tambien conocido como bloqueante p-adrenergico, antagonista p- adrenergico o agente antiarrftmico de clase II, incluyen acebutolol (Sectral), alprenolol, amosulalol, arotinolol,
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atenolol, befunolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bucumolol, bufetolol, bufuralol, bunitrolol, bupranolol, clorhidrato de butidrina, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, cloranolol, dilevalol, epanolol, esmolol (Brevibloc), indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nadoxolol, nifenalol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, practolol, pronetalol, propanolol (Inderal), sotalol (Betapace), sulfinalol, talinolol, tertatolol, timolol, toliprolol y xibinolol. En determinadas realizaciones, el beta- bloqueante comprende un derivado de ariloxipropanolamina. Ejemplos no limitativos de derivados de ariloxipropanolamina incluyen acebutolol, alprenolol, arotinolol, atenolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bunitrolol, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, epanolol, indenolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propanolol, talinolol, tertatolol, timolol y toliprolol.
Ejemplos no limitativos de un agente que prolonga la repolarizacion, tambien conocido como agente antiarrftmico de clase III, incluyen amiodarona (Cordarone) y sotalol (Betapace).
Ejemplos no limitativos de un bloqueante de los canales de calcio, tambien conocido como agente antiarrftmico de clase IV, incluyen una arilalquilamina (por ejemplo, bepridilo, diltiazem, fendilina, galopamilo, prenilamina, terodilina, verapamilo), un derivado de dihidropiridina (felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, nisoldipina, nitrendipina), un derivado de piperazina (por ejemplo, cinnarizina, flunarizina, lidoflazina) o un bloqueante de canales de calcio miscelaneo tal como benciclano, etafenona, magnesio, mibefradil o perhexilina. En determinadas realizaciones, un bloqueante de los canales de calcio comprende un antagonista de calcio de dihidropiridina de accion prolongada (de tipo nifedipina).
Ejemplos no limitativos de agentes antiarrftmicos miscelaneos incluyen adenosina (Adenocard), digoxina (Lanoxin), acecainida, ajmalina, amoproxano, aprindina, tosilato de bretilio, bunaftina, butobendina, acido capobenico, cifenlina, disopiranida, hidroquinidina, indecainida, bromuro de ipatropio, lidocafna, lorajmina, lorcainida, meobentina, moricizina, pirmenol, prajmalina, propafenona, pirinolina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina y viquidil.
Ejemplos no limitativos de agentes antihipertensivos incluyen agentes simpatolfticos, alfa/beta-bloqueantes, alfa- bloqueantes, agentes anti-angiotensina II, beta-bloqueantes, bloqueantes de los canales de calcio, vasodilatadores y antihipertensivos miscelaneos.
Ejemplos no limitativos de un a-bloqueante, tambien conocido como bloqueante a-adrenergico o antagonista a- adrenergico, incluyen amosulalol, arotinolol, dapiprazol, doxazosin, mesilatos de ergoloide, fenspirida, indoramina, labetalol, nicergolina, prazosina, terazosina, tolazolina, trimazosina y yohimbina. En determinadas realizaciones, un alfa-bloqueante puede comprender un derivado de quinazolina. Ejemplos no limitativos de derivados de quinazolina incluyen alfuzosina, bunazosina, doxazosina, prazosina, terazosina y trimazosina.
En determinadas realizaciones, un agente antihipertensivo es un antagonista tanto a- como p-adrenergico. Ejemplos no limitativos de un alfa/beta-bloqueante comprenden labetalol (Normodyne, Trandate).
Ejemplos no limitativos de agentes anti-angiotensina II incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y antagonistas de receptores de angiotensina II. Ejemplos no limitativos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE) incluyen alacepril, enalapril (Vasotec), captopril, cilazapril, delapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltopril, perindopril, quinapril y ramipril. Ejemplos no limitativos de un bloqueante de receptores de angiotensina II, tambien conocido como antagonista de receptores de angiotensina II, bloqueante de receptor de ANG o bloqueante de receptor de ANG-II de tipo 1 (ARBS), incluyen angiocandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan y valsartan.
Ejemplos no limitativos de un simpatolftico incluyen un simpatolftico que actua centralmente o un simpatolftico que actua perifericamente. Ejemplos no limitativos de un simpatolftico que actua centralmente, tambien conocido como simpatolftico del sistema nervioso central (SNC), incluyen clonidina (Catapres), guanabenz (Wytensin), guanfacina (Tenex) y metildopa (Aldomet). Ejemplos no limitativos de un simpatolftico que actua perifericamente incluyen un agente bloqueante de ganglios, un agente bloqueante de neuronas adrenergicas, un agente bloqueante p- adrenergico o un agente bloqueante alfal-adrenergico. Ejemplos no limitativos de un agente bloqueante de ganglios incluyen mecamilamina (Inversine) y trimetafan (Arfonad). Ejemplos no limitativos de un agente bloqueante de neuronas adrenergicas incluyen guanetidina (Ismelin) y reserpina (Serpasil). Ejemplos no limitativos de un bloqueante p-adrenergico incluyen acenitolol (Sectral), atenolol (Tenormin), betaxolol (Kerlone), carteolol (Cartrol), labetalol (Normodyne, Trandate), metoprolol (Lopressor), nadanol (Corgard), penbutolol (Levatol), pindolol (Visken), propranolol (Inderal) y timolol (Blocadren). Ejemplos no limitativos de un bloqueante alfal-adrenergico incluyen prazosina (Minipress), doxazocina (Cardura) y terazosina (Hytrin).
En determinadas realizaciones, un agente terapeutico cardiovascular puede comprender un vasodilatador (por ejemplo, un vasodilatador cerebral, un vasodilatador coronario o un vasodilatador periferico). En determinadas realizaciones preferidas, un vasodilatador comprende un vasodilatador coronario. Ejemplos no limitativos de un vasodilatador coronario incluyen amotrifeno, bendazol, hemisuccinato de benfurodilo, benciodarona, cloracizina,
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cromonar, clobenfurol, clonitrato, dilazep, dipiridamol, droprenilamina, efloxato, tetranitrano de ertritilo, etafenona, fendilino, floredil, ganglefeno, herestrol bis(P-dietilaminoetil eter), hexobendina, tosilato de itramina, kelina, lidoflanina, hexanitrano de manitol, medibazina, nicorglicerina, tetranitrato de pentaeritritol, pentrinitrol, perhexilina, pimefilina, trapidil, tricromilo, trimetazidina, fosfato de trolnitrato y visnadina.
En determinadas realizaciones, un vasodilatador puede comprender un vasodilatador para terapia cronica o un vasodilatador de emergencia hipertensiva. Ejemplos no limitativos de un vasodilatador para terapia cronica incluyen hidralazina (Apresoline) y minoxidil (Loniten). Ejemplos no limitativos de un vasodilatador de emergencia hipertensiva incluyen nitroprusiato (Nipride), diazoxido (Hiperstat IV), hidralazina (Apresoline), minoxidil (Loniten) y verapamilo.
Ejemplos no limitativos de antihipertensivos miscelaneos incluyen ajmalina, acido y-aminobutfrico, bufeniodo, cicletainina, ciclosidomina, un tannato de criptenamina, fenoldopam, flosequinan, ketanserina, mebutamato, mecamilamina, metildopa, tiosemicarbazona de metil-4-piridilcetona, muzolimina, pargilina, pempidina, pinacidil, piperoxan, primaperona, una protoveratrina, raubasina, rescimetol, rilmenideno, saralasina, nitroprusiato de sodio, ticrinafeno, camsilato de trimetafan, tirosinasa y urapidilo.
En determinadas realizaciones, un antihipertensivo puede comprender un derivado de ariletanolamina, un derivado de benzotiadiazina, un derivado de W-carboxialquil(peptido/lactama), un derivado de dihidropiridina, un derivado de guanidina, una hidrazina/ftalazina, un derivado de imidazol, un compuesto de amonio cuaternario, un derivado de reserpina o un derivado de sulfonamida.
Ejemplos no limitativos de derivados de ariletanolamina incluyen amosulalol, bufuralol, dilevalol, labetalol, pronetalol, sotalol y sulfinalol.
Ejemplos no limitativos de derivados de benzotiadiazina incluyen altizida, bendroflumetiazida, benztiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, ciclotiazida, diazoxido, epitiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotizida, hidroflumetizida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclormetiazida y triclormetiazida.
Ejemplos no limitativos de derivados de W-carboxialquil(peptido/lactama) incluyen alacepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltipril, perindopril, quinapril y ramipril.
Ejemplos no limitativos de derivados de dihidropiridina incluyen amlodipino, felodipino, isradipino, nicardipino, nifedipino, nilvadipino, nisoldipino y nitrendipino.
Ejemplos no limitativos de derivados de guanidina incluyen betanidina, debrisoquina, guanabenz, guanaclina, guanadrel, guanazodina, guanetidina, guanfacina, guanoclor, guanoxabenz y guanoxano.
Ejemplos no limitativos de hidrazinas/ftalazinas incluyen budralazina, cadralazina, dihidralazina, endralazina, hidracarbazina, hidralazina, feniprazina, pildralazina y todralazina.
Ejemplos no limitativos de derivados de imidazol incluyen clonidina, lofexidina, fentolamina, tiamenidina y tolonidina.
Ejemplos no limitativos de compuestos de amonio cuaternario incluyen bromuro de azametonio, cloruro de clorisondamina, hexametonio, bis(metilsulfato) de pentacinio, bromuro de pentametonio, tartrato de pentolinio, cloruro de fenactropinio y metosulfato de trimetidinio.
Ejemplos no limitativos de derivados de reserpina incluyen bietaserpina, deserpidina, rescinnamina, reserpina y sirosingopina.
Ejemplos no limitativos de derivados de sulfonamida incluyen ambusida, clopamida, furosemida, indapamida, quinetazona, tripamida y xipamida.
Los vasopresores se usan generalmente para aumentar la tension arterial durante el choque, que puede producirse durante un procedimiento quirurgico. Ejemplos no limitativos de un vasopresor, tambien conocido como antihipotensivo, incluyen metilsulfato de amezinio, amida de angiotensina, dimetofrina, dopamina, etifelmina, etilefrina, gepefrina, metaraminol, midodrina, norepinefrina, foledrina y sinefrina.
Ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva incluyen agentes anti- angiotensina II, tratamiento de reduccion de poscarga-precarga, diureticos y agentes inotropicos.
En determinadas realizaciones, un sujeto animal que no puede tolerar un antagonista de angiotensina puede tratarse con una terapia de combinacion. Dicha terapia puede combinar la administracion de hidralazina (Apresoline) y dinitrato de isosorbida (Isordil, Sorbitrate).
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Ejemplos no limitativos de un diuretico incluyen una tiazida o derivado de benzotiadiazina (por ejemplo, altiazida, bendroflumetazida, benztiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, epitiazida, etiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclorometiazida, triclormetiazida), un organomercurial (por ejemplo, clormerodrina, meralurida, mercamfamida, mercaptomerina sodica, acido mercumalflico, mercumatilina sodica, cloruro mercuroso, mersalil), una pteridina (por ejemplo, furtereno, triamtereno), purinas (por ejemplo, acefilina, 7-morfolinometilteofilina, pamobrom, proteobromina, teobromina), esteroides incluyendo antagonistas de aldosterona (por ejemplo, canrenona, oleandrina, espironolactona), un derivado de sulfonamida (por ejemplo, acetazolamida, ambusida, azosemida, bumetanida, butazolamida, cloraminofenamida, clofenamida, clopamida, clorexolona, difenilmetano-4,4'-disulfonamida, disulfamida, etoxzolamida, furosemida, indapamida, mefrusida, metazolamida, piretanida, quinetazona, torasemida, tripamida, xipamida), un uracilo (por ejemplo, aminometradina, amisometradina), un antagonista moderado de potasio (por ejemplo, amilorida, triamtereno) o un diuretico miscelaneo tal como aminozina, arbutina, clorazanilo, acido etacrfnico, etozolina, hidracarbazina, isosorbida, manitol, metochalcona, muzolimina, perhexilina, ticrnafeno y urea.
Ejemplos no limitativos de un agente inotropico positivo, tambien conocido como cardiotonico, incluyen acefilina, una acetildigitoxina, 2-amino-4-picolina, amrinona, hemisuccinato de benfurodilo, bucladesina, cerberosina, camfotamida, convalatoxina, cimarina, denopamina, deslanosido, digitalina, digitalis, digitoxina, digoxina, dobutamina, dopamina, dopexamina, enoximona, eritroflefna, fenalcomina, gitalina, gitoxina, glicociamina, heptaminol, hidrastinina, ibopamina, un lanatosido, metamivam, milrinona, nerifolina, oleandrina, ouabaina, oxifedrina, prenalterol, proscilaridina, resibufogenina, escilareno, escilarenina, estrofantina, sulmazol, teobromina y xamoterol.
En realizaciones particulares, un agente inotropico es un glicosido cardiaco, un agonista beta-adrenergico o un inhibidor de fosfodiesterasa. Ejemplos no limitativos de un glicosido cardiaco incluyen digoxina (Lanoxin) y digitoxina (Crystodigin). Ejemplos no limitativos de un agonista p-adrenergico incluyen albuterol, bambuterol, bitolterol, carbuterol, clembuterol, clorprenalina, denopamina, dioxetedrina, dobutamina (Dobutrex), dopamina (Intropin), dopexamina, efedrina, etafedrina, etilnorepinefrina, fenoterol, formoterol, hexoprenalina, ibopamina, isoetarina, isoproterenol, mabuterol, metaproterenol, metoxifenamina, oxifedrina, pirbuterol, procaterol, protokilol, reproterol, rimiterol, ritodrina, soterenol, terbutalina, tretoquinol, tulobuterol y xamoterol. Ejemplos no limitativos de un inhibidor de fosfodiesterasa incluyen amrinona (Inocor).
Los agentes antianginosos pueden comprender organonitratos, bloqueantes de canales de calcio, beta-bloqueantes y combinaciones de los mismos.
Ejemplos no limitativos de organonitratos, tambien conocidos como nitrovasodilatadores, incluyen nitroglicerina (Nitro-bid, Nitrostat), dinitrato de isosorbida (Isordil, Sorbitrate) y nitrato de amilo (Aspirol, Vaporole).
La endotelina (ET) es un peptido de 21 aminoacidos que tiene efectos fisiologicos y fisiopatologicos potentes que parecen estar implicados en el desarrollo de insuficiencia cardiaca. Los efectos de la ET estan mediados por la interaccion con dos clases de receptores de superficie celular. El receptor de tipo A (ET-A) esta asociado a vasoconstriccion y crecimiento celular, mientras que el receptor de tipo B (ET-B) esta asociado a vasodilatacion mediada por celulas endoteliales y a la liberacion de otras neurohormonas, tales como aldosterona. Se conocen en la tecnica agentes farmacologicos que pueden inhibir la produccion de ET su capacidad para estimular celulas relevantes. La inhibicion de la produccion de ET implica el uso de agentes que bloquean una enzima denominada enzima convertidora de endotelina que esta implicada en el procesamiento del peptido activo a partir de su precursor. La inhibicion de la capacidad de la ET para estimular celulas implica el uso de agentes que bloquean la interaccion de ET con sus receptores. Ejemplos no limitativos de antagonistas de receptores de endotelina (ARE) incluyen bosentano, enrasentano, ambrisentano, darusentano, tezosentano, atrasentano, avosentano, clazosentano, edonentano, sitaxsentano, TBC 3711, BQ 123 y BQ 788.
En determinadas realizaciones, el agente terapeutico secundario puede comprender una cirugfa de algun tipo, que incluye, por ejemplo, cirugfa preventiva, de diagnostico o estadificacion, curativa y paliativa. La cirugfa, y en particular una cirugfa curativa, puede usarse conjuntamente con otras terapias, tales como la presente invencion y uno o mas de otros agentes.
Tales agentes terapeuticos quirurgicos para enfermedades y trastornos vasculares y cardiovasculares son conocidos por los expertos en la tecnica, y pueden comprender, pero no se limitan a, realizar cirugfa en un organismo, proporcionar una protesis mecanica cardiovascular, angioplastia, reperfusion de arterias coronarias, ablacion de cateter, proporcionar un desfibrilador cardioversor implantable al sujeto, soporte circulatorio mecanico o una combinacion de los mismos. Ejemplos no limitativos de un soporte circulatorio mecanico que puede usarse en la presente invencion comprenden una contrapulsacion con balon intraaortico, un dispositivo de asistencia ventricular izquierda o una combinacion de los mismos.
Formulaciones farmaceuticas y vfas para la administracion a sujetos
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende un agonista o antagonista
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de miR-29a-c. El agonista puede ser un vector de expresion que comprende un segmento de acido nucleico que codifica para miR-29a-c, o un polinucleotido que comprende una secuencia de miR-29a-c madura o una porcion eficaz de la misma. El agonista puede estar comprendido en un vehfculo de suministro lipfdico. El antagonista puede ser un polinucleotido que se hibrida a miR-29a-c o una diana del mismo.
Cuando se contemplan aplicaciones clfnicas, se prepararan composiciones farmaceuticas de una forma apropiada para la aplicacion prevista. Generalmente, esto supondra preparar composiciones que estan esencialmente libres de pirogenos, asf como de otras impurezas que podrfan ser nocivas para humanos o animales.
Pueden usarse sistemas de dispersion coloidal, tales como complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lfpidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas, como vehfculos de suministro para los inhibidores de oligonucleotido (por ejemplo, antagonistas) de la funcion de microARN o constructos que expresan microARN particulares. Las emulsiones de grasas disponibles comercialmente que son adecuadas para suministrar los acidos nucleicos de la invencion a tejidos de musculo esqueletico y cardiaco incluyen Intralipid®, Liposyn®, Liposyn® II, Liposyn® III, Nutrilipid, y otras emulsiones de lfpidos similares. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehfculo de suministro in vivo es un liposoma (es decir, una vesfcula de membrana artificial). La preparacion y el uso de tales sistemas se conocen bien en la tecnica. Tambien se divulgan formulaciones a modo de ejemplo en los documentos US 5.981.505, US 6.217.900, US 6.383.512, US 5.783.565, US 7.202.227, US 6.379.965, US 6.127.170, US 5.837.533, US 6.747.014 y WO03/093449.
Generalmente, se deseara emplear sales y tampones apropiados para hacer que los vehfculos de suministro sean estables y permitan su captacion por las celulas diana. Tambien se emplearan tampones para introducir celulas recombinantes en un sujeto. Las composiciones acuosas de la presente invencion comprenden una cantidad eficaz del vehfculo de suministro que comprende los polinucleotidos inhibidores o secuencias de polinucleotido de miARN (por ejemplo, liposomas u otros complejos o vectores de expresion) o celulas, disueltos o dispersados en un medio acuoso o portador farmaceuticamente aceptable. Las frases “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alergicas u otras no deseadas cuando se administran a un animal o un humano. Tal como se usa en el presente documento, “portador farmaceuticamente aceptable” incluye disolventes, tampones, disoluciones, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion y similares aceptables para su uso en la formulacion de productos farmaceuticos, tales como productos farmaceuticos adecuados para su administracion a humanos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los principios activos de la presente invencion, se contempla su uso en composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones, siempre que no inactiven los vectores o las celulas de las composiciones.
Las composiciones activas de la presente invencion pueden incluir preparaciones farmaceuticas clasicas. La administracion de estas composiciones segun la presente invencion puede realizarse por medio de cualquier via comun siempre que el tejido diana este disponible por medio de esa via. Esto incluye oral, nasal o bucal. Alternativamente, la administracion puede realizarse mediante inyeccion intradermica, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, o mediante inyeccion directa en el tejido cardiaco. Tambien pueden administrarse composiciones farmaceuticas que comprenden antagonistas de miARN o constructos de expresion que comprenden secuencias de miARN mediante sistemas de cateter o sistemas que afslan la circulacion coronaria para la administracion de agentes terapeuticos al corazon. Se conocen en la tecnica diversos sistemas de cateter para administrar agentes terapeuticos al corazon y a la vasculatura coronaria. Algunos ejemplos no limitativos de metodos de administracion basados en cateter o metodos de aislamiento coronario adecuados para su uso en la presente invencion se divulgan en la patente estadounidense n.° 6.416.510, la patente estadounidense n.° 6.716.196, la patente estadounidense n.° 6.953.466, el documento WO 2005/082440, el documento WO 2006/089340, la patente estadounidense con n.° de publicacion 2007/0203445, la patente estadounidense con n.° de publicacion 2006/0148742 y la patente estadounidense con n.° de publicacion 2007/0060907. Tales composiciones se administrarfan normalmente como composiciones farmaceuticamente aceptables, tal como se describio anteriormente.
Los compuestos activos tambien pueden administrarse por via parenteral o por via intraperitoneal. A modo de ilustracion, pueden prepararse disoluciones de los compuestos activos como base libre o como sales farmacologicamente aceptables en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen generalmente un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable o administracion por cateter incluyen, por ejemplo, dispersiones o disoluciones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de dispersiones o disoluciones inyectables. Generalmente, estas preparaciones son esteriles y fluidas hasta el grado de que exista una facil inyectabilidad. Las preparaciones deben ser estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y
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deben conservarse frente a la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Los medios de dispersion o disolventes apropiados pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede fomentarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede fomentarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden preparase disoluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en una cantidad apropiada en un disolvente, junto con cualquier otro ingrediente (por ejemplo, tal como se enumero anteriormente) segun se desee, seguido por esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados a un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes deseados, por ejemplo, tal como se enumero anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos incluyen tecnicas de secado a vacfo y secado por congelacion que producen un polvo del(de los) principio(s) activo(s) mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolucion previamente esterilizada por filtracion de los mismos.
Las composiciones de la presente invencion pueden formularse generalmente en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protefna) derivadas de acidos inorganicos (por ejemplo, acidos clorhfdrico o fosforico) o de acidos organicos (por ejemplo, acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares). Las sales formadas con los grupos carboxilo libres de la protefna tambien pueden derivarse de bases inorganicas (por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico) o de bases organicas (por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procafna y similares).
Tras la formulacion, las disoluciones se administran preferiblemente de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones pueden administrarse facilmente en una variedad de formas de dosificacion tales como disoluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmacos y similares. Para la administracion parenteral en una disolucion acuosa, por ejemplo, la disolucion generalmente se tampona adecuadamente y el diluyente lfquido se vuelve en primer lugar isotonico, por ejemplo, con suficiente solucion salina o glucosa. Tales disoluciones acuosas pueden usarse, por ejemplo, para
administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. Preferiblemente, se emplean medios acuosos esteriles tal como conocen los expertos en la tecnica, particularmente en vista de la presente divulgacion. A modo de ilustracion, una dosis unica puede disolverse en 1 ml de disolucion isotonica de NaCl y o bien anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o bien inyectarse en el sitio de infusion propuesto (vease por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15a edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producira necesariamente una cierta variacion en la dosificacion dependiendo del estado del sujeto que esta recibiendo el tratamiento. La persona responsable de la administracion, en cualquier caso, determinara la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para administracion a humanos, las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza segun requiera la Oficina de Normas Biologicas de la FDA.
Las formulaciones cosmeticas para aumentar el deposito de colageno en tejidos pueden comprender al menos un antagonista de miR-29a-c. El antagonista puede ser un antagonista de miR-29a, miR-29b, miR-29c, o
combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el antagonista de miR-29a-c es un antagomir. El
antagonista puede estar unido o conjugado a agentes que facilitan la entrada del antagonista en la celula o tejidos.
Tales agentes pueden incluir transportadores de internalizacion celular, tales como antennapedia, TAT, Buforin II, Transportan, peptido anfipatico modelo, K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, SynB1, SynB3, SynB5, Pep-7, HN-1, bis- guanidinio-espermidina-colesterol, bis-guanidinio-tren-colesterol y poliarginina. El agente puede unirse al antagonista de miR-29a-c en su extremo amino o carboxilo terminal. En una realizacion, el agente se une al antagonista mediante una secuencia que se escinde tras la entrada en la celula. Tales secuencias comprenden normalmente secuencias consenso para proteasas, tal como se conocen en la tecnica.
Las composiciones cosmeticas pueden formularse en todos los tipos de vehfculos. Ejemplos no limitativos de vehfculos adecuados incluyen emulsiones (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite, agua en aceite en agua, aceite en agua, aceite en agua en aceite, aceite en agua en silicona), cremas, lociones, disoluciones (tanto acuosas como hidroalcoholicas), bases anhidras (tales como barras de labios y polvos), geles y pomadas o mediante otro metodo o cualquier combinacion de los anteriores tal como conocena un experto habitual en la tecnica (Remington's, 1990). Las variaciones y otros vehfculos apropiados resultaran evidentes para el experto en la tecnica y son apropiados para su uso en la presente invencion. En determinadas realizaciones, las concentraciones y combinaciones de los ingredientes se seleccionan de un modo tal que las combinaciones sean qufmicamente compatibles y no formen complejos que precipiten en el producto terminado.
Se contempla tambien que principios activos cutaneos aromaticos e ingredientes adicionales identificados a lo largo
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de toda esta memoria descriptiva puedan encapsularse para su administracion a una zona diana tal como la piel. Ejemplos no limitativos de tecnicas de encapsulacion incluyen el uso de liposomas, vesfculas y/o nanopartfculas (por ejemplo, partfculas coloidales biodegradables y no biodegradables que comprenden materiales polimericos en los que el ingrediente esta atrapado, encapsulado y/o absorbido, los ejemplos incluyen nanoesferas y nanocapsulas) que pueden usarse para como vehfculos de suministro para suministrar tales ingredientes a la piel (veanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.387.398, la patente estadounidense n.° 6.203.802, la patente estadounidense n.° 5.411.744 y Kreuter 1998).
Tambien se contemplan composiciones farmaceuticamente aceptables o farmacologicamente aceptables. La frase “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” incluye composiciones que no producen una reaccion alergica o reaccion adversa similar cuando se administra a un humano. Normalmente, tales composiciones se preparan como composiciones topicas, disoluciones o suspensiones liquidas, aunque tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para su disolucion en, o suspension en, lfquido antes de su uso. Las vfas de administracion pueden variar con la ubicacion y naturaleza del estado que va a tratarse, e incluyen, por ejemplo, formulacion y administracion topica, por inhalacion, intradermica, transdermica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutanea, percutanea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, por perfusion, lavado, inyeccion directa y oral.
Las composiciones de la presente invencion pueden incorporarse en productos. Ejemplos no limitativos de productos incluyen productos cosmeticos, productos alimenticios, productos farmaceuticos, etc. Unicamente a modo de ejemplo, productos cosmeticos no limitativos incluyen productos solares, productos de bronceado sin sol, productos capilares, productos para las unas, cremas hidratantes, cremas y lociones de tratamiento de la piel, suavizantes, lociones de dfa, geles, pomadas, bases de maquillaje, cremas de noche, barras de labios, mascaras, sombras de ojos, delineadores, coloretes, limpiadores, tonicos, mascarillas u otros productos o aplicaciones cosmeticos conocidos. Adicionalmente, los productos cosmeticos pueden formularse como productos con aclarado o sin aclarado.
Las composiciones de la presente invencion pueden incluir ingredientes adicionales. Ejemplos no limitativos de ingredientes adicionales incluyen ingredientes cosmeticos (tanto activos como no activos) e ingredientes farmaceuticos (tanto activos como no activos). El CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (2004) describe una amplia variedad de ingredientes cosmeticos no limitativos que pueden usarse en el contexto de la presente invencion. Ejemplos de estas clases de ingredientes incluyen: fragancias (artificiales y naturales), tintes e ingredientes de color (por ejemplo, azul 1, azul 1 lago, rojo 40, dioxido de titanio, D&C azul n.° 4, D&C verde n.° 5, D&C naranja n.° 4, D&C rojo n.° 17, D&C rojo n.° 33, D&C violeta n.° 2, D&C amarillo n.° 10 y D&C amarillo n.° 11), adsorbentes, emulsionantes, estabilizadores, lubricantes, disolventes, hidratantes (incluyendo, por ejemplo, emolientes, humectantes, formadores de pelfcula, agentes oclusivos y agentes que afectan a los mecanismos de hidratacion natural de la piel), repelentes del agua, absorbentes de UV (absorbentes ffsicos y qufmicos tales como acido paraaminobenzoico (“PABA”) y derivados de PABA correspondientes, dioxido de titanio, oxido de zinc, etc.), aceites esenciales, vitaminas (por ejemplo, A, B, C, D, E y K), metales traza (por ejemplo, zinc, calcio y selenio), anti- irritantes (por ejemplo, antiinflamatorios esteroides y no esteroideos), extractos botanicos (por ejemplo, aloe vera, camomila, extracto de pepino, ginkgo biloba, ginseng y romero), agentes antimicrobianos, antioxidantes (por ejemplo, BHT y tocoferol), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA de disodio y EDTA de tetrasodio), conservantes (por ejemplo, metilparabeno y propilparabeno), agentes de ajuste del pH (por ejemplo, hidroxido de sodio y acido cftrico), absorbentes (por ejemplo, octenilsuccinato de aluminio y almidon, caolfn, almidon de mafz, almidon de avena, ciclodextrina, talco y zeolita), agentes de aclaramiento y blanqueamiento de la piel (por ejemplo, hidroquinona y lactato de niacinamida), humectantes (por ejemplo, glicerina, propilenglicol, butilenglicol, pentilenglicol, sorbitol, urea y manitol), exfoliantes (por ejemplo, alfa-hidroxiacidos y beta-hidroxiacidos tales como acido lactico, acido glicolico y acido salicflico; y sales de los mismos), agentes impermeabilizantes (por ejemplo, estearato de magnesio/hidroxido de aluminio), agentes de acondicionamiento de la piel (por ejemplo, extractos de aloe, alantofna, bisabolol, ceramidas, dimeticona, acido hialuronico y glicirrizato de dipotasio), agentes espesantes (por ejemplo, sustancias que pueden aumentar la viscosidad de una composicion tales como polfmeros de acido carboxflico, polfmeros de poliacrilato reticulados, polfmeros de poliacrilamida, polisacaridos y gomas), y compuestos de recubrimiento de silicona (por ejemplo, aceites de silicona y poliorganosiloxanos).
Tambien se contemplan ingredientes farmaceuticos como utiles en las composiciones en emulsion de la presente invencion. Ejemplos no limitativos de ingredientes farmaceuticos incluyen agentes anti-acne, agentes usados para tratar la rosacea, analgesicos, anestesicos, anorrectales, antihistamfnicos, agentes antiinflamatorios incluyendo farmacos antiinflamatorios no esteroideos, antibioticos, antifungicos, antivirales, antimicrobianos, compuestos activos anticancerfgenos, escabicidas, pediculicidas, antineoplasicos, antitranspirantes, antiprurfticos, agentes antipsoriasicos, agentes antiseborreicos, protefnas y peptidos biologicamente activos, agentes de tratamiento de quemaduras, agentes cauterizantes, agentes de despigmentacion, depilatorios, agentes de tratamiento del sarpullido del panal, enzimas, estimulantes del crecimiento del cabello, retardantes del crecimiento del cabello incluyendo DFMO y sus sales y analogos, hemostasicos, queratolfticos, agentes de tratamiento de aftas, agentes de tratamiento de ulceras bucales, agentes de tratamiento dental y periodontal, agentes activos fotosensibilizadores, agentes de barrera/protectores de la piel, esteroides incluyendo hormonas y corticosteroides, agentes de tratamiento de quemaduras solares, protectores solares, agentes activos transdermicos, agentes activos nasales, agentes activos
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vaginales, agentes de tratamiento de verrugas, agentes de tratamiento de heridas, agentes de cicatrizacion, etc.
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitativo, se incluye un miARN individual en un kit. El kit puede incluir ademas agua y tampon de hibridacion para facilitar la hibridacion de las dos hebras de los miARN. En algunas realizaciones, el kit puede incluir uno o mas oligonucleotidos para inhibir la funcion de un miARN diana. El kit puede incluir tambien uno o mas reactivos de transfeccion para facilitar el suministro del miARN o antagonistas de miARN a celulas.
Los componentes de los kits pueden envasarse o bien en medios acuosos o bien en forma liofilizada. Los medios contenedores de los kits incluiran generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el que puede colocarse un componente, y preferiblemente, alicuotarse adecuadamente. Cuando hay mas de un componente en el kit (el reactivo de etiquetado y la etiqueta pueden envasarse juntos), el kit tambien contendra generalmente un segundo, tercero u otro contenedor adicional en el que los componentes adicionales pueden colocarse por separado. Sin embargo, en un vial pueden estar comprendidas diversas combinaciones de componentes. Los kits de la presente invencion tambien incluiran normalmente un medio para contener los acidos nucleicos, y cualquier otro contenedor de reactivos confinados en un espacio reducido para su venta comercial. Tales recipientes pueden incluir contenedores de plastico moldeados por inyeccion o por soplado en los que se retienen los viales deseados.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en una y/o mas disoluciones lfquidas, la disolucion lfquida es una disolucion acuosa, siendo particularmente preferida una disolucion acuosa esteril.
Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adicion de un disolvente adecuado. Se preve que el disolvente pueda proporcionarse tambien en otro medio contenedor.
El medio contenedor incluira generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa y/u otro medio contenedor, en el que se colocan las formulaciones de acidos nucleicos, preferiblemente, ubicadas adecuadamente. Los kits tambien pueden comprender un segundo medio contenedor para contener un tampon esteril, farmaceuticamente aceptable y/u otro diluyente.
Los kits de la presente memoria descriptiva tambien incluiran normalmente un medio para contener los viales en confinados en un espacio reducido para su venta comercial, tal como, por ejemplo, contenedores de plastico moldeados por inyeccion y/o por soplado en los que se retienen los viales deseados.
Tales kits pueden incluir tambien componentes que conservan o mantienen el miARN u oligonucleotidos inhibidores de miARN o que los protegen frente a su degradacion. Tales componentes pueden estar libres de ARNasa o protegerse frente a ARNasas. Tales kits comprenderan generalmente, en medios adecuados, distintos contenedores para cada reactivo o disolucion individual.
Un kit incluira tambien instrucciones sobre el uso de los componentes del kit, asf como sobre el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden implementarse. Un kit tambien puede incluir utensilios o dispositivos para administrar el agonista o antagonista de miARN mediante diversas vfas de administracion, tales como administracion parenteral o por cateter.
Se contempla que tales reactivos puedan formar parte de los kits de la memoria descriptiva. Sin embargo, tales kits no se limitan a los artfculos particulares identificados anteriormente y pueden incluir cualquier reactivo usado para la manipulacion o caracterizacion de miARN.
Metodos para identificar moduladores
La presente memoria descriptiva comprende ademas metodos para identificar agonistas de miR-29a-c que son utiles en la prevencion o el tratamiento o la reversion de la fibrosis cardiaca, la hipertrofia cardiaca o la insuficiencia cardiaca. Estos ensayos pueden comprender el cribado al azar de grandes bibliotecas de compuestos candidatos; alternativamente, los ensayos pueden usarse para centrarse en clases particulares de compuestos seleccionados con miras a atributos estructurales que se cree que aumentan la probabilidad de que promuevan la expresion y/o funcion de miR-29a-c.
Para identificar un modulador de miR-29a-c, se determinara generalmente la funcion de un miR-29a-c en presencia y ausencia del compuesto candidato. Por ejemplo, un metodo comprende generalmente:
(a) proporcionar un compuesto candidato;
(b) mezclar el compuesto candidato con un miR-29;
(c) medir la actividad de miR-29a-c; y
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(d) comparar la actividad en la etapa (c) con la actividad de miR-29a-c en ausencia del compuesto candidato,
en el que una diferencia entre las actividades medidas de miR-29a-c indica que el compuesto candidato es, de hecho, un modulador de miR-29a-c.
Tambien pueden realizarse ensayos en celulas aisladas, organos o en organismos vivos.
Por supuesto, se entendera que todos los metodos de cribado de la presente memoria descriptiva son utiles por si mismos a pesar del hecho de que puedan no encontrarse candidatos eficaces. La memoria descriptiva proporciona metodos para el cribado de tales candidatos, no solamente metodos para encontrarlos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “compuesto candidato” se refiere a cualquier molecula que pueda modular potencialmente aspectos que regulan la fibrosis o el colageno de miR-29a-c. Se adquiriran normalmente, de diversas fuentes comerciales, bibliotecas moleculares que se cree que cumplen los criterios basicos para farmacos utiles en un esfuerzo por “usar la fuerza bruta” en la identificacion de compuestos utiles. El cribado de tales bibliotecas, incluyendo bibliotecas generadas de manera combinatoria (por ejemplo, bibliotecas de antagomires), es un modo rapido y eficaz de cribar un gran numero de compuestos relacionados (y no relacionados) para determinar su actividad. Los enfoques combinatorios se prestan por si mismos a una rapida evolucion de posibles farmacos mediante la creacion de compuestos de segunda, tercera y cuarta generacion modelizados a partir de compuestos activos, pero por lo demas no deseados.
Un ensayo rapido, barato y facil de ejecutar es un ensayo in vitro. Tales ensayos usan generalmente moleculas aisladas, pueden ejecutarse rapidamente y en grandes cantidades, aumentando de ese modo la cantidad de informacion que puede obtenerse en un corto periodo de tiempo. Puede usarse una variedad de recipientes para ejecutar los ensayos, incluyendo tubos de ensayo, placas, platos y otras superficies tales como varillas o perlas.
En el documento WO 84/03564 se describe una tecnica para el cribado de alto rendimiento de compuestos. Puede sintetizarse una gran cantidad de compuestos de antagomires pequenos sobre un sustrato solido, tal como clavijas de plastico o alguna otra superficie. Tales moleculas pueden cribarse rapidamente para determinar su capacidad para inhibir miR-29a-c.
La presente memoria descriptiva tambien contempla el cribado de compuestos para determinar su capacidad para modular la actividad de miR-29ac y expresion en celulas. Para tales ensayos de cribado pueden utilizarse diversas lfneas celulares, incluyendo las derivadas de celulas de musculo esqueletico, incluyendo celulas modificadas por ingenierfa genetica especfficamente para este fin. Tambien pueden usarse celulas cardiacas primarias, como la lfnea celular H9C2.
Los ensayos in vivo implican el uso de diversos modelos animales de cardiopatfa, enfermedad de musculo esqueletico, fibrosis o perdida de colageno incluyendo animales transgenicos, que se han modificado por ingenierfa genetica para tener defectos especfficos, o para portar marcadores que pueden usarse para medir la capacidad de una sustancia candidata para alcanzar y afectar a diferentes celulas dentro del organismo. Debido a su tamano, facilitad de manipulacion e informacion sobre su fisiologfa y constitucion genetica, los ratones son una realizacion preferida, especialmente para experimentos transgenicos. No obstante, otros animales son tambien adecuados, incluyendo ratas, conejos, hamsteres, cobayas, jerbos, marmotas, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos y monos (incluyendo chimpances, gibones y babuinos). Pueden realizarse ensayos para detectar inhibidores usando un modelo animal derivado de cualquiera de estas especies.
El tratamiento de animales con compuestos de prueba implicara la administracion del compuesto, en una forma apropiada, al animal. La administracion se realizara mediante cualquier via que pueda utilizarse para fines clfnicos. La determinacion de la eficacia de un compuesto in vivo puede implicar una variedad de diferentes criterios, incluyendo pero sin limitarse a la alteracion de las rutas de senalizacion hipertroficas y de sfntomas ffsicos de hipertrofia. Ademas, la medicion de la toxicidad y de las respuestas a la dosis puede realizarse en animales de un modo mas significativo que en ensayos in vitro o in cyto.
Animales transgenicos
Un caso particular de la presente memoria descriptiva proporciona animales transgenicos que carecen de uno o ambos alelos funcionales de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c. Ademas, animales transgenicos que expresan miR- 29a-c bajo el control de un promotor inducible, constitutivo o selectivo de tejido, lfneas celulares recombinantes derivadas de tales animales y embriones transgenicos pueden ser utiles en la determinacion del papel exacto que desempena miR-29a-c en el control de la fibrosis y en el desarrollo de hipertrofia cardiaca patologica e insuficiencia cardiaca. Ademas, estos animales transgenicos pueden proporcionar conocimientos sobre el desarrollo del corazon. El uso de un miR-29a-c inducible o reprimible que codifica para acido nucleico proporciona un modelo para la expresion no regulada o regulada en exceso. Ademas, se contemplan animales transgenicos “desactivados” para miR-29a-c, en uno o ambos alelos. Ademas, se contemplan animales transgenicos “desactivados” para miR-29a-c, en uno o ambos alelos para uno o ambos clusters.
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En un caso general, un animal transgenico se produce mediante la integracion de un transgen dado en el genoma de una manera que permite la expresion del transgen. Metodos para producir animales transgenicos se describen generalmente por Wagner y Hoppe (patente estadounidense n.° 4.873.191), y Brinster et al. (1985).
Normalmente, un gen flanqueado por secuencias genomicas se transfiere mediante microinyeccion en un ovocito fertilizado. Los ovocitos microinyectados se implantan en un huesped hembra, y se examina la progenie para detectar la expresion del transgen. Pueden producirse animales transgenicos a partir de los ovocitos fertilizados de varios animales incluyendo, pero sin limitarse a, reptiles, anfibios, aves, mamfferos y peces.
Pueden prepararse clones de ADN para microinyeccion mediante cualquier medio conocido en la tecnica. Por ejemplo, clones de ADN para microinyeccion pueden escindirse con enzimas apropiadas para eliminar las secuencias de plasmido bacteriano, y los fragmentos de ADN pueden someterse a electroforesis en geles de agarosa al 1 % en tampon TBE, usando tecnicas convencionales. Las bandas de ADN se visualizan mediante tincion con bromuro de etidio, y la banda que contiene las secuencias de expresion se escinde. La banda escindida se coloca entonces en bolsas de dialisis que contienen acetato de sodio 0,3 M a pH 7,0. El ADN se somete a electroelucion dentro de las bolsas de dialisis, se extrae con una disolucion fenol:cloroformo 1:1 y se precipita mediante dos volumenes de etanol. El ADN vuelve a disolverse en 1 ml de tampon de baja concentracion de sal (NaCl 0,2 M, Tris 20 mM, pH 7,4 y EDTA 1 mM) y se purifica en una columna Elutip-D™. La columna se ceba en primer lugar con 3 ml de tampon de alta concentracion de sal (NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 7,4 y EDTA 1 mM) seguido por lavado con 5 ml de tampon de baja concentracion de sal. Se hacen pasar las disoluciones de ADN a traves de la columna tres veces para unir el ADN a la matriz de la columna. Tras un lavado con 3 ml de tampon de baja concentracion de sal, el ADN se eluye con 0,4 ml de tampon de alta concentracion de sal y se precipita mediante dos volumenes de etanol. Las concentraciones de ADN se miden mediante absorcion a 260 nm en un espectrofotometro UV. Para la microinyeccion, las concentraciones de ADN se ajustan a 3 pg/ml en Tris 5 mM, pH 7,4 y EDTA 0,1 mM. Otros metodos para la purificacion de ADN para microinyeccion se describen en Palmiter et al. (1982); y en Sambrook et al. (2001).
En un procedimiento de microinyeccion a modo de ejemplo, se inducen ratones hembra de seis semanas de edad a que superovulen con una inyeccion de 5 UI (0,1 cc, por via i.p.) de gonadotropina serica de yegua prenada (PMSG; Sigma), seguido 48 horas despues de una inyeccion de 5 UI (0,1 cc, por via i.p.) de gonadotropina corionica humana (hCG; Sigma). Las hembras se colocan con los machos inmediatamente despues de la inyeccion de hCG. Veintiuna horas despues de la inyeccion de hCG, las hembras apareadas se sacrifican mediante asfixia con CO2 o dislocacion cervical y los embriones se recuperan de los oviductos extirpados y se colocan en solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco con albumina serica bovina al 0,5% (BSA; Sigma). Se eliminan las celulas del cumulo circundantes con hialuronidasa (1 mg/ml). A continuacion, los embriones pronucleares se lavan y se colocan en disolucion salina equilibrada de Earle que contiene BSA al 0,5% (EBSS) en una incubadora a 37,5 °C con una atmosfera humidificada al 5 % de CO2 y 95 % de aire hasta el momento de la inyeccion. Los embriones pueden implantarse en la fase de dos celulas.
Los ratones hembra adultos se aparean en ciclos al azar con machos sometidos a vasectomfa. Pueden usarse para este fin ratones C57BL/6 o Swiss u otras cepas comparables. Las hembras receptoras se aparean al mismo tiempo que las hembras donantes. En el momento de la transferencia de embriones, las hembras receptoras se anestesian con una inyeccion intraperitoneal de 0,015 ml de avertina al 2,5% por gramo de peso corporal. Se exponen los oviductos mediante una unica incision dorsal en la lfnea media. Entonces, se hace una incision a traves de la pared corporal directamente sobre el oviducto. A continuacion, se rasga la bolsa ovarica con pinzas de relojero. Los embriones que van a transferirse se colocan en DPBS (solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco) y en la punta de una pipeta de transferencia (aproximadamente de 10 a 12 embriones). Se inserta la punta de la pipeta en el infundfbulo y se transfieren los embriones. Tras la transferencia, se cierra la incision mediante dos suturas.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el termino “insuficiencia cardiaca” se usa ampliamente para referirse a cualquier estado que reduzca la capacidad del corazon para bombear sangre. Como resultado, se desarrollan congestion y edema en los tejidos. Lo mas frecuentemente, la insuficiencia cardiaca es provocada por una reducida contractilidad del miocardio, que resulta de un flujo de sangre coronario reducido; sin embargo, muchos otros factores pueden dar como resultado una insuficiencia cardiaca, incluyendo dano en las valvulas del corazon, deficiencia de vitaminas y enfermedad primaria del musculo cardiaco. Aunque los mecanismos fisiologicos precisos de la insuficiencia cardiaca no se comprenden totalmente, se cree generalmente que la insuficiencia cardiaca implica trastornos en varias propiedades autonomas cardiacas, incluyendo respuestas simpatica, parasimpatica y barorreceptora. La frase “manifestaciones de insuficiencia cardiaca” se usa ampliamente para abarcar todas las secuelas asociadas a la insuficiencia cardiaca, tales como dificultad para respirar, edema con fovea, un hfgado sensible y agrandado, venas del cuello ingurgitadas, estertores pulmonares y similares, incluyendo hallazgos de laboratorio asociados a insuficiencia cardiaca.
El termino “tratamiento” o equivalentes gramaticales abarca la mejora y/o reversion de los sfntomas de insuficiencia
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cardiaca (es decir, la capacidad del corazon para bombear sangre). La “mejora en la funcion fisiologica” del corazon puede evaluarse usando cualquiera de las mediciones descritas en el presente documento (por ejemplo, medicion de la fraccion de eyeccion, acortamiento fraccional, dimension interna del ventnculo izquierdo, frecuencia cardiaca, etc.), asf como cualquier efecto sobre la supervivencia del animal. En el uso de modelos animales, se compara la respuesta de animales transgenicos tratados y animales transgenicos no tratados usando cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento (ademas, pueden incluirse animales no transgenicos tratados y no tratados como controles). Un compuesto que provoca una mejora en cualquier parametro asociado a insuficiencia cardiaca usado en los metodos de cribado de la presente invencion puede identificarse de ese modo como un compuesto terapeutico.
El termino “cardiomiopatia dilatada” se refiere a un tipo de insuficiencia cardiaca caracterizada por la presencia de ventnculo izquierdo dilatado simetricamente con mala funcion contractil sistolica y, ademas, implica frecuentemente al ventnculo derecho.
El termino “compuesto” se refiere a cualquier entidad qmmica, producto farmaceutico, farmaco, y similares que puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad, afeccion, dolencia o trastorno de la funcion corporal. Los compuestos comprenden compuestos terapeuticos tanto conocidos como potenciales. Puede determinarse que un compuesto es terapeutico mediante cribado usando los metodos de cribado de la presente invencion. Un “compuesto terapeutico conocido” se refiere a un compuesto terapeutico que ha demostrado (por ejemplo, a traves de ensayos en animales o experiencia previa con administracion a humanos) que es eficaz en tal tratamiento. En otras palabras, un compuesto terapeutico conocido no se limita a un compuesto eficaz en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “hipertrofia cardiaca” se refiere al proceso en el que los miocitos cardiacos adultos responden al estres a traves de un crecimiento hipertrofico. Tal crecimiento se caracteriza por aumentos del tamano celular sin division celular, ensamblaje de sarcomeros adicionales dentro de la celula para maximizar la generacion de fuerza, y una activacion de un programa genico cardiaco fetal. La hipertrofia cardiaca se asocia a menudo a un aumento del riesgo de morbilidad y mortalidad y, por tanto, estudios dirigidos a comprender los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca podnan tener un impacto significativo sobre la salud humana.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “modular” se refiere a un cambio o una alteracion en una actividad biologica. La modulacion puede ser un aumento o una disminucion en la actividad de protemas, un cambio en una actividad cinasa, un cambio en las caractensticas de union o cualquier otro cambio en las propiedades biologicas, funcionales o inmunologicas asociadas a la actividad de una protema u otra estructura de interes. El termino “modulador” se refiere a cualquier molecula o compuesto que es capaz de cambiar o alterar la actividad biologica tal como se describio anteriormente.
El termino “antagonista de receptores p-adrenergicos” se refiere a un compuesto qrnmico o entidad que es capaz de bloquear, parcialmente o completamente, el tipo beta (p) de receptores adrenergicos (es decir, receptores del sistema adrenergico que responden a catecolaminas, especialmente norepinefrina). Algunos antagonistas de receptores p-adrenergicos presentan un grado de especificidad para un subtipo de receptor (generalmente Pi); tales antagonistas se denominan “antagonistas de receptores adrenergicos espedficos de Pi” y “antagonistas de receptores adrenergicos espedficos de P2”. El termino “antagonista de receptores p-adrenergicos” se refiere a compuestos qrnmicos que son antagonistas selectivos y no selectivos. Ejemplos de antagonistas de receptores p- adrenergicos incluyen, pero no se limitan a, acebutolol, atenolol, butoxamina, carteolol, esmolol, labetolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, propanolol y timolol. El uso de derivados de antagonistas de receptores p- adrenergicos conocidos esta comprendido en los metodos de la presente invencion. De hecho, cualquier compuesto que se comporte funcionalmente como un antagonista de receptores p-adrenergicos esta comprendido en los metodos de la presente invencion.
Los terminos “inhibidor de enzima convertidora de angiotensina” o “inhibidor de ACE” se refieren a un compuesto qrnmico o entidad que es capaz de inhibir, parcialmente o completamente, la enzima implicada en la conversion de la angiotensina I relativamente inactiva en la angiotensina II activa en el sistema de renina-angiotensina. Ademas, los inhibidores de ACE inhiben simultaneamente la degradacion de bradicinina, que probablemente potencia significativamente el efecto antihipertensivo de los inhibidores de ACE. Ejemplos de inhibidores de ACE incluyen, pero no se limitan a, benazepril, captopril, enalopril, fosinopril, lisinopril, quiapril y ramipril. El uso de derivados de inhibidores de ACE conocidos esta comprendido en los metodos de la presente invencion. De hecho cualquier compuesto que se comporte funcionalmente como un inhibidor de ACE esta comprendido en los metodos de la presente invencion.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “genotipos” se refiere a la conformacion genetica real de un organismo, mientras que “fenotipo” se refiere a los rasgos ffsicos que presenta un individuo. Ademas, el “fenotipo” es el resultado de la expresion selectiva del genoma (es decir, es una expresion de la historia celular y de su respuesta al entorno extracelular). De hecho, se estima que el genoma humano contiene 30.000-35.000 genes. En cada tipo celular, solo se expresa una pequena fraccion (es decir, el 10-15 %) de estos genes.
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El uso de la palabra “uno” o “una” cuando se usa conjuntamente con el termino “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero tambien es consecuente con el significado de “uno o mas”, “al menos uno” y “uno o mas de uno”.
Se contempla que cualquier realizacion analizada en el presente documento pueda implementarse con respecto a cualquier metodo o composicion de la invencion, y viceversa. Ademas, las composiciones y kits de la invencion pueden usarse para lograr los metodos de la invencion.
A lo largo de toda esta solicitud, el termino “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviacion estandar de error para el dispositivo o metodo que esta empleandose para determinar el valor.
El uso del termino “o” en las reivindicaciones se usa para expresar “y/o” a menos que se indique explfcitamente que se refiere a las alternativas unicas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgacion apoya una definicion que se refiere a alternativas unicas e “y/o.”
Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicacion(es), las palabras “que comprende” (y cualquier forma de “que comprende”, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de “que tiene”, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de “que incluye”, tal como “incluye” e “incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de” que contiene”, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen elementos o etapas de metodos adicionales no mencionados.
Aunque se han insertado encabezamientos de seccion en esta solicitud para facilitar la revision, tales encabezamientos no deben interpretarse como una division de las realizaciones.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar adicionalmente diversos aspectos de la invencion. Los expertos en la tecnica deben apreciar que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas y/o composiciones descubiertas por el inventor que funcionan bien en la practica de la invencion y que, por tanto, pueden considerarse modos preferidos para su puesta en practica.
Ejemplos
Codificado dentro de un intron del gen de a-MHC se encuentra miR-208 (figura 1A). Al igual que a-MHC, miR-208 se expresa especfficamente en el corazon con expresion residual en el pulmon (figura 1B). miR-208 se procesa fuera del pre-ARNm de a-MHC en vez de transcribirse como transcrito separado. Sin embargo, sorprendentemente, miR- 208 presenta una semivida notablemente larga de al menos 14 dfas, y de ese modo puede ejercer funciones aun cuando la expresion de ARNm de a-MHC se haya regulado por disminucion. Aunque la delecion genetica de miR- 208 en ratones no pudo inducir un fenotipo manifiesto, el analisis de microarrays en corazones de animales de tipo natural y miR-208'/' a los 2 meses de edad revelo que la eliminacion de miR-208 da como resultado una expresion pronunciada de numerosos genes de protefnas contractiles de musculo esqueletico rapido, que normalmente no se expresan en el corazon. Por tanto, estos resultados sugieren que, en condiciones normales, miR-208 se coexpresa con el unico gen de MHC especffico cardiaco para mantener la identidad de cardiomiocitos reprimiendo la expresion de genes de musculo esqueletico en el corazon.
La funcion mas notable de miR-208 se revelo por la respuesta aberrante de ratones nulos para miR-208 al estres cardiaco (van Rooij et al., 2007). En respuesta a la sobrecarga de presion por constriccion aortica toracica o senalizacion mediante calcineurina, una fosfatasa dependiente de calcio/calmodulina que dirige la remodelacion patologica del corazon, los ratones nulos para miR-208 practicamente no mostraron hipertrofia de cardiomiocitos o fibrosis y no podfan regular por incremento la expresion de p-MHC (figuras 6-8). En cambio, otros genes sensibles al estres, tales como los que codifican para ANF y BNP, se indujeron fuertemente en animales mutantes para miR-208, demostrando que miR-208 esta dedicado especfficamente al control de la expresion de p-MHC, que puede desacoplarse de otras facetas de la respuesta a estres cardiaco.
La expresion de p-MHC se reprime mediante senalizacion por hormona tiroidea y esta regulada por incremento en el estado hipertiroideo (Leung et al., 2006). Los animales miR-208'/' eran tambien resistentes a la regulacion por incremento de la expresion de p-MHC tras el tratamiento con el inhibidor de T3 propiltiouracilo (PTU), que induce hipotiroidismo. Sin embargo, sorprendentemente, la expresion de p-MHC antes del nacimiento era normal en ratones mutantes para miR-208, indicando que miR-208 esta dedicada especfficamente a la regulacion posnatal de la expresion de p-MHC, lo que coincide con la adquisicion de sensibilidad a la hormona tiroidea del gen de p-MHC (figura 5).
Una clave del mecanismo de accion de miR-208 procede de la semejanza de los corazones miR-208'/' con corazones hipertiroideos, ambos de los cuales presentan un bloqueo a la expresion de p-MHC, regulacion por incremento de genes de respuesta al estres y proteccion contra hipertrofia patologica y fibrosis (figuras 6-10). La regulacion por incremento de genes de musculo esqueletico rapido en corazones miR-208'/' tambien imita la
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induccion de fibras de musculo esqueletico rapido en el estado hipertiroideo (Wei et al., 2005).
Estos hallazgos sugieren que miR-208 actua, al menos en parte, reprimiendo la expresion de un componente comun de las rutas de senalizacion de respuesta al estres y de la hormona tiroidea en el corazon. Entre las dianas predichas mas fuertes de miR-208 esta el corregulador del receptor de hormona tiroidea (RT) THRAP1, que puede ejercer efectos positivos y negativos sobre la transcripcion (Pantos et al., 2006; Yao y Eghbali, 1992; figura 12). El RT actua a traves de un elemento de respuesta a hormona tiroidea negativo (ERT) para reprimir la expresion de p- MHC en el corazon adulto (Zhao et al., 2005). Por tanto, cabrfa predecir que el aumento en la expresion de THRAP1 en ausencia de miR-208 potenciara la actividad represiva del RT hacia la expresion de p-MHC, consecuente con el bloqueo de la expresion de p-MHC en corazones miR-208"/". Sin embargo, aunque THRAP1 parece ser una diana fiable para miR-208, estos datos no excluyen la potencial implicacion de dianas adicionales en la regulacion de la expresion de p-MHC.
Puesto que, incluso un sutil cambio hacia p-MHC reduce el rendimiento mecanico y la eficacia del corazon adulto, serfa de valor terapeutico aprovechar la regulacion de miR-208 para prevenir un aumento en la expresion de p-MHC durante la cardiopatfa. La especificidad y dedicacion cardiacas de miR-208 a la respuesta al estres cardiaco, pero no al desarrollo cardiaco normal, hacen que miR-208 (y sus efectores posteriores) sea una diana terapeutica atractiva para manipular los niveles de p-MHC (figura 13).
Materiales y metodos
Analisis de transferencia de tipo Northern. Se obtuvieron muestras de tejido cardiaco de ventrfculos izquierdos de humanos anonimos a los que se les diagnostico que tenfan corazones defectuosos o no defectuosos de Gilead Colorado (Westminster, CO). Se obtuvieron muestras de tejido cardiaco de regiones de zona limftrofe de humanos anonimos a los que se les diagnostico que habfan padecido un infarto de miocardio. Se aislo el ARN total de las celulas, muestras de tejido cardiaco de raton, rata y humano o miocitos aislados usando el reactivo Trizol (Gibco/BRL). Se confirmo una igual carga tinendo los geles de Northern con bromuro de etidio. Se realizaron transferencias de tipo Northern para detectar microARN tal como se describio previamente (van Rooij et al., 2006). Una sonda U6 sirvio como control de carga. Para detectar la expresion de a-MHC, se utilizo con sonda una transferencia de tipo Northern que contenfa 10 pg de ARN de tejido cardiaco de animales adultos tanto de tipo natural como mutantes para miR-208 con un fragmento de ADNc de a-MHC que cubre una parte de la region UTR 5' y el primer exon.
Tratamiento con PTU. Se indujo deficiencia en la hormona tiroidea alimentando a los animales durante las duraciones indicadas con pienso libre de yodo complementado con PTU al 0,15% adquirido de Harlan Teklad Co. (TD 97061) (Madison, WI).
Analisis de microarrays y PCR en tiempo real. Se aislo ARN total de tejido cardiaco usando Trizol (Invitrogen). Se realizo el analisis de microarrays usando el array Mouse Genome 430 2.0 (Affymetrix). Para detectar el nivel de miARN, se realizo RT-PCR usando el kit de transcriptasa inversa de MicroARN Taqman (Applied Biosystems, ABI) segun las recomendaciones del fabricante. Se usaron 5 ng de ARN para generar ADNc con un cebador especffico para miARN, tras lo cual se utilizo una sonda Taqman especffica para miARN para detectar el nivel de expresion del miARN de interes. Tras la RT-PCR con cebadores de hexameros al azar (Invitrogen) sobre muestras de ARN, se analizo la expresion de un subconjunto de genes mediante PCR o mediante PCR en tiempo real cuantitativa usando sondas Taqman adquiridas de ABI.
Generacion de ratones mutantes para miR-208. Para generar el vector de direccionamiento de miR-208, se digirio un fragmento de 0,4 kb (brazo 5') que se extiende en sentido 5' de la region que codifica para miR-208 con SacII y NotI y se ligo en el plasmido de direccionamiento pGKneoF2L2dta en sentido 5' de los sitios loxP y el casete de neomicina flanqueado por Frt. Se digirio un fragmento de 3,3 kb (brazo 3') con Sail y HindIII y se ligo en el vector entre los casetes de resistencia a neomicina y de seleccion negativa de Dta. Las celulas ES como dianas que portan el alelo alterado se identificaron mediante analisis de transferencia de tipo Southern con sondas en 5' y 3'. Se identificaron tres clones de ES dirigidos a miR-208 y se usaron para la inyeccion en blastocistos. Los ratones quimericos resultantes se cruzaron con C57BL/6 para obtener transmision a la lfnea germinal del alelo mutante.
Generacion de ratones transgenicos. Se subclono un fragmento genomico de raton que flanquea al miARN de interes en un plasmido de expresion especffico de tejido cardiaco que contenfa la senal de poli(A)+ de GH humana y a-MHC (Kiriazis y Kranias, 2000). Se aislo el ADN genomico de biopsias de cola de raton y se analizo mediante PCR usando cebadores especfficos para la senal de poli(A)+ de GH humana.
Inmunotransferencia de tipo Western. Se extrajo miosina de tejido cardiaco tal como se describio (Morkin, 2000). Se separaron las isoformas de MHC mediante SDS PAGE y se realizo inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo monoclonal de raton frente a a-MHC (BA-G5) (ATCC, Rockville, MD) y anticuerpo monoclonal de raton antimiosina (M8421 esqueletico, lento) (Sigma, MO), que es altamente especffico para p-MHC. Para detectar toda la miosina estriada, se uso un anticuerpo panespecffico (3-48 monoclonal de raton; Accurate Chemical & Scientific
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Corporation, NY). Se detecto THRAP1 mediante inmunoprecipitacion a partir de 400 pg de lisado de protefna cardiaca. Tras el aclaramiento previo de las muestras durante 1 hora a 4 °C, el sobrenadante se incubo durante la noche a 4 °C con 1 pl de anticuerpo policlonal de conejo anti-THRAP1 (un regalo de R. Roeder, Rockefeller University) y 15 pl de perlas de protefna A. Las perlas se lavaron tres veces con tampon de lisis y se sometieron a ebullicion en tampon de muestra de SDS. La protefna THRAP1 inmunoprecipitada se resolvio mediante SDS-PAGE y se analizo usando anticuerpo policlonal de conejo anti-THRAP1 a una dilucion 1:3000 y anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa del rabano a una dilucion 1:5000 con deteccion mediante reactivo Luminol (Santa Cruz).
Analisis histologico e hibridacion in situ de ARN. Los tejidos usados para la histologfa se incubaron en disolucion de Krebs-Henselheit, se fijaron en paraformaldehfdo al 4 %, se cortaron en secciones y se procesaron para la tincion con hematoxilina y eosina (H&E) y tricromica de Masson o hibridacion in situ mediante tecnicas convencionales (Krenz y Robbins, 2004). Se generaron sondas de ARN marcado con 35S usando el kit Maxiscript (Amersham). Se pseudocolorearon las senales en rojo usando Adobe Photoshop.
Ecocardiograffa transtoracica. La funcion cardiaca y las dimensiones del corazon se evaluaron mediante ecocardiograffa bidimensional en ratones conscientes usando un sistema de Vingmed (GE Vingmed Ultrasound, Horten, Noruega) y un transductor de matriz lineal de 11,5 MHz. Se usaron registros graficos en modo M para medir los grosores de pared anterior y posterior en la diastole final y en la sfstole final. El diametro interno del ventrfculo izquierdo (VI) (DIVI) se midio como diametro anteroposterior maximo en diastole (DIVId) o en sfstole (DIVIs). Un unico observador enmascarado para el genotipo de raton analizo los datos. Se calculo el acortamiento fraccional (AF) del VI segun la siguiente formula: AF (%) = [(DIVId - DIVIs)/DIVId] x 100.
Plasmidos y ensayos de transfeccion. Un fragmento genomico de 305 pb que abarcaba la region que codifica para miR-208 se amplifico mediante PCR y se ligo en pCMV6. Un fragmento de 1 kb que abarcaba toda la THRAP1- UTR murina se amplifico mediante PCR y se ligo en un constructo de expresion de pCMV6 etiquetado con HA y el constructo indicador de luciferasa de luciernaga (f-luc) (pMIR-REPORT™, Ambion). Se construyo una mutacion de la secuencia de union a simiente de miR-208 UCGUCUUA mediante mutagenesis basada en PCR.
Cultivo celular, transfeccion y ensayos de luciferasa. Un fragmento genomico de 1793 pb que abarcaba la region que codifica para miR-29b-1 y miR-29a se amplifico mediante PCR y se ligo en pCMV6. Fragmentos genomicos de la UTR 3' murina que abarcaban el(los) sitio(s) de union a miR-29a-c se amplificaron mediante PCR y se ligaron en el constructo indicador de luciferasa de luciernaga (f-luc) (pMIR-REPORTTM, Ambion). Se transfectaron celulas COS con Fugene 6 (Stratagene) segun las instrucciones del fabricante. La cantidad total de ADN por pocillo se mantuvo constante anadiendo la cantidad correspondiente de vector de expresion sin un inserto de ADNc. 48 horas despues de la transfeccion, se sometieron a ensayo extractos celulares para detectar la expresion de luciferasa usando el kit de ensayo de luciferasa (Promega). Las actividades promotoras relativas se expresan como unidades relativas de luminiscencia normalizadas para la expresion de p-galactosidasa en los extractos celulares.
Se aislaron fibroblastos cardiacos (FC) tal como se describio previamente (Simpson y Savion, 1982). En resumen, se extirparon los corazones de ratas Sprague-Dawley neonatas de 1-2 dfas de edad anestesiadas (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, EN), se trituraron y se digirieron con pancreatina al 0,1 %. Las celulas se sembraron sobre placas Primaria durante 2 h, y se retiro el medio que contenfa la fraccion de cardiomiocitos del tejido digerido. Los fibroblastos cardiacos se unieron y proliferaron mucho mas rapidamente que los miocitos cardiacos; esto produjo cultivos de fibroblastos practicamente puros tras el primer paso, que se confirmo mediante siembra en placa diferencial repetida y evaluacion microscopica. Las celulas se desprendieron con tripsina al 0,05 % para la realizacion de pases, y se realizaron estudios de cultivo en los pases 2 a 4. Las celulas se hicieron crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) con alta concentracion de glucosa (4,5 gm/lt) que contenfa FBS inactivado con calor al 10 % y antibioticos (penicilina y estreptomicina). Se indujo diferenciacion de miofibroblastos cambiando el medio a baja concentracion de suero (FBS al 2 %) con acido L-ascorbico (10 pg/pl) y administracion de TGFp1 10 ng/ml durante 48 horas.
Silenciamiento de miR-29b in vivo mediante tratamiento con anti-miR. Se usaron oligonucleotidos antisentido modificados qufmicamente que comprendfan una secuencia complementaria a miR-29b (anti-miR-29b) para inhibir la expresion de miR-29b. Todas las bases estaban modificadas con 2'-OMe, en donde las dos primeras y las cuatro ultimas bases conteman un enlace intemucleosfdico fosforotioato y el extremo 3' de los oligonucleotidos estaba conjugado con colesterol. Ratones macho C57BL/6 de ocho semanas de edad recibieron anti-miR-29b (AsAsCACUGAUUUCAAAUGGUsGsCsUsAs-Colesterol) o miR-29b con apareamiento erroneo (AsAsAACUGAUGUCACAUGGUsGsAsUsAs-Colesterol) a una dosis de 80 mg/kg de peso corporal o un volumen comparable de solucion salina mediante inyeccion en la vena de la cola. Se recogieron los tejidos tras 3 dfas o tras 3 semanas de tratamiento.
Ejemplo 1. Regulacion de la hipertrofia cardiaca y la insuficiencia cardiaca mediante miARN sensibles al estres.
En vista de su implicacion en la modulacion de fenotipos celulares, los inventores plantearon la hipotesis de que los
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miARN pueden desempenar un papel en la regulacion de la respuesta del corazon al estres cardiaco, que se sabe que da como resultado cambios transcripcionales y traduccionales en la expresion genica. Para investigar la posible implicacion de los miARN en la hipertrofia cardiaca, realizaron un analisis de microarrays de miARN lado a lado en 2 modelos de raton establecidos de hipertrofia cardiaca, usando un microarrays que representaba 186 miARN diferentes (Babak et al., 2004). Los ratones se sometieron a bandeo aortico toracico (BAT), que induce hipertrofia mediante poscarga aumentada sobre el corazon (Hill et al., 2000), y se compararon con animales operados de manera simulada. En un segundo modelo, ratones transgenicos que expresan calcineurina activada (CnA) en el corazon, que da como resultado una forma grave y bien caracterizada de hipertrofia (Molkentin et al., 1998), se compararon con companeros de camada de tipo natural (figura 14A). El ARN aislado de corazones de ratones sometidos a BAT mostraba expresion aumentada de 27 miARN en comparacion con los controles operados de manera simulada, y los ratones CnA Tg mostraron expresion aumentada de 33 miARN en comparacion con controles de companeros de camada no transgenicos, de los cuales 21 estaban regulados por incremento en ambos modelos. De manera similar, la hipertrofia inducida por BAT y CnA estaba acompanada por una expresion reducida de 15 y 14 miARN, respectivamente, de los cuales 7 miARN estaban regulados por disminucion en comun (figura 14B). El analisis de tipo Northern de estos miARN (datos no publicados) y los analisis de microarrays previos (Barad et al., 2004; Sempere et al., 2004; Shingara et al., 2005; Liu et al., 2004) indican que se expresan en una amplia gama de tejidos. Basandose en sus niveles de expresion relativa, la conservacion de secuencias de humano, rata y raton, y los niveles de expresion durante la hipertrofia, los inventores se centraron en 11 miARN regulados por incremento y 5 regulados por disminucion (figura 14C).
El analisis de transferencia de tipo Northern de ARN cardiaco de animales WT y CnA-Tg confirmo un aumento de la expresion de los miR -21, -23, -24, -125b, -195, -199a y -214, y una disminucion de la expresion de los miR -29, -93, -150 y -181b (figura 14C y figura 15). Colectivamente, estos datos indican que distintos miARN se regulan durante la hipertrofia cardiaca, lo que sugiere la posibilidad de que funcionen como moduladores de este proceso.
Ejemplo 2. Descubrimiento de la familia miR-29 como dianas posteriores para la regulacion por miR-208.
Los inventores realizaron un microarray de miARN en corazones de ratones de tipo natural y nulos para miR-208 en un esfuerzo por identificar miARN posteriores que podrfan mediar en las acciones de miR-208 (figura 16). Descubrieron que multiples miembros de la familia miR-29 estaban regulados por incremento en ratones nulos para miR-208 (figura 17). La prediccion de dianas indico que los miembros de la familia miR-29 tienen como diana ARNm que codifican para multiples colagenos y otros componentes de la matriz extracelular (figura 18). Por tanto, es probable que la regulacion por incremento de miembros de la familia miR-29 en ratones nulos para miR-208 explique el bloqueo de la fibrosis observada en estos animales (figura 19).
El descubrimiento de que miR-29a-c esta regulado por disminucion en el corazon enfermo y tiene como diana ARNm que codifican para colagenos y protefnas de la matriz extracelular sugiere que las estrategias para potenciar la expresion de miR-29a-c o su asociacion con ARNm diana pueden tener efectos beneficiosos sobre el corazon en los entornos de fibrosis y remodelacion cardiaca patologica. Ademas, la elevacion de la expresion o funcion de miR-29a- c puede prevenir la fibrosis asociada a muchas enfermedades en tejidos tales como musculo esqueletico, hfgado, pulmon, rinones y otros. Ademas, el descubrimiento de que miR-208 reprime la expresion de miR-29a-c, y que la perdida de miR-208 regula por incremento la expresion de miR-29a-c, indica que miR-29a-c es un mediador posterior de las acciones de miR-208 sobre el corazon.
Ejemplo 3. MiR-29a-c regula la expresion de genes fibroticos.
Para comenzar a definir las posibles funciones de miR-29a-c en el corazon tras un IM, los inventores hicieron uso de predicciones informaticas para identificar posibles dianas de miR-29a-c. El sitio web de prediccion Targetscan indico un numero inesperadamente alto de ARNm relacionados con fibrosis que codifican para colagenos, metalopeptidasas e integrinas como posibles dianas para miR-29a-c (pagina web en targetscan.org). Para determinar si la regulacion por disminucion de miR-29a-c podrfa regular la fibrosis cardiaca, los inventores se centraron en dianas predichas implicadas en la produccion de ECM en el corazon. La elastina (ELN), la fibrilina 1 (FBN1), el colageno tipo I a1 y a2 (COL1A1, COL1A2) y el colageno tipo III a1 (COL3A1) contienen todos una o mas potenciales secuencias simiente conservadas para miR-29a-c (figura 20A).
Dado que los miARN regulan por disminucion los niveles en estado estacionario, asf como la traduccion, de sus ARNm diana, los inventores analizaron la expresion de dianas de ARNm de miR-29a-c predichas. El analisis por RT- PCR en tiempo real de estos genes reguladores clave para fibrosis cardiaca en muestras cardiacas 3 dfas despues de un infarto de miocardio indico que la regulacion por disminucion especffica de miR-29a-c en la region infartada se correlaciona con el aumento en la expresion de COL1A1, COL1A2, COL3A1 y FBN1. En cambio, la ELN aparecfa sin cambios en la zona limftrofe, e incluso mostro un aumento en el miocardio remoto (figura 20B).
Usando un plasmido de expresion dirigido por CMV, los inventores sobreexpresaron miR-29b-1 y miR-29a en celulas COS (figura 20C) con plasmidos de expresion de luciferasa que conteman las UTR 3' de las dianas de miR -29a-c predichas. Cantidades crecientes de miR-29b-1/miR-29a dirigido por CMV dieron como resultado una disminucion dependiente de la dosis en la actividad luciferasa, mientras que cantidades comparables de miR-206, como control,
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no tuvieron ningun efecto (figuras 20C-D), confirmando a estos ARNm como dianas para la represion por miR-29a-c. Ejemplo 4. Regulacion de miR-29a-c en fibroblastos cardiacos
La fibrosis cardiaca es un aspecto importante del proceso de remodelacion observado normalmente en el corazon danado. La proliferacion de fibroblastos y el aumento del deposito de componentes de la ECM dan como lugar a rigidez miocardica y disfuncion diastolica. Se ha mostrado que el factor de crecimiento transformante p (TGFp) desempena un papel dominante en la produccion y el deposito de colagenos en el corazon e induce una transformacion de fibroblastos en miofibroblastos (Border y Noble, 1994). El analisis por PCR en tiempo real de fibroblastos cardiacos expuestos a TGFp revelo una disminucion en la expresion de miR-29a-c, lo que sugiere que la disminucion en miR-29a-c tras un IM podrfa estar regulada por TGFp (figura 21A). De manera interesante, se ha mostrado que peptidos natriureticos como el peptido natriuretico de tipo B (BNP) inhiben la expresion genica regulada por TGFp relacionada con la fibrosis y la conversion de miofibroblastos (Kapoun et al., 2004). En este sentido, los inventores informaron previamente de que ratones que carecen del miARN especffico de tejido cardiaco miR-208 eran resistentes a la fibrosis cardiaca y a la remodelacion y presentaban una expresion aumentada de BNP a nivel inicial (van Rooij et al., 2007). Puesto que se sabe que el BNP antagoniza los efectos de TGFp, los inventores especularon que los niveles aumentados de BNP en estos ratones podrfan potenciar la expresion de miR-29a-c. De hecho, el analisis de tipo Northern mostro un aumento dependiente de la dosis en la expresion de miR-29a-c tras la eliminacion de miR-208, que coincidfa con un nivel de expresion creciente de BNP (figura 21B). Estos datos indican que TGFp induce la expresion de genes relacionados con colageno en fibroblastos al menos parcialmente a traves de la disminucion del nivel de miR-29a-c, que puede inhibirse por el BNP secretado por los cardiomiocitos.
Ejemplo 5. La inactivacion in vivo de miR-29a-c induce fibrosis y expresion de genes de colageno
Para explorar adicionalmente el posible papel de miR-29a-c como regulador negativo de la expresion de colageno, los inventores inactivaron miR-29b in vivo usando oligonucleotidos modificados con colesterol complementarios a la secuencia de miARN madura de miR-29b (anti-miR-29b) y o bien solucion salina o bien un oligonucleotido que contenfa un apareamiento erroneo de cuatro bases (miR-29b mm) como control negativo (figura 22A). Tres dfas despues de una unica inyeccion de anti-miR-29b (80 mg/kg) en la vena de la cola, los inventores observaron una disminucion drastica de la expresion de miR-29b en todos los tejidos examinados (figura 22B). En cambio, una dosis comparable del oligonucleotido antisentido miR-29b mm no tuvo ningun efecto sobre el nivel de expresion de miR- 29b en comparacion con el control de solucion salina. La inactivacion por anti-miR-29b parecfa ser especffica para el miARN maduro, puesto que el nivel de pre-miARN permanecfa comparable entre animales tratados con anti-miR y mm. Aunque la inactivacion en el hfgado y el rinon parecfa ser completa, un bajo nivel de miR-29b permanecfa detectable en el corazon y el pulmon (figura 22B).
Puesto que los otros miembros de miR-29 comparten una alta homologfa de secuencia con miR-29b, tambien se examino la expresion de miR-29a y -c en respuesta a anti-miR-29b. Aunque se detecto una inactivacion significativa en hfgado y rinon (especialmente para miR-29c), la expresion cardiaca no parecfa cambiar (figura 23). El analisis por PCR en tiempo real indico que la inactivacion de miR-29b era suficiente para inducir la expresion de genes de colageno en el hfgado especfficamente, mientras que este efecto estaba ausente en los controles con apareamiento erroneo (figura 22C).
Para potenciar la inactivacion cardiaca de miR-29b, los inventores inyectaron 80 mg/kg de oligonucleotido por via intravenosa en dos dfas consecutivos y recogieron material 3 semanas despues. El analisis de tipo Northern indico una inactivacion completa de miR-29b en rinon e hfgado en respuesta a anti-miR-29b en comparacion con el nivel de expresion observado tras la inyeccion de miR-29b mm. Los niveles cardiacos de miR-29b tambien se redujeron drasticamente, mientras que la expresion de miR-29b en el pulmon parecfa no verse afectada por anti-miR-29b (figura 22D). La expresion de colageno en el corazon aumento en respuesta a la inhibicion de miR-29b (figura 22E). Considerados conjuntamente, estos datos indican que miR-29b funciona como regulador negativo de la expresion de genes de colageno in vivo y, de ese modo, influye en el deposito de colageno y la fibrosis en el corazon y el hfgado.
Ejemplo 6. Regulacion por disminucion de la expresion de colageno con un mimetico de miR-29a-c
Para determinar si la sobreexpresion de miR-29a-c podia reducir la expresion de colageno, los inventores expusieron fibroblastos a un mimetico de miR-29b. El nivel de expresion de miR-29b en cultivos de fibroblastos aumento en hasta 400 veces tras 3 dfas de exposicion al mimetico de miR-29b (figura 22F). La expresion de miR- 29a no se vio afectada y la expresion de miR-29c aumento solo ligeramente tras la exposicion al mimetico de miR- 29b (figura 22F). El analisis por PCR en tiempo real indico que la expresion de genes de colageno disminufa en respuesta al mimetico de miR-29b (figura 22G). Sin embargo, la magnitud de la disminucion de la expresion de colageno era modesta en comparacion con el aumento de la expresion de miR-29b, lo que indica que los niveles de miR-29a-c no son el unico determinante de los niveles de colageno.
Todas las composiciones y procedimientos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden hacerse y ejecutarse sin experimentacion excesiva en vista de la presente divulgacion.
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Claims (29)

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2.
10 3.
4. 15
5.
6.
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8.
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16.
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Un agonista de miR-29a-c para su uso en un metodo para el tratamiento o la prevencion de fibrosis tisular en un sujeto que lo necesita, en el que el agonista de miR-29a-c es un polinucleotido que comprende un pri- miARN, pre-miARN, o secuencia madura de miR-29a, miR-29b y/o miR-29c.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 o 2 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el polinucleotido se expresa a partir de un vector de expresion.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 3 para su uso segun la reivindicacion 3, en el que el vector de expresion es un vector de expresion viral.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 4 para su uso segun la reivindicacion 4, en el que el vector de expresion viral es un vector de expresion adenoviral.
El agonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agonista se formula para administracion parenteral, oral, transdermica, intradermica, intramuscular, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, de liberacion sostenida, liberacion controlada, liberacion retardada, por supositorio, por inhalacion, por cateter o sublingual o para inyeccion directa en el tejido cardiaco.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicha fibrosis tisular es fibrosis cardiaca, esclerodermia, fibrosis muscular esqueletica, fibrosis hepatica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar o fibrosis diabetica.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 3 para su uso segun la reivindicacion 3, en el que el polinucleotido esta unido operativamente a un promotor especffico de fibroblastos.
El agonista de miR-29a-c segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polinucleotido es bicatenario.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 o 2 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el polinucleotido esta conjugado con colesterol.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 2 para su uso segun la reivindicacion 2, en el que el polinucleotido tiene de 18 a 25 nucleotidos de longitud.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 2 para su uso segun la reivindicacion 2, en el que el polinucleotido tiene de 70 a 200 nucleotidos de longitud.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 o 2 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el polinucleotido comprende una o mas modificaciones qufmicas.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 13 para su uso segun la reivindicacion 13, en el que las modificaciones qufmicas se seleccionan del grupo que consiste en acidos nucleicos bloqueados, modificaciones de azucares y modificaciones de la estructura principal.
El agonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 1 o 2 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el polinucleotido se formula en un vehfculo de administracion de nanopartfculas.
Un antagonista de miR-29a-c para su uso en un metodo para tratar tejido que comprende una herida, dano qufmico, dano por calor o dano por frfo, en el que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
El antagonista segun la reivindicacion 16 para su uso segun la reivindicacion 16, en el que el oligonucleotido antisentido se formula para inyeccion en el tejido, inyeccion en la vasculatura que alimenta al tejido o aplicacion topica.
18. El antagonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 17 para su uso segun la reivindicacion 17, en el que la formulacion topica es una pomada, una crema, un gel, un unguento o un balsamo.
65
19. Un antagonista de miR-29a-c para su uso en la prevencion del infarto de miocardio convirtiendo una o mas
5 20.
21.
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30.
placas blandas en tejido fibrotico, en el que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
El antagonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 19 para su uso segun la reivindicacion 19, en el que dicho oligonucleotido antisentido se formula para administracion por cateter o como recubrimiento para una endoprotesis o un balon.
El antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicho oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
El antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 para su uso segun una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicho oligonucleotido antisentido comprende una secuencia que es complementaria al 100% a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
El antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 para su uso segun una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que el oligonucleotido antisentido comprende una
secuencia que es complementaria en al menos el 95% a una secuencia de pre-miR-29a, pre-miR-29b o pre- miR-29c.
El antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que dicho oligonucleotido antisentido tiene de 15 a 50 nucleotidos de longitud.
Un antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que el oligonucleotido antisentido tiene de 19 a 25 nucleotidos de longitud.
El antagonista de miR-29a-c segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en el que el oligonucleotido antisentido comprende al menos una modificacion de un azucar y/o de la estructura principal.
El antagonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 26 para su uso segun la reivindicacion 26, en el que dicha una modificacion de al menos un azucar es una modificacion 2'-O-alquilo o una modificacion de un acido nucleico bloqueado.
El antagonista de miR-29a-c segun la reivindicacion 26 para su uso segun la reivindicacion 26, en el que la modificacion de la estructura principal es una union fosforotioato.
Un dispositivo medico usado en cirugfa vascular recubierto con al menos un antagonista de miR-29a-c, en el que dicho antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido o antagomir que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia madura de miR-29a, miR-29b o miR-29c, y en el que el recubrimiento comprende ademas un compuesto anti-reestenosis seleccionado de paclitaxel, rapamicina, tacrolimus, zotarolimus, everolimus, docetaxel y pimecrolimus.
El dispositivo medico segun la reivindicacion 29, en el que el dispositivo medico es una endoprotesis o un balon.
50 31. El dispositivo medico segun la reivindicacion 29 o 30, en el que el antagonista es un oligonucleotido
antisentido o antagomir que comprende una secuencia que es complementaria en al menos el 85% a una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
32.
55
El dispositivo medico segun la reivindicacion 29 o 30, en el que el antagonista es un oligonucleotido antisentido o antagomir que comprende una secuencia que es complementaria al 100% a una secuencia de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
33.
60
El dispositivo medico segun una cualquiera de las reivindicaciones 29-32, en el que el antagonista es un oligonucleotido antisentido que comprende al menos una modificacion de un azucar y/o de la estructura principal.
34. El dispositivo medico segun una cualquiera de las reivindicaciones 29-33, en el que el oligonucleotido antisentido o antagomir tiene de 19 a 25 nucleotidos de longitud.
65 35. Una formulacion cosmetica que comprende un antagonista de miR-29a-c, en la que el antagonista de miR-
29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es complementaria en al menos
el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
36. Un uso cosmetico de un antagonista de miR-29a-c en una formulacion cosmetica para aplicaciones cosmeticas de fotoenvejecimiento debido a dano solar de la piel, arrugas o marcas de estiramiento, en el 5 que el antagonista de miR-29a-c es un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia que es
complementaria en al menos el 85% a una secuencia de miR-29a, miR-29b o miR-29c.
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