ES2621165T3 - Adenovirus de simio de la subfamilia B SADV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos - Google Patents

Adenovirus de simio de la subfamilia B SADV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un adenovirus que tiene una cápside que comprende: una proteína hexona del SAdV-28, los aminoácidos 1 a 944 de la SEQ ID NO: 11; una proteína pentona del SAdV-28, los aminoácidos 1 a 582 de la SEQ ID NO: 6; y una proteína de fibra del SAdV-28, los aminoácidos 1 a 323 de la SEQ ID NO: 21; encapsidando dicha cápside una molécula heteróloga portadora de un gen unido operativamente a secuencias de control de la expresión que dirigen la transcripción, la traducción y/o la expresión del mismo en una célula hospedadora, y que comprende adicionalmente los elementos en cis en 5' y en 3' del adenovirus necesarios para la replicación y la encapsidación.

Description

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DESCRIPCION
Adenovirus de simio de la subfamilia B SAdV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos Antecedentes de la invencion
Un adenovirus es un virus de ADN bicatenario con un tamano de genoma de aproximadamente 36 kilobases (kb), que ha sido ampliamente usado para aplicaciones de transferencia genica debido a su capacidad para conseguir una transferencia genica muy eficaz en una diversidad de tejidos objetivo y a su gran capacidad transgenica. Convencionalmente, los genes E1 del adenovirus son delecionados y sustituidos por un casete transgenico que consiste en el promotor de eleccion, la secuencia de ADNc del gen de interes y una senal de poli A, dando como resultado un virus recombinante con una replicacion defectuosa.
Los adenovirus tienen una morfologfa caractenstica con una capside icosaedrica que consiste en tres protemas principales, la hexona (II), la base de pentona (III) y una fibra knobbed (IV), junto con otras varias protemas menores, VI, VIII, IX, IIIa y IVa2 [W. C. Russell, J. Gen Virol., 81: 2573-2604 (noviembre de 2000)]. Las secuencias de acidos nucleicos del genoma del virus es un ADN bicatenario lineal con una protema terminal unida covalentemente al 5' terminal, que tiene repeticiones terminales invertidas (ITR). El ADN del virus esta mtimamente asociado con la protema muy basica VII y un pequeno peptido pX (anteriormente denominado mu). Otra protema, la V, esta empaquetada en este complejo de ADN-protema y proporciona una conexion estructural con la capside a traves de la protema VI. El virus tambien contiene una proteasa codificada por el virus, que es necesaria para el procesado de algunas de las protemas estructurales para la produccion de virus infecciosos maduros.
Se ha desarrollado un esquema de clasificacion para la familia Mastadenovirus, que incluye adenovirus humanos, de simio, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, caninos y de zarigueya. Este esquema de clasificacion fue desarrollado tomando como base las diferentes capacidades de las secuencias de los adenovirus de la familia para aglutinar los globulos rojos sangumeos. El resultado fue de seis subgrupos, conocidos ahora como los subgrupos A, B, C, D, E y F. Vease T. Shenk et al., Adenoviridae: The Viruses and their Replication", Cap. 67, en FIELD'S VIROLOGY, 6a Ed., editado por B. N Fields et al., (Lippincott Raven Publishers, Filadelfia, 1996), pags. 111-2112.
Los adenovirus recombinantes se han descrito para la administracion de moleculas heterologas a celulas hospedadoras. Vease la Patente de Estados Unidos 6.083.716, que describe el genoma de dos adenovirus de chimpance. Los adenovirus de simio C5, C6 y C7, han sido descritos en la Patente de Estados Unidos n° 7.247.472 como utiles como vectores de vacunas. Otros adenovirus de chimpance se describen en el documento WO 2005/1071093 como utiles para la elaboracion de adenovirus portadores en vacunas.
Lo que se necesita en la materia son vectores que administren de forma eficaz moleculas a un objetivo y minimicen el efecto de la inmunidad preexistente frente a los serotipos de adenovirus seleccionados en la poblacion.
En el presente documento se describen secuencias de acidos nucleicos y secuencias de aminoacidos aisladas del adenovirus de simio 28 (SAdV-28), del adenovirus de simio 27 (SAdV-27), del adenovirus de simio 29 (SAdV-29), del adenovirus de simio 32 (SAdV-32), del adenovirus de simio 33 (SAdV-33) y del adenovirus de simio 35 (SAdV-35) y vectores que contienen estas secuencias. Tambien se describen varios metodos para el uso de los vectores y de las celulas descritas en el presente documento.
Los metodos descritos en el presente documento implican la administracion de uno o mas genes heterologos seleccionados a un paciente mairnfero mediante la administracion de un vector de la invencion. El uso de las composiciones descritas en el presente documento para la vacunacion permite la presentacion del antfgeno seleccionado para desencadenar respuestas inmunitarias protectoras. Las secuencias de acidos nucleicos de los vectores basados en el SAdV-28, en el SAdV-27, en el SAdV-29, en el SAdV-32, en el SAdV-33 y en el SAdV-35 tambien pueden usarse para la produccion de productos genicos heterologos in vitro. Dichos productos genicos son por sf mismos utiles para diversos fines, tales como los que se describen en el presente documento.
Estas y otras realizaciones y ventajas de la invencion se describen con mas detalle a continuacion.
Sumario de la invencion
La invencion proporciona, en un aspecto, un adenovirus que tiene una capside que comprende: una protema hexona del SAdV-28, los aminoacidos 1 hasta 944 de la SEQ ID NO: 11; una protema pentona del SAdV-28, los aminoacidos 1 hasta 582 de la SEQ ID NO: 6; y una protema de fibra del SAdV-28, los aminoacidos 1 a 323 de la SEQ ID NO: 21; encapsidando dicha capside una molecula heterologa portadora de un gen unido operativamente a secuencias de control de la expresion que dirigen la transcripcion, la traduccion y/o la expresion del mismo en una celula hospedadora y que comprende adicionalmente los elementos en cis en 5' y 3' del adenovirus necesarios para la replicacion y la encapsidacion.
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La invencion tambien se extiende a las composiciones que comprenden los adenovirus de la invencion, en portadores farmaceuticos.
Descripcion detallada de la invencion
Se proporcionan las secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos del adenovirus de simio 28, del SAdV-27, del SAdv-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35, cada uno de los cuales se aislo a partir de heces de chimpance. Tambien se proporcionan vectores adenovmcos y lmeas celulares de empaquetamiento para la produccion de esos vectores para su uso en la produccion in vitro de protemas recombinantes o de fragmentos o de otros reactivos. Adicionalmente se proporcionan composiciones para su uso en la administracion de una molecula heterologa para fines terapeuticos o de vacuna. Dichas composiciones terapeuticas o de vacuna contienen los vectores adenovmcos portadores de una molecula heterologa insertada. Ademas, las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35 son utiles para proporcionar las funciones colaboradoras esenciales necesarias para la produccion de los vectores vmcos adenoasociados (AAV) recombinantes. Por lo tanto, se proporcionan las construcciones colaboradoras, los metodos y las lmeas celulares que usan estas secuencias en dichos metodos de produccion.
El termino “homologfa sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a un acido nucleico o a un fragmento del mismo, indica que, cuando estan optimamente alineadas con las apropiadas inserciones o deleciones de nucleotidos, con otro acido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad en la secuencia de nucleotidos de al menos entre aproximadamente el 95 y el 99 % de las secuencias alineadas.
El termino “homologfa sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a aminoacidos o a fragmentos de los mismos, indica que, cuando estan optimamente alineadas con las apropiadas inserciones o deleciones de aminoacidos con otro aminoacido (o su hebra complementaria), existe una identidad en la secuencia de aminoacidos de al menos entre aproximadamente el 95 y el 99 % de las secuencias alineadas. Preferiblemente, la homologfa es a lo largo de la totalidad de la secuencia, o de una protema de la misma, o de un fragmento de la misma que tiene al menos 8 aminoacidos, o mas deseablemente, al menos 15 aminoacidos de longitud. Algunos ejemplos de fragmentos adecuados se describen en el presente documento.
El termino "porcentaje de identidad en la secuencia" o "identica" en el contexto de secuencias de acidos nucleicos se refiere a los residuos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia maxima. Cuando se requieren huecos para alinear una secuencia con otra, el grado de puntuacion se calcula con respecto a la secuencia mas larga sin penalizar por los huecos. Las secuencias que conservan la funcionalidad del polinucleotido o del polipeptido codificado por el mismo son mas estrechamente identicas. La longitud de la comparacion de la identidad de la secuencia puede ser a lo largo de la totalidad del genoma (por ejemplo, de aproximadamente 36 kpb), de la totalidad de un marco abierto de lectura de un gen, de una protema, de una subunidad o de una enzima [veanse, por ejemplo, las tablas que proporcionan las regiones codificantes adenovmcas], o de un fragmento de al menos entre aproximadamente 500 y 5.000 nucleotidos. Sin embargo, tambien puede desearse la identidad entre fragmentos mas pequenos, por ejemplo, de al menos aproximadamente nueve nucleotidos, habitualmente de al menos aproximadamente 20 hasta 24 nucleotidos, de al menos aproximadamente 28 hasta 32 nucleotidos, de al menos aproximadamente 36 o mas nucleotidos. De forma analoga, el "porcentaje de identidad en la secuencia" puede ser facilmente determinado para las secuencias de aminoacidos, a lo largo de la totalidad de la longitud de una protema, o de un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento tiene al menos aproximadamente 8 aminoacidos de longitud, y puede tener hasta aproximadamente 700 aminoacidos. Algunos ejemplos de fragmentos adecuados se describen en el presente documento.
La identidad se determina facilmente mediante el uso de algoritmos y de programas informaticos, tales como los que se definen en el presente documento, con sus ajustes por defecto. Preferiblemente, dicha identidad es a lo largo de la totalidad de la longitud de la protema, de la enzima, de la subunidad, o a lo largo de un fragmento de al menos aproximadamente 8 aminoacidos de longitud. Sin embargo, la identidad puede basarse en regiones mas cortas, donde son adecuadas al uso que se le esta dando al producto genico identico.
Como se describe en el presente documento, las alineaciones pueden llevarse a cabo mediante el uso de cualquiera de una diversidad de Programas de Alineacion de Secuencias Multiples publicos o disponibles comercialmente, tales como "Clustal W", accesible a traves de Web Servers en internet. Alternativamente, tambien se usan las utilidades Vector NTI® [InVitrogen]. Tambien existen diversos algoritmos conocidos en la materia que pueden usarse para medir la identidad en la secuencia de nucleotidos, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, pueden compararse las secuencias de polinucleotidos mediante el uso de Fasta, un programa de GCG Version 6.1. Fasta proporciona alineaciones y porcentajes de identidad en la secuencia de las regiones que mejor solapan entre las secuencias de interrogacion y de busqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad en la secuencia puede ser determinado mediante el uso de Fasta con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 6 y el factor de NOPAM para la matriz de puntuacion) segun se proporciona en GCG Version 6.1. De forma analoga, hay disponibles programas para llevar a cabo las alineaciones de aminoacidos. Generalmente, estos programas se usan con los ajustes por defecto, aunque el experto en la materia puede alterar estos ajustes segun sea necesario. Alternativamente, el experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o
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programa informatico que proporcione al menos el nivel de identidad con la alineacion tal y como los proporcionan los algoritmos y programas referenciados.
"Recombinante", aplicado a un polinucleotido, significa que el polinucleotido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonacion, restriccion o ligacion, y de otros procedimientos que dan como resultado una construccion que es distinta al polinucleotido que se encuentra la naturaleza. Un virus recombinante es una partfcula vmca que comprende un polinucleotido recombinante. Los terminos incluyen respectivamente replicados de la construccion original del polinucleotido y la progenie de la construccion del virus original.
"Heterologo" significa derivado de una entidad genotfpicamente distinta a la del resto de la entidad con la que se esta comparando. Por ejemplo, un polinucleotido introducido mediante tecnicas de ingeniena genetica en un plasmido o un vector derivado de una especie diferente, es un polinucleotido heterologo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante natural y unido operativamente a una secuencia codificante con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterologo. Un sitio de recombinacion espedfica de sitio que ha sido clonado en el genoma de un virus o en un vector vmco, en el que el genoma del virus no lo contiene de forma natural, es un sitio de recombinacion heterologo. Cuando se usa un polinucleotido con una secuencia que codifica una recombinasa para alterar geneticamente una celula que normalmente no expresa la recombinasa, tanto el polinucleotido como la recombinasa son heterologos para la celula.
Segun se usa a lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones, el termino "comprender" y sus variantes, incluyendo "comprende", "que comprende", entre otras variantes, es incluyente de los demas componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares. El termino "consiste en" o "que consiste en” es excluyente de otros componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares.
I. Las secuencias de los adenovirus de simio
La divulgacion proporciona secuencias de acidos nucleicos y secuencias de aminoacidos del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35 de simio, cada una de las cuales se afsla a partir de otro material con el que estan asociados a la naturaleza. Se ha determinado que cada uno de estos adenovirus esta en el mismo subgrupo que el subgrupo B humano.
A. Secuencias de acidos nucleicos
Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV-28 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35610 de la SEQ ID NO: 1. Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV-27 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35592 de la SEQ ID NO: 39. Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV- 29 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35646 de la SEQ ID NO: 71. Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV-32 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35588 de la SEQ ID NO: 103. Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV-33 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35694 de la SEQ ID NO: 134. Las secuencias de acidos nucleicos del SAdV- 35 proporcionadas en el presente documento incluyen los nucleotidos 1 a 35606 de la SEQ ID NO: 166.
Las secuencias de acidos nucleicos descritas en el presente documento engloban adicionalmente la hebra que es complementaria de las secuencias de las SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134 y 166, asf como las secuencias de ARN y de ADNc correspondientes a las secuencias de las siguientes secuencias y sus hebras complementarias. En otra alternativa, la secuencia de acidos nucleicos engloba adicionalmente secuencias que son identicas en mas del 98,5 %, y preferentemente, identicas en mas aproximadamente el 99 %, a la Lista de Secuencias. En una alternativa tambien se incluyen las variantes naturales y las modificaciones artificiales de las secuencias proporcionadas en las SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134 y 166 y sus hebras complementarias. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la materia, una metilacion y la sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales por un nucleotido degenerado.
TABLA 1 - REGIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Regiones
ORF DEL SAdV-28, ORF DEL SAdV-27, ORF DEL SAdV-29, ORF DEL SAdV-32, ORF DEL SAdV-33, ORF DEL SAdV-35,
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 166
ITR
1.132 1 132 1 132 1..131 1..131 1,126
E1a
13S 12S 9S Unir 574..1147, 1236..1441 Unir 575..1151, 1245..1450 Unir 574-1150, 1239-1444 Unir 573-1149, 1238-1443 Unir 571..1150, 1247-1449 Unir 561-1140, 1232-1437
T/19Kpequeno 1612..2154 1621..2163 1615-2157 1614-2156 1620-2162 1606-2148
E1b
T/55K grande 1917..3401 1926-3410 1920-3404 1919-3403 1925-3409 1911-3395
IX 3496..3909 3506-3919 3499-3912 3500-3913 3504-3917 3491-3904
E2b
pTP Complemento (8455..10410, 13882..13890) Complemento (8462..10396, 13903-13911) Complemento (8459..10438, 13910-13918) Complemento (8456..10399, 13872-13880) Complemento (8460.10439, 13918-13926) Complemento (8445..10418, 13869..13877)
Polimerasa
Complemento (5081..8653, 13882..13890) Complemento (5091..8456, 13903-13911) Complemento (5085..8657, 13910-13918) Complemento (5085..8654, 13872-13880) Complemento (5089.8658, 13918-13926) Complemento (5068..8643, 13869..13877)
IVa2 Complemento (3978..5308, 5587..5599) Complemento (3988-5321, 5597.5609) Complemento (3982-5312, 5591.5603) Complemento (3982-5312, 5591.5603) Complemento (3986-5316, 5595..5607) Complemento (3965-5295, 5574.5586)
L1
52/55 D 10893..12059 10921.12081 10922.12088 10883.12049 10924-12093 10886..12052
Ilia
12087..13847 12109-13869 12116-13876 12077-13837 12121.13884 12083..13843
Pentona 13935..15680 13956-15644 13963-15690 13916-15670 13972-15684 13919..15607
L2
VII 15692..16267 15651-16226 15697-16272 15683-16258 15692-16264 15621.16196
V
16313..17362 16272..17321 16318.. 17367 16304.17353 16309..17358 16239..17297
pX 17394..17618 17353-17577 17399-17623 17385-17609 17390-17614 17329..17556
VI 17696..18445 17655-18404 17699-18448 17687-18436 17691.18440 17632..18381
L3
Hexona 18564..21395 18532-21399 18570-21431 18555-21419 18565-21417 18510..21377
Endoproteasa 21430..22056 21430..22056 21462.22088 21455.22081 21457..22083 21253..21861
E2a
DBP Complemento (22152..23708) Complemento (22153-23700) Complemento (22182-23729) Complemento (22176-23729) Complemento (22177-23724) Complemento (22116-23663)
100 kD 23739..26222 23731..26214 23760.26255 23760.26255 23755-26253 23694..26177
Homologo de 33 kD Unir 25927..26275, Unir 25919-26267, Unir 25951..26308, Unir 25951..26308, Unir 25952..26306, Unir 25882-26230,
L4
26445..26809 26437-26786 26478-26836 26478-26833 26476-26828 26400..26749
22 kD 25927..26541 25919-26512 25951-26568 25951-26565 25952-26554 25882-26475
VIII 268S2..27562 26861-27541 26909-27589 26905-27585 26901.27581 26824..27504
TABLA 1 - REGIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
ORF DEL SAdV-28, ORF DEL SAdV-27, ORF DEL SAdV-29, ORF DEL SAdV-32, ORF DEL SAdV-33, ORF DEL SAdV-35,
Kegiones
SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 166
ITR
1.132 1..132 1..132 1.131 1 ..131 1..126
12,5 K 27565..27879 27544.. 27861 27592..27906 27588..27902 27584.. 27901 27507..27824
CR1-alfa 27836..28279 27818.28255 27863..28306 27859..28302 27858.28307 27781..28218
gp19K 28267..28800 28243.28758 28294..28827 28290..28823 28295.28810 28206..28721
CR 1-beta 28656..29393 28798.29328 28683..29420 28854..29465 28788.29372 28699..29292
E3
CR1-gamma 29415..29978 29353.29919 29442..30005 29487..30293 29395.29958 29435..29872
CR 1-delta 29997..30314 29938.. 30240 30024..30344 29979.. 30335 29891..30190
RID-alfa 30347..30619 30286.. 30558 30377..30649 30306..30578 30380.. 30652 30234..30506
RID-beta 30594..31010 30533.. 30967 30624..31043 30553..30975 30627..31061 30481..30915
14,7 K 31006..31401 30963.. 31367 31039..31434 30971..31372 31057..31461 30911..31315
L5
Fibra 31630..32598 31597..32571 31663..32634 31609..32565 31699..32673 31550..32608
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
E4
Orf 6/7 (32642..32890, (32615..32863, (32678..32926, 32614.. 32862, (32721..32969, (32654..32902,
33613..33816) 33586.33774) 33649..33852) 33576.. 33773 33683.33880) 33613..33825)
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(32890..33816) (32863..33774) (32926..33852) (32862..33773) (32969..33880) (32902..33825)
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(33692..34072) (33665..34045) (33728.34108) (33664.34044) (33771..34151) (33701.34081)
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(34085..34435) (34058..34408) (34121..34471) (34057..34407) (34164.34514) (34095..34445)
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(34435..34821) (34408..34794) (34471.34857) (34407..34793) (34514.34900) (34445.34831)
Off 1 Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(34862..35233) (34841..35212) (34899..35270) (34837..35208) (34945..35316) (34873..35244)
Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento Complemento
(35479..35610) (35461..35592) (35515..35646) (35458..35588) (35564..35694) (35481..35606)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una alternativa se proporcionan fragmentos de las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35, y sus hebras complementarias, el ADNc y el ARN complementary del mismo. Los fragmentos adecuados tienen al menos 15 nucleotidos de longitud, y engloban fragmentos funcionales, es dedr, fragmented que son de interes biologico. Por ejemplo, un fragmento funcional puede expresar un producto adenovmco deseado o puede ser util en la produccion de vectores vmcos recombinantes. Dichos fragmentos incluyen las secuencias genicas y los fragmentos recogidos en las tablas del presente documento. Las tablas proporcionan las regiones transcritas y los marcos abiertos de lectura de las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35. Para algunos genes, los transcritos y los marcos abiertos de lectura (ORF) estan ubicados en la hebra complementaria a la presentada en las SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134 o 166. Vease, por ejemplo, E2b, E4 u E2a. Tambien se muestran los pesos moleculares calculados de las protemas codificadas. Notese que el marco abierto de lectura E1a del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 y el marco abierto de lectura E2b, contienen sitios internos de empalme. Estos sitios de empalme estan indicados en las tablas anteriores.
Las secuencias de acidos nucleicos adenovmcas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV- 33 y/o del SAdV-35 son utiles como agentes terapeuticos y para la construccion de una diversidad de sistemas de vectores y celulas hospedadoras. Segun se usa en el presente documento, un vector incluye cualquier molecula de acido nucleico adecuada, incluyendo un ADN desnudo, un plasmido, un virus, un cosmido o un episoma. Estas secuencias y productos pueden usarse solos o junto con otras secuencias o fragmentos adenovmcos, o junto con elementos de otras secuencias adenovmcas o no adenovmcas. Las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 tambien son utiles como vectores de administracion antisentido, vectores para la terapia genica o vectores para vacunas. Por lo tanto, adicionalmente se proporcionan moleculas de acido nucleico, vectores para la administracion de genes y celulas hospedadoras que contienen las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35.
Por ejemplo, la invencion engloba una molecula de acido nucleico que contiene las secuencias ITR de un Ad de simio de la invencion. En otro ejemplo, la invencion proporciona una molecula de acido nucleico que contiene las secuencias de un Ad de simio de la invencion que codifican un producto genico del Ad deseado. Otras moleculas mas de acidos nucleicos construidas mediante el uso de las secuencias de la invencion seran evidentes para el experto en la materia, en vista de la informacion proporcionada en el presente documento.
En una realizacion, las regiones genicas del Ad de simio identificadas en el presente documento pueden usarse en una diversidad de vectores para la administracion de una molecula heterologa a una celula. Por ejemplo, se generan vectores para la expresion de una protema de la capside adenovmca (o de un fragmento de la misma) con el fin de generar un vector vmco en una celula hospedadora de empaquetamiento. Dichos vectores pueden estar disenados para su expresion en trans. Alternativamente, dichos vectores estan disenados para proporcionar celulas que contienen de forma estable secuencias que expresan las funciones adenovmcas deseadas, por ejemplo, una o mas de E1a, E1b, las secuencias repetitivas terminales, E2a, E2b, E4, la region E4ORF6.
Ademas, las secuencias genicas adenovmcas y los fragmentos de las mismas son utiles para proporcionar las funciones colaboradoras necesarias para la produccion de los virus dependientes de colaboradores (por ejemplo, vectores adenovmcos con funciones esenciales eliminadas, o virus adenoasociados (AAV)). Para dichos metodos de produccion, pueden utilizarse las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35 en dicho metodo de una forma similar a las descritas para el Ad humano. Sin embargo, debido a las diferencias en las secuencias entre las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV- 33 y del SAdV-35, y las del Ad humano, el uso de las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35 minimiza en gran medida o elimina la posibilidad de una recombinacion homologa con funciones colaboradoras en celula hospedadora portadora de funciones E1 de un Ad humano, por ejemplo, las celulas 293, que pueden producir contaminantes adenovmcos infecciosos durante la produccion del rAAV.
Los metodos para la produccion del rAAV mediante el uso de las funciones colaboradoras adenovmcas han sido ampliamente descritos en la bibliograffa con serotipos adenovmcos humanos. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.258.595 y las referencias mencionadas en la misma. Vease tambien la Patente de Estados Unidos5.871.982; el documento WO 99/14354; el documento WO 99/15685; el documento WO 99/47691. Tambien pueden usarse estos metodos en la produccion de un AAV de serotipo no humano, incluyendo serotipos de AAV de primates no humanos. Las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y del SAdV-35 que proporcionan las funciones colaboradoras necesarias (por ejemplo, los ORF6 E1a, E1b, E2a y/o E4) pueden ser particularmente utiles para proporcionar la necesaria funcion adenovmca mientras se minimiza o elimina la posibilidad de recombinacion con cualquier otro adenovirus presente en la celula de empaquetamiento del rAAV que normalmente son de origen humano. Por lo tanto, pueden utilizarse los genes o los marcos abiertos de lectura seleccionados del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35 en estos metodos de produccion de rAAV.
Alternativamente, en estos metodos pueden utilizarse vectores recombinantes basados en las secuencias del SAdV- 28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35. Dichos vectores adenovmcos de simio
5
10
15
20
25
30
35
40
recombinantes pueden incluir, por ejemplo, un hubrido Ad/AAV de chimpance en el que las secuencias del Ad de chimpance flanquean un casete de expresion del rAAV formado, por ejemplo, por las ITR en 3' y/o en 5' del AAV y un transgen bajo el control de las secuencias reguladoras que controlan su expresion. El experto en la materia reconocera que otros vectores adenovmcos de simio y/o las secuencias genicas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 seran utiles para la produccion de rAAV y de otros virus dependientes de un colaborador adenovmco.
En otra alternativa mas se disenan moleculas de acidos nucleicos para la administracion y la expresion de productos genicos adenovmcos seleccionados en una celula hospedadora para conseguir un efecto fisiologico deseado. Por ejemplo, puede administrate una molecula de acido nucleico que contiene las secuencias que codifican una protema E1a del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 a un sujeto para su uso como tratamiento del cancer. Opcionalmente, dicha molecula esta formulada en un portador basado en lfpidos y preferentemente se dirige a las celulas cancerosas. Dicha formulacion puede combinarse con otros productos terapeuticos oncologicos (por ejemplo, cisplatino, taxol o similares). Otros usos mas de las secuencias adenovrncas proporcionadas en el presente documento seran evidentes para el experto en la materia.
Ademas, el experto en la materia comprendera facilmente que las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV- 29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden ser facilmente adaptadas para su uso en una diversidad de sistemas de vectores vmcos y no vmcos para la administracion in vitro, ex vivo o in vivo de moleculas terapeuticas e inmunogenas. Por ejemplo, pueden utilizarse las secuencias del Ad del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 de simio en una diversidad de sistemas de vectores rAd y no rAd. Dichos sistemas de vectores pueden incluir, por ejemplo, plasmidos, lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus de la variolovacuna y sistemas vmcos adenoasociados, entre otros. La seleccion de estos sistemas de vectores no es una limitacion de la presente invencion.
La divulgacion tambien proporciona moleculas utiles para la produccion de las protemas de simio y derivadas de simio de la invencion. Dichas moleculas que portan polinucleotidos que incluyen las secuencias de ADN de un Ad de simio de la invencion pueden estar en forma de un ADN desnudo, de un plasmido, de un virus o de cualquier otro elemento genetico.
B. Protemas adenovrncas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35
Se proporcionan los productos genicos de los adenovirus SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 o SAdV- 35, tales como protemas, enzimas y fragmentos de las mismas, que estan codificados por los acidos nucleicos adenovmcos descritos en el presente documento. Adicionalmente estan englobadas las protemas, las enzimas y los fragmentos de las mismas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35, que tienen las secuencias de aminoacidos codificadas por estas secuencias de acidos nucleicos que son generadas mediante otros metodos. Dichas protemas incluyen aquellas codificadas por los marcos abiertos de lectura identificados en la tabla anterior, las protemas en la Tabla 2 (mostradas tambien en la Lista de Secuencias) y los fragmentos de los mismos de las protemas y de los polipeptidos.
TABLA 2 - SECUENCIAS DE PROTEfNAS
Regiones
SAdV-28 SEQ ID NO: SAdV-27 SEQ ID NO: SAdV-29 SEQ ID NO: SAdV-32 SEQ ID NO: SAdV-33 SEQ ID NO: SAdV-35 SEQ ID NO:
E1a
13S 30 68 95 131 163 195
12S
9S
E1b
T/19K pequeno 23 61 93 125 156 187
T/55K grande
2 40 73 104 135 167
IX
3 41 73 105 136 168
L1
52/55D 4 42 74 106 137 169
IIIa
5 43 75 107 138 170
L2
Pentona 6 44 76 108 139 171
VII
7 45 77 109 140 172
V
8 46 78 110 141 173
px
9 47 79 111 142 174
L3
VI 10 48 80 112 143 175
Hexona
11 49 81 113 144 176
Endoproteasa
12 50 82 114 145 189
5
10
15
20
25
30
35
40
TABLA 2 - SECUENCIAS DE PROTEfNAS
Regiones
SAdV-28 SEQ ID NO: SAdV-27 SEQ ID NO: SAdV-29 SEQ ID NO: SAdV-32 SEQ ID NO: SAdV-33 SEQ ID NO: SAdV-35 SEQ ID NO:
L4
100 kD 13 51 83 115 146 177
Homologo de 33 kD
32 70 97 133 165 197
22 kD
25 63 99 127 158 190
VIII
14 52 84 116 147 178
E3
12,5 k 15 53 100 117 148 179
CR1-alfa
26 64 85 128 159 191
gp19 K
16 54 101 118 149 180
CR1-beta
27 55 86 119 160 192
CR1-gamma 17 56 87 120 150 181
CR1-delta
18 57 88 151 182
RID-alfa
19 65 89 121 152 183
RID-beta
28 58 102 129 161 193
14,7 K
20 66 90 122 153 184
L5
Fibra 21 59 91 123 154 185
Por lo tanto, en una alternativa, se proporcionan protemas unicas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35 que son sustancialmente puras, es dedr, estan exentas de otras protemas vmcas y proteicas. Preferiblemente, estas protemas son homogeneas en al menos un 10%, mas preferentemente homogeneas en un 60 %, y lo mas preferentemente homogeneas en un 95 %.
En una alternativa se proporcionan protemas de la capside derivadas de simio unicas. Segun se usa en el presente documento, una protema de la capside derivada de simio incluye cualquier protema de la capside adenovmca que contenga una protema de la capside del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35 o un fragmento de la misma, como se ha definido anteriormente, incluyendo, sin limitacion, protemas de la capside quimericas, protemas de fusion, protemas de la capside artificiales, protemas de la capside sinteticas y protemas de la capside recombinantes, sin limitacion con respecto al medio para la generacion de estas protemas.
Adecuadamente, estas protemas de la capside derivadas de simio contienen una o mas regiones del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35 o fragmentos de las mismas (por ejemplo, una hexona, una pentona, una fibra o un fragmento de las mismas) junto con regiones de la capside o fragmentos de las mismas de diferentes serotipos adenovmcos, o protemas o fragmentos de la capside de simio modificados, segun se describe en el presente documento. Una “modificacion de una protema de la capside asociada con un tropismo alterado" segun se usa en el presente documento, incluye una protema de la capside alterada, es decir, una pentona, una hexona o una region de la protema de fibra, o un fragmento de las mismas, tal como el dominio knob de la region de fibra, o un polinucleotido que codifica las mismas, de forma que se altere la especificidad. La capside derivada de simio puede construirse con uno o mas de los Ad de simio de la invencion o con otro serotipo de Ad que puede ser de origen humano o no humano. Dicho Ad puede ser obtenido a partir de una diversidad de fuentes que incluyen la ATCC, fuentes comerciales o academicas, o pueden obtenerse las secuencias del Ad a partir del GenBank o de otras fuentes adecuadas.
Se proporcionan las secuencias de aminoacidos de la protema pentona del SAdV-28 (SEQ ID NO: 6), del SAdV-27 (SEQ ID NO: 44), del SAdV-29 (SEQ ID NO: 76), del SAdV-32 (SEQ ID NO: 108), del SAdV-33 (SEQ ID NO: 139) y del SAdV-35 (SEQ ID NO: 171). Adecuadamente, estas protemas pentona, o fragmentos unicos de las mismas, pueden utilizarse con diversos fines. Algunos ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la pentona que tiene truncamientos N-terminales y/o C-terminales de aproximadamente 50, 100, 150 o 200 aminoacidos, basados en la numeracion de los aminoacidos proporcionada anteriormente y en las SEQ ID NO: 6, 44, 76, 108, 139 y 171, respectivamente. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos internos mas cortos, C-terminales o N- terminales. Ademas, la protema pentona puede ser modificada para una diversidad de fines conocidos por los expertos en la materia.
Tambien se proporcionan las secuencias de aminoacidos de la protema hexona del SAdV-28 [SEQ ID NO: 11], del SAdV-27 (SEQ ID NO: 49), del SAdV-29 (SEQ ID NO: 81), del SAdV-32 (SEQ ID NO: 113), del SAdV-33 (SEQ ID NO: 144) y del SAdV-35 (SEQ ID NO: 176). Adecuadamente, estas protemas hexona, o fragmentos unicos de las mismas, pueden utilizarse para diversos fines. Algunos ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la hexona que tiene truncamientos N-terminales y/o C-terminales de aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 aminoacidos, basados en la numeracion de los aminoacidos proporcionada anteriormente y en las SEQ ID NO: 11,
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49, 81, 113, 144 o 176, respectivamente. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos internos mas cortos, C- terminales o N-terminales. Por ejemplo, un fragmento adecuado es la region de bucle (dominio) de la protema hexona, denominada DE1 y FG1, o una region hipervariable de la misma. Dichos fragmentos incluyen las regiones que abarcan los residuos de aminoacidos desde aproximadamente el aminoacido 125 hasta el 443; desde aproximadamente el 138 hasta el 441, o fragmentos menores, tales como aquellos que abarcan desde aproximadamente el residuo 138 hasta el residuo 163; desde aproximadamente el 170 hasta aproximadamente el 176; desde aproximadamente el 195 hasta aproximadamente el 203; desde aproximadamente el 233 hasta aproximadamente el 246; desde aproximadamente el 253 hasta aproximadamente el 264; desde aproximadamente el 287 hasta aproximadamente el 297; y desde aproximadamente el 404 hasta aproximadamente el 430 de las protemas hexonas de simio, con referencia a las SEQ ID NO: 11, 49, 81, 113, 144 o 176, respectivamente. Otros fragmentos adecuados pueden ser facilmente identificados por el experto en la materia. Ademas, la protema hexona puede ser modificada para una diversidad de fines conocidos por los expertos en la materia. Debido a que la protema hexona es el determinante del serotipo de un adenovirus, dichas protemas hexonas artificiales danan como resultado adenovirus con unos serotipos artificiales. Tambien pueden construirse otras protemas de la capside artificiales mediante el uso de de las secuencias de la pentona del Ad de chimpance y/o de las secuencias de la fibra de la invencion y/o de fragmentos de las mismas.
En una alternativa puede generarse un adenovirus que tiene una protema hexona alterada mediante la utilizacion de las secuencias de una protema hexona del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35. Un metodo adecuado para alterar las protemas hexonas se describe en la Patente de Estados Unidos 5.922.315. En este metodo se cambia al menos una region de bucle de la hexona del adenovirus por al menos una region de bucle de otro serotipo de adenovirus. Por lo tanto, al menos una region de bucle de dicha protema hexona de adenovirus alterada es una region de bucle de la hexona del Ad de simio SAdV-28 (o como alternativa, del SAdV- 27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35). En una alternativa, una region de bucle de la protema hexona del SAdV-28 (o como alternativa, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35) es sustituida por una region de bucle de otro serotipo de adenovirus. En otra alternativa, se usa la region de bucle de la hexona del SAdV-28 (o como alternativa, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35) para sustituir una region de bucle de otro serotipo de adenovirus. Los serotipos de adenovirus adecuados pueden seleccionarse facilmente entre serotipos humanos y no humanos, segun se describe en el presente documento. La seleccion de un serotipo adecuado no es una limitacion de la presente invencion. Otros usos mas de las secuencias de la protema hexona del SAdV-28 (o como alternativa, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 o del SAdV-35) seran facilmente apreciables por los expertos en la materia.
Las secuencias de aminoacidos de las protemas de fibra del SAdV-28 [SEQ ID NO: 21], del SAdV-27[SEQ ID NO: 59], del SAdV-29 [SEQ ID NO: 91], del SAdV-32 [SEQ ID NO: 123], del SAdV-33 [SEQ ID NO: 154] o del SAdV-35 [sEq ID NO: 185]. Adecuadamente, esta protema de fibra, o fragmentos unicos de la misma, pueden ser utilizados para diversos fines. Un fragmento adecuado es la fibra knob, ubicada en las SEQ ID NO: 21, 59, 91, 123, 154 o 185. Algunos ejemplos de otros fragmentos adecuados incluyen la fibra que tiene truncamientos N-terminales y/o C- terminales de aproximadamente 50, 100, 150 o 200 aminoacidos, basados en la numeracion de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NO: 21, 59, 91, 123, 154 o 185. Otros fragmentos adecuados mas incluyen fragmentos internos. Ademas, la protema de fibra puede ser modificada mediante el uso de una diversidad de tecnicas conocidas por los expertos en la materia.
Los fragmentos unicos de las protemas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 tienen al menos 8 aminoacidos de longitud. Sin embargo, pueden utilizarse facilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Ademas, en el presente documento se proporcionan modificaciones que pueden ser introducidas para mejorar el rendimiento y/o la expresion de un producto genico del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35, por ejemplo, la construccion de una molecula de fusion en la que la totalidad o un fragmento del producto genico del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV- 33 y/o del SAdV-35 esta fusionado (tanto directamente como a traves de un conector) con un companero de fusion para mejorar. Otras modificaciones adecuadas incluyen, sin limitacion, el truncamiento de una region codificante (por ejemplo, de una protema o de una enzima) para eliminar una pre- o una pro-protema habitualmente escindida y para proporcionar la protema o la enzima madura, y/o la mutacion de una region codificante para proporcionar un producto genico secretable. Otras modificaciones mas seran facilmente apreciables por el experto en la materia. Adicionalmente estan englobadas las protemas que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 99 % con las protemas del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 proporcionadas en el presente documento.
Segun se describe en el presente documento, los vectores de la invencion que contienen las protemas adenovmcas de la capside del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 son particularmente muy adecuados para su uso en las aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la eficacia de otros vectores basados en el serotipo del Ad, asf como de otros vectores vmcos. Los vectores de rAd son particularmente ventajosos en la repeticion de administraciones para la terapia genica de repeticion o para el refuerzo de la respuesta inmunitaria (tftulos de vacuna).
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En ciertas circunstancias puede ser deseable el uso de uno o mas de los productos genicos del SAdV28, del SAdV- 27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 (por ejemplo, de una protema de la capside o de un fragmento de la misma) para generar un anticuerpo. El termino "un anticuerpo”, segun se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de inmunoglobulina que es capaz de unirse espedficamente a un epttopo. Los anticuerpos pueden existir en diversas formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales de alta afinidad, anticuerpos monoclonales, anticuerpos sinteticos, anticuerpos quimericos, anticuerpos recombinantes y anticuerpos humanizados. Dichos anticuerpos proceden de las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
Dichos anticuerpos pueden ser generados mediante el uso de cualquiera de los diversos metodos conocidos en la materia. Los anticuerpos adecuados pueden ser generados mediante tecnicas convencionales bien conocidas, por ejemplo, la de Kohler y Milstein y las muchas modificaciones conocidas de la misma. De forma analoga se generan anticuerpos de tftulo alto deseables mediante la aplicacion de las tecnicas recombinantes conocidas a los anticuerpos monoclonales o policlonales desarrollados contra estos antfgenos [vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT n° PCT/GB85/o0392; la Publicacion de Solicitud de Patente Britanica n° GB2188638A; Amit et al., 1986 Science, 233: 747-753; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033; la Solicitud de Patente PCT n° PCT/WO9007861; y Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Huse et al., 1988a Science, 246: 1275-1281]. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser producidos mediante la manipulacion de las regiones determinantes de la complementariedad de anticuerpos animales o humanos contra el antfgeno de esta invencion. Vease, por ejemplo, E. Mark y Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", capftulo 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (junio de 1994); Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y Bird et al., 1988, Science 242: 423-426. La presente invencion proporciona adicionalmente anticuerpos anti-idiotfpicos (Ab2) y anticuerpos anti-anti-idiotfpicos (Ab3). Vease, por ejemplo, M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by antiidiotypic antibodies" en Idiotypic Network and Diseases, ed. por J. Cerny y J. Hiernaux, 1990 J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC: paginas 203-229]. Estos anticuerpos anti-idiotfpicos y anti- anti-idiotfpicos son producidos mediante el uso de tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos anticuerpos pueden usarse para diversos fines, incluyendo metodos diagnosticos y clmicos, y kits.
En ciertas circunstancias puede ser deseable la introduccion de un marcador o de una etiqueta detectable en un producto genico del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35, en un anticuerpo o en otra construccion. Segun se usa en el presente documento, un marcador detectable es una molecula que es capaz, sola o despues de la interaccion con otra molecula, de proporcionar una senal detectable. Lo mas deseable es que el marcador sea detectable visualmente, por ejemplo, mediante fluorescencia, para su uso inmediato en analisis inmunohistoqmmicos o en microscopfa inmunofluorescente. Por ejemplo, algunos marcadores adecuados incluyen isotiocianato de fluorescema (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), corifosfina-O (CPO) o colorantes en tandem, PE-cianina-5 (PC5) y PE-Rojo Texas (ECD). Todos estos colorantes fluorescentes estan disponibles en el mercado, y sus usos son conocidos en la tecnica. Otros marcadores utiles incluyen un marcador de oro coloidal. Otros marcadores utiles mas incluyen compuestos o elementos radioactivos. Adicionalmente, los marcadores incluyen una diversidad de sistemas enzimaticos que operan para revelar una senal colorimetrica en un ensayo, por ejemplo, la oxidasa de glucosa (que utiliza glucosa como sustrato) libera peroxido como producto que, en presencia de peroxidasa y de un donante de hidrogeno tal como tetrametil benzidina (TMB), produce TMB oxidada que se observa como un color azul. Otros ejemplos incluyen peroxidasa de rabano picante (hRp), fosfatasa alcalina (AP) y hexocinasa junto con deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato que reacciona con el ATP, la glucosa y el NAD+ para producir, entre otros productos, NADH, que es detectado como un aumento en la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm.
Otros sistemas de marcaje que se utilizan en los metodos descritos en el presente documento son detectables mediante otros medios, por ejemplo, se usan micropartmulas de latex coloreadas [Bangs Laboratories, Indiana] en las que se incluye un colorante en lugar de enzimas para formar conjugados con las secuencias objetivo, para proporcionar una senal visual indicativa de la presencia del complejo resultante en los ensayos aplicables.
Los metodos para el acoplamiento o la asociacion del marcador con una molecula deseada son similarmente convencionales y conocidos por los expertos en la materia. Se describen metodos conocidos para la union de marcadores [vease, por ejemplo, Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals, 6a Ed., R. P. M. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Life Science and Analytical Research Products, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1994/1995]. Por lo tanto, la seleccion del marcador y de los metodos de acoplamiento no limita esta invencion.
Las secuencias, las protemas y los fragmentos del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden ser producidos mediante cualquier medio adecuado, incluyendo una produccion recombinante, una smtesis qrnmica u otros medios sinteticos. Las tecnicas de produccion adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, tambien pueden sintetizarse peptidos mediante metodos de smtesis de peptidos en fase solida bien conocidos (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) paginas 27-62). Estos y
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otros metodos de produccion adecuados estan en el conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitacion de la presente invencion.
Ademas, el experto en la materia comprendera facilmente que las secuencias del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV- 29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden adaptarse con facilidad para su uso en una diversidad de sistemas de vectores vmcos y no vmcos para la administracion in vitro, ex vivo o in vivo de moleculas terapeuticas e inmunogenas. Por ejemplo, en una alternativa se usan las protemas de la capside del Ad de simio y otras protemas de adenovirus de simio descritas en el presente documento para la administracion no vmca basada en protemas de genes, de protemas y de otras moleculas diagnosticas, terapeuticas e inmunogenas deseables. En dicha alternativa se une una protema de la invencion, directa o indirectamente, a una molecula para su direccionamiento a las celulas con un receptor para adenovirus. Preferiblemente, para dicho direccionamiento se selecciona una protema de la capside tal como una hexona, un pentona, una fibra o un fragmento de las mismas que tiene un ligando para un receptor de la superficie celular. Las moleculas adecuadas para su administracion se seleccionan entre las moleculas terapeuticas descritas en el presente documento y sus productos genicos. Como conectores puede utilizarse una diversidad de conectores que incluyen lfpidos, poliLys, y similares. Por ejemplo, la protema pentona de simio puede utilizarse facilmente para dicho fin mediante la produccion de una protema de fusion mediante el uso de las secuencias de la pentona de simio de una manera analoga a la descrita en Medina-Kauwe LK, et al., Gene Ther. Mayo de 2001; 8 (10): 795-803 y en Medina-Kauwe LK, et al., Gene Ther. Diciembre de 2001; 8 (23): 1753-1761. Alternativamente, pueden utilizarse las secuencias de aminoacidos de la protema IX del Ad de simio para el direccionamiento de vectores a un receptor de la superficie celular, segun se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20010047081. Algunos ligandos adecuados incluyen un antfgeno CD40, una secuencia que contiene RGD o que contiene polilisina, y similares. Otras protemas de Ad de simio mas, incluyendo, por ejemplo, la protema hexona y/o la protema de fibra, pueden usarse para estos fines y similares.
Otras protemas adenovmcas mas del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden usarse, solas o junto con otra protema adenovmca, para diversos fines que seran facilmente apreciables por el experto en la materia. Ademas, otros usos mas para las protemas adenovmcas del SAdV-28 seran facilmente apreciables por el experto en la materia.
II. Los vectores adenovmcos recombinantes
Las composiciones descritas en el presente documento incluyen vectores que administran una molecula heterologa a las celulas, tanto con fines terapeuticos como de vacuna. Segun se usa en el presente documento, un vector puede incluir cualquier elemento genetico, incluyendo, sin limitacion, ADN desnudo, un fago, un transposon, un cosmido, un episoma, un plasmido o un virus. Dichos vectores contienen ADN de adenovirus de simio del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 y un minigen. Por "minigen" o "casete de expresion" se entiende la combinacion de un gen heterologo seleccionado y de los demas elementos reguladores necesarios para dirigir la traduccion, la transcripcion y/o la expresion del producto genico en una celula hospedadora.
Normalmente, un vector adenovmco derivado del SAdV se disena de tal forma que el minigen este ubicado en una molecula de acido nucleico que contiene otras secuencias adenovmcas en la region nativa de un gen adenovmco seleccionado. El minigen puede ser insertado en una region genica existente para disrumpir la funcion de esa region, si se desea. Alternativamente, el minigen puede ser insertado en el sitio de un gen adenovmco parcial o completamente delecionado. Por ejemplo, el minigen puede estar ubicado en un sitio tal como el sitio de una delecion funcional E1 o de una delecion funcional e3, entre otras que pueden ser seleccionadas. El termino “delecionado funcionalmente" o "delecion funcional" significa que se elimina una cantidad suficiente de la region del gen o se dana de otro modo, por ejemplo, mediante una mutacion o una modificacion, de forma que la region del gen ya no es capaz de producir productos de expresion genica funcionales. Si se desea, puede eliminarse la totalidad de la region del gen. Otros sitios adecuados para una disrupcion o una delecion genica son analizados en cualquier parte de la solicitud.
Por ejemplo, para un vector de produccion util para la generacion de un virus recombinante, el vector puede contener el minigen y bien el extremo 5' del genoma adenovmco o bien el extremo 3' del genoma adenovmco, o ambos extremos 5' y 3' del genoma adenovmco. El extremo 5' del genoma adenovmco contiene los elementos en cis en 5' necesarios para el empaquetamiento y la replicacion; es decir, las secuencias de repeticion terminal invertida en 5' (ITR) (que funcionan como ongenes de replicacion) y los dominios potenciadores del empaquetamiento nativos en 5' (que contienen las secuencias necesarias para el empaquetamiento de los genomas del Ad lineales y los elementos potenciadores para el promotor E1). El extremo 3' del genoma adenovmco incluye los elementos en cis en 3' (incluyendo las ITR) necesarios para el empaquetamiento y la encapsidacion. Adecuadamente, un adenovirus recombinante contiene ambos elementos adenovmcos en cis en 5' y en 3', y el minigen esta ubicado entre las secuencias adenovmcas en 5' y en 3'. Un vector adenovmco basado en el SAdV-28, en el SAdV-27, en el SAdV-29, en el SAdV-32, en el SAdV-33 y/o en el SAdV-35 tambien puede contener secuencias adenovmcas adicionales.
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Adecuadamente, estos vectores adenovmcos basados en el SAdV-28, en el SAdV-27, en el SAdV-29, en el SAdV- 32, en el SAdV-33 y/o en el SAdV-35 contienen uno o mas elementos adenovmcos derivados del genoma adenovmco. En una alternativa, los vectores contienen las ITR adenovmcas del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 y secuencias adenovmcas adicionales del mismo serotipo de adenovirus. En otra alternativa, los vectores contienen las secuencias adenovmcas que derivan de un serotipo de adenovirus diferente al que proporciona las ITR.
Segun se define en el presente documento, un adenovirus pseudotipado se refiere a un adenovirus en el que la protema de la capside del adenovirus es de un adenovirus diferente al adenovirus que proporciona las ITR.
Ademas, pueden construirse adenovirus quimericos o tnbridos mediante el uso de los adenovirus descritos en el presente documento mediante el uso de tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, el documento US 7.291.498.
La seleccion de la fuente adenovmca de las ITR y de la fuente de cualquier otra secuencia adenovmca presente en el vector no es una limitacion de la presente invencion. Hay disponible una diversidad de cepas de adenovirus en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, o disponible bajo demanda en una diversidad de fuentes comerciales e institucionales. Ademas, las secuencias de muchas de dichas cepas estan disponibles en una diversidad de base de datos que incluyen, por ejemplo, PubMed y GenBank. En la bibliograffa publicada se describen vectores de adenovirus homologos preparados a partir de otros adenovirus de simio o de humano [vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 5.240.846]. Las secuencias de ADN de diversos tipos de adenovirus estan disponibles en el GenBank, incluyendo el tipo Ad5 [n° de registro del GenBank M73260]. Las secuencias de los adenovirus pueden obtenerse a partir de cualquier serotipo de adenovirus conocido, tal como los serotipos 2, 3, 4, 7, 12 y 40, y que incluyen adicionalmente cualquiera de los tipos humanos actualmente identificados. De forma analoga tambien pueden emplearse adenovirus que se sabe que infectan a animales no humanos (por ejemplo, a simios) en las construcciones de vector de esta invencion. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 6.083.716.
Las secuencias vmcas, los virus colaboradores (si fueran necesarios) y las partfculas vmcas recombinantes, y los demas componentes y secuencias del vector empleados en la construccion de los vectores descritos en el presente documento, se obtienen como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de ADN del adenovirus de simio SAdV28 de la invencion se emplean para la construccion de vectores y de lmeas celulares utiles en la preparacion de dichos vectores.
Pueden generarse modificaciones en las secuencias de acidos nucleicos que forman los vectores descritos en el presente documento, incluyendo deleciones, inserciones y otras mutaciones en la secuencia, mediante el uso de las tecnicas de biologfa molecular habituales, y tambien son de interes.
A. El "minigen"
Los metodos empleados para la seleccion del transgen, la clonacion y la construccion del "minigen", y su insercion en el vector vmco, estan en la pericia de la tecnica, dadas las ensenanzas proporcionadas en el presente documento.
1. El transgen
El transgen es una secuencia de acidos nucleicos, heterologa de las secuencias del vector que flanquean el transgen, que codifica un polipeptido, una protema u otro producto de interes. La secuencia codificante del acido nucleico esta unida operativamente a los componentes reguladores de una forma que permite la transcripcion, la traduccion y/o la expresion del transgen en una celula hospedadora.
La composicion de la secuencia del transgen dependera del uso que se le dara al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia del transgen incluye una secuencia indicadora, que tras su expresion produce una senal detectable. Dichas secuencias indicadoras incluyen, sin limitacion, secuencias de ADN que codifican la p-lactamasa, la p-galactosidasa (LacZ), la fosfatasa alcalina, la cinasa de timidina, la protema fluorescente verde (GFP), la acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT), la luciferasa, las protemas unidas a la membrana, incluyendo, por ejemplo, la CD2, la CD4, la CD8, la protema hemaglutinina de la gripe, y otras bien conocidas en la materia, contra las que existen o pueden ser producidos anticuerpos de alta afinidad mediante medios convencionales, y protemas de fusion que comprenden una protema unida a la membrana apropiadamente fusionada con un dominio de etiqueta de antfgeno de, entre otras, la hemaglutinina o la Myc. Cuando estas secuencias codificantes estan asociadas con los elementos reguladores que dirigen su expresion, proporcionan senales detectables mediante medios convencionales que incluyen ensayos enzimaticos, radiograficos, colorimetricos, de fluorescencia u otros en ensayos espectrograficos, ensayos de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia y ensayos inmunologicos, incluyendo un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) y una inmunohistoqmmica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector portador de la senal es detectada mediante ensayos de actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgen es el de la GFP
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o la luciferasa, el vector portador de la senal puede medirse visualmente mediante la produccion de color o de luz con un luminometro.
En una realizacion, el transgen es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es util en biologfa y en medicina, tal como protemas, peptidos, ARN, enzimas o ARN catalfticos. Algunas moleculas de ARN deseables incluyen ARNt, ARNbc, ARN ribosomico, ARN catalfticos y ARN antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN util es una secuencia que extingue la expresion de una secuencia de acidos nucleicos objetivo en el animal tratado.
El transgen puede usarse para el tratamiento de, por ejemplo, deficiencias geneticas, como una terapia o una vacuna contra el cancer, para la induccion de una respuesta inmunitaria y/o con fines profilacticos de vacuna. Segun se usa en el presente documento, la induccion de una respuesta inmunitaria se refiere a la capacidad de una molecula (por ejemplo, de un producto genico) de inducir una respuesta inmunitaria y/o humoral en los linfocitos T frente a la molecula. La invencion incluye adicionalmente el uso de multiples transgenes, por ejemplo, para corregir o mejorar una afeccion causada por una protema multi-subunidad. En ciertas situaciones puede usarse un transgen diferente para codificar cada subunidad de una protema, o para codificar diferentes peptidos o protemas. Esto es deseable cuando el tamano del ADN que codifica la subunidad de la protema es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o una protema distrofina. Con objeto de que la celula produzca la protema multi-subunidad, se infecta una celula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, las diferentes subunidades de una protema pueden estar codificadas por el mismo transgen. En este caso, un unico transgen incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, estando el ADN de cada subunidad separado por un sitio interno de entrada de ribozima (IRES). Esto es deseable cuando el tamano del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeno, por ejemplo, el tamano total del ADN que codifica las subunidades y el IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un peptido 2A, que se autoescinde en un acontecimiento post-traduccional. Vease, por ejemplo, M. L. Donnelly, et al., J. Gen. Virol., 78 (Pt 1): 13-21 (enero de 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8 (11): 864-873 (junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8 (10): 811-817 (mayo de 2001). Este peptido 2A es significativamente menor que un IRES, lo que lo hace muy apropiado para su uso cuando el espacio es un factor limitante. Sin embargo, el transgen seleccionado puede codificar cualquier producto activo biologicamente u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para un estudio.
Los transgenes adecuados pueden ser facilmente seleccionados por el experto en la materia. La seleccion del transgen no se considera una limitacion de esta realizacion.
2. Elementos reguladores
Ademas de los elementos principales identificados anteriormente para el minigen, el vector tambien incluye los elementos de control convencionales necesarios que estan unidos operativamente al transgen de una forma que permita su transcripcion, su traduccion y/o su expresion en una celula transfectada con el vector de plasmido o infectada con el virus producido por la invencion. Segun se usa en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen secuencias tanto de control de la expresion que son contiguas al gen de interes como secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a distancia para controlar el gen de interes.
Las secuencias de control de expresion incluyen las apropiadas secuencias de inicio de la transcripcion, de terminacion, promotoras y potenciadoras; senales de procesado eficiente del ARN tales como senales de empalme y de poliadenilacion (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmatico; secuencias que mejoran la eficacia de la traduccion (es decir, secuencias consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de la protema; y, cuando se desee, secuencias que mejoran la secrecion del producto codificado.
En la materia se conoce y puede utilizarse un gran numero de secuencias de control de la expresion, incluyendo promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o espedficos tisulares. Algunos ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitacion, el promotor del virus del sarcoma de Rous retrovmco (RSV) LTR (opcionalmente con el potenciador del RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador del CMV) [vease, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521 -530 (1985)], el promotor del SV40, el promotor de la reductasa de dihidrofolato, el promotor de la actina p, el promotor de la cinasa de fosfoglicerol (PGK) y el promotor EF1a [Invitrogen].
Los promotores inducibles permiten la regulacion de la expresion genica y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados de forma exogena, factores ambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiologico espedfico, por ejemplo, una fase aguda, un estado de diferenciacion en particular de la celula o unicamente en celulas en replicacion. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles estan disponibles en diversas fuentes comerciales que incluyen, sin limitacion, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito otros muchos sistemas y pueden ser facilmente seleccionados por el experto en la materia. Por ejemplo, algunos promotores inducibles incluyen el promotor de la metalotionina (MT) de oveja inducible con cinc y el promotor del virus del tumor de mama de raton (MMTV) inducible con dexametasona (Dex). Otros sistemas inducibles incluyen el sistema promotor de la polimerasa T7 [documento WO 98/10088]; el promotor de insecto de la ecdisona [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], un sistema reprimible con tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad.
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Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], un sistema inducible con tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), vease tambien Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)]. Otros sistemas incluyen el dfmero FK506, VP16 o p65 mediante el uso de castradiol, difenol murislerona, el sistema inducible con RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible con rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. La eficacia de algunos promotores inducibles aumenta con el tiempo. En dichos casos se puede mejorar la eficacia de dichos sistemas mediante la insercion de multiples represores en tandem, por ejemplo, TetR unido a TetR mediante un IRES. Alternativamente, se pueden esperar al menos 3 dfas antes del cribado de la funcion deseada. Se puede mejorar la expresion de las protemas deseadas mediante medios conocidos para mejorar la eficacia del sistema. Por ejemplo, mediante el uso del elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck (WPRE).
En otra realizacion se usara el promotor nativo del transgen. El promotor nativo puede ser preferido cuando se desea que la expresion del transgen mimetice la expresion nativa. El promotor nativo puede usarse cuando la expresion del transgen debe ser regulada de forma temporal o con el desarrollo, de una forma espedfica segun el tejido o en respuesta a un estfmulo transcripcional espedfico. En una realizacion adicional tambien pueden usarse otros elementos de control de la expresion nativos, tales como elementos mejoradores, sitios de poliadenilacion o secuencias consenso de Kozak para mimetizar la expresion nativa.
Otra realizacion del transgen incluye un transgen unido operativamente a un promotor espedfico tisular. Por ejemplo, si se desea la expresion en el musculo esqueletico, debena usarse un promotor activo en el musculo. Estos incluyen los promotores de los genes que codifican la actina p esqueletica, la cadena ligera de la miosina 2A, la distrofina, la cinasa de creatina muscular, asf como promotores musculares sinteticos con unas actividades mayores que los promotores naturales (vease Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Se conocen algunos ejemplos de promotores que son espedficos del tejido para el tugado (albumina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); el promotor del nucleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); la alfa-fetoprotema (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), la osteocalcina osea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); la sialoprotema osea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), los linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); la cadena pesada de la inmunoglobulina; la cadena del receptor de los linfocitos T), promotores neuronales tales como la enolasa espedfica neuronal (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), el gen de la cadena ligera de un neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)) y el gen del vgf espedfico neuronal (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
Opcionalmente, los vectores portadores de transgenes que codifican productos terapeuticamente utiles o inmunogenos tambien pueden incluir marcadores seleccionables o genes indicadores pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geneticina, a la higromicina o a la purimicina, entre otras. Dichos genes indicadores o marcadores seleccionables (ubicados preferentemente fuera del genoma vmco para ser empaquetados en una partmula vmca) pueden usarse para senalizar la presencia de los plasmidos en las celulas bacterianas, tal como la resistencia a la ampicilina. Otros componentes del vector pueden incluir un origen de replicacion. La seleccion de estos y de otros promotores y elementos del vector son convencionales y hay disponibles muchas otras de dichas secuencias [vease, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias mencionadas en el mismo].
Estos vectores son generados mediante el uso de las tecnicas y las secuencias proporcionadas en el presente documento, junto con las tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Dichas tecnicas incluyen tecnicas de clonacion convencionales del ADNc tales como las descritas en los textos [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY], el uso de secuencias de oligonucleotidos solapantes de los genomas del adenovirus, una reaccion en cadena de la polimerasa y cualquier metodo adecuado que proporcione la secuencia de nucleotidos deseada.
III. Produccion del vector vmco
En una realizacion, se usan los plasmidos adenovmcos de simio (u otros vectores) para la produccion de vectores adenovmcos. En una realizacion, los vectores adenovmcos son partfculas adenovmcas que tienen una replicacion defectuosa. En una realizacion, la replicacion defectuosa de las partmulas adenovmcas se consigue mediante deleciones en los genes E1a y/o E1b. Alternativamente, la replicacion defectuosa en los adenovirus se consigue mediante otro medio, conservando opcionalmente los genes E1a y/o E1b. Los vectores adenovmcos tambien pueden contener otras mutaciones en el genoma adenovmco, por ejemplo, mutaciones sensibles a la temperatura o deleciones en otros genes. En otras realizaciones, es deseable conservar una region E1a y/o E1b intacta en los vectores adenovmcos. Dicha region E1 intacta puede estar ubicada en su localizacion nativa en el genoma adenovmco o colocada en el sitio de una delecion del genoma adenovmco nativo (por ejemplo, en la region E3).
En la construccion de vectores adenovmcos de simio utiles para la administracion de un gen a una celula humana (o de otro mamffero), puede emplearse un amplio abanico de secuencias de acidos nucleicos adenovmcas en los vectores. Por ejemplo, puede eliminarse la totalidad o una porcion del gen temprano retardado del adenovirus E3 en la secuencia del adenovirus de simio que forma parte del virus recombinante. Se cree que la funcion del E3 de simio es irrelevante para la funcion y la produccion de las partfculas del virus recombinante. Los vectores adenovmcos de simio tambien pueden construirse con una delecion de al menos la region ORF6 del gen E4, y mas deseablemente,
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debido a la redundancia en la funcion de esta region, la totalidad de la region E4. Otro vector mas de esta invencion contiene una delecion en el gen temprano retardado E2a. Las deleciones tambien pueden realizarse en cualquiera de los genes tardms L1 hasta L5 del genoma del adenovirus de simio. De forma analoga, las deleciones en los genes intermedios IX y IVa2 pueden ser utiles para ciertos fines. Pueden realizarse otras deleciones en otros genes adenovmcos estructurales o no estructurales. Las deleciones analizadas anteriormente pueden usarse de forma individual, es decir, una secuencia adenovmca para su uso segun se describe en el presente documento puede contener deleciones en una unica region individual. Alternativamente, pueden usarse deleciones de genes completos o de porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biologica, en cualquier combinacion. Por ejemplo, en un ejemplo de vector, la secuencia adenovmca puede tener deleciones de los genes E1 y E4, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E3, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin la delecion del E3, y asf sucesivamente. Como se ha analizado anteriormente, dichas deleciones pueden usarse junto con otras mutaciones, tales como mutaciones sensibles a la temperatura, para conseguir un resultado deseado.
Puede cultivarse un vector adenovmco que carezca de cualquier secuencia adenovmca esencial (por ejemplo, E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 y L5) en presencia de los productos genicos adenovmcos ausentes, que son necesarios para la infectividad vmca y la propagacion de una partfcula adenovmca. Estas funciones colaboradoras pueden ser proporcionadas mediante el cultivo del vector adenovmco en presencia de una o mas construcciones colaboradoras (por ejemplo, un plasmido o un virus) o por una celula hospedadora de empaquetamiento. Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas para la preparacion de un vector Ad humano "mmimo" en la Solicitud de Patente Internacional WO96/13597, publicada el 9 de mayo de 1996.
1. Virus colaboradores
Por lo tanto, dependiendo del contenido del gen del adenovirus de simio de los vectores vmcos empleados para portar el minigen, puede ser necesario un adenovirus colaborador o un fragmento vmco no replicante para proporcionar las suficientes secuencias genicas del adenovirus de simio necesarias para producir una partfcula vmca recombinante infecciosa que contenga el minigen. Los virus colaboradores utiles contienen secuencias genicas del adenovirus seleccionadas que no estan presentes en la construccion del vector del adenovirus y/o que no son expresadas por la lmea celular de empaquetamiento en la que es transfectado el vector. En una realizacion, el virus colaborador tiene una replicacion defectuosa y contiene diversos genes del adenovirus ademas de las secuencias descritas anteriormente. Dicho virus colaborador se usa deseablemente junto con una lmea celular de expresion de E1.
Los virus colaboradores tambien pueden formarse en conjugados de polication segun se describe en Wu et al., J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de abril de 1994). El virus colaborador puede contener opcionalmente un segundo minigen indicador. Varios de dichos genes indicadores son conocidos en la tecnica. La presencia de un gen indicador en el virus colaborador que es diferente del transgen del vector adenovmco permite monitorizar independientemente el vector Ad y el virus colaborador. Este segundo indicador se usa para permitir la separacion entre el virus recombinante resultante y el virus colaborador despues de la purificacion.
2. Lmeas celulares complementarias
Para la generacion de adenovirus de simios (Ad) recombinantes con cualquiera de los genes delecionados descritos anteriormente, la funcion de la region genica delecionada, si es esencial para la replicacion y la infectividad del virus, debe ser aportada al virus recombinante por un virus colaborador o una lmea celular, es decir, una lmea celular de empaquetamiento o complementaria. En muchas circunstancias puede usarse una lmea celular que expresa el E1 humano para transcomplementar el vector Ad de chimpance. Esto es particularmente ventajoso porque, debido a la diversidad entre las secuencias Ad de chimpance de la invencion y las secuencias AdE1 humanas que se encuentran en las celulas de empaquetamiento disponibles actualmente, el uso de las actuales celulas que contienen el E1 humano previene la generacion de adenovirus con una replicacion competente durante el proceso de replicacion y de produccion. Sin embargo, en ciertas circunstancias, sera deseable la utilizacion de una lmea celular que exprese los productos genicos E1 y que pueda ser utilizada para la produccion de un adenovirus de simio con el E1 delecionado. Dichas lmeas celulares han sido descritas. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.083.716.
Si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en el presente documento para generar una celula o una lmea celular de empaquetamiento que exprese, como mmimo, el gen E1 del adenovirus del SAdV28 bajo el control transcripcional de un promotor para su expresion en una lmea celular parental seleccionada. Para este fin pueden emplearse promotores inducibles o constitutivos. Algunos ejemplos de dichos promotores se describen con detalle en cualquier parte de esta memoria descriptiva. Se selecciona una celula parental para la generacion de una nueva lmea celular que exprese cualquier gen del SAdV28 deseado. Sin limitacion, dicha lmea celular parental puede ser de celulas HeLa [n° de registro de la ATCC CCL 2], A549 [n° de registro de la ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72] y WI-38 [CCL 75], entre otras. Todas estas lmeas celulares estan disponibles en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201102209. Otras lmeas celulares parentales adecuadas pueden obtenerse en otras fuentes.
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Dichas lmeas celulares que expresan el E1 son utiles en la generacion de vectores recombinantes de adenovirus de simio con el E1 delecionado. Adicionalmente, o como alternativa, pueden construirse lmeas celulares que expresen uno o mas productos genicos adenovmcos de simio, por ejemplo, E1a, E1b, E2a, y/o E4 ORF6, mediante el uso esencialmente de los mismos procedimientos que los usados en la generacion de los vectores vmcos recombinantes de simio. Dichas lmeas celulares pueden ser utilizadas para transcomplementar vectores de adenovirus con los genes esenciales delecionados que codifican para esos productos, o para proporcionar las funciones colaboradoras necesarias para el empaquetamiento de un virus dependiente de un colaborador (por ejemplo, de virus adenoasociados). La preparacion de una celula hospedadora implica tecnicas tales como el ensamblaje de las secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede llevarse a cabo mediante la utilizacion de las tecnicas convencionales. Dichas tecnicas incluyen la clonacion de ADNc y genomico, que son bien conocidas y se describen en Sambrook et al., mencionado anteriormente, el uso de secuencias de oligonucleotidos solapantes de los genomas del adenovirus, combinado con una reaccion en cadena de la polimerasa, metodos sinteticos y cualquier otro metodo adecuado que proporcione la secuencia de nucleotidos deseada.
En otra alternativa mas se proporcionan los productos genicos adenovmcos esenciales en trans por parte del vector adenovmco o y/o del virus colaborador. En dicho caso puede seleccionarse una celula hospedadora adecuada entre cualquier organismo biologico, incluyendo celulas procariotas (por ejemplo, bacterias) y celulas eucariotas, incluyendo celulas de insecto, celulas de levadura y celulas de mairnfero. Las celulas hospedadoras particularmente deseables se seleccionan entre cualquier especie de marnffero, incluyendo, sin limitacion, celulas tales como celulas A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 o PERC6 (ambas de las cuales expresan el E1 adenovmco funcional) [Fallaux, FJ et al., (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, celulas L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y mioblastos derivados de mamfferos que incluyen seres humanos, mono, raton, rata, conejo y hamster. La seleccion de la especie de mamffero que proporcione las celulas no es una limitacion de esta invencion; ni tampoco lo es el tipo de celula de mamffero, es decir, fibroblasto, hepatocito, celula tumoral, etc.
3. Ensamblaje de la partmula vmca y transfeccion de una lmea celular
Generalmente, cuando se administra el vector que comprende el minigen mediante una transfeccion, el vector es administrado en una cantidad de desde aproximadamente 5 |jg hasta aproximadamente 100 |jg de ADN, y preferentemente de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 jg de ADN y desde aproximadamente 1 x 104 celulas hasta aproximadamente 1 x 1013 celulas, y preferentemente hasta aproximadamente 105 celulas. Sin embargo, las cantidades relativas del ADN del vector con respecto a las celulas hospedadoras pueden ajustarse teniendo en consideracion factores tales como el vector seleccionado, el metodo de administracion y las celulas hospedadoras seleccionadas.
El vector puede ser cualquier vector conocido en la materia o divulgado anteriormente, incluyendo ADN desnudo, un plasmido, un fago, un transposon, cosmidos, episomas, virus, etc. La introduccion en la celula hospedadora del vector puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido en la materia o segun se ha divulgado anteriormente, incluyendo una transfeccion y una infeccion. Uno o mas de los genes adenovmcos pueden ser integrados de forma estable en el genoma de la celula hospedadora, expresados de forma estable en forma de episomas, o expresados de forma temporal. Todos los productos genicos pueden ser expresados de forma temporal, en un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos genicos pueden ser expresados de forma estable mientras que otros son expresados de forma temporal. Adicionalmente, los promotores de cada uno de los genes adenovmcos pueden ser seleccionados independientemente entre un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor nativo adenovmco. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiologico espedfico del organismo o de la celula (es decir, por un estado de diferenciacion o celulas en replicacion o quiescentes) o por factores anadidos de forma exogena, por ejemplo.
La introduccion de las moleculas (en forma de plasmidos o de virus) en la celula hospedadora tambien puede llevarse a cabo mediante el uso de tecnicas conocidas por el artesano experto y segun se analiza lo largo de la memoria descriptiva. En las realizaciones preferidas, se usan las tecnicas de transfeccion habituales, por ejemplo, una transfeccion con CaPO4 o una electroporacion.
El ensamblaje de las secuencias de ADN seleccionadas del adenovirus (asf como del transgen y de otros elementos del vector en diversos plasmidos intermedios, y el uso de los plasmidos y de los vectores para producir una partmula vmca recombinante, se consiguen, todos, mediante el uso de tecnicas convencionales. Dichas tecnicas incluyen las tecnicas de clonacion convencionales del ADNc tales como las descritas en los textos [Sambrook et al., mencionado anteriormente], el uso de secuencias de oligonucleotidos solapantes de los genomas del adenovirus, una reaccion en cadena de la polimerasa, y cualquier metodo adecuado que proporcione la secuencia de nucleotidos deseada. Se emplean tecnicas de transfeccion y de cotransfeccion habituales, por ejemplo, tecnicas de precipitacion con CaPO4. Otros metodos convencionales empleados incluyen una recombinacion homologa de los genomas vmcos, el cultivo de los virus en una capa de agar, metodos para medir la generacion de la senal, y similares.
Por ejemplo, despues de la construccion y el ensamblaje del vector vmco que contiene el minigen deseado, el vector es transfectado in vitro en presencia de un virus colaborador en la lmea celular de empaquetamiento. Se produce una recombinacion homologa entre las secuencias del colaborador y del vector, que permite que las secuencias
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transgenicas del adenovirus del vector sean replicadas y empaquetadas en capsides de viriones, dando como resultado las partteulas del vector vmco recombinante. El metodo actual para la produccion de dichas partteulas vmcas esta basado en la transfeccion. Sin embargo, la invencion no esta limitada a dichos metodos.
Estos adenovirus de simio recombinantes resultantes son utiles en la transferencia de un transgen seleccionado a una celula seleccionada. En los experimented in vivo con el virus recombinante cultivado en las lmeas celulares de empaquetamiento, los vectores adenovmcos recombinantes de simio con el E1 delecionado de la invencion muestran utilidad en la transferencia de un transgen a una celula que no es de simio, preferentemente de un ser humano.
IV. Uso de los vectores adenovmcos recombinantes
Los vectores recombinantes basados en el SAdV-28, en el SAdV-27, en el SAdV-29, en el SAdV-32, en el SAdV-33 y/o en el SAdV-35 son utiles para la transferencia genica a un paciente humano o veterinario no simio in vitro, ex vivo e in vivo.
Los vectores adenovmcos recombinantes descritos en el presente documento pueden usarse como vectores de expresion para la produccion de los productos codificados por los genes heterologos in vitro. Por ejemplo, los adenovirus recombinantes que contienen un gen insertado en la ubicacion de una delecion E1 pueden ser transfectados en una lmea celular que expresa el E1 como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, pueden usarse adenovirus de replicacion competente en otra lmea celular seleccionada. Las celulas transfectadas se cultivan despues de la forma convencional, permitiendo que el adenovirus recombinante exprese el producto genico a partir del promotor. Despues, el producto genico puede ser recuperado del medio de cultivo mediante los metodos convencionales conocidos de aislamiento y recuperacion de protemas a partir de un cultivo.
Un vector adenovmco recombinante de simio derivado del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 proporciona un vehteulo de transferencia genica eficaz que puede administrar un transgen seleccionado a una celula hospedadora seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes contra uno o mas serotipos del AAV. En una alternativa, el rAAV y las celulas se mezclan ex vivo; las celulas infectadas se cultivan mediante el uso de las metodologfas convencionales; y las celulas transducidas son reinfundidas al paciente. Estas composiciones son particularmente adecuadas para la administracion de genes para fines terapeuticos y para una inmunizacion, incluyendo la induccion de una inmunidad protectora.
Mas habitualmente, los vectores adenovmcos recombinantes del SAdV28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 se utilizaran para la administracion de moleculas terapeuticas o inmunogenas, como se describe a continuacion. Para mas aplicaciones se comprendera facilmente que los vectores adenovmcos recombinantes son particularmente adecuados para su uso en regfmenes que implican la administracion repetida de vectores adenovmcos recombinantes. Dichos regfmenes implican normalmente la administracion de una serie de vectores vmcos en los que las capsides vmcas estan alternadas. Las capsides vmcas pueden ser modificadas en cada administracion posterior, o despues de un numero preseleccionado de administraciones de una capside de un serotipo en particular (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o mas). Por lo tanto, un regimen puede implicar la administracion de un rAd con una primera capside de simio, la administracion de un rAd con una segunda capside de simio, y la administracion con una tercera capside de simio. Una diversidad de otros regfmenes que usan las capsides Ad solas, una junto con otra o junto con otros adenovirus (que preferentemente no son reactivos cruzados inmunologicamente) seran evidentes para los expertos en la materia. Opcionalmente, dicho regimen puede implicar la administracion de los rAd con capsides de otros adenovirus de primates no humanos, de adenovirus humanos o de secuencias artificiales tales como las que se describen en el presente documento. Cada fase del regimen puede implicar la administracion de una serie de inyecciones (o de otras vfas de administracion) con una untea capside de Ad seguida de en una serie con otra capside de una fuente de Ad diferente. Alternativamente, los vectores del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden ser utilizados en regfmenes que implican otros sistemas de administracion no mediados por adenovirus, que incluyen otros sistemas vmcos, sistemas de administracion no vmcos, protema, peptidos y otras moleculas biologicamente activas.
Las siguientes secciones se centraran en ejemplos de moleculas que pueden ser administradas a traves de los vectores adenovmcos de la invencion.
A. Administracion mediada por Ad de moleculas terapeuticas
En una alternativa, los vectores recombinantes descritos anteriormente son administrados a seres humanos segun los metodos publicados para una terapia genica. Un vector vmco de simio portador del transgen seleccionado puede ser administrado a un paciente, preferentemente suspendido en una solucion biologicamente compatible o en un vehteulo de administracion farmaceuticamente aceptable. Un vehteulo adecuado incluye solucion salina esteril. Para este fin pueden emplearse otras soluciones de inyeccion esteriles isotonicas acuosas y no acuosas, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas conocidas por ser portadores farmaceuticamente aceptables y bien conocidas por los expertos en la materia.
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Los vectores adenovmcos de simio son administrados en unas cantidades suficientes para transducir las celulas objetivo y para proporcionar unos niveles suficientes de transferencia y expresion genica para proporcionar un beneficio terapeutico sin unos excesivos efectos adversos fisiologicos medicamente aceptables, que pueden ser determinados por los expertos en el arte medico. Las vfas de administracion convencionales y farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, una administracion directa en la retina y otros metodos de administracion intraocular, la administracion directa en el hugado, la inhalacion, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutanea, intradermica, rectal, oral y otras vfas de administracion parenterales. Las vfas de administracion pueden combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del transgen o de la afeccion. La via de administracion dependera principalmente de la naturaleza de la afeccion que se va a tratar.
Las dosis del vector vmco dependeran principalmente de factores tales como la afeccion que se va a tratar, la edad, el peso y la salud del paciente, y por lo tanto pueden variar dependiendo del paciente. Por ejemplo, una dosis terapeuticamente eficaz para un ser humano adulto o veterinaria del vector vmco esta generalmente en el intervalo de desde aproximadamente 100 pl hasta aproximadamente 100 ml de un portador que contiene unas concentraciones de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1015 partmulas, de desde aproximadamente 1 x 1011 hasta 1 x 1013 partmulas, o de desde aproximadamente 1 x 109 hasta 1 x 1012 partmulas de virus. Las dosis variaran dependiendo del tamano del animal y de la via de administracion. Por ejemplo, una dosis adecuada humana o veterinaria (para un animal de aproximadamente 80 kg) para una inyeccion intramuscular esta en el intervalo de desde aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 5 x 1012 partmulas por ml, para un unico sitio. Opcionalmente pueden administrarse en multiples sitios de administracion. En otro ejemplo, una dosis adecuada humana o veterinaria puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 1 x 1011 hasta aproximadamente 1 x 1015 partmulas para una formulacion oral. El experto en la materia puede ajustar estas dosis dependiendo de la via de administracion y de la aplicacion terapeutica o de vacuna para la cual se emplea el vector recombinante. Los niveles de expresion del transgen, o para un inmunogeno, el nivel de anticuerpo en circulacion, pueden ser monitorizados para determinar la frecuencia de administracion de la dosis. Otros metodos mas para la determinacion de la cronologfa de la frecuencia de administracion seran evidentes para el experto en la materia.
Una etapa opcional del metodo implica la administracion conjunta al paciente, ya sea conjuntamente, o antes o despues de la administracion del vector vmco, de una cantidad adecuada de un inmunomodulador de accion corta. El inmunomodulador seleccionado se define en el presente documento como un agente capaz de inhibir la formacion de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el vector recombinante de esta invencion o capaz de inhibir la eliminacion por parte de los linfocitos T citoltticos (CTL) del vector. El inmunomodulador puede interferir con las interacciones entre los subconjuntos de linfocitos T colaboradores (Tm o Th2) y los linfocitos B para inhibir la formacion de anticuerpos neutralizantes. Alternativamente, el inmunomodulador puede inhibir la interaccion entre los linfocitos Tm y los CTL para reducir la aparicion de la eliminacion por parte de los CTL del vector. Una diversidad de inmunomoduladores utiles y las dosis de uso de los mismos se divulgan, por ejemplo, en Yang et al., J. Virol., 70 (9) (septiembre de 1996); en la Solicitud de Patente Internacional n° WO96/12406, publicada el 2 de mayo de 1996; y en la Solicitud de Patente Internacional n° PCT/US96/03035.
1. Transgenes terapeuticos
Los productos terapeuticos utiles codificados por el transgen incluyen hormonas y factores de crecimiento y de diferenciacion que incluyen, sin limitacion, insulina, glucagon, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberacion de la hormona de crecimiento (GRF), hormona foliculoestimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina corionica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor estimulante de las colonias de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento basico de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento acido de fibroblastos (aFGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento insulinoide I y II (IGF-I e IGF-II), un factor cualquiera de la superfamilia de los factores de crecimiento transformantes, incluyendo TGF, activinas, inhibinas o cualquiera de las protemas morfogeneticas oseas (BMP), las BMP 1-15, uno cualquiera de la familia de los factores de crecimiento heregluina/neuregulina/ARIA/factor de diferenciacion neu (NDF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrofico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrofico ciliar (CNTF), factor neurotrofico derivado de lmeas celulares gliales (GDNF), neurturina, agrina, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), efrinas, noggin, sonic hedgehog e hidroxilasa de tirosina.
Otros productos transgenicos incluyen protemas que regulan el sistema inmunitario que incluyen, sin limitacion, citocinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) desde la IL-1 hasta la IL-25 (incluyendo, por ejemplo, la IL-2, la IL-4, la IL-12 y la IL-18), protema quimioatractora de monocitos, factor inhibidor de la leucemia, factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrofagos, ligando Fas, factores de necrosis tumoral e interferones, y factor de celulas madre, ligando flk-2/flt3. Los productos genicos producidos por el sistema inmunitario tambien son utiles en la invencion. Estos incluyen, sin limitacion, las inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quimericas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena unica, receptores de los linfocitos T, receptores de los linfocitos T quimericos, receptores de los linfocitos T de cadena unica, moleculas del MHC de la clase I y de la clase II, asf como inmunoglobulinas y moleculas del MHC modificadas geneticamente.
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Algunos productos genicos utiles tambien incluyen protemas reguladoras del complemento, tales como protemas reguladoras del complemento, protema del cofactor de membrana (MCP), factor acelerador de la degradacion (DAF), CR1, CF2 y CD59.
Otros productos genicos utiles mas incluyen uno cualquiera de los receptores de hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, protemas reguladoras y protemas del sistema inmunitario. La invencion engloba receptores para la regulacion del colesterol, incluyendo el receptor de las lipoprotemas de baja densidad (LDL), el receptor de las lipoprotemas de alta densidad (HDL), el receptor de las lipoprotemas de densidad muy baja (VLDL) y el receptor de capturadores. La invencion tambien incluye productos genicos tales como miembros de la superfamilia de los receptores de hormonas esteroideas, incluyendo los receptores de glucocorticoides y los receptores de estrogenos, los receptores de la vitamina D y otros receptores nucleares. Ademas, algunos productos genicos utiles incluyen factores de transcripcion tales como jun, fos, max, mad, factores de respuesta sericos (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, protemas que contienen la caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, AtF2, ATF3, aTf4, ZF5, NFAT, CREB, HNF- 4, C/EBP, SP1, protemas que se unen a la caja CCAAT, factor de regulacion del interferon (IRF-1), protema tumoral de Wilms, protema de union a ETS, STAT, protemas que se unen a la caja GATA, por ejemplo, GATA-3, y la familia forkhead de protemas en helice con alas.
Otros productos genicos utiles incluyen, sintetasa de carbamoMo I, transcarbamilasa de ornitina, sintetasa de arginosuccinato, liasa de arginosuccinato, arginasa, hidrolasa de fumarilacetacetato, hidroxilasa de fenilalanina, alfa- 1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, desaminasa de porfobilinogeno, factor VIII, factor IX, beta-sintasa de cistation, descarboxilasa de cetoacido de cadena ramificada, albumina, deshidrogenasa de isovaleril-coA, carboxilasa de propionil CoA, mutasa de metil malonil CoA, deshidrogenasa de glutaril CoA, insulina, beta-glucosidasa, carboxilato piruvato, fosforilasa hepatica, cinasa fosforilasa, descarboxilasa de glicina, protema H, protema T, una secuencia reguladora transmembranaria de la fibrosis qmstica (CFTR) y una secuencia del ADNc de la distrofina.
Otros productos genicos utiles incluyen polipeptidos no naturales, tales como polipeptidos quimericos o tubridos que tienen una secuencia de aminoacidos no natural que contiene inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos. Por ejemplo, las inmunoglobulinas modificadas de cadena unica podnan ser utiles en ciertos pacientes inmunodeprimidos. Otros tipos de secuencias genicas no naturales incluyen moleculas antisentido y acidos nucleicos cataltticos, tales como ribozimas, que podnan usarse para reducir la sobreexpresion de un objetivo.
La reduccion y/o la modulacion de la expresion de un gen son particularmente deseables para el tratamiento de afecciones hiperproliferativas caracterizadas por celulas hiperproliferativas, como son los canceres y la psoriasis. Los polipeptidos objetivo incluyen aquellos polipeptidos que son producidos que exclusivamente o a mayores niveles en las celulas hiperproliferativas en comparacion con las celulas normales. Los antfgenos objetivo incluyen los polipeptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocacion bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Ademas de los productos oncogenicos como antfgenos objetivo, los polipeptidos objetivo para tratamientos antineoplasicos y regfmenes protectores incluyen las regiones variables de los anticuerpos creados por los linfomas de linfocitos B y las regiones variables de los receptores de los linfocitos T de los linfomas de linfocitos T que, en algunas realizaciones, tambien se usan como antfgenos objetivo en la enfermedad autoinmune. Otros polipeptidos asociados a tumores pueden usarse como polipeptidos objetivo, tales como los polipeptidos que se encuentran con mayores niveles en las celulas tumorales, incluyendo el polipeptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y los polipeptidos de union al folato.
Otros polipeptidos y protemas terapeuticas adecuados incluyen aquellos que pueden ser utiles para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunes, al conferir una amplia respuesta protectora basada en la inmunidad frente a los objetivos que estan asociados con una autoinmunidad, incluyendo receptores celulares y celulas que producen auto-anticuerpos. Algunas enfermedades autoinmunes mediadas por los linfocitos T incluyen artritis reumatoide (AR), esclerosis multiple (EM), smdrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes sacarina dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerodermia, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades esta caracterizada por los receptores de los linfocitos T (TCR) que se unen a antfgenos endogenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes.
Los vectores adenovmicos de simio de la invencion son particularmente adecuados para regfmenes terapeuticos en los que se desean multiples administraciones de transgenes mediadas por adenovirus, por ejemplo, en regfmenes que implican la readministracion del mismo transgen o en regfmenes de combinacion que implican la administracion de otros transgenes. Dichos regfmenes pueden implicar la administracion de un vector adenovmco del SAdV28 de simio, seguido de la readministracion con un vector del mismo serotipo de adenovirus. Los regfmenes particularmente deseables implican la administracion de un vector adenovmico del SAdV28 de simio, en los que la fuente de las secuencias de la capside adenovmica del vector administrado en la primera administracion difiere de la fuente de las secuencias de la capside adenovmica del vector vmco utilizado en una o mas de las administraciones posteriores. Por ejemplo, un regimen terapeutico implica la administracion de un vector del SAdV28 y la repeticion de la administracion con uno o mas vectores adenovmicos del mismo serotipo o de uno diferente. En otro ejemplo, un regimen terapeutico implica la administracion de un vector adenovmico seguida de la repeticion de la administracion con un vector del SAdV28 que tiene una capside que difiere de la fuente de la capside del primer
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vector adenovmco administrado, y opcionalmente la administracion adicional con otro vector que es el mismo o, preferentemente, que difiere de la fuente de la capside adenovmca del vector de las etapas de administracion previas. Estos regfmenes no estan limitados a la administracion de los vectores adenovmcos construidos mediante el uso de las secuencias del SAdV28 de simio. Mas bien, estos regfmenes pueden utilizar facilmente otras secuencias adenovmcas que incluyen, sin limitacion, otras secuencias adenovmcas de simio, (por ejemplo, Pan9 o C68, C1, etc.), otras secuencias adenovmcas de un primate no humano o secuencias adenovmcas humanas, junto con uno o mas de los vectores del SAdV28. Algunos ejemplos de dichos serotipos adenovmcos de simio, de otro primate no humano y humanos se analizan en cualquier parte de este documento. Ademas, estos regfmenes terapeuticos pueden implicar la administracion simultanea o secuencial de vectores adenovmcos del SAdV28 junto con vectores no adenovmcos, vectores no vmcos y/o una diversidad de otros compuestos o moleculas terapeuticamente utiles. La invencion no esta limitada a estos regfmenes terapeuticos, una variedad de los cuales sera facilmente apreciada por el experto en la materia.
B. Administracion mediada por Ad de transgenes inmunogenos
Los vectores recombinantes del SAdV-28 tambien pueden emplearse como composiciones inmunogenas. Segun se usa en el presente documento, una composicion inmunogena es una composicion frente a la cual se crea una respuesta humoral (por ejemplo, anticuerpo) o celular (por ejemplo, un linfocito T citotoxico) frente a un producto transgenico administrado por la composicion inmunogena despues de su administracion a un mairnfero, y preferentemente a un primate. Un Ad recombinante de simio puede contener, en cualquiera de sus deleciones de la secuencia del adenovirus, un gen que codifica un inmunogeno deseado. Es probable que el adenovirus de simio sea mas adecuado para su uso en forma de una vacuna de un virus recombinante vivo en diferentes especies animales en comparacion con un adenovirus de origen humano, pero no se limita a dicho uso. Los adenovirus recombinantes pueden usarse en vacunas profilacticas o terapeuticas frente a cualquier patogeno para el cual se ha(n) identificado el (los) antfgeno(s) crucial(es) para la induccion de una respuesta inmunitaria y es capaz de limitar la diseminacion del patogeno, y para el cual esta disponible el ADNc.
Dichas composiciones de vacuna (u otras inmunogenas) se formulan en un vehuculo de administracion adecuado, como se ha descrito anteriormente. Generalmente, las dosis de las composiciones inmunogenas estan en el intervalo definido anteriormente para las composiciones terapeuticas. Los niveles de inmunidad del gen seleccionado pueden ser monitorizados para determinar la necesidad, si la hubiera, de refuerzos. Despues de la evaluacion de los tftulos del anticuerpo en el suero, pueden desearse inmunizaciones de refuerzo adicionales.
Opcionalmente, una composicion de vacuna de la invencion puede formularse para que contenga otros componentes que incluyen, por ejemplo, adyuvantes, estabilizantes, ajustadores del pH, conservantes y similares. Dichos componentes son bien conocidos por los expertos en el arte de las vacunas. Algunos ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, sin limitacion, liposomas, alumbre, monofosforil lfpido A y cualquier factor biologicamente activo, tal como una citocina, una interleucina, una quimiocina, un ligando y, optimamente, combinaciones de los mismos. Algunos de estos factores biologicamente activos pueden ser expresados in vivo, por ejemplo, a traves de un plasmido o de un vector vmco. Por ejemplo, dicho adyuvante puede ser administrado con una vacuna de ADN de sensibilizacion que codifica un antfgeno para mejorar la respuesta inmunitaria espedfica frente al antfgeno en comparacion con la respuesta inmunitaria generada tras la sensibilizacion con una vacuna de ADN que codifica unicamente el antfgeno.
Los adenovirus recombinantes son administrados en “una cantidad que inmunogena", es decir, una cantidad de adenovirus recombinante que es eficaz, a traves de una via de administracion, para transfectar las celulas deseadas y proporcionar unos niveles de expresion suficientes del gen seleccionado como para inducir una respuesta inmunitaria. Cuando se proporciona una inmunidad protectora, los adenovirus recombinantes se consideran composiciones de vacuna utiles en la prevencion de la infeccion y/o de una enfermedad recurrente.
Alternativamente, o ademas, los vectores de la invencion pueden contener un transgen que codifica un peptido, un polipeptido o una protema que induce una respuesta inmunitaria frente a un inmunogeno seleccionado. Se espera que los vectores recombinantes del SAdV-28, del AdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 sean muy eficaces en la induccion de los linfocitos T citolfticos y de los anticuerpos frente a la protema antigenica heterologa insertada expresada por el vector.
Por ejemplo, los inmunogenos pueden seleccionarse entre una diversidad de familias de virus. Algunos ejemplos de familias de virus frente a los cuales sena deseable una respuesta inmunitaria incluyen, la familia de picornavirus, que incluye los generos de rhinovirus, que son responsables de aproximadamente el 50 % de los casos de resfriado comun; los generos de enterovirus, que incluyen poliovirus, coxsackievirus, ecovirus y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A; y los generos de apthovirus, que son responsables de enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. En la familia de virus de los picornavirus, algunos antfgenos objetivo incluyen la VP1, la VP2, la VP3, la VP4 y la VPG. Otra familia de virus incluye la familia de los calcivirus, que engloba el grupo de virus de Norwalk, que son un importante agente causal de gastroenteritis epidemicas. Otra familia vmca mas, deseable para su uso en el direccionamiento de antfgenos para la induccion de respuestas inmunitarias en humanos y en animales no humanos, es la familia de los togavirus, que incluye los generos alfavirus,
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que incluyen el virus de Sindbis, el virus de RossRiver y el virus de la encefalitis de Venezuela, equina oriental y occidental, y los rubivirus, incluyendo el virus de la rubeola. La familia flaviviridae incluye el virus del dengue, de la fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis de San Luis y de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antfgenos objetivo pueden ser generados a partir de la familia de la Hepatitis C o de coronavirus, que incluyen varios virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves), el virus porcino de transmision gastroenterica (cerdos), el virus de la encefalomielitis porcina hemaglutinante (cerdos), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos), el coronavirus enterico felino (gatos), el coronavirus canino (perros) y el coronavirus respiratorio humano, que puede provocar el resfriado comun y/o la hepatitis no A, B o C. En la familia de los coronavirus, algunos antigenos objetivo incluyen la glicoprotema E1 (tambien denominada M o protema de la matriz), la E2 (tambien denominada S o protema Spike), la E3 (tambien denominada HE o hemaglutina-elterosa) (no presente en todos los coronavirus) o la N (nucleocapside). Otros antfgenos mas pueden ser dirigidos contra la familia de los rhabdovirus, que incluye los generos vesiculovirus (por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular), y el lyssavirus general (por ejemplo, rabies).
En la familia de los rhabdovirus, los antfgenos adecuados pueden derivar de la protema G o de la protema N. La familia de los filoviridae, que incluye virus de fiebres hemorragicas tales como el virus de Marburg y de Ebola, puede ser una fuente adecuada de antfgenos. La familia de los paramyxovirus incluye el virus paragripal de tipo 1, el virus paragripal de tipo 3, el virus paragripal bovino de tipo 3, el rubulavirus (el virus de la parotiditis), el virus paragripal de tipo 2, el virus paragripal de tipo 4, el virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), la peste bovina, morbillivirus, que incluye sarampion y moquillo canino, y pneumovirus, que incluye el virus respiratorio sincitial. El virus de la gripe esta clasificado en la familia ortomyxovirus y es una fuente adecuada de antfgeno (por ejemplo, la protema HA, la protema NI). La familia de los bunyavirus incluye los generos bunyavirus (encefalitis de California La Crosse), phlebovirus (fiebre del valle de Rift), hantavirus (puremala es un virus de la fiebre hemahagina), nairovirus (enfermedad de las ovejas de Nairobi) y otros diversos bungavirus sin clasificar. La familia de los arenavirus proporciona una fuente de antfgenos frente al virus de la LCM y de la fiebre de Lassa. La familia de los reovirus incluye los generos reovirus, rotavirus (que provoca una gastroenteritis aguda en ninos), orbivirus y cultivirus (fiebre de las garrapatas de Colorado, Lebombo (seres humanos), encefalosis equina, lengua azul).
La familia de los retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que engloba enfermedades humanas y veterinarias
tales como el virus de la leucemia felina, el HTLVI y el HTLVII, la lentivirinal (que incluye el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la anemia infecciosa equina y spumavirinal). Entre los lentivirus se han descrito muchos antfgenos adecuados y pueden ser seleccionados facilmente. Algunos ejemplos de antfgenos adecuados del VIH y del VIS incluyen, sin limitacion, las protemas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef y Rev, asf como diversos fragmentos de las mismas. Por ejemplo, algunos fragmentos adecuados de la protema Env pueden incluir cualquiera de sus subunidades, tales como la gp120, la gp160, la gp41 o fragmentos menores de las mismas, por ejemplo, de al menos aproximadamente 8 aminoacidos de longitud. De forma analoga, pueden seleccionarse fragmentos de la protema tat. [Vease la Patente de Estados Unidos 5.891.994 y la Patente de Estados Unidos 6.193.981.] Veanse tambien las protemas del VIH y del VIS descritas en D. H. Barouch et al., J. Virol., 75 (5): 2462-2467 (marzo de 2001), y en R. R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de abril de 2001). En otro ejemplo, pueden usarse las
protemas o los peptidos inmunogenos del VIH y/o del VIS para formar protemas de fusion u otras moleculas
inmunogenas. Veanse, por ejemplo, las protemas de fusion VIH-1 Tat y/o Nef y los regfmenes de inmunizacion descritos en el documento WO 01/54719, publicado el 2 de agosto de 2001, y en el documento WO 99/16884, publicado el 8 de abril de 1999. La invencion no esta limitada a las protemas o los peptidos inmunogenos del VIH y/o del VIS descritos en el presente documento. Ademas, se han descrito diversas modificaciones de estas protemas, o podnan ser realizadas facilmente por el experto en la materia. Vease, por ejemplo, la protema gag modificada que se describe en la Patente de Estados Unidos 5.972.596. Ademas, cualquier inmunogeno deseado del VIH y/o del VIS puede ser administrado solo o en combinacion. Dichas combinaciones pueden incluir la expresion desde un unico vector o desde multiples vectores. Opcionalmente, otra combinacion puede implicar la administracion de uno o mas inmunogenos expresados con la administracion de uno o mas de los inmunogenos en forma de una protema. Dichas combinaciones se analizan con mas detalle a continuacion.
La familia de los papovavirus incluye la subfamilia de los poliomavirus (los virus BKU y JCU) y la subfamilia de los papilomavirus (asociados con canceres o con la progresion maligna de un papiloma). La familia de los adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedades respiratorias y/o enteritis. La familia de los parvovirus de los parvovirus felinos (enteritis felina), de los panleucopeniavirus felinos, de los parvovirus caninos y de los parvovirus porcinos. La familia de los herpesvirus incluye la subfamilia de los alfaherpesvirinae, que engloba los generos simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (seudorrabia, varicela zoster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los generos citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los generos linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitt), rinotraquettis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek y rhadinovirus. La familia de los poxvirus incluye la subfamilia de los cordopoxvirinae, que engloba los generos ortopoxvirus (Variola (viruela) y Vaccinia (viruela vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia de los hepadnavirus incluye el virus de la hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antfgenos es el virus de la hepatitis delta. Otras fuentes vmcas mas pueden incluir el virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa de aves y el virus del smdrome respiratorio y reproductor porcino. La familia de los alfavirus incluye el virus de la arteritis y varios virus de encefalitis.
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Algunos inmunogenos que son utiles para inmunizar a un ser humano o a un animal no humano frente a otros patogenos incluyen, por ejemplo, bacterias, hongos, microorganismos parasitos o parasitos multicelulares que infectan a vertebrados humanos y no humanos, o de una celula cancerosa o una celula tumoral. Algunos ejemplos de patogenos bacterianos incluyen cocos patogenos grampositivos que incluyen neumococos; estafilococos; y estreptococos. Algunos cocos patogenos gramnegativos incluyen meningococos; gonococos. Algunos bacilos entericos patogenos gramnegativos incluyen enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (que causa el chancroide); brucella; Franisella tularensis (que causa la tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis y spirillum; algunos bacilos grampositivos incluyen listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopatiae; Corynebacterium diphtheria (difteria); colera; B. antracis (antrax); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis. Algunas enfermedades causadas por bacterias patogenas anaerobias incluyen el tetanos; el botulismo; otros clostridios; la tuberculosis; la lepra; y otras micobacterias. Algunas enfermedades patogenas por espiroquetas incluyen sifilis; treponematosis: pian, pinta y sifilis endemica; y leptospirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patogenas superiores y hongos patogenos incluyen actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petriellidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Algunas infecciones por rickettsias incluyen la fiebre tifoidea, la fiebre moteada de las montanas rocosas, la fiebre Q y la rickettsiosis exantematica. Algunos ejemplos de infecciones por micoplasma y por clamidia incluyen: mycoplasma pneumoniae; linfogranuloma venereo; psittacosis; e infecciones perinatales por clamidia. Algunos eucariotas patogenos engloban protozoos y helmintos patogenos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniosis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos; e infecciones por cestodos (gusanos planos).
Muchos de estos organismos y/o las toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros de Control de Enfermedades [(CDC), Department of Heath and Human Services, Estados Unidos], como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biologicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biologicos incluyen, Bacillus antracis (antrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (peste), variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia) y fiebres hemorragicas vmcas [filovirus (por ejemplo, Ebola, Marburg], y arenavirus [por ejemplo Lassa, Machupo]), todos los cuales estan actualmente clasificados como agentes de la Categona A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (la toxina ricino), Clostridium perfringens y su toxina (la toxina epsilon), especies de Staphylococcus y sus toxinas (la enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psittacosis), amenazas para la salubridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), fiebre tifoidea (Richettsia powazekii) y encefalitis vmcas (alfavirus, por ejemplo, encefalitis equina de Venezuela; encefalitis equina oriental; encefalitis equina occidental); todos los cuales estan actualmente clasificados como agentes de la Categona B; y el virus de Nipan y los hantavirus, que actualmente estan clasificados como agentes de la Categona
C. Ademas, otros organismos, que tambien estan asf clasificados o clasificados de una forma diferente, pueden ser identificados y/o usados para dichos fines en el futuro. Se comprendera facilmente que los vectores vmcos y otras construcciones descritas en el presente documento son utiles para la administracion de antfgenos procedentes de estos organismos, de virus, de sus toxinas o de otros subproductos, que prevendran y/o trataran una infeccion u otra reaccion adversa con estos agentes biologicos.
Se anticipa que la administracion de los vectores del SAdV-28 para la administracion de inmunogenos frente a la region variable de los linfocitos T desencadenara una respuesta inmunitaria que incluya a los CTL para la eliminacion de esos linfocitos T. En la AR se han caracterizado varias regiones variables espedficas de los TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen el V-3, el V-14, el V-17 y el Va-17. Por lo tanto, la administracion de una secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos uno de estos polipeptidos desencadenara una respuesta inmunitaria que estara dirigida contra los linfocitos T implicados en la AR. En la EM, se han caracterizado varias regiones variables espedficas de los TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen el V-7 y el Va-10. Por lo tanto, la administracion de una secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos uno de estos polipeptidos desencadenara una respuesta inmunitaria que estara dirigira contra los linfocitos T implicados en la EM. En la esclerodermia se han caracterizado varias regiones variables espedficas de los TCR que estan implicadas en la enfermedad. Estos TCR incluyen el V-6, el V-8, el V-14 y el Va-16, el Va-3C, el Va-7, el Va-14, el Va-15, el Va-16, el Va-28 y el Va-12. Por lo tanto, la administracion de un adenovirus recombinante de simio que codifica al menos uno de estos polipeptidos desencadenara una respuesta inmunitaria que estara dirigida contra los linfocitos T implicados en la esclerodermia.
C. Metodos de administracion mediada por los Ad
Los niveles terapeuticos, o los niveles de inmunidad, del gen seleccionado pueden ser monitorizados para determinar la necesidad, si la hubiera, de refuerzos. Despues de una evaluacion de la respuesta de los linfocitos T CD8+, u opcionalmente, de los tftulos del anticuerpo, en el suero, pueden desearse inmunizaciones de refuerzo opcionales. Opcionalmente, los vectores recombinantes del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 pueden ser administrados en una unica administracion o en varios regfmenes de combinacion, por ejemplo, junto con un regimen o un plan de tratamiento que implique otros principios activos, o en un regimen de sensibilizacion y refuerzo. En la materia se ha descrito una variedad de dichos regfmenes y pueden
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ser seleccionados con facilidad.
Por ejemplo, los regfmenes de sensibilizacion y refuerzo pueden implicar la administracion de un vector basado en ADN (por ejemplo, de un plasmido) para sensibilizar el sistema inmunitario frente a la segunda inmunizacion de refuerzo con un antfgeno tradicional, tal como una protema o un virus recombinante portador de las secuencias que codifican dicho antigeno. Vease, por ejemplo, el documento WO 00/11140, publicado el 2 de marzo de 2000. Alternativamente, un regimen de inmunizacion puede implicar la administracion de un vector recombinante del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 para sensibilizar la respuesta inmunitaria frente a un vector (ya sea vmco o basado en ADN) portador de un antfgeno, o a una protema. En otra alternativa mas, un regimen de inmunizacion implica la administracion de una protema seguida de un refuerzo con un vector que codifica el antigeno.
En una alternativa se describe un metodo de sensibilizacion y refuerzo de una respuesta inmunitaria frente a un antigeno seleccionado mediante la administracion de un vector de plasmido de ADN portador de dicho antigeno, seguido del refuerzo con un vector recombinante del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV- 33 y/o del SAdV-35. En una alternativa, el regimen de sensibilizacion y refuerzo implica la expresion de multiprotemas del vehmulo de sensibilizacion y/o de refuerzo. Vease, por ejemplo, R. R. Amara, Science, 292: 69-74 (6 de abril de 2001) que describe un regimen multiproteico para la expresion de subunidades de protemas utiles para la generacion de una respuesta inmunitaria frente al VIH y al VIS. Por ejemplo, una sensibilizacion con ADN puede administrar las Gag, Pol, Vif, VPX y Vpr, y las Env, Tat y Rev, a partir de un unico transcrito. Alternativamente, las Gag y Pol del VIS, y la Env del VIH-1 son administradas en una construccion de adenovirus recombinante del SAdV- 28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35. Otros regfmenes mas se describen en el documento WO 99/16884 y el documento WO 01/54719.
Sin embargo, los regfmenes de sensibilizacion y refuerzo no se limitan a la inmunizacion frente al VIH o a la administracion de estos antfgenos. Por ejemplo, la sensibilizacion puede implicar la administracion de un primer vector del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 seguida del refuerzo con un segundo vector Ad, o con una composicion que contiene el propio antfgeno en forma de protema. En un ejemplo, el regimen de sensibilizacion y refuerzo puede proporcionar una respuesta inmunitaria protectora frente al virus, las bacterias u otro organismo a partir del cual deriva el antfgeno. En otro ejemplo, el regimen de sensibilizacion y refuerzo proporciona un efecto terapeutico que puede medirse mediante el uso de los ensayos convencionales para la deteccion de la presencia de la afeccion para la cual se esta administrando la terapia.
La composicion de sensibilizacion puede ser administrada en diversas zonas del cuerpo de una forma dependiente de la dosis, que depende del antfgeno contra el que se esta dirigiendo la respuesta inmunitaria deseada. La cantidad o el (los) sitio(s) de inyeccion o el portador farmaceutico no son una limitacion. Mas bien, el regimen puede implicar una etapa de sensibilizacion y/o una de refuerzo, cada una de las cuales puede incluir una unica dosis que es administrada cada hora, cada dfa, cada semana, cada mes o cada ano. Como ejemplo, los mairnferos pueden recibir una o dos dosis que contienen desde aproximadamente 10 |jg hasta aproximadamente 50 |jg del plasmido en un portador. Una cantidad deseable de una composicion de ADN vana desde aproximadamente 1 jg hasta aproximadamente 10.000 jg del vector de ADN. Las dosis pueden variar desde aproximadamente 1 jg hasta 1.000 jg de ADN por kg de peso corporal del sujeto. La cantidad o el sitio de administracion se selecciona deseablemente basandose en la identidad y el estado del mamnfero.
En el presente documento se describe la unidad de dosificacion del vector adecuada para la administracion del antfgeno al mamffero. El vector es preparado para su administracion suspendiendolo o disolviendolo en un portador farmaceutica o fisiologicamente aceptable, tal como solucion salina isotonica; soluciones salinas isotonicas u otras formulaciones que seran evidentes para los expertos en dicha administracion. El portador apropiado sera evidente para los expertos en la materia y dependera en gran medida de la via de administracion. Las composiciones descritas en el presente documento pueden ser administradas a un mamffero segun las rutas descritas anteriormente, en una formulacion de liberacion sostenida mediante el uso de un polfmero biocompatible biodegradable, o mediante una administracion en el sitio mediante el uso de micelas, geles y liposomas. Opcionalmente, la etapa de sensibilizacion tambien incluye la administracion, junto con la composicion de sensibilizacion, de una cantidad adecuada de adyuvante, tal como los que se definen en el presente documento.
Preferiblemente al sujeto mamffero se le administra una composicion de refuerzo entre aproximadamente 2 y aproximadamente 27 semanas despues de la administracion de la composicion de sensibilizacion. La administracion de la composicion de refuerzo se leva a cabo mediante el uso de una cantidad eficaz de una composicion de refuerzo que contiene o es capaz de administrar el mismo antfgeno que el administrado por la vacuna de sensibilizacion de ADN. La composicion de refuerzo puede estar formada por un vector vmco recombinante derivado de la misma fuente vmca (por ejemplo, las secuencias adenovmcas de la invencion) o de otra fuente. Alternativamente, la "composicion de refuerzo" puede ser una composicion que contenga el mismo antfgeno que el codificado por la vacuna de sensibilizacion de ADN, pero en forma de una protema o de un peptido, composicion que induce una respuesta inmunitaria en el hospedador. En otra alternativa, la composicion de refuerzo contiene una secuencia de ADN que codifica el antfgeno bajo el control de una secuencia reguladora que dirige su expresion en una celula de mamffero, por ejemplo, vectores tales como los bien conocidos vectores bacterianos o vmcos. Los
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principales requisitos de la composicion de refuerzo son que el antigeno de la composicion sea el mismo antigeno que, o un antigeno con reactividad cruzada con, el codificado por la composicion de sensibilizacion.
En otra realizacion, los vectores del SAdV-28 tambien son muy adecuados para su uso en una diversidad de otros reg^enes de inmunizacion y terapeuticos. Dichos regfmenes pueden implicar la administracion de vectores del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 simultaneamente o secuencialmente con vectores Ad de diferentes serotipos de capside, regfmenes en los que los vectores del SAdV- 28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 son administrados simultaneamente o secuencialmente con vectores no Ad, regfmenes en los que los vectores del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 son administrados simultaneamente o secuencialmente con protemas, peptidos y/u otros compuestos terapeuticos o inmunogenos biologicamente utiles. Dichos usos seran facilmente apreciables por el experto en la materia.
Los siguientes ejemplos ilustran la clonacion del SAdV-28, del SAdV-27, del SAdV-29, del SAdV-32, del SAdV-33 y/o del SAdV-35 y la construccion de los vectores recombinantes ejemplares del SAdV-28. Estos ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden limitar el ambito de la presente invencion.
Ejemplo 1 - Aislamiento de los adenovirus de simio
Se obtuvieron muestras de heces de la colonia chimpances del University of Louisiana New Iberia Research Center, 4401 W. Admiral Doyle Drive, New Iberia, Louisiana, Estados Unidos, y de la colonia de chimpances del Michael E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Bastrop, Texas, Estados Unidos. Los sobrenadantes de las muestras de heces de chimpance en suspension en solucion salina equilibrada de Hanks se filtraron esteriles a traves de filtros de jeringa de 0,2 micrometres. Se inocularon 100 pl de cada muestra filtrada en cultivos de la lmea celular humana A549. Estas celulas se cultivaron en Ham F12 con un 10 % de FBS, un 1 % de penicilina-estreptomicina y 50 pg/ml de gentamicina. Despues de entre aproximadamente 1 y 2 semanas de cultivo, el efecto citopatico visual (CPE) era evidente en los cultivos celulares con varios de los inoculos. Los adenovirus se purificaron a partir de los cultivos de las celulas A549 mediante el uso de tecnicas estandar publicadas de gradiente de cloruro de cesio para la purificacion de adenovirus. Se aislo el ADN de los adenovirus purificados y fue completamente secuenciado por Qiagen Genomic services, Hilden, Alemania.
Tomando como base el analisis filogenetico de las secuencias de ADN vmcas, se determino que los adenovirus indicados, que eran el adenovirus de simio 27 (SAdV-27), el adenovirus de simio 28 (SAdV-28), el adenovirus de simio 29 (SAdV-29), el adenovirus de simio 32 (SAdV-32), el adenovirus de simio 33, (SAdV-33) y el adenovirus de simio 35 (SAdV-35), estaban en el mismo subgrupo que el subgrupo B humano.
La metodologfa usada para la creacion de los vectores era crear en primer lugar un clon molecular del plasmido bacteriano de la totalidad del vector adenovrnco con el E1 delecionado, seguido de la transfeccion del ADN del plasmido en la lmea celular complementaria del E1 HEK 293 para rescatar el vector vmco.
Con objeto de crear clones moleculares de un vector adenovrnco con el E1 delecionado, en primer lugar se crearon los clones moleculares del plasmido de los adenovirus con el E1 delecionado en los que se han insertado sitios de reconocimiento para las enzimas de restriccion de corte raro I-CeuI y PI-Scel en lugar de una delecion E1. Los casetes de expresion flanqueados por I-CeuI y PI-SceI, y escindidos mediante el uso de estas enzimas de restriccion, se ligaron en los clones de plasmidos adenovmcos con el E1 delecionado. El clon molecular adenovrnco del plasmido portador del casete de expresion deseado en lugar de la delecion del E1 fue transfectado en las celulas HEK 293 para rescatar los vectores adenovmcos recombinantes. Se encontro que el rescate posterior a la transfeccion estaba facilitado si en primer lugar se liberaba el genoma adenovrnco lineal del plasmido mediante una digestion con enzimas de restriccion.
Ejemplo 2 - Construccion de clones moleculares de plasmido con el E1 delecionado basados en los adenovirus de simio del Subgrupo B 27, 28, 29, 32, 33 y 35 para facilitar la derivacion de los vectores adenovmcos recombinantes con el E1 delecionado
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con el AdC1 (el SAdV-21) ha indicado que las deleciones del E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK 293, se construyeron vectores basados en las especies B de adenovirus SAdV-27, SAdV-28, SAdV-29, SAdV-32 y SAdV-35, basandose en la estrategia descrita previamente de construccion de vectores adenovmcos tnbridos mediante el uso de AdC1 [Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], en los que los extremos izquierdo y derecho de una construccion quimerica derivan del adenovirus de chimpance Pan 5 (tambien conocido como el adenovirus de simio 22).
El plasmido de partida para la construccion de los vectores adenovmcos del subgrupo B era uno que habfa sido construido en un intermedio de la construccion del vector quimerico AdC1 - pPan5C1de1RI, segun se describe en el documento WO 2005/001103 A3, publicado el 6 de enero de 2005. El plasmido pPan5C1de1 RI porta los genomas de los adenovirus quimericos con el E1 delecionado Pan 5 (SAdV-22) y Ad C1 (SAdV-21) que ha sido delecionado
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internamente entre los sitios de restriccion EcoRI. Adicionalmente, estan presentes los sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccion de corte raro I-CeuI y PI-SceI en lugar de la delecion E1 para facilitar una facil insercion de los casetes del transgen.
A. Construccion de un clon molecular de plasmido con el E1 delecionado basado en el SAdV-27, mediante el uso de tecnicas estandar de biolog^a molecular
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con el AdC1 han indicado que las deleciones del E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK 293, se genero un adenovirus tnbrido basandose en una estrategia mediante el uso del AdC1 [Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], en el que los extremos izquierdo y derecho de una construccion quimerica derivan del adenovirus de chimpance Pan 5 (tambien conocido como el adenovirus de simio 22).
1. Insercion del conector
El segmento Ad C1 del pPan5C1de1 RI (entre ClaI y EcoRI) fue sustituido por un conector de ADN creado mediante la hibridacion de los oligomeros SAD27 top y SAD27 bot. SEQ ID NO: 198: SAD27 top - CGCGCCGAGCATTCATGCTTGTACGTACCCACGCACAGCTTTAAACATTTG y SEQ ID NO: 199: SAD27 bot - AATTCAAATGTTTAAAGCTGTGCGTGGGTACGTACAAGCATGAATGCTCGG. Este plasmido es el pC5endsSAD27 oligo.
2. PCR
El plasmido pC5endsSAD27 oligo fue digerido con AscI y EcoRI y en el se clono un fragmento generado mediante una PCR de 3873 pb (digerido tambien con AscI y EcoRI), para crear el pC5endsSAD27PCR. El fragmento de la PCR fue generado mediante el uso del ADN vmco del SAdV-27 como molde, mediante el uso de los cebadores SAD27 Asc y SAD27 RI mediante el uso del kit de PCR NEB Phusion, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores de la PCR conteman los sitios AscI y EcoRI, respectivamente.
SEQ ID NO: 200: SAD27 Asc - TACCACCAGCGGCGCGCCAGACATCAAG SEQ ID NO: 201: SAD27 RI - AAATGGAATTCAAATGTTTAAAGCTGTG
3. Insercion del fragmento AscI (7951 - 17458) del SAdV-27
El plasmido pC5endsSAD27PCR fue digerido con AscI y en el se clono el fragmento de ADN vmco del SAdV-27 AscI (7951 - 17458) fragmento de 9507 pb. El clon con la orientacion correcta se denomino pC5SAD27 PCR Asc.
4. Insercion del fragmento PacI (18409 - 29019)
El plasmido pC5SAD27 PCR Asc fue digerido con PacI y en el se clono el fragmento de ADN vmco del SAdV-27 PacI (18409 - 29019) de 10610 pb. El clon con la orientacion correcta se denomino pC5C27delAsc-Pac.
5. Insercion del fragmento MluI (16026) - SbfI (23007).
El plasmido pC5C27delAsc-Pac fue digerido con MluI + SbfI y en el se clono el fragmento de ADN vmco del SAdV- 27 MluI (16026) - SbfI (23007) de 6981 pb para crear el pC5/C27 IP.
El plasmido pC5/C27 IP porta un ADN vmco (SAdV-22) con el E1 delecionado Ad Pan 5 en el que un segmento interno de 25603 pb (pb n° 7955 - pb n° 33557) ha sido sustituido por un segmento analogo funcional de 24753 pb (pb n° 7951 - pb n° 32703) del SAdV-27, es decir, esto da como resultado la sustitucion de los genes del SAdV-22 para la protema pre-terminal, la protema 52/55K, la base pentona, la pVII, el Mu, la hexona, la endoproteasa, la protema de union al ADN, la protema de soporte de 100 K, la protema de 33 K, la pVIII, la region E3 y la fibra, por los del SAdV-27. El sitio AscI en el extremo izquierdo del fragmento del SAdV-27 esta en el comienzo del marco abierto de lectura de la polimerasa de ADN (el residuo 236 de la protema de 1192 residuos) y da como resultado una protema quimerica. El sitio EcoRI, que constituye el extremo derecho del fragmento del SAdV-27 esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la E4. El extremo derecho se ligo a un fragmento terminal derecho generado mediante una PCR del Ad Pan 5, de forma que el producto de la traduccion regenerado del orf 6/7 de la E4 sea quimerico entre el Ad Pan 5 y el SAdV-27.
B. Construccion de un clon molecular de plasmido con el E1 delecionado basado en el SAdV-28, mediante el uso de tecnicas estandar de biologfa molecular
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con el AdC1 han indicado que las deleciones E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK 293, se genero un adenovirus tnbrido basandose en una estrategia mediante el uso del AdC1 [Roy et al., J Virol.
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El plasmido de partida era uno que habfa sido construido en un intermedio de la construccion del vector quimerico AdC1 - pPan5C1de1 RI, segun se describe en el documento WO 2005/001103 A3, publicado el 6 de enero de 2005.
1. PCR
El segmento Ad C1 del pPan5C1de1 RI (entre Clal y EcoRI) fue sustituido por un fragmento generado mediante una PCR mediante el uso del ADN vmco del SAdV-28 como molde. Los cebadores de la PCR contienen los sitios Clal y EcoRI respectivamente. Se usaron los cebadores CCATCTATCGATGCATAATCAGCAAACC [SEQ ID NO: 33, (W33 directo, Tm - 64,5 °)] y CTCAAATGGAATTCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34]. El cebador 'W33 directo' contiene el sitio ClaI (subrayado). Las dos bases que siguen al sitio ClaI son CA en la secuencia natural, pero se han cambiado por GC en el cebador para convertir el sitio ClaI en uno que no este metilado en las bacterias. Este cambio altera un aminoacido - S94C - en la protema E3 de 106 aminoacidos que es homologa de la supuesta protema del Ad4 CR1 delta de 11 K). El cebador 'W33 inverso' contiene el sitio EcoRI (subrayado). La correspondiente secuencia natural del Ad es GAATCC. La base cambiada esta en un codon para la isoleucina (residuo 123 del orf 6/7 de la protema E4) que no se ve alterada por este cambio. El sitio ClaI es el mismo que el que esta en el 30273 del SAdV-28; se creo el sitio EcoRI en el cebador de forma que su empalme con la region E4 del Ad Pan 5 crea un orf 6/7 de la E4 quimerico (el sitio EcoRI del pPan5C1delRI esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la protema E4 del Ad Pan 5).
Se llevo a cabo una PCR mediante el uso de la polimerasa NEB Phusion y de los tampones proporcionados por el fabricante.
El producto de 2474 pb fue digerido con EcoRI y ClaI y clonado en pBluescript II SK+ entre los dos mismos sitios para producir el pBS W33 PCR. El plasmido pBS W33 PCR fue digerido con ClaI y EcoRI y el fragmento (originalmente) de 2453 pb derivado de la PCR se clono en pPan5CldelRI entre los dos mismos sitios para producir el pPan5CldelR1 -W33 PCR.
2. Insercion del fragmento AscI (11065) en ClaI (18577) (entre el sitio AscI presente en el gen pol y el unico sitio ClaI)
El plasmido pPan5C1delR1-W33 PCR fue digerido con AscI y ClaI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-28 AscI (11065) en ClaI (18577) (entre el sitio AscI presente en el gen pol y el unico sitio ClaI), para producir el pPan5-W33 delAsc delCla.
3. Insercion del fragmento AscI (7941) en AscI (11065) (para crear un gen de la polimerasa quimerico)
El plasmido pPan5-W33 delAsc delCla fue digerido con AscI y en el se clono el fragmento del ADN vmico del SAdV- 28 AscI (7941) en AscI (11065) (crea un gen de la polimerasa quimerico). El clon con la orientacion correcta se denomino pPan5-W33 del Cla.
4. Insercion del fragmento ClaI (18577) en ClaI (30273)
El plasmido pPan5-W33 del Cla fue digerido con ClaI y en el se clono el fragmento del ADN vmico del SAdV-28 ClaI (18577) en ClaI (30273). El clon con la orientacion correcta se denomino pC5/C28 IP.
El plasmido pC5/C28 IP porta un ADN vmico con el E1 delecionado del Ad Pan 5 (SAdV-22) en el que un segmento interno de 25603 pb (pb n° 7955 - pb n° 33557) ha sido sustituido por un segmento analogo funcional de 24779 pb (pb n° 7946 - pb n° 32657) del SAdV-28, es decir, esto da como resultado la sustitucion de los genes del SAdV-22 para la protema pre-terminal, la protema 52/55K, la base pentona, la pVII, el Mu, la hexona, la endoproteasa, la protema de union al ADN, la protema de soporte de 100 K, la protema de 33 K, la pVIII, la region E3 y la fibra, por los del SAdV-28. El AscI en el extremo izquierdo del fragmento del SAdV-28 esta en el comienzo del marco abierto de lectura de la polimerasa de ADN (residuo 236 de la protema de 1192 residuos) y da como resultado una protema quimerica. El sitio EcoRI, que constituye el extremo derecho del fragmento del SAdV-28 esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la E4. El extremo derecho se ligo a un fragmento terminal derecho generado mediante una PCR del Ad Pan 5, de forma que el producto de la traduccion regenerado orf 6/7 de la E4 sea quimerico entre el Ad Pan 5 y el SAdV-28.
C. Construccion de un clon molecular de plasmido basado en el SAdV-29, mediante el uso de tecnicas estandar de biologfa molecular
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con AdC1 han indicado que las deleciones E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK
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293, se genera un adenovirus hnbrido basandose en una estrategia mediante el uso del AdC1 [Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], en el que los extremos izquierdo y derecho de una construccion quimerica derivan del adenovirus de chimpance Pan 5 (tambien conocido como el adenovirus de simio 22).
El plasmido de partida era uno que habfa sido construido en un intermedio de la construccion del vector quimerico AdC1 - pPan5C1delRI, segun se describe en el documento WO 2005/001103 A3, publicado el 6 de enero de 2005.
1. PCR
El segmento Ad C1 del pPan5C1delRI (entre Clal y EcoRI) fue sustituido por un fragmento generado mediante una PCR mediante el uso del ADN vmco del SAdV-29 como molde. Los cebadores de la PCR contienen los sitios Clal y EcoRI, respectivamente. Se usaron los cebadores CCATCTATCGATGCATAATCAGCAAACC [SEQ ID NO: 33] y CTCAAATGGAATTCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34]. El cebador 'W33 directo' contiene el sitio Clal (subrayado). Las dos bases que siguen al sitio ClaI son CA en la secuencia natural, pero se han cambiado por GC en el cebador para convertir el sitio ClaI en uno que no este metilado en las bacterias. Este cambio altera un aminoacido - S94C - en la protema E3 de 106 aminoacidos que es homologa de la supuesta protema del Ad4 CR1 delta de 11 K). El cebador 'W33 inverso' contiene el sitio EcoRI (subrayado). La correspondiente secuencia natural del Ad es GAATCC. La base cambiada esta en un codon para la isoleucina (residuo 123 del orf 6/7 de la protema E4) que no se ve alterada por este cambio.
El sitio ClaI es el mismo que el que esta en el 30303 del SAdV-29; se creo el sitio EcoRI en el cebador de forma que su empalme con la region E4 del Ad Pan 5 crea un orf 6/7 de la E4 quimerico (el sitio EcoRI en pPan5C1delRI esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la protema E4 del Ad Pan 5).
Se llevo a cabo una PCR mediante el uso de la polimerasa NEB Phusion y de los tampones proporcionados por el fabricante.
El producto de 2480 pb PCR fue digerido con EcoRI y ClaI y clonado en pPan5C1 delRI entre los dos mismos sitios para producir pPan5C1delR1-C29 PCR.
2. Insercion del fragmento AscI (11094) en ClaI (18583) (entre el sitio AscI presente en el gen pol y el unico sitio ClaI).
El plasmido pPan5C1delR1-C29 PCR fue digerido con AscI y ClaI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-29 AscI (11094) en ClaI (18583) (entre el sitio AscI presente en el gen pol y el unico sitio ClaI), para producir el pPan5-C29 delAsc delCla.
3. Insercion del fragmento AscI (7945) en AscI (11094) (para crear un gen de la polimerasa quimerico).
El plasmido pPan5-C29 delAsc delCla fue digerido con AscI y en el se clono el fragmento de ADN vmco del SAdV-29 AscI (7945) en AscI (11094) (crea un gen de la polimerasa quimerico). El clon con la orientacion correcta se denomino pPan5-C29 del Cla.
4. Insercion del fragmento ClaI (18583) en ClaI (30303).
El plasmido pPan5-C29 del Cla fue digerido con ClaI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-29 ClaI (18583) en ClaI (30303). El clon con la orientacion correcta se denomino pC5/C29 IP. El plasmido pC5/C29 IP porta un ADN vmco (SAdV-22) con el E1 delecionado del Ad Pan 5 en el que un segmento interno de 25603 pb (pb n° 7955 - pb n° 33557) ha sido sustituido por un segmento analogo funcional de 24817 pb (pb n° 7945 - pb n° 32761) del SAdV-29, es decir, esto da como resultado la sustitucion de los genes del SAdV-22 para la protema pre-terminal, la protema 52/55 K, la base pentona, la pVII, el Mu, la hexona, la endoproteasa, la protema de union al ADN, la protema de soporte de 100 K, la protema de 33 K, la pVIII, la region E3 y la fibra, por los del SAdV-29. El AscI en el extremo izquierdo del fragmento del SAdV-29 esta en el comienzo del marco abierto de lectura de la polimerasa de ADN (residuo 236 de la protema de 1192 residuos) y da como resultado una protema quimerica. El sitio EcoRI, que constituye el extremo derecho del fragmento del SAdV-29, esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la E4. El extremo derecho se ligo a un fragmento terminal derecho generado mediante una PCR del Ad Pan 5 de forma que el producto de la traduccion regenerado del orf 6/7 de la E4 sea quimerico entre el Ad Pan 5 y el SAdV-29.
D. Construccion de un clon molecular de plasmido basado en el SAdV-32, mediante el uso de tecnicas estandar de biologfa molecular
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con AdC1 han indicado que las deleciones E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK 293, se genero un adenovirus hnbrido basandose en una estrategia mediante el uso del AdC1 [Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], en el que los extremos izquierdo y
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El plasmido de partida era uno que ha^a sido construido en un intermedio de la construccion del vector quimerico AdC1 - pPan5C1delRI, segun se describe en el documento WO 2005/001103 A3, publicado el 6 de enero de 2005.
1. PCR
El segmento Ad C1 del pPan5C1delRI (entre Clal y EcoRI) fue sustituido por un fragmento generado mediante una PCR mediante el uso del ADN vmco del SAdV-32 como molde.
Se usaron los cebadores SEQ ID NO: 202: TTGTAGCATAGTTTGCCTGG [C32 directo] y SEQ ID NO: CTCAAATGGAAT- TCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34, (W33 inverso)]. El cebador 'W33 inverso' contiene el sitio EcoRI (subrayado). La correspondiente secuencia del Ad natural es GAATCC. La base cambiada esta en un codon para la isoleucina del orf 6/7 de la protema E4, que no se ve alterada por este cambio. Se creo un sitio EcoRI en el cebador de forma que su empalme con la region E4 del Ad Pan 5 crea un orf 6/7 de la E4 quimerico (el sitio EcoRI de pPan5C1delRI esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la protema E4 del Ad Pan 5).
Se llevo a cabo una PCR mediante el uso de la polimerasa NEB Phusion y de los tampones proporcionados por el fabricante.
El producto de 2259 pb fue digerido con MluI y EcoRI y se clono en pPan5C1 delRI entre los dos mismos sitios para producir el pPan5C1 C32 PCR.
2. Insercion del fragmento AscI (7945) en MluI (16058) del SAdV-32 (entre el sitio AscI presente en el gen pol y el sitio MluI).
El plasmido pPan5C1 C32 PCR fue digerido con AscI y MluI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV- 32 viral (7945) en MluI (16058), para producir el pPan5/C32 del Mlu.
3. Insercion del fragmento MluI (desde 16058 hasta 30510).
El plasmido pPan5/C32 del Mlu fue digerido con MluI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-32 MluI (desde 16058 hasta 30510). El clon con la orientacion correcta se denomino pC5/C32 IP.
El plasmido pC5/C32 IP porta un ADN vmco con el E1 delecionado del Ad Pan 5 (SAdV-22) en el que un segmento interno de 25603 pb (pb n° 7955 - pb n° 33557) ha sido sustituido por un segmento analogo funcional de 24817 pb (pb n° 7945 - pb n° 32761 ) del SAdV-32, es decir, esto da como resultado la sustitucion de los genes del SAdV-22 para la protema pre-terminal, la protema 52/55 K, la base pentona, la pVII, el Mu, la hexona, la endoproteasa, la protema de union al ADN, la protema de soporte de 100 K, la protema de 33 K, la pVIII, la region E3 y la fibra, por los del SAdV-32. El AscI en el extremo izquierdo del fragmento del SAdV-32 esta en el comienzo del marco abierto de lectura de la polimerasa de ADN (residuo 236 de la protema de 1192 residuos) y da como resultado una protema quimerica. El sitio EcoRI, que constituye el extremo derecho del fragmento del SAdV-32, esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la E4. El extremo derecho se ligo a un fragmento terminal derecho generado mediante una PCR del Ad Pan 5, de forma que el producto de la traduccion regenerado orf 6/7 de la E4 sea quimerico entre el Ad Pan 5 y el SAdV-32.
E. Construccion de un clon molecular de plasmido con el E1 delecionado basado en el SAdV-35, mediante el uso de tecnicas estandar de biologfa molecular
Debido a que tanto los informes publicados como la experiencia de los inventores con AdC1 han indicado que las deleciones E1 en los adenovirus del subgrupo B no son complementadas por los genes Ad5 E1 en las celulas HEK 293, se genero un adenovirus hubrido basandose en una estrategia mediante el uso del AdC1 [Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], en el que los extremos izquierdo y derecho de una construccion quimerica derivan del adenovirus de chimpance Pan 5 (tambien conocido como el adenovirus de simio 22).
El plasmido de partida era uno que habfa sido construido en un intermedio de la construccion del vector quimerico AdC1 - pPan5C1delRI, segun se describe en el documento WO 2005/001103 A3, publicado el 6 de enero de 2005.
1. Insercion del fragmento AscI (11058) en EcoRI (22198) del SAdV-35.
El plasmido pPan5C1delRI fue digerido con AscI y EcoRI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-35 AscI (11058) en EcoRI (22198), para producir el pPan5CI C35 Asc-RI.
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2. Insercion del fragmento AscI (desde 7928 hasta 11058)
El plasmido pPan5CI C35 Asc-RI fue digerido con AscI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-35 AscI (desde 7928 hasta 11058). El clon con la orientacion correcta se denomino pPan5CI C35 Asc-RI + Asc.
3. Insercion del fragmento EcoRI (desde 22198 hasta 32738)
El plasmido pPan5CI C35 Asc-RI + Asc fue digerido con EcoRI y en el se clono el fragmento del ADN vmco del SAdV-35 EcoRI (desde 22198 hasta 32738). El clon con la orientacion correcta se denomino pC5/C35 IP.
El plasmido pC5/C35 IP porta un ADN vmco con el E1 delecionado del Ad Pan 5 (SAdV-22) en el que un segmento interno de 25603 pb (pb n° 7955 - pb n° 33557) ha sido sustituido por un segmento analogo funcional de 24817 pb (pb n° 7945 - pb n° 32761 ) del SAdV-35, es decir, esto da como resultado la sustitucion de los genes del SAdV-22 para la protema pre-terminal, la protema 52/55 K, la base pentona, la pVII, el Mu, la hexona, la endoproteasa, la protema de union al ADN, la protema de soporte de 100 K, la protema de 33 K, la pVIII, la region E3 y la fibra, por los del SAdV-35. El AscI en el extremo izquierdo del fragmento del SAdV-35 esta en el comienzo del marco abierto de lectura de la polimerasa de ADN (residuo 236 de la protema de 1192 residuos) y da como resultado una protema quimerica. El sitio EcoRI, que constituye el extremo derecho del fragmento del SAdV-35, esta en el marco abierto de lectura orf 6/7 de la E4. El extremo derecho se ligo a un fragmento terminal derecho generado mediante una PCR del Ad Pan 5, de forma que el producto de la traduccion regenerado orf 6/7 de la E4 sea quimerico entre el Ad Pan 5 y el SAdV-35.
F. Vectores adenovmcos con el E1 delecionado
Con objeto de construir vectores adenovmcos con el E1 delecionado que expresan la nucleoprotema del virus de la gripe, se optimizaron los codones de la secuencia de nucleotidos de la NP del virus de la gripe A H1N1 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai, numero de registro del GenBank AF389119.1) y se sintetizo completamente (Celtek Genes, Nashville, TN). Se construyo un casete de expresion formado por el promotor temprano del citomegalovirus humano, un intron sintetico (obtenido a partir del plasmido pCI (Promega, Madison, Wisconsin), la secuencia codificante con los codones optimizados de la NP de la gripe A y la senal de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina. El plasmido pShuttle CMV PI FluA NP porta el casete de expresion anteriormente descrito en el que esta flanqueado por los sitios de reconocimiento para las enzimas de restriccion de corte raro I-CeuI y PI-SceI (New England Biolabs) respectivamente. Con objeto de crear un clon molecular de un vector adenovmco con el E1 delecionado, se creo en primer lugar un clon molecular del plasmido de los adenovirus con el E1 delecionado en el que se han insertado los sitios de reconocimiento para las enzimas de restriccion de corte raro I-CeuI y PI-SceI en lugar de una delecion E1. Los plasmidos adenovmcos con el E1 delecionado se digirieron despues con I-CeuI y PI-SceI y se ligo en ellos el casete de expresion (digerido con las mismas enzimas). Los clones moleculares del plasmido adenovmco resultante se transfectaron en celulas HEK 293 para rescatar el vector adenovmco recombinante. Se encontro que el rescate posterior a la transfeccion estaba facilitado si en primer lugar se liberaba el genoma adenovmco lineal del plasmido mediante una digestion con enzimas de restriccion.
Ejemplo 3 - Evaluacion de la neutralizacion cruzada
Se evaluo la actividad de neutralizacion cruzada de los SAdV-27, SAdV-28, SAdV-29, SAdV-32 y SAdV-35 naturales en comparacion con el Adenovirus 5 humano (subespecie C) y el adenovirus 7 de chimpance (SAdV-24), y las IgG humanas se agruparon mediante el uso de un ensayo de anticuerpos neutralizantes de inhibicion de la infeccion monitorizado mediante una inmunofluorescencia directa. Las IgG humanas agrupadas [IgG Hu agrupadas] fueron adquiridas comercialmente y aprobadas para su administracion en pacientes inmunodeprimidos, ya que contienen anticuerpos contra varios antfgenos a los que esta expuesta la poblacion humana en general. La presencia o la ausencia de anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus de simio para las IgG humanas agrupadas es un reflejo de la prevalencia de los anticuerpos contra estos adenovirus en la poblacion general.
El ensayo se llevo a cabo como sigue. Las muestras sericas de los conejos a los que se les inyectaron el HAdV-5 o el SAdV-24 fueron inactivadas con calor a 56 °C durante 35 min. Los adenovirus naturales (108 partfculas/pocillo) se diluyeron en medio de Eagle modificado por Dulbecco exento de suero (DMEM) y se incubaron con diluciones dobles sucesivas de las muestras sericas inactivadas con calor en DMEM durante 1 h a 37 °C. Posteriormente, la mezcla de suero-adenovirus se anadio a portaobjetos en pocillos con una monocapa de 105 celulas A549. Despues de 1 h, las celulas de cada pocillo se complementaron con 100 pl de suero bovino fetal al 20 % (FBS)-DMEM y se cultivaron durante 22 h a 37 °C en un 5 % de CO2. Despues, las celulas se aclararon dos veces con PBS y se tineron con DAPI y un anticuerpo de cabra con una amplia reactividad cruzada marcado con FITC (Virostat) creado contra el HAdV-5 despues de una fijacion en paraformaldehudo (al 4 %, 30 min) y una permeabilizacion en Triton al 0,2 % (a 4 °C, 20 min). El nivel de infeccion se determino mediante el recuento del numero de celulas positivas para FTTC bajo un microscopio. El tttulo de NAB se notifico como la mayor dilucion serica que inhibfa la infeccion por adenovirus en un 50 % o mas, en comparacion con el suero de control sin tratar.
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Cuando se muestra un valor del tftulo < 1/20, la concentracion de anticuerpos neutralizantes esta por debajo del Ifmite de deteccion, es decir, de 1/20.
Especie
Virus Anti-HAdV-5 Anti-SAdV-24 IgG H. agrupadas
C
HAdV-5 1/81.920 < 1/20 1/640
E
SAdV-24 (C7) < 1/20 1/655.360 1/20
SAdV-27 1/20 < 1/20 < 1/20
B
SAdV-28 < 1/20 < 1/20 1/40
SAdV-29
< 1/20 < 1/20 < 1/20
SAdV-32 < 1/20 < 1/20 < 1/20
SAdV-35 < 1/20 < 1/20 1/20
Estos datos indican que no hay ninguna inmunidad preexistente detectable contra el SAdV-27, el SAdV-29 ni el SAdV-32 en la poblacion en general; y una minima inmunorreactividad contra el SAdV-28 y el SAdV-35. Estos datos indican adicionalmente que los adenovirus de simio de la anterior Tabla, que no presentan reactividad cruzada con el HAdV-5 ni con el SAdV-24, podnan ser utiles en regfmenes que implican la administracion secuencial de adenovirus, por ejemplo, en terapias de sensibilizacion y refuerzo u oncologicas.
Ejemplo 4 - Induccion de citocinas
Se aislaron celulas dendnticas plasmacitoides a partir de celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) y se cultivaron en medio en placas de 96 pocillos y se infectaron con los adenovirus. Despues de 48 h las celulas se rotan y el sobrenadante se recoge y se analiza para evaluar la presencia de interferon a.
Mas espedficamente, las PBMC se obtuvieron en el centro de inmunologfa del Center For SIDA Research (CFAR) de la University of Pennsylvania. Despues se usaron 300 millones de estas celulas para aislar las celulas dendnticas plasmacitoides (pDC) mediante el uso del "kit de aislamiento de celulas dendnticas plasmacitoides humanas" de Miltenyi Biotec segun las instrucciones proporcionadas junto con el kit. El aislamiento mediante el uso de este kit se baso en la eliminacion de todos los demas tipos celulares excepto las pDC a partir de las PBMC.
La cantidad final de celulas habitualmente es variable de un donante a otro, pero vana entre 0,4-0,7 millones de celulas. De forma que los datos que se han generado (analizados a continuacion) proceden del analisis de las celulas de multiples donantes. No obstante, sorprendentemente, la separacion de los subgrupos basada en la liberacion de interferon o de otras citocinas se mantiene incluso cuando se analizan celulas procedentes de multiples donantes.
Las celulas se cultivaron en medio RPMI-1640 (Mediatech) complementado con L-glutamina, suero bovino fetal al 10% (Mediatech), solucion tampon de Hepes 10 mM (Invitrogen), antibioticos (penicilina, estreptomicina y gentamicina - de Mediatech) e interleucina humana 3 (20 ng/ml - R&D). Se anadieron directamente los adenovirus naturales a las celulas a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 10.000 (10.000 partfculas vmcas por celula, con una concentracion de 106 celulas/ml). Despues de 48 h las celulas se rotaron y el sobrenadante se ensayo para evaluar la presencia de interferon. Las citocinas se midieron mediante el uso de un kit de ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA) de PBL Biomedical Laboratories mediante el uso del protocolo recomendado por el fabricante.
El estudio demostro que los adenovirus del subgrupo C no produdan unas cantidades detectables de IFNa (el ensayo tiene un lfmite deteccion de 1.250 pg/ml). Por el contrario, todos los miembros ensayados de los adenovirus del subgrupo E produdan IFNa y, en general, produdan significativamente mas IFNa en comparacion con el subgrupo de adenovirus B.
Tambien se detectaron otras diversas citocinas en el cribado de los adenovirus. Sin embargo, en general, los adenovirus del subgrupo E produdan unos niveles significativamente mayores de IL-6, de RANTES, de MIP-1a, de TNF-a, de IL-8 y de IP-10 que los adenovirus del subgrupo C. Los adenovirus del subgrupo B tambien superaron a los adenovirus del subgrupo C en la induccion de IFNa, de IL-6, de RANTES y de MIP1a.
Dado que no se observo una lisis celular significativa en este estudio, esto sugiere que la citocina es producida mediante el contacto de las celulas con los adenovirus del subgrupo E, independientemente de la infeccion y en ausencia de cualquier cantidad significativa de replicacion vmca.
En otro estudio (no mostrado) las celulas se incubaron como se ha descrito anteriormente con protemas de la capside C7 vadas (subgrupo E de Ad) o con un vector vmco C7 de adenovirus inactivado con UV (la inactivacion con UV provoca una reticulacion, eliminando la expresion genica del adenovirus). En estos estudios se observaron unos niveles iguales o superiores del IFNa tanto para la capside vada como para el vector vmco inactivado, en comparacion con el C7 intacto.
En el ambito de la anteriormente identificada memoria descriptiva se incluyen numerosas modificaciones y variaciones, y se espera que sean obvias para el experto en la materia. Se cree que dichas modificaciones y alteraciones, tales como las selecciones de diferentes minigenes o la seleccion de los vectores o de los moduladores inmunitarios, estan en el ambito de las reivindicaciones anexas a la misma.
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Claims (6)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un adenovirus que tiene una capside que comprende:
    una protema hexona del SAdV-28, los aminoacidos 1 a 944 de la SEQ ID NO: 11; una protema pentona del SAdV-28, los aminoacidos 1 a 582 de la SEQ ID NO: 6; y una protema de fibra del SAdV-28, los aminoacidos 1 a 323 de la SEQ ID NO: 21;
    encapsidando dicha capside una molecula heterologa portadora de un gen unido operativamente a secuencias de control de la expresion que dirigen la transcripcion, la traduccion y/o la expresion del mismo en una celula hospedadora, y que comprende adicionalmente los elementos en cis en 5' y en 3' del adenovirus necesarios para la replicacion y la encapsidacion.
  2. 2. El adenovirus segun la reivindicacion 1, en el que dicho adenovirus recombinante carece de la totalidad o de parte del gen E1.
  3. 3. El adenovirus segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicho adenovirus tiene una replicacion defectuosa.
  4. 4. El adenovirus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho adenovirus es un adenovirus pseudotipado que comprende los elementos en cis en 5' y en 3' del adenovirus necesarios para la replicacion y la encapsidacion, comprendiendo dichos elementos en cis una repeticion terminal invertida en 5' del adenovirus y una repeticion terminal invertida en 3' del adenovirus.
  5. 5. Una composicion que comprende un virus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un portador farmaceuticamente aceptable.
  6. 6. Un adenovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en la administracion de una molecula a una celula objetivo.
ES08857781.2T 2007-11-28 2008-11-24 Adenovirus de simio de la subfamilia B SADV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos Active ES2621165T3 (es)

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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008331906B2 (en) 2007-11-28 2014-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-39
CA2716928C (en) * 2008-03-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses sadv-36,-42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US8940290B2 (en) 2008-10-31 2015-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50 and uses thereof
EP2435559A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
US9217159B2 (en) 2012-05-18 2015-12-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1302, A1320, A1331 and A1337 and uses thereof
CA3115891A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
DK3198009T3 (da) 2014-09-24 2021-11-22 Salk Inst For Biological Studi Onkolytiske tumorvira og anvendelsesfremgangsmåder
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
SG10202001102XA (en) 2014-11-14 2020-03-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
CN107109407A (zh) 2014-11-14 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
CA2975432A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Transgene Sa Immunotherapeutic vaccine and antibody combination therapy
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
BR112017026523A2 (pt) * 2015-06-12 2018-08-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa vetor recombinante, adenovírus recombinante, composição, uso de um vetor recombinante, de um adenovírus recombinante ou de uma composição, método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, e, polinucleotídeo isolado.
AU2016362477A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
EP3390645B1 (en) 2016-02-23 2022-09-14 Salk Institute for Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US20190134190A1 (en) 2016-05-04 2019-05-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
EP3458588B1 (en) 2016-05-18 2025-10-29 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
EP3458589A4 (en) 2016-05-18 2020-01-01 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING MORBUS HUNTINGTON
WO2018035503A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
EP3522920A2 (en) 2016-10-10 2019-08-14 Transgene SA Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
CN110062630A (zh) 2016-12-12 2019-07-26 萨克生物研究学院 肿瘤靶向合成腺病毒及其用途
US11752181B2 (en) 2017-05-05 2023-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's disease
AU2018261790B2 (en) 2017-05-05 2024-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
EP3654860A1 (en) 2017-07-17 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
CN111448308A (zh) 2017-08-03 2020-07-24 沃雅戈治疗公司 递送aav的组合物和方法
US20200263199A1 (en) 2017-09-29 2020-08-20 Voyager Therapeutics, Inc. Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CA3096099A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions with enhanced replication properties
CN112424359A (zh) 2018-05-15 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森氏病的组合物和方法
US12060567B2 (en) 2018-06-13 2024-08-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered untranslated regions (UTR) for AAV production
CA3106078A1 (en) 2018-07-17 2020-01-23 Junghun Lee Treatment of neuropathy with dna constructs expressing igf-1 isoforms
CA3107462A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
CN113383010B (zh) 2018-09-28 2025-09-09 沃雅戈治疗公司 具有经工程化改造的启动子的共济蛋白表达构建体及其使用方法
WO2020072849A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020072844A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
JP2022505106A (ja) 2018-10-15 2022-01-14 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおけるｒＡＡＶの大規模産生のための発現ベクター
CA3128230A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Oregon Health & Science University Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids
NL2023464B1 (en) * 2019-07-09 2021-02-02 Academisch Ziekenhuis Leiden Oncolytic Non-human adenoviruses and uses thereof
TW202217002A (zh) 2020-07-13 2022-05-01 法商傳斯堅公司 免疫抑制之治療
BR112023015303A2 (pt) 2021-02-01 2023-11-14 Regenxbio Inc Método para tratar doença cln2 devido a deficiência de tpp1 em um sujeito
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
WO2023173114A2 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 Technovax, Inc. Recombinant virus-like particle capsid vaccines against adenoviruses and compositions, methods, and use thereof
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117143833B (zh) * 2023-08-21 2024-06-04 暨南大学 一种猴腺病毒毒株及其应用
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法
US20250276095A1 (en) 2024-03-04 2025-09-04 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2025226842A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Kate Therapeutics, Inc. Expression control by drg-expressed mirnas
WO2025226841A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Kate Therapeutics, Inc. Gene therapy approach for treating disorders associated with tnnt2
WO2026011009A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Kate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for muscle disorders
WO2026011008A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Kate Therapeutics, Inc. Expression control by skeletal muscle-expressed mirnas
WO2026030242A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2026030244A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of limb girdle muscular dystrophy 2a
WO2026050402A1 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Kate Therapeutics, Inc. Liver de-targeted muscle tropic capsids

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2008A (en) * 1841-03-18 Gas-lamp eok conducting gas pkom ah elevated buhner to one below it
US2009A (en) * 1841-03-18 Improvement in machines for boring war-rockets
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
AU1822499A (en) 1997-12-12 1999-06-28 Saint Louis University Ctip, a novel protein that interacts with ctbp and uses therefor
CA2450470C (en) 2001-06-22 2012-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
PL216200B1 (pl) * 2001-06-22 2014-03-31 Univ Pennsylvania Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka
WO2003046124A2 (en) 2001-11-21 2003-06-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
US7291498B2 (en) * 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7491508B2 (en) * 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
ATE449105T1 (de) 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
US20080004236A1 (en) * 2004-02-06 2008-01-03 Comper Wayne D High Dose, Short Interval Use of Sulfated Polysaccharides for Treatment of Infections
PL1802336T3 (pl) * 2004-10-14 2012-03-30 Crucell Holland Bv Szczepionki pierwotne/przypominające przeciw malarii
AU2006245920A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Glaxo Group Limited Vaccine composition
ES2341501T3 (es) 2006-04-28 2010-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Proteina hexon de adenovirus modificado y usos de la misma.
AU2008331906B2 (en) 2007-11-28 2014-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-39
EP2463362B1 (en) 2007-11-28 2017-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily c adenovirus SAdv-31 and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX389295B (es) 2025-03-20
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CA2706257A1 (en) 2009-06-11
CA2706257C (en) 2017-06-06
AU2014277699B2 (en) 2017-04-06

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ES2621165T3 (es) Adenovirus de simio de la subfamilia B SADV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos
US11807866B2 (en) Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50, and uses thereof
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