PL216200B1 - Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka - Google Patents

Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka

Info

Publication number
PL216200B1
PL216200B1 PL372294A PL37229402A PL216200B1 PL 216200 B1 PL216200 B1 PL 216200B1 PL 372294 A PL372294 A PL 372294A PL 37229402 A PL37229402 A PL 37229402A PL 216200 B1 PL216200 B1 PL 216200B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
recombinant
adenovirus
simian
adenoviral
Prior art date
Application number
PL372294A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372294A1 (pl
Inventor
Hildegund C.J. Ertl
James M. Wilson
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Wistar Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pennsylvania, Wistar Inst filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of PL372294A1 publication Critical patent/PL372294A1/pl
Publication of PL216200B1 publication Critical patent/PL216200B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka.
Niniejsza praca była finansowana przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia (National Institute of Health), P30 DK 47757-08 i P01 HL59407-02 i grant NIAID AI49766-01.
Adenowirusowe rekombinanty ludzkiego serotypu 5 testowano jako nośniki szczepionki różnych antygenów pochodzących z wirusów, pasożytów lub komórek nowotworowych. Wyniki były zachęcające, gdyż adenowirusowe rekombinanty wywoływały odpowiedzi odpornościowe przeciwko produktowi transgenowemu. Adenowirus ludzkiego serotypu 5 (Ad5) jest wszechobecnym wirusem przeziębienia, który zaraża większość ludzi w ich pierwszym roku życia. Twórcy stwierdzili, że istniejąca wcześniej odporność na pospolite ludzkie serotypy obniża skuteczność rekombinowanej adenowirusowej szczepionki opartej na homologicznym serotypie wirusa. W pewnych przypadkach to obniżenie skuteczności może być przezwyciężone przez dostarczanie wyższych dawek rekombinantów ludzkiego adenowirusa. Jednakże, te wyższe dawki mogą być związane z innymi niepożądanymi efektami ubocznymi.
Potrzebne są zatem kompozycje, użyteczne do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko wybranym cząsteczkom, które są pozbawione problemów związanych z obecnymi sposobami dostarczania.
Podsumowanie wynalazku
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają indukowanie cytotoksycznej odpowiedzi odpornościowej na heterologiczną cząsteczkę przez dostarczanie cząsteczki gospodarzowi za pośrednictwem zrekombinowanego małpiego adenowirusa. Twórcy niespodziewanie stwierdzili, że zrekombinowane małpie adenowirusy, zastosowane zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku, prezentują immunogen w sposób, który indukuje znacząco skuteczniejsze odpowiedzi limfocytów T CD8+ niż, gdy immunogen jest dostarczany przez porównywalny ludzki wirus typu 5. Dodatkowo, twórcy stwierdzili, że zrekombinowane adenowirusy szympansa indukują w przybliżeniu pięciokrotnie wyższe poziomy interferonu-α i interferonu-β, niż ludzkie adenowirusy.
Zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza adenowirusowego małpiego wektora o uszkodzonej zdolności do replikacji zawierającego, w kapsydzie małpiego adenowirusa, elementy cis małpiego adenowirusa oraz heterologiczny gen funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontrolującymi ekspresję, przy czym kapsyd małpiego adenowirusa jest otrzymany z adenowirusa szympansa wybranego z grupy składającej się z Pan 5, Pan 6, oraz Pan 7. Korzystnie, uszkodzona zdolność do replikacji adenowirusowego wektora według wynalazku wynika z braku zdolności do wyrażania adenowirusowych E1a i E1b. Korzystniej, w adenowirusowym małpim wektorze według wynalazku usunięty jest opóźniony wczesny gen E3. Również korzystnie adenowirusowy małpi wektor według wynalazku wykazuje funkcjonalną delecję genu E4 lub wykazuje delecję w opóźnionym wczesnym genie E2a lub delecję w dowolnym z późnych genów L1 do L5 genomu małpiego adenowirusa.
W korzystnej postaci wykonania gen heterologiczny w adenowirusowym wektorze według wynalazku koduje produkt immunogenny z wirusa wybranego z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odporności, małpiego wirusa niedoboru odporności, syncytjalnego wirusa oddechowego, wirusa parainfIuenzy typu 1-3, wirusa grypy, wirusa opryszczki Herpes simplex, ludzkiego wirusa cytomegalii, wirusów zapalenia wątroby, ludzkiego wirusa brodawczaka, wirusa polio, rotawirusa, caliciwirusów, wirusa odry, wirusa świnki, wirusa różyczki, adenowirusa, wirusa wścieklizny, psiego wirusa nosówki, wirusa księgosuszu, koronawirusa, parwowirusa, zakaźnych wirusów zapalenia nosotchawicy, kociego wirusa białaczki, zakaźnego kociego wirusa zapalenia otrzewnej, ptasiego zakaźnego wirusa chorób torebki maziowej, wirusa choroby Newcastle, wirusa choroby Mareka, świńskiego wirusa zespołu oddechowego i rozrodczego, końskiego wirusa zapalenia tętnicy i wirusów zapalenia mózgu.
Korzystnie gen heterologiczny w adenowirusowym wektorze według wynalazku koduje produkt immunogenny z bakterii wybranej z grupy składającej się z Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, kompleks Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium
PL 216 200 B1 tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae oraz Mycoplasma gallisepticum.
W alternatywnej korzystnej postaci wykonania adenowirusowy małpi wektor zawiera gen heterologiczny kodujący produkt immunogenny z grzyba wybranego z grupy składającej się z Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus oraz Histoplasma.
W innej korzystnej postaci wykonania adenowirusowy małpi wektor według wynalazku zawiera gen heterologiczny kodujący produkt immunogenny z pasożyta wybranego z grupy składającej się z Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii oraz Pneumocystis carinii.
W kolejnej korzystnej postaci wykonania adenowirusowy małpi wektor według wynalazku zawiera gen heterologiczny przeznaczony do wywołania działania przeciwrakowego z wykorzystaniem antygenu rakowego lub antygenu związanego z guzem wybranego z grupy składającej się z antygenu specyficznego wobec prostaty, antygenu rakowo-embrionalnego, MUC-1, Her2, CA-125 oraz MAGE-3.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania wektora według wynalazku, który obejmuje złożenie genu heterologicznego i elementu cis sekwencji ITR małpiego adenowirusa.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanego adenowirusa według wynalazku do wytwarzania leku do indukowania u osobnika odpowiedzi limfocytów T na immunogen, przy czym zrekombinowany małpi adenowirus korzystnie indukuje odpowiedzi limfocytów T CD8+ na immunogen gdy jest dostarczony podskórnie, a ponadto, rekombinowany adenowirus zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunogen pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które kierują ekspresją immunogenu u osobnika.
Wynalazek dotyczy również zastosowania rekombinowanego adenowirusa według wynalazku do wytwarzania leku do indukowania u osobnika odpowiedzi przeciwciał na immunogen, przy czym rekombinowany małpi adenowirus korzystnie indukuje odpowiedź przeciwciał na immunogen przy niskich dawkach, gdy jest dostarczony do śluzówki, a ponadto rekombinowany adenowirus zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunogen pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które kierują ekspresją immunogenu u osobnika.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku rekombinowany małpi adenowirus jest korzystnie spreparowany do podawania podskórnie lub do podawania w małej dawce. Korzystniej rekombinowany małpi adenowirus jest zgodnie z zastosowaniem według wynalazku spreparowany do podawania w skutecznej dawce, będącej w zakresie od 104 pfu do 106 pfu.
W korzystnej postaci wykonania zastosowania według wynalazku immunogen jest wybrany z grupy składającej się z peptydu, polipeptydu lub białka otrzymanych z patogennego wirusa wybranego z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1, ludzkiego wirusa brodawczaka i wirusa wścieklizny.
W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza immunogennej kompozycji użytecznej do indukowania cytolitycznej odpowiedzi odpornościowej na ludzki wirus niedoboru odporności, obejmującej (a) rekombinowany małpi adenowirus według wynalazku zawierający optymalizowaną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmodyfikowane białko gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 oraz (b) fizjologicznie dopasowany nośnik. Lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do indukowania odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności u ssaków.
W innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanego małpiego adenowirusa według wynalazku kodującego immunogenne białko otrzymane z ludzkiego wirusa brodawczaka do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka u ssaków. Alternatywnie wynalazek dotyczy zastosowania rekombinowanego małpiego adenowirusa według wynalazku kodującego immunogenne białko otrzymane z wirusa wścieklizny do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi neutralizujących przeciwciał przeciwko wściekliźnie u ssaków.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności zawierającej rekombinowany małpi adenowirus według wynalazku, przy czym gen heterologiczny koduje antygen ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 (HIV-1), a korzystniej antygen jest wybrany z grupy składającej się z otoczki, regionu pol i gag HIV-1. W korzystnej postaci wykonania z adenowirusa usunięto elementy genetycznej niestabilności. Również korzystnie, heterologicznym genem jest cDNA kodujący gag HIV-1 obejmujący sekwencję z SEK NR ID: 6.
PL 216 200 B1
Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko wściekliźnie zawierająca rekombinowany małpi adenowirus według wynalazku, przy czym heterologiczny gen koduje antygen wścieklizny.
Korzyści niniejszego wynalazku będą z łatwością zrozumiałe na podstawie poniższego szczegółowego opisu wynalazku.
Krótki opis rysunku
Fig. 1 podsumowuje genetyczną organizację genomu adenowirusa C68 szympansa. Na fig. 1A genom adenowirusa C68 szympansa jest schematycznie przedstawiony jako prostokąt na górze. Odwrócone końcowe powtórzenia zaznaczono na czarno i wczesne regiony zaznaczono na szaro. Strzałki powyżej prostokąta wskazują kierunek ekspresji wczesnych genów. Linia poniżej prostokąta przedstawia podział genomu na 100 jednostek mapowych. Strzałki poniżej linii przedstawiają pięć późnych regionów genu oraz białka kodowane w każdym z tych regionów. Liczby poniżej prostokąta lub strzałki wskazują na start (promotor lub kodon inicjujący) i koniec (kanoniczny sygnał PoliA) dla każdego regionu. * oznacza późny promotor E2A. Fig. 1B przedstawia klony Pstl; Fig. 1C przedstawia klony BamHI. Fig. 1D przedstawia klony Hindlll. Dla części 1B-1D, niezacieniowane regiony wskazują, że fragment wklonowano do plazmidowego wektora, jak wymieniono w Tabeli 1, podczas gdy zacieniowane regiony wskazują, że fragment restrykcyjny nie był klonowany. Dla każdej sekcji nazwa fragmentu, alfabetycznie, zaczynając od A oznaczającego największy fragment, i wielkości fragmentów wymieniono powyżej prostokąta, a punkty końcowe fragmentu wymieniono poniżej prostokąta.
Fig. 2 dostarcza wielokrotne przyporządkowanie sekwencji heksonowych białek. Wydedukowane sekwencje aminokwasowe bardzo podobnych ludzkich adenowirusowych heksonów porównano z adenowirusem szympansa stosując CLUSTAL X. Serotypy i podgrupy wskazano na lewym marginesie, a następnie podano liczbę reszt. Numerowanie dotyczy pozycji aminokwasowych w odniesieniu do początku translacji. Aminokwasy zacieniowano w odniesieniu do C68, aby wyróżnić podobieństwa sekwencji (szary) i identyczności (czarny). Siedem hiperzmiennych regionów w domenach pętli DE1 i FG1 oznakowano u dołu i odpowiadają one następującym sekwencjom Ad2 w przyporządkowaniu: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3, 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278-294; HVR6, 316-327; i HVR7, 433-465. Numery dostępu w GenBank przestawionych sekwencji są następujące: AAD03657 (Ad4), S37216 (Ad16), S39298 (Ad3), AAD03663 (Ad7), i NP040525 (Ad2).
Szczegółowy opis wynalazku
W porównaniu immunogenności adenowirusowych rekombinantów ludzkiego szczepu 5 do immunogenności adenowirusa szympansa szczepu 68, obu wyrażających odciętą sekwencję gag, wykazano, że adenowirus szympansa był bardziej skuteczny. Podobne wyniki obserwowano dla zrekombinowanych adenowirusów szympansa wyrażających białko o zielonej fIuorescencji i glikoproteiny wirusa wścieklizny. Ta większa skuteczność zrekombinowanego adenowirusa szympansa nie jest najprawdopodobniej połączona z wyższą ekspresją transgenową, zgodnie z badaniami przeprowadzonymi z zastosowaniem rekombinantów zarówno Ad jak i szympansa niosących podobne kasety ekspresyjne, w których transgen jest kontrolowany przez wczesny promotor wirusa cytomegalii. Dane przedstawione tutaj również wskazują, że jest to mało prawdopodobne, aby odzwierciedlane były różnice w tropizmie, gdyż wirusy zarówno szympansa jaki i Ad5 wykorzystują ten sam receptor komórkowy. Wyniki te raczej wykazują, że zrekombinowane adenowirusy szympansa, zastosowane według niniejszego wynalazku, niespodziewanie wykazują działanie wspomagające (adiuwacyjność), która jest różna niż ludzkich adenowirusów. Lepsze działanie wspomagające (adiuwacyjność) ma zasadniczy wpływ na wielkość i kinetykę specyficznych dla transgenu odpowiedzi immunologicznych indukowanych przez adenowirus szympansa.
Korzystnie, ta wyższa skuteczność pozwala na zastosowanie niższych dawek adenowirusów szympansa, niż byłoby to konieczne dla układu dostarczania ludzkim adenowirusem. Dodatkowo, twórcy stwierdzili, że zrekombinowane adenowirusy szympansa indukują w przybliżeniu pięciokrotnie wyższe poziomy interferonu-α i interferonu-β niż ludzkie adenowirusy.
Ponadto, stwierdzono, że zrekombinowane adenowirusy szympansa mają w przybliżeniu taką samą zdolność wobec komórek dendrytycznych, jak ludzkie wirusy typu 5 adenowirusów. Zdolność ta, sprzężona z niespodziewaną skutecznością małpich adenowirusów dostarcza znaczące korzyści w indukcji cytotoksycznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko wybranemu antygenowi i w leczeniu stanów, w których zwiększony poziom indukcji interferonu-α i/lub interferonu-β jest pożądana.
I. Zrekombinowany małpi adenowirus
A. Źródła
PL 216 200 B1
Różne źródła sekwencji adenowirusa szympansa są dostępne z American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, i z innych źródeł. Pożądanymi są szympansie szczepy Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], i Pan 7 [ATCC VR-593]. Szczególnie pożądane szczepy adenowirusa szympansa, są adenowirusowe szczepy szympansa Bertha lub C1 [ATCC Nr dostępu VR-20] i adenowirus szympansa, szczep Pan 9 lub CV68 [ATCCVR-594]. Dla wygody, wirus CV68 określa się w całym niniejszym opisie jako „C68. Wirusy pierwotnie wyodrębniono z kału [C1, Rowe i wsp., Proc. Soc. Exp. Med., 91: 260 (1956)] lub krezkowego węzła chłonnego [C68, Basnight i wsp., Am. Epidemiol., 94: 166 (1971)] zakażonych szympansów. Sekwencje tych szczepów, i lokalizację adenowirusowych genów E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4 i L5 dostarczono w opisie patentowym US nr 6,083,716, który jest włączony tutaj jako odnośnik. Ewentualnie, inne niż szympansie, małpie adenowirusowe sekwencje mogą mieć zastosowanie do wytwarzania zrekombinowanych wektorów według wynalazku. Takie inne niż adenowirusy szympansa obejmują te szczepy adenowirusowe otrzymane od pawiana [np., ATCC VR275], szczepy adenowirusowe wyodrębnione z małp rezusów [np., ATCC VR-209, ATCC VR-275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], i adenowirusowe szczepy wyodrębnione z afrykańskich zielonych małp [np. ATCC VR-541; ATCC VR-941; ATCC VR-942; ATCC VR-943].
Zrekombinowane adenowirusy szympansa (lub innych małp) opisane tutaj, mogą zawierać adenowirusowe sekwencje pochodzące z jednego, więcej niż jednego adenowirusowego szczepu małpy. Sekwencje te mogą być otrzymane z naturalnego źródła, wytwarzane rekombinacyjnie, syntetycznie, lub innymi technikami inżynierii genetycznej lub sposobami chemicznymi.
B. Zrekombinowane małpie adenowirusy
Zrekombinowane małpie adenowirusy użyteczne w rozwiązaniu według wynalazku stanowią cząsteczki wirusowe, które są złożone z sekwencji zrekombinowanych małpich adenowirusów niosących heterologiczną cząsteczkę i/lub białka otoczki adenowirusa małpy. Te małpie adenowirusy, a zwłaszcza sekwencje szympansa C68 i C1 są również użyteczne do tworzenia hybrydowych wektorów z innymi małpimi i niemałpimi adenowirusami, i w tworzeniu pseudotypowanych zrekombinowanych wirusów, to jest zrekombinowanych wirusów z adenowirusowym wektorem niosącym heterologiczną cząsteczkę, która jest opakowana heterologicznym białkiem otoczki pochodzącym od małpy.
1. Zrekombinowany małpi adenowirus
Zrekombinowany małpi adenowirus użyteczny według wynalazku zawiera przynajmniej elementy cis małpiego adenowirusa konieczne do replikacji i otoczenia wirionu kapsydem, które to elementy cis flankują gen heterologiczny. To jest, wektor zawiera sekwencje aktywne cis 5' odwróconych końcowych powtórzeń (ITR, ang. inverted terminal repeat) adenowirusów, które funkcjonują jako miejsce inicjacji procesu replikacji, natywne domeny 5' wprowadzania do otoczki/wzmacniania (które zawierają sekwencje konieczne do wprowadzania do otoczki linowych genomów Ad i elementy enchancera promotora E1), sekwencje cząsteczki heterologicznej i sekwencje 5'ITR. Patrz, na przykład, techniki opisane do wytwarzania „minimalnego ludzkiego wektora Ad w opisie patentowym US nr 6,203,975, który jest włączony jako odniesienie, mogą być z łatwością dostosowane do zrekombinowanego małpiego adenowirusa.
Ewentualnie, zrekombinowane małpie adenowirusy użyteczne w niniejszym wynalazku zawierają więcej niż minimalne sekwencje małpiego adenowirusa zdefiniowane powyżej. Te inne wektory Ad mogą być scharakteryzowane jako zawierające modyfikacje, które niszczą zdolność adenowirusa do wyrażania jednego lub więcej wybranych produktów genów. Określenie „funkcjonalne delecje zastosowano tutaj, aby opisać takie modyfikacje. Takie „funkcjonalne delecje typowo przyjmują postać delecji wszystkich lub części genu wirusa. Jednakże, takie funkcjonalne delecje mogą również mieć postać mutacji przesunięcia ramki. Jeszcze inne odpowiednie manipulacje, które prowadzą do funkcjonalnej delecji będą z łatwością zauważone przez specjalistów w dziedzinie.
W szczególnie pożądanej postaci wykonania, małpie adenowirusy są uszkodzone pod względem replikacji ze względu na brak zdolności do wyrażania adenowirusa E1a i E1b, to jest uzyskano funkcjonalne usunięcie E1a i E1b. Te zrekombinowane małpie adenowirusy mogą również nieść funkcjonalne delecje w innych genach.
Na przykład, z małpiej adenowirusowej sekwencji, która tworzy część zrekombinowanego wirusa, może być usunięty opóźniony wczesny gen E3. Funkcja E3 nie jest konieczna do wytwarzania cząsteczki zrekombinowanego adenowirusa. Zatem, nie jest konieczne zastąpienie funkcji tego produktu genu w celu wprowadzenia do otoczki zrekombinowanego małpiego adenowirusa użytecznego według wynalazku.
PL 216 200 B1
Zrekombinowane małpie adenowirusy mogą również zostać skonstruowane, tak aby miały funkcjonalną delecję genu E4, pomimo, że może być pożądane utrzymanie funkcji ORF6 E4. Jeszcze inny wektor według wynalazku zawiera delecję w opóźnionym wczesnym genie E2a. Delecje mogą również być przeprowadzone w dowolnym z późnych genów L1 do L5 genomu małpiego adenowirusa. Podobnie, delecje w pośrednich genach IX i IVa2 mogą być użyteczne do pewnych celów. Inne delecje mogą być przeprowadzone w innych strukturalnych lub niestrukturalnych genach adenowirusa. Powyżej omówione delecje mogą być zastosowane pojedynczo, to jest adenowirusowa sekwencja do zastosowania w niniejszym wynalazku może zawierać delecje jedynie E1. W innym rozwiązaniu, delecje całych genów lub ich części skuteczne do zniszczenia ich biologicznej aktywności mogą być zastosowane w dowolnej kombinacji. Na przykład, w jednym przykładowym wektorze, adenowirusowa sekwencja może mieć delecje genu E1 i genu E4, lub genów E1, E2a i E3, lub genów E1 i E3, lub genów E1, E2a i E4, z lub bez delecji E3, ltd. Takie delecje mogą być zastosowane w połączeniu z innymi mutacjami, takimi jak mutacje wrażliwe na temperaturę, aby osiągnąć żądany skutek.
Transgen może być wprowadzony w dowolny usunięty region małpiego adenowirusa. W innym rozwiązaniu, transgen może być wprowadzony do istniejącego regionu genu, aby przerwać funkcjonowanie tego regionu, jeśli jest to pożądane.
Bez względu na to czy zrekombinowany małpi adenowirus zawiera tylko minimalną sekwencję Ad, lub cały genom Ad z jedynie funkcjonalnymi delecjami w regionach E1 i/lub E3, zrekombinowany wirus zawiera otoczkę małpiego adenowirusa. Alternatywnie w innych postaciach wykonania, w sposobach według wynalazku mogą być zastosowane rekombinowane pseudotypowane adenowirusy. Takie pseudotypowane adenowirusy wykorzystują białka otoczki adenowirusa małpy, do których cząsteczka kwasu nukleinowego niosąca sekwencje heterologicznego małpiego adenowirusa, lub sekwencje niemałpiego adenowirusa została wprowadzona. Takie rekombinowane małpie adenowirusy według wynalazku mogą być wytwarzane przy zastosowaniu sposobów, które są znane specjalistom w dziedzinie.
C. Wytwarzanie zrekombinowanej wirusowej cząsteczki
Sposoby wytwarzania odpowiednich zrekombinowanych małpich adenowirusów wykorzystują techniki, które są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, np., takie jak opisano w opisie patentowym US 6,083,716. W konstrukcji zrekombinowanych małpich adenowirusów do dostarczania osobnikowi heterologicznej cząsteczki (np. ludzkiej, psiej, kociej, lub innych ssaków), adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego zastosowane w wektorach mogą pochodzić od różnych gatunków małp.
Wektor zawierający małpie (np. szympansa) adenowirusowe sekwencje, pozbawione małpich adenowirusowych sekwencji koniecznych do wytwarzania zakaźnej zrekombinowanej wirusowej cząsteczki może być zastosowany w połączeniu z pomocniczym (ang. helper) wirusem lub wektorem. Pomocniczy wirus dostarcza zasadnicze produkty genowe konieczne dla zachowania wirusowej zakaźności i rozmnażania się małpiego adenowirusa. Gdy przeprowadzona została tylko jedna lub więcej wybranych delecji genów małpiego adenowirusa, w poza tym funkcjonalnym wirusowowym wektorze, usunięte produkty genów mogą być dostarczone w procesie produkcji wirusowego wektora przez rozmnażanie wirusa w wybranej komórce otoczkującej.
Zatem, funkcje te mogą być dostarczone w trwale transformowanych przekształconych liniach komórkowych, które dostarczają pewne lub wszystkie z adenowirusowych funkcji, które są konieczne do wprowadzania wirusa do otoczki, np. dowolne cząsteczki RNA E1a, E1b, E2a, E4 ORF6, VA, które są nieobecne w wektorze. Jeśli to konieczne lub alternatywnie, każda konieczna dodatkowa funkcja adenowirusa może być dostarczona do komórki otoczkującej przez transfekcję lub infekcję konstruktem zawierającym te funkcje. Ewentualnie, adenowirusowe funkcje mogą być wybrane, tak aby umożliwić wprowadzanie do heterologicznego małpiego adenowirusowego białka otoczki wirusowego wektora niosącego minigen. Odpowiednie sposoby „pseudotypowania wykorzystujące małpie (np. C68) białko otoczki, będą z łatwością dostrzeżone w oparciu o to co jest znane w stanie techniki odnośnie pseudotypowania ludzkiego adenowirusa. Patrz, np., opis patentowy US nr 6,203,975.
Składanie wybranych sekwencji DNA adenowirusa, i transgenu oraz innych elementów wektora w różnych pośrednich plazmidach i wektorach ulegających ekspresji w dwóch gospodarzach (ang. shuttle vectors), i zastosowanie plazmidów i wektorów do wytworzenia zrekombinowanej wirusowej cząsteczki osiągnięto stosując tradycyjne techniki. Takie techniki obejmują tradycyjne techniki klonowania cDNA, takie jak te opisane w podręczniku [Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wyd. 2, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)], zastosowanie nakładających się sekwencji oligonukleotydowych genomów adenowirusowych, reakcję łańcuchowej polimeraPL 216 200 B1 zy, i dowolny odpowiedni sposób, który dostarcza pożądaną sekwencję nukleotydową. Standardowe techniki transfekcji i kotransfekcji znajdują zastosowanie, np., techniki wytrącania CaPO4. Inne zastosowane tradycyjne sposoby obejmują homologiczną rekombinację wirusowych genomów, wysiewanie wirusów w warstwowym agarze, sposoby pomiaru wytwarzanego sygnału i tym podobne.
Na przykład, po konstrukcji i składaniu zawierającego żądany transgen wektora ulegającego ekspresji w dwóch gospodarzach, wektor ten transfekowano in vitro do komórki gospodarza w celu wprowadzania do otoczki. Komórki gospodarza dostarczają, lub dostarcza im się, dowolne brakujące funkcje adenowirusa. Homologiczna rekombinacja występuje pomiędzy pomocniczą, a wektorową sekwencją, co umożliwia replikację adenowirusowej-transgenicznej sekwencji w wektorze i pakowane do kapsydów wirionów, prowadząc do uzyskania cząsteczek zrekombinowanego adenowirusa.
Korzystnie, twórcy stwierdzili, że białka ludzkiego adenowirusa E1 transkomplementują z pozbawionym E1 małpim adenowirusem, umożliwiając jego wprowadzenie do cząsteczek małpiego adenowirusa. Jednakże, ze względu na niski stopień homologii pomiędzy ludzkim Ad E1, a sekwencjami flankującymi usunięte małpie sekwencje Ad E1, istnieje minimalne ryzyko, że małpi AdE1 będzie ulegał homologicznej rekombinacji do wytworzenia kompetentnego pod względem replikacji małpiego adenowirusa.
Zrekombinowane cząsteczki małpiego adenowirusa, tak uzyskane, mogą być izolowane i oczyszczone dowolnym z szeregu sposobów znanych specjalistom w dziedzinie do zastosowania w sposobie według wynalazku.
II. Heterologiczne cząsteczki do dostarczania gospodarzowi
A. Immunogeny
Heterologiczna cząsteczka niesiona przez małpi adenowirus w celu dostarczania do komórki gospodarza może być dowolną pożądaną substancją obejmującą, bez ograniczeń, polipeptyd, białko, enzym, węglowodany, reszty chemiczne, lub cząsteczki kwasu nukleinowego, które mogą obejmować: oligonukleotydy, RNA, DNA, i/lub hybrydy RNA/DNA. W jednej pożądanej postaci wykonania, cząsteczka niesiona przez małpi adenowirus jest transgenem. Transgenowa cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, heterologiczną względem adenowirusowych sekwencji, które kodują białko, peptyd, polipeptyd, enzym, lub inny produkt będący przedmiotem zainteresowania i regulatorowych sekwencji kierujących transkrypcją i/lub translacją kodowanego produktu w komórce gospodarza i które umożliwiają ekspresję kodowanego produktu w komórkach gospodarza lub osobnika. Kompozycja transgenu zależy od tego jakie jest zamierzone zastosowanie małpiego adenowirusa.
Na przykład, jeden typ transgenu zawiera reporterową lub markerową sekwencję która, w wyniku ekspresji, wytwarza wykrywalny sygnał. Jednakże, zwłaszcza pożądane są produkty genów i inne cząsteczki z którymi przeciwciało i co jest najbardziej pożądane, odpowiedź immunologiczna, w której pośredniczy komórka są indukowane.
Te immunogenne produkty genów i cząsteczki mogą pochodzić z wielu różnych patogennych mikroorganizmów, obejmujących między innymi te wybrane z grupy obejmującej wirusy, bakterie, grzyby lub pasożytnicze mikroorganizmy, które zakażają ludzi i nie będących ludźmi kręgowce, lub z komórek rakowych lub komórek guza. Immunogen może obejmować peptydy lub polipeptydy pochodzące z białek. W pewnych przypadkach więcej niż jeden immunogen jest włączony do kompozycji.
Pożądane immunogenne kompozycje zawierające te produkty genu i inne cząsteczki obejmują te skierowane do zapobiegania i/lub leczenia choroby powodowane przez, między innymi, wirusy takie jak ludzki wirus niedoboru odporności, małpi wirus niedoboru odporności, syncytjalny wirus oddechowy, wirus parainfIuenzy typu 1-3, wirus grypy (np. wirusy grypy A i B), wirus opryszczki Herpes simplex, ludzki wirus cytomegalii, wirusy zapalenia wątroby (obejmujące wirusy zapalenia wątroby typu A, zapalenia wątroby typu B, i zapalenia wątroby typu C), ludzki wirus brodawczaka, wirus polio, rotawirus, caliciwirusy, wirus odry, wirus świnki, wirus różyczki, adenowirus, wirus wścieklizny, psi wirus nosówki, wirus księgosuszu, koronawirus, parwowirus, zakaźne wirusy zapalenia nosotchawicy, koci wirus białaczki, zakaźny koci wirus zapalenia otrzewnej, ptasi zakaźny wirus chorób torebki maziowej, wirus choroby Newcastle, wirus choroby Mareka, świński wirus zespołu oddechowego i rozrodczego, koński wirus zapalenia tętnicy i różne wirusy zapalenia mózgu.
Jeszcze inne immunogeny są skierowane do zapobiegania i/lub leczenia choroby powodowanej przez, między innymi zakresu, bakterie takie jak Haemophilus influenzae (zarówno typowalne jak i nietypowalne), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogeny, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria menin8
PL 216 200 B1 gitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamlydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, kompleks Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinohacillus pleuropneunaoniae i Mycoplasma gallisepticum.
Jeszcze inne pożądane immunogeny obejmują te skierowane do zapobiegania i/lub leczenia choroby powodowanej przez, między innymi, patogeny grzybów takie jak Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus i Histoplasma.
Dodatkowo, inne pożądane immunogeny obejmują te skierowane do zapobiegania i/lub leczenia choroby powodowanej przez, między innymi, pasożyty takie jak Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii i Pneumocystis carinii.
Ponadto, pożądane immunogeny obejmują te przeznaczone do wywoływania terapeutycznego lub profilaktycznego przeciwrakowego działania u gospodarza będącego kręgowcem, takie jak, między innymi, te wykorzystujące antygen rakowy lub antygen związany z guzem, obejmujące, nieograniczająco, antygen specyficzny dla prostaty, antygen rakowo-embrionalny, MUC-1, Her2, CA-125 i MAGE-3.
Przykłady dostarczone poniżej specyficznie ilustrują korzyści rozwiązań według wynalazku wykorzystujących zrekombinowany małpi wektor adenowirusowy, z którego immunogenny peptyd wścieklizny (glikoproteina G) lub ludzki wirus niedoboru odporności-1 (zmodyfikowane białko gag) ulegają ekspresji. Inna pożądana postać wykonania wykorzystuje małpi adenowirus niosący immunogenny peptyd z ludzkiego wirusa brodawczaka. Jednakże, wynalazek nie jest ograniczony do tych źródeł immunogenów.
B. Elementy regulatorowe
Zaprojektowanie transgenu lub innej sekwencji kwasu nukleinowego, która wymaga transkrypcji, translacji i/lub ekspresji, aby otrzymać żądany produkt genu w komórkach i u gospodarzy, może obejmować odpowiednie sekwencje, które są funkcjonalnie połączone z sekwencjami kodującymi będącymi przedmiotem zainteresowania w celu zwiększenia ekspresji kodowanego produktu. „Funkcjonalnie połączone sekwencje obejmują zarówno sekwencje kontrolujące ekspresję, które sąsiadują z sekwencjami kwasu nukleinowego będącymi przedmiotem zainteresowania jak i sekwencje kontrolujące ekspresję, które działają in trans lub w odległości do kontrolowanych sekwencji kwasu nukleinowego będących przedmiotem zainteresowania.
Sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują odpowiednie sekwencje początku transkrypcji, terminacji, promotora i wzmacniacza (ang. enhancer); skuteczne sygnały obróbki RNA, takie jak sygnały składania i poliadenylacji; sekwencje, które stabilizują cytoplazmatyczne mRNA; sekwencje, które zwiększają skuteczność translacji (to jest sekwencja zgodności Kozaka); sekwencje, które zwiększają stabilność białka; i jeśli jest to pożądane, sekwencje, które zwiększają wydzielanie białka. Duża liczba sekwencji kontrolujących ekspresję i natywnych, konstytutywnych, indukowalnych i/lub specyficznych dla tkanki - jest znana w dziedzinie i może być stosowana do kierowania ekspresją genu, w zależności od typu żądanej ekspresji. Dla komórek eukariotycznych, sekwencje kontrolujące ekspresję typowo obejmują promotor, wzmacniacz, taki jak ten pochodzący z genu kodującego imimunoglobulinę, SV40, wirus cytomegalii, itp., i sekwencję poliadenylacji, która może obejmować łączący donor (ang. splice donor) i miejsca akceptorowe. Sekwencja poliadenylacji (poliA) ogólnie jest wprowadzona po sekwencjach transgenu i przed sekwencją 3' adenowirusa ITR. W jednej postaci wykonania, wybrano bydlęcy hormon wzrostu poliA. Małpi adenowirus według niniejszego wynalazku może również zawierać intron, użytecznie zlokalizowany pomiędzy sekwencją promotora/wzamacniacza a transgenem. Jedna z możliwych sekwencji intronu również pochodzi z SV-40 i określana jest jako sekwencja intronowa SV-40 T. Inny element, który może być zastosowany w wektorze obejmuje wewnętrzne miejsce wprowadzenia rybosomu (IRES). Sekwencję IRES zastosowano do wytworzenia więcej niż jednego polipeptydu z pojedynczego transkryptu genu. Sekwencja IRES może być zastosowana do wytworzenia białka, które zawiera więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy. Wybór tych i innych typowych elementów wektora jest ogólnie znany i wiele takich sekwencji jest dostępnych (patrz, np., Sambrook i wsp., i odnośniki tam cytowane, na przykład strony 3.18-3.26 i 16.17-16.27 oraz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989).
W jednej postaci wykonania, będzie pożądany wysoki poziom konstytutywnej ekspresji. Przykłady użytecznych konstytutywnych promotorów obejmują, nieograniczająco, retrowirusowy promotor
LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV, ang. Rous sarcoma virus) (ewentualnie ze wzmacniaczem RSV),
PL 216 200 B1 promotor wirusa cytomegalii (CMV, ang. cytomegalovirus) (ewentualnie ze wzmacniaczem CMV) (patrz, np., Boshart i wsp., Cell, 41: 521-530 (1985)), promotor SV40, promotor reduktazy dihydrofolanowej, promotor β-aktyny, promotor kinazy fosfoglicerolowej (PGK, ang. phosphoglycerol kinase), i promotor EF1a (Invitrogen). Indukowalne promotory, regulowane przez egzogennie dostarczane związki, są również użyteczne i obejmują, indukowalny cynkiem owczy promotor melatoniny (MT), indukowalny deksametazonem (Dex) mysi promotor wirusa raka sutka (MMTV, ang. mouse mammary tumor virus), układ promotora polimerazy T7 (WO 98/10088); owadzi promotor ekdysonu (No i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351(1996)), mogący ulec represji układ tetracykliny (Gossen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89:5547-5551 (1992)), system indukowalny tetracykliny (Gossen i wsp., Science, 268:1766-1769 (1995), patrz również Harvey i wsp., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), układ indukowalny RU486 (Wang i wsp., Nat. Biotech., 15:239 243 (1997) i Wang i wsp., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) oraz układ indukowalny rapamycyną (Magari i wsp., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Inne rodzaje indukowalnych promotorów, które mogą być użyteczne w tym odniesieniu obejmują te, które są regulowane specyficznym stanem fizjologicznym, np., temperaturą, fazą ostrą, szczególnym stanem różnicowania komórki, lub jedynie w komórkach ulegających replikacji.
W innej postaci wykonania, zostanie użyty natywny promotor transgenu. Natywny promotor może być korzystny, gdy pożądane jest, aby ekspresja transgenu naśladowała natywną ekspresję. Natywny promotor może być stosowany gdy ekspresja transgenu musi być regulowana czasowo lub rozwojowo, lub w specyficzny dla tkanki sposób, lub w odpowiedzi na specyficzny bodziec transkrypcyjny. W kolejnej postaci wykonania, inne natywne elementy kontroli ekspresji, takie jak elementy wzmacniające, miejsca poliadenylacji lub sekwencje zgodności Kozaka mogą również być zastosowane do naśladowania natywnej ekspresji.
W innej postaci wykonania transgen obejmuje transgen funkcjonalnie połączony ze specyficznym dla tkanki promotorem. Na przykład, jeśli ekspresja w mięśniu szkieletowym jest pożądana, promotor aktywny w mięśniu powinien być użyty. Obejmują one promotory genów kodujących szkieletową α-aktynę, lekki łańcuch 2A miozyny, dystrofinę, kinazę kreatyny mięśniowej, jak i syntetyczne prom otory mięśniowe o aktywnościach wyższych niż naturalnie występujących promotorów (patrz Li i wsp., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). Przykłady promotorów, które są specyficzne dla tkanki są znane dla wątroby (albumina, Miyatake i wsp. J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B, Sandig i wsp., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); alfa-fetoproteiny (AFP), Arbuthnot i wsp., Hum. GeneTher., 7:1503-14 (1996)), osteokalcyny w kości (Stein i wsp., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteiny w kości (Chen i wsp., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), limfocyty (CD2, Hansal i wsp., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); ciężki łańcuch immunoglobuliny; łańcuch α receptora limfocytów T), neuronalny, taki jak promotor specyficznej dla neuronu enolazy (NSE) (Andersen i wsp., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), gen kodujący lekki łańcuch neurofilamentu (Piccioli i wsp., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88:5611-5 (1991)) i specyficzny dla neuronu gen vgf (Piccioli wsp., Neuron, 15: 373-84 (1995)), między innymi.
Oczywiście, nie wszystkie sekwencje kontrolujące ekspresję będą funkcjonować równie dobrze przy prowadzeniu ekspresji wszystkich transgenów. Jednakże, specjalista w dziedzinie może przeprowadzić selekcję pomiędzy tymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję bez oddalania się od zakresu wynalazku. Odpowiednie sekwencje promotora/wzmacniacza mogą być wybrane przez specjalistę w dziedzinie stosując wskazówki dostarczone w obecnym zgłoszeniu. Taka selekcja jest sprawą rutynową i nie ogranicza ani cząsteczki ani konstruktu. Na przykład, można wybrać jedną lub więcej sekwencji kontrolujących ekspresję, które mogą być funkcjonalnie połączone z kodującą sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania i wprowadzone do transgenu, minigenu, i transferowego wirusa według wynalazku. Zgodnie z jednym ze sposobów wprowadzania do otoczki małpiego adenowirusa, opisanym w niniejszym opisie, lub jak wskazano w stanie techniki, można zakazić odpowiednie komórki in vitro lub in vivo. Liczba kopii minigenu w komórce może być monitorowana techniką Southern blot lub ilościową metodą PGR. Poziom ekspresji RNA może być monitorowany techniką Northern blot lub ilościową metodą RT-PCR. Poziom ekspresji może być monitorowany techniką Western blot, techniką immunohistochemii, ELISA, RIA, lub testami biologicznej aktywności produktu genu. Zatem, można łatwo oznaczyć czy dana sekwencja kontrolna ekspresji jest odpowiednia do specyficznego wytwarzania kodowanego przez transgen produktu i wybrać najbardziej odpowiednią sekwencję kontrolną ekspresji. Alternatywnie, gdy cząsteczka do dostarczania nie wymaga ekspresji, np. węglowodanu, polipeptydu, peptydu, itp., sekwencja kontrolująca ekspresję nie musi tworzyć części zrekombinowanego małpiego adenowirusa lub innej cząsteczki.
PL 216 200 B1
III. Preparat wirusa do dostarczania
Zrekombinowane małpie adenowirusy, korzystnie zawieszone w fizjologicznie dopasowanym (ang. compatibile) nośniku, mogą być podawane ludziom lub niebędącym ludźmi ssaczym pacjentom. Odpowiednie nośniki mogą być z łatwością wybrane przez specjalistę w dziedzinie w związku ze wskazaniem, przeciwko którym transferowy wirus jest skierowany. Na przykład, dopasowany nośnik obejmuje roztwór soli w wodzie, który może być utworzony z różnymi roztworami buforującymi (np. roztwór soli buforowany fosforanem). Inne przykładowe nośniki obejmują sterylny roztwór soli w wodzie, laktozę, sacharozę, fosforan wapnia, żelatynę, dekstran, agar, pektynę, olej z orzechów ziemnych, olej sezamowy i wodę. Wybór nośnika nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku.
Ewentualnie, kompozycje według wynalazku mogą zawierać, dodatkowo oprócz zrekombinowanego małpiego adenowirusa i nośnika(ów), inne konwencjonalne farmaceutyczne składniki, takie jak konserwanty, chemiczne środki stabilizujące, lub adiuwanty do zastosowania w szczepionkach. Odpowiednie przykładowe konserwanty obejmują chlorobutanol, sorbat potasu, kwas sorbinowy, ditlenek siarki, galusan propylu, parabeny, etylowanilinę, glicerynę, fenol i parachlorofenol. Odpowiednie chemiczne środki stabilizujące obejmują żelatynę i albuminę. Odpowiednie przykładowe adiuwanty obejmują, między innymi, kompleksy stymulujące odporność (ISCOM, ang. immune-stimulating complexes), analogi LPS obejmujące 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (RibiImmunochem Research, Inc.; Hamilton, MT), olej mineralny i wodę, wodorotlenek glinu, Amfigen, Awirydnę, L121/skwalen, muramylowe peptydy, i saponiny, takie jak Quil A.
IV. Dostarczanie zrekombinowanego wirusa do leczenia i/lub profilaktyki
Zrekombinowane adenowirusy o uszkodzonej replikacji są podawane w „farmaceutycznie skutecznej ilości, co oznacza, ilość zrekombinowanego adenowirusa, która jest skuteczna w trybie podawania do transfekowania pożądanych komórek i zapewnia wystarczające poziomy ekspresji wybranego genu, w celu zapewnienia terapeutycznej lub szczepionkowej odpowiedzi odpornościowej, np. pewien, mierzalny poziom odporności zabezpieczającej.
Tradycyjne i farmaceutycznie dopuszczalne tryby podawania obejmują, lecz nie są ograniczone do, podawania donosowego, domięśniowego, dotchawiczego, podskórnego, śródskórnego, doodbytniczego, doustnego i innych dośluzówkowych i pozajelitowych trybów podawania. Jak zastosowano tutaj, dośluzówkowe tryby podawania obejmują te, które dostarczają do śluzówkowych tkanek, obejmujących w sposób nieograniczający zakresu, inhalację, tryb doustny, donosowy, dopochwowy i doodbytniczy. Tryby podawania mogą być połączone, jeśli jest to pożądane, lub dostosowane do immunogenu lub choroby. Na przykład, w profilaktyce wścieklizny, podskórne, dotchawicze, donosowe i doustne tryby są korzystne. Tryb podawania głównie będzie zależał od charakteru leczonej choroby.
Dawki lub skuteczne ilości zrekombinowanego wirusa Ad o uszkodzonej replikacji będą zależały głównie od czynników takich jak stan, wybrany gen, wiek, masa i stan zdrowia zwierzęcia i mogą zatem różnić się u różnych zwierząt.
Dawkowanie wirusowego wektora będzie zależało głównie od czynników takich jak stan leczony, wiek, masa i stan zdrowia zwierzęcia, i mogą zatem różnić się u różnych ssaczych pacjentów (włącznie z ludźmi). Korzystnie, niespodziewana skuteczność zrekombinowanych małpich (np. szympansa) adenowirusów według wynalazku pozwala na zastosowanie znacząco niższych ilości zrekombinowanego adenowirusa szympansa w celu zapewnienia skutecznej ilości do indukowania żądanego działania immunogennu (np., indukcja do wcześniej wyznaczonego poziomu limfocytów T CD8+). Na przykład, skuteczna dawka zrekombinowanego małpiego adenowirusa może być dostarczona przez 104 pfu i 106 pfu adenowirusa szympansa. Jednakże, wyższe dawki mogą być z łatwością wybrane, np., w zależności od wybranego trybu dostarczania. Na przykład, wirusowy wektor może być dostarczony w ilości, która jest w zakresie od około 100 μΐ do około 100 ml, i korzystniej, około 1 ml do około ml, roztworu nośnika zawierającego stężenia w zakresie od około 1 x 104 jednostek tworzących
9 łysinki (pfu, ang. plaque forming units) do około 1 x 1013 pfu wirusów/ml, i około 1 x 109 do około 1 x
1011 pfu/ml wirusa, w oparciu o 80 kg masy ciała dorosłego pacjenta. Korzystne dawkowanie oszaco10 wano na około 50 ml roztworu soli w wodzie przy 2 x 1010 pfu/ml. Korzystna dawka wynosi od około 1 do około 10 ml nośnika (np. roztworu soli w wodzie) przy powyższych stężeniach. Terapeutyczne poziomy, lub poziomy odporności, wybranego genu mogą być monitorowane, aby wyznaczyć potrzebę, jeśli jakiekolwiek, dawek przypominających (wspomagających). Po wyznaczeniu odpowiedzi limfocytów T CD8+, lub ewentualnie, mian przeciwciał w surowicy, ewentualne dawki przypominające immunizacje mogą być pożądane. Ewentualnie, zrekombinowane małpie adenowirusy mogą być dostarczane stosując tryb sprawdzenia dawki wspomagającej przed użyciem. Różne rodzaje takich trybów
PL 216 200 B1 zostały opisane w dziedzinie i mogą być z łatwością wybrane. Zwłaszcza pożądany jest sposób opisany w publikacji WO 00/11140, opublikowanej 2 marca 2000.
W jednej pożądanej postaci wykonania, wynalazek dostarcza sposobu indukowania u osobnika korzystnie odpowiedzi limfocytów T CD8+ na ludzki wirus niedoboru odporności przez dostarczenie zrekombinowanego małpiego adenowirusa zawierającego zmodyfikowane białko gag. Zmodyfikowane białko gag prezentowane w przykładach poniżej zostało zoptymalizowane, np. jak opisano w opisie patentowym US 5,972,596. Sekwencję kodującą i sekwencję białka przedstawiono tutaj jako SEK NR ID: 6 i SEK NR ID: 7. Patrz, również, G. Meyers i wsp., Red., Human retroviruses and AIDS. A compilation and analysis of nucleid acid and amino acid sequences (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 1991). Jednakże, dowolny z wielu sposobów poprawiania ekspresji białka gag, lub dowolnego innego wybranego immunogenu lub antygenu jak opisano w niniejszym opisie, jest znany specjalistom w stanie techniki i może być stosowany, np. humanizacja sekwencji kodonu gag HIV-1, usunięcie miejsca łączącego gag HIV-1, insercja dodatkowych sekwencji liderowych w górę od sekwencji kodonu gag HIV-1, insercja sekwencji Kozak w górę od sekwencji kodonu gag HIV-1. Wybór sposobu optymalizacji nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku. W innym rozwiązaniu, opisany niniejszym sposób może być zastosowany do dostarczenia osobnikowi zrekombinowanego małpiego adenowirusa niosącego gen kodujący białko otoczki HIV, lub pol HIV. Jednym z pożądanych białek otoczki HIV jest glikoproteina 120 HIV, której sekwencje są dostępne w GenBank. Jednakże, inne odpowiednie białka otoczki wirusowej mogą być stosowane. Sekwencja pol HIV-1 jest znana, jak i wiele zmodyfikowanych sekwencji pol. Patrz np. w opisie patentowym US 5,972,596 i R. Scheider i wsp., R. Virol., 71 (7):4892-4903 (July 1997).
Niniejszym opisano sposób indukowania odpowiedzi korzystnie limfocytów T CD8+ na związane z guzem białko specyficzne dla wybranego nowotworu przez dostarczenie osobnikowi zrekombinowanego małpiego adenowirusa zawierającego związane z guzem białko. Takie białko obejmuje komórkowe onkogeny, takie jak zmutowany ras lub p53.
Rozwiązania według wynalazku dotyczą korzystnie sposobu indukowania limfocytów T CDB+ na związane z guzem białko specyficzne dla wybranego nowotworu przez dostarczenie osobnikowi zrekombinowanego małpiego adenowirusa zawierającego związane z guzem białko.
Jeszcze inne pożądane rozwiązanie obejmuje dostarczenie zrekombinowanego małpiego adenowirusa zawierającego białko pochodzące z ludzkiego wirusa brodawczaka do zapobiegania zakażeniom tym wirusem i do leczenia i profilaktyki związanych z nim stanów. Na przykład, białko może być wybrane z grupy obejmującej E6, E7 i/lub L1 (Seedorf, K. i wsp., Virol., 145: 181-185 (1985)). Gdy stan oznacza zakażenie wirusem oddechowym, białko wybrano z grupy obejmującej gliko -(G) proteinę i fuzyjne (F) białko, dla których sekwencje są dostępne z GenBank.
Poniższe przykłady dostarczono w celu zilustrowania wynalazku i nie mają one ograniczać jego zakresu. Specjalista w dziedzinie doceni fakt, że mimo opisania specyficznych odczynników i stanów w poniższych przykładach, możliwe jest wykonanie modyfikacji, które co jest zrozumiałe, są objęte ideą i zakresem wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Otrzymanie wektora z usuniętym E1 w oparciu o adenowirus szympansa C68
Odmianę C68 o uszkodzonej replikacji do zastosowania do przeniesienia genu. Klasyczna strategia tworzenia rekombinanta z usuniętym E1, została przeprowadzona przez homologiczną rekombinację w linii komórkowej prowadzącej ekspresję E1. Pierwszy etap stanowiło utworzenie plazmidu zawierającego m.u. 0 do 1,3 a następnie dodanie minigenu prowadzącego ekspresję udoskonalonego zielonego fluorescencyjnego białka (GFP) z promotora CMV i zawierającego sekwencję C68 rozciągającą się 9-16,7 m.u. Tym przeprowadzonym w postać liniową plazmidem współtransfekowano linię komórkową prowadzącą ekspresję E1 z plazmidem C68 trawionym Ssp T (Sspl tnie w 3,6 m.u. pozostawiając 4644 par zasad homologicznej rekombinacji). Doświadczenia początkowo przeprowadzono na komórkach 293, które zawierają E1 z ludzkiego Ad5, z nadzieją, że będzie to dostateczne do transkomplementacji. Faktycznie, utworzyły się łysinki, które przedstawiają żądany rekombinant. Otrzymany wektor nazwano C68-CMV-GFP.
Strategia wytwarzania rekombinantów została zmodyfikowana, aby umożliwić skuteczne i szybkie wyodrębnienie rekombinantów. Po pierwsze DNA kodujące alkaliczną fosfatazę w wyjściowym wektorze bifunkcjonalnym zastąpiono prokariotycznym genem GFP kierowanym przez prokariotyczny promotor z IacZ. To umożliwiło skuteczne badanie przesiewowe bakteryjnych transformantów po próbie włączenia żądanej eukariotycznej transkrypcyjnej jednostki RNA pol II do bifunkcjonalnego
PL 216 200 B1 wektora. Otrzymane transformanty mogą być przeszukiwane pod kątem ekspresji GFP; białe kolonie uległy rekombinacji, podczas gdy zielone kolonie zawierają wyjściowy plazmid.
Selekcję biały-zielony zastosowano do przeszukiwania produktów kotransfekcji w celu wyodrębnienia ludzkich rekombinantów Ad5 (A. R. Davis i wsp., Gene Thera., 5: 1148-1152 (1998)); dostosowano to do układu C68. Wyjściowy wektor bifunkcjonalny zmodyfikowano, aby obejmował sekwencje 3' rozciągające się od 9 do 26 MU. Wektor ten poddano jednoczesnej transfekcj i wirusowym DNA z wyjściowego izolatu C68-CMV-GFP, który cięto XbaI, który tnie przy MU 16,5 umożliwiając nakładanie 9,5 Kb w homologicznej rekombinacji. Otrzymane łysinki przeszukiwano pod mikroskopem florescencyjnym z kontrastem fazowym w przypadku izolatów nie wykazujących fIuorescencji, które stanowią żądane rekombinanty. To ogromnie upraszcza przesiewowe badanie w porównaniu do standardowych sposobów opartych na strukturze lub ekspresji transgenowej.
A. Plazmid bifunkcjonalny (ang. shuttle)
Aby skonstruować plazmidowy wektor bifunkcjonalny (ang. shuttle) w celu utworzenia zrekombinowanego wirusa C68, plazmid pSP72 (Promega, Madison, WI) zmodyfikowano przez trawienie Bgl II, a następnie przez stępienie końców enzymem Klenowa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i ligację z syntetycznym linkerem Pac I o 12 parach zasad (New England Biolabs, Beverly, MA) aby otrzymać pSP72-Pac. Fragment Pac I/SnaB I o 456 parach zasad rozciągający się 0-1,3 jednostek mapowych (m.u. lub MU, map unit) genomu C68 wyodrębniono z plazmidu pNEB-BamE zawierającego fragment BamHI E genomu C68 i wklonowano do Pac I i EcoR V poddanego działaniu pSP72-Pac z wytworzeniem pSP-C68-MU 0-1,3. Kasetę minigenu obejmującą wczesny promotor wirusa cytomegalii kierujący IacZ z sygnałem SV40 poli A oddzielono od pCMVp (Clontech, Palo Alto, CA) jako fragment EcoRI/Sall o 4,5 Kb i ligowano z pSP-C68-MU 0-1.3 ciętym tym samym zestawem enzymów, prowadząc do pSP-C68-MU 0-1,3-CMVLacZ.
Do wstępnego etapu wyodrębnienia regionu C68 9-16,7 MU, zarówno pGEM-3Z (Promega, Madison, MI), jak i pBS-C68-BamF podwójnie trawiono enzymami BamHI i Sph I. Następnie fragment o 293 parach zasad z pBS-C68-BamF ligowano z głównym pGEM-3Z z wytworzeniem pGEM-C68-MU 9-9,8. Fragment 2,4 Kb obejmujący C68 MU 9,8-16,7 otrzymano z klonu pBS-C68 BamHB po trawieniu XbaI, wypełniając w reakcji, a następnie działając BamHI i wklonowano do podwójnie trawionego BamHI/Smal pGEM-C68-MU 9-9,8 w celu wytwarzania pGEM-C68-MU 916.7. Region C68 9-16,7 m.u. wyodrębniono z pGEM-C68-MU 9-16.7 przez trawienie EcoRI, wypełniono końce enzymem Klenowa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), ligowano syntetyczny linker HindIII o 12 parach zasad (NEB), a następnie trawiono HindIII. Ten fragment C68 o 2,7 Kb rozciągający się 9-16,7 MU wklonowano w miejsce cięcia HindIII pSP-C68-MU 0-1.3-CMVlacZ z wytworzeniem końcowego plazmidu bifunkcjonalny pC68-CMV-LacZ. Dodatkowo, fragment cDNA 820 par zasad kodujący alkaliczną fosfatazę (AP) wyodrębniono z pAdCMVALP (K. J. Fisher, i wsp., J. Virol., 70:520-532 (1996)) i zmieniono na IacZ w miejscach Not I pC68-CMV-lacZ, prowadząc do pC68-CMV-AP.
B. Konstrukcja zrekombinowanego wirusa
Aby utworzyć pozbawiony E1 zrekombinowany wektor C68-CMVEGFP, bifunkcjonalny plazmid pC68 CMV-EGFP został najpierw skonstruowany przez zastąpienie transgenu IacZ w pC68-CMVIacZ z ulepszonym genem kodującym zielone fluorescencyjne białko (EGFP, ang. enhanced green fluorescent protein). Proces klonowania zastępującego przeprowadzono następująco. Dodatkowe miejsce restrykcyjne NotI wprowadzono do końca 5' kodującego sekwencję EGFP w pEGFP-1 (Clontech, Palo Alto, CA) przez trawienie BamHI, reakcję wypełnienia i ligację syntetycznego linkera NotI o 8 parach zasad (NEB). Po cięciu NotI obu konstruktów, sekwencję EGFP wyodrębniono ze zmodyfikowanego pEGFP-1 i zastosowano do zastąpienia genu IacZ w pC68-CMV-lacZ. Komórki 293 współtransfekowano konstruktem pC68-CMVEGFP (3 μg) z genomowym DNA C68 trawionym Ssp I (1 μg) w celu uzyskania homologicznej rekombinacji jak wcześniej opisano (G. Gao, i wsp., J. Virol, 70:89348943 (1996)). Zielone łysinki uwidocznione we fluorescencyjnej mikroskopii, wyodrębniono w dwóch cyklach oczyszczania łysinek, rozmnażania i oczyszczania przez osadzanie w gradiencie CsCI (G. Gao, i wsp., cytowany powyżej).
W próbie zastosowania dogodnych procesów selekcji zielony/biały (A. R. Davis, i wsp., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) w konstrukcji zrekombinowanych wektorów C68, fragmenty o 7,2 Kb rozciągające się od 9 do 36 MU wyodrębniono z plazmidu pBSC68 BamB przez działanie endonukleazami restrykcyjnymi AgeI i BsiwI i wklonowano w miejsca Asp718 i AgeI bifunkcjonalnego plazmidu pC68-CMV-AP, prowadząc do otrzymania nowego plazmidu nazwanego pC68CMV-AP-MU36. Dalszą modyfikację prowadzono, aby usunąć 26 do 36 m.u. z pC68CMV-AP-MU36 trawiąc Eco47III i NruI.
PL 216 200 B1
Nowy bifunkcjonalny plazmid nazwany pC68CMV-AP-MU26 miał krótszy region homologicznej rekombinacji (to jest 16,7-26 MU) 3' względem minigenu. Aby utworzyć zrekombinowany wektor C68, zastąpiono gen kodujący alkaliczną fosfatazę (AP) genem będącym przedmiotem zainteresowania. Otrzymanym konstruktem pC68CMV-Nugene-MU26 z wirusowym DNA dC68-CMVGFP trawionym Xba I (16,5 MU) współtransfekowano komórki 293, a następnie nakładano górną warstwę agaru. Zrekombinowane łysinki wirusowe (białe) wytworzono w wyniku homologicznej rekombinacji w regionie 16,7-26 MU, który jest wspólny dla konstruktu pC68CMV-Nugene i wirusowego szkieletu C68; rekombinanty które tworzą białe łysinki wybrano spośród zielonych łysinek nieciętego wirusa C68-CMVGFP.
Mechanizm selekcji zielone/białe również wprowadzono do procesu wklonowania genu będącego przedmiotem zainteresowania w bifunkcjonalny plazmid pC68. Gen AP zarówno w pC68CMVAP-MIJ36 i pC68CMV-AP-MU26 zastąpiono kasetą prokariotycznego genu GFP kierowanego przez promotor IacZ wyodrębniony z pGFPMU31 (Clontech, Palo Alto, CA). Zatem, białe kolonie bakteryjnych transformantów będą zawierać zrekombinowany plazmid. Ten proces selekcji zielone/białe dla bakteryjnych kolonii rozwiązał potrzebę tworzenia i charakteryzowania dużej liczby minipreparatów DNA, a więc jeszcze bardziej zwiększył skuteczność tworzenia zrekombinowanych wektorów C68.
P r z y k ł a d 2
Ekspresja antygenu (wydzielanie Gag) w komórkach TK- zakażonych szczepionką konstruktów małpiego adenowirusa
Adenowirusowe rekombinanty szympansa szczepu 68 (Adchimp68) i ludzkiego szczepu 5 (Adhu5) niosące zmodyfikowaną wersję sekwencji nukleotydowej o skróconej formie genu gag HIV-1 clade B skonstruowano jak opisano (w Przykładzie 1 i w pracy Z. Q. Xiang, i wsp., Virol. 219, 200 (1996)). Transkrypty strukturalnych białek HIV-1, obejmujące gag, zawierają genetycznie niestabilne elementy, które wymagają obecności białka rev do jądrowego eksportu i skutecznej ekspresji w cytoplazmie (S. Schwartz i wsp., J. Virol 66, 7176 (1992); S. Schwartz, i wsp., J. Virol 66, 150-159 (1992); G. Nasioulas i wsp., J. Virol 68, 2986 (1994)). Adenowirusy polegają na jądrowej transkrypcji, a zatem wymagają rev do ekspresji białek HIV-1. Aby rozwiązać problem zależności od Rev, sekwencje gag o zmodyfikowanym kodonie, z którego genetycznie niestabilne elementy usunięto przez kierowaną miejscowo mutagenezę (R. Schneider i wsp., J Virol 71, 4892 (1997); S. Schwartz i wsp., J. Virol 66, 7176 (1992); S. Schwartz, i wsp., J Virol 66,150 (1992)) wprowadzono do adenowirusowego wektora. Wprowadzony gen kodował skrócone białko p37gag (regiony p17 i p24). Skrócone białko gag nie tworzy cząsteczek wirusowych i jest częściowo wydzielane do nadsączu transfekowanych ludzkich komórek (R. Schneider i wsp., J. Virol 71, 4892(1997)). Zmutowane konstrukty gag zastosowano w doświadczeniach szczepienia i prowadzą one do wytworzenia komórkowej i humoralnej odpowiedzi odpornościowej u myszy i naczelnych (J. T. Qiu i wsp., J. Virol 73, 9145. (1999)).
Rekombinanty Adchimp68 i Adhu5 oba wytworzono i namnażano w komórkach 293 transfekowanych adenowirusem E1 ludzkiego szczepu 5. Twórcy stwierdzili, że ten heterologiczny E1 jest odpowiedni do komplementowania pozbawionych E1 rekombinantów wirusa Adchimp68, a zatem obniża ryzyko rekombinacji i powrotu do zdolnego do replikacji typu dzikiego wirusa.
Obecność białka gag w supernatantach hodowli TK- analizowano techniką Western blot stosując mysie monoklonalne przeciwciała przeciwko gag. Komórki TK- (1 x 106) infekowano przez 48 godzin wirusem Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37 (10 pfu na komórkę). Dodatkowe komórki TK- infekowano konstruktem Adhu5 lub Adchimp68 prowadzącym ekspresję glikoproteiny wirusa wścieklizny. Białka w hodowli nadsączu rozdzielono w 12% denaturującym poliakrylamidowym żelu i przenoszono stosując elektroblot na membrany PVDF. Blot barwiono monoklonalnym przeciwciałem 183-H12-5C przeciwko HIV-1 p24 (B. Chelsebro, i wsp., J. Virol. 66: 6547 (1992)).
Dwa adenowirusowe zrekombinowane klony (Adhu5gag37, Adchimp68gag37) niosące tę zmodyfikowaną sekwencję gag prowadziły ekspresję produktu transgenu na porównywalnych poziomach, jak wykazano techniką blotu Westerna. Białko o spodziewanej wielkości (37 kDa), które wiąże się z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko gag HIV-1 wykryto w nadsączach komórek zainfekowanych 10 jednostkami tworzącymi łysinki (pfu) dowolnego zrekombinowanego adenowirusa gag. Kontrolne komórki zakażone rekombinantem Adhu5 lub Adchimp68, prowadzącym ekspresję glikoproteiny wirusa wścieklizny (Adhu5rab.gp i Adchimp68.gp) nie wytworzyły tego białka.
P r z y k ł a d 3
Indukcja odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko gag przez małpi adenowirus u ssaków
Poniższe doświadczenie wykazuje, że splenocyty myszy po domięśniowym (i.m.) podaniu zarówno rekombinanta Adhu5gag37 jak i Adchimp68gag37 odpowiadały na immunodominujący epitop
PL 216 200 B1 (B. Doe i C. M. Walker, AIDS 10, 793 (1996)) białka gag przez wydzielenie cytokiny, to jest interferonu (IFN)-y, jak i przez lizę docelowych komórek.
A. Test uwalniania cytokin
6 7
Grupy 3 myszy Balb/c immunizowanego domięśniowo 2 x 105, 2 x 106 lub 2 x 107 pfu wirusa
Adchimp68gag37, 2 x 106 pfu wirusa AdhuSL1 (H. C. J. Ertl, i wsp., J Virol, 63:2885 (1989)), 2 x 106 pfu wirusa Adhu5 gag37 lub 2 x 107 pfu wirusa VVgag. Splenocyty badano pod kątem odpowiedzi limfocytów T CD8+ na gag 10 dni później. Aby oznaczyć produkcję cytokin (IFN-γ), splenocyty (1 x 106/próbkę) hodowano przez 5 godzin w temp. 37°C z 3 μg/ml peptydu AMQMLKETI (SEK NR ID: 1), który niesie immunodominujący epitop limfocytów T CD8+ dla H-2d haplotypu i 1 μg/ml Brefeldyny A (GolgiPlug, PharMingen, San Diego, CA) w 96 studzienkowych o okrągłym dnie, szalkach mikrotitracyjnych w zmodyfikowanej wg Dulbecco pożywce Eagles (DMEM) uzupełnionej 2% płodową bydlęcą surowicą (FBS) i 10-6 M 2-merkaptoetanolem. Komórki przemywano PBS i inkubowano przez 30 min. w temp. 4°C z FITC znakowanym przeciwciałem przeciwko mysiemu CD8. Komórki przemywano permaebilizowano w 1X Cytofix/Cytoperm (PharMingen) przez 20 min. w temp. 4°C. Komórki przemywano 3 razy Perm/Wash (PharMingen) i inkubowano w tym samym buforze przez 30 min. w temp. 4°C z przeciwciałem znakowanym przeciwko mysiemu IFN-γ. Po przemyciu, komórki badano dwubarwną cytometrią przepływową i dane analizowano oprogramowaniem WinmDi. Liczba w prawym rogu przedstawia procent komórek CDB+ względem wszystkich limfocytów T CD8+, które barwią się pozytywnie względem INF-γ.
Siedem do dziesięciu dni po pojedynczej immunizacji, mierzalny ułamek całej populacji limfocytów T CD8+ śledziony wytwarzał IFN-γ w odpowiedzi na peptyd gag. Pierwszorzędowe splenocyty testowane bez dalszego rozmnażania in vitro lizowanymi kompatybilnymi docelowymi komórkami H-2 wcześniej traktowanymi peptydem gag. Specyficzna względem gag aktywność limfocytów T CDB+ była wyższa w wyniku immunizacji konstruktem Adchimp68, która osiągnęła częstość limfocytów T
CDB+ na gag ~16-19% całej populacji komórek CD8+ śledziony. Odpowiedź wykazywała zależność 5 od dawki jak wykazano dla wirusa Adchimp68gag37, gdzie niska dawka wirusa 2 x 105 pfu nadal wywoływała częstość niemal 10%. Rekombinant Adhu5gag37 indukował optymalne częstości ~9% przy x 106 pfu. Te częstości nie uległy znaczącemu zwiększeniu w wyniku zwiększania dawki tej szczepionki (dane nieprzedstawione). Rekombinant wirusowy prowadzący ekspresję pełnej długości gag (VVgag, oznaczony jako vDK1 w S. Chacarabarti i wsp., Mol. Cell. Biol. 5,3403 (1985)) stymulował znacznie niższe częstości limfocytów T CDB+ przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin.
B. Liza docelowych komórek.
Splenocyty myszy immunizowanych 10 dni wcześniej pojedynczą dawką adenowirusowych rekombinantów jak opisano w A lub dwoma dawkami zrekombinowanego Vvgag, pierwsza podana domięśniowo, a następnie 2 tygodnie później przez śródotrzewnową iniekcję badano 5-cio godzinnym
4 testem uwalniania 51Cr w różnych stosunkach efektor do komórek docelowych na 1 x 104 komórek P815, które traktowano przez 16-24 godziny w temperaturze pokojowej bądź peptydem przeciwko gag (pełne kwadraty) lub kontrolnym peptydem 31D (X) określonym na podstawie sekwencji nukleproteiny wirusa wścieklizny (H. C. J. Ertl i wsp., J. Virol. 63: 2885 (1989)). Dwie immunizacje szczepionką VVgag były konieczne, aby indukować wykrywalną pierwszorzędową cytolizę w której pośredniczą limfocyty T, specyficzną wobec gag.
C. Kinetyka odpowiedzi limfocytów T CD8+ na gag
Grupy 4 myszy Balb/c immunizowanego 5 x 106 pfu wirusa Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37. Splenocyty zbierano 6-12 dni później i badano pod kątem produkcji IFN-γ i Iizy docelowych komórek, jak opisano powyżej. Kinetyka odpowiedzi limfocytów T CD8+ na gag wywoływanej przez dwa adenowirusowe rekombinanty była różna. Odpowiedź na gag wywołana przez wirus Adhu5gag37 miała szczyt 2-4 dni wcześniej niż odpowiedzi limfocytów T CD8+ na rekombinanta Adchimp68gag37.
P r z y k ł a d 4
Wpływ wcześniejszego wystawienia na działanie ludzkiego adenowirusa na szczepionkę z małpim adenowirusem
Aby badać wpływ wcześniejszego wystawienia na działanie zwykłego ludzkiego szczepu 5 adenowirusa, myszy immunizowano pojedynczą dawką rekombinanta Adhu5 prowadzącego ekspresję nieodpowiedniego antygenu (ludzki wirus brodawczaka L1). Dwa tygodnie później myszy szczepiono bądź szczepionką Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37.
Bardziej szczegółowo, myszy immunizowano domięśniowo 108 pfu szczepionki Adhu5L1. Dwa tygodnie później immunizowane Adhu5 jak i niestykające się z bodźcem myszy otrzymywały iniekcje
PL 216 200 B1 x 106 lub 2 x 107 pfu rekombinantów Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37 (4-5 myszy na grupę). Dodatkowe grupy immunizowane Adhu5L1 lub nie stykających się z bodźcem myszy immunizowano 2 x 106 pfu wirusem Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37. Dziewięć dni później myszy otrzymywały iniekcje śródotrzewnowo 106 pfu wirusowej szczepionki rekombinanta prowadzącego ekspresję pełnej długości gag. Myszy uśmiercano pięć dni po iniekcji wirusową szczepionką.
Myszy przed immunizacją wirusem Adhu5 nie były w stanie odpowiedzieć na gag po szczepieniu szczepionką Adhu5gag37. Wykazywały one częstości specyficznych względem gag limfocytów T CD8+ podobne do tych obserwowanych u kontrolnych myszy i odpowiednio, ich splenocyty nie były w stanie spowodować Iizy docelowych komórek prowadzących ekspresję gag. Przeciwnie, odpowiedź limfocytów T CD8+ na gag była tylko niewiele zmniejszona u uodpornionych na Adhu5 myszy szczepionych konstruktem Adchimp68gag37. Częstości limfocytów T CDB+ na gag uległy obniżeniu jedynie o ~30% a cytolityczna aktywność splenocytów została obniżona o ~50% porównując różne stosunki efektorowych do docelowych komórek.
Zatem, oba adenowirusowe rekombinanty indukują częstości limfocytów T CDB+ na gag, przewyższające te wywoływane przez wcześniej opisane szczepionki, takie jak nagie DNA lub rekombinanty wirusa ospy (S. Schwartz, i wsp., J Virol 66, 150-159 (1992)). Częstości były również wyższe niż te ogólnie obserwowane u chronicznie zakażonych osobników (D. H. Barouch i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 97,4192 (2000); T. U. Vogel i wsp., J. Immunol. 164,4968 (2000); P. A. Goepferti wsp., J. Virol. 74,10249 (2000); C. R. Rinaldo Jr. i wsp., AIDS Res. & Hum. Retr., 14: 1423 (1998)). Wyniki te podkreślają skuteczność szczepionki z adenowirusowymi rekombinantami.
P r z y k ł a d 5
Wpływ stymulowania i pobudzania przez dawkę przypominającą limfocytów T CD8+ na antygen
Pierwszorzędowe splenocyty z komórek niestykających się z bodźcem lub uodpornionych na Adhu5 myszy immunizowanych 2 x 107 pfu wirusa Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37 porównano ze splenocytami z niestykającymi się z bodźcem lub uodpornionych na Adhu5 myszy szczepionych 2 x 106 pfu wirusa Adhu5gag37 lub Adchimp68gag37, a następnie podano dawkę przypominającą 106 pfu wirusów VVgag. Splenocyty analizowano 5 dni później pod kątem CD8 i wewnątrzkomórkowego IFN-γ.
Testy te zostały przeprowadzone zasadniczo jak opisano powyżej, z takim wyjątkiem, że nie było dalszej hodowli in vitro do lizy komórek P815 traktowanych peptydem gag lub kontrolnym peptydem
D w 5-cio godzinnym teście uwalniania 51Cr.
Dawki stymulujące lub przypominające immunizację z zastosowaniem szczepionki konstruktu heterologicznego, zrekombinowanego VVgag, nie spowodowały odnowienia odpowiedzi limfocytów T CDB na gag prezentowanej przez szczepionkę rekombinanta Adhu5. Pomimo, że u zwierząt szczepionych Adhu5, którym podano dawkę przypominającą Adhu5gagp37 i VVgag, aż 7,1% limfocytów T CDB+ śledziony produkujących IFN-γ w odpowiedzi na gag, limfocyty T CDB+ były całkowicie pozbawione cytolitycznej aktywności przeciwko prezentującym gag docelowym komórkom. Wyniki te wskazują, że wcześniejsze wystawienie na antygeny nośnika szczepionki miało nie tylko wpływ ilościowy, lecz również jakościowy na odpowiedzi limfocytów T CDB+ na produkt transgenu adenowirusowego rekombinanta. Odpowiedzi limfocytów T CDB+ na gag u uodpornionych na Adhu5 myszy szczepionych Adchimp68gag37 wykazały działanie przypominające w wyniku immunizacji VVgag podobny do tych obserwowanych u nie stykających się z bodźcem myszy.
Częstości limfocytów T CD8+ na gag jak i pierwszorzędowa Iiza docelowych komórek mogłyby być wspomagane ponadto przez stymulację (nie przedstawioną) lub dawkę przypominającą nośnika heterologicznej szczepionki, takiego jak rekombinant VVgag. Po podaniu domięśniowo dawki stymulującej adenowirusowych rekombinantów następnie podano 9 dni później i.p. (śródotrzewnowo) dawki przypominające immunizację VVgag, specyficzne względem gag limfocyty T CD8+ analizowane 5 dni po stymulacji stanowiły ~40% całej populacji komórek CD8+ śledziony.
Istniejąca uprzednio odporność na Adhu5 znacząco obniżyła skuteczność szczepionki Adhu5gag37, lecz tylko niewiele osłabiło odpowiedzi limfocytów T CDB+ na wirus Adchimp68gag37. Wcześniej opisywano, że myszy immunizowane wirusem Adhu5 rozwinęły obniżoną odpowiedź limfocytów B na szczepienie szczepionką Adhu5 na wirus wścieklizny. Zwiększając dawkę szczepionki lub stosując szczepionkę DNA umożliwiającą ekspresję tego samego antygenu wirusa wścieklizny może z łatwością rozwiązać tłumiący wpływ wstępnego wystawienia na działanie wirusa Adhu5 (Z. Q. Xiang, i wsp., J. Immunol. 162,6716 (1999)).
Przeciwnie, odpowiedź limfocytów T CD8+ na gag prezentowany przez rekombinanta Adhu5 w szczepionce była znoszona u uodpornionych na Adhu5 myszy i może tylko częściowo zostać przy16
PL 216 200 B1 wrócona przez dodatkową immunizację heterologiczną szczepionką przeciwko gag. Może to wskazywać, że indukcja limfocytów T CDB+ będzie bardziej podatna na zakłócenie przez krążące neutralizujące wirus przeciwciała w porównaniu do stymulacji limfocytów B.
P r z y k ł a d 6
Wytwarzanie zrekombinowanych adenowirusów zawierających glikoproteinę wścieklizny
Adenowirusy ludzkich serotypów 2, 4, 5, 7, 12 i serotypu 68 szympansa namnażano i oznaczano miana w ludzkich komórkach 293. Zrekombinowane adenowirusy oparte na ludzkim serotypie 5 prowadzącym ekspresję glikoproteiny serotypu ERA wirusa wścieklizny lub białka L1 ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV)-16 opisano wcześniej (Z. Q. Xiang, i wsp., Virology 219:220-227 (1996); D. W. Kowalcyk, i wsp., (2001).
Tryb podawania szczepionki w celu zapobiegania przekazywanym drogą płciową zakażeniom ludzkim wirusem brodawczaka typu 16. Układ ekspresji oparty na adenowirusach szympansa o serotypie 68 opracowano jak w przykładzie 1.
Adenowirusy namnażano na nE1 (pochodzącym z ludzkiego serotypu 5 transfekowanych komórek 293 (F. L. Graham, et. al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)). Wirusy zebrano rozmrożone po zamrożeniu komórek. W niektórych doświadczeniach wirus oczyszczano oczyszczaniem w gradiencie CsCI. W innych doświadczeniach stosowano oczyszczony supernatant zakażonych komórek uśmiercany przez trzy cykle rozmrażania po zamrożeniu. Oznaczano miana wirusów w komórkach 293, aby wyznaczyć jednostki tworzące łysinki (pfu).
Adenowirusowy rekombinant serotypu 68 szympansa prowadzącego ekspresję glikoproteiny wirusa wścieklizny, oznaczony Adchimp68rab.gp wytworzono w komórkach 293 transfekowanych E1 adenowirusowego ludzkiego serotypu 5, jak opisano szczegółowo w tym przykładzie. Wirusowe klony wstępnie przeszukiwano stosując pośrednią immunofIuorescencję z monoklonalnym przeciwciałem 509-6 przeciwko epitopowi zależnemu od konformacji glikoproteiny wirusa wścieklizny. W rezultacie selekcji stabilnego adenowirusowego subklonu, ekspresję pełnej długości glikoproteiny wirusa wścieklizny wywołaną przez wirus Ad.chimp68rab.gp w zakażonych komórkach TK- potwierdzono przez immunoprecypitację, jak opisano w poniższym przykładzie.
P r z y k ł a d 7
Ekspresja produktu transgenu przez adenowirusowe rekombinanty
Przykład ten przedstawia, że wirus Adhu5 osiągnął znacząco wyższe poziomy ekspresji glikoproteiny wirusa wścieklizny w komórkach TK- w porównaniu do konstruktu Adchimp68. Poziomy transkrypcji tych transgenowych przebiegały równolegle do ekspresji białek co wskazuje, że różnice nie były związane z różnicami w potranslacyjnych modyfikacjach. Komórki TK- są CAR pozytywne i szybkości transdukcji przez wirusowe serotypy powinny być zatem porównywalne.
Do zastosowania w tych doświadczeniach, ssacze komórki, to jest komórki młodociane nerki chomika (BHK, ang. Baby hamster kidney)-21, komórki 293 transfekowane E1 i komórki TK-, namnażano w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej według Eagle'a (DMEM) uzupełnionej glutaminą, Na-pirowanem, nie podstawowymi aminokwasami, buforem HEPES, antybiotykiem i 10% płodową bydlęcą surowicą (FBS).
A. Immunoprecypitacja
Komórki ΤΚ- (106 na próbkę) infekowano 5 pfu na komórkę każdego z adenowirusowych rekombinantów prowadzących ekspresję glikoproteiny wirusa wścieklizny lub kontrolować konstrukty prowadzące ekspresję niepokrewnego wirusowego antygenu. Po 48 godzinach komórki przemywano dwukrotnie sterylnym roztworem soli w wodzie buforowanym fosforanem (PBS), a następnie inkubo35 wano przez 90 min. w pożywce bez surowicy przed dodaniem 20 μΐ S-znakowanej cysteiny i metioniny (Promix, NEN, Boston, MA). Po 4 godzinach inkubacji, komórki przemywano PBS, a następnie traktowano przez 20 min. 1 ml inhibitorów proteazy zawierających bufor RIPA. Komórki i resztki komórek usunięto ze studzienek, zworteksowano krótko i wirowano przez 2 min. przy 12000 rpm. Nadsącz inkubowano przez 90 min. w temp. 4°C z 15 μ^ płynu puchlinowego zawierającego monoklonalne przeciwciało 509-6 przeciwko glikoproteinie wirusa wścieklizny. Białko sefaroza G dodano w ilości 75 μΐ na próbkę i inkubowano w temp. 4°C przy łagodnym mieszaniu przez 30 min. Próbki osadzano przez wirowanie i przemywano 4 razy buforem RIPA. Zwirowany osad zawieszono ponownie w 80 μΐ buforu do wprowadzania, trzymano w stanie wrzenia przez 4 min. Próbki (20 μΐ) następnie rozdzielono w żelu 12% SDS-poliakrylamidowym (PAGE) w porównaniu standardów mas cząsteczkowych. Żele suszono na bibułach filtracyjnych, którymi naświetlano przez 48 godzin klisze Kodak Scientific Imaging Film (X-Omat Blue XB-1).
PL 216 200 B1
Rekombinant Adchimp68rab.gp prowadzący ekspresję białka o spodziewanej wielkości, które wiąże się z przeciwciałem 509-6. Osad komórek TK- infekowany wirusem Adhu5rab.gp wykazał prążek identyczny co do wielkości, którego nie było w lizatach z komórek infekowanych adenowirusowymi rekombinantami prowadzącymi ekspresję niepokrewnego produktu transgenu. Ekspresja giikoproteiny wirusa wścieklizny była bardziej wyraźna w komórkach infekowanych konstruktem Adhu5rab.gp. Różnice w ekspresji produktu transgenu mogą odzwierciedlać przed translacyjne procesy takie jak różnice w przenikaniu wirusa, szybkość transkrypcji lub stabilność transkryptu. W innym rozwiązaniu, translacyjne lub potranslacyjne różnice takie jak różne modyfikacje łańcucha bocznego mogą prowadzić do ilościowych różnic w serologicznie wykrywalnym białku.
Aby kontynuować rozpoznanie pomiędzy tymi dwoma możliwościami, całkowity RNA wyodrębniono z komórek TK- infekowanych każdym z adenowirusowych rekombinantów. mRNA glikoproteiny wirusa wścieklizny po odwrotnej transkrypcji i konstytutywnego genu amplifikowano metodą rzeczywistego czasu PCR przeprowadzoną jak opisano w części B.
B. Metoda łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (PCR) W czasie rzeczywistym
Konfluentne monowarstwy komórek TK- infekowano w dwóch niezależnych próbkach 10 pfu każdego z adenowirusowych rekombinantów. Komórki wyodrębniono 24 godziny później i RNA ekstrahowano odczynnikiem TRI zgodnie z instrukcjami producenta (Mol. Res. Center, Cincinnati, OH). RNA poddano działaniu DNAzy pozbawionej RNAzy, oczyszczono przez ekstrakcję fenolem i dostosowano do ilości 50 ng RNA na próbkę. RNA po odwrotnej transkrypcji i zamplifikowanu stosując zestaw do amplifikacji Light Cycler-RNA SYBR green (Roche, Mannheim, Germany; Z. He, i wsp., Virology 270: 146-1617 (2000)), stosując startery glikoproteiny wirusa wścieklizny (SEK NR ID: 2: 5'AA GCA TTT CCG CCC AAC AC; SEK NR ID: 3: 3' GGT TAG TGG AGC AGT AGG TAG A) i konstytutywny gen kodujący dehydrogenazę glutaraldehydo-3-fosforanu (GAPDH) (SEK NR ID: 4: 5'GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT T; SEK NR ID:5 : 3'AAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C).
Dane w tabeli 1 przedstawiają wyniki. Dane pokazują średnie wartości z dwóch niezależnych pomiarów ± SD.
T a b e l a 1
Żródło RNA Względna wielkość transkryptu
GAPDH rab.gp Stosunek (GAPDH/rab.gp)
TK-, Adhu5rab.gp 3,2±0,2 3494±18 1082
TK-, Adchimp68rab.gp 0,52±0,01111 64±6 64
Jak wykazano powyższymi danymi, transkrypt transgenu dostosowany do tych konstytutywnego genu wykazał ilościową różnicę porównywalną do tej serologicznie wykrywalnego białka.
W danych niedostarczonych w tym przykładzie, dwa inne rekombinanty Adchimp68 prowadzące ekspresję zielonego fluorescencyjnego białka i skróconego białka gag o zmodyfikowanym kodonie wirusa niedoboru odporności-1 porównano do rekombinantów Adhu5 prowadzących ekspresję tych samych produktów transgenów wykazały równoważne poziomy ekspresji białka w komórkach TK-. Na podstawie powyższego podsumowano, że obniżona ekspresja glikoproteiny wirusa wścieklizny przez wirus Adchimp68 nie odzwierciedla różnicy ani w pobieraniu wirusa ani w szybkości transkrypcji, która w przypadku obu konstruktów jest regulowana tymi samymi elementami kontroli.
P r z y k ł a d 8
Immunizacja myszy stosując antygen wirusa wścieklizny
Specyficzna dla wirusa wścieklizny odpowiedź przeciwciała na wirus Ad.chimp68rab.gp została porównana do odpowiedzi na wirus Adhu5rab.gp we wsobnym i pochodzącym z hodowli niekrewniaczej szczepach myszy. Myszy otrzymywały iniekcje serii rozcieńczeń każdego z rekombinantów podanych podskórnie lub i.n. (donosowo). Surowice zebrano 14 dni później i badano pod kątem przeciwciała przeciwko glikoproteinie wirusa wścieklizny oznaczeniem ELISA i testem neutralizacji wirusa. Adenowirusowe rekombinanty prowadzące ekspresję niepokrewnego transgenu, to jest gag HIV-1 (opisany w przykładach powyżej) zastosowano jako kontrole. Te rekombinanty nie zdołały indukować odpowiedzi przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny wykrywalnej przez dowolny z testów. Bardziej szczegółowa dyskusja tych badań i wyników znajduje się poniżej.
PL 216 200 B1
Samice w wieku 6-8 tygodni myszy C3H/He i C57B1/6 zakupiono w Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine. Pochodzące z hodowli niekrewniaczej ICR myszy zakupiono w Charles River (Wilmington, MA).
Myszy otrzymywały iniekcje różnych dawek adenowirusów lub adenowirusowych rekombinantów podawane w 100 μΐ roztworu soli w wodzie podskórnie (s.c.) lub 50 μΐ donosowo (i.n.). Myszy poddano prowokacji wirusem wścieklizny szczepu CVS-11 podanym w 10 średnich śmiertelnych dawkach (LD50) śródmózgowo (i.c.). Wirus wścieklizny z Evelyn Rokitniki-Abelseth (ERA) i szczep Challenge Virus Standard (CVS)-11 namnażano w komórkach BHK-21. Wirus ERA oczyszczano w gradiencie sacharozy, inaktywowano przez działanie betapropionolaktonem i doprowadzono do stężenia białka 0,1 mg/ml. Oznaczano miana wirusa CVS-11 w komórkach BHK-21 i przez śródmózgową iniekcję dorosłym myszom ICR (Z.Q. Xiang, Z. Q. & H. C. Ertl, R. Virol. Meth. 47:103-16 (1994)). Po prowokacji myszy sprawdzano co 24-48 godzin przez przynajmniej 21 dni. Myszy uśmiercano gdy rozwinęły pełny paraliż tylnych nóg, który jest objawem końcowego zapalenia mózgu w wyniku wirusa wścieklizny.
Serologiczne testy obejmowały immunologiczne oznaczanie biologicznie aktywnych substancji z zastosowaniem enzymów unieruchamianych na sorbentach (ELISA), izotypowy profil przeciwciał i testy neutralizacji wirusa.
A. ELISA
Myszy skrwawiono w różnych przedziałach czasowych po immunizacji przez punkcję wsteczną oczodołową. Surowice uzyskano i badano pod kątem przeciwciał przeciwko wirusowi wścieklizny w szalkach powlekanych 0,1 μg/studzienkę inaktywowanego wirusa wścieklizny. Surowice badano pod kątem przeciwciała przeciwko adenowirusowi na szalkach powlekanych 0,1 μg/studzienkę oczyszczonych rekombinantów adenowirusa pozbawionego E1 przeciwko ludzkiemu GEP serotypowi 5 lub serotypie 68 szympansa. Oznaczenia ELISA przeprowadzono zasadniczo jak opisano wcześniej (Z. Q. Xiang, i wsp., Virology 219,220-227 (1996)). Szalki powlekano przez noc. Następnie zostały blokowane przez 24 godziny PBS zawierającym 3% bydlęcej albuminy z surowicy (BSA). Po przemyciu, surowice rozcieńczono PBS - 3% BSA dodawano przez 60 min. Po przemyciu, rozcieńczenie 1:100 alkalicznej fosfatazy sprzężonej z kozim anty mysim Ig (Cappel) dodano przez 1 godzinę na lodzie. Po przemyciu, substrat dodano przez 20-30 min. w temperaturze pokojowej. Optyczną gęstość odczytano przy 405 nm.
B. Izotypy przeciwciał
Izotypy przeciwciał przeciwko wirusowi wścieklizny określono testem ELISA na szalkach powlekanych inaktywowanym wirusem ERA stosując Calbiochem Hybridoma Subisotyping (LaJolla, CA) zestaw z pewnymi mniejszymi wcześniej opisanymi modyfikacjami (Xiang, Virol, 1996, powyżej cytowanymi).
Izotypowy profil przeciwciał przeciwko również zróżnicowanym w wyniku podskórnej immunizacji, lecz był porównywalny w wyniku donosowego podania dwóch adenowirusowych szczepionek. Oba rekombinanty, w wyniku dostarczania wszystkich trybów zaszczepienia, wywoływały przeciwciała IgG2 na antygen wirusa wścieklizny.
Oba rekombinanty w wyniku donosowej immunizacji i szczepionki Adhu5rab.gp w wyniku podskórnego podawania indukowana wyrażana odpowiedź IgG1 wskazująca na pomoc Th2, która była pozbawiona w odpowiedzi na konstrukt Ad.chimp68rab.gp podany podskórnie.
C. Przeciwciała neutralizujące
Surowice badano pod kątem neutralizujących przeciwciał przeciwko wirusowi wścieklizny szczepu CVS-11, który jest antygenowo blisko spokrewniony ze szczepem ERA (Z. Q. Xiang, i wsp., Virology. 214:398-404 (1996)). Surowica odnośna WHO została zastosowana do porównania. Miana wyrażono w międzynarodowych jednostkach.
Wirus Adchimp68rab.gp podany podskórnie indukowany mniejszą odpowiedź limfocytów B na produkt transgenu w porównaniu do konstruktu Adhu5rab.gp. Różnice w wielkości odpowiedzi przeciwciała, które obserwowano we wszystkich punktach czasowych badanych w zależności od mysiego szczepu i był mniej wyrażany w pochodzących z hodowli niekrewniaczej ICR, niż we wsobnych myszach C3H/He. Przeciwnie, w wyniku donosowej immunizacji zarówno szczepionki indukujące porównywalne miana przeciwciał jak określono testem ELISA i testem neutralizacji wirusa.
Wyrażona odpowiedź Th1 na rekombinant Adchimp68rab.gp w wyniku podskórnej immunizacji kontrastującej z bardziej zrównoważoną odpowiedzią Th1/Th2 w wyniku iniekcji Adhu5rab.gp dowodzi różnicę w adiuwantowości. W wyniku podawania do dróg oddechowych, naturalny tryb infekcji wiruPL 216 200 B1 sem Adhu5 i przypuszczalnie wirusami Adchimp68 zarówno rekombinantami indukowane miana przeciwciał przeciwko produktu transgenu, które były porównywalne w wielkości i ich izotypowym profilu. To sugeruje, że postulowane różnice w tropizmie i/lub adiuwantowości zależą od tkanki, to jest brakujące lub mniej wyrażone w drogach oddechowych w porównaniu do podawania podskórnego.
P r z y k ł a d 9
Indukcja korzystnej cytotoksycznej odpowiedzi limfocytów T zrekombinowanym adenowirusem szympansa
Indukowane szczepionką zabezpieczenie przeciwko wirusowi wścieklizny koreluje się z neutralizującym wirus przeciwciałami (VNA, ang. wirus neutralizing antipodies). Badania białka wścieklizny tak skoncentrowanej na stymulacji tego ramienia układu odpornościowego. We wszystkich doświadczeniach, myszy immunizowano wirusem Adchimp68rab.gp i, równolegle, z wcześniej opisanym wirusem Adrab.gp w oparciu o ludzki serotyp 5. W zakresie obecnego zgłoszenia, ten rekombinant określano jako wirus Adhu5rab.gp.
Zabezpieczenie indukowane przez oba adenowirusowe rekombinanty aby uzyskać prowokacje wirusem wścieklizny. Myszy C3H/He immunizowane 5 x 106 pfu dowolnych adenowirusowych rekombinantów podanych podskórnie pozostały wolne od choroby gdy prowokowano 3 tygodnie później 10 średnimi śmiertelnymi dawkami (LD50) wirusa wścieklizny szczepu CVS. Ten szczep wirusa wścieklizny jest antygenowo blisko spokrewniony ze szczepem ERA lecz jest bardziej zjadliwy u gryzoni. Przy 5 niższych dawkach szczepionki 5 x 105 pfu, wirus Adhu5rab.gp nadal dostarczone pełne zabezpieczenie podczas gdy mały procent immunizowanych Adchimp68rab.gp myszy ulegających infekcji. Ponadto redukcja dawki szczepionki prowadziła do utraty skuteczności szczepionki Adchimp68rab.gp.
W wyniku donosowej immunizacji, obie szczepionki dostarczały pełne zabezpieczenie jeśli podane przy 5 x 105 pfu. W niższych dawkach 5 x 104 pfu 50% myszy szczepionych szczepionką Adhu5rab.gp rozwinęły progresywne choroby podczas gdy te immunizowane tą dawką rekombinanta Adchimp68rab.gp były chronione.
Wszystkie myszy immunizowane adenowirusowymi rekombinantami każdego z serotypów pro3 wadzących ekspresję niepokrewnego antygenu lub 5 x 103 pfu każdego z adenowirusowych rekombinantów przeciwko glikoproteinie wirusa wścieklizny rozwinęły śmiertelne zapalenie mózgu spowodowane wścieklizną.
P r z y k ł a d 10
Wpływ istniejącej uprzednio odporności na różne serotypy ludzkich adenowirusów na odpowiedź przeciwciał na wirus wścieklizny
Aby zbadać czy uprzednie wystawienie na działanie na dowolny z typowych serotypów ludzkich adenowirusów (np., ludzkie serotypy 2, 4, 5, 7 i 12) może hamować odpowiedź przeciwciała na szczepionkę Adchimp68rab.gp, grupy myszy C3H/He immunizowane adenowirusami 4 x 108 pfu o kompetentnej replikacji ludzkich serotypów 2, 4, 5, 7 lub 12 lub serotypem 68 szympansa (ten ostatni serotyp był pozbawiony E1). Dwa tygodnie później, myszy szczepiono podskórnie zarówno wirusem 5
Adhu5rab.gp jak i Adchimp68rab.gp. Rekombinbant Adhu5rab.gp zastosowano w dawce 2 x 105 pfu na mysz, rekombinant Adchimp68rab.gp, który jest podany podskórnie, tylko indukuje marginalne odpowiedzi przeciwciała u myszy C3H/He, w tak niskiej dawce podawanej przez iniekcje 2 x 107 pfu na mysz. Surowice zebrano 2 tygodnie później i badano pod kątem przeciwciał przeciwko glikoproteinie wirusa testem ELISA. Specyficzna dla wirusa wścieklizny odpowiedź na Adhu5rab.gp była niewiele wyższa, u nie stykających się z bodźcem myszy, niż u tych które były wystawione na wirus Adchimp68. Odpowiedź na wirus Adhu5rab.gp była całkowicie zahamowana u wcześniej uodpornionych myszy Adhu5. Pewną redukcję również obserwowanego u myszy wcześniej uodpornionych na adenowirusowe ludzkie serotypy 4, 2, 7 i 12. Nie stwierdzono wpływu na odpowiedź u myszy, które były wstępnie narażone na działanie wirusa Adchimp68. Odpowiedź na wirus Adchimp68rab.gp była silnie hamowana u myszy, które wcześniej uodporniono na homologiczny wirus. Myszy, które miały wcześniej kontakt z adenowirusowym ludzkim serotypem 2 wykazały niewielką redukcję odpowiedzi przeciwciała na antygen wirusa wścieklizny prezentowany przez szczepionkę Adchimp68. Myszy szczepione dowolnym z innych serotypów ludzkich adenowirusów rozwinęły miana przeciwciał na wściekliznę w wyniku wirusa Adchimp68rab.gp, które były lub są podobne lub zwiększone w porównaniu do tych u myszy, które nie stykały się z bodźcem przed szczepieniem. W szczególności, myszy wstępnie uodporniane na wirus Adhu5 rozwinęły wyższe miana przeciwciał w wyniku szczepienia konstruktem Adchimp68rab.gp, co może odzwierciedlać obecność krzyżowo reaktywnych limfocytów T pomocniczych, które zwiększają odpowiedź limfocytów B na produkt transgenu.
PL 216 200 B1
Aby dalej określić czy przy równych dawkach szczepionki, szczepionka Adchimp68rab.gp indukowała zwiększone miana przeciwciał w porównaniu do wirusa Adhu5rab.gp u myszy wstępnie uodpornionych na wirus Adhu5, przeprowadzono doświadczenia z określeniem miana szczepionki. Grupy myszy C3H/He immunizowano podskórnie 4 x 108 pfu adenowirusowego rekombinanta z usuniętym E1 z antygenem L1 HPV-16. Myszy szczepiono 2 tygodnie później wirusem Adhu5rab.gp lub Adchimp68rab.gp podawanym podskórnie w różnych dawkach. Myszy skrwawiano 2 tygodnie później i miana przeciwciał w surowicy przeciwko wirusowi wścieklizny określono testem ELISA (nie przedstawione) i testem neutralizacji wirusa. Żaden z testów nie wykazał znaczącej redukcji w odpowiedzi przeciwciała na konstrukt Adchimp68rab.gp u uodpornionych Adhu5 myszy. Dotkliwość redukcji miana przeciwciał przeciwko wirusowi wścieklizny prezentowanemu przez konstrukt Adhu5 u myszy wstępnie uodpornionych na homologiczny wirus zależał od dawki szczepionki. Wpływ na odpowiedź przeciwciała na niższe dawki szczepionki był większy niż na odpowiedź na wyższe dawki szczepionki. Miana VNA zasadniczo bardziej uległy obniżeniu niż miana w teście ELISA. Miana VNA przy najwyższej dawce szczepionki stanowiły połowę mian u myszy wstępnie uodpornianych na wirus Adhu5, podczas gdy przy dwóch niższych dawkach szczepionki miana uległy obniżeniu ponad 20 krotnie. W każdej z badanych dawek, rekombinant Adchimp68rab.gp indukował wyższe miana VNA przeciwko wściekliźnie u wstępnie uodpornionych Adhu5 myszy w porównaniu do tych osiągniętych przez równą dawkę szczepionki Adhu5rab.gp. Wykazano szkodliwy wpływ istniejącej uprzednio odporności na Adhu5 na skuteczność szczepionki Adhu5 w kolejnym doświadczeniu ochrony. Nie stykające się z bodźcem 5 myszy immunizowane 2 x 105 pfu wirusa Adhu5rab.gp lub Adchimp68rab.gp były całkowicie zabezpieczone przed prowokacją wirusem CVS-11. Większość (65%) wstępnie uodpornianych Adhu5 myszy immunizowanych tą dawką szczepionki Adhu5rab.gp uległy infekcji wirusem wścieklizny podczas gdy te szczepione taką samą dawką wirusa Adchimp68rab.gp pozostały zabezpieczone. Zwiększając dawkę wirusa Adhu5rab.gp do 2 x 106 pfu na mysz przywrócono skuteczność szczepionki.
Odpowiedź przeciwciała na produkt transgenu ulegający ekspresji przez rekombinanta Adchimp68 nie była dotknięta przez istniejącą uprzednio odporność na pospolite ludzkie adenowirusowe serotypy, które hamują odpowiedź na odpowiadający mu rekombinant ludzkiego serotypu 5. W wyniku wstępnej immunizacji wirusami o kompetentnej replikacji, odpowiedź immunologiczna na szczepionkę theAdhu5rab.gp została zniesiona u wstępnie uodpornianych Adhu5 myszy i obniżona u myszy wstępnie uodporniane na inne ludzkie serotypy adenowirusa takiego jak 2 i 4. Odpowiedź na rekombinanta Adchimp68 była, jak się spodziewano hamowana u myszy wstępnie uodpornianych na homologiczny wirus. Nie należy do problematyki klinicznej, gdyż wirus Adchimp68 nie krąży w ludzkiej populacji i typowe ludzkie serotypy nie mają wspólnych neutralizujących epitopów z wirusem Adchimp68.
Wstępne wystawienie na działanie wirusa Adhu5 o uszkodzonej replikacji również obniżyło odpowiedź przeciwciała na glikoproteinę wirusa wścieklizny prezentowanego przez rekombinanty Adhu5 pomimo, że wpływ nie był tak dotkliwy jak u myszy wcześniej infekowanych wirusem o kompetentnej replikacji. Surowice myszy wstępnie uodpornianych na wirus Adhu5 o uszkodzonej replikacji rozwinęły mniej, lecz z łatwością wykrywalne przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny w wyniku immunizacji szczepionką theAdhu5rab.gp. Zwiększając dawkę konstruktu Adhu5rab.gp mogło częściowo ominąć wpływ istniejącej uprzednio odporności. Indukowane szczepionką zabezpieczenie przeciwko wirusowi wścieklizny wymaga VNA, które nie były indukowane tak skutecznie u wstępnie uodpornianych myszy w wyniku szczepionki Adhu5 zwłaszcza gdy zastosowane w niższych dawkach. U wstępnie uodpornianych Adhu5 myszy odpowiedź VNA na konstrukt Adchimp68rab.gp była wyższa przy wszystkich dawkach badanych, względem odpowiedzi na szczepionkę Adhu5, zatem więcej niż wyrównanie niewiele niższych skuteczności tej szczepionki w wyniku podskórnej immunizacji.
Rekombinanty Adchimp68 zatem dostarczają atrakcyjnej alternatywy jako nośnika szczepionki do zastosowania u ludzi. Jak wykazano tutaj są one skuteczne nawet jeśli są stosowane w niskich 5 dawkach 2 x 105 pfu przy nie inwazyjnych trybach podawania takich jak przez górne drogi oddechowe. Śluzówkowa immunizacja przez donosowe podawanie ma tę przewagę, że zwiększa indukcję odpowiedzi typowego układu odpornościowego śluzówki, który jest odmienny, lecz połączony z centralnym układem odpornościowym będącym celem szczepionek podawanych przez iniekcje.
P r z y k ł a d 11
Zawiesina wyjściowa i replikacja wirusa szympansa C68
Poniższe Przykłady 11 do 15, dostarczają dodatkową charakterystykę C68 szympansa. Będzie zrozumiałe przez specjalistę w dziedzinie, że ta informacja może być z łatwością zastosowana do konstrukcji nowych zrekombinowanych adenowirusowych konstruktów szympansa.
PL 216 200 B1
Zawiesinę wyjściową wirusa C68 otrzymano z ATCC (Rockville, MD) i namnażano w komórkach 293 (ATCC) hodowanych w DMEM (Sigma, St. Louis, MO) uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FCS; Sigma lub Hyklon, Logan, UT) i 1% Penicyliną-Streptomycyną (Sigma). Infekcję komórek 293 przeprowadzono w DMEM uzupełnioną 2% FCS przez pierwsze 24 godzin, po czym dodano FCS, aby uzyskać końcowe stężenie 10%. Infekowane komórki zebrano gdy 100% komórek wykazywało indukowany wirusem efekt cytopatyczny (CPE, ang. cytopathic effect), zebrano i zatężono przez wirowanie. Osad komórek zawieszono ponownie w 10 mM Tris (pH 8,0), i lizowano w 3 cyklach zamrażania i tajania. Wirusowe preparaty otrzymane po 2 etapach ultrawirowania w gradientach gęsto12 ści chlorku cezu i wyjściowe zawiesiny wirusa rozcieńczono 1 x 1012 cząsteczek/ml w 10 mM Tris/100 mM NaCI/50% glicerol i przechowywano w temp. -70°C.
P r z y k ł a d 12
Klonowanie i sekwencjonowanie wirusowego genomowego DNA
Genomowe DNA wyodrębniono z oczyszczonego wirusowego preparatu zgodnie ze standardowymi sposobami i trawiono zestawem 16 enzymów restrykcyjnych zgodnie z zaleceniami producenta. Z wyjątkiem jak wskazano, wszystkie enzymy restrykcyjne i modyfikujące otrzymano z Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. Genomowe DNA trawiono BamHI, Pstl, Sall, HindIII lub Xbal i fragmenty wklonowano do plazmidów (K. L. Berkner and P. A. Sharp, Nucl. AcidsRes., 11:6003-20 (1983)). Po usunięciu białek, syntetyczne linkery PacI o 10 parach zasad (New England Biolabs, Beverly, MA) podwójnie trawiono Pad i BamHI, lub PstI.
Klony Pstl, BamHI i HindIII wytworzone z C68 przedstawiono na Fig. 1, jako części odpowiednio C, D i E. Fragmenty wskazane przez zacieniowane prostokąty nie były klonowane, lecz sekwencję całego genomu wyznaczono przez sekwencjonowanie nakładających się klony i wirusowy DNA bezpośrednio (niezacieniowane prostokąty). Sklonowane fragmenty opisano w Tabeli 2.
T a b e l a 2. Klony plazmidu C68 i wielkości insertów
Nazwa konstruktu wielkość insertu (par zasad) Fragment z końca 5' Fragment z końca 3' End Jednostka mapowa końca 5' Jednostka mapowa końca 3'
Fragmenty Pst-I
C68-Pst-A 6768 24784 31551 67,9% 86,4%
pBS:C68-Pst-B 6713 4838 11550 13,2% 31,6%
pBS:C68-Pst-C 5228 14811 20038 40,6% 54,9%
pBS:C68-Pst-D 2739 12072 14810 33,1% 40,6%
pBS:C68-Pst-E 2647 20039 22685 54,9% 32,1%
pBS:C68-Pst-F 1951 32046 33996 87,8% 93,1%
pNEB:C68-Pst-G 1874 1 1874 0,0% 5,1%
pBS:C68-Pst-H 1690 23094 24783 63,2% 67,9%
pBS:C68-Pst-I 1343 33997 35339 93,1% 96,8%
pNEB:C68-Pst-J 1180 35340 36519 96,8% 100,0%
pBS:C68-Pst-K 1111 2763 3873 7,6% 10,6%
pBS:C68-Pst-L 964 3874 4837 10,6% 13,2%
pBS:C68-Pst-M 888 1875 2762 5,1% 7,6%
pBS:C68-Pst-N 408 22686 23093 62,1% 63,2%
C68-Pst-O 380 31666 32045 86,7% 87,7%
PL 216 200 B1 cd. tabeli 2
pBS:C68-Pst-P 285 11551 11835 31,6% 32,4%
C68-Pst-Q 236 11836 12071 32,4% 33,1%
pBS:C68-Pst-R 114 31552 31665 86,4% 86,7%
Fragmenty BamHI
C68-Bam-A 16684 19836 36519 54,3% 100,0%
pBS:C68-Bam-B 8858 3582 12439 9,8% 34,1%
pBS:C68-Bam-C 4410 12440 16849 34,1% 46,1%
pBS:C68-Bam-D 2986 16850 19835 46,1% 54,3%
pNEB:C68-Bam-E 2041 1 2041 0,0% 5,6%
pBS:C68-Bam-F 1540 2042 3581 5,6% 9,8%
Fragmenty HindIII
pBR:C68-Hind-B 9150 23471 32620 64,3% 89,3%
pBS = klon pBluescript SK+ pNEB = klon pNEB 193 pBR = klon pBR322
Bez przedrostka = fragmentu nie klonowano
Adenowirus szympansa, C68, otrzymano z ATCC i namnażano w ludzkich komórkach 293. Wirusowe genomowe DNA wyodrębniono z oczyszczonych wirionów stosując ustalone procedury (A. R. Davis, i wsp., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) i trawiono panelem enzymów restrykcyjnych; dane były zgodne z wcześniejszymi badaniami (data nie przedstawione) (G. R. Kitchingman, Gene, 20:205210 (1982); Q. Li and G. Wadell, Arch Virol. 101:65-77 (1998); R. Wigand, i wsp., Intervirology. 30: 1-9 (1989)). Fragmenty restrykcyjne rozciągającą się na cały genom C68 wklonowano do plazmidów. Schematyczne rozrysowanie genomu C68 przedstawiono na fig. 1A i fragmenty Pst-I, BamHI i Hindlll, które wklonowano do plazmidowych wektorów wskazano przez niezacieniowane prostokąty na fig. odpowiednio 1B, 1C, i 1D. Wklonowane fragmenty, wielkości fragmentów i genomowe pozycje są również wymienione w tabeli 2. Oba plazmidowe klony i genomowe DNA zastosowano jako matryce do sekwencjonowania. Genom sekwencjonowano przez kroczenie startera w obu kierunkach i każda zasada została objęta w średnio w przybliżeniu z czterech reakcji.
Genom C68 ma 36521 par zasad długości [patrz, opis patentowy US nr 6,083,716]. Wstępne porównanie z sekwencjami GenBank wskazało różne stopnie podobieństwa z innymi ludzkimi i zwierzęcymi adenowirusami wzdłuż całej długości wirusowego genomu. Regiony z homologią do wszystkich wcześniej opisanych adenowirusowych genetycznych jednostek, wczesne regiony 1-4 i główne późne geny, stwierdzono w genomie C68 (Fig. 1A). Homologie DNA pomiędzy C68 a ludzkimi adenowirusami, które całkowicie sekwencjonowano, Ad2 (NC001405), Ad5 (NC001405), Ad12 (NC001460), Ad17 (NC002067) i Ad40 (NC01464), zastosowano w celu zamawiania klonów. Otwarte ramki odczytu (ORF) wyznaczono i geny zidentyfikowano w oparciu o homologie z innymi ludzkimi adenowirusami. Wszystkie z głównych adenowirusowych wczesnych i późnych genów są obecne w C68. Odwrócone końcowe powtórzenia (ITR=s) obejmują 130 par zasad długości.
P r z y k ł a d 13
Analiza sekwencji C68
Pełną sekwencję nukleotydową z każdego elementu rodzaju Mastadenowirus dostępnego z GenBank, obejmującego izolaty z różnych gatunków, przeszukiwano pod kątem identyczności z C68. Minigenom Ad4 zestawiono z następujących sekwencji GenBank; leworęczny ITR (J01964); region E1A (M 14918); pol i pTP DNA (X74508, 74672); VA RNA-1, II (U10682); 52,55K (U52535); pVII (U70921); hekson (X84646); endoproteaza (M16692); DNA-białko wiążące (M12407); włókno (X76547); praworęczny ITR (J01965). Złożony genom Ad7 uzyskano z poniższych danych sekwencji: Mu 3-21 (X03000); VA RNA-I, II, pTP & 52,55K (U52574); penton (AD001675); pVI, hekson i endoproteaza (AF065065); DNA-białko wiążące (K02530); E3 i region włókna (API 04384); praworęczny ITR(V00037).
PL 216 200 B1
Przyporządkowanie sekwencji aminokwasowej wytworzono przy pomocy Clustal X, edytowanego stosując Jalview (http://www.ebi.ac.uk/~michele/jalview/), i analizowano stosując Boxshade (http://www.ch.embnet.org/sofiware/BOX form.html). Publicznie dostępne heksonowe sekwencje białka ze wszystkich ludzkich adenowirusowych serotypów początkowo przyporządkowano do identyfikacji zestawu przedstawiającego najwyższą homologię z C68.
Sekwencja nukleotydowa i przewidywane sekwencje aminokwasowe ze wszystkimi znaczącymi otwartymi ramkami odczytu w genomie C68 porównano do znanych sekwencji DNA i białka. Sekwencję nukleotydową C68 porównano z sekwencjami Ad 2, 4, 5, 7, 12, 17 i 40. Zgodnie z wcześniejszą analizą restrykcyjną (Kitchingman, cytowany powyżej; Li i Wadell, cytowany powyżej) C68 jest najbardziej podobny do ludzkiego Ad4 (podgrupa E).
Obszar E1 C68 rozciąga się od boksy TATA w nt 480 do poli A dodanego miejsca w pozycji 1521. Miejsca zgodności łączenia donora i miejsca akceptorowe są w analogicznej pozycji ludzkich odpowiedników Ad, i białka 28,2K i 24,8K są podobne wielkością do ludzkiego białka Ad. ORF dla najmniejszego białka E1 C68 przewidywalnie kodują reszty 101 w przeciwieństwie w przybliżeniu 60 aminokwasów na inne adenowirusy. Przy reszcie 60 występuje kodon TTA w C68, gdzie inne adenowirusy często mają kodon stop TGA. Pierwsze 60 reszt białka E1A 100R C68 ma 85% identyczności z homologiem Ad4.
Genom C68 koduje geny kodujące cztery białka E1B, 20,5K, 54,7K, 10,1K i 18,5K jak i pIX. Wszystkie pięć kodowanych białek C68 jest podobnych wielkością do tych innych białek E1B Ad i pIX. Homolog białka E1B 21K Ad4 ma tylko 142 aminokwasów, gdzie C68 ma 186 reszt a inne ludzkie adenowirusy mają 163-178 reszt. Białka C68 i Ad4 mają 95% identyczności z pierwszymi 134 aminokwasami, następnie podobieństwo kończy się i białko Ad4 kończy się 142 aminokwasami.
Genom C68 koduje homologi białka wiążącego DNA E2A 55K i białka dojrzewania Iva2, jak i końcowe białko E2B i polimerazę DNA. Wszystkie regiony białka E2 są podobne pod względem wielkości do ich ludzkich Ad odpowiedników, a białka E2B są szczególnie dobrze konserwowane. Polimeraza DNA C68 E2B 123.6K przewiduje się, że ma 1124 reszt, podczas gdy Ad4 przewiduje się, że ma 1193 pomimo, że inne ludzkie adenowirusy mają mniejsze polimerazy.
Reszty 1-71 polimeraz Ad4 nie mają podobieństwa z żadną inną polimerazą Ad, i jest możliwe, że to białko faktycznie inicjuje przy wewnętrznym kodonie ATG. Od aminokwasów 72-1193, polimerazy Ad4 i C68 mają 96% identyczność aminokwasów.
Regiony E3 ludzkich adenowirusów zsekwencjonowano do tej pory wykazują znaczącą zmienność sekwencji i zdolności kodującej. Ad40 ma pięć regionów E3 genów, Ad12 ma sześć, C68 Ad5 mają siedem, Ad38 ma osiem oraz Ad3 jak i Ad7 (podgrupy B ludzkich adenowirusów) mają dziewięć przypuszczalnych regionów E3 genów. Region Ad4 E3 nie został jeszcze zsekwencjonowany. W porównaniu z regionem E3 Ad35, wszystkie 7 homologów genu E3 zidentyfikowano w genomie C68 (C. F. Basler and M. S. Horwitz, Virology, 215: 165-177 (1996)).
Region C68 E4 ma 6 ORFów i każdy jest homologiczny do białek w regionie E4 ludzkiego Ad5, 12 i 40. Nomenklatura E4 jest myląca ponieważ homologi ORF2 C68, Ad12 i Ad40 mają w przybliżeniu 130 reszt, podczas gdy w Ad5 występują dwa ORFy kodujące białka o 64 i 67 resztach z homologią, odpowiednio do amino i karboksy końcowych fragmentów większych ORF2 białek. ORF5 została ominięta w naszej nomenklaturze ponieważ 5ta ORF w regionie E4 jest homologiczna do obszernie badanej ORF6 białka ludzkiego Ad5.
Główny późny promotor i trzy-częściowe liderowe sekwencje genomu C68 zostały zlokalizowane. ORFy z potencjałem kodują 15 głównych późnych białek zlokalizowano. Wszystkie z późnych białek C68 są podobne pod względem wielkości do ich ludzkich Ad odpowiedników. Procent aminokwasowych identyczności pomiędzy późnymi białkami szympansa i ludzkiego Ad różnią się znacząco. Białko włókna C68 przewiduje się, że ma 90% aminokwasowej identyczności z białkiem Ad4, lecz znacznie mniejsze podobieństwo z innymi ludzkimi białkami włókna Ad. Miejsce wiązania CAR w węźle włókna jest obecne w C68.
P r z y k ł a d 14
Testy przeciwciał neutralizujących wirusy
Kilka badań przeprowadzono, aby wyznaczyć czy występuje oddziaływanie krzyżowe pomiędzy specyficznymi dla typu surowicami odpornościowymi C68 i ludzkiego adenowirusa. Neutralizująca aktywność surowic była badana następująco. Zespoły surowic od normalnych ludzi (N=50), małp rezusów (N=52) i szympansów (N=20) określano pod kątem neutralizujących przeciwciał przeciwko opartym na Ad5 i C68 wektorom stosując komórki 293 jako indykacyjną linię komórkową. Surowice
PL 216 200 B1 zebrane od poszczególnych ludzi, małp rezusów, lub szympansów inaktywowano w temp. 56°C przez 30 minut. Serię rozcieńczeń każdej próbki (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 w 100 μl DMEM zawierającej 10% FCS) dodano równej ilości H5. 010CMVEGFP (1000 PFU/studzienkę) lub wirus C68CMVEGFP i inkubowano w temp. 4°C przez dwie godziny. Sto pięćdziesiąt mikrolitrów mieszaniny przenoszono do 2 x 10 komórek 293 w 96 studzienkach o płaskich dnach. Kontrolne studzienki infekowano równymi ilościami wirusa (bez dodania surowicy). Próbki inkubowano w temp. 37°C w 5% CO2 przez 48 godzin i badano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rozcieńczenia próbki, które wykazały > 50% redukcję zielonych fluorescencyjnych soczewek w porównaniu do infekowanych kontroli, które oceniano pod kątem pozytywnych względem neutralizacji przeciwciał.
Jak się spodziewano, w przybliżeniu u 35% normalnych ludzi wykazano neutralizujące przeciwciała przeciwko Ad5, częstość znacznie wyższa, niż obserwowana w surowicach małp rezusów i szympansów. Neutralizujące przeciwciało na C68 obserwowano w 80% u szympansa i tylko w 2% u normalnych ludzi lub małp rezusów. Miana neutralizujących przeciwciał u niedocelowych gatunków były ogólnie niskie.
Aby dalej określić reaktywność krzyżową C68 z ludzkimi adenowirusowymi wektorami, myszy immunizowano 2 x 107 jednostkami tworzącymi łysinki (pfu) Ad 2, 4, 5, 7 i 12 jak i C68. Surowice zebrano 2 tygodnie później i badano pod kątem przeciwciał, które neutralizowały zarówno Ad5 jak i wektory C68. Neutralizujące przeciwciało przeciwko wektorowi Ad5 było tylko wykryte u zwierząt immunizowanych Ad5. Ważne jest że tylko zwierzęta z neutralizującym przeciwciałem przeciwko wektorowi C68 były tymi immunizowanymi wektorem C68; żaden z ludzkich badanych serotypów, obejmujących Ad4, nie wytwarzał przeciwciał u myszy, które neutralizują C68 in vitro.
Ważny dla zastosowania wektora C68 w próbach na ludziach jest brak neutralizującego przeciwciała w ludzkiej populacji. W naszym badaniu, w wyniku przeszukiwania 50 normalnych ludzi nie zdołano wykryć żadnych znaczących neutralizujących przeciwciał ( > 1:10) stosując ten sam test, który wykazał neutralizujące przeciwciała w ilości > 50% u szympansów. Ponadto, surowice myszy immunizowanego wielokrotnymi ludzkimi Ad serotypami obejmującymi Ad4, nie neutralizowały infekcji C68.
W innym badaniu, grupy dziesięciu do dwudziestu myszy ICR szczepiono różnymi dawkami szczepionki Adhu5rab.gp lub AdC68rab.gp podawanej podskórnie (s.c.), donosowo (i.n.) lub doustnie (per os). Myszy skrwawiono 21 dni później i miana wirusowego neutralizującego przeciwciała (VNA) ulegającego ekspresji wyznaczono w międzynarodowych jednostkach. Myszy poddano prowokacji 4 tygodnie po szczepieniu 10 średnimi śmiertelnymi dawkami wirusa CVS-24 podawanymi bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego.
MianaVNA (% przeżycie w wyniku prowokacji)
Dawka szczepionki 5x107 5x106 5x105 5x104
Adhu5rab.gp,podskór. 972 (100) 324 (100) 108 (100) 12 (100)
AdC68rab.gp,podskór. 240 (100) 36 (100) 12 (80) 8 (80)
Adhu5rab.gp,donos. nt 162 (100) 162 (100) 18 (50)
AdC68rab.gp,donos. nt 54 (100) 162 (100) 18 (50)
2x107 2x106 2x105 2x104
Adhu5rab.gp, dopust. 108 (100) 54 (88) 18 (80) 4 (30)
AdC68rab.gp,dopust. 108 (100) 36 (78) 12 (55) 0,2 (0)
Te dane wykazują, że konstrukt AdC68 niespodziewanie indukuje lepszą zabezpieczającą odpowiedź przeciwciała przy niskich donosowych dawkach niż ludzki typ 5.
P r z y k ł a d 15
Strukturalna analiza białek heksonu
Brak neutralizujących przeciwciał pomiędzy C68 i ludzkimi serotypami zmusił nas do bardziej uważnego określenia strukturalnych różnic regionów heksonu prawdopodobnie zawierającego specyficzne dla typu epitopy. Wcześniejsze badania sugerowały, że te epitopy są zlokalizowane w obrębie 7 hiperzmiennych regionów heksonu określonych przez Crawforda-Mikszę i Schnurra (J Virol, 70:18361844 (1996)). Porównanie sekwencji aminokwasowych białka heksonu pomiędzy C68 a kilkoma ludzkimi adenowirusami przedstawiono na Fig. 2. Faktycznie, C68 zasadniczo jest niepodobny w znacząPL 216 200 B1 cych regionach do tych hiperzmiennych sekwencji. Bardziej szczegółowo modelowanie trzy wymiarowej struktury heksonu C58 przeprowadzono w celu zmapowania wyjątkowych sekwencji. Modele struktur heksonowych z C68 i Ad4 wytworzono w oparciu o rentgenowskie krystaliczne struktury heksonów dla Ad2 i Ad5.
Struktury kryształów heksonu Ad5 wyznaczono stosując promieniowanie rentgena (Protein Data Bank identyfikator 1RUX) (J. J. Rux i R. M. Burnett, Mol. Ther. 1: 18-30 (2000)), i dla Ad2 (F. K. Athappilly, i wsp., J. Mol. Biol., 242:430-455 (1994)), oczyszczono dalej, aby otrzymać obecne modele heksonów (Rux i Burnett, będzie opublikowane gdzie indziej). Modele homologicznego C68 i Ad4 heksonów początkowo wytwarzały stosując Szwajcarski PdbViewer środowisko modelowania białka (N. Guez and M. C. Peitsch, Electrophoresis, 18:2714-2723 (1997)). Jest to zautomatyzowana procedura, którą zastosowano do przypisania sekwencji aminokwasowych C68 i Ad4 heksonu do tej Ad2 i Ad5 heksonowych krystalicznych struktur. Przyporządkowania sekwencji zastosowano do przeprowadzania nici modelowych sekwencji na znane molekularne struktury. Pozycje bocznych łańcuchów reszt not obserwowanych znanych strukturach wybrano z biblioteki promotorów łańcuchów bocznych. Te wyjściowe molekularne modele następnie ręcznie dostosowano, w celu poprawienia automatycznego przyporządkowania, przez przenoszenie przerw do narażonych na działanie zmiennych regionów i przez optymalizację wprowadzania do otoczki łańcuchów bocznych. Pozycje segmentów zewnętrznej pętli nie służą do struktur w matrycy Ad2 i Ad5, były bądź są wybrane z biblioteki o znanych strukturach pętli lub są dopasowywane ręcznie. Konformacje każdego modelu ponadto, poddano oczyszczaniu przez minimalizację energii stosując molekularnie mechaniczny program CHARMM (B. R. Brooks, i wsp., J Comp. Chem., 4: 187-217 (1983)). Struktury tych modeli heksonu C68 i Ad4 następnie przyporządkowano i nowe sekwencje przyporządkowane obliczono. Różnice pomiędzy dwoma strukturalnie przyporządkowanymi heksonowymi sekwencjami zastosowano do barwnego obrazowania homologicznych modeli. Obrazy graficzne przygotowane w oprogramowaniu SwissPdbViewer wysyłano i poddawano obróbce programem Persistence of Vision Ray Tracer (POV-Ray 2000, Version 3.1 g).
Podczas gdy całkowita sekwencja C68 jest bardzo podobna do tej heksonu Ad4, różnice pomiędzy dwoma sekwencjami są głównie skupione w pętlach DE1 i FG1, i te zawierają wszystkie siedem hiperzmienne regiony. Pętle te DE1, FG1, i FG2, każda z różnych podjednostek, które jednorodnie łączą się aby utworzyć domeny wieży na górze trimerycznej cząsteczki. Heksonowe wieże tworzą większość zewnętrznej powierzchni wirionu i są miejscami przyłączenia przeciwciała. Ponieważ boki i podstawa heksonów są wprowadzane razem do kapsydu, regiony te są chronione przed wiązaniem przeciwciała i ich sekwencje są konserwowane. Przeciwnie, sekwencje C68 i Ad4 są całkiem różne w wieżach heksonów. To natychmiast wyjaśnia dlaczego przeciwciała skierowane przeciwko dowolnym z wirusów nie reagują krzyżowo.
Wszystkie publikacje cytowane w tym opisie i listy sekwencji włączono tutaj na drodze odniesienia. Podczas gdy wynałazek opisano w odniesieniu do szczególnie korzystnego rozwiązania, będzie zrozumiałe, że modyfikacje mogą być wytworzone bez oddalania się od idei wynalazku. Takie modyfikacje mają być objęte zakresem załączonych zastrzeżeń.
PL 216 200 B1
LISTA SEKWENCJI <110> The Wiatar InstŁtute of Anatemy and Biology
The Trustees of The University of Pennsylyania Ertl, Hildegund C.J.
Wilson, James M.
<12G> Sposoby wywoływania cytotoksycznej odpowiedzi odpornościowej i użyteczne w nich kompozycje rekombinowanego małpiego adenowirusa <13G> WST104A/UPNW2628A <150 US ¢0/300,131 <1S1> 2001-06-22 <15ΰ> US 60/304,843 <151> 2001-07-12 <160> 13 <170> Fatentln wersja 3.1 <210 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Syntetyczny peptyd, niosący immunodominujący epitop limfocytu TCD8+ haplotypu H-2d <400 1*
Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile
5 <210 2 <211> 19 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> , , , , , <223> 5'Starter dla giikoproteiny wirusa wścieklizny <400> 2 aagcatttcc gcccaacac <210 3 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223> 3'St arter dla glikoproteiny wirusa wścieklizny
PL 216 200 B1 <400 3 ggttagtgga gcagtaggta ga <210 4 <211> 25 <212> DNA <213> 'sekwencja sztuczna <220>
<223> 5<starter dla dehydrogenazy glutaraldehydu-3-fosforanowego(GADPH) <400> 4 ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223> 3' Starter dla GADPH <400 5 aatgccaaag ttgtcatgga tgacc <2lO> 6 <211> 7228 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> zmodyfikowana sekwencja gag HIV-1 <220>
<221> CDS <222> (729)..(1820) <223>
<400 6 tggaagggct cacaaggcta tgacctttgg aataaggaga agggagaagt agctgcatcc ctggggactt aatttggtcc cttccctgat atggtgcttc gaagaacagc attagtgtgg ggagtactac tccagggagg caaaaaagac tggcagaact aagttagtac ttgttacacc aagtttgaca aaagactgct tgtggcctgg aagagatcct acacaccagg cagttgaacc ctatgagcca gcctcctagc gacatcgagc gcgggactgg tgatctgtgg gccagggatc agagcaagta gcatgggatg atttcgtcac tttctacaag ggagtggcga atctaccaca agatatccac gaagaggcca gaggacccgg atggcccgag ggactttccg gccctcagat
120
180
240
300
360
420
PL 216 200 B1 gctacatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tcfcctggota actagggaac ccactgctfca agcctcaata aagcttgoct 540 tgagtgctca aagtagtgtg tgcecgtctg fctgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagfcggcg cccgaacagg gactfcgaaag 660 cgaaagtaaa gccagaggag atctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcgfccg 720 acagagag afcg ggt gcg aga gcg tca gta tta agc ggg gga gaa tta gat 770
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp 15 10
ega Arg 15 tgg gaa aaa att cgg Ile Arg 20 tta agg cca ggg gga aag aag aag tac aag 818
Trp Glu Lys Leu Arg Pro Gly Gly 25 Lys Lys lys Tyr Łys 30
eta aag cac atc gta tgg gca agc agg gag eta gaa ega ttc gca gtt 866
Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val
35 40 45
aat cct gg<= ctg tta gaa aca tca gaa ggc tgt aga caa ata ctg gga 914
Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin Ile Leu Gly
50 55 60
cag eta caa cca tcc ctt cag aca gga tca gag gag ctt ega tca eta 962
Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu
65 70 75
tac aae aca gta gca acc ctc tat tgt gtg cac cag cgg atc gag atc 1010
Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg Ile Glu Ile
80 85 90
aag gac acc aag gaa get tta gac aag ata gag gaa gag caa aac 1058
Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gin Asn Lys
95 100 105 110
tcc aag aag aag gee cag cag gca gca get gac aca gga cac agc aat 1106
Ser Lys lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn
115 120 125
cag gte agc caa aat tao cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg 1154
Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile Val Gin Asn Ile Gin Gly Gin Met
130 135 140
gta cat cag gee ata tca cct aga act tta aat gca tgg gta aaa gta . 1202
Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val
145 150 155
gta gaa gag aag get ttc agc cca gaa gtg ata ccc a tg ttfc tca gca 1250
Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala
160 165 170
tta tca gaa gga gee acc cca cag gac ctg aac acg atg ttg <Sia.€! acc 1298
Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr
PL 216 200 B1
175 180 185 190
gtg ggg gga cat caa gca ęcc atg caa atg tta aaa gag acc atc aat 1346
Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn
195 200 205
gag gaa get gca gaa tgg gat aga gtg cat cca ęfcę cat gca ggg C 1394
Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Ero
210 215 220
a fet gca cca 99= cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga 1442
Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
225 230 ? 3 5
act act agt acc ctt cag {JSL& caa ata gga tgg atg aea aat aat cca 1490
Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Ero
240 245 250
cct atc cca gta gga gag atc tac aag agg tęcp ata atc ctg gga ttg 1538
Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
255 260 265 270
aac aag atc gtg agg atg tat age cct acc age att etę gac ata aga 1586
Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg
275 280 285
caa gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gac cgg ttc tat aaa 1634
Gin Gly Pro Lys Glu Pro Ehe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys
290 295 300
act eta aga get gag caa get tea cag gag gta aaa aat tgg atg aca 1682
Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr
305 310 315
gaa a cc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gat tgt aag acc atc ctg 1730
Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu
320 325 330
aag get ctc 99« cca g«g get a ca eta gaa gaa atg atg έΐ C»gL gca tgt 1778
Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys
335 340 345 350
cag gga gta gga gga ccc ggc cat aag gca aga gtt ttg tag 1820
Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 360 ggatccacta gttctagact cgaggggggg cccggtacct ttaagaccaa tgactfcacaa 1880 ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 1940 ctcccaaaga agacaagafca tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 2000 tgattggcag aactacaeac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg 2060 ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag gccaataaag gagagaacac 2120 cagctfcgfcta caccctgtga gcctgcatgg aatggatgac ectgagagag aagtgttaga 2180
PL 216 200 B1
gtggaggttt gacagccgcc tagcatfctca tcacgtggcc cgagagctgc atccggagta 2240
cttcaagaac tgctgacatc gagcttgcta caagggactt tccgctgggg actttccagg 2300
gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatgctgca tataagcagc 2360
tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg 2420
gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag 2480
tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagate cctcagaccc ttttagtcag 2540
tgtggaaaat ctetagcacc ccccaggagg tagaggttgc agtgagccaa gatcgcgcca 2600
ctgcattcca gcctgggcaa gaaaacaaga ctgtctaaaa taataataat aagttaaggg 2660
tattaaatat atttatacąt ggaggteata aaaatatata tatttgggct gggcgcagtg 2720
gctcacacct gcgcccggcc ctttgggagg ccgaggcagg tggatcacct gagtttggga 2780
gttccagacc agoctgacca acatggagaa accccttctc tgtgtatttt tagtagafctfc 2840
tattttatgt gtattttatt caeaggtatt tctggaaaac tgaaactgtt tttcctctac 2900
tctgatacca caagaatcat cagcacagag gaagacttct gtgatcaaat gtggtgggag 2960
agggaggttt tcaccagcac atgagcagtc agttctgccg cagactcggc gggtgtcctt 3020
cggttcagtt ccaacaccgc ctgcctggag agaggtcaga ccacagggtg agggctcagt 3080
ccccaagaca taaacaccca agacataaac acecaaeagg tccaccccgc ctgctgccca 3140
ggcagagccg attcaccaag acgggaatta ggatagagaa agagtaagtc acacagagcc 3200
ggctgtgcgg gagaacggag ttctattatg actcaaatca gtctccccaa gcattcgggg 3260
atcagagttt ttaaggataa cttagtgtgt agggggccag tgagttggag atgaaagcgt 3320
agggagtcga aggtgtectt ttgcgccgag tcagttcctg ggtgggggcc acaagatcgg 3380
atgagccagt ttatcaatcc gggggtgcca gctgatccat ggagtgcagg gtctgcaaaa 3440
tatctcaagc actgattgat cttaggtttt acaatagtga tgttacccca ggaaeaattt 3500
ggggaaggtc agaatcttgt agcctgtagc tgcatgactc otaaaccata atttcttttt 3560
tgtttttttt tttttatttt tgagacaggg tctcactctg tcacctaggc tggagtgcag 3620
tggtgcaatc acagctcact gcagccccta gagcggccgc caccgcggtg gagctccaat 36S0
tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 3740
gaaaaccetg gcgttacoca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 3800
cgtaatagcg aagaggeccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag ectgaatggc 3860
PL 216 200 B1
gaatggegcg aaattgtaaa cgttaatatfc ttgttaaaat tcgcgttaaa tfctttgttaa 3920
atcagotcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 3980
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 4040
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 4100
ccatcaccct tttggggtcg &ggfcgccgfc«i aagcactaaa tcggaaecct 4160
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 4220
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 4230
gfcaaceacca cacccgccgc gcfc/fc&afcgcg ccgctacagg gcgcgtccca ggtggcactt 4340
tfccggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 4400
afcecgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 4460
tgagtattca acatttccgt gtegccctta ttccettttt tgeggcattt tgecttcctg 4520
tttttgctca cccagaaacg etggtgaaag taaaagatge tgaagatcag ttgggtgcac 4580
gagtgggtta cafccgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4640
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4700
gfcattgacgc cgggcaagag caactcggtc gcogcataca etatteteag aatgacttgg 4760
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4820
gcagtgctgc 'cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4880
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg δι tli·* ej c 4940
atcgttggga accggagcfcg aatgaagcca t a cjca aa. cgai cgagcgtgac accacgatgc 5000
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 5060
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca c t £ c t g c g c t 5120
cggcccttcc ggctggctgg fcttafctgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 5180
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 5240
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gategetgag ataggtgcct 5300
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatataett tagattgatt 5360
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 5420
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgte agaccccgta gaaaagatca 5480
aaggatcttc ttgagatect ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa ae&aaaastac . 5540
caecgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 5600
PL 216 200 B1
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 5660
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgcfectgcfca atcctgttac 5720
cagtggctgc tgccagtggc gafcaagtcgt gtcttaeegg gttggactca agacgatagt 5780
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5840
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5900
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 5960
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgccfc ggtatcttfca tagtcefcgtc gggtttcgcc 6020
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgafc gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6080
acgccagcaa egcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacafcgt 6140
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 6200
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 6260
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 6320
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cg caattaa t g t g ag tt a g c 6380
fccactcafcta ggcaccccag gcfcttacacfc ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 6440
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 6500
gaattaaccc- teactaaagg gaacaaaagc tgctgcaggg tccctaaetg ccaagcccca 6560
cagtgtgccc tgaggctgcc ccttccttct agcggcfcgcc cccactcgge tttgctttcc 6620
ctagtttcag ttactfcgcgt tcagccaagg tctgaaacta ggtgcgcaca gagcggtaag 6680
actgcgagag aaagagacca gctttacagg gggtttatca cagtgcaccc tgacagtcgt 6740
cagcctcaca gggggtttafc cacattgcac cctgacagtc gtcagcctca cagggggfctt 6800
atcacagtgc accctfcacaa tcattccatt tgattcacaa tttttttagt ctctactgtg 6860
cctaacttgt aagfctaaatt tgatcagagg tgtgttccca gaggggaaaa cagtatatac 6920
agggttcagt actatcgcat ttcaggcctc c^it. gt c ttggaatgtg tcccccgagg 6960
ggtgatgact acctcagttg gatctccaca ggtcacagtg acacaagata accaagacac 7040
ctcccaaggc taccacaatg ggccgccctc cacgtgcaca tggccggagg aactgccatg 7100
tcggaggtgc aagcacacct gcgcatcaga gtccttggtg tggagggagg gaccagcgca 7160
gcttccagcc atccacctga tgaacagaac cfcagggaaag ccccagttet actfcacacca 7220
ggaaaggc 7228
PL 216 200 B1 <210> 7 <211> 363 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Zmodyfikowana sekwencja gag HIV-1 <400> 7
Met 1 Gly Ala Arg Ala 5 Ser Val Leu Ser Gly Gly 10 Glu Leu Asp Arg 15 Trp
Glu Lys Ile Arg 20 Leu Arg Pro Gly Gly 25 Lys Lys Lys Tyr Lys 30 Leu Lys
His Ile Val 35 Trp Ala Ser Arg Glu 40 Leu Glu Arg Phe Ala 45 Val Asn Pro
Gly Leu 50 Leu Glu Thr Ser Glu 55 Gly Cys Arg Gin Ile 60 Leu Gly Gin leu
Gin 65 Pro Ser Leu Gin Thr 70 Gly Ser Glu Glu Leu 75 Arg Ser Leu Tyr Asn 80
Thr Val Ala Thr Leu 85 Tyr Cys Val His Gin 90 Arg Ile Glu Ile Lys 95 Asp
Thr Lys Glu Ala 100 Leu Asp Lys Ile Glu 105 Glu Glu Gin Asn Lys 110 Ser Lys
Lys Lys Ala 115 Gin Gin Ala Ala Ala 120 Asp Thr Gly His Ser 125 Asn Gin Val
Ser Gin 130 Asn Tyr Pro Ile Val 135 Gin Asn Ile Gin Gly 140 Gin Met Val His
Gin 145 Ala Ile Ser Pro Arg 150 Thr Leu Asn Ala Trp 155 Val Lys Val Val Glu 160
Glu Lys Ala Phe Ser 165 Pro Glu Val Ile Pro 170 Met Phe Ser Ala Leu 175 Ser
Glu Gly Ala Thr 180 Pro Gin Asp Leu Asn 185 Thr Met Leu Asn Thr 190 Val Gly
PL 216 200 B1
Gly His Gin Ala 195 Ala Met Gin Met Leu 200 Lys Glu Thr Ile 205 Asn Glu Glu
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
245 250 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gin Gly
275 280 285
Pro lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 • 310 315 320
Leu leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 360 <210> 8 <21ł> 311 <212> PRT <213> Adenowirus typu szympansiego <400> 8
Asn. Thr Cys Gin Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala Thr Glu 15 10 15
PL 216 200 B1
Lys Thr Tyr Thr 20 Tyr Gly Asn Ala Pro 25 Val Gin Gly Ile Asn 30 Ile Thr
Lys Asp Gly 35 Ile Gin Leu Gly Thr 40 Asp Thr Asp Asp Gin 45 Pro Ile Tyr
Ala Asp 50 Thr Tyr Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly Asp 60 Ala Glu Trp
His 65 Asp Ile Thr Gly Thr Asp 70 Glu Lys Tyr Gly 75 Gly Arg Ala Leu Lys 80
Pro Asp Thr Lys Met 85 Lys Pro Cys Tyr Gly 90 Ser Phe Ala Lys Pro 95 Thr
Asn Ly3 Glu Gly 100 Gin Ala Asn Val 105 Lys Thr Gly Thr Gly 110 Thr Thr
Lys Glu Tyr 115 Asp Ile Asp Met Ala 120 Phe Phe Asp Asn Arg 125 Ser Ala Ala
Ala Ala 130 Gly Leu Ala Pro Glu 135 Ile Val Leu Tyr Thr Glu 140 Asn Val Asp
Leu 145 Glu Thr Pro Asp Thr His 150 Ile Val Tyr Lys 155 Ala Gly Thr Asp Asp 160
Ser Ser Sar Ser Ile 165 Asn Leu Gly Gin Gin 170 Ala Met Pro Asn Arg 175 Pro
Val Tyr Ile Gly 180 Phe Arg Asp Asn Phe 185 Ile Gly Leu Met Tyr 190 Tyr Asn
Ser Thr Gly 195 Asn Met Gly Val Leu 200 * Gly Gin Ala Ser 205 Gin Leu Asn
Ala Val 210 Val Asp Leu Gin Asp 215 Arg Asn Thr Glu Leu Ser 220 Tyr Gin Leu
Leu 225 Leu Asp Ser Leu Gly Asp 230 Arg Thr Arg Tyr 235 Phe Ser Met Trp Asn 240
Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His
PL 216 200 B1
245 250 255
Gly Val Glut Asp 260 Glu Leu Pro Asn Tyr 265 Cys Phe Pro Leu Asp 270 Ala Val
Gly Arg Thr 275 Asp Thr Tyr Gin Gly 230 Ile Lys Ala Asn Gly 285 Thr Asp Gin
Thr Thr 290 Trp Thr Lys Asp Asp 2S5 Ser Val Asn Asp Ala 300 Asn Glu Ile Gly
Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310 <210> 9 <211> 314 <212> PRT <213> Ludzki adenowirus typu 4 <40G> 9
Asn 1 Thr Cys Gin Trp 5 Lys Asp Ser Asp 10 Lys Met His Thr Phe 15 Gly
Ala Ala Ala Met 20 Pro Gly Val Thr Giy 25 Lys Lys Ile Glu Ala 30 Asp Gly
Leu Pro Ile 35 Arg Ile Asp Ser Thr 40 Ser Gly Thr Asp Thr 45 Val Ile Tyr
Ala Asp 50 Lys Thr Phe Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly 60 Asn Asp Ser Trp
Val 65 Asp Thr Asn Gly Ala 70 Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg 75 Ala Leu Lys 80
Asp Thr Thr Lys' Met 85 Asn Pro Cys Tyr Gly 90 Ser Phe Ala Lys Pro 95 Thr
Asn Lys Glu Gły ICO Gly Gin Ala Asn Leu 105 Lys Asp Ser Glu Pro 110 Ala Ala
Thr Thr Pro 115 Asn Tyr Asp Ile Asp 120 Leu Ala Phe Phe Asp 125 Ser Lys Thr
PL 216 200 B1
Ile Val 130 Ala Asn Tyr Asp Pro Asp 135 Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn 140 Val
Asp Leu Gin Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu
145 150 155 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gin Gin Ala Met Pro Asn Arg
165 170 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu
195 200 205
Asn Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin
210 21S 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225 230 235 240
Asn Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn
245 250 255
His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly
260 265 270
Val Gly Leu Thr Asp Thr Tyr Gin Gly Val Lys Val Lys Thr Asp Ala
275 280 285
Gly Ser Glu Lys Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val Ser Asn Ala Asn
290 295 300
Glu Ile His Val Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310
<210> 10
<211> 318
<212> PRT
<213> Ludzki adenowirus typu 16
<400> 10
Asn Thr Cys Gin Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
PL 216 200 B1
1 5 10 15
Val Ala Ala Met Pro Gly Val Thr 20 Gly lys 25 Lys Ile Glu Ala Asp Gly 30
Leu Pro Ile Gly Ile Asp Ser Thr 35 40 Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr 45
Ala Asp 50 Lys Thr Phe Gin Pro Glu 55 Pro Gin Val Gly Asn Ala Ser Trp 60
Val Asp 65 Ala Asn Gly Thr Glu Glu 70 Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys 75 80
Asp Thr Thr Lys Met Lys Pro Cys 85 Tyr Gly 90 Ser Phe Ala Lys Pro Thr 95
Asn Lys Glu Gly Gly Gin Ala Asn 100 Leu Lys 105 Asp Ser Glu Thr Ala Ala 110
Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp 115 120 Leu Ala Phe Phe Asp Asn Lys Asn 125
Ile Ala 130 Ala Asn Tyr Asp Pro Asp 135 Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val 140
Asp Leu 145 Gin Thr Pro Asp Thr His 150 Ile Val Tyr Lys Pro Gly Thr Glu 155 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu 165 Gly Gin 170 Gin Ala Met Pro Asn Arg 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp 180 Asn Phe 185 Ile Gly Leu Met Tyr Tyr 190
Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val 195 200 Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu 205
Asn Ala 210 Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn 215 Thr Glu Leu Ser Tyr Gin 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225 230 235
PL 216 200 B1
Asn Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn
245 250 255
His Gly Val Glu Asp Glu leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro leu Asn Gly
260 265 270
Val Gly Phe Thr Asp Thr Tyr Gin Gly Val lys Val Lys Thr Asp Ala
275 280 285
Val Ala siy Thr Ser Gly Thr Gin Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val
290 295 300
Ser Thr Ala Asn Glu Ile His Gly Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310 315
<210> 11 <2ll> 323 <212> PRT <213> Ludzki adenowirus typu 3 <400> 11
Asn 1 Thr Ser Gin Trp 5 Ile Val Thr Thr Asn 10 Gly Asp Asn Ala Val 15 Thr
Thr Thr Thr Asn 20 Thr Phe Gly Ile Ala 25 Ser Met Lys Gly Gly 30 Asn Ile
Thr Lys Glu 35 Sly Leu Gin Ile Gly Lys 40 Asp Ile Thr Thr 45 Thr Glu Gly
Glu Glu Lys 50 Pro Ile Tyr Ala 55 Asp Lys Thr Tyr Gin 60 Pro Glu Pro Gin
Val 65 Gly Glu Glu Ser Trp 70 Thr Asp Thr Asp Gly 75 Thr Asn Glu Lys Phe 80
Gly Gly Arg Ala Leu 85 Lys Pro Ala Thr Asn 90 Met Lys Pro Cys Tyx 95 siy
Ser Phe Ala Arg 100 Pro Thr Asn Ile Lys 105 Gly Gly Gin Ala Lys 110 Asn Arg
PL 216 200 B1
Lys Val Lys 115 Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp
120 125
Ile Asp 130 Met Glu Phe Phe Asp 135 Gly Arg Asp Ala Val 140 Ala Gly Ala Leu
Ala 145 Pro Glu Ile Val Leu 150 Tyr Thr Glu Asn Val 155 Asn Leu Glu Thr Pro 160
Asp Ser Bis Val Val 165 Tyr Lys Pro Glu Thr 170 Ser Asn Asn Ser His 175 Ala
Asn Leu Gly Gin 180 Gin Ala Met Pro Asn 185 Arg Pro Asn Tyr Ile 190 Gly Phe
Arg Asp Asn 195 Phe Val Gly Leu Met 200 Tyr Tyr Asn Ser Thr 205 Gly Asn Met
Gly Val 210 Leu Ala Gly Gin Ala 215 Ser Gin Leu Asn Ala 220 Val Val Asp Leu
Gin 225 Asp Arg Asn Thr Glu 230 Leu Ser Tyr Gin Leu 235 Leu Leu Asp Ser Leu 240
Gly Asp Arg Thr Arg 245 Tyr Phe Ser Met Trp 250 Asn Gin Ala Val Asp 255 Ser
Tyr Asp Pro Asp 260 Val Arg Ile Ile Glu 265 Asn His Gly Ile Glu 270 Asp Glu
Leu Pro Asn 275 Tyr Cys Phe Pro Leu 280 Asn Gly Ile Gly Pro 285 Gly His Thr
Tyr Gin 290 Gly Ile Lys Lys Val 295 Lys Thr Asp Asp Thr 300 Asn Gly Trp Glu
Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn
305 310 315 320
Leu Ala Met <210> 12
PL 216 200 B1 <211> 315 <212> PRT <213> Ludzki adenowirus typu 7 <400> 12
Asn Thr Ser Głn Trp Ile Val Thr Ala Gly Glu Glu Arg Ala Val Thr
1 5 10 15
Thr Thr Thr Asn Thr 20 Phe Gly Ile Ala Ser 25 Met Lys Gly Asp Asn Ile 30
Thr Lys Glu Gly Leu 35 Glu Ile Gly Lys Asp 40 Ile Thr Ala Asp Asn Lys 45
Pro Ile Tyr Ala Asp 50 Lys Thr Tyr Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly Glu 60
Glu 65 Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn 70 Glu Lys Phe Gly Gly Arg 75 80
Ala Leu Łys Pro Ala 85 Thr Lys Met Lys Pro 90 Cys Tyr Gly Ser Phe Ala 95
Arg Pro Thr Asn Ile 100 Lys Gly Gly Gin Ala 105 Lys Asn Arg Lys Val Lys 110
Pro Thr Glu Gly Asp 115 Val Glu Thr Glu Glu 120 Pro Asp Ile Asp Met Glu 125
Phe Phe Asp Gly Arg 130 Glu Ala Ala Asp Ala 135 Phe Ser Pro Glu Ile Val 140
Łeu 145 Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr 150 Pro Asp Ser His Val Val 155 160
Tyr Lys Pro Gly Thr 165 Ser Asp Asp Asn Ser 170 His Ala Asn Leu Gly Gin 175
Gin Ala Met Pro Asn 180 Arg Pro Asn Tyr Ile 185 Gly Phe Arg Asp Asn Phe 190
Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala
195 200 205
PL 216 200 B1
Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn 220
210 215
Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr
22S 230 235 240
Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp
245 250 255
Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr
260 265 270
Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ile Gly Pro Ala Lys Thr Tyr Gin Gly Ile
275 280 285
Lys Ser Lys Asp Asn Gly Trp Glu Lys Asp Asp Asn Val Ser Lys Ser
290 295 300
Asn Glu Ile Ala Ile Gly Asn Asn Gin Ala Met
305 310 315
<210> : 13
<211> : 345
<212> J PRT
<213> Ludzki adenowirus typu 2
<400 : 13
Asn Ser Cys Glu Trp Glu Gin Thr Glu Asp Ser Gly Arg Ala Val Ala
1 5 10 15
Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Gin Asn Ala Arg Asp Gin Ala Thr Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gin
35 40 45
Ala Pro Leu Ser Gly Glu Thr Leu Thr Lys Ser Gly Leu Gin Ile Gly
50 55 60
Ser Lys Asn Ala Glu Thr Gin Ala Lys Pro Val Tyr Ala Asp Pro Ser
65 70 75 80
Tyr Gin Pro Glu Pro Gin Ile Gly Glu Ser Gin Trp Asn Glu Ala Asp
PL 216 200 B1
90 95
Ala Asn Ala Ala 100 Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys
105 110
Pro Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Pro Phe Gly Gly Gin Ser
115 120 125
Val Len Val Pro Asp Glu Lys Gly Val Pro Leu Pro Lys Val Asp Leu
130 135 140
Gin Phe Phe Ser Asn Thr Thr Ser Leu Asn Asp Arg Gin Gly Asn Ala
145 150 155 160
Thr lys Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Thr
165 170 175
Pro Asp Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Gly Asp Glu Asn ser
190 IBS 190
Lys Ala Met Leu Gly Gin Gin Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile
195 200 205
Ala Ehe Arg. Asp jAs η P he Ile Gly Leu Ket Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly
210 215 220
Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn Ala Val Val
225 230 235 240
Asp Leu Gin Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val
260 265 270
Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu
275 230 235
Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly ile Gly Val Thr
290 295 300
Asp Thr Tyr Gin Ala Ile Lys Ala Asn Gly Asn Gly Ser Gly Asp Asn
305 310 315 320
Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr Arg Asn Glu
325 330 335
Ile Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met
340 345
PL 216 200 B1

Claims (27)

1. Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji zawierający, w kapsydzie małpiego adenowirusa, elementy cis małpiego adenowirusa oraz heterologiczny gen funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontrolującymi ekspresję, przy czym kapsyd małpiego adenowirusa jest otrzymany z adenowirusa szympansa wybranego z grupy składającej się z Pan 5, Pan 6, oraz Pan 7.
2. Adenowirusowy małpi wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że jego uszkodzona zdolność do replikacji wynika z braku zdolności do wyrażania adenowirusowych E1a i E1b.
3. Adenowirusowy małpi wektor według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że opóźniony wczesny gen E3 jest usunięty.
4. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że wykazuje funkcjonalną delecję genu E4.
5. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że wykazuje delecję w opóźnionym wczesnym genie E2a.
6. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że wykazuje delecję w dowolnym z późnych genów L1 do L5 genomu małpiego adenowirusa.
7. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje produkt immunogenny z wirusa wybranego z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odporności, małpiego wirusa niedoboru odporności, syncytjalnego wirusa oddechowego, wirusa parainfIuenzy typu 1-3, wirusa grypy, wirusa opryszczki Herpes simplex, ludzkiego wirusa cytomegalii, wirusów zapalenia wątroby, ludzkiego wirusa brodawczaka, wirusa polio, rotawirusa, caliciwirusów, wirusa odry, wirusa świnki, wirusa różyczki, adenowirusa, wirusa wścieklizny, psiego wirusa nosówki, wirusa księgosuszu, koronawirusa, parwowirusa, zakaźnych wirusów zapalenia nosotchawicy, kociego wirusa białaczki, zakaźnego kociego wirusa zapalenia otrzewnej, ptasiego zakaźnego wirusa chorób torebki maziowej, wirusa choroby Newcastle, wirusa choroby Mareka, świńskiego wirusa zespołu oddechowego i rozrodczego, końskiego wirusa zapalenia tętnicy i wirusów zapalenia mózgu.
8. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje produkt immunogenny z bakterii wybranej z grupy składającej się z Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, kompleks Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae oraz Mycoplasma gallisepticum.
9. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje produkt immunogenny z grzyba wybranego z grupy składającej się z Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus oraz Histoplasma.
10. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że gen heterologiczny koduje produkt immunogenny z pasożyta wybranego z grupy składającej się z Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii oraz Pneumocystis carinii.
11. Adenowirusowy małpi wektor według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że gen heterologiczny jest przeznaczony do wywołania działania przeciwrakowego z wykorzystaniem antygenu rakowego lub antygenu związanego z guzem wybranego z grupy składającej się z antygenu specyficznego wobec prostaty, antygenu rakowo-embrionalnego, MUC-1, Her2, CA-125 oraz MAGE-3.
12. Sposób wytwarzania wektora określonego w jednym z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że obejmuje złożenie genu heterologicznego i elementu cis sekwencji ITR małpiego adenowirusa.
13. Zastosowanie rekombinowanego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 do 11 do wytwarzania leku do indukowania u osobnika odpowiedzi limfocytów T na immunogen, przy czym zrekombinowany małpi adenowirus korzystnie indukuje odpowiedzi l imfocytów T CD8+ na immunogen gdy jest dostarczony podskórnie, oraz ponadto, rekombinowany adenowirus zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunogen pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które kierują ekspresją immunogenu u osobnika.
PL 216 200 B1
14. Zastosowanie rekombinowanego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 do 11 do wytwarzania leku do indukowania u osobnika odpowiedzi przeciwciał na immunogen, przy czym rekombinowany małpi adenowirus korzystnie indukuje odpowiedź przeciwciał na immunogen przy niskich dawkach, gdy jest dostarczony do śluzówki, ponadto rekombinowany adenowirus zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunogen pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które kierują ekspresją immunogenu u osobnika.
15. Zastosowanie według zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, że rekombinowany małpi adenowirus jest spreparowany do podawania podskórnie.
16. Zastosowanie według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienne tym, że rekombinowany małpi adenowirus jest spreparowany do podawania w małej dawce.
17. Zastosowanie według jednego z zastrz. 13 do 16, znamienne tym, że rekombinowany małpi adenowirus jest spreparowany do podawania w skutecznej dawce, będącej w zakresie od 104 pfu do 106 pfu.
18. Zastosowanie według jednego z zastrz. 13 do 16, znamienne tym, że immunogen jest wybrany z grupy składającej się z peptydu, polipeptydu lub białka otrzymanych z patogennego wirusa wybranego z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1, ludzkiego wirusa brodawczaka i wirusa wścieklizny.
19. Immunogenna kompozycja użyteczna do indukowania cytolitycznej odpowiedzi odpornościowej na ludzki wirus niedoboru odporności, znamienna tym, że obejmuje (a) rekombinowany małpi adenowirus określony w jednym z zastrz. 1 do 7 zawierający optymalizowaną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmodyfikowane białko gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 oraz (b) fizjologicznie dopasowany nośnik.
20. Zastosowanie immunogennej kompozycji określonej w zastrz. 19 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności u ssaków.
21. Zastosowanie rekombinowanego małpiego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 do 7 kodującego immunogenne białko otrzymane z ludzkiego wirusa brodawczaka do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka u ssaków.
22. Zastosowanie rekombinowanego małpiego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 do 7 kodującego immunogenne białko otrzymane z wirusa wścieklizny do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi neutralizujących przeciwciał przeciwko wściekliźnie u ssaków.
23. Szczepionka przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności, znamienna tym, że zawiera rekombinowany małpi adenowirus określony w jednym z zastrz. 1 do 7, przy czym gen heterologiczny koduje antygen ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 (HIV-1).
24. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że antygen jest wybrany z grupy składającej się z otoczki, regionu pol i gag HIV-1.
25. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że usunięto elementy genetycznej niestabilności.
26. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że heterologicznym genem jest cDNA kodujący gag HIV-1 obejmujący sekwencję z SEK NR ID: 6.
27. Szczepionka przeciwko wściekliźnie, znamienna tym, że zawiera rekombinowany małpi adenowirus określony w jednym z zastrz. 1 do 7, przy czym heterologiczny gen koduje antygen wście-
PL372294A 2001-06-22 2002-05-13 Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka PL216200B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30013101P 2001-06-22 2001-06-22
US30484301P 2001-07-12 2001-07-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372294A1 PL372294A1 (pl) 2005-07-11
PL216200B1 true PL216200B1 (pl) 2014-03-31

Family

ID=26971607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372294A PL216200B1 (pl) 2001-06-22 2002-05-13 Adenowirusowy małpi wektor o uszkodzonej zdolności do replikacji, sposób jego wytwarzania, zastosowanie, immunogenna kompozycja oraz szczepionka

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20040241181A1 (pl)
EP (1) EP1409012B1 (pl)
JP (1) JP2005523233A (pl)
KR (1) KR20040043129A (pl)
CN (1) CN1518457A (pl)
AT (1) ATE422365T1 (pl)
AU (1) AU2002308713B2 (pl)
BR (1) BR0210586A (pl)
CA (1) CA2451864C (pl)
CY (1) CY1109059T1 (pl)
CZ (1) CZ304169B6 (pl)
DE (1) DE60231123D1 (pl)
DK (1) DK1409012T3 (pl)
ES (1) ES2322043T3 (pl)
HU (1) HU228327B1 (pl)
IL (2) IL159454A0 (pl)
MX (1) MXPA04000024A (pl)
NO (1) NO333252B1 (pl)
NZ (1) NZ530245A (pl)
PL (1) PL216200B1 (pl)
PT (1) PT1409012E (pl)
SG (1) SG153649A1 (pl)
SI (1) SI1409012T1 (pl)
WO (1) WO2003000283A1 (pl)
ZA (1) ZA200309360B (pl)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
WO2003046124A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
US7491508B2 (en) * 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
ATE449105T1 (de) 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
KR101253363B1 (ko) 2004-10-13 2013-04-15 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도
AU2006245920A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Glaxo Group Limited Vaccine composition
AU2007276219B2 (en) 2006-07-18 2013-10-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
JP2010520874A (ja) * 2007-03-09 2010-06-17 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション パピローマウイルスワクチン組成物
SG186022A1 (en) * 2007-11-28 2012-12-28 Univ Pennsylvania Simian subfamily b adenovirus sadv-28,27,-29,-32,-33, and -35 and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
ES2645156T3 (es) * 2011-03-21 2017-12-04 Altimmune Inc. Agente terapéutico inmunológico de acción rápida y prolongada
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN103468743B (zh) * 2013-08-19 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种狂犬病疫苗及其制备方法
ES2715890T3 (es) * 2013-11-01 2019-06-06 Pfizer Vectores de expresión de antígenos asociados a la próstata
EP3145537B1 (en) 2014-05-19 2018-12-12 Valo Therapeutics Oy Coated oncolytic adenoviruses for cancer vaccines
BR112016028816A8 (pt) 2014-06-13 2021-07-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa combinação imunogênica, método para obter uma resposta imunológica específica, uso de uma combinação imunogênica, e, regime de vacinação para prevenção, redução ou tratamento de infecção por vírus sincicial respiratório
BR112017026523A2 (pt) 2015-06-12 2018-08-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa vetor recombinante, adenovírus recombinante, composição, uso de um vetor recombinante, de um adenovírus recombinante ou de uma composição, método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, e, polinucleotídeo isolado.
MX2019002178A (es) 2016-08-23 2019-09-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Peptidos de fusion con antigenos enlazados a fragmentos cortos de cadena invariante (cd74).
US11466292B2 (en) 2016-09-29 2022-10-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions and methods of treatment
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
WO2018104919A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chimpanzee adenovirus constructs with lyssavirus antigens
GB201701239D0 (en) 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
US11649467B2 (en) 2017-07-21 2023-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chikungunya virus antigen constructs
WO2019086466A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
WO2019086450A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
CN111295449B (zh) 2017-10-31 2023-12-05 扬森疫苗与预防公司 腺病毒载体及其用途
KR20200074987A (ko) 2017-10-31 2020-06-25 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
KR20200101394A (ko) 2017-12-20 2020-08-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 엡스타인-바 바이러스 항원 구축물
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
US20220339281A1 (en) 2019-03-05 2022-10-27 GalxoSmithKline Biologicals SA Hepatitis b immunisation regimen and compositions
TW202217002A (zh) 2020-07-13 2022-05-01 法商傳斯堅公司 免疫抑制之治療
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccne for papillomavirus
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
US6019978A (en) * 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US6210663B1 (en) * 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Also Published As

Publication number Publication date
EP1409012B1 (en) 2009-02-11
JP2005523233A (ja) 2005-08-04
NO20035740L (no) 2004-02-16
PT1409012E (pt) 2009-05-11
ZA200309360B (en) 2005-07-27
CN1518457A (zh) 2004-08-04
NZ530245A (en) 2007-04-27
CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
DK1409012T3 (da) 2009-05-18
NO333252B1 (no) 2013-04-22
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
IL159454A (en) 2009-09-01
AU2002308713B2 (en) 2008-05-15
US20040241181A1 (en) 2004-12-02
HK1061511A1 (en) 2004-09-24
CA2451864C (en) 2013-01-15
PL372294A1 (pl) 2005-07-11
DE60231123D1 (de) 2009-03-26
HU228327B1 (en) 2013-03-28
HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
CA2451864A1 (en) 2003-01-03
EP1409012A1 (en) 2004-04-21
WO2003000283A1 (en) 2003-01-03
ES2322043T3 (es) 2009-06-16
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
SG153649A1 (en) 2009-07-29
AU2002308713A2 (en) 2003-01-08
NO20035740D0 (no) 2003-12-19
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
CY1109059T1 (el) 2014-07-02
CZ304169B6 (cs) 2013-12-04
IL159454A0 (en) 2004-06-01
BR0210586A (pt) 2005-07-12
ATE422365T1 (de) 2009-02-15
SI1409012T1 (sl) 2009-08-31
EP1409012A4 (en) 2005-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2451864C (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
JP7113924B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン
EP3385387B1 (en) Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
EP3475433B9 (en) Adenoviral vector
DK2714916T3 (en) ABEADENOVIRUS AND HYBRID ADENOVIRUS VECTORS
DK2402451T3 (en) Method for Stabilizing a DNA Insert in a Recombinant Vaccine Vector
AU2002308713A1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
US20120093853A1 (en) Simian Adenovirus Vectors and Methods of Use
PL209133B1 (pl) Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie
US6511845B1 (en) Methods for producing an immune response against HIV-1
CA2519207A1 (en) Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
US20040253210A1 (en) Adenovirus type7 vectors
CN116802280B (zh) 不包括有复制能力的腺病毒的新型腺病毒载体及其用途
HK40068020A (en) Adenoviral vector
HK1061511B (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
BR112017003908B1 (pt) Vacina contra filovírus de vírus de vaccinia modificado recombinante ankara (mva)
HK1009934B (en) Recombinant adenovirus vaccines
HK1009934A1 (en) Recombinant adenovirus vaccines