ES2621858T3 - Miembro de la familia de ligandos de TNF - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que es específico para una proteína trimérica seleccionada del grupo que consiste en: a) una proteína trimérica que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y b) una proteína trimérica que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 98% a la SEQ ID NO: 1 y capaz de unirse a las células B; para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, artritis reumatoide, inflamación o cáncer; en donde dicho anticuerpo es un antagonista de la unión de dicha proteína trimérica a su receptor en la línea celular RPMI 8866 del linfoma B

Description

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DESCRIPCION

Miembro de la familia de ligandos de TNF La presente descripcion proporciona lo siguiente:

1. Un anticuerpo que es espedfico para una protema trimerica seleccionada del grupo que consiste en:

a) una protema trimerica que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 y

b) una protema trimerica que tiene una secuencia de aminoacidos por lo menos identica en un 98% a SEQ ID NO 1 y capaz de unirse a la celulas B;

para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, artritis reumatoide, inflamacion o cancer;

donde dicho anticuerpo es un antagonista de la union de dicha protema trimerica a su receptor en la lmea celular RPMI 8866 del linfoma B

2. El anticuerpo segun el punto 1, donde dicha protema se expresa en una celula de mairnfero.

3. El anticuerpo segun el punto 2, donde la celula de marnffero es una celula HEK293T o HeLa.

4. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos anteriores el cual es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos anteriores el cual es un anticuerpo quimerico o humanizado.

6. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos anteriores donde dicho anticuerpo es un antagonista de la union de una protema trimerica que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 a las lmeas de celulas B RPMI8866, RPMI8226 y Raji.

La presente descripcion se refiere a una nueva protema de la superfamilia de ligandos de TNF, los nucleotidos que la codifican, los vectores y las celulas hospedadoras que la contienen y los metodos de seleccion de moduladores de la interaccion entre dicha protema y su receptor, estos moduladores se utilizan en la terapia de diversos trastornos que incluyen, pero no se limitan a, cancer, inflamacion, infeccion y enfermedades autoinmunes. Tambien, se describe el uso directo de dicho ligando en terapias contra, por ejemplo, enfermedades virales o como adyuvante potencial en vacunas.

Actualmente se han clonado y publicado otros quince miembros de la familia de ligandos de TNF y se ha demostrado que la mayona se une a los receptores de la superficie celular de la familia de los receptores de TNF. La interaccion entre un ligando de TNF y su receptor es la senal clave para iniciar una cadena de acontecimientos que conducen a una serie de respuestas tan diversas como la proliferacion de celulas T, la apoptosis y la induccion de la produccion de citoquinas. Algunas actividades, tales como la induccion de la proliferacion de celulas T, son comunes a muchos miembros de la familia, mientras que otras son compartidas solo por unos pocos y otras son exclusivas. La interaccion entre estos ligandos y sus receptores proporciona una diana atractiva para el desarrollo de nuevas terapias.

La presente descripcion describe una protema aislada que comprende i) un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 1 o ii) una variante del polipeptido de i). La descripcion tambien describe una protema aislada que comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos que se proporciona en la figura 2 o variantes de la misma. La protema que tiene la secuencia de aminoacidos proporcionada en la figura 2 se puede obtener de humanos y es una protema de membrana de tipo II con un unico dominio transmembrana cerca del extremo N-terminal, que contiene dos sitios potenciales de N-glicosilacion, y un sitio de escision de proteasas entre los aminoacidos arginina 133 y alanina 134. El polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos proporcionada en la figura 1 es soluble y forma parte de la region extracelular del polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos proporcionada en la figura 2. La protema puede comprender un polipeptido que tiene una homologfa del 65%, 75%, 80% o 90% con la secuencia de aminoacidos de la figura 1La protema puede comprender un polipeptido que tiene una homologfa de, al menos 95%, por ejemplo 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoacidos de la figura 1. La protema se puede obtener de mamfferos, por ejemplo de ratones o de humanos.

La presente descripcion describe ademas una protema que comprende un polipeptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 2 desde el aminoacido 134 en adelante, o la secuencia que se proporciona en la figura 6 desde el aminoacido 127 en adelante.

La presente descripcion describe ademas una protema que comprende un polipeptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 2 desde el aminoacido 122 en adelante.

La presente descripcion describe ademas una protema que comprende un polipeptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 6 desde el aminoacido 195 en adelante.

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La presente descripcion describe ademas una protema aislada que comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos que se proporciona en la figura 5, o variantes de la misma. Por otra parte, la descripcion describe una protema aislada que comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos que se proporciona en la figura 6 o variantes de la misma. La protema que tiene la secuencia de aminoacidos que se proporciona en la figura 6 se puede aislar de ratones y es una protema de membrana de tipo II con un unico dominio transmembrana cerca del extremo N-terminal, esta protema contiene un sitio potencial de N-glicosilacion, y un sitio de escision de proteasas entre los aminoacidos arginina 126 y alanina 127. El polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos proporcionado en la figura 5 es soluble, y forma parte de la region extracelular del polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos proporcionada en la figura 6.

Las protemas descritas en esta memoria que se pueden aislar de humanos, y las protemas descritas en esta memoria que se pueden aislar de ratones son altamente homologas, mostrando una identidad de aminoacidos del 67% de la secuencia completa. En la region C-terminal implicada en la union al receptor, la identidad de aminoacidos es mucho mayor (87%). Una diferencia significativa entre las protemas descritas en esta memoria que se pueden aislar de humanos o de ratones, es la presencia de un exon adicional en la secuencia de raton que codifica 31 aminoacidos extra, lo que reduce la homologfa total entre las dos protemas.

El termino variante se refiere a protemas que tienen sustancialmente la misma funcionalidad biologica que la protema para la que se ha proporcionado informacion en la secuencia. El termino variante abarca fragmentos, derivados y analogos de la protema de la descripcion.

Los fragmentos incluyen porciones de la protema que conservan una identidad suficiente con la protema original para ser eficaces, por ejemplo, en un cribado.

Los derivados incluyen formas alternativas de la secuencia de la protema que pueden tener deleciones, adiciones o sustituciones de uno o mas aminoacidos. Un experto en la tecnica entendera que se pueden llevar a cabo determinadas sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos, o bien pueden ocurrir de forma natural, sin alterar sustancialmente la funcion de la protema.

Los analogos incluyen, pero no estan limitados a protemas precursoras que pueden activarse por escision de la protema precursora para producir una protema madura activa o una fusion con una secuencia lfder o secretora que ayude a la purificacion.

La protema de la presente descripcion puede ser una protema recombinante, una protema natural o una protema sintetica.

Las protemas de la descripcion pueden estar presentes en esta memoria en forma trimerica. Normalmente, las protemas de la descripcion se uniran a su receptor como un tnmero, permitiendo asf que dos o mas moleculas del receptor se aproximen. Un tnmero puede ser un heterotnmero en el que este presente mas de un tipo de subunidades, o un homotnmero en el que todas las subunidades son iguales.

La presente descripcion tambien describe anticuerpos espedficos para una protema tal y como se define en las reivindicaciones. El termino anticuerpo segun se utiliza en este documento incluye todas las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que contienen sitios de reconocimiento para determinantes antigenicos de las protemas de la presente descripcion. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, pueden ser moleculas de anticuerpos intactas o fragmentos que contienen la region de union activa del anticuerpo, por ejemplo Fab o F(ab)2. Tambien se describen anticuerpos quimericos, de cadena sencilla y anticuerpos humanizados y fusiones con moleculas que no son inmunoglobulinas. Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de tales anticuerpos y fragmentos.

Las protemas de la descripcion, sus variantes o celulas que las expresan se pueden utilizar como un inmunogeno para producir anticuerpos contra ellas. Los anticuerpos generados contra las protemas de la descripcion pueden obtenerse mediante inyeccion directa del polipeptido en un animal, por ejemplo, no humano. El anticuerpo obtenido de este modo se unira entonces a la protema misma. De esta manera, puede utilizarse incluso un fragmento de la protema de la descripcion para generar anticuerpos que se unan a la protema nativa completa.

Los anticuerpos se pueden utilizar para localizar la protema de la descripcion en el tejido que expresa esa protema. Tambien son utiles, por ejemplo, para la purificacion de una protema de la descripcion, y en consecuencia se describe un metodo de purificacion de una protema de la descripcion, metodo que comprende el uso de un anticuerpo descrito en esta memoria. Los anticuerpos de la presente descripcion tambien se pueden usar como agentes terapeuticos como se define en las reivindicaciones.

Un aspecto adicional de la descripcion describe un polinucleotido aislado que codifica una protema de la descripcion. Tambien se incluyen dentro de la descripcion nucleotidos anti-sentido o cadenas complementarias. El nucleotido puede codificar una protema de la descripcion que puede aislarse a partir de raton o de humano. El polinucleotido aislado puede comprender la parte de un polinucleotido que tiene la secuencia nucleotfdica mostrada en la figura 3, que codifica el polipeptido mostrado en la figura 1, una variante de dicha porcion, o una cadena complementaria. La presente descripcion describe ademas un polinucleotido aislado que comprende la secuencia de nucleotidos

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mostrada en la figura 4, que codifica para el polipeptido de la figura 2.

La secuencia de nucleotidos se puede aislar de una celula (por ejemplo una celula humana), mediante cribado con una sonda derivada de la protema de la descripcion, o mediante otras metodologfas conocidas en la tecnica tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo sobre el ADN genomico con cebadores oligonucleotfdicos apropiados derivados o disenados basandose en la protema de la descripcion. Se puede generar una biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos utilizando ADN de raton o humano con fines de cribado.

Las secuencias de nucleotidos de la presente descripcion pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, por ejemplo ADNc, ADN genomico y ADN sintetico. La secuencia de nucleotidos puede ser ADNc. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o cadena no codificante (antisentido). La secuencia de codificacion que codifica la protema de la descripcion puede ser identica a una de las secuencias de codificacion establecidas en las figuras, o puede ser una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneracion del codigo genetico, codifica la misma protema que las secuencias mostradas en estas.

Una secuencia de nucleotidos que codifica una protema de la presente descripcion puede incluir: una secuencia que codifica la protema o cualquier variante de la misma; una secuencia que codifica la protema o cualquier variante de la misma y una secuencia de codificacion adicional, tal como una secuencia lfder o secretora o una secuencia de proprotema; una secuencia que codifica la protema o cualquier variante de la misma (y opcionalmente la secuencia de codificacion adicional) y secuencias no codificantes, tales como intrones o secuencias no codificantes 5' y/o 3' de la secuencia de codificacion de la protema de longitud completa.

La descripcion tambien describe variantes de nucleotidos, analogos, derivados y fragmentos que codifican una protema de la descripcion. Se incluyen nucleotidos que pueden tener una identidad de al menos 65% a lo largo de su longitud completa con el nucleotido que tiene la secuencia de la figura 3. Las secuencias pueden tener una identidad de al menos 75% a lo largo de su longitud completa con el nucleotido que tiene la secuencia de la figura 3. Los polinucleotidos pueden mostrar una identidad de al menos 90%, por ejemplo 95%, 97%, 98% o 99% a lo largo de su longitud completa con el nucleotido que tiene la secuencia de la figura 3.

Las secuencias de nucleotidos de la descripcion tambien pueden tener la secuencia codificante fusionada en marco con una o mas secuencias marcadoras que permiten la purificacion de la protema de la presente descripcion, tal como un epftopo FLAG, una secuencia myc o una senal secretora.

Las secuencias de nucleotidos de la presente descripcion pueden emplearse para producir una protema de la descripcion mediante tecnicas recombinantes. Asf, por ejemplo la secuencia de nucleotidos puede incluirse en uno cualquiera de los diversos vehmulos de expresion o vehmulos de clonacion, en particular vectores o plasmidos para la expresion de una protema. Estos vectores incluyen secuencias de ADN cromosomico, no cromosomico y sintetico. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen los derivados de plasmidos bacterianos; ADN de fago; plasmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fago y ADN viral. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plasmido o vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

Tambien se describe un vector que comprende una o mas secuencias de nucleotidos descritas anteriormente. Los vectores son, por ejemplo, un vector de expresion, tal como un plasmido o un vector viral en el que se ha insertado un polinucleotido aislado de la descripcion, en una orientacion directa o inversa. El vector puede ademas comprender una o mas secuencias reguladoras para dirigir la smtesis de ARNm, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Los promotores adecuados incluyen: los promotores CMV, LTR o SV40 y otros promotores conocidos que controlan la expresion de los genes en celulas procariotas o eucariotas o sus virus. El vector puede contener un potenciador y un sitio de union al ribosoma para la iniciacion de la traduccion y un terminador de la transcripcion.

Los expertos en la tecnica conocen un gran numero de vectores y promotores/potenciadores adecuados, pero cualquier plasmido o vector, promotor/potenciador pueden ser utilizados, siempre que sean replicables y funcionales en el hospedador.

Los vectores de clonacion y los vectores de expresion apropiados para su uso con hospedadores procariotas y eucariotas incluyen vectores de expresion de mairnfero, vectores de expresion de insectos, vectores de expresion de levaduras, vectores de expresion bacterianos y vectores de expresion de virus y se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor, NY., (1989) Un vector puede ser pFLAG-CMV-1 o pcDNA3.

El vector tambien puede incluir secuencias apropiadas para la seleccion y/o amplificacion de la expresion. Para esto, el vector comprendera uno o mas marcadores fenotfpicos que se puedan seleccionar/amplificar. Estos marcadores son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Tambien estan descritas celulas hospedadoras que comprenden un vector de la descripcion, y que son capaces de expresar una secuencia de nucleotidos de la descripcion. Las celulas hospedadoras pueden ser, por ejemplo, una celula eucariota superior, tal como una celula de marnffero o una celula eucariota inferior, tal como una celula de

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levadura o una celula procariota, tal como una celula bacteriana. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformacion incluyen E. coli. Los hospedadores eucariotas adecuados incluyen celulas HEK293T y celulas HeLa.

Tambien se pueden emplear sistemas de traduccion sin celulas para producir tales protemas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente descripcion.

Se pueden emplear metodos rutinarios para purificar la protema de la descripcion a partir de cultivos de celulas recombinantes. Estos metodos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Las protemas y las secuencias de nucleotidos de la presente descripcion se describen en una forma aislada. El termino "aislado" pretende dar a entender que el material no se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, la secuencia de nucleotidos o la protema de origen natural presente en un animal vivo estan en su estado nativo y no estan aisladas, pero la misma secuencia de nucleotidos o la protema, separadas de alguno o de todos los materiales con los que coexisten en el sistema natural, estan aisladas. Del mismo modo, una protema que ha sido producida por metodos sinteticos, por ejemplo, por metodos recombinantes, esta "aislada". Dicha secuencia de nucleotidos podna ser parte de un vector. Dicha secuencia de nucleotidos o protema podna ser parte de una composicion, y seguir estando aislada en dicho vector o composicion que no son parte de su entorno natural. Las protemas y secuencias de nucleotidos tambien pueden estar en forma purificada, y pueden estar purificadas por lo menos a menos del 50% de pureza, aproximadamente 75% de pureza, 90% de pureza o mas, tal como 95%, 98% de pureza.

Tambien se describe el uso de las protemas de acuerdo con la descripcion en metodos de cribado. Estos metodos identifican compuestos que actuan como moduladores de la interaccion entre las protemas de la descripcion y sus receptores. En terminos generales, este tipo de procedimientos de cribado comprende poner en contacto una protema de la descripcion, por ejemplo en forma trimerica, y su receptor en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, y medir el aumento o disminucion del nivel de union, o el aumento o disminucion de una respuesta, por ejemplo de la activacion de NF-kB o de la activacion de CD40, cuando el compuesto de ensayo esta presente. Las protemas de la descripcion se pueden usar en cribados de alto rendimiento, lo que permite estudiar un gran numero de compuestos. Los metodos de cribado de la descripcion son generalmente conocidos para el experto en la tecnica. Tambien se describen aquellos compuestos identificados por medio de los metodos de cribado de la descripcion por tener una actividad util.

Tambien se describen compuestos que son moduladores de la interaccion entre una protema de la descripcion y su receptor para su uso en terapia, por ejemplo en inmunoterapia. Los compuestos se pueden utilizar en el tratamiento, por ejemplo, de enfermedades autoinmunes, inflamacion y otras enfermedades asociadas con la activacion del factor de transcripcion NF-kB, por ejemplo, artritis reumatoide, inflamacion neuronal, asma, en el tratamiento de canceres, en el tratamiento de infecciones, tales como choque septico y en el tratamiento de la aterosclerosis. Los compuestos pueden ser agonistas o antagonistas del receptor al cual se unen las protemas de la descripcion. Los compuestos incluyen, por ejemplo, aptameros, polipeptidos y moleculas pequenas.

Tambien se describe el uso de compuestos que han sido identificados por medio de las tecnicas de cribado de la descripcion, para la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento o profilaxis de trastornos que es sensible a la modulacion de la interaccion entre la protema de la descripcion y su receptor.

Tambien se describe un metodo de tratamiento de un trastorno que es sensible a la modulacion de la interaccion entre la protema de la descripcion y su receptor, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un compuesto que se identifica por medio de las tecnicas de cribado de la descripcion, o una cantidad eficaz de la protema de la descripcion.

La protema puede ser para uso en terapia, por ejemplo, para su uso en inmunoterapia, especialmente durante infecciones virales, como vacuna, o como un adyuvante de vacunas.

Tambien se describe el uso de la protema de la descripcion en la preparacion de un medicamento para uso en inmunoterapia, por ejemplo, durante infecciones virales o como adyuvante de vacuna.

Tambien se describe un metodo de tratamiento de un trastorno que es sensible a un aumento de la cantidad de la protema de la descripcion, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de la protema de la descripcion.

La descripcion tambien describe una secuencia de nucleotidos como se define en este documento, para uso en terapia genica o como vacuna, por ejemplo, para aumentar la produccion de la protema de la descripcion en trastornos sensibles a un aumento del nivel de la protema de la secuencia de la figura 1 o de la figura 2. Puede administrase a un paciente dicho nucleotido como polinucleotido desnudo, en forma de un vector de expresion, como un plasmido, o con un vector viral que comprende dicho nucleotido o una celula que comprende dicho nucleotido o vector.

Las cadenas complementarias o antisentido de las secuencias de nucleotidos de la descripcion tambien se pueden utilizar en terapia genica. Por ejemplo, una secuencia de ADNc o fragmentos de la misma se podnan usar en estrategias de terapia genica para regular por disminucion la expresion de la protema de la descripcion. La

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tecnologfa antisentido se puede utilizar para controlar la expresion genica mediante la formacion de una triple helice de ADN o de ARN antisentido, ambos procedimientos se basan en la union de una secuencia de nucleotidos a ADN o a ARN.

Las tecnicas adecuadas para introducir el polinucleotido o vector desnudo en un paciente incluyen la aplicacion topica con un vehfculo apropiado. El polinucleotido desnudo o el vector pueden estar presentes junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable, tal como una solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Una tecnica implica el bombardeo de partfculas (que tambien se conoce como tecnolog^a de "pistola de genes" y se describe en la patente de Estados Unidos US5371015). En la misma, se recubren partfculas inertes (tales como perlas de oro) con un acido nucleico, y se aceleran a una velocidad suficiente como para permitir que penetren en la superficie de un receptor (por ejemplo, la piel), por ejemplo por medio de la descarga a alta presion desde un dispositivo de proyeccion. (Tambien se describen las partfculas recubiertas con una molecula de acido nucleico de la presente descripcion, asf como los dispositivos cargados con tales partfculas.) Otros metodos de administracion del acido nucleico directamente a un receptor incluyen ultrasonidos, estimulacion electrica, electroporacion y microsiembra se describen en la patente de Estados Unidos US5697901.

Las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion tambien se pueden administrar por medio de vectores de administracion especializados utiles en terapia genica. Se describen estrategias de terapia genica, por ejemplo en Verme et al., Nature 1997, 389: 239-242. Se pueden utilizar sistemas virales y no virales. Los sistemas basados en virus incluyen sistemas retrovirales, lentivirales, adenovirales, asociados a adenovirales, herpes virus y vaccinia virus. Los sistemas no basados en virus incluyen la administracion directa de acidos nucleicos y sistemas basados en liposomas.

Se puede administrar una secuencia de acido nucleico de la presente descripcion por medio de celulas transformadas. Estas celulas incluyen celulas recogidas de un sujeto. El polinucleotido o vector desnudo de la presente descripcion se pueden introducir en dichas celulas in vitro y las celulas transformadas posteriormente pueden devolverse al sujeto. El polinucleotido de la descripcion puede integrarse en un acido nucleico ya presente en una celula mediante recombinacion homologa. Una celula transformada puede cultivarse in vitro, si se desea, y se pueden utilizar una o mas celulas resultantes de la presente memoria. Las celulas se pueden administrar a un paciente en una zona apropiada, mediante tecnicas quirurgicas o microquirurgicas conocidas (por ejemplo, injerto, microinyeccion, etc.)

Tambien se describen composiciones que comprenden el polipeptido, polinucleotido, vector o celula transfectada de la descripcion ademas de aquellas que se pueden administrar mediante pistola de genes. Por lo tanto, los polipeptidos de la presente descripcion se pueden utilizar en combinacion con un vehfculo no esteril o esteril o con vehfculos para uso con celulas, tejidos u organismos, tales como un vehfculo farmaceutico adecuado para la administracion a un sujeto. Estas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de la descripcion y un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. Estos vehfculos pueden incluir, pero no se limitan a, una solucion salina, una solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion.

Tambien se describen envases y kits de diagnostico y farmaceuticos que comprenden uno o mas recipientes llenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas. Adjunto a este contenedor o contenedores puede haber una indicacion en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, que refleje la aprobacion por la agencia de la fabricacion, uso o venta del producto para la administracion a humanos.

Los polipeptidos, polinucleotidos y otros compuestos de la presente descripcion, tales como aquellos identificables por los metodos de cribado descritos anteriormente, se pueden emplear solos o en conjuncion con otros compuestos, tales como compuestos terapeuticos. Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar de cualquier forma eficaz conveniente incluyendo, por ejemplo, la administracion por via topica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intranasal o intradermica, entre otras. Las composiciones farmaceuticas generalmente se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento o profilaxis de una indicacion o indicaciones espedficas. En general, las composiciones se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal. En la mayona de los casos se administraran en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por dfa. En la mayona de los casos, la dosis es de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, diariamente. Se considerara que la dosificacion optima se determinara por metodos estandar para cada modalidad de tratamiento e indicacion, teniendo en cuenta la indicacion, la gravedad, la via de administracion, las complicaciones y similares.

En terapia o como profilactico, el agente activo se puede administrar a un individuo como una composicion inyectable, por ejemplo como una dispersion acuosa esteril, por ejemplo isotonica.

Como alternativa, la composicion puede formularse para una aplicacion topica, por ejemplo en forma de unguentos, cremas, lociones, pomadas oculares, gotas para los ojos, gotas para los ofdos, enjuague bucal, vendajes impregnados y suturas y aerosoles, y puede contener aditivos convencionales apropiados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetracion del farmaco y emolientes en unguentos y cremas. Estas

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formulaciones topicas tambien pueden contener vehmulos convencionales compatibles, por ejemplo bases para cremas o pomadas, y etanol o alcohol oleico para lociones. Estos vehmulos pueden constituir aproximadamente de 1% a aproximadamente 98% en peso de la formulacion; mas usualmente constituiran hasta aproximadamente 80% en peso de la formulacion.

Para la administracion a mairnferos, y particularmente a humanos, se piensa que el nivel de dosis diaria del agente activo sera de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, normalmente aproximadamente de 1 mg/kg. El medico en cualquier caso determinara la dosis real mas adecuada para un individuo que variara con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplos del caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se requieran intervalos de dosificacion mayores o menores.

Tambien se describe un metodo de produccion de una protema de la descripcion, metodo que comprende introducir en una lmea celular apropiada un vector que comprende un polinucleotido como se define en el presente documento en condiciones adecuadas para obtener la expresion de la protema.

Tambien se describe un metodo de produccion de tnmeros que comprenden la protema de la descripcion, metodo que comprende introducir en una lmea celular apropiada un vector que comprende un polinucleotido como se define en el presente documento, en condiciones adecuadas para obtener la expresion de la protema, y permitir que la protema producida forme tnmeros.

Como se muestra en el ejemplo 6, la protema descrita en esta memoria, se une a lmeas de celulas B, tales como la lmea celular del linfoma de Burkitt Raji, la lmea celular B del linfoma ROMI 8866 y PRMl8826. Como se muestra en el ejemplo 7, en preparaciones de sangre completa, la protema descrita en esta memoria se une solo a las celulas B, no a las celulas T. Estos ejemplos confirman la presencia del receptor de la protema descrita en esta memoria en las celulas B, y apoyan el papel de la protema descrita en esta memoria en la regulacion del sistema inmune y en las enfermedades que se describen anteriormente. Esto tambien esta apoyado por el hecho de que la protema descrita en esta memoria se expresa fuertemente en las celulas y tejidos del sistema inmune, como se muestra en el ejemplo 5.

Uno de los primeros acontecimientos inducidos por la mayona de los miembros de la familia de ligandos de TNF es la activacion de NF-kB. Mukhopadhyay et al. (Journal of Biological Chemistry Vol. 274, numero 23, 04 de junio 1999, pag. 15978-15981) han demostrado que la protema descrita en esta memoria puede activar NF-kB de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. El rango de dosis utilizado fue de 1 pM a 1000 pM. El tratamiento de celulas con tan poca cantidad como 1 pM de la protema descrita en esta memoria, produjo un incremento de la activacion de NF-kB en comparacion con las celulas no tratadas. La activacion de este importante factor de transcripcion sugiere que la protema descrita en esta memoria puede estar implicada en la activacion de las rutas inflamatorias. Las moleculas que modulan la interaccion de la protema descrita en esta memoria con su receptor seran, por tanto, capaces de modular la activacion de NF-kB y por lo tanto seran utiles en cualquier enfermedad que responda a la modulacion del nivel de actividad de NF-kB, por ejemplo enfermedades del sistema inmune, tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, inflamacion neuronal y asma, y enfermedades proliferativas, como el cancerMukhophadhyay et al. demuestran ademas que la activacion de NF-kB en el mismo sistema puede ser inhibida por anticuerpos espedficos de la protema de la descripcion. Segun Mukhophadhyay et al., la protema descrita en esta memoria se incubo con los anticuerpos espedficos antes de ser utilizada para tratar las celulas. Al contrario que con el experimento anterior, se observo una reduccion de la activacion de NF-kB.

Se postula que la presencia del anticuerpo afecta a la union de la protema descrita en esta memoria a su receptor, impidiendo asf la generacion de una senal y por lo tanto la reduccion de la activacion de NF-kB. Estos hallazgos indican que en un cribado se pueden identificar otros compuestos, por ejemplo moleculas pequenas, que modulen la interaccion entre la protema descrita en esta memoria y su receptor, y se pueden utilizar para modular la activacion de NF-kB y otros efectos posteriores.

En el Ejemplo 9, los experimentos de localizacion cromosomica muestran que el gen que codifica la protema descrita en esta memoria, se localiza en la region q33 del cromosoma humano 13. No se han localizado otros miembros de la familia del ligandos de TNF en esta region. Las anomalfas en este locus se han caracterizado como el segundo defecto mas frecuente en los linfomas de Burkitt (Berger et al. Genes Chromosomes Cancer. 1:115-118). Tambien, como se muestra en el ejemplo 6, la protema descrita en esta memoria se une fuertemente a la lmea celular de linfoma de Burkitt Raji, y Schneider et al. (segun se hace referencia anteriormente) han demostrado que la forma soluble de la protema descrita en esta memoria se une fuertemente a otras lmeas de celulas del linfoma de Burkitt tales como BJAB, Namalawa, Ramos y JIYOYE.

Mukhophadhy et al. (segun se hace referencia anteriormente) han demostrado que la protema descrita en esta memoria es capaz de inhibir el crecimiento de lmeas de celulas tumorales humanas. La activacion de NF-kB es una respuesta celular temprana que generalmente va seguida de efectos citotoxicos para las celulas tumorales. Mediante el tratamiento de diversas lmeas celulares con la protema descrita en esta memoria y examinando la viabilidad, los autores fueron capaces de demostrar que hay una disminucion dependiente de la dosis, en la viabilidad de las celulas en presencia de la protema descrita en esta memoria.Esto se demostro para una lmea

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celular de linfoma histiodtico humano, una lmea celular de cancer de prostata, una lmea celular de cancer de colon, una lmea celular de carcinoma de cuello de utero y una lmea celular de carcinoma de mama.

Estos hechos sugieren que la protema descrita en esta memoria puede jugar un papel importante en la regulacion del desarrollo tumoral, y que las moleculas que pueden modular la interaccion de la protema descrita en esta memoria con su receptor pueden ser utiles en el tratamiento del cancer. Ademas, la protema descrita en esta memoria en sf misma, en su forma unida a la membrana o soluble, puede ser util en el tratamiento del cancer.

Schneider et al. (Journal of Experimental Medicine volumen 189, numero 11, 7 de junio 1999 pag. 1747-1756) han demostrado que el crecimiento de celulas B se puede coestimular por la protema de longitud completa descrita en esta memoria (es decir, la forma unida a la membrana), asf como por la forma soluble de la protema descrita en esta memoria. Por lo tanto ambas formas se pueden utilizar en terapia, o para establecer la base de un cribado de moleculas pequenas que pueden modular la interaccion entre la protema descrita en esta memoria y su receptor.

Breve descripcion de las figuras:

La figura 1 muestra la SEQ ID NO: 1 - la secuencia de aminoacidos de la forma humana soluble de la protema descrita en esta memoria. Los sitios de union al receptor se muestran en negrita, y los posibles sitios de N- glicosilacion se marcan con un punto.

La figura 2 muestra la SEQ ID NO: 2 - la secuencia de aminoacidos de la forma de la protema humana unida a la membrana descrita en esta memoria, que incluye la forma soluble de la SEQ ID N° 1. Las anotaciones son similares a las de la figura 1. La secuencia de transmembrana esta subrayada.

La figura 3 muestra el la SEQ ID NO: 3 - la secuencia de nucleotidos del ADNc que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, alineada con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. Las regiones de union al receptor estan enmarcadas, y los posibles sitios de N-glicosilacion estan marcados con un punto.

La figura 4 muestra la SEQ ID NO: 4 - la secuencia de nucleotidos de ADNc que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, alineada con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2. Las anotaciones son similares a las de la figura 3. La secuencia de transmembrana esta subrayada.

La figura 5 muestra la SEQ ID NO: 5 - la secuencia de aminoacidos de la forma soluble de la protema de raton descrita en esta memoria. El sitio de N-glicosilacion esta marcado con un punto.

La figura 6 muestra la SEQ ID NO: 6 - la secuencia de aminoacidos de la forma unida a la membrana de la protema de raton descrita en esta memoria. Las anotaciones son similares a las de la figura 5. La region de transmembrana esta subrayada.

La figura 7 muestra la SEQ ID NO: 7 - la secuencia de nucleotidos de ADNc que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, alineada con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5. Las anotaciones son similares a las de la figura 5.

La figura 8 muestra la SEQ ID NO: 8 - la secuencia de nucleotidos de ADNc que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6, alineada con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6. Las anotaciones son similares a las de la figura 6.

La figura 9 muestra un alineamiento entre las formas el raton y humanas de la forma de longitud completa de la protema descrita en esta memoria. (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6).

La figura 10 muestra el analisis de la induccion de CD40 en presencia (sombreado) o ausencia (sin sombrear) de la forma humana soluble recombinante de la protema descrita en esta memoria (A) o IL-4 (B).

La figura 11 muestra el analisis de transferencia de Northern de la expresion espedfica de tejido, de la protema descrita en esta memoria, en un raton normal (A) y en lmeas celulares tumorales humanas (B). (B) los tejidos.

La figura 12 muestra el analisis de transferencia de Northern de la expresion espedfica de tejido, de la protema descrita en esta memoria, en el tejido inmune relacionado (A) y en lmeas celulares tumorales humanas (B).

La figura 13 muestra los datos de la union de FLAG-sD7 (como se define en el ejemplo 3 a continuacion). El area sombreada indica la union a la lmea celular del linfoma de celulas B RPMI 8866. En ausencia de FLAG-sD7 no se ve union (lmea de puntos).

La figura 14 muestra la union del FLAG-sD7 a las celulas B CD19+ (A) y a las celulas T CD3 + (B) en sangre completa, lo que demuestra la especificidad de la union a las celulas B solamente.

La figura 15 muestra la filtracion en gel de FLAG-sD7 recombinante, y el posterior analisis en SDS-PAGE de las fracciones de muestra que mostraron un contenido de protema. Estos resultados indican que la forma soluble de la protema descrita en esta memoria es capaz de trimerizar.

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En los ejemplos: la protema que tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra en la figura 1 se denominara ligando D7 soluble y la protema que tiene la secuencia de aminoacidos que se muestra en la figura 2 se denominara ligando D7.

Ejemplo 1: Uso del ligando D7 soluble en un cribado para identificar compuestos que modulan la interaccion entre el ligando D7 y su receptor.

Todas las incubaciones se realizaron a temperature ambiente.

Se recubren placas Costar RIA/EIA de alta avidez con 2 pg/ml de IgG de cabra anti-humano (Sigma 13382) en PBS durante la noche. El anticuerpo de recubrimiento se retira, y se bloquean las placas durante al menos 2 horas en PBS/BSA al 2% (p/v). Posteriormente las placas se lavan tres veces con PBS/ Tween20 al 0.1% (v/v).

Se anaden 100 pl del receptor Fc (1 pg/ml) en PBS/ BSA al 1% (p/v)/Tween 200 al 0,1% (v/v), y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/ Tween20 al 0.1% (v/v).

Se anaden diluciones de biotina-ligando D7 soluble en PBS/BSA al 1% / Tween 20 al 0,1%, y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/Tween20 al 0.1% (v/v).

Se anade fosfatasa alcalina estreptavidina (1:1000) (Amersham RPN1234), y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/Tween20 al 0.1% (v / v).

La union se detecta usando soluciones amplificadoras de Life Technologies (19589-019).

Ejemplo 2: Un cribado basado en celulas para identificar compuestos que modulan la interaccion entre el ligando D7 soluble y su receptor

Un protocolo general para el uso de un cribado basado en celulas para identificar compuestos que modulan la interaccion entre el ligando D7 soluble y su receptor es el siguiente:

Una lmea de celulas B que se sabe que une y responde al ligando D7, se trata con el ligando D7 humano soluble recombinante del ejemplo (por ejemplo, FLAG-shD7 como en el ejemplo a continuacion) durante un tiempo definido. Las celulas se recogen, y se comprueba la respuesta (la respuesta posiblemente puede ser, proliferacion, apoptosis, activacion de NF-kB o produccion de citoquinas). El ensayo permite determinar si la adicion de compuestos inhibe la induccion de una respuesta en las celulas diana.

Un ejemplo espedfico es el siguiente:

Un ligando D7 soluble regula al alza CD40

Se cultivo la lmea celular L3055 del linfoma de Burkitt sobre una capa de alimentacion de celulas de fibroblastos fetales humanos (HFF515) en medio L3 (RPMI 1640 + 10% de suero Supreme + antibioticos). Las celulas HEK293 se cultivaron en OMEM suplementado con suero fetal de ternera al 10% y antibioticos. Las celulas L3055 se trataron con el medio de control (cuatro partes de medio L3 mas una parte del sobrenadante de las celulas HEK 293T) o con medio sD7 (cuatro partes de medio L3 mas una parte del sobrenadante celular de las celulas HEK293T recogida 24 horas despues de la transfeccion transitoria con sD7) o con IL -4 (medio de control mas 200 U/ml de IL-4 recombinante humana [Sigma]) y se incubaron a 37°C durante 72 horas. Las celulas se recogieron y se lavaron una vez en tampon de union, despues se tineron con anti-CD40 de raton anti-humano conjugado con FITC (Transduction Laboratories) a temperatura ambiente. Despues, las celulas se lavaron dos veces en el tampon de union antes del analisis por citometna de flujo. Se observo la induccion de CD40 tras el tratamiento con sD7 durante 72 horas en comparacion con el controlEste ensayo se repite en presencia de una molecula que inhibe o aumenta la induccion de la respuesta en las celulas diana, y se comparan los resultados. Se puede demostrar claramente la inhibicion/incremento de la respuesta. El resultado final de la regulacion al alza de CD40 es que las celulas B reciben la senal para el crecimiento y la diferenciacion. Por lo tanto, este experimento apoya una funcion del ligando D7 en la gestion de la respuesta inmune, y en enfermedades del sistema inmune tales como la inflamacion.

Ejemplo 3: Smtesis y purificacion del ligando D7 soluble

Se genera el acido nucleico que codifica el ligando D7 soluble humano (aminoacidos 133 a 285) por PCR utilizando el marco de lectura abierto de longitud completa clonado como molde.

El acido nucleico que codifica el ligando D7 soluble humano se clono en el vector pFLAG-CMV-1 (Kodak) (que contiene un promotor CMV, una secuencia lfder de preprotripsina, un epftopo amino-terminal FLAG y una secuencia de adicion de poliA de la hormona de crecimiento humana) para formar la construccion pFLAG -CMV-1-hsD7.

Se volvieron a suspender 5 x 106 celulas HEK 293T en 250 pl de citomix (KCl 120 mM; CaCl2 0,15 mM, K2HPO4/KH2PO410 mM, pH 7,6; Hepes 25 mM, pH 7,6; EGTA 2 mM, pH 7,6; MgCh5 mM; ATP 2 mM; glutation 5 mM; pH ajustado con KOH) que conterna 25 pg de pFLAG-CMV-1-hsD7. La transfeccion se llevo a cabo mediante el uso de un Gene Pulser de BioRad (960 pF, 270V).

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Despues de la transfeccion, las celulas se dejaron en hielo durante 10 min, a continuacion se transfirieron a un matraz de cultivo de tejido de 75 cm2 que contiene 15 ml de medio (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina (5 pg/ml) y estreptomicina (5 pg/ml)). El medio que contiene el ligando secretado se recogio 48 horas despues y se aplico a una columna de cromatograffa de afinidad que contema el anticuerpo anti-FLAG M2 conjugado con agarosa (Kodak).

Se lavo con una solucion salina tamponada con Tris (pH 7,4) y las fracciones se eluyeron en tampon citrato 0,1 M (pH 2,5). Las fracciones se neutralizaron inmediatamente con 0,2 volumenes de Tris.HCl 1M (pH 7,6).

Se identificaron las fracciones que contienen un ligando D7 humano soluble unido al epftopo FLAG (FLAG-hsD7) mediante inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-FLAG M2. Estas fracciones se agruparon y se concentraron usando una columna Centricon Plus-20 (NWML 5000) (Millipore). El ligando FLAG-hsD7 se almaceno a -70°.

Ejemplo 4: Smtesis y purificacion del ligando D7

El marco de lectura abierta del ligando D7 humano se clona en el vector pcDNA3 (que contiene un promotor CMV y una senal de adicion de poliA de la hormona de crecimiento bovino) para formar la construccion pcDNA3-HD7. El plasmido pcDNA3-HD7 se transfecta transitoriamente por electroporacion en celulas HEK 293T (protocolo como en el ejemplo 3).

Las celulas se recogieron despues de 48 h, y se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce en tres volumenes de tampon de extraccion de protemas (Hepes 25 mM pH 7,4, Triton-X-100 al 0,5%, 1 tableta de coctel inhibidor de proteasa "completo" (Boehringer Mannheim) por 50 ml de tampon). El ligando D7 se purifica mediante cromatograffa de afinidad usando el anticuerpo anti-D7 conjugado con agarosa.

Ejemplo 5: Analisis de transferencia de Northern de la distribucion tisular del ligando D7.

El ADNc que codifica para el ligando D7 humano se escindio de pCDNA3-HD7 (vease el ejemplo 4) con las enzimas de restriccion BamH1 y Xba1. Este fragmento de ADNc se etiqueto con 32P dCTP usando el sistema “ready-prime” de Amersham segun el protocolo de los fabricantes. Una almuota de 5pl de esta mezcla, se mezclo con 10 ml de solucion ExpressHyb (Clontech 8015-1) y la mezcla resultante se incubo con una de las siguientes transferencias de Clontech: Raton (7762-1), Human-1 (# 7760), lmea celular de cancer humano (# 7757) o sistema inmune humano ll (# 7768-1); durante 2 horas a 65° C con agitacion. A continuacion se retiro la solucion de la sonda y la transferencia se lavo sucesivamente con SSC x 2 (citrato sodico salino), SDS al 0,05% a temperatura ambiente durante tres penodos de 20 minutos. Esto fue seguido de un lavado con SSC al 0,1%, SDS al 0,1% a temperatura ambiente. A continuacion, la transferencia se expuso a una pelmula Kodak XAR-5 a -70° C durante 48 horas.

Los resultados del analisis de transferencia de Northern demuestran que el ARN del ligando D7 se expresa en corazon, pulmon, bazo, rinon y musculo esqueletico, pero no en el cerebro, tanto en ratones (figura 111A) como en humanos (figura 11B).Una transferencia de tejidos relacionados con el sistema inmune demuestra una fuerte expresion del ARN del ligando D7 en bazo, ganglio linfatico, timo, apendice, medula osea y leucocitos de sangre periferica (fig12A) lo que apoya su papel potencial como un regulador de las funciones del sistema inmune. El analisis de transferencia de Northern de una variedad de lmeas celulares tumorales humanas muestra la expresion del ARN del ligando D7 en celulas HL-60 de leucemia promielocftica, pero no en una gama de otras lmeas de celulas tumorales (figura 12B). La presencia del ligando D7 en una lmea celular leucemica tambien es compatible con el hecho de que el ligando D7 esta implicado en la regulacion y trastornos del sistema inmune.

Ejemplo 6: Deteccion de la superficie celular de union de FLAG-sD7

Se incubaron 106 celulas con 50 ng de ligando FLAG-hsD7 (vease el ejemplo 3) en un tampon de union (PBS/FCS al 2,5%/azida de sodio al 0,1%) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues de lavar una vez en tampon de union, las celulas se incubaron con 1 pg de anticuerpo anti-FLAG M2 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron una vez en tampon de union, luego se incubaron con 150 pg de anticuerpos anti-raton conjugado con ficoeritrina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues de dos lavados en tampon de union, se realizo una citometna de flujo utilizando un citometro de flujo de mesa Coulter XL y se recogieron los datos de 104 celulas viables.

Los resultados de uno de estos experimentos se muestran en la figura 13. No se detecto ninguna senal significativa cuando se trataba alguna de las lmeas ensayadas con el anticuerpo anti-FLAG M2 y con el anticuerpo secundario conjugado con R-ficoeritrina solamente, pero despues de un tratamiento previo con FLAG-sD7, la senal mostraba claramente que FLAG-hsD7 se une a la lmea celular de linfoma B RPMI 8866. Los experimentos con otras lmeas celulares han mostrado que FLAG-hsD7 se une otras dos lmeas de celulas B (RPMI 8226 y Raji), pero no se une a las lmeas de celulas T H9 y Jurkat, o las lmeas de estirpe mielomonocftica HL-60, U937 o THp-1.Estos resultados muestran que el dominio extracelular del ligando D7 humano se une a las celulas B, lo que apoya su posible funcion en la regulacion del sistema inmune, y tambien sugiere que la expresion del receptor D7 se restringe a las celulas B.

Ejemplo 7: Deteccion de la union a la superficie celular de Flag-sD7 en sangre completa.

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La sangre completa de voluntarios sanos se diluyo 1:10 con citrato de sodio al 3,8% (p/v). Se utilizaron 100 |jl en cada ensayo de union. La union a la superficie celular de FLAG-sD7 se detecto como en el ejemplo 6, excepto que el segundo anticuerpo era una IgG anti-raton conjugada Alexa 488 (Molecular Probes) y, despues del lavado, las celulas se incubaron con 1jg de anti CD3 humano de raton conjugado con PE (Becton Dickinson) o con anti CD19 humano de raton conjugado con PE (Coulter-lmmunotech). Este experimento confirma la especificidad de union de FLAG-sD7 demostrada en el Ejemplo 6. En la figura 13 se puede observar que, aunque estaban presentes tanto celulas B como celulas T, FLAG-sD7 se une solo a las celulas B CD19+ (figura 14 A), y no a las celulas T CD3+ (figura 14 B). Esto confirma la especificidad de union a las celulas B observada con las lmeas celulares, y sugiere de nuevo que la expresion del receptor D7 se restringe a las celulas B.

Ejemplo 8: FLAG-sD7 es capaz de trimerizar.

Se fracciono FLAG-sD7 recombinante purificada en una columna de Superose 12 (Pharmacia). Las protemas se eluyeron en PBS y las fracciones (1 ml) se analizaron por inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma). La columna se calibro con protemas estandar: apoferritina (443 kDa), b-amilasa (200 kDa), ADH (150 kDa), BSA (66 kDa), anhidrasa carbonica (29 kDa) y citocromo C (12,5 kDa). La figura 15 A muestra la elucion de la columna. La figura 15 B muestra las fracciones que conteman los picos observados en la figura 15A aplicados en un SDS-PAGE. Los marcadores del SDS-PAGE se encuentran en el lado izquierdo, lo que indica que la protema desnaturalizada se mueve hasta aproximadamente los 22 kDa. Los marcadores en la parte superior del gel son las protemas estandar utilizadas para calibrar la columna y muestran que FLAG-sD7 eluye en las fracciones de filtracion en gel correspondientes a un peso molecular de aproximadamente 70-25 kDa. Estos experimentos demuestran que FLAG-sD7 es capaz de ensamblarse correctamente como un homotnmero, con un peso molecular de aproximadamente 3 x 22 kDa.

Ejemplo 9: Mapeo FISH del ligando D7.

Los linfocitos aislados de sangre humana se cultivaron en un medio esencial mmimo (a-MEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10% y fitohemaglutinina a 37°C durante 68-72 horas. Los cultivos de linfocitos se trataron con BrdU (0,18 mg/ml Sigma) para sincronizar la poblacion celular. Las celulas sincronizadas se lavaron tres veces con un medio sin suero para liberar el bloque y se volvieron a cultivar a 37°C durante 6 horas en a-MEM con timidina (2,5 jg/ml Sigma). Las celulas se recogieron y se prepararon portaobjetos utilizando procedimientos estandar, que incluyen un tratamiento hipotonico, fijacion y sacado con aire.

Los portaobjetos se pusieron en el horno a 55° C durante 1 hora. Tras el tratamiento con ARNasa, los portaobjetos se desnaturalizaron en formamida al 70% en 2xSSC durante 2 minutos a 70° C, seguido de una deshidratacion con etanol. La sonda de ADN D7-27, que es la longitud completa del ADNc de D7 como se muestra en la figura 4, mas 150 nucleotidos de la region 5' no traducida y 50 nucleotidos de la region 3' no traducida), se biotinilo con dATP y las sondas se desnaturalizaron a 75° C durante 5 min en una mezcla de hibridacion que consiste en formamida al 50% y sulfato de dextrano al 10%.

Las sondas se cargaron en los portaobjetos cromosomicos desnaturalizados. Despues de hibridar durante la noche, los portaobjetos se lavaron, detectaron y amplificaron. Las senales FISH y las bandas DAPI se registraron por separado tomando fotograffas, y se logro la asignacion de los datos de mapeo FISH con las bandas cromosomicas, mediante la superposicion de las senales FISH con las bandas de cromosomas DAPI. Las bandas DAPI mostraban que la senal se localiza en el cromosoma humano 13, y los resultados de FISH lo localizan ademas en la region q33.

Claims (6)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo que es espedfico para una protema trimerica seleccionada del grupo que consiste en:

   a) una protema trimerica que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 y

   b) una protema trimerica que tiene una secuencia de aminoacidos por lo menos identica en un 98% a la SEQ ID NO: 1 y capaz de unirse a las celulas B;

   para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, artritis reumatoide, inflamacion o cancer;

   en donde dicho anticuerpo es un antagonista de la union de dicha protema trimerica a su receptor en la lmea celular RPMI 8866 del linfoma B
2. 2. El anticuerpo segun la reivindicacion 1, donde dicha protema se expresa en una celula de mairnfero.
3. 3. El anticuerpo segun la reivindicacion 2, donde la celula de mai^ero es una celula HEK293T o HeLa.
4. 4. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo monoclonal.
5. 5. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones el cual es un anticuerpo quimerico o humanizado.
6. 6. El anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones donde dicho anticuerpo es un antagonista de la union de una protema trimerica que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 a las lmeas de celulas B RPMI8866, RPMI8226 y Raji.