ES2227862T3 - Variantes de lag-3 obtenidas por corte y empalme. - Google Patents

Variantes de lag-3 obtenidas por corte y empalme.

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ES2227862T3 ES98934908T ES98934908T ES2227862T3 ES 2227862 T3 ES2227862 T3 ES 2227862T3 ES 98934908 T ES98934908 T ES 98934908T ES 98934908 T ES98934908 T ES 98934908T ES 2227862 T3 ES2227862 T3 ES 2227862T3
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Frederic Triebel
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Sergio Romagnani
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Abstract

Esta invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, seleccionada del grupo constituido por: a) las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 5; b) las secuencias nucleotídicas que se hibridan en condiciones estrictas a cualquiera de las secuencias definidas en a) y que codifican para un polipéptido que es una variante de la molécula LAG-3; c) las secuencias nucleotídicas degeneradas como resultado del código genético para las secuencias nucleotídicas definidas en a) y b) y que codifican para un polipéptido que es una variante genética de una molécula LAG-3.

Description

Variantes de LAG-3 obtenidas por corte y empalme.
La presente invención se refiere a la identificación de variantes diferencialmente cortadas y empalmadas de la molécula de LAG-3 y su uso como inmunomoduladores.
En la actualidad está reconocido que las proteínas codificadas por la región de Clase II de MHC están involucradas en muchos aspectos del reconocimiento inmune, incluida la interacción entre diferentes células linfoides como linfocitos y células de presentación de antígenos. Diferentes observaciones han mostrado también que otros mecanismos que no tienen lugar a través de CD4 participan en la función efectora de los linfocitos T helper.
El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) expresado en células T y NK activadas humanas codifica una proteína de membrana de tipo I de 498 aminoácidos (aa) con cuatro dominios (1) de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF). El análisis de esta secuencia puso de manifiesto parches considerables de identidad con las extensiones de unas secuencias de aa encontradas en la correspondientes posiciones en CD4, aunque la homología global de secuencias de aa con CD4 humano está escasamente por encima del nivel de fondo (aproximadamente 20% de identidad de secuencias). Hay también algunas homologías de secuencias internas en la molécula de LAG-3 entre los dominios 1 (D1) y 3 (D3) así como entre los dominios y (D1) y 4 (D4) sugiriendo que el LAG3 se ha desarrollado como CD4 por duplicación génica desde una estructura 2 IgSF previamente existente. Además, los genes LAG-3 y CD4 están colocados en una proximidad muy estrecha sobre la parte distal del brazo corto del cromosoma 12 (2, B. Huard, P. Gaulard, F. Faure, T. Hercend, F. Triebel, Immunogenetics 39, 213, 1994). Por lo tanto, LAG-3 y CD4 pueden ser considerados como "primos hermanos" evolutivos con el IgSF (2).
Usando un ensayo de adhesión celular cuantitativo, los autores de la presente invención mostraron previamente que la formación de rosetas entre células Cos-7 transfectadas con lG-3 y linfocitos B clase II^{+} era específicamente dependiente de la interacción de la clase II de LAG3/MHC (3). Se observó también una unión directa y específica de LAG-3 a diversas moléculas de clase II humana (incluidos diferentes alelos e isotipos), así como a moléculas de clase II murinas y de mono, con una proteína de fusión LAG-3Ig (4). Esta globulina recombinante LAG-3Ig dímera se une a residuos monomórficos de clase II de MHC con una actividad mucho mayor (Kd = 60 nM a 37ºC) que la CD4Ig (5); LAG-3Ig es capaz de hecho de bloquear la interacción de clase II de CD4/MHC en un ensayo de adhesión 
\hbox{intercelular (5).}
La función de la interacción de moléculas LAG3/clase II ha sido investigada usando anticuerpos monoclonales específicos de LAG-3 (mAb) (6) y moléculas de LAG-3Ig (7). Esta interacción conduce a una baja regulación de la activación de clones de células T. La interacción de clase II de LAG-3/MHC productiva está mediada a través de contactos de células T-T, presumiblemente a través de una señalización negativa de la clase II de mHC en células T. Globalmente, LAG-3 es expresada solamente después de la activación de linfocitos tanto in vitro como in vivo (6) y, por tanto, no desempeña ninguna función en la fase de inducción de la respuesta, en contraste con CD4. Además, experimentos de bloqueo de mAb han mostrado que LAG-3 no participa en la fase de reconocimiento de clones de células T CD4^{+} restringidas a clase II de MHC. Por tanto, el papel funcional de LAG-3 es sorprendentemente diferente del de los demás ligandos de MHC, CD4 y CD8. Actualmente se cree que las moléculas de clase II de MHC de células T tienen una función similar a CTLA-4 a continuación de la unión a lAG-3 (4), es decir, la inducción de la deleción clonal de células T previamente activadas (8).
Más recientemente, se ha encontrado que LAG-3 es preferentemente expresado y liberado por medio de células Th1 activadas, es decir, células helper T que producen IFN-\gamma y TNF, que está regulado al alza por IL-12, una potente citoquina inductora de Th1 (F. Annunziato, R. Manetti, L. Tomasévic, MG. Giudizi, R. Biagiotti, V. Giannò, P. Germano, C. Mavilia, E. Maggi y S. Romagnani, FASEB J. 10, 769-775, 1996). Se encontraron también niveles elevados de LAG-3 soluble (sLAG-3) en el suero de pacientes con esclerosis múltiple recurrente (MS) (ibidem) y de unos pocos pacientes con lupus sistémico eritematoso (S. Romagnani, Clin. Immunol. Immunopath. 80, 225-235, 1996). Estos descubrimientos sugieren que LAG-3 podría representar un marcador de diagnóstico útil para enfermedades inmunes mediadas por Th1, como tiroiditis de Hashimoto, diabetes mellitus de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis reumatoide, rechazo agudo de aloinjertos y enfermedad aguda de injerto frente a hospedante (GVHD). Por otra parte, la presencia de niveles elevados de sLAG-3 en el suero de pacientes de MS y posiblemente de otros pacientes que padezcan las enfermedades anteriores, apoya una función protectora que se produce de forma natural para sLAG-3, ya que podría competir con la forma unida a membranas y, por tanto, bloquear las respuestas inmunes mediadas por LAG-3.
Los autores de la presente invención han investigado si son expresadas otras formas de LAG-3, debidas a un corte y empalme alternativo del trascripto nuclear.
La mayoría de los genes codificadores de proteínas eucarióticas contienen las secuencias presentes en el correspondiente mRNA maduro en fragmentos discontinuos de DNA (exones) intercalados entre secuencias (intrones) que no forman una parte del mRNA maduro. Por tanto, los trascriptos primarios de estos genes contienen las dos secuencias correspondientes a exones y secuencias correspondientes a intrones. Las secuencias de intrones son posteriormente cortadas mediante un procedimiento nuclear de múltiples etapas, conocido como corte y empalme pre-mRNA. A saber, los intrones son desmarcados por medio de secuencias de consenso en sus contornos 5' (donante) y 3' (aceptor). El procedimiento de partición comprende escindir en el sitio aceptor con ligadura concomitante de los exones 5' y 3'.
En la mayoría de los casos, los exones presentes en un gen están incorporados en mRNA maduro a través de una ligadura invariable de pares consecutivos de sitios de partición donantes y aceptores, proporcionado un único producto génico.
Sin embargo, en algunos casos, el mismo gen contienen sitios de partición alternados que pueden conducir a trascriptos diferentes. El mecanismo que regula esta partición alternativa está escasamente comprendido, pero al menos para algunos genes, es conocido que es específico para células y desarrollo.
El corte y empalme alternativo conduce a la producción de múltiples isoformas de proteínas a partir de un único gen. Es uno de los procedimientos responsables de generar la diversidad de proteínas.
Actualmente se conoce que más de 50 genes generan diversidad de proteínas mediante el uso de cortes y empalmes alternativos. Este mecanismo es particularmente común y es elaborado entre los genes de proteínas contráctiles.
Los autores de la presente invención han descubierto tres nuevas variantes de LAG-E diferencialmente cortadas y empalmadas, respectivamente denominadas LAG-3V1, LAG-3V2 y LAG-3V3.
LAG-3V1 codifica una proteína soluble de 36 kD que contiene 8 nuevos residuos de aminoácidos después del dominio D2, LAG-3V2 codifica una proteína de transmembranas de 68 kD que no contiene el dominio D4, y LAG-3V3 codifica una proteína de 52 kD soluble que contiene 8 nuevos residuos de aminoácidos después del dominio
D3.
Estas variantes proporcionan nuevas aproximaciones para estudiar tanto la regulación del gen LAG-3 como la función biológica de la proteína, y son útiles para la elaboración de nuevos compuestos inmunomoduladores, especialmente compuestos que emulan la función biológica de LAG-3 o que pueden actuar como agonistas o antagonistas de la interacción entre LAG-3 y las moléculas de clase II de MHC.
Por tanto, el objeto de la presente invención es una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada entre el grupo que consiste en:
a) las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5;
b) las secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones restringidas a cualquiera de las secuencias definidas en el apartado a) y que codifican un polipéptido que es una variante de la de molécula de LAG-3;
c) las secuencias de nucleótidos que son degeneradas como consecuencia del código genético para las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados a) y b), y que codifican un polipéptido que es una variante genética de la molécula de LAG-3.
La presente invención se dirige también a los polipéptidos purificados, codificados por las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas. Dichos polipéptidos son denominados en lo sucesivo "variantes de LAG-3".
La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de variante de LAG-3. Estas composiciones son útiles para tratar patologías asociadas al sistema inmune, en particular enfermedades dependientes de Th1 como tiroiditis de Hashimoto, diabetes mellitus de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis reumatoide, rechazo agudo de aloinjertos, GVHD aguda, oftalmopatía de Grave, malaria cerebral, artritis de Lyme, artritis reactiva (inducida por Yersinia), hepatitis crónica inducida por HCV, colangitis esclerosante primaria, dermatitis de contacto, aborto recurrente inexplicado, anemia aplástica y artritis gástrica inducida por Helicobacter pilori.
La presente invención se refiere también al uso de las variantes de LAG-3 para la elaboración de compuestos inmunomoduladores. Estos compuestos pueden emular o alterar la función biológica de LAG-3 y variantes de LAG-3, induciendo por lo tanto algunas modificaciones de las interacciones celulares que incluyen la participación de LAG-3 o sus variantes.
La presente invención se dirige también a anticuerpos poli- o monoclonales, Fab, Fab' y F(ab')_{2} o sus fragmentos de Fv, dirigidos a epitopos específicos que consisten en 240-247 residuos de SEQ ID Nº 2 y 331-338 residuos de SEQ ID Nº 6. El uso de estos anticuerpos específicos para purificar dichas variantes o para preparar composiciones terapéuticas o de diagnóstico, así como las composiciones resultantes, están también comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención proporciona adicionalmente un método terapéutico para tratar patologías asociadas al sistema inmune, que comprende la administración a un paciente de una variante de LAG-3 en una cantidad eficaz, o una composición que comprenda dicha variante, como ingrediente activo.
La invención se refiere también a un método terapéutico para tratar patologías asociadas al sistema inmune, que comprende la administración a un paciente de un anticuerpo anti-variante de LAG-3 como se definió anteriormente, o una composición terapéutica que comprende dicho anticuerpo como ingrediente activo.
En una realización preferida, la invención se dirige a una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 5 o sus secuencias completamente complementarias.
La invención se refiere también a un polipéptido purificado que resulta de la expresión de una de las secuencias de nucleótidos de la invención. Preferentemente, el polipéptido es seleccionado entre el grupo que consiste en LAG-3V1, LAG-3V2 y LAG-3V3, respectivamente codificados por las secuencias SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 5 y correspondientes respectivamente a las secuencias SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.
Los polipéptidos según la invención pueden ser obtenidos mediante cualquiera de los métodos estándar o purificación de proteínas de membranas o solubles, mediante síntesis de péptidos o mediante la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Dichas técnicas comprenden la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifique uno de los péptidos de la invención en un vector de expresión, como un plásmido, y la transformación de células hospedantes con este vector de expresión, mediante cualquiera de los métodos disponibles por el experto en la técnica, como por ejemplo, electroporación.
Ventajosamente, las secuencias de nucleótidos de la invención son obtenidas por RT-PCR (reacción de cadenas de transcriptasa inversa-polimerasa) del correspondiente cDNA de la variante de LAG-3. Brevemente, el RNA total es extraído de linfocitos activados de sangre periférica humana (PBL), y es inversamente transcrito y amplificado usando un par específico de cebadores de oligonucleótidos. En el caso de la presente invención, los cebadores consisten en un cebador de sentido y un cebador de antisentido que están colocados en dos posiciones específicas en la secuencia de LAG-3 que se describirá más en detalle en los siguientes ejemplos. El cDNA resultante es seguidamente amplificado por amplificación enzimática y puede ser subclonado en una célula hospedante apropiada.
La presente invención se refiere también a vectores de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según la invención y células hospedantes transformadas con estos vectores.
Un "vector de expresión" se refiere a una construcción de DNA replicable usada para amplificar o expresar DNA que codifica uno de los polipéptidos de la invención.
Las células hospedantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluidas, pero sin limitación, bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, incluidas líneas celulares que están disponibles en el comercio.
La presente invención se dirige también a anticuerpos anti-variantes de LAG-3 o sus fragmentos, como se definió anteriormente. Opcionalmente, estos anticuerpos o sus fragmentos pueden estar unidos a un marcador (radioisótopo, colorante fluorescente, marcador enzimático, etc.) o a una molécula terapéuticamente activa que es, por ejemplo, un compuesto citotóxico.
Los anticuerpos policlonales pueden ser preparados según métodos bien conocidos, como se describe por BENEDICT A.A. et al. Los métodos de producción de los anticuerpos monoclonales son bien conocidos a partir de la técnica anterior, especialmente la descrita por KOHLER y MILSTEIN. Este método, junto con sus variantes, está descrito por YELTON et al.
Estos anticuerpos pueden ser usados en un método para purificar un polipéptido según la invención, o para un método de dosificación o identificación. Dicho método es, por ejemplo, pero sin limitación, un método radio-inmunológico del tipo RIA o IRMA, un método inmuno-enzimático, como el método ELISA, o un método de inmunofluorescencia directo o indirecto.
La invención incluye también el uso de dichos anticuerpos para la elaboración de composiciones terapéuticas capaces de bloquear la actividad de variantes de LAG-3, es decir, que tengan actividades inmunomoduladoras, como la inducción de la maduración, diferenciación, proliferación y/o función de células que expresan una variante de LAG-3, por ejemplo, células T y NK activadas.
Los anticuerpos para variantes de LAG-3 pueden ser usados como potenciadores de vacunas o inmunoestimulantes en pacientes con supresión del sistema inmune, como pacientes infectados con VIH o tratados con sustancias inmunosupresoras.
Las composiciones terapéuticas según la presente invención comprenden proteínas de variantes de LAG-3 o anticuerpos como se definieron anteriormente, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser formuladas según las técnicas habituales. El vehículo puede variar de forma según la vía de administración escogida: oral, parenteral, sublingual, rectal o nasal.
Para las composiciones para una administración parenteral, el vehículo comprenderá generalmente aguas esterilizada así como otros posibles ingredientes que favorezcan la solubilidad de la composición o su capacidad para ser almacenada. La vía de administración parenteral puede consistir en inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas.
La composición terapéutica puede ser del tipo de liberación sostenida, en particular para tratamientos a largo plazo, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes. La dosis que vaya a ser administrada depende del sujeto que vaya a ser tratado, en particular de la capacidad de su sistema inmune para conseguir el grado deseado de protección. Las cantidades precisas de ingrediente activo que va a ser administrado pueden ser fácilmente determinadas por el facultativo que inicie el tratamiento.
Las composiciones terapéuticas según la invención pueden comprender, además de variantes de LAG-3 solubles o los anticuerpos según la invención, otro ingrediente activo, cuando sea apropiado, unido a través de un enlace químico a la variante de LAG-3 o a un anticuerpo según la invención. Como ejemplo, pueden ser mencionadas las proteínas de variantes de LAG-3 solubles mencionadas según la invención fusionadas a una toxina, por ejemplo, ricino o anatoxina de difteria, capaz de unirse a moléculas de clase II de MCH y de destruir las células dianas, por ejemplo, células leucémicas o de melanomas, o fusionadas a un radioisótopo.
Los ejemplos que siguen, junto con las figuras de referencia anejas, ilustrarán la invención más en detalle.
Leyendas de las figuras
- La Fig. 1 representa la estructura esquemática de LEG-3 de tipo salvaje (wt) y sus variantes V1, V2 y V3. LAG-3V1 deriva de la retención del intrón 4, es decir, no se produce la escisión en los sitios de donantes y aceptores que flanquean el intrón 4. Un codón de detención dentro del marco situado después de 8 codones en el intrón 4 retenido conduce a una proteína de LAG-3V1 soluble truncada, que contiene D1, D2 y 8 residuos de aminoácidos nuevos.
LAG-3V2 carece del exón 6, debido a la ligadura del sitio donante del intrón 5 al sitio aceptor en el intrón 6. Como no se produce ningún desplazamiento del marco de lectura, la proteína de LAG-3V2 resultante es una proteína de transmembrana que no contiene el dominio D4.
LAG-3V3 deriva de la escisión del trascripto nuclear en un sitio de poliadenilación diferente colocado \sim170 pb (pares de bases) aguas abajo del extremo 5' del intrón 5. La secuencia del intrón 5 retenido contiene un codón de detención en el marco. El mRNA codifica una proteína soluble truncada que contiene D1, D2, D3 y 8 nuevos residuos de aminoácidos.
- La Fig. 2 es una representación esquemática de la organización de intrón/exón del gen LAG-3. Los acontecimientos de corte y empalme que resultan en la generación de trascriptos de RNA cual codifican wtLAG-3, LAG-3V1, LAG-3V2 o LAG-3V3 están indicados por líneas de puntos.
SP: péptido señal; D1-D4: dominios 1-4 de IgSF; TM: secuencia de transmembrana; CYT: dominio citoplásmico; I1-19: intrón 1-9.
Los nuevos exones en LAG-3V1 y LAG-3V3 se muestran como recuadros oscurecidos.
- La Fig. 3 es una representación esquemática de wtLAG-3 y LAG-3V1. La situación de los cebadores y sondas usados para el aislamiento de LAG-3V1 está indicada mediante flechas. Los fragmentos de DNA amplificados usando los cebadores específicos están mostrados por líneas sencillas. El tamaño de los fragmentos obtenidos mediante RT-PCR está indicado.
- La Fig. 4 muestra un análisis de transferencia Southern de fragmentos de cDNA de wtLAG-3 y LAG-3V1 amplificados por RT-PCR con cebadores F459 y R460.
a) Gel teñido con bromuro de etidio. b) Transferencia hibridada con una sonda de cDNA específica para LAG-3. La banda inferior deriva de wtLAG-3 mientras que la superior, evidente solo después de la hibridación, deriva de LAG-3V1.
- La Fig. 5 muestra un análisis por transferencia Southern de fragmentos de cDNA de LAG-3V1 amplificados por RT-PCR con cebadores F176 y R460. a) Gel teñido con bromuro de etidio. La banda principal deriva de wtLAG-3. b) Transferencia hibridada con la oligosonda 14 específica del intrón 4 de LAG-3. La banda superior deriva de LAG-3V1 mientras que la inferior es un heteroduplex de wtLAG-3/LAG-3V1.
- La Fig. 6 es una representación esquemática de wtLAG-3, LAG-3V2 y LAG-3V3. La situación de los cebadores y sondas usados para el aislamiento de LAG-3V2 y LAG-3V3 está indicada mediante flechas. Los fragmentos de DNA amplificados usando los cebadores específicos están mostrados por medio de líneas sencillas. El tamaño de los fragmentos obtenidos mediante RT-PCR está indicado.
- La Fig. 7 muestra un análisis por transferencia Southern de fragmentos de cDNA de wtLAG-3, LAG-3V2 y LAG-3V3 amplificados por RT-PCR con cebadores F176 y R401.
a) Gel teñido con bromuro de etidio. b) Transferencia hibridada con la oligosonda F459 específica para LAG-3D2. La banda superior deriva de wtLAG-3 mientras que las bandas de 780 y 940 pb derivan de LAG-3V2 y LAG-3V3, respectivamente.
- La Fig. 8 muestra el modelo de electroforesis sobre gel de agarosa de productos de RT-PCR obtenidos con cebadores específicos para LAG-3V2 y LAG-3V3, es decir, 173/V2R y 173/V3R, respectivamente.
- La Fig. 9 muestra los modelos de transferencia Western de extracciones de PHA con anti-LAG-3 en mAbs.
Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de variante 1 de LAG-3 humanos (LAG-3V1) por RT-PCR sobre PBMC humanas (células mononucleares de sangre periférica) - Extracción de RNA y RT-PCR
Se aislaron PMBM mediante centrifugación por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se activaron con 1 \mug/ml de PHA y 100 U/ml de IL-2 durante 48 h a 37ºC, 5% CO_{2}. Se extrajo mRNA por medio del estuche de ensayo de mRNA Oligotex Direct (Ouiagen Inc., Chatsworth, CA, EE.UU.) y fue sometido a transcripción inversa con un cebador oligo(dT), usando un primer estuche de ensayo de síntesis de cadenas (RT-PCR kit, Stratagen, La Jolla, CA, EE.UU.).
La amplificación de cDNA se realizó con una polimerasa 2.5 U Taq y 100 mg de cada uno de cebador directo F459 (5' TCTCTCAGAGCCTCCGATGGGTCATTTTG 3') (SEQ ID Nº 7) cebador inverso R460 (5' TCCTGCAGATGGATATGGCAGGTGTAGGTC 3') (SEQ ID Nº 8) que se reasocian a los nucleótidos 762-791 y 1217-1246 de la secuencia de LAG-3, respectivamente (Fig. 3). Se realizaron treinta ciclos de PCR, y cada ciclo incluía una desnaturalización a 94ºC durante 1 minutos, reasociación a 66ºC durante 1 minutos y extensión a 72ºC durante 2 minutos.
- Análisis de DNA amplificado mediante transferencia Southern
Una parte alícuota de 10 \mul del DNA amplificado fue fraccionada en un gel de agarosa al 2%. Fue observado el fragmento de LAG-3 de 485 pb esperado (Fig. 4a). Después de hacer una transferencia sobre un filtro de membrana de nitrocelulosa y de una hibridación con una sonda de cDNA específico de LAG-3D1D2 marcado con P^{32} obtenida por PCR, además de la banda de 485 pb, se encontró una banda de \sim890 pb. El fragmento de 890 pb fue nuevamente amplificado,clonado y secuenciado.
-Clonación y secuenciado del fragmento de LAG-3 de 890 pb
El fragmento de 890 pb fue clonado en el vector pCR®II (Promega) y el inserto fue secuenciado usando el estuche de ensayo "ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin-Elmer) y el secuenciador de DNA automatizado mod. 373A (Perkin-Elmer). Los resultados indican que este fragmento es de 892 pb de longitud y deriva de una variante de LAG-3 que retiene el intrón 4 (Fig. 2). Debido a la presencia de un codón de detención en el marco en el intrón 4, esta variante, denominada LAG-3V1, está previsto que codifique una proteína de 36 kD soluble que contiene los dominios D1, D2 y 8 residuos de aminoácidos C-terminales (Fig. 1).
- Confirmación de expresión de LAG-3V1
Para confirmar que el fragmento de LAG-3V1 deriva de mRNA y no de DNA genómico, se realizó un segundo experimento pr RT-PCR usando el cebador directo F176 (5' CCTGGGCCAGGCCTCGA TGAC 3') (SEQ ID Nº 9) que se reasocia a los nucleótidos 725-745 de la secuencia de LAG-3, y el cebador inverso R460 (Fig. 3). El cebador F176 que extiende el sitio de unión de corte y empalme D1/D2 no debe permitir la amplificación de DNA genómico de LAG-3.
Tras una electroforesis sobre gel de agarosa de los productos de PCR, se observó la banda esperada de wtLAG-3 de \sim520 pb (Fig. 5a). Una transferencia Southern con la oligosonda I4 específica para el intrón 4 de LAG-3 (5' CCCCACTCTGCTTCACATTT 3') (SEQ ID Nº 10) mostró la banda de LAG-3V1 de 930 pb esperada y una banda de \sim800 pb adicional (Fig. 5b). Los dos fragmentos fueron reamplificados y secuenciados. La banda superior se confirmó que correspondía a LAG-3V1, mientras que la inferior era un heteroduplex de wtLAG/3-LAG-3V1.
Ejemplo II Clonación de variante 2 de LAG-3 humano (LAG-3V2) y variante 3 de LAG-3 (LAG-3V3) por RT-PCR sobre PBMC activadas - Extracción de RNA y RT-PCR
Fueron aisladas PBMC por centrifugación por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se activaron con 1 \mug/ml de pHA y 100 U/ml de IL-2 durante 48 h a 37ºC, 5% CO_{2}.
Se extrajo RNA total por medio de reactivo TriZol (GIBCO-BRL). El RNA total (5 \mug) fue sometido a transcripción inversa usando la mezcla de cebadores oligo(dT) de anclaje AT17A, AT17C y AT17G (5' GGCCCTGGATCCGGACCTAA(T)_{17} (SEQ ID Nº 1) seguida de A, C o G) (Fig. 6) que permite obtener moléculas de cDNA con extremos 3' homogéneos y un anclaje para una posterior PCR.
Se realizó una reacción de transcriptasa inversa (RT) en un volumen final de 50 \mul de 1 x tampón RT, DTT 10 mM, dNTP 1 mM, 40 U de inhibidor de RNasa (Boehringer) y 400 U de Superscript II RT (GIBCO-BRL) a 37ºC durante 90 minutos. La reacción de RT fue detenida a 90ºC durante 5 minutos. El RNA fue digerido con 1 U de RNasa (Boehringer) a 37ºC durante 30 minutos.
Se realizó una PCR con el cebador F176 directo y el cebador R401 inverso (5' GGCCCTGGATCCGGACCTAA 3') (SEQ ID Nº 12) que se reasocia al anclaje 3' de Cdna (Fig. 6). Los cebadores F176 y R401 deben permitir amplificar todas las variantes de corte y empalme de LAG-3 que contengan la unión D1D2 hasta la cola de poli(A).
Se realizó una PCR sobre 0,5 \mul de equivalente de cDNA hasta 0,5 \mug de RNA total en 100 \mul de volumen final que contenían 1 x tampón Taq, 2,5 U de DNA-polimerasa Taq (Advanced Biotechnologies), MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 200 \muM, 10% de DMSO y 50 pmoles de cada uno de los cebadores F176 y R401. Se usaron una técnica de comienzo en caliente y 30 ciclos de PCR (96ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 4 minutos). Se usó RNA sin RT como testigo negativo en el experimento de PCR.
- Análisis de transferencia southern de productos de RT-PCR
Los productos de RT-PCR (10 \mul) fueron fraccionados por electroforesis sobre gel de agarosa y sometidos a transferencia en membrana de nilón Hybond N+ (Amersham). La transferencia fue hibridada con la oligosonda F459 específica para LAG-3D2 marcada con DIG (Fig. 6) en 2X SSC, 0,02% de SDS, 0,5% de reactivo de bloqueo (Boehringer), 0,1% de N-laurilsarcosina a 55ºC durante 30 minutos.
La transferencia fue lavada dos veces con 2x SSC y 0,1% de SDS a 55ºC. Se relación una detección híbrida con anticuerpos anti-DIG conjugados con HRP (Boehringer) y reactivos ECL (Amersham).
Los resultados mostraron que además del fragmento de wtLAG-3 de 1,12 kb, estaban presentes dos bandas menores de aproximadamente 940 y 780 pb tanto en el gel teñido con bromuro de etidio (Fig. 7a) como en la transferencia Southern (Fig. 7b).
- Secuenciado de fragmentos de LAG-3
Los fragmentos de PCR de 940 y 780 pb fueron aislados a partir de gel de agarosa, reamplificados con cebadores F176/R401 y directamente secuenciados. Los resultados mostraron que el fragmento de 780 pb deriva de una omisión en el marco del exón 6 de LAG-3 (Fig. 2). Esta variante, denominada LAG-3V2, está previsto que codifique una proteína de transmembrana de 61 kD que no contiene el dominio D4 (Fig. 1).
El secuenciado del fragmento de 940 pb mostró que deriva de la escisión del trascripto nuclear en un sitio de poliadenilación diferente situado \sim170 pb aguas abajo del extremo 5' el intrón 5 (Fig. 2). La secuencia del intrón 5 retenido contiene un codón de detención en el marco. El mRNA resultante codifica una variante de LAG-3 soluble de 52 kD, denominada LAG-3V3, que contiene los dominios D1, D2 y D3, seguida de 3 residuos de aminoácidos nuevos (Fig. 1). Tanto LAG-3V2 como LAG-3V3 mantienen los 4 sitios de glicosilación de wtLAG-3.
- Confirmación de la expresión de LAG-3V2 y LAG-3V3
Para confirmar la expresión de LAG-3V2 y LAG-3V3 y para valorar la presencia de la secuencia en 5' completa que codifica el LAG-3 N-terminal, se realizó una RT-PCR sobre RNA total de PMBC activadas con el cebador directo 173 (5' TATAGGATCCGGTGCCCAG ACCATAGGAGAGATG 3') (SEQ ID Nº 13) que se reasocia a los nucleótidos 212-233 de una secuencia de LAG-3 que extiende el codón de comienzo de ATG, y los cebadores inversos V2R (5'GGCGTTCACGTGGTTGGGCACCTGTGATGATT 3') (SEQ ID N DEG 14) o V3R (5'TCACCTACTCGAGAAAAGTGGGGGCCGAGAT 3') (SEQ ID N DEG 15) (Fig. 6). Como el cebador V2R se reasocia al sitio de omisión de la unión D3/TM de LAG-3V2 y el cebador V3R se reasocia a la secuencia en 5' del intrón 5 retenido en LAG-3V3, solo se produciría la amplificación de estas dos variantes.
Se realizó una PCR con una temperatura de reasociación de 68ºC para los dos primeros ciclos y 72ºC para los 28 ciclos restantes. Tras una electroforesis sobre gel de agarosa, fueron encontrados los fragmentos esperados de LAG-3V2 de 1,10 Kb y LAG-3V3 de 1,23 Kb. El secuenciado de DNA de los fragmentos amplificados confirmó que LAG-3V2 codifica una proteína de transmembrana de 61 kD que contiene los dominios D1, D2 y D3, el dominio de transmembrana (TM) y el dominio citoplásmico (CYT), mientras que LAG-3V3 codifica una proteína insoluble de 52 kD que contiene D1, D2 y una cola en C de 8 nuevos aa (Fig. 1).
En conclusión, en la actualidad han sido descubiertas cuatro moléculas de LAG-3, dos unidas a membrana (wtLAG-3 y LAG-3V2) y dos formas solubles que carecen de la secuencia de transmembrana (LAG-3V1 y LAG-3V3). El análisis de la expresión de la variante de LAG-3 en subconjuntos de células T específicas y en diferentes estados de activación pueden proporcionar una información útil para una mejor comprensión de la función de LAG-3.
Ejemplo III Caracterización de proteína de LAG-3V3
Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) por centrifugación sobre gradiente de densidad de ficoll-diatriazoato a partir de células mononucleares de cultivo de unidades de donantes de sangre. Las PBMC fueron obtenidas de dos donantes sanos. Las PBMC recogidas de la superficie interfacial entre la materia sobrenadante y el gradiente fueron lavadas tres veces en PBS y finalmente se volvieron a poner en suspensión a la concentración de 2\cdot10^{6} células/ml en medio de cultivo RPMI 1640 enriquecido con 10% de suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Seguidamente se añadieron fitohemaglutinina (PHA) e interleucina recombinante (IL-2) a una concentración final de 1 \mug/ml y 100 U/ml, respectivamente.
Las células fueron incubadas a 37ºC en atmósfera con 5% de CO_{2} durante 72 y 120 horas. Al final de los tiempos de incubación, las suspensiones celulares fueron transferidas a tubos de polipropileno de 50 ml y centrifugadas a 400 g durante 10 minutos. Las materias sobrenadantes fueron recogidas e inmediatamente congeladas a -20ºC. La determinación de proteínas totales se llevó a cabo mediante el método de Bradford, usando el ensayo de proteínas Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Para un análisis, 100 \mug de muestras fueron completamente secadas bajo centrifugación a vacío, se volvieron a poner en suspensión en 10 \mul de agua bi-destilada (ddH_{2}O), se añadieron 10 \mul de tampón por muestra dos veces y las muestras fueron incubadas 5 minutos a 100ºC.
Las muestras fueron seguidamente introducidas en geles de poliacrilamida-Tris-glicina para un análisis SDS-PAGE y y se realizó bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras a 125 voltios constantes. El experimento fue detenido cuando el frente de colorante alcanzó el fondo del gel.
El gel fue retirado e incubado durante 20 minutos en tampón de transferencia. Una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum fue incubada durante 10 minutos en tampón de transferencia en un recipiente separado con agitación suave. Las proteínas en el gel fueron seguidamente transferidas por vía electroforética a la membrana durante 90 minutos a 75 voltios constantes. Cuando la transferencia se completó, la membrana fue secada a temperatura ambiente y seguidamente incubada durante 20 minutos en KOH al 1% (p/v) con agitación suave y se lavó 4 veces con PBS durante 5 minutos. La membrana fue teñida 5 minutos en solución Ponceau S para mostrar proteínas y marcadores del peso molecular y desteñida 4 veces con PBS. Los sitios de unión no específica fueron bloqueados incubando la membrana durante una noche a 4ºC con Mile al 1% en PBS/Tween al 0,5%. Después de eliminar la solución de bloqueo, la membrana fue sometida a transferencia con anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 (mAb) 2H6 diluido a 5 \mug/ml de solución de bloqueo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente con agitación, la membrana fue lavada 5 veces con PBS/0,5% Tween durante 10 minutos cada vez y seguidamente fue incubada durante una hora a temperatura ambiente con agitación con anticuerpos policlonales anti-ratón de cabra conjugados con peroxidasa de rabanillo (HRP) diluida 1:1000 en solución de bloqueo. Al final de la incubación, la membrana fue lavada como se describió anteriormente.
Resultados
Las proteínas sometidas a inmunotransferencia fueron seguidamente reveladas usando un método quimioluminiscente mejorado (ECL) (Amersham Italia, Milan, Italia).
Las columnas 1 y 3 de la figura 9 representan los resultados obtenidos para el donante 1, respectivamente después de 72 y 120 oras de incubación; mientras que las columnas 2 y 4 corresponden al donante 2 y la columna 5 a la línea celular linfoblastoide RAJI como testigo negativo. Las concentraciones de proteínas de partida fueron respectivamente 3,1 mg/ml; 1,9 mg/ml; 2,8 mg/ml; 3,4 mg/ml; 3,4 mg/ml de la columna 1 a la columna 5.
Una banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 5,5 kDa reaccionó con anti-LAG-3 mAb. Este peso molecular aparente está en congruencia con el esperado para la variante 3 de LAG-3 putativa basada en la secuencia de mRNA. Esta banda aparece específicamente en PHA-blastos y no está presente en la materia sobrenadante de la línea celular linfoblástica B RAJI, tratada como las materias sobrenadantes de PHA-blastos.
(i)
SOLICITANTES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 101 rue de Tolbiac
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: París
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Institut Gustave Roussy
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 19 rue Camille Desmoulins
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Villejuif
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94805
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Applied Research Systems ARS Hoding N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6 John R. Gorsiraweg PO Box 3889
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Curacao
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: The Dutch West Indies
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de LAG-3
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/M-DOS
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2279 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 247 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1629 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 422 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1458 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
8
9 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTCAGAG CCTCCGATGG GTCATTTTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCTGCAGAT GGATATGGCA GGTGTAGGTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGGGCCAG GCCTCGATGA C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCACTCTG CTTCACATTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCCTGGAT CCGGACCTAA TTTTTTTTTT TTTTTTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCCTGGAT CCGGACCTAA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATAGGATCC GGTGCCCAGA CCATAGGAGA GATG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGTTCACG TGGTTGGGCA CCTGTGATGA TT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
TCACCTACTC GAGAAAAGTG GGGGCCGAGA T

Claims (12)

1. Una secuencia de nucleótidos aislada, seleccionada entre el grupo que consiste en:
a) las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5;
b) las secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones restringidas a cualquiera de las secuencias definidas en el apartado a) y que codifican un polipéptido que es una variante de la molécula de LAG-3, y se seleccionan entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6;
c) las secuencias de nucleótidos que son degeneradas como consecuencia del código genético para las secuencias de nucleótidos definidas en los apartados a) y b), y que codifican un polipéptido que es una variante genética de la molécula de LAG-3 y se seleccionan entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.
2. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, y SEQ ID Nº 5 o las secuencias completamente complementarias de las mismas.
3. Un polipéptido, seleccionado entre el grupo que consiste en LAG-3V1, LAG-3V2 y LAG-3V3, que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4, y SEQ ID Nº 6, respectivamente codificadas por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5.
4. Un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.
5. Una célula hospedante, transformada con un vector de expresión según la reivindicación 4.
6. Una composición farmacéutica, que comprende como ingrediente activo un polipéptido según la reivindicación 3.
7. El uso de un polipéptido según la reivindicación 3, para la elaboración de una composición terapéutica para tratar patologías asociadas al sistema inmune.
8. Anticuerpos dirigidos a epitopos que consisten en los residuos 240-247 de la SEQ ID Nº 2 y los residuos 331-338 de la SEQ ID Nº 6.
9. Anticuerpos según la reivindicación 8, en los que dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales o Fab, Fab', F(ab') o fragmentos de Fv de los mismos.
10. El uso de anticuerpos según la reivindicación 8 ó 9, en un método para purificar, dosificar o identificar un polipéptido según la reivindicación 3.
11. El uso de anticuerpos según la reivindicación 8 ó 9, para la elaboración de una composición terapéutica para tratar patologías asociadas al sistema inmune.
12. Una composición terapéutica, que comprende como ingrediente activo un anticuerpo según la reivindicación 8 ó 9.
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