ES2622076T3 - Regulación de la expresión de genes Aggrecan usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo para el tratamiento de la osteoartritis, la artritis reumatoide, lesion de cartilago y/o defectos de cartilago que comprenden: una fuente de senal que genera al menos una senal especifica y selectiva que tiene una configuracion de onda sinusoidal y electrodos o bobinas conectadas a la fuente de senal para recibir al menos una senal especifica y selectiva y que estan operativamente dispuestos con respecto al tejido de cartilago diana, causando dichos electrodos o bobinas, tras la recepcion de dicha al menos una senal especifica y selectiva, la generacion de un campo que tiene una amplitud de aproximadamente 10-20 mV/cm en el tejido de cartilago diana a 60 kHz, siendo dicho campo especifico y selectivo para regular hacia arriba la expresion genica de ARNm en agrecano en dicho tejido de cartilago diana, caracterizándose porque: dicha fuente de senal esta configurada para aplicar dicha al menos una senal especifica y selectiva aplicada a dichos electrodos o bobinas con aproximadamente un ciclo de trabajo del 50% durante 30 ci- clos de un minuto de encendido y un minuto de apagado, a fin de regular selectivamente hacia arriba la expresion genica de ARNm de agrecano en dicho tejido de cartilago diana como resultado de la aplicacion del campo especifico y selectivo.
Description
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Regulacion de la expresion de genes Aggrecan usando senales electricas y electromagneticas especificas y selectivas
Descripcion
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion esta dirigida a un dispositivo de regulacion de la expresion de genes de Aggrecan en las celulas del cartflago mediante la aplicacion de campos generados por senales electricas y electromagneticas especificas y selectivas para el tratamiento de cartflago articular lesionado o enfermo.
Antecedentes de la invencion
[0002] Las interacciones bioelectricas y actividad que se cree que esta presente en una variedad de celulas y tejidos biologicos son uno de los procesos menos entendidos de los procesos fisiologicos. Sin embargo, recientemente ha habido mucha investigacion en estas interacciones y actividades relacionadas con el crecimiento y la reparacion de ciertos tejidos y celulas. En particular, ha habido mucha investigacion sobre la estimulacion por campos electricos y electromagneticos y su efecto sobre el crecimiento y reparacion de hueso y cartflago. Los investigadores creen que tal investigacion podna ser util en el desarrollo de nuevos tratamientos para una variedad de problemas medicos.
[0003] La osteoartritis, tambien conocida como enfermedad degenerativa de las articulaciones, se caracteriza por la degeneracion del cartflago articular, asf como la proliferacion y remodelacion del hueso subcondral. Los smtomas habituales son rigidez, limitacion del movimiento y dolor. La osteoartritis es la forma mas comun de artritis, y las tasas de prevalencia aumentan notablemente con la edad. Se ha demostrado que los pacientes ancianos con osteoartritis autoinformada visitan a los medicos dos veces mas frecuentemente que los no afectados. Estos pacientes tambien experimentan mas dfas de restriccion de actividad y de confinamiento en la cama en comparacion con otros de su grupo de edad. En un estudio, la mayona de los pacientes sintomaticos quedaron significativamente discapacitados durante un penodo de 8 anos de seguimiento. Massardo et al., Ann Rheum Dis. 48: 893-7 (1989).
[0004] Los farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) siguen siendo la modalidad de tratamiento primario para la osteoartritis. Se desconoce si la eficacia de los AINE depende de sus propiedades analgesicas o antiinflamatorias o de la ralentizacion de los procesos degenerativos en el cartflago. Tambien existe la preocupacion de que los AINE sean perjudiciales para los pacientes. Por ejemplo, los AINE tienen efectos toxicos bien conocidos en el estomago, el tracto gastrointestinal, el hfgado y el rinon. Sin embargo, la aspirina inhibe la smtesis de proteoglicanos y los procesos normales de reparacion cartilaginosa en animales. Un estudio en seres humanos sugirio que la indometacina podna acelerar la descomposicion del cartflago de la cadera. Todos los efectos adversos aparecen mas comunmente en los ancianos, la poblacion mas susceptible a la osteoartritis.
[0005] En la enfermedad conocida comunmente como osteoporosis, un hueso se desmineraliza y se vuelve anormalmente enrarecido. El hueso comprende un componente organico de celulas y matriz asf como un componente inorganico o mineral. Las celulas y la matriz comprenden un armazon de fibras colagenas que esta impregnado con el componente mineral de fosfato de calcio (85%) y carbonato de calcio (10%) que imparte rigidez al hueso. Mientras que se considera generalmente que la osteoporosis afecta a los ancianos, ciertos tipos de osteoporosis pueden afectar a personas de todas las edades cuyos huesos no estan sujetos a estres funcional. En estos casos, los pacientes pueden experimentar una perdida significativa de hueso cortical y esponjoso durante periodos prolongados de inmunizacion. Se sabe que los pacientes ancianos experimentan perdida osea debido al desuso cuando se inmovilizan despues de la fractura de un hueso, lo que puede conducir en ultima instancia a una fractura secundaria en un esqueleto ya osteoporotico. La disminucion de la densidad osea puede conducir al colapso de las vertebras, fracturas de caderas, brazos, munecas, tobillos, asf como dolores incapacitantes. Se necesitan terapias alternativas no quirurgicas para estas enfermedades.
[0006] Campos electromagneticos pulsados (CEMP) y acoplamiento capacitivo (AC) se han utilizado ampliamente para el tratamiento de fracturas que no cicatrizan y los problemas relacionados con la curacion del hueso desde la aprobacion de la Administracion de Alimentos y Farmacos en 1979. La base original para esta forma de terapia era la observacion de que el estres ffsico en el hueso causaba la aparicion de pequenas corrientes electricas que se pensaba que, junto con la deformacion mecanica, eran los mecanismos subyacentes a la transduccion de las tensiones ffsicas en una senal que promueve la formacion osea. Junto con la estimulacion directa del campo electrico que tuvo exito en el tratamiento de no union, tecnologfas no invasivas, utilizando PEMF y acoplamiento capacitivo (donde los electrodos se colocan sobre la piel en la zona de tratamiento) eran efectivas. Los campos electromagneticos pulsados generan pequenas corrientes inducidas (corrientes de Faraday) en el fluido extracelular altamente conductor, mientras que el acoplamiento capacitivo provoca directamente corrientes en los tejidos; Tanto PEMFs como AC imitan las corrientes electricas endogenas.
[0007] Se ha demostrado que las corrientes electricas endogenas, que originalmente se crefa que se debfan a fenomenos que ocurren en la superficie de los cristales en el hueso, se deben primordialmente al movimiento de electrolitos que contienen fluidos en los canales de los huesos que contienen constituyentes organicos con cargas
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negativas fijas, generando lo que se llama "potenciales de transmision". Los estudios de los fenomenos electricos en el cartflago han demostrado un mecanismo mecanico-electrico de transduccion que se asemeja a los descritos en el hueso, que aparecen cuando el carfflago se comprime mecanicamente, provocando el movimiento de fluidos y electrolitos sobre la superficie de cargas negativas fijas en los proteoglucanos y colageno en la matriz del carfflago. Estos potenciales de flujo, al parecer, cumplen una funcion en el carfflago similar a la del hueso y, junto con la deformacion mecanica, conducen a la transduccion de senales que es capaz de estimular la smtesis de condrocitos de los componentes de la matriz.
[0008] La principal aplicacion de corriente directa, acoplamiento capacitivo, y PEMF ha sido en ortopedia en la curacion de fracturas oseas sin union (Brighton et al, J. Bone and Joint Surgery, 63:. 2-13, 1981; Brighton y Pollack, J. Bone and Joint Surgery, 67: 577 - 585, 1985, Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng., 17: 451 - 529 (1989); Bassett et al., J AMA 247: 623 - 8 (1982). Se han notado respuestas clmicas en la necrosis avascular de caderas en adultos y en la enfermedad de Legg-Perthes en ninos. Bassett et al., Clin Orthop 246: 172 - 6 (1989); Aaron et al., Clin Orthop 249: 209 - 18 (1989); Harrison et al., J Pediatry Orthop 4: 579 - 84 (1984). Tambien se ha demostrado que los PEMF (Mooney, Spine, 15: 708-712, 1990) y el acoplamiento capacitivo (Goodwin, Brighton et al., Spine, 24: 1349 - 1356, 1999) pueden aumentar significativamente la tasa de exito de fusiones lumbares. Tambien se ha notado un aumento de la regeneracion y funcion de los nervios perifericos y promocion de la angiogenesis. Bassett, Bioensays 6: 36 - 42 (1987). Los pacientes con tendinitis persistente del manguito rotador frente a la inyeccion de esteroides y otras medidas convencionales, mostraron un beneficio significativo en comparacion con los pacientes tratados con placebo. Binder et al., Lancet 695 - 8 (1984). Finalmente, Brighton et al. han demostrado en ratas la capacidad de un campo electrico de acoplamiento capacitivo apropiado para prevenir y revertir la osteoporosis vertebral en la columna lumbar (Brighton et al., J. Orthop Res. 6: 676-684, 1988; Brighton et al., J. Bone and Joint Surgery, 71: 228-236, 1989).
[0009] Mas recientemente, la investigacion en esta area se ha centrado en los efectos que ha tenido la estimulacion en tejidos y celulas. Por ejemplo, se ha conjeturado que las corrientes directas no penetran las membranas celulares y que el control se logra a traves de la diferenciacion de la matriz extracelular. Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Engng 9: 133 (1983). A diferencia de las corrientes directas, se ha notado que los PEMF pueden penetrar en las membranas celulares y estimularlas o afectar directamente a los organelos intracelulares. Un examen del efecto de la PEMF sobre matrices extracelulares y osificacion endocondral in vivo encontro un aumento de la smtesis de moleculas de cartflago y la maduracion de las trabeculas del hueso. Aaron et al., J. Bone Miner. Res. 4: 227 - 233 (1989). Mas recientemente, Lorich, Brighton et al. notaron (Clin Orthop and Related Research 350: 246-256, 1998) que la transmision de senales de una senal electrica acoplada capacitivamente se realiza a traves de canales de calcio bloqueados por voltaje, lo que conduce a un aumento en el calcio citosolico con un aumento subsiguiente en calmodulina activada (citoesqueleto).
[0010] Muchas investigaciones se han dirigido al estudio del cultivo de tejidos con el fin de comprender los mecanismos de respuesta. En un estudio, se encontro que los campos electricos aumentaron la incorporacion de [3H]-timidina en el ADN de los condrocitos, apoyando la nocion de que flujos de Na y de Ca2+ generados por la smtesis de ADN gatillo de estimulacion electrica. Rodan et al., Science 199: 690 - 692 (1978). Los estudios han encontrado cambios en el segundo mensajero, AMPc y reordenamientos citoesqueleticos debido a perturbaciones electricas. Ryaby et al., Trans. BRAGS 6: (1986); Jones et al., Trans. BRAGS 6: 51 (1986); Brighton y Townsend, J. Orthop. Res. 6: 552-558, 1988. Otros estudios han encontrado efectos sobre glicosaminoglicano, sulfatacion, acido hialuronico, actividad de lisozima y secuencias de polipeptidos. Norton et al., J. Orthop. Res. 6: 685 - 689 (1988); Goodman et al., Proc. Natn. Acad. Sci. USA 85: 3928 - 3932 (1988).
[0011] Se informo en 1996 por los presentes inventores que una cepa mecanica cmlica biaxial del 0,17% produce un aumento significativo de ARNm TGF-G1 en celulas oseas MC3T3- E1 cultivadas. Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 229: 449 - 453 (1996). Varios estudios significativos siguieron en 1997. En un estudio se informo de que la misma cepa mecanica dclica biaxial del 0,17% produce un aumento significativo de PDGF A-ARNm en celulas oseas similares. Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 43: 339 - 346 (1997). Tambien se informo de que un campo electrico de 60 kHz capacitivamente acoplado de 20 mV/cm produjo un aumento significativo de TGF-S1 en celulas oseas similares. Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 237: 225 - 229 (1997). Sin embargo, el efecto que tal campo tendna sobre otros genes no ha sido reportado en la literatura. 0012 * * * * * *
[0012] En el documento WO 01/62336 titulado "regulacion de genes por aplicacion de senales electromagneticas y
electricas espedficas y selectivas," metodos se describieron para la determinacion de las senales electromagneticas y electricas espedficas y selectivas para su uso en la creacion de campos para regular genes diana de tejidos
enfermos o lesionados. La presente invencion se basa en la tecnica descrita en la misma mediante la regulacion de
una expresion genica dirigida, a saber, la expresion genica de agrecano, mediante la aplicacion de un campo
generado por una senal electrica y electromagnetica espedfica y selectiva, para el tratamiento de la enfermedad del
cartflago (artritis), y defectos del cartflago. [0013] El documento WO 01/62336 muestra un dispositivo segun el
preambulo de la reivindicacion 1.
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Resumen de la invencion
[0014] La presente invencion proporciona un dispositivo como se define en la reivindicacion 1. Las reivindicaciones dependientes definen realizaciones preferidas. Aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente descripcion que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invencion. Una senal "espedfica y selectiva" es una senal que tiene caractensticas predeterminadas de amplitud, duracion, ciclo obligatorio, frecuencia y forma de onda que regula positivamente la expresion del gen agrecano (especificidad). Esto permite elegir diferentes senales para aumentar la regulacion de las expresiones genicas Aggrecan con el fin de lograr una determinada respuesta biologica o terapeutica (selectividad).
[0015] Tambien se describe la metodologfa para determinar la senal “espedfica y selectiva" para el gen Aggrecan variando metodicamente la duracion de una senal de partida conocida para aumentar o susceptible de aumentar la produccion celular de agrecano. Despues de seleccionar la duracion optima, la amplitud de la senal se vana durante la duracion optima del tiempo determinada por la expresion genica del agrecano. El ciclo de trabajo, la frecuencia y la forma de onda vanan metodicamente manteniendo constantes las otras caractensticas de la senal. Este proceso se repite hasta que se determina la senal optima que produce el mayor incremento en la expresion de agrecano.
[0016] Estos y otros aspectos de la presente invencion se detallaran en la siguiente descripcion detallada de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
[0017] La presente invencion sera evidente a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion tomada en conjuncion con los dibujos adjuntos, de los cuales:
La Figura 1 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando los condrocitos de cartflago articular estan expuestos a un campo electrico de 20 mV/cm capacitivamente acoplado por varias duraciones de tiempo. Como se indica, la produccion optima de ARNm de agrecano se produjo con una senal de 30 minutos de duracion.
La Figura 2 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando los condrocitos de cartflago articular estan expuestos a diversas amplitudes de un campo capacitivamente acoplado de una duracion de 30 minutos. Como se indica, la produccion optima de ARNm de agrecano se produjo con una senal que produjo una amplitud de campo electrico de 10-20 mV/cm.
La Figura 3 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando condrocitos de cartflago articular se exponen a un campo electrico capacitivamente acoplado de varios ciclos de trabajo con una duracion de 30 minutos (en tiempo) a una amplitud de campo electrico de 20 mV/cm. Como se indica, el ciclo de trabajo optimo es del 50%.
La Figura 4 es una representacion grafica de los condrocitos de cartflago articular expuestos a un campo electrico capacitivamente acoplado de varias frecuencias de duracion de 30 minutos (en tiempo) a una amplitud de campo electrico de 20 mV/cm con un ciclo de trabajo del 50%. Como se indica, la frecuencia optima es de 60 kHz.
La Figura 5 es una representacion grafica de los condrocitos de cartflago articular cultivados durante 7 dfas en cultivo y despues expuestos al campo electrico optimo acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo 50% (duracion de 30 minutos en tiempo), a una frecuencia de 60 kHz, y una configuracion de onda sinusoidal. Interleuquina no estaba presente en los medios de los cultivos y, como se ha indicado, la hexosamina mostro un aumento de 3,5 veces.
La Figura 6 es una representacion grafica de los condrocitos de cartflago articular cultivados durante 7 dfas y expuestos al campo electrico optimo acoplado capacitivamente de 20/cm, ciclo de trabajo mV 50% (30 minutos de duracion en el tiempo), a una frecuencia de 60 kHz, y una configuracion de onda sinusoidal. Interleucina (10 ug/ml) o se anadio IL-p1 a los medios en el dfa 7. Como se indica, hexosamina mostro un aumento de 3,5 veces a pesar de la presencia de interleuquina en los medios de los cultivos.
La Figura 7 es un diagrama que ilustra un dispositivo para el tratamiento de osteoartritis de la rodilla, de acuerdo con una forma de realizacion preferida de la presente invencion.
Descripcion detallada de realizaciones preferidas de la invencion
[0018] La invencion se describira en detalle a continuacion con referencia a las Figuras 1-7. Los expertos en la tecnica apreciaran que la descripcion que se da en la presente memoria con respecto a esas figuras es solo a tftulo de ejemplo y no pretende en modo alguno limitar el alcance de la invencion. Todas las preguntas relacionadas con el alcance de la invencion pueden resolverse haciendo referencia a las reivindicaciones adjuntas. 0019 * * * *
[0019] La presente invencion se basa en el descubrimiento de que la expresion de ciertos genes puede regularse
mediante la aplicacion de campos generados por senales electricas y/o electromagneticas espedficas y selectivas.
En otras palabras, se ha descubierto por los presentes inventores que existe una senal electrica y/o
electromagnetica espedfica que genera un campo para regular cada gen en celulas de hueso, cartflago y otros
tejidos y que estas senales espedficas son capaces de regular espedficamente y selectivamente los genes en
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dichas celulas. En particular, la expresion genica que controla el crecimiento, el mantenimiento, la reparacion y la degeneracion o deterioro de tejidos o celulas puede regularse de acuerdo con la invencion mediante la aplicacion de campos generados por senales electricas y/o electromagneticas espedficas y selectivas para producir un efecto clmico saludable. Tales descubrimientos son utiles en el desarrollo de metodos de tratamiento que se dirigen a ciertas afecciones medicas incluyendo fracturas y defectos oseos, osteoartritis, osteoporosis, cancer y otras enfermedades, as^ como para el desarrollo de dispositivos que emplean tales metodos.
[0020] Como se usa en el presente documento, la frase "senal" se utiliza para referirse a una variedad de senales incluyendo senales mecanicas, senales de ultrasonido, senales electromagneticas y las senales de salida electrica por un dispositivo. Debe entenderse que el termino "campo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un campo electrico dentro del tejido diana, ya sea un campo combinado o un campo electromagnetico pulsado o generado por corriente directa, acoplamiento capacitivo o acoplamiento inductivo.
[0021] La frase "a distancia" se usa para significar actuar, actuado o controlado a distancia. La regulacion "remota" se refiere al control de la expresion de un gen a distancia. Proporcionar "remotamente" se refiere a proporcionar desde una distancia. Por ejemplo, proporcionar una senal espedfica y selectiva desde una fuente remota puede referirse a proporcionar la senal desde una fuente a una distancia del tejido o de una celula o desde una fuente externa o externa al cuerpo.
[0022] La frase senal “espedfica y selectiva" significa una senal que produce un campo electrico que tiene caractensticas de amplitud predeterminadas, duracion, ciclo de trabajo, frecuencia y forma de onda que aumentan o disminuyen un gen diana o se dirigio a genes funcionalmente complementarios (especificidad). Esto permite elegir diferentes senales "espedficas y selectivas" para regular o regular negativamente diversas expresiones genicas con el fin de lograr una determinada respuesta biologica o terapeutica (selectividad).
[0023] El termino "regular" significa controlar la expresion genica Por regular se entiende la inclusion tanto de la regulacion hacia arriba como la regulacion hacia abajo. Regular hacia arribe significa aumentar la expresion de un gen, mientras que regular hacia abajo significa inhibir o prevenir la expresion de un gen.
[0024] "Funcionalmente complementario" se refiere a dos o mas genes cuyas expresiones son complementarios o sinergicos en una celula o tejido dado.
[0025] "Tejido" se refiere a un agregado de celulas junto con sus sustancias extracelulares que forman uno de los materiales estructurales de un paciente. Como se usa en la presente memoria, el termino "tejido" pretende incluir tejido de musculo y organo asf como tejido de hueso o cartflago. Ademas, el termino "tejido" tal como se utiliza en la presente memoria tambien puede referirse a una celula individual.
[0026] "Paciente" se refiere a un animal, preferiblemente un mamifero, mas preferiblemente un ser humano.
[0027] La presente invencion proporciona dispositivos que se dirigen a ciertos tejidos, celulas o enfermedades. En particular, la expresion genica asociada con el proceso de reparacion en tejidos o celulas danadas o enfermas puede regularse por la aplicacion de campos generados por senales electricas que son espedficas y selectivas para que los genes se regulen en los tejidos o celulas diana. La expresion genica puede regularse hacia arriba o regularse hacia abajo mediante la aplicacion de senales que son espedficas y selectivas para cada gen o cada conjunto de genes complementarios con el fin de producir un efecto clmico beneficioso. Por ejemplo, una senal particular y selectiva particular puede crear un campo electrico que regule una determinada expresion genica deseable, mientras que la misma u otra senal espedfica y selectiva particular puede crear un campo electrico que regule hacia abajo una cierta expresion genica deseable. Un cierto gen puede regularse hacia arriba por un campo generado por una senal espedfica y selectiva y regularse hacia abajo por un campo generado por otra senal espedfica y selectiva. Los expertos en la tecnica entenderan que ciertos tejidos enfermos o lesionados pueden ser objeto de tratamiento mediante la regulacion de los genes que gobiernan el crecimiento, el mantenimiento, la reparacion y la degeneracion o deterioro de los tejidos.
[0028] Los dispositivos de la presente invencion se basan en la identificacion de aquellas senales que generen campos que son espedficos y selectivos para la expresion de genes asociados con cierto tejido enfermo o lesionado espedfico. Por ejemplo, la electricidad en sus diversas formas (por ejemplo, acoplamiento capacitivo, acoplamiento inductivo, campos combinados) puede regular espedfica y selectivamente la expresion de genes en tejidos o celulas diana en el cuerpo de un paciente variando la frecuencia, la amplitud, la forma de onda o ciclo de trabajo del campo aplicado para cada gen seleccionado. La duracion del tiempo expuesto a la electricidad tambien puede influir en la capacidad de la electricidad para regular espedficamente y selectivamente la expresion de genes en los tejidos o celulas diana en el cuerpo de un paciente. Las senales espedficas y selectivas pueden generar campos electricos para la aplicacion sistematica de cada gen hasta que se encuentre la combinacion apropiada de frecuencia, amplitud, forma de onda, ciclo de trabajo y duracion que proporcione el efecto deseado sobre la expresion genica. 0029 *
[0029] Se ha de entender que una variedad de tejidos enfermos o lesionados o estados de enfermedad pueden ser
objeto de tratamiento debido a que la especificidad y selectividad de un campo electrico para una determinada
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expresion genica puede ser influenciada por varios factores. En particular, un campo electrico de frecuencia, amplitud, forma de onda y/o ciclo de trabajo apropiados puede ser espedfico y selectivo para la expresion de ciertos genes y proporcionar asf tratamientos espedficos. Los factores temporales (por ejemplo, la duracion del tiempo expuesto al campo electrico) tambien pueden influir en la especificidad y selectividad de un campo electrico para una expresion genica particular. La regulacion de la expresion genica puede ser mas eficaz (o posible) a traves de la aplicacion de un campo electrico durante un tiempo determinado. Por lo tanto, los expertos en la tecnica comprenderan que la presente invencion se destina a variar la frecuencia, la amplitud, la forma de onda, el ciclo de trabajo y/o la duracion de la aplicacion de un campo electrico hasta que se compruebe que el campo electrico es espedfico y selectivo para ciertas expresiones genicas con el fin de proporcionar tratamientos dirigidos a una variedad de tejidos o enfermedades enfermas o lesionadas.
[0030] Asf, la presente invencion puede destinarse a tratamientos espedficos porque es posible regular la expresion de ciertos genes asociados con un tejido enfermo o lesionado particular a traves de la aplicacion de campos generados por senales espedficas y selectivas de frecuencia apropiada, amplitud, forma de onda y/o ciclo de trabajo durante un penodo de tiempo apropiado. La especificidad y la selectividad de una senal que genera un campo electrico pueden influenciarse asf para regular la expresion de ciertos genes con el fin de dirigir ciertos tejidos o estados enfermos o lesionados para el tratamiento. En particular, la presente invencion proporciona el tratamiento dirigido de la osteoartritis, la artritis reumatoide, las lesiones del cartflago y los defectos del cartflago.
[0031] La presente invencion tambien proporciona un dispositivo que incluye una fuente de al menos una senal espedfica y selectiva para la expresion genica de agrecano. Los dispositivos de la presente invencion pueden proporcionar la produccion de tales senales para su aplicacion a celulas de cartflago mediante al menos un electrodo adaptado para aplicar el campo generado por la senal espedfica y selectiva.
[0032] El dispositivo de la presente invencion es capaz de aplicar un campo generado por senales espedficas y selectivas directamente al tejido enfermo o lesionado y/o a la piel de un paciente. El dispositivo de la presente invencion tambien puede proporcionar la aplicacion remota de campos espedficos y selectivos (por ejemplo, aplicacion de un campo a una distancia de tejido enfermo o lesionado), aunque se apreciara que los dispositivos acoplados capacitivamente deben tocar la piel. El dispositivo de la presente invencion puede incluir medios para unir los electrodos al cuerpo de un paciente en las proximidades de tejido lesionado o enfermo. Por ejemplo, electrodos conductores de auto-adherente pueden estar unidos a la piel del paciente en ambos lados de una articulacion de rodilla que padece osteoartritis, como se muestra en la Figura 7. Como tambien se muestra en la Figura 7, el dispositivo 10 de la presente invencion puede incluir electrodos de auto-adherente 12 para unir el dispositivo 10 en el cuerpo de un paciente. Por ejemplo, el dispositivo 10 de la presente invencion, puede incluir electrodos 12 unidos a una unidad de potencia 14 que tiene un parche VELCRO® 16 en el lado inverso de tal manera que la unidad de potencia 14 se pueda unir a una correa VELCRO® (no mostrada) ajustada alrededor de la pantorrilla, el muslo o la cintura del paciente.
[0033] El dispositivo 10 de la presente invencion se pueden emplear en una variedad de maneras. El dispositivo 10 puede ser portatil o puede estar temporalmente o permanentemente unido al cuerpo de un paciente. El dispositivo 10 de la presente invencion es preferiblemente no invasivo. Por ejemplo, el dispositivo 10 de la presente invencion puede aplicarse a la piel de un paciente mediante la aplicacion de electrodos adaptados para el contacto con la piel de un paciente para la aplicacion de campos generados por las senales espedficas y selectivas predeterminadas. Tales senales pueden aplicarse tambien a traves de bobinas en las que fluyen corrientes variables en el tiempo, produciendo campos electromagneticos espedficos y selectivos que penetran en el tejido. El dispositivo 10 de la presente invencion tambien puede ser capaz de implantacion en un paciente, incluyendo la implantacion bajo la piel de un paciente.
[0034] El siguiente ejemplo ilustrara que la presente invencion puede destinarse al crecimiento y reparacion del cartflago. El crecimiento y reparacion del cartflago puede estimularse mediante senales espedficas y selectivas para la regulacion de la expresion de agrecano en las celulas del cartflago para estimular la reparacion del cartflago en pacientes con osteoartritis. En particular, la presente invencion puede proporcionar la regulacion ascendente de genes de agrecano que reparan el cartflago. Una variedad de celulas de cartflago puede ser atacada por los metodos de la presente invencion incluyendo condrocitos articulares e incluyendo cartflago articular, cartflago hialino y cartflago de placa de crecimiento.
[0035] El ejemplo siguiente ilustra ademas que la presente invencion preve la regulacion de la expresion genica en condrocitos articulares. Por ejemplo, en el ejemplo siguiente, los condrocitos articulares fetales se han expuesto a un campo electrico de 60 kHz acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante 0,5, 2,0, 6,0 y 24,0 horas. Una incorporacion estadfsticamente significativa de 35SO4/ug de ADN (lo que indica una smtesis de proteoglicanos significativa) se encontro despues de solo 0,5 horas de estimulacion. Se repitio un experimento identico y se monitorizaron los niveles de ARNm de agrecano, el mensajero para el proteoglicano del cartflago principal. Despues de solo 0,5 horas de estimulacion electrica, hubo un aumento significativo (casi 100%) en ARNm de agrecano. En consecuencia, los factores temporales pueden influir en la especificidad y selectividad de una senal que genera campos electricos para regular la expresion genica en condrocitos articulares.
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[0036] Los expertos en la tecnica entenderan que una variedad de otras enfermedades de cartflago y lesiones pueden ser objeto de tratamiento a traves de la presente invencion.
[0037] Los expertos en la tecnica entenderan ademas que los dispositivos de la presente invencion pueden proporcionarse en una variedad de formas, incluyendo una unidad de potencia acoplada capacitivamente con multiples senales espedficas y selectivas conmutables programadas para aplicacion a un par o a multiples pares de electrodos, bobinas electromagneticas unidas a una unidad de potencia con senales conmutables multiples y selectivas. En terminos generales, la preferencia del dispositivo se basa en la aceptacion del paciente y la conformidad del paciente. La unidad mas pequena y mas portatil disponible en la tecnica en la actualidad es una unidad de acoplamiento capacitiva; Sin embargo, los pacientes con piel extremadamente sensible pueden preferir el uso de unidades de acoplamiento inductivo.
Ejemplo
[0038] La invencion se demuestra en el siguiente ejemplo, el cual es para fines de ilustracion y no se pretende limitar el alcance de la presente invencion.
Materiales y metodos
[0039] Cultivos de condrocitos se prepararon a partir de cartflago articular fetal bovino. Los condrocitos (5 x 105 celulas/cm2) se sembraron en placas de Cooper especialmente modificadas. Las celulas se hicieron crecer hasta siete dfas con el medio cambiado justo antes del comienzo de la condicion experimental. Los cultivos celulares experimentales a lo largo de estos estudios se sometieron a un campo electrico de senal de onda sinusoidal de 60 kHz acoplado capacitivamente con una salida de 44,81 voltios pico a pico. Esto produjo una intensidad de campo calculada en el medio de cultivo en las placas de 20 mV/cm con una densidad de corriente de 300 pA/cm2. Las capsulas de cultivo de celulas de control eran identicas a las de las placas estimuladas excepto que los electrodos no estaban conectados a un generador de funciones.
[0040] El ARN total se aislo utilizando TRIzol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se realizo transcripcion inversa usando transcriptasa inversa de Superscript II. Los cebadores de oligonucleotidos que se utilizaran en la tecnica de PCR competitiva se seleccionaron de las secuencias de ADNc publicadas. El analisis cuantitativo de los productos de PCR se realizo con el software ScionImage.
[0041] La senal optima para la regulacion genica deseada se encontro sistematicamente de la siguiente manera. Se toma como senal de partida para determinar la senal espedfica para generar el campo para la expresion genica (ARNm) de esa protema una senal electrica que se sabe que aumenta (o incluso se sospecha que aumenta) la produccion celular de una protema dada. Una curva de dosis-respuesta se realiza primero mediante la variacion de la duracion de la senal mientras que se mantienen constantes todas las caractensticas de la senal (amplitud, ciclo de servicio, frecuencia y forma de onda) (Figura 1). Esto determina la duracion optima de la senal de partida para la expresion genica de esa protema. Se realiza una segunda curva de dosis-respuesta variando la amplitud del campo para la duracion optima del tiempo (Figura 2). Esto determina la amplitud optima del campo para la duracion optima del tiempo determinada por la expresion genica de la protema de interes. Se realiza una tercera curva de dosis- respuesta, variando esta vez el ciclo de servicio del 100% (constante) al 1% o menos mientras que se mantiene constante la amplitud optima y otras caractensticas de la senal (Figura 3). Una respuesta a la dosis se repite una cuarta vez (frecuencia variable) (Figura 4) y una quinta vez (forma de onda variable) manteniendo constante la otra caractenstica de la senal. Mediante este metodo se determina una senal optima para producir el mayor incremento en la expresion genica de la protema de interes.
[0042] La expresion de protemas se puede determinar por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como la PCR de transcriptasa inversa, analisis de Northern, inmunoensayos, y similares.
Produccion de agrecano por condrocitos articulares
[0043] Condrocitos articulares fueron expuestos a un campo electrico capacitivamente acoplado de 20 mV/cm a 60 kHz. Los resultados se ilustran en las Figuras 1-4.
La Figura 1 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando los condrocitos de cartflago articular (attomol por pl) se exponen a un campo electrico 20 mV/cm acoplado capacitivamente para el varias duraciones de tiempo (0,5, 2, 6, y 24 horas). Tal como se indica, la produccion optima de ARNm de agrecano (un aumento de casi dos veces) se produjo con una senal de duracion de 30 minutos.
La Figura 2 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando condrocitos de cartflago articular (attomol por pl) estan expuestos a diversas amplitudes (1, 5, 10, 20, y 40 mV/cm) de un campo acoplado capacitivamente de 30 minutos de duracion. Tal como se indica, la produccion optima de ARNm de agrecano ocurrio con una senal que produce una amplitud de campo electrico de 10-20 mV/cm.
La Figura 3 es una representacion grafica de la expresion de ARNm de agrecano cuando condrocitos de cartflago articular (attomol por pl) se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de diversos ciclos
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La Figura 4 es una representacion grafica de los condrocitos de cartflago articular (attomol por pl) expuestos a un campo electrico acoplado capacitivamente de varias frecuencias (30 kHz, 60 kHz, y 120 kHz) de una duracion de 30 minutos (en el tiempo) en una amplitud de campo electrico de 20 mV/cm con un ciclo de trabajo del 50%. Tal como se ha indicado, la frecuencia optica es 60 kHz.
La Figura 5 es una representacion grafica de condrocitos de cartflago articular cultivados durante 7 dfas en cultivo y a continuacion se exponen al campo electrico optimo acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo del 50% (duracion de 30 minutos en el tiempo), a una frecuencia de 60 kHz, y una configuracion de onda senoidal. Los condrocitos fueron expuestos a este campo durante 1 hora al dfa durante 7 dfas. Los condrocitos de control se cultivaron en las mismas condiciones pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. Ninguna interleuquina, una citoquina que degrada el cartflago articular, estaba presente en los medios de los cultivos. Como se indica en la Figura 5, hexosamina, una protema cuya smtesis es estimulada y regulada por ARNm de agrecano y es el principal constituyente de proteoglicano, mostro un aumento de 3,5 veces cuando se expone al campo electrico aplicado en comparacion con los condrocitos de control que no fueron expuestos al campo electrico.
La Figura 6 es una representacion grafica de los condrocitos de cartflago articular cultivados durante 7 dfas, despues se expuso al campo electrico optimo acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo de 50% (duracion de 30 minutos en el tiempo), a una frecuencia de 60 kHz, y una configuracion de onda senoidal. Interleucina (10 ug/ml) o IL-p1 se anadio a los medios en el dfa 7. Los condrocitos fueron expuestos a este campo durante 1 hora por dfa durante 7 dfas. Condrocitos de control se cultivaron bajo las mismas condiciones con interleucina en los medios, pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. Como se indica en la Figura 6, a pesar de la presencia de interleuquina en los medios de los cultivos, hexosamina, una protema cuya smtesis es estimulada y regulada por ARNm de agrecano y es el principal constituyente de proteoglicano, todavfa mostraron un aumento de 3,5 veces cuando se expusieron al campo electrico aplicado en comparacion con los cultivos de control que no se expusieron al campo electrico.
La Figura 7 ilustra un dispositivo 10 de acuerdo con la presente invencion que se utiliza para tratar a un paciente con osteoartritis de la rodilla. Tal como se ilustra, dos electrodos circulares, auto-adherentes, conductivos blandos 12 se colocan sobre la piel a cada lado de la rodilla en el nivel de la lmea de la articulacion. Los electrodos 12 estan unidos a una unidad de potencia 14 que tiene un parche VELCRO® 16 en el lado inverso de tal manera que la unidad de potencia 14 pueda estar unida a una correa de VELCRO® (no mostrada) montada alrededor de la pantorrilla, el muslo o la cintura. Los electrodos 12 pueden colocarse sobre la piel antes de que el paciente vaya a la cama cada noche o en cualquier otro momento conveniente. Por supuesto, tambien se pueden utilizar otros tipos adecuados de electrodos 12.
[0044] La unidad de potencia 14 es preferiblemente pequena (por ejemplo, 6-8 onzas) y alimentada por una batena estandar de 9 voltios para emitir un pico a pico de 5 voltios, 6-10 mAmp, 20 mV/cm, senal de onda sinusoidal de 60 kHz a los electrodos 12 colocados en la piel. Cuando se proporciona esta senal de aproximadamente 30 minutos por dfa con el ciclo de trabajo adecuado (50%), se ha demostrado que regula significativamente hacia arriba los genes que codifican agrecano. Este tratamiento debe evitar o minimizar el deterioro adicional del cartflago articular, asf como sanar el cartflago articular que ya esta danado o degenerado.
[0045] El ejemplo descrito anteriormente demuestra que la expresion del gen de agrecano puede regularse significativamente hacia arriba para aumentar la produccion de proteoglicano en el cartflago articular asf como para tratar la artritis (tanto la osteoartritis como la artritis reumatoide), lesiones del cartflago, y los defectos del cartflago. Proteoglicano, junto con colageno de tipo II, es el principal constituyente del cartflago articular y se degrada y se destruye en las etapas iniciales del desarrollo de la artritis. La presente invencion muestra claramente que el campo electrico optimo descrito en el ejemplo puede regular el ARNm de agrecano muy significativamente hacia arriba y, por lo tanto, incrementar la smtesis de proteoglicanos, incluso en presencia de IL-p1. Los expertos en la tecnica apreciaran que un campo electrico adecuado, como se describe aqrn con acoplamiento capacitivo, tambien es igualmente eficaz con cualquier y todos los sistemas electromagneticos que producen caractensticas de campo electrico equivalentes, o casi equivalentes. Los expertos en la tecnica tambien apreciaran que caractensticas de senal mas particularizadas pueden descubrirse a traves de mas experimentacion con mas datos (por ejemplo, un ciclo de trabajo de 50+3% durante 30+3 minutos), pero se cree que tales variaciones relativamente menores en cada una de las caractensticas de la senal estan dentro del nivel de los expertos en la tecnica, dada la informacion aqrn descrita.
[0046] Los expertos en la tecnica tambien apreciaran que otras numerosas modificaciones a la invencion son posibles dentro del alcance de la invencion. Por ejemplo, el campo optimo descrito en este documento puede ser aplicado a cualquier articulacion a traves de dos o mas electrodos de superficie apropiados, en parejas o en tiras, incorporados en prendas de vestir, tirantes, envolturas, o moldes, y administrados por medio de acoplamiento capacitivo, acoplamiento inductivo (campos electromagneticos), o campos combinados. De acuerdo con ello, no se pretende que el alcance de la invencion este limitado a la realizacion preferida descrita anteriormente, sino solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (6)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Un dispositivo para el tratamiento de la osteoartritis, la artritis reumatoide, lesion de cartHago y/o defectos de cartHago que comprenden:una fuente de senal que genera al menos una senal espedfica y selectiva que tiene una configuracion de onda sinusoidal yelectrodos o bobinas conectadas a la fuente de senal para recibir al menos una senal espedfica y selectiva y que estan operativamente dispuestos con respecto al tejido de cartHago diana, causando dichos electrodos o bobinas, tras la recepcion de dicha al menos una senal espedfica y selectiva, la generacion de un campo que tiene una amplitud de aproximadamente 10-20 mV/cm en el tejido de cartHago diana a 60 kHz, siendo dicho campo espedfico y selectivo para regular hacia arriba la expresion genica de ARNm en agrecano en dicho tejido de cartHago diana, caracterizandose porque:dicha fuente de senal esta configurada para aplicar dicha al menos una senal espedfica y selectiva aplicadaa dichos electrodos o bobinas con aproximadamente un ciclo de trabajo del 50% durante 30 ci- clos de unminuto de encendido y un minuto de apagado, a fin de regular selectivamente hacia arriba la expresion genica de ARNm de agrecano en dicho tejido de cartHago diana como resultado de la aplicacion del campo espedfico y selectivo.
- 2. El dispositivo de la reivindicacion 1 que comprende ademas una unidad de energfa portatil que impulsa dicha fuente de senal.
- 3. El dispositivo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 que comprende ademas medios para la fijacion de los electrodos o bobinas a un cuerpo de un paciente en la proximidad del tejido de cartHago.
- 4. El dispositivo de cualquier reivindicacion precedente que comprende ademas medios para unir la fuente de senal a un cuerpo de un paciente.
- 5. El dispositivo de cualquier reivindicacion precedente en el que el campo electrico generado por dichos electrodoso bobinas como respuesta a la aplicacion de dicha al menos una senal espedfica y selectiva a dicho tejido decartHago diana a traves de uno de acoplamiento capacitivo y el acoplamiento inductivo.
- 6. El dispositivo de cualquier reivindicacion precedente, en el que la fuente de senal esta configurado para aplicar dicha al menos una senal espedfica y selectiva a dichos electrodos o bobinas una vez al dfa.
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