ES2622733T3 - Amplificación de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Un método para amplificar un genoma completo, cuyo método comprende, exponer células a condiciones alcalinas para formar un lisado celular, en donde el lisado celular comprende un genoma completo, reducir el pH del lisado celular para formar el lisado celular estabilizado, e incubar el lisado celular estabilizado en condiciones que promueven la replicación del genoma, en donde la replicación del genoma da lugar a cadenas replicadas en donde, durante la replicación, al menos una de las cadenas replicadas se desplaza del genoma mediante replicación por desplazamiento de cadena de otra cadena replicada.
Description
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Los ácidos nucleicos diana pueden incluir ADN dañado y muestras de ADN dañado. Por ejemplo, la preparación de muestras de ADN genómico puede provocar daño al ADN genómico (por ejemplo, degradación y fragmentación). Esto puede hacer que la amplificación del genoma o secuencias en este sea más difícil y proporciona menos resultados confiables (por ejemplo, provocando la amplificación de muchas secuencias genómicas fragmentadas y parciales). El ADN dañado y las muestras de ADN dañado son, por lo tanto, útiles para el método descrito para amplificar el ADN dañado. Se puede utilizar cualquier ADN degradado, fragmentado o de otra manera dañado o muestra que contenga dicho ADN en el método descrito.
1. Secuencias diana para la amplificación por desplazamiento de cadena
Aunque se pueden amplificar múltiples sitios en una muestra de ácido nucleico de forma simultánea en la misma reacción de MSDA, para simplificar, el siguiente análisis hará referencia a las características de una única secuencia de ácido nucleico de interés que será amplificada. Esta secuencia se denomina en la presente «secuencia diana». Se prefiere que una secuencia diana para la MSDA incluya dos tipos de regiones diana, una diana de amplificación y una diana de hibridación. La diana de hibridación incluye las secuencias en la secuencia diana que son complementarias a los cebadores en un conjunto de cebadores. La diana de amplificación es la parte de la secuencia diana que se debe amplificar. Con esta finalidad, la diana de amplificación es preferiblemente posterior o está flanqueada por la o las dianas de hibridación. No hay ningún requisito estructural o secuencia específica para elegir una secuencia diana. La diana de hibridación y la diana de amplificación dentro de la secuencia diana se definen en términos de la relación de la secuencia diana con respecto a los cebadores en un conjunto de cebadores. Los cebadores están diseñados para que coincidan con la secuencia diana elegida. Aunque se prefiere, no es necesario que las secuencias que se van a amplificar y los sitios de hibridación de los cebadores estén separados, dado que se amplificarán las secuencias en los sitios y alrededor de estos donde se hibridan los cebadores.
En la amplificación por desplazamiento de cadena múltiple del ADN circularizado, los fragmentos de ADN circulares son las dianas de amplificación. Las dianas de hibridación incluyen las secuencias que son complementarias a los cebadores utilizados para la amplificación. Una forma de ADN circular para la amplificación es el ADNc circularizado.
En la amplificación por desplazamiento de cadena múltiple del ADN concatenado con enlazadores, los fragmentos de ADN unidos por los enlazadores son las dianas de amplificación y los enlazadores son la diana de hibridación. Las dianas de hibridación (es decir, los enlazadores) incluyen las secuencias que son complementarias a los cebadores utilizados para la amplificación. Una forma de ADN concatenado para la amplificación es el ADNc concatenado.
B. Cebadores
Los cebadores para uso en el método de amplificación descrito son oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria a la secuencia diana. A esta secuencia se la conoce como la parte complementaria del cebador. La parte complementaria de un cebador puede tener cualquier longitud que apoye la hibridación específica y estable entre el cebador y la secuencia diana conforme a las condiciones de reacción. Generalmente, para las reacciones a 37 °C, esta puede tener una longitud de 10 a 35 nucleótidos o una longitud de 16 a 24 nucleótidos. Para la amplificación del genoma completo, los cebadores pueden tener una longitud de 5 a 60 nucleótidos, y en particular, pueden tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y/o 20 nucleótidos.
Para algunas formas del método descrito, tales como aquellas que usan cebadores o secuencia degenerada o aleatoria (es decir, el uso de una colección de cebadores que tienen una variedad de secuencias), la hibridación de cebadores no necesita ser específica. En dichos casos, los cebadores necesitan ser efectivos solamente en la síntesis de cebado. Por ejemplo, en la amplificación del genoma completo la especificidad del cebado no es esencial dado que el objetivo, por lo general, es simplificar todas las secuencias por igual. Los conjuntos de cebadores aleatorios o degenerados pueden estar compuestos por cebadores de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y/o 20 nucleótidos de longitud o más. A los cebadores de seis nucleótidos de longitud se los conoce como cebadores hexámeros. Los cebadores preferidos para la amplificación del genoma completo son cebadores hexámeros aleatorios, por ejemplo, cebadores hexámeros aleatorios donde cada posible secuencia de seis nucleótidos está representada en el conjunto de cebadores. De manera similar, los conjuntos de cebadores aleatorios de otras longitudes particulares, o de una mezcla de longitudes contienen preferiblemente cada secuencia posible la longitud del cebador o, en particular, la longitud de la parte complementaria del cebador. Se describe el uso de los cebadores aleatorios en la patente estadounidense N.° 5,043,272 y la patente estadounidense N.° 6,214,587.
Los cebadores descritos pueden presentar uno o más nucleótidos modificados. En la presente se hace referencia a dichos cebadores como cebadores modificados. Los cebadores modificados presentan varias ventajas. En primer lugar, algunas formas de cebadores modificados, tal como los cebadores quiméricos de ARN/2’-0-metilo ARN, tienen una mayor temperatura de fusión (Tm, por sus siglas en inglés) que los cebadores de ADN. Esto aumenta la estabilidad de la hibridación del cebador y aumentará la invasión de cadena por parte de los cebadores. Esto conducirá a un cebado más eficiente. Además, dado que los cebadores están hechos de ARN, estos serán resistentes a la exonucleasa. Dichos cebadores, si se etiquetan con aglutinantes de surco menor en su extremo 5’ tendrán también una mejor invasión de la cadena de ADNcd de plantilla. Además, los cebadores de ARN pueden ser
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5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.
Los análogos de nucleótidos también pueden modificarse en el resto fosfato. Los restos fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que pueden ser modificados de forma tal que el enlace entre dos nucleótidos contenga un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosforotriéster, aminoalquilfosforotriéster, fosfonatos de metilo y otros alquilos que incluyen 3'alquilenfosfonato y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Se entiende que estos enlaces fosfato o fosfato modificados entre dos nucleótidos pueden establecerse a través de un enlace 2'-5’ o enlace 3’-5’, y el enlace puede contener polaridad inversa, tal como 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas ácidas libres. Gran cantidad de patentes estadounidenses presentan información relativa a la producción y el uso de fosfatos modificados que contienen nucleótidos, e incluyen pero no se limitan a 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 y 5,625,050, cada una de las que se incorpora en la presente por referencia.
Se entiende que solo es necesario que los análogos de nucleótidos contengan una única modificación, pero también pueden contener múltiples modificaciones en uno de los restos o entre restos diferentes.
Los sustitutos de nucleótidos son moléculas con propiedades funcionales similares a las de los nucleótidos, pero que no contienen un resto fosfato, tal como un ácido péptidonucleico (PNA, por sus siglas en inglés). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán ácidos nucleicos complementarios y que se hibridarán con ellos conforme al modelo de Watson y Crick o al de Hoogsteen, pero que se enlazan entre sí a través de un resto diferente a un resto fosfato. Los sustitutos de nucleótidos tienen la capacidad de conformar una estructura tipo doble hélice al interactuar con el ácido nucleico diana adecuado.
Los sustitutos de nucleótidos son nucleótidos o análogos de nucleótidos en los que se reemplazó el resto fosfato y/o los restos de azúcares. Los sustitutos de nucleótidos no contienen un átomo de fósforo estándar. Por ejemplo, los sustitutos de fosfato pueden ser enlaces internucleosídicos cicloalquilo o alquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos cicloalquilo o alquilo y heteroátomos mezclados, o uno o más enlaces internucleosídicos heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos con enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes N, O, S y CH2 mezcladas. Gran cantidad de patentes estadounidenses describen formas de producción y de uso de dichos tipos de reemplazos de fosfatos e incluyen pero no se limitan a5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 y 5,677,439, cada una de las que se incorpora en la presente por referencia.
También se entiende que en un sustituto de nucleótido tanto los restos azúcares como fosfato del nucleótido pueden ser reemplazados, por ejemplo, por un enlace tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Las patentes estadounidenses 5,539,082; 5,714,331 y 5,719,262 indican cómo producir y utilizar moléculas de PNA, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia. (Véase también Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)).
Los cebadores pueden comprender nucleótidos y pueden producirse a partir de diferentes tipos de nucleótidos o del mismo tipo de nucleótidos. Por ejemplo, uno o más de los nucleótidos en un cebador pueden ser ribonucleótidos, 2'O-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil ribonucleótidos; aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 % de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil ribonucleótidos; aproximadamente 50 % o más de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil ribonucleótidos; o todos los nucleótidos son ribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil ribonucleótidos. Los nucleótidos pueden comprender bases (es decir, la parte básica del nucleótido) y pueden comprender diferentes tipos de bases (y, normalmente, los comprenderán). Por ejemplo, una o más de las bases pueden ser bases universales, tales como 3-nitropirrolo o 5-nitroindolo; aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 % de las bases pueden ser bases universales; aproximadamente 50 % o más de las bases pueden ser bases universales, o todas las bases pueden ser bases universales.
Los cebadores pueden, pero no necesariamente, incluir además una secuencia adicional en el extremo 5’ del cebador que no es complementario a la secuencia diana. A esta secuencia se la conoce como parte no complementaria del cebador. La parte no complementaria del cebador, si se encuentra presente, sirve para facilitar el desplazamiento de cadena durante la replicación del ADN. La parte no complementaria del cebador puede incluir además una secuencia funcional tal como un promotor para la ARN polimerasa. La parte no complementaria de un cebador puede tener cualquier longitud, pero, por lo general, tiene una longitud de 1 a 100 nucleótidos y
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preferiblemente una longitud de 4 a 8 nucleótidos. El uso de una parte no complementaria no se prefiere cuando se utilizan cebadores aleatorios o parcialmente aleatorios para la amplificación del genoma completo.
1. Cebadores para la amplificación por desplazamiento de cadena del genoma completo
En el caso de la amplificación por desplazamiento de cadena del genoma completo, se prefiere utilizar un conjunto de cebadores con secuencias de nucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios. En una muestra de ácido nucleico de complejidad considerable o significativa, que es la secuencia diana preferida para la WGSDA, no es necesario conocer las secuencias de ácido nucleico específicas presentes en la muestra y no es necesario diseñar cebadores para que sean complementarios a cualquier secuencia particular. En vez de eso, la complejidad de la muestra de ácido nucleico da lugar a una gran cantidad de secuencias diana de hibridación diferente en la muestra, que serán complementarias a diversos cebadores de secuencia aleatoria o parcialmente aleatoria. La parte complementaria de los cebadores para uso en la WGSDA puede estar completamente aleatorizada, puede tener solo una parte que esté aleatorizada o puede estar de otra manera selectivamente aleatorizada.
La cantidad de posiciones de bases aleatorias en la parte complementaria de los cebadores son preferiblemente de 20 % a 100 % de la cantidad total de nucleótidos en la parte complementaria de los cebadores. Más preferiblemente, la cantidad de posiciones de bases aleatorias son de 30 % a 100 % de la cantidad total de nucleótidos en la parte complementaria de los cebadores. Más preferiblemente, la cantidad de posiciones de bases aleatorias son de 50 % a 100 % de la cantidad total de nucleótidos en la parte complementaria de los cebadores. Los conjuntos de cebadores con secuencias aleatorias o parcialmente aleatorias pueden sintetizarse usando técnicas estándar que permiten la adición de cualquier nucleótido en cada posición a aleatorizar. Además, se prefiere que los conjuntos de cebadores estén compuestos por cebadores con longitud y/o características de hibridación similares.
2. Cebadores para la amplificación por desplazamiento de cadena múltiple
En el caso de la amplificación por desplazamiento de cadena múltiple, la parte complementaria de cada cebador está diseñada para ser complementaria a la diana de hibridación en la secuencia diana. En un conjunto de cebadores, se prefiere que la parte complementaria de cada cebador sea complementaria a una parte diferente de la secuencia diana. Es más preferible que los cebadores en el conjunto sean complementarios a los sitios adyacentes en la secuencia diana. Se prefiere además que dichos sitios adyacentes en la secuencia diana se encuentren adyacentes también a la diana de amplificación en la secuencia diana.
Se prefiere que, cuando se hibridan con una secuencia diana, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros. Se prefiere que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 5 bases. Es más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 10 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 20 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 30 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 40 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en al menos 50 bases.
Se prefiere que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en no más de aproximadamente 500 bases. Es más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en no más de aproximadamente 400 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en no más de aproximadamente 300 bases. Es incluso más preferible que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en no más de aproximadamente 200 bases. Se contempla específicamente cualquier combinación de los límites inferiores y superiores preferidos de la separación descrita anteriormente, inclusive todos los intervalos intermedios. Cuando se hibridan, no es necesario separar a los cebadores unos de otros en un conjunto de cebadores en la misma cantidad de bases. Se prefiere que, cuando se hibridan, los cebadores en un conjunto de cebadores se encuentren separados unos de otros en aproximadamente la misma cantidad de bases.
La distancia de separación óptima entre los cebadores no será la misma para todas las ADN polimerasas, dado que este parámetro depende de la velocidad de polimerización neta. Una ADN polimerasa procesiva tendrá una velocidadde polimerización característica que puede oscilar entre 5 y 300 nucleótidos por segundo y puede verse influenciada por la presencia o ausencia de proteínas de unión al ADN monocatenario y helicasas accesorias. En el caso de una polimerasa no procesiva la velocidadde polimerización neta dependerá de la concentración enzimática dado que a mayores concentraciones hay más eventos de reiniciación y, por lo tanto, la velocidadde polimerización neta aumentará. Un ejemplo de una polimerasa procesiva es la ADN polimerasa Φ29, que sigue a 50 nucleótidos por segundo. Un ejemplo de una polimerasa no procesiva es la ADN polimerasa Vent exo(-) que proporcionará velocidades de polimerización de 4 nucleótidos por segundo a una baja concentración o de 16 nucleótidos por segundo a concentraciones más altas.
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aproximadamente 900 mM o aproximadamente 1 M.
La solución de lisis puede estar compuesta por múltiples soluciones y/o componentes que pueden agregarse a células de forma separada o combinada en diferentes combinaciones antes de la adición a las células. Por lo tanto, por ejemplo, puede agregarse una solución de 400 mM de KOH y 10 mM de EDTA y una solución de 100 mM de ditiotreitol a las células de forma separada. De manera similar, los kits descritos pueden estar compuestos por múltiples soluciones y/o componentes que se combinarán a efectos de formar una solución de lisis antes de la adición a las células o para una adición separada a las células.
D. Solución de estabilización
En el método descrito, el pH del lisado celular puede reducirse para formar un lisado celular estabilizado. Una solución de estabilización es generalmente una solución que reduce el pH de un lisado celular expuesto a condiciones alcalinas como se describe en otra parte en la presente. En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender un ácido. Los ácidos útiles incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido acetilsalicílico, ácido ascórbico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido nítrico, ácido perclórico, HF, HBr, HI, H2S, HCN, HSCN, HCIO, ácido monocloroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético y cualquier ácido carboxílico (etanoico, propanoico, butanoico, etc., que incluye ambos ácidos carboxílicos de cadena lineal o ramificada). En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender un tampón. Los tampones útiles incluyen Tris-HCl, HEPES, tampones «Good» (tales como BES, BICINE, CAPS, EPPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TAPS, TES y TRICINE), cacodilato de sodio, citrato de sodio, acetato de trietilamonio, bicarbonato de trietilamonio, Tris, Bis-tris y Bis-tris propano. Las formulaciones de soluciones de estabilización útiles incluyen solución de estabilización que comprende 800 mM de Tris-HCl; solución de estabilización que comprende 800 mM de Tris-HCl a pH 4,1, y solución de estabilización que consiste en 800 mM de Tris-HCl, pH 4,1.
En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender múltiples agentes ácidos. Tal como se utiliza en la presente, un agente ácido es un compuesto, composición o solución que forma un ácido en solución. En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender múltiples agentes amortiguadores. Un agente amortiguador ácido es un agente amortiguador que forma un ácido en solución. En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender una combinación de uno o más ácidos, agentes ácidos, tampones y agentes amortiguadores.
Un lisado celular estabilizado es un lisado celular cuyo pH se encuentra en el intervalo neutro (de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente pH 9,0). Los lisados celulares estabilizados útiles tienen un pH que permite la replicación de los ácidos nucleicos en el lisado celular. Por ejemplo, el pH del lisado celular estabilizado es útil a un pH en el que puede funcionar la ADN polimerasa. El pH del lisado celular puede reducirse mezclando el lisado celular con una solución de estabilización.
La cantidad de solución de estabilización mezclada con el lisado celular puede ser la cantidad que provoca una reducción en el pH hasta el intervalo neutro (u otro valor de pH deseado). Generalmente, este volumen estará directamente deteriminado por el pH de la mezcla de solución de estabilización/lisado celular. Por lo tanto, puede determinarse generalmente la cantidad de solución de estabilización que se mezcla con el lisado celular a partir del volumen del lisado celular, su pH y capacidad amortiguadora y la concentración ácida de la solución amortiguadora. Por ejemplo, se necesitaría un volumen más pequeño de una solución de estabilización con un ácido más fuerte y/o mayor concentración de ácido para reducir el pH de forma suficiente que el volumen que se necesita de una solución de estabilización con un ácido más débil y/o menor concentración de ácido. La solución de estabilización puede formularse de modo que el lisado celular se mezcle con un volumen igual de la solución de estabilización (para producir el pH deseado).
Por ejemplo, las soluciones de estabilización pueden ser soluciones que tienen un pH de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,5, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,0, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,0, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,5, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,5, de aproximadamente 3,0 a
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desnaturalización. En algunas realizaciones, la solución de desnaturalización puede comprender un tampón. Los tampones útiles incluyen tampones de fosfato, tampones «Good» (tales como BES, BICINE, CAPS, EPPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TAPS, TES y TRICINE), cacodilato de sodio, citrato de sodio, acetato de trietilamonio, bicarbonato de trietilamonio, Tris, Bis-tris y Bis-tris propano. La solución de desnaturalización puede comprender múltiples agentes amortiguadores. Tal como se utiliza en la presente, un agente amortiguador es un compuesto, composición o solución que actúa como un tampón. Un agente amortiguador alcalino es agente amortiguador que provoca condiciones alcalinas. En algunas realizaciones, la solución de desnaturalización puede comprender una combinación de una o más bases, agentes básicos, tampones y agentes amortiguadores.
La cantidad de solución de desnaturalización mezclada con las muestras de ADN puede ser esa cantidad que provoca, en combinación con otras condiciones tales como calentamiento, la desnaturalización sustancial del ADN en la muestra de ADN. Generalmente, este volumen estará directamente determinado por el pH, la fuerza iónica y la temperatura de la muestra/ mezcla de solución de desnaturalización.
Por lo tanto, la cantidad de solución de desnaturalización para mezclar con las muestras de ADN puede determinarse generalmente a partir del volumen de la muestra de ADN, la concentración alcalina del amortiguador de desnaturalización y la temperatura a la que se calentará la mezcla resultante. Por ejemplo, a una temperatura determinada, se necesitaría un volumen más pequeño de una solución de desnaturalización con una base más fuerte y/o mayor concentración de base para crear condiciones de desnaturalización suficientes que el volumen que se necesita de una solución de desnaturalización con una base más débil y/o menor concentración de base. La solución de desnaturalización puede formularse de modo que las muestras de ADN se mezclen, por ejemplo, con una décima parte del volumen de la solución de desnaturalización (para producir las condiciones desnaturalización deseadas).
Por ejemplo, las soluciones de desnaturalización pueden tener un pH de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 11,0 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 11,5 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 12,0 a aproximadamente 13,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 12,0, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 12,0 de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 12,0, de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 12,0, de aproximadamente 11,0 a aproximadamente 12,0, de aproximadamente 11,5 a aproximadamente 12,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 11,0 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 11,0, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,0, de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 11,0, de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,5, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 10,5, de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 10,5, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,0 de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 9,5, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10,0, aproximadamente 10,5, aproximadamente 11,0, aproximadamente 11,5, aproximadamente 12,0, aproximadamente 12,5 o aproximadamente 13,0,
Las soluciones de desnaturalización pueden tener, por ejemplo, concentraciones de componentes de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 900 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 700 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 600 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 80 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 70 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 900 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 700 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 600 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 80 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 70 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 900 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 700 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 600 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 30 mM a
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Marino, Flavina Brillante Maxilon 10 GFF, Flavina Brillante Maxilon 8 GFF, MPS (estilbeno de pironina verde de metilo), Mitramicina, NBD Amina, Nitrobenzoxadidol, Noradrenalina, Rojo Rápido Nuclear, Amarillo Nuclear, Flavina Brillante Nilosan E8G, Oxadiazol, Pacific Blue, Pararrosanilina (Feulgen), Solución Phorwite AR, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, Fosfina 3R, Ftalocianina, Ficoeritrina R, Poliazaindaceno Pontochrome Blue Black, Porfirina, Primulina, Procion Yellow, Pironina, Pironina B, Flavina Brillante Pyrozal 7GF, Mostaza de Quinacrina, Rodamina 123, Rodamina 5 GLD, Rodamina 6G, Rodamina B, Rodamina B 200, Rodamina B Extra, Rodamina BB, Rodamina BG, Rodamina WT, Serotonina, Rojo Brillante Sevron 2B, Rojo Brillante Sevron 4G, Rojo Brillante Sevron B, Naranja Sevron, Amarillo Sevron L, SITS (Primulina), SITS (ácido isotiosulfónico de estilbeno), Estilbeno, Snarf 1, Sulforodamina B Can C, Sulforodamina G Extra, Tetraciclina, Rojo de Tiazina R, Tioflavina S, Tioflavina TCN, Tioflavina 5, Tiolita, Naranja de tiozol, Tinopol CBS, True Blue, Ultralite, Uranina B, Uvitex SFC, Naranja de xileno y XRITC.
Las etiquetas fluorescentes preferidas son la fluoresceína (5-carboxfiluoresceína-N-hidroxisuccinimida éster), la rodamina (5,6-tetrametil rodamina) y los tintes de cianina Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5 y Cy7. La absorción y emisión máxima, respectivamente, para estas fluoresceínas son: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 mm), Cy3,5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5,5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm), por lo tanto, permite su detección simultánea. Otros ejemplos de tintes de fluoresceína incluyen 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',4',1,4,tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX), 2',7'-dimetoxi-4', 5'-dicloro-6carboxirodamina (JOE), 2'-cloro-5,-fluoro-7',8'-fusionado fenil-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (NED) y 2'-cloro-7'fenil-1,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (VIC). Las etiquetas fluorescentes se pueden obtener de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Molecular Probes, Eugene, OR; y Research Organics, Cleveland, Ohio.
Las etiquetas adicionales de interés incluyen aquellas que proporcionan señal solamente cuando la sonda con la cual se asocian se une específicamente a una molécula diana, donde dichas etiquetas incluyen: «balizas moleculares» como se describe en Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology (1996) 14:303 y EP 0 070 685 Bl. Otras etiquetas de interés incluyen aquellas descritas en las patentes estadounidenses N.o 5,563,037, WO 97/17471 y WO 97/17076.
Los nucleótidos etiquetados son una forma de etiqueta de detección preferida dado que pueden incorporarse directamente en los productos de amplificación durante la síntesis. Los ejemplos de etiquetas de detección que se pueden incorporar en ácidos nucleicos amplificados incluyen análogos de nucleótido tales como BrdUrd (5bromodeoxiuridina, Hoy y Schimlce, Mutation Research 290:217-230 (1993)), aminoalildesoxiuridina (Henegariu et al., Nature Biotechnology 18:345-348 (2000)), 5-metilcitosina (Sano et al., Biochim. Biophys. Acta 951:157-165 (1988)), bromouridina (Wansick et al., J. Cell Biology 122:283-293 (1993)) y nucleótidos modificados con biotina (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78:6633 (1981)) o con haptenos adecuados tales como digoxigenina (Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992)). Los nucleótidos etiquetados por fluorescencia adecuados son Fluoresceína-isotiocianato-dUTP, Cianina-3-dUTP y Cianina-5-dUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res., 22:3226-3232 (1994)). Una etiqueta de detección análoga de nucleótidos preferida para el ADN es la BrdUrd (bromodeoxiuridina, BrdUrd, BrdU, BUdR, Sigma-Aldrich Co). Otros análogos de nucleótidos preferidos para incorporar la etiqueta de detección en el ADN son AA-dUTP (aminoalill-desoxiuridina trifosfato, Sigma-Aldrich Co.) y 5-metil-dCTP (Roche Molecular Biochemicals). Un análogo de nucleótidos preferido para la incorporación de la etiqueta de detección en el ARN es la biotina-16-UTP (biotina-16-uridina-5'-trifosfato, Roche Molecular Biochemicals). La fluoresceína, Cy3 y Cy5 pueden unirse a dUTP para su etiquetado directo. Cy3,5 y Cy7 están disponibles como conjugados antidigoxigenina o avidina para la detección secundaria de sondas etiquetadas con digoxigenina o biotina.
Las etiquetas de detección que se incorporan en el ácido nucleico amplificado tales como la biotina, pueden detectarse posteriormente usando métodos sensibles muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, la biotina puede ser detectada usando conjugado de fosfavelocidadalcalina-estreptavidina (Tropix, Inc.), que se une a la biotina y se detecta posteriormente mediante quimioluminiscencia de sustratos adecuados (por ejemplo, sustrato quimioluminiscente CSPD: disodio, 3-(4-metoxispiro-[1,2,-dioxetano-3-2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.13,7]decano]-4-il) fenil fosfato; Tropix, Inc.). Las etiquetas pueden ser también enzimas, tales como la fosfavelocidadalcalina, la peroxidasa de soja, la peroxidasa de rábano picante y polimerasas, que pueden detectarse, por ejemplo, con amplificación de señales químicas o mediante el uso de un sustrato para la enzima que produce luz (por ejemplo, un sustrato 1,2dioxetano quimioluminiscente) o señal fluorescente.
Las moléculas que combinan dos o más de estas etiquetas de detección se consideran también etiquetas de detección. Se puede utilizar cualquiera de las etiquetas de detección conocidas con las sondas, etiquetas y método descrito para etiquetar y detectar ácido nucleico amplificado usando el método descrito. Los métodos para detectar y medir las señales generadas por las etiquetas de detección son conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, es posible detectar isótopos radioactivos mediante recuento por centelleo o visualización directa; se pueden detectar moléculas fluorescentes con espectrofotómetros fluorescentes; se pueden detectar moléculas con un espectrofotómetro o visualizarlas directamente con una cámara; se pueden detectar enzimas mediante detección
o visualización del producto de una reacción catalizada por la enzima; se pueden detectar anticuerpos detectando una etiqueta de detección secundaria acoplada al anticuerpo. Tal como se utiliza en la presente, las moléculas de detección son moléculas que interactúan con el ácido nucleico amplificado y a las cuales se acoplan una o más
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Muchos de los oligonucleótidos que se describieron en la presente están diseñados para ser complementarios de determinadas partes de otros oligonucleótidos o ácidos nucleicos de manera que entre ellos puedan formarse híbridos estables. Se puede calcular la estabilidad de dichos híbridos mediante métodos conocidos tales como los que se describen en Lesnick y Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8:674-678 (1990), y Rychlik et al., Nucleic Acids Res. 18:6409-6412 (1990).
Los oligonucleótidos hexámeros se sintetizaron en un sistema de síntesis de ácidos nucleicos expedito Perseptive Biosystems 8909 usando química de acoplamiento de β-cianoetil fosforamidita estándar en columnas de síntesis dA+dC+dG+dT mezcladas (Glen Research, Sterling, VA). Las cuatro fosforamiditas se mezclaron en proporciones iguales para aleatorizar las bases en cada posición en el oligonucleótido. La oxidación de las fosfitas recién formadas se realizó usando el reactivo de sulfuración 3H-1,2-benzotiol-3-ona-1,1-idóxido (Glen Research) en vez del reactivo de oxidación estándar luego de la primera y segunda etapa de adición de fosforamidita. Los oligonucleótidos tio-fosfitilados se desprotegieron usando hidróxido de amonio al 30 % (3,0 ml) en agua a 55 °C durante 16 horas, se concentraron en una unidad de desprotección Savant Oligo Prep OP 120 durante 2 horas y se desalaron con columnas Sephadex PD10 usando el protocolo proporcionado por el fabricante.
M. ADN polimerasas
Las ADN polimerasas útiles en la amplificación por desplazamiento múltiple deben ser capaces de desplazar, ya sea solas o en combinación con un factor de desplazamiento de cadena compatible, una cadena hibridada que se encuentra durante la replicación. Dichas polimerasas se denominan en la presente ADN polimerasas con desplazamiento de cadena. Se prefiere que una ADN polimerasa con desplazamiento de cadena carezca de una actividad de exonucleasas 5' a 3’. El desplazamiento de cadena es necesario para provocar la síntesis de múltiples copias de una secuencia diana. Una actividad de exonucleasas 5' a 3’, si se encuentra presente, puede provocar la destrucción de una cadena sintetizada. Se prefiere también que las ADN polimerasas para usar en el método descrito sean sumamente procesivas. La adecuación de una ADN polimerasa para usar en el método descrito puede determinarse fácilmente evaluando su capacidad para realizar la replicación por desplazamiento de cadena. Las ADN polimerasas con desplazamiento de cadena preferidas son la ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 (patentes estadounidenses N.o 5,198,543 y 5,001,050 para Blanco et al.), la ADN polimerasa de fragmento grande Bst (Exo(-) Bst; Aliotta et al., Genet. Anal. (Países Bajos) 12:185-195 (1996)) y la ADN polimerasa exo(-)Bca (Walker y Linn, Clinical Chemistry 42:1604-1608 (1996)). Otras polimerasas útiles incluyen la ADN polimerasa del fago M2 (Matsumoto et al., Gene 84:247 (1989)), la ADN polimerasa del fago ΦPRD1 (Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:8287 (1987)), la ADN polimerasa exo(-)VENT® (Kong et al., J. Biol. Chem. 268:1965-1975 (1993)), fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I (Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623-627 (1974)), la ADN polimerasa T5 (Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)), Sequenase (U.S. Biochemicals), la ADN polimerasa PRD1 (Zhu y Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)), y la holoenzima de ADN polimerasa T4 (Kaboord y Benlcovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995)), la ADN polimerasa Φ29 es la más preferida.
El desplazamiento de cadena puede facilitarse a través del uso de un factor de desplazamiento de cadena, tal como la helicasa. Se considera que cualquier ADN polimerasa que pueda realizar la replicación por desplazamiento de cadena en presencia de un factor de desplazamiento de cadena es adecuada para uso en el método descrito, incluso si la ADN polimerasa no realiza la replicación por desplazamiento de cadena en ausencia de dicho factor. Los factores de desplazamiento de cadena útiles en la replicación por desplazamiento de cadena incluyen la subunidad accesoria de la BMRF1 polimerasa (Tsurumi et al., J. Virology 67(12):7648-7653 (1993)), la proteína de unión al ADN adenovirus (Zijderveld y van der Yliet, J. Virology 68(2): 1158-1164 (1994)), la proteína viral del herpes simple ICP8 (Boehmer y Lehman, J. Virology 67(2):711-715 (1993); Skaliter y Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91(22): 10665-10669 (1994)); proteínas de unión al ADN monocatenario (SSB; Rigler y Romano, J. Biol. Chem. 270:8910-8919 (1995)); proteína 32 génica de fago T4 (Villemain y Giedroc, Biochemistry 35:14395-14404 (1996); y helicasa del timo de ternera (Siegel et al., J. Biol. Chem. 267:13629-13635 (1992)).
La capacidad de una polimerasa de realizar la replicación por desplazamiento de cadena puede determinarse usando la polimerasa en un ensayo de replicación por desplazamiento de cadena tal como los que se describen en los Ejemplos 1 y 5. El ensayo en los ejemplos puede modificarse según sea apropiado. Por ejemplo, se puede usar una helicasa en vez de SSB. Dichos ensayos deben llevarse a cabo a una temperatura adecuada para que la enzima que se está usando tenga una actividad óptima, por ejemplo, 32 °C para la ADN polimerasa Φ29, de 46 °C a 64 °C para la ADN polimerasa exo(-) Bst o de aproximadamente 60 °C a 70 °C para una enzima de un organismo hipertermófilo. Para los ensayos de 60°C a 70°C, se puede aumentar la longitud de los cebadores para proporcionar una temperatura de fusión adecuada para la temperatura del ensayo. Otro ensayo útil para seleccionar una polimerasa es el ensayo de bloque de cebadores descrito en Kong et al., J. Biol. Chem. 268:1965-1975 (1993). El ensayo consiste en un ensayo de extensión de cebadores que usa una plantilla del ADN monocatenario M13 en presencia o ausencia de un oligonucleótido que se hibrida antes del cebador de extensión para bloquear su avance. Se espera que las enzimas capaces de desplazar el cebador de bloqueo en este ensayo sean útiles para el método descrito.
N. Kits
Los materiales que se describieron anteriormente pueden ser envasados juntos en cualquier combinación adecuada
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como un kit útil para llevar a cabo el método descrito. Los componentes del kit en un kit dado están diseñados y adaptados para su uso conjunto en el método descrito. Por ejemplo, se describen kits para amplificar el ADN genómico, tal kit comprende una solución de lisis, una solución de estabilización, un conjunto de cebadores y una ADN polimerasa. Se describen en otra parte de la presente los componentes de dicho kit. En algunas formas del kit, la solución de lisis puede comprender hidróxido de potasio, por ejemplo, 400 mM de KOH. Algunas formas útiles de la solución de lisis pueden comprender 400 mM de KOH, 100 mM de ditiotreitol y 10 mM de EDTA. En algunas formas del kit, la solución de estabilización puede comprender Tris-HCl a pH 4,1. Algunas formas útiles de la solución de estabilización pueden comprender 800 mM de Tris-HCl, pH 4,1. En algunas formas del kit, el conjunto de cebadores puede comprender cebadores hexámeros aleatorios. En algunas formas del kit, la ADN polimerasa puede ser la ADN polimerasa Φ29. En algunas formas del kit, el kit puede comprender además desoxinucleótidos trifosfatos. En algunas formas del kit, el kit puede comprender una o más sondas de detección. Las sondas de detección se describen en otra parte en la presente. En algunas formas del kit, las sondas de detección pueden comprender cada una parte complementaria, donde la parte complementaria es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de interés. En algunas formas del kit, el kit puede comprender además una solución de desnaturalización. En algunas formas del kit, el kit puede comprender además una mezcla de reacción.
Algunos kits útiles pueden comprender una solución de lisis, una solución de estabilización, un conjunto de cebadores, una ADN polimerasa Φ29, 1M ditiotreitol, 1X solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5, y plantilla de ADN de control; donde la solución de lisis comprende 400 mM de KOH y 10 mM de EDTA, la solución de estabilización comprende 800 mM de Tris-HCl, pH 4, y el conjunto de cebadores comprende una mezcla de reacción; donde la mezcla de reacción comprende 150 mM de Tris-HCl, 200 mM de HCl, 40 mM de MgCl2, 20 mM de (NH4) 2SO4, mM de desoxinucleótidos trifosfatos, y 0,2 mM de cebadores hexámeros aleatorios.
Cualquiera de los componentes que pueden estar presentes en un kit, que pueden utilizarse juntos, se pueden combinar en un único componente del kit. Por lo tanto, una mezcla de reacción puede incluir, por ejemplo, tampones, desoxinucleótidos trifosfatos y cebadores. De manera similar, los componentes y soluciones pueden dividirse en partes constituyentes o subsoluciones. Los kits pueden utilizarse para cualquier propósito, generalmente, para la amplificación de ácidos nucleicos. En algunas formas, el kit puede diseñarse para detectar las secuencias de ácido nucleico de interés en un genoma u otras muestras de ácido nucleico. En algunas formas, el kit puede diseñarse para evaluar una enfermedad, afección o predisposición de un individuo de acuerdo con una secuencia de ácido nucleico de interés.
O. Mezclas
Se describen mezclas que se forman realizando cualquier forma del método descrito o que se forman durante la realización de este. Por ejemplo, se describen mezclas que comprenden, por ejemplo, células y solución de lisis; lisado celular y solución de estabilización; lisado celular estabilizado y uno o más cebadores; lisado celular estabilizado y ADN polimerasa; lisado celular estabilizado, uno o más cebadores y ADN polimerasa; lisado celular estabilizado y cadenas replicadas; lisado celular estabilizado; uno o más cebadores y cadenas replicadas; lisado celular estabilizado, ADN polimerasa y cadenas replicadas; lisado celular estabilizado, uno o más cebadores, ADN polimerasa y cadenas replicadas; lisado celular estabilizado y una o más sondas de detección; lisado celular estabilizado, uno o más cebadores, una o más sondas de detección y cadenas replicadas; lisado celular estabilizado, ADN polimerasa; una o más sondas de detección y cadenas replicadas; y lisado celular estabilizado, uno o más cebadores, ADN polimerasa, una o más sondas de detección y cadenas replicadas.
Cuando el método implica mezclar o poner en contacto, por ejemplo, composiciones o componentes o reactivos, la realización del método crea una cantidad de mezclas diferentes. Por ejemplo, si el método incluye tres etapas de mezclado, después de cada una de estas etapas se forma una única mezcla si las etapas se llevan a cabo en forma secuencial.
Además, se forma una mezcla al término de todas las etapas independientemente de cómo se llevaron a cabo las etapas. La presente descripción contempla estas mezclas obtenidas al llevar a cabo el método descrito, así como también mezclas que contienen cualquier reactivo, composición o componente descrito, por ejemplo, descrito en la presente.
Usos
El método y las composiciones descritas son aplicables en varias áreas que incluyen, pero no se limitan al análisis de ácidos nucleicos presentes en las células (por ejemplo, análisis de ADN genómico en las células), detección de enfermedades, detección de mutaciones, descubrimiento de genes, mapeo de genes (haplotipos moleculares) e investigación agrícola. La amplificación genómica es particularmente útil. Otros usos incluyen, por ejemplo, la detección de ácidos nucleicos en células y en matrices de ADN genómico; haplotipos moleculares; detección de mutaciones, detección de enfermedades hereditarias tales como fibrosis cística, distrofia muscular, diabetes, hemofilia, anemia de células falciformes; evaluación de la predisposición a cánceres como el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de páncreas.
Método
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En algunas realizaciones, la solución de lisis puede comprender múltiples agentes básicos. Tal como se utiliza en la presente, un agente básico es un compuesto, composición o solución que provoca condiciones de desnaturalización. En algunas realizaciones, la solución de lisis puede comprender un tampón. Los tampones útiles incluyen tampones de fosfato, tampones «Good» (tales como BES, BICINE, CAPS, EPPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TAPS, TES y TRICINE), cacodilato de sodio, citrato de sodio, acetato de trietilamonio, bicarbonato de trietilamonio, Tris, Bis-tris y Bis-tris propano. La solución de lisis puede comprender múltiples agentes amortiguadores. Tal como se utiliza en la presente, un agente amortiguador es un compuesto, composición o solución que actúa como un tampón. Un agente amortiguador alcalino es un agente amortiguador que provoca condiciones alcalinas. En algunas realizaciones, la solución de lisis puede comprender una combinación de una o más bases, agentes básicos, tampones y agentes amortiguadores.
El pH del lisado celular puede reducirse para formar un lisado celular estabilizado. Un lisado celular estabilizado es un lisado celular cuyo pH se encuentra en el intervalo neutro (de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente pH 9,0). Los lisados celulares estabilizados útiles tienen un pH que permite la replicación de los ácidos nucleicos en el lisado celular. Por ejemplo, el pH del lisado celular estabilizado es útil en un pH en el que puede funcionar la ADN polimerasa. El pH del lisado celular puede reducirse mezclando el lisado celular con una solución de estabilización. La solución de estabilización comprende una solución que puede reducir el pH de un lisado celular expuesto a condiciones alcalinas como se describe en otra parte en la presente.
La cantidad de solución de estabilización mezclada con el lisado celular puede ser la cantidad que provoca una reducción en el pH para el intervalo neutro (u otro valor de pH deseado). Generalmente, este volumen estará directamente determinado por el pH de la mezcla de solución de estabilización/lisado celular. Por lo tanto, es posible determinar generalmente la cantidad de solución de estabilización que se mezcla con el lisado celular a partir del volumen del lisado celular, su pH y capacidad amortiguadora, y la concentración ácida del tampón de estabilización. Por ejemplo, se necesitaría un volumen más pequeño de una solución de estabilización con un ácido más fuerte y/o mayor concentración de ácido para reducir el pH en el grado necesario que el volumen que se necesita de una solución de estabilización con un ácido más débil y/o menor concentración de ácido. La solución de estabilización puede formularse de modo que el lisado celular se mezcle con un volumen igual de la solución de estabilización (para producir el pH deseado).
En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender un ácido. Los ácidos útiles incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido acetilsalicílico, ácido ascórbico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido nítrico, ácido perclórico, HF, HBr, HI, H2S, HCN, HSCN, HCIO, ácido monocloroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético y cualquier ácido carboxílico (etanoico, propanoico, butanoico, etc., que incluye ambos ácidos carboxílicos de cadena lineal o ramificada). En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender un tampón. Los tampones útiles incluyen Tris-HCl, HEPES, tampones «Good» (tales como BES, BICINE, CAPS, EPPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TAPS, TES y TRICINE), cacodilato de sodio, citrato de sodio, acetato de trietilamonio, bicarbonato de trietilamonio, Tris, Bis-tris y Bis-tris propano. Las formulaciones útiles de soluciones de estabilización incluyen solución de estabilización que comprende 800 mM de Tris-HCl; solución de estabilización que comprende 800 mM de Tris-HCl a pH 4,1, y solución de estabilización que consiste en 800 mM de Tris-HCl, pH 4,1.
En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender múltiples agentes ácidos. Tal como se utiliza en la presente, un agente ácido es un compuesto, composición o solución que forma un ácido en solución. En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender múltiples agentes amortiguadores. Un agente amortiguador ácido es un agente amortiguador que forma un ácido en solución. En algunas realizaciones, la solución de estabilización puede comprender una combinación de uno o más ácidos, agentes ácidos, tampones y agentes amortiguadores.
En algunas realizaciones, el pH del lisado celular puede reducirse a aproximadamente pH 9,0 o menos, a aproximadamente pH 8,5 o menos, a aproximadamente pH 8,0 o menos, a aproximadamente pH 7,5 o menos, a aproximadamente pH 7,2 o menos o a aproximadamente pH 7,0 o menos. En algunas realizaciones, el pH del lisado celular puede reducirse hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 6,0 hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 6,8, hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 7,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 7,2 hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 7,5 hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 8,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente 8,5 de pH, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 6,8 hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 7,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 7,2, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 7,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,5 a aproximadamente pH 8,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 6,8, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 7,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 7,2, hasta el intervalo de aproximadamente pH 8,0 a
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aproximadamente 7,5 de pH, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 6,8 hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 7,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,5 a aproximadamente pH 7,2 hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 6,8 hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 7,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 6,5, hasta el intervalo de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 6,8 hasta el intervalo de aproximadamente pH 6,8 a aproximadamente pH 6,0, hasta el intervalo de aproximadamente pH 6,8 a aproximadamente pH 6,5, o hasta el intervalo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 6,0. En algunas realizaciones, el pH del lisado celular puede reducirse a cualquier intervalo que tenga cualquier combinación de criterios de valoración de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente pH 9,0. Todos los criterios de valoración e intervalos se contemplan de forma específica y separada.
En algunas realizaciones, las células no se lisan mediante calor. Los expertos en la técnica entenderán que las diferentes células en distintas condiciones se lisarán a distintas temperaturas y así se pueden determinar las temperaturas y los tiempos en los que las células no se lisarán mediante calor. En general, las células no se someten a un calentamiento por encima de una temperatura y durante un tiempo eso causaría una lisis celular sustancial en ausencia de las condiciones alcalinas utilizadas. Tal como se utiliza en la presente, la lisis celular sustancial hace referencia al 90 % o más de las células expuestas a condiciones alcalinas. La lisis celular significativa hace referencia a la lisis del 50 % o más de las células expuestas a condiciones alcalinas. La lisis celular suficiente hace referencia a la lisis de suficientes células expuestas a condiciones alcalinas para permitir la síntesis de una cantidad detectable de productos de amplificación mediante la amplificación por desplazamiento de cadena múltiple. En general, las condiciones alcalinas usadas en el método descrito solamente necesitan provocar lisis celular suficiente. Debería entenderse que no es necesario que las condiciones alcalinas que podrían provocar lisis celular significativa o sustancial provoquen lisis celular significativa o sustancial cuando se realiza el método.
En algunas realizaciones, las células no se someten a un calentamiento sustancial o considerablemente por encima de la temperatura en la que crecen las células. Tal como se utiliza en la presente, la temperatura en la que crecen las células hace referencia a la temperatura estándar o las distintas temperaturas estándar más elevadas en las que se cultivan las células del mismo tipo. En el caso de las células de animales, la temperatura en la que crecen las células hace referencia a la temperatura corporal del animal. En otras realizaciones, las células no se someten a un calentamiento sustancial o considerablemente por encima de la temperatura de la reacción de amplificación (donde se replica el genoma).
En algunas realizaciones, el lisado celular no se somete a purificación antes de la reacción de amplificación. En el contexto del método descrito, purificación hace referencia, generalmente, a la separación de los ácidos nucleicos de otro material en el lisado celular. Se ha descubierto que la amplificación por desplazamiento múltiple puede realizarse en muestras no purificadas y parcialmente purificadas. Se cree comúnmente que las reacciones de amplificación no se pueden llevar a cabo de forma eficiente usando ácido nucleico no purificado. En particular, la PCR es muy sensible a los contaminantes.
Las formas de purificación incluyen centrifugación, extracción, cromatografía, precipitación, filtración y diálisis. El lisado celular parcialmente purificado incluye lisados celulares sometidos a centrifugación, extracción, cromatografía, precipitación, filtración y diálisis. El lisado celular parcialmente purificado no incluye lisados celulares sometidos a precipitación o diálisis de ácidos nucleicos. Tal como se utiliza en la presente, la separación del ácido nucleico de otro material hace referencia a una separación física, de modo que el ácido nucleico que se debe simplificar se encuentre en un recipiente o recipiente diferente del material. La purificación no exige la separación de todo el ácido nucleico de todos los demás materiales. En vez de eso, lo que se exige es la separación de algún ácido nucleico de algún otro material. Tal como se utiliza en el contexto de los ácidos nucleicos que se deben amplificar, la purificación hace referencia a la separación del ácido nucleico de otro material. En el contexto de los lisados celulares, la purificación hace referencia a la separación de los ácidos nucleicos de otro material en el lisado celular. Tal como se utiliza en la presente, la purificación parcial hace referencia a la separación del ácido nucleico de algo, aunque no todo, del otro material con el cual se mezcla el ácido nucleico. En el contexto de los lisados celulares, la purificación parcial hace referencia a la separación del ácido nucleico de algo, aunque no todo, del otro material en el lisado celular.
A menos que el contexto indique claramente de otro modo, la referencia en la presente a una falta de purificación, falta de uno o más tipos de purificación u operaciones o técnicas de separación, o exclusión de purificación o uno o más tipos de purificación u operaciones o técnicas de separación no abarca la exposición de las células a condiciones alcalinas (o sus resultados), la reducción del pH de un lisado celular (o sus resultados). Es decir, en la medida que las condiciones alcalinas y la reducción de pH del método descrito produzcan un efecto que podría considerarse de «purificación» o «separación», dichos efectos se excluyen de la definición de purificación y separación cuando esos términos se utilizan en el contexto de procesamiento y manipulación de lisados celulares y lisados celulares estabilizados (a menos que el contexto indique claramente de otro modo).
Tal como se utiliza en la presente, la purificación sustancial hace referencia a la separación del ácido nucleico de al
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