ES2380775T3 - Reactivos y procedimientos para mejorar la reproducibilidad y reducir el cebado defectuoso en la amplificación por PCR - Google Patents

Abstract

Reactivo que no contribuye a la fluorescencia de fondo pero que puede evitar por lo menos una manifestación del cebado defectuoso en una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir por lo menos un producto de ADN amplificado cuando es añadido a una concentración no superior a 650 nM a una mezcla de amplificación por PCR que incluye 1,25 unidades de una ADN polimerasa termoestable por 25 μl de mezcla de reacción, siendo dicho reactivo un oligonucleótido no extensible que presenta un extremo 3' y una estructura de tallo-bucle, que no es una sonda de hibridación para dicho por lo menos un producto de ADN amplificado, que presenta un tallo que comprende una región de doble cadena que presenta una longitud superior a seis nucleótidos, y un extremo alejado del bucle que comprende un nucleótido 3' y un nucleótido 5', presentando dicho tallo una temperatura de fusión del tallo (Tm) calculada inferior a 94ºC, en el que: (a) el extremo 3' no es extensible por dicha ADN polimerasa, y (b) dicho extremo de tallo resulta estabilizado por unos medios no fluorescentes seleccionados de entre el grupo constituido por grupos no fluorescentes inhibidores de fluoróforo unidos covalentemente a los nucleótidos 3' y 5' de dicho extremo del tallo y nucleótidos no naturales que se unen más fuertemente que un híbrido ADN-ADN natural al extremo del tallo.

Description

Reactivos y procedimientos para mejorar la reproducibilidad y reducir el cebado defectuoso en la amplificación por PCR.

Campo técnico

La presente invención se refiere a reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y ensayos que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo ensayos homogéneos, tanto en tiempo real como de punto final.

Antecedentes

La amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es bien conocida, al igual que los ensayos que incluyen la amplificación por PCR (ver las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195 y nº

4.965.188 y, de manera general, PCR PROTOCOLS, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., editores, Academic Press (San Diego, CA, USA, 1990). También son bien conocidos los ensayos de PCR homogéneos que no requieren lavado para eliminar los reactivos o sondas detectoras no unidas y que, de esta manera, pueden llevarse a cabo sin abrir recipientes de reacción de amplificación. Entre los ensayos de PCR homogéneos se incluyen tanto ensayos de punto final, en los que se detecta el producto amplificado al final de la reacción de amplificación, como los ensayos en tiempo real, en los que el producto amplificado se detecta durante parte o la totalidad de los ciclos térmicos a medida que se produce la reacción (ver las patentes US nº 5.994.056, nº 5.487.972, nº 5.925.517 y nº 6.150.097).

Las reacciones de amplificación por PCR generalmente se diseñan para que sean simétricas, es decir, para que generen amplicones de doble cadena mediante la utilización de un cebador directo y un cebador inverso que son "correspondientes", es decir, que presentan temperaturas de fusión de máxima similitud y que se añaden a la reacción en concentraciones equimolares. Una técnica de uso limitado para preparar ADN de una cadena directamente en una reacción de PCR es la "PCR asimétrica" (Gyllensten y Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reactions and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7652-7656, 1988, y patente US nº 5.066.584). La PCR asimétrica difiere de la PCR simétrica en que uno de los cebadores se añade en una cantidad limitante, típicamente 1 a 20 por ciento de la concentración del otro cebador.

Más recientemente, los presentes inventores han desarrollado un método de amplificación por PCR no simétrico conocido como PCR "lineal tras exponencial" o, abreviadamente, "LATE-PCR" (ver Sánchez et al., PNAS 101:19331938, 2004; Pierce et al., PNAS 102:8609-8614, 2005, y solicitud publicada de patente internacional WO nº 03/054233 (3 de julio de 2003), que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad). La LATE-PCR considera las temperaturas de fusión reales de los cebadores de PCR al inicio de la amplificación, denominadas Tm[0]; Tm[0], las cuales pueden determinarse empíricamente, lo que resulta necesario en el caso de que se utilicen nucleótidos no naturales, o calcularse según el método del "vecino más próximo" (Santa Lucia J., PNAS (USA) 95:1460-1465, 1998; y Allawi H.T. y Santa Lucia J., Biochem. 36:10581-10594, 1997), utilizando ajustes de la concentración salina. En el trabajo de los presentes inventores se utilizó una concentración de sal monovalente de 0,07 M.

Una característica no deseable de las amplificaciones por PCR, que se alivia en el caso de la LATE-PCR, es la dispersión entre réplicas. Tras la etapa exponencial de la amplificación, las réplicas de amplificación sometidas a seguimiento en tiempo real son divergentes y alcanzan niveles de saturación diferentes. La dispersión indica que las réplicas no presentan la misma cinética de reacción, reduciendo la precisión. Éste es un problema general de los ensayos de PCR, aunque concretamente de los ensayos de punto final y de los ensayos que dependen de la pendiente de la señal en la etapa lineal.

Otro problema significativo de las amplificaciones por PCR es el cebado defectuoso, que los presentes inventores consideran que se manifiesta en forma de por lo menos tres tipos: tipo 1, cebado defectuoso que se produce durante la preparación de mezclas de reacción previamente al inicio de la amplificación; tipo 2, cebado defectuoso que se produce durante la amplificación en el caso de que las temperaturas del ciclado incluyan cualquiera temperatura significativamente inferior a la temperatura de fusión de un cebador, y tipo 3, el cebado defectuoso que se produce en las últimas etapas de una amplificación por PCR que se continúa tras alcanzar una concentración elevada de amplicón. Se han utilizado varios enfoques para resolver el primer tipo de cebado defectuoso. Un enfoque es modificar la polimerasa químicamente, de manera que ésta se encuentre inactiva hasta alcanzar una temperatura elevada, tal como 95ºC (ver las patentes US nº 5.677.152 y nº 5.773.258). Otro enfoque consiste en unir un anticuerpo a la polimerasa para inhibirla hasta que la reacción alcance una temperatura elevada, tal como 95ºC, a fin de desnaturalizar irreversiblemente el anticuerpo (ver la patente US nº 5.338.671). Todavía otro enfoque consiste en incluir un aptámero en la mezcla de reacción (ver Doug y Jayasena, J. Mol. Biol. 264:268-278, 1996, y la patente US nº 6.020.130). Un aptámero es un oligonucleótido monocatenario de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que se une a una polimerasa y que inhibe su capacidad de extender un extremo 3' a temperaturas bajas. Los aptámeros no resultan desnaturalizados irreversiblemente a 95ºC, una temperatura máxima típica en un ciclo de

PCR. Kainz et al., Biotechniques 28:278-282, 2000, han informado de que la adición a mezclas de reacción de PCR de fragmentos de ADN de doble cadena que presentan longitudes de entre 16 y 21 nucleótidos en determinadas cantidades inhibe las polimerasas a temperaturas inferiores a las temperaturas de extensión de PCR típicas y suprime la síntesis de productos no específicos. Los fragmentos de ADN resultan desnaturalizados irreversiblemente durante el ciclado de la PCR. La compañía Eppendorf-5 Prime, Inc. comercializa un ligando propietario que se afirma se une a la polimerasa Taq de un modo dependiente de la temperatura e inhibe su unión al ADN de doble cadena a temperaturas inferiores a aproximadamente 50ºC. A pesar de estos muchos intentos, el cebado defectuoso sigue siendo un problema en las amplificaciones por PCR.

El documento WO 01/02559 enseña la utilización de oligonucleótidos inhibidores que pueden presentar una estructura de horquilla y que pueden utilizarse para bloquear la síntesis de ácidos nucleicos no específicos. La patente US nº 6.183.967 B1 enseña la utilización de un ligando de ácidos nucleicos que puede presentar una estructura de tallo-bucle y que puede impedir que una mezcla de PCR amplifique ADN de fondo.

Otra manifestación del cebado defectuoso durante la amplificación por PCR es la formación y amplificación de dímeros de cebadores. En este fenómeno un cebador se hibrida con el otro cebador o a sí mismo y después experimenta la extensión del extremo 3', generando un pequeño amplicón de doble cadena, que después puede amplificarse adicionalmente o multimerizarse y amplificarse adicionalmente. La formación de dímero de cebadores puede producirse en ausencia de diana.

El análisis cuantitativo de las amplificaciones por PCR ha resultado posible gracias a los métodos de detección en tiempo real, ya que el ciclo de PCR en el que la señal fluorescente resulta visible a un nivel superior al ciclo umbral o CT de las reacciones es indicativo de las concentraciones diana iniciales. Los análisis de punto final en el mejor de los casos son semicuantitativos, debido en parte a la dispersión entre réplicas observada fuera del intervalo de amplificación exponencial de la reacción de amplificación. El análisis electroforético de los amplicones de doble cadena es semicuantitativo y puede utilizar cebadores marcados fluorescentemente. El análisis de punto final con sondas marcadas fluorescentemente, sondas discriminantes de alelos o sondas tolerantes al desapareamiento, también son semicuantitativos en el mejor de los casos. Mediante la reducción de la dispersión y generación de producto de una sola cadena, la LATE-PCR proporciona una mejora significativa de los análisis de punto final, aunque la dispersión entre réplicas con frecuencia no consigue eliminarse por completo, llevando a una detección multiplex cuantitativa menos precisa de lo deseado.

Un aspecto de la presente invención es una clase de aditivos reactivos que mejoran la especificidad del producto y eliminan los efectos del cebado defectuoso en las reacciones de amplificación por PCR. Estos aditivos funcionan mejor que las metodologías de "inicio en caliente" existentes en todos los tipos de PCR y pueden utilizarse para evitar la acumulación de productos no deseados, incluyendo los cebadores-dímeros y los amplicones incorrectamente cebados, tanto en las primeras etapas de la reacción como durante las reacciones de LATE-PCR que presentan muchos ciclos (típicamente 60 ciclos o más).

Otro aspecto de la presente exposición son los métodos de amplificación por PCR y de análisis, tanto de PCR simétrica como no simétrica, incluyendo, aunque sin limitación, la LATE-PCR y los kits, kits parciales y conjuntos de oligonucleótidos que incluyen dichos aditivos reactivos.

Sumario

La invención se define según las reivindicaciones adjuntas. Los reactivos según la presente invención son aditivos que pueden prevenir una o más manifestaciones del cebado defectuoso en por lo menos algunas amplificaciones por PCR. La expresión "impedir una manifestación" se refiere a que un producto o productos del cebado defectuoso no se detectan al final de la reacción mediante las técnicas descritas en la presente memoria, es decir, pigmentos fluorescentes del ADN, electroforesis en gel, secuenciación de ADN y análisis de puntos de fusión. Los reactivos según la presente exposición pueden incluirse en mezclas de amplificación por PCR antes de iniciar la amplificación a una concentración relativamente baja, inferior a 1 micromolar (1 μM), es decir, 1.000 nM, preferentemente no superior a 650 nanomolar (nM), más preferentemente no superior a 300 nM, y todavía más preferentemente de entre 50 y 250 nM, incluso al utilizar polimerasa que presentan tanto actividad de polimerización como actividad de exonucleasa 5' a 3'. Los reactivos según la presente invención son oligonucleótidos de una sola cadena modificados. Los oligonucleótidos que pueden utilizarse para construir reactivos según la presente invención son oligonucleótidos en términos amplios. Pueden ser de ADN, ARN o mixtos de ADN-ARN. Pueden contener nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, por ejemplo 2'-O-metilribonucleótidos, enlaces entre nucleótidos no naturales, moléculas conectoras no nucleotídicas, APN, ALN y fracciones químicas añadidas, tales como los nucleótidos con caperuza descritos por Glenn Research.

Los reactivos según la presente invención son oligonucleótidos de una cadena que forman una estructura de tallo y bucle; comúnmente denominados estructura "de horquilla", en una mezcla de reacción de amplificación por PCR, aunque también pueden encontrarse comprendidos en una estructura de tallo-bucle en la que el bucle no comprende nucleótidos. En este tipo de estructura, una parte central de la molécula permanece de una cadena (no hibridada) (el bucle) y los extremos se hibridan entre sí formando el tallo. Un tallo puede ser de extremo romo o una

cadena puede extenderse más allá del extremo de la otra. Un tallo puede comprender una región de doble cadena continua o puede incluir un desapareamiento interno, causando un abultamiento. El extremo del tallo formado por los extremos del oligonucleótido se encuentra estabilizado, de manera que se encuentra más fuertemente unido que un híbrido ADN-ADN. Los presentes inventores caracterizaron el tallo de un reactivo según la presente invención haciendo referencia a su temperatura de fusión, o Tm. La temperatura de fusión es la temperatura en grados centígrados a la que el 50% de las secuencias complementarias del tallo no se encuentran hibridadas (configuración abierta) y el 50% de las secuencias complementarias se encuentran hibridadas o parcialmente hibridadas a sí mismas (configuración cerrada). En la presente solicitud, la "Tm calculada" de un tallo se refiere a la temperatura de fusión calculada de la parte tallo del oligonucleótido de ADN completo no estabilizado correspondiente, obtenido utilizando el programa M-fold (Zucker M., "Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction", Nucl. Acids Res. 31:3406-3415, 2003, suponiendo una concentración de sodio de 70 milimolar (mM) y una concentración de magnesio de 3 mM. En el caso de formas de realización preferidas que presentan parejas de inhibidores añadidos, preferentemente inhibidores no fluorescentes tales como dabcilo e inhibidores Black Hole que absorben luz pero emiten la energía absorbida en forma de calor, Tm es la Tm calculada de la horquilla de ADN sin los inhibidores. En el caso de formas de realización que presentan nucleótidos con caperuza en sus extremos, la Tm es la Tm calculada de la horquilla de ADN que contiene los nucleótidos equivalentes sin caperuza. En el caso de las inclusiones de 2'-O-metilribonucleótiods en un extremo de tallo, la Tm es la Tm calculada de todos los análogos desoxirribonucleótidos que contiene horquillas de ADNn de los 2'-O-metilribonucleótidos. Los presentes inventores utilizan esta metodología por el motivo práctico de que resulta difícil obtener el punto de fusión real de una horquilla estabilizada, reconociendo que el punto de fusión real será varios grados superior que la Tm calculada debido a la modificación estabilizadora. Los reactivos de la presente invención presenta una Tm de tallo calculada no superior a 94ºC, y que se encuentra comprendida preferentemente en el intervalo de 50ºC a 85ºC. Para algunas formas de realización, los presentes inventores prefieren una Tm de tallo calculada que sea superior a la temperatura de hibridación del cebador (típicamente 55ºC a 72ºC de una reacción de amplificación, es decir, que se encuentra comprendida en el intervalo de 72ºC a 85ºC), aunque en otras formas de realización los presentes inventores prefieren una Tm de tallo calculada que sea inferior a la temperatura de hibridación del cebador, es decir, comprendida en el intervalo de 50ºC a 71ºC. Las secuencias complementarias del tallo se abren, se convierten en monocatenarias, a 95ºC, la temperatura utilizada para la fusión de cadenas durante el ciclado de PCR. Además, el tallo de los reactivos según la presente invención presenta una longitud superior a seis nucleótidos a temperaturas suficientemente bajas para la formación de una conformación cerrada, autohibridada. En la actualidad, las formas de realización preferidas de los presentes inventores forman tallos de una longitud comprendida entre 9 y12 pares de bases, preferentemente de entre 9 y 11 pares de bases, en estado cerrado, más preferentemente de entre 9 y 12, más preferentemente de entre 9 y 11, pares de bases complementarios continuos sin desapareamientos internos, más preferentemente tallos de extremos romos de 9 a 12 pares de bases de longitud y perfectamente complementarios. El extremo 3' del reactivo no es extensible por una ADN polimerasa en la reacción de amplificación, de manera que la reacción no es un cebador de PCR. Cualquier extremo 3' protuberante se bloquea para evitar la extensión, por ejemplo mediante la adición de un fosfato o algún grupo químico de bloqueo.

La longitud del bucle puede modificarse considerablemente. En el caso de que el bucle está constituido por nucleótidos y enlaces entre nucleótidos, presenta una longitud de por lo menos tres nucleótidos. Además, en el caso de que presente una longitud de sólo tres nucleótidos, contiene un residuo de timidina. Los bucles de nucleótidos actualmente preferidas por los presentes inventores presentan longitudes comprendidas en el intervalo de 3 a 22 nucleótidos. Los bucles también pueden ser moléculas conectoras químicas no nucleotídicas, por ejemplo cadenas de alquileno. En el caso de los conectores de cadena de carbonos, los presentes inventores prefieren una longitud de entre 3 y 6 átomos de carbono, y una longitud más preferida de 3 átomos de carbono. En las cadenas de carbono alquileno, los dos electrones de valencia remanentes de cada elemento de la cadena de carbonos también se encuentran implicados en los enlaces covalentes. Dichos enlaces pueden ser con átomos de hidrógeno, con grupos de alquilo o alquileno de cadena corta, o con sustituyentes para unir el reactivo a una superficie sólida. Los bucles no oligonucleótidos que comprenden conectores químicos no se encuentra limitados a cadenas hidrocarburo y pueden incluir heteroátomos (no de carbono o de hidrógeno). Los presentes inventores prefieren que los conectores químicos sean eléctricamente neutros, de manera que no se unan a la polimerasa. Debido a que la actividad del reactivo depende de la conformación cerrada del tallo, resulta preferido que la composición del bucle, para los reactivos que presentan bucles de más de 5 nucleótidos, no sean extensamente complementarios a cualquier otra secuencia o secuencias en la reacción, o generadas por la reacción. Un reactivo según la presente invención no es una sonda de hibridación para cualquiera producto de la reacción de amplificación y no indica acumulación de producto.

Tal como se ha expuesto, los reactivos según la presente invención incluyen la estabilización del extremo del tallo más alejado del bucle, de manera que el extremo del tallo se una más fuertemente que el extremo de un híbrido ADN-ADN. En las formas de realización más preferidas en el contexto de la presente memoria, el tallo presenta extremos romos, y el extremo del tallo ha sido modificado de manera que inhiba la separación parcial de cadenas en comparación con un híbrido ADN-ADN natural. Se demuestra posteriormente el efecto de añadir grupos químicos de interacción estabilizadora a los extremos del tallo, tanto un par de grupos dabcilo unidos covalentemente a los nucleótidos 3' y 5' del tallo por medio de un conector comercial como un par de inhibidores Black HoleTM disponibles comercialmente (inhibidores propietarios comercializados por Biosearch Technologies, Novato, CA, U.S.A.). Los presentes inventores también demuestran el efecto de utilizar nucleótidos no natural fuertemente ligantes, 2'-O

metilribonucleótidos, en el extremo del tallo. Los grupos estabilizadores preferidos son no fluorescentes, de manera que los reactivos no contribuyan la fluorescencia de fondo a las amplificaciones y ensayos de amplificación. Las horquillas de oligonucleótidos de ADN no estabilizados de reactivos según la presente invención, añadidas a concentraciones inferiores a 1 μM, no es necesario que reduzcan sustancialmente el cebado defectuoso en el caso de que no se hayan modificado tal como se ha descrito para estabilizar el extremo del tallo unido por enlaces de hidrógenos, y en muchos no lo hacen. De esta manera, la estabilización resulta esencial en los reactivos según la presente invención.

Los reactivos de horquilla según la presente invención pueden describirse como moléculas que contienen dos oligómeros de nucleótidos complementarios que se mantienen unidos de manera que puedan formar un tallo de más de 6 pares de bases, y el extremo abierto del tallo se modifica químicamente por un medio u otro de manera que la tendencia del tallo de desenrollarse o "deshilacharse" en su extremo abierto resulte suprimida. Aunque una mayor comprensión del mecanismo molecular de acción requiere un análisis adicional de cinética enzimática en presencia y en ausencia de reactivos según la presente invención, así como el análisis estructural de la interacción de dichos reactivos con la polimerasa mediante microscopía electrónica, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X, puede anticiparse una comprensión parcial del mecanismo basándose en la información presentada en la presente memoria y en la literatura científica. La literatura enseña que la polimerasa Taq, al igual que otras ADN polimerasas, comprende un dominio sintético y un dominio exonucleolítico 5'. El dominio exonucleolítico 5' no se encuentra presente en el fragmento Stoffel. La literatura enseña además que el dominio sintético lleva a cabo la polimerización del ADN en primer lugar uniéndose y desplazándose a lo largo del ADN de doble cadena. El dominio sintético presenta una forma que se ha comparado con una "mano abierta" que, en presencia de dNTP, experimenta un cambio de forma a nivel de los polipéptidos al entrar en contacto con ADN de doble cadena. Como resultado, los "dedos" de la "mano" se "cierran" en torno a la molécula de ADN de doble cadena. Las secuencias incorrectamente apareadas dentro de una molécula de doble cadena provocan que la polimerasa retroceda algunos nucleótidos y sustituya la base correcta utilizando la función editora 3' del dominio sintético. La síntesis de una nueva cadena de ADN se produce a medida que el enzima lee la cadena molde y extiende el extremo 3' del cebador complementario. En el caso de que el enzima encuentre una cola 5' de un oligonucleótido ya unido a la cadena molde, la polimerasa puede invadir la región del oligonucleótido unido por 1 ó 2 nucleótidos y cortar la cola 5' resultante por medio del dominio 5'-exonucleasa del enzima.

Basándose en esta información puede plantearse la hipótesis de que el tallo de doble cadena del reactivo según la presente invención funciona, por lo menos en parte, mediante su unión al dominio sintético de la polimerasa en la conformación abierta y provocando que se cierre. De esta manera resulta inhibida la actividad sintética de la polimerasa. De esta manera, sin pretender vincularse a ninguna teoría en particular, puede postularse que el primer modo de acción es un inhibidor dependiente de la temperatura de la actividad sintética de la polimerasa. La evidencia presentada posteriormente indica que por lo menos algunas versiones de los reactivos no resultan liberadas por el enzima a la temperatura de fusión de sus regiones de doble cadena, por ejemplo los tallos, sino que siguen unidas a temperaturas más altas, incluyendo, especialmente, las temperaturas típicas de extensión por PCR. Sin embargo, durante la etapa de desnaturalización (o fusión de cadenas) de un ciclo de PCR, los reactivos de la presente invención se desligan de la ADN polimerasa. Durante la etapa de desnaturalización de los ciclos de PCR (también denominada etapa de fusión de cadenas), típicamente a una temperatura superior a 90ºC, los tallos de los reactivos de horquilla según la presente invención se separan por fusión y pueden unirse nuevamente a la polimerasa únicamente en el caso de que la temperatura caiga suficientemente para que se forme nuevamente la región de doble cadena. Por lo tanto, puede optarse por diseñar un reactivo según la presente invención que sea de doble cadena únicamente hasta la primera desnaturalización, es decir, que sea de doble cadena al añadirse a una mezcla de reacción de PCR previamente a la amplificación (comúnmente a temperatura ambiente) pero que posteriormente se mantenga a una temperatura superior a la Tm de su tallo. Para este tipo de forma de realización, la temperatura de hibridación de cebador de todos los ciclos de amplificación y cualquier temperatura de detección a baja temperatura de LATE-PCR es superior a la Tm de tallo calculada, preferentemente en por lo menos 5ºC. Alternativamente, puede optarse por diseñar un reactivo según la presente invención que nuevamente adquiera doble cadena posteriormente durante la amplificación. Esto puede llevarse a cabo utilizando una Tm de tallo (calculada tal como se ha indicado) que sea superior a la temperatura de hibridación del cebador utilizada en la totalidad o en algunos de los ciclos de amplificación. Alternativamente, en la amplificación por LATE-PCR, lo anterior puede llevarse a cabo utilizando una Tm de tallo inferior a la temperatura de hibridación del cebador, aunque superior a la temperatura de detección baja. El primer diseño generalmente no inhibe la polimerización, según indicaría un retraso del CT, mientras que la utilización de una temperatura de hibridación de cebador inferior a la Tm de tallo resultaría en un retraso modesto del CT de 1 a 3 ciclos de amplificación.

Además, aunque sin pretender vincularse a ninguna teoría en particular, puede postularse que un segundo modo de acción de los reactivos según la presente invención es un inhibidor dependiente de la temperatura de la actividad exonucleolítica 5' de la polimerasa. Los presentes inventores muestran posteriormente que los reactivos según la presente invención inhiben la actividad exonucleasa 5' a 3' del enzima polimerasa a temperaturas hasta por lo menos 55ºC y ello sin suprimir indebidamente la capacidad del enzima de extender una cadena de ADN mediante polimerización de su extremo 3' (del mismo modo que se extienden los cebadores de PCR en las amplificaciones por PCR).

Adicionalmente, aunque sin pretender vincularse a ninguna teoría en particular, puede postularse que un tercer modo de acción de los reactivos según la presente invención es un ligando dependiente de la temperatura que se une a la polimerasa, causando que los polipéptidos de la polimerasa cambien su forma. Tras liberarse el ligando del enzima, éste conserva la forma alterada durante algún tiempo antes de volver a su forma anterior. Por el contrario, en la forma alterada, el enzima se une preferentemente a híbridos de cebador-molde completamente complementarios y no a híbridos de cebador-molde parcialmente desapareados.

Basándose en dicho modelo puede anticiparse que la capacidad del tallo de los reactivos según la presente invención de cambiar la forma del dominio sintético de la polimerasa es diferente de la capacidad de los reactivos según la presente invención de inhibir la función sintética de la polimerasa (primer modo, expuesto anteriormente) o de la función exonucleasa 5' de la polimerasa (segundo modo, indicado anteriormente). Tanto el primer como el segundo modo de acción dependen de hecho de la velocidad a la que el reactivo unido resulta liberado por la polimerasa. Los reactivos según la presente invención que resultan liberados rápidamente actúan preferentemente mediante el tercer modo sin inhibir significativamente la actividad sintética de la polimerasa, incluso a concentración elevada. En contraste, los reactivos según la presente invención que resultan liberados de la polimerasa lentamente, probablemente presentan una acción inhibidora a concentración elevada. A título de ejemplo, el compuesto 12-C3DD que comprende un tallo y un bucle conector de carbonos de tres grupos metileno (-CH2-) y el compuesto 12-C3 C3DD que comprende un tallo y un bucle conector de carbonos de seis grupos metileno (-CH2-) sólo inhiben parcialmente la amplificación por PCR a una concentración de 3.000 nM. En contraste, los reactivos según la presente invención que presentan bucles que comprenden nucleótidos típicamente inhiben la amplificación por PCR completamente a una concentración <1.000 nM y en ocasiones a concentraciones inferiores a <500 nM en el ensayo del Ejemplo 1.

Tal como apreciarán los expertos en las interacciones de proteína-ácido nucleico, la acción de un reactivo según la presente invención puede producirse mediante más de uno de los modos 1 a 3, los cuales no son mutuamente exclusivos, sino que son relativos. Tal como se describe posteriormente, los presentes inventores han concebido un ensayo cuantitativo (Ejemplo 14) que puede utilizarse para determinar el grado con el que una estructura molecular particular que une los dos oligonucleótidos que comprenden el tallo provoca que el compuesto completo actúe como un inhibidor enzimático (mediante el primer o el segundo modo) o principalmente como intensificador de la especificidad enzimática: el tercer modo de acción.

Basándose en el modelo mencionado anteriormente, puede preverse adicionalmente que pueden unirse una o más moléculas de polimerasa a un número igual de moléculas de un reactivo según la presente invención que, a su vez, se unen covalentemente a un grupo de mayor tamaño, tal como una perla, partícula o material realizado de un material sólido. De esta manera, el sólido podría considerarse "cargado" con polimerasa. El enlace de los reactivos según la presente exposición al sólido podría ser temporal o podría cortarse mediante una diversidad de medios conocidos de la técnica. El corte del enlace liberaría el reactivo o el complejo de reactivo-polimerasa a la solución (posteriormente el reactivo podría liberarse de la polimerasa).

El diseño de reactivos según la presente invención puede ser apreciado por los expertos en la materia. Se apreciará que la temperatura de fusión de un tallo puede ajustarse considerablemente mediante la modificación de su contenido de G-C. Por ejemplo, los tallos de las dos formas de realización preferidas descritas posteriormente presentan una longitud de nueve nucleótidos, pero presentan Tm calculadas que difieren en 25ºC (81ºC y 56ºC). Los presentes inventores utilizan habitualmente el programa informático M-fold, mencionado anteriormente, para el cálculo de la Tm de tallo conjuntamente con una o más posibles secuencias de bucle. De otra manera la secuencia del bucle no se ha encontrado que resulte significativa en el cebado defectuoso de los reactivos según la presente invención. En el diseño de los presentes inventores se utilizó una secuencia que forma un tallo de extremos romos perfecto, es decir, un tallo sin desapareamientos internos y sin extremo protuberante terminal. De esta manera se podría, mediante simple ensayo y error, evaluar el efecto de la introducción de un desapareamiento interno (un desapareamiento terminal resulta desestabilizador y no es aceptable, tal como se muestra en el Ejemplo 1) o una extensión corta de un nucleótidos o como máximo de dos nucleótidos más allá de la región de doble cadena.

La construcción de reactivos según la presente invención se encuentra comprendida dentro de los conocimientos de la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse secuencias de oligonucleótidos en un sintetizador de oligonucleótidos. Pueden incluirse grupos estabilizadores utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, puede añadirse dabcilo convenientemente partiendo de una columna dabcilada (Glen Research) y concluyendo la síntesis con un nucleótido modificado con dabcilo. Pueden utilizarse nucleótidos no naturales como primer, penúltimo y último nucleótidos de la síntesis.

Tras diseñar y construir un reactivo candidato, la temperatura de fusión del tallo del mismo puede aproximarse empíricamente en algunos casos mediante la adición de pigmento fluorescente ligante de ADN y realizando un análisis de fusión bajo estimulación del pigmento (bajo la premisa de que el pigmento mismo presenta un efecto sobre la Tm). Además, en muchos casos puede obtenerse información práctica útil sobre la temperatuar de fusión real de un tallo estabilizado de un reactivo según la presente invención, por inferencia a partir de la realización de amplificación por PCR en tiempo real utilizando diferentes temperaturas de hibridación. Pueden llevarse a cabo ajustes de la longitud de los tallos o del contenido de G-C, en caso necesario, con el fin de alcanzar una Tm

deseada. A continuación, los presentes inventores evaluaron los efectos de un reactivo candidato sobre diversas manifestaciones del cebado defectuoso y la eficiencia de amplificación determinando su rendimiento en una amplificación por PCR rigurosa, tal como se indica posteriormente, en el Ejemplo 1. Se considera que un reactivo candidato es un reactivo según la presente exposición en el caso de que, al incluirse en la mezcla de reacción del Ejemplo 1 a alguna concentración inferior a 1.000 nM, preferentemente no superior a 650 nM, se obtenga un amplicón puro (ver la fig. 1). Se evaluaron los ensayos candidatos utilizando el ensayo del Ejemplo 1, aunque con la diana y cebadores deseados. Sin embargo, las amplificaciones y ensayos (amplificación más detección) según la presente exposición no se encuentran limitados a las condiciones o procedimientos del Ejemplo 1. Aunque un reactivo según la presente exposición debe inhibir por lo menos una manifestación del cebado defectuoso al añadirse a una concentración inferior a 1.000 nM en comparación con una concentración de polimerasa (Ejemplo 1) de 1,25 unidades por cada 25 μl de mezcla de reacción, el reactivo puede utilizarse a cualquier concentración respecto a la concentración de polimerasa a la que resulta efectivo; es decir, a cualquier concentración (o concentración relativa) a la que evite el apareamiento incorrecto pero no impida sustancialmente la amplificación. La utilización de los cebadores deseados en la evaluación revela las consecuencias no pretendidas, tales como el fracaso en el bloqueo del extremo 3' del reactivo o la no detección de complementariedad.

La presente exposición incluye reacciones y ensayos de amplificación por PCR que incluyen reacciones de amplificación por PCR, incluyendo reacciones en las que las mezclas de reacción de amplificación incluyen una ADN polimerasa termoestable que presenta tanto actividad de polimerización como actividad de exonucleasa 5'-3', tal como ADN polimerasa Taq, y en la que por lo menos un reactivo según la presente invención se encuentra incluido en la mezcla de reacción de amplificación. Muchos reactivos según la presente exposición inhiben la actividad de la polimerasa y se añaden a una concentración, respecto a la concentración de polimerasa comprendida dentro de los intervalos indicados anteriormente, previamente o durante el ciclado térmico, que no es superior a 1.000 nM, preferentemente no superior a 650 nm, para una reacción que contiene 1,25 unidades de ADN polimerasa por cada 25 μl de volumen de reacción. Algunos reactivos según la presente exposición, aunque resultan efectivos a concentraciones inferiores a 1.000 nM y preferentemente a concentraciones inferiores a 650 nM, inhiben la actividad de la polimerasa en menor grado y pueden añadirse a concentraciones de hasta 1.500 nM, o incluso de 3.000 nM, para dicha concentración de polimerasa. En los ensayos que contienen más de un reactivo según la presente invención, cada reactivo puede presentar un tallo con su propia Tm y puede añadirse a su propia concentración. de manera que diferentes reactivos funcionan en diferentes partes de las etapas durante el procedimiento de amplificación. En el caso de que se añada un reactivo de la presente invención durante el ciclado térmico, debe añadirse sin aspirar la mezcla de reacción hacia el interior del área de trabajo. Dichas reacciones de amplificación incluyen las amplificaciones por PCR simétricas, las amplificaciones por PCR asimétricas y las amplificaciones por LATE-PCR, cualquiera de las cuales puede incluir además transcripción inversa, en el caso de que se encuentren implicadas dianas de ARN. Las amplificaciones por PCR pueden utilizarse para preparar producto amplificado con cualquier fin, por ejemplo como material de partida para la secuenciación dideoxi. Las amplificaciones por PCR pueden combinarse con la detección del producto amplificado en un ensayo, incluyendo ensayos particularmente homogéneos que utilizan cebadores marcados, sondas marcadas o pigmentos fluorescentes ligantes de ADN, tales como verde SYBR o bromuro de etidio. El ensayo puede ser un ensayo en tiempo real, en el que las lecturas de detección se toman durante múltiples ciclos de amplificación, o un ensayo de punto final, en el que la detección se lleva a cabo tras completarse la amplificación. Puede ser cualitativa o cuantitativa, comprendiendo de manera no limitativa, un ensayo de punto final cuantitativo. El ensayo puede diseñarse para amplificar un único producto de doble cadena o de una cadena, o más de un producto de doble cadena sin o con productos relacionados de una cadena.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "LATE-PCR" se refiere a una amplificación de ADN no simétrica que utiliza el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un cebador oligonucleótido (el "cebador en exceso") en un exceso de por lo menos cinco veces con respecto al otro cebador (el "cebador limitante"), el cual se utiliza a concentración baja, de hasta 200 nM, de manera que se agote en un número de ciclos de PCR aproximadamente suficiente para producir amplicón de doble cadena detectable por fluorescencia, en el que la temperatura de fusión ajustada según la concentración del cebador limitante al inicio de la amplificación, Tm[0], es superior, o no inferior en más de 5ºC a la temperatura de fusión ajustada según la concentración del cebador en exceso al inicio de la amplificación, Tm[0]x, preferentemente 3 a 10ºC superior; y en el que el ciclado térmico se continúa durante múltiples ciclos tras agotarse el cebador limitante, con el fin de producir producto de una cadena, es decir, el producto de extensión del cebador en exceso. Los ensayos de LATE-PCR pueden incluir una etapa de detección a baja temperatura en la que se reduce la temperatura a un nivel inferior a la de hibridación del cebador durante por lo menos algunos ciclos de amplificación lineal. Preferentemente dicha etapa se produce tras la extensión antes de la fusión de cadenas.

La presente exposición también incluye kits completos de PCR, kits parciales y conjuntos de oligonucleótidos. Un kit completo de amplificación por PCR incluye por lo menos todos los reactivos para llevar a cabo una amplificación o ensayo de PCR, incluyendo por lo menos una pareja de cebadores de PCR, dNTP, tampón de reacción, ADN polimerasa termoestable, preferentemente una polimerasa que presenta actividad de exonucleasa 5' a 3', y por lo menos un reactivo según la presente invención. Un kit completo para un ensayo de PCR homogéneo incluye además cualquier reactivo adicional de detección que resulta necesario, por ejemplo un pigmento fluorescente del ADN o sondas marcadas fluorescentemente. Un kit completo de cualquiera de los tipos preferentemente incluye reactivos para la preparación de muestras y puede incluir, en algunas formas de realización, una transcriptasa inversa. Los kits parciales según la presente exposición omiten por lo menos algunos ingredientes de un kit completo, pero incluyen por lo menos la ADN polimerasa termoestable (y, en caso necesario, transcriptasa inversa) y por lo menos un reactivo según la presente invención. Por ejemplo, los productos conocidos comercialmente como

5 "mezcla maestra" o "kit básico" omiten típicamente cebadores y sondas de PCR. Un kit parcial preferente incluye todos los reactivos necesarios para una amplificación o ensayo excepto para la preparación de muestras. Los conjuntos de oligonucleótidos según la presente invención incluyen por lo menos una pareja de cebadores de PCR y por lo menos un reactivo según la presente invención. Pueden incluir además sondas oligonucleótidas o cebadores de secuenciación.

10 Los detalles de una o más formas de realización de la invención se proporcionan en los dibujos adjuntos y en la descripción, a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

15 Descripción de los dibujos

La figura 1 representa un análisis de electroforesis en gel de muestras procedentes de un ensayo de PCR riguroso cualitativo para los errores de cebado defectuoso, diseñado para someter a ensayo la actividad de inhibición de los reactivos descritos en la presente invención.

20 La fig. 2 representa que los reactivos según la presente invención permiten realizar ensayo basados en PCR en tiempo real y de punto final.

La fig. 3 representa un cromatograma de una secuencia de ADN obtenida a partir de productos de ADN de una 25 cadena generados tras 70 ciclos de amplificación por LATE-PCR en ausencia de errores de cebado defectuoso utilizando los reactivos descritos en la presente invención.

La fig. 4 representa el efecto del compuesto 9-3DD sobre una amplificación por LATE-PCR pentaplex.

30 La fig. 5 representa evidencia de que tras la unión de los reactivos de la invención a polimerasa Taq, no resultan liberados de la polimerasa hasta que la temperaturas de ciclado por PCR alcanzan la etapa de desnaturalización.

La fig. 6 representa una comparación directa de los reactivos de la presente invención para su efecto sobre la actividad de la ADN polimerasa a 25ºC.

35 La fig. 7 ilustra un ensayo para evaluar el efecto de los reactivos según la presente invención sobre una actividad exonucleasa de polimerasa en ausencia de actividad de polimerasa.

La fig. 8 ilustra la capacidad de un reactivo según la presente invención de evitar el cebado defectuoso en un ensayo 40 de PCR simétrico.

La fig. 9 ilustra un ensayo para cuantificar la inhibición de las exonucleasas.

La fig. 10 representa el efecto dependiente de la dosis de un reactivo según la presente invención sobre la formación 45 de dímeros de cebadores y oligómeros de cebadores en una amplificación por LATE-PCR.

La fig. 11 representa el efecto de una concentración baja de reactivo 9-22 DD sobre una amplificación por LATE-PCR dúplex de dos secuencias diana con dos parejas de cebadores.

50 La fig. 12 representa el efecto de modificar la composición del tallo del reactivo 9-3DD sobre una amplificación por LATE-PCR dúplex de dos secuencias dianas con dos parejas de cebadores.

La fig. 13 representa el efecto de modificar la concentración del reactivo 9-3bDD sobre una amplificación por LATE-CPR dúplex de dos secuencias diana con dos parejas de cebadores.

55 La fig. 14 representa el efecto de concentraciones crecientes de reactivo 9-3DD sobre la eficiencia de una amplificación por LATE-CPR en términos de los valores de CT.

La fig. 15 representa el efecto de concentraciones crecientes de reactivo 9-3DD sobre la eficiencia de una 60 amplificación por LATE-CPR en términos de pendiente de la señal de fluorescencia y de la fluorescencia final.

La fig. 16 representa los productos de una reacción multiplex realizada con y sin una mezcla de compuestos según la presente invención.

65 La fig. 17 representa los resultados de un ensayo para la acción del compuesto 12-3DD.

La fig. 18 representa los resultados de un ensayo para la acción del compuesto 12-C3DD.

En los diversos dibujos elementos similares se identifican con símbolos de referencia similares.

Descripción detallada

Tal como se ha expuesto anteriormente, los presentes inventores han identificado lo que consideran son tres tipos y causas diferentes de errores de cebado defectuoso. Para evaluar el cebado defectuoso de los tres tipos, los presentes inventores desarrollaron el ensayo riguroso del Ejemplo 1, posteriormente. La amplificación se inicia con ADN fragmentado, que estimula el cebado defectuoso. La manipulación física, por ejemplo aspirar el ADN con una pipeta, tiende a fragmentarlo. Además, debido a que sólo puede evitarse el cebado defectuoso de tipo 1 mediante reactivos y métodos de "inicio en caliente", los presentes inventores han incluido en el ensayo muchos ciclos de temperatura (por lo menos 60). Además, los presentes inventores han incluido una etapa de detección a temperatura baja, utilizada en algunos ensayos de LATE-PCR. Además, los presentes inventores también identifican la formación de dímeros de cebadores y la oligomerización y amplificación adicionales de los mismos como un tipo adicional de cebado defectuoso. La formación y amplificación de dímeros de cebadores puede producirse tanto en presencia como en ausencia de ADNs de molde añadidos, y los presentes inventores también han desarrollado ensayos para estos fenómenos.

Mientras que los enzimas de inicio en caliente resultan efectivos únicamente antes del inicio de la amplificación debido a cambios irreversibles producidos tras el calentamiento a una temperatura elevada, por ejemplo 95ºC, los reactivos de cebado defectuoso según la presente invención no se desnaturalizan irreversiblemente y podrían provocar efectos positivos o negativos, o ambos, posteriormente en la reacción, en el caso de que se incluya una etapa de baja temperatura.

Pueden diseñarse tallos para que presenten temperaturas de fusión, Tm, superiores o inferiores a temperaturas de ciclo particulares, con diferentes impactos sobre la amplificación. Durante el diseño de los tallos, se considera preferentemente que la fusión es un fenómeno dinámico que se produce en un intervalo de temperaturas, especificando la Tm la temperatura a la que el cincuenta por ciento de las moléculas se encuentra en forma de doble cadena y el cincuenta por ciento en forma de una cadena. Los presentes inventores creen que la unión de algunos tallos a la polimerasa desplaza el equilibrio entre las moléculas que siguen no unidas a la polimerasa en favor al cierre de más tallos. En el caso de que se desee que la amplia mayoría de los tallos se encuentren cerrados a una temperatura de ciclo particular, tal como la temperatura de hibridación del cebador, generalmente se parte de un tallo oligonucleótido no modificado que presente una Tm calculada por lo menos 5ºC superior a dicha temperatura, partiendo de la base de que la modificación estabilizadora del tallo incrementará la Tm real en varios grados. A la inversa, en el caso de que se desee que la amplia mayoría de los tallos se encuentre abierto a una temperatura de ciclo particular, generalmente partiremos de un tallo oligonucleótido no modificado que presente una Tm calculada por lo menos 5ºC inferior, preferentemente por lo menos aproximadamente 10ºC inferior, a dicha temperatura de ciclo particular, nuevamente partiendo de la base de que la modificación estabilizadora del tallo probablemente elevará la Tm real en varios grados.

Mediante la utilización de un reactivo particular según la presente invención con diferentes temperaturas de hibridación de cebador puede presentar diferentes efectos sobre la eficiencia de amplificación, tal como demuestran los presentes inventores posteriormente, en el Ejemplo 5. Una de las formas de realización actualmente calculadas (el compuesto 9-22 DD) expuesto a continuación presenta una Tm calculada de 81ºC. Se cerrará durante cada ciclo térmico de PCR típico a medida que se baja la temperatura respecto de la temperatura de fusión de cadenas (por ejemplo 95ºC) hasta la temperatura de hibridación del cebador (por ejemplo 55ºC). Un reactivo con dicho tallo presentará un efecto durante cada ciclo de amplificación. Otra de las formas de realización preferidas en el contexto de la presente invención (compuesto 9-3DD) presenta una Tm calculada de 56ºC. En el caso de que las mezclas de amplificación por PCR se preparen a temperatura ambiente, dicho reactivo presenta un tallo cerrado y se une a la polimerasa. Permanece unido a medida que se eleva la temperatura al inicio de la amplificación. Las moléculas de 9-3DD unidas a la polimerasa se desligan y se abren durante la etapa inicial a alta temperatura y no se unen a la polimerasa nuevamente a menos que la temperatura se baje suficientemente para que el tallo de las moléculas no unidas se cierre. De esta manera, manteniendo la temperatura de ciclo más baja a 65ºC, no se forma nuevamente el tallo. Bajo estas condiciones, dicha forma de realización funcionará en el aspecto de que la amplificación como reactivo de inicio en caliente para impedir el cebado defectuoso que se produce antes del inicio de la amplificación. Sin embargo, en el caso de que se incluya una etapa de detección a baja temperatura, por ejemplo la incubación a 40ºC tras la extensión en un ciclo de LATE-PCR para permitir la hibridación de una baliza molecular de baja temperatura u otra sonda marcada, con la cadena individual que se acumula durante la etapa lineal de la amplificación, el tallo que presenta una temperatura de fusión calculada de 56ºC se cerrará, permitiendo que el reactivo se una a la polimerasa nuevamente hasta alcanzar una temperatura elevada de fusión de las cadenas.

El Ejemplo 1, a continuación, describe un ensayo de LATE-PCR riguroso que los presentes inventores utilizan para evaluar el rendimiento de los reactivos según la presente invención. La fig. 1 muestra que los errores de cebado defectuoso no sólo se producen con ADN polimerasas Taq "normales", es decir, ADN polimerasas termoestables con actividad exonucleasa 5' a 3', sino sin modificación de inicio en caliente (carriles b y carriles c), sino también con

polimerasas Taq de inicio en caliente (carriles d y carriles e). La fig. 1 muestra además la eliminación de los productos no específicos formados debido a errores de cebado defectuoso, no sólo a amplificaciones con polimerasas de inicio en caliente (carriles h y carriles i), sino también a amplificaciones con ADN polimerasas Taq normales (carriles f y carriles g). La efectividad de los compuestos 9-22 DD y 9-3DD en la supresión del cebado defectuoso se evaluó utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. SE encontró que ambos suprimían el cebado defectuoso de tipo 1. La Tm calculada reducida del tallo de 9-3DD (56ºC) permite que se utilice simplemente a modo de reactivo eficaz de inicio en caliente mediante la utilización de un protocolo de amplificación por PCR con todas las temperaturas de ciclo de 60ºC y superiores. Mediante el mantenimiento de una temperatura superior al punto de fusión del tallo, éste no se forma nuevamente a medida que se produce la amplificación. El compuesto 9-3DD no presenta un efecto inhibidor de la eficiencia de la polimerización al utilizarse de esta manera. El Ejemplo 5, posteriormente, es ilustrativo de este aspecto. Compara amplificaciones en las que se utiliza reactivo 9-3DD y temperaturas de hibridación de 65ºC y 55ºC. A 65ºC no se encontró ningún efecto sobre la eficiencia de la polimerización, tal como indica CT. A 55ºC, sin embargo, se detecta un retraso de CT. Esto pone de manifiesto que, en el caso de que se reduzca la temperatura suficientemente para que se cierre el tallo y se una la polimerasa, la unión se mantiene a medida que se eleva la temperatura para la extensión del cebador, incluso en el caso de que la temperatura de extensión del cebador sea superior a la Tm del tallo. Por otra parte, la elevada Tm del tallo de 9-22 D (81ºC) permite que el tallo forme nuevamente una horquilla durante la etapa de hibridación del cebador de cada ciclo de PCR. Evita la manifestación no sólo del cebado defectuoso de tipo 1, sino también del cebado defectuoso de tipo 1, del cebado defectuoso de tipo 3 y la formación de dímeros de cebadores. Sin embargo, no afecta a la eficiencia de la polimerización, tal como pone de manifiesto un retraso de 1,5 ciclos del ciclo umbral (CT) de la amplificación por PCR seguida en tiempo real por verde SYBR-1 ó una sonda de baliza molecular específica de diana utilizada a una concentración de 100 nM.

La Tabla I en el Ejemplo 1 informa de la aplicación de dicho ensayo riguroso a una serie de aditivos, e informa además de la concentración mínima necesaria para conseguir la prevención de las manifestaciones del cebado defectuoso, es decir, la prevención de niveles detectables de productos no específicos formados debido a errores de cebado defectuoso y la presencia de únicamente el producto de amplificación específico deseado, tal como se muestra en los carriles f y g de la fig. 1, utilizando ADN polimerasa Taq normal y no la versión de inicio en caliente. En la Tabla I, se identificaron los compuestos mediante el sistema de nomenclatura de los presentes inventores. Las moléculas de horquilla no modificadas se identifican a partir de la longitud de bucle del tallo. Por ejemplo, el compuesto 6-22 presenta un tallo de seis nucleótidos de longitud y un bucle de veintidós nucleótidos de longitud. En el caso de que el identificador del bucle se inicie con un número o sea únicamente un número ("22" ó "3b"), el bucle es de nucleótidos. Los bucles no nucleotídicos se especifican adicionalmente. El compuesto 12-C3C3 presenta un tallo de dos nucleótidos de longitud y un bucle que es una cadena de seis carbonos, es decir, una cadena de seis grupos metileno (CH2). Se han realizado diversas modificaciones en uno o ambos extremos de las horquillas básicas. Éstas se designan mediante sufijos, en los que 3D es dabcilo (5'-dimetoxitritiloxi-5-[(N-4'-carboxi-4(dimetilamino)-azobenceno)-aminohexil-3-acrilimido]-2'-desoxiuridina-3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita) añadido al nucleótido 3'-terminal, 5D es un bacilo añadido al nucleótido 5'-terminal, DD es un dabcilo añadido a ambos nucleótidos terminales, BHQBHQ es un inhibidor Black Hole añadido a ambos nucleótidos terminales, FF es un fluoróforo (en este caso, FAM) añadido a ambos nucleótidos terminales, AA es una adenosina (A) añadida a ambos nucleótidos terminales y TT es una timidina (T) añadida a ambos nucleótidos terminales.

Además de las adiciones, pueden realizarse varias modificaciones a los tallos básicos. El sufijo 2'OM4 indica que se modificaron cuatro nucleótidos terminales, los últimos dos en cada oligonucleótido del tallo o brazo, de desoxirribonucleótidos a 2'-O-metilnucleótidos. Para modificar la temperatura de fusión de los tallos, los presentes inventores modificaron el contenido de G-C. Los compuestos en los que la secuencia del tallo, pero no la longitud del mismo, ha sido modificada, se indica con un indicador en letras minúsculas que precede al sufijo modificador terminal, por ejemplo 9-3bDD ó 9-3i DD. Las secuencias de nucleótidos, que también muestran los bucles de cadena de carbonos, para los diversos compuestos en la Tabla I se presentan en la Tabla II. La Tabla I es ilustrativa de varios aspectos. Muestra, por ejemplo, que en dicho ensayo, los oligonucleótidos de horquilla de ADN no modificados no resultan efectivos o resultan efectivos únicamente a concentraciones elevadas, de 1.000 nM o superiores. El oligómero 9-22 (tallo de 9 nucleótidos de longitud, bucle de 22 nucleótidos de longitud) resultaba efectivo únicamente a la concentración de 3.000 nM, el nivel informado de supresión del cebado defectuoso para el ADN de doble cadena. Los oligómeros 6-22 (tallo de 6 nucleótidos de longitud, bucle de 22 nucleótidos de longitud) y 9-5 (tallo de 9 nucleótidos de longitud, bucle de 5 nucleótidos de longitud) no resultaron efectivos ni siquiera a la concentración de 3.000 nM. Sin embargo, al modificar el oligómero 9-22 mediante la adición de grupos dabcilo a ambos extremos del tallo para crear el compuesto 9-22 DD, un reactivo preferido según la presente invención, únicamente resultó necesaria una concentración de 50 nM para evitar las manifestaciones del cebado defectuoso. Al modificar de manera similar el oligómero 9-3, únicamente resultó necesaria una concentración de 100 nM.

La Tabla I muestra el efecto de la longitud del tallo. Mientras que varios oligómeros con tallos de nueve y doce nucleótidos eliminaron el cebado defectuoso a concentración reducida al modificarlos con una pareja de inhibidores dabcilo de interacción, el oligómero 6-22 no respondió de esta manera a la modificación: la composición 6-22 DD, que no es un reactivo según la presente invención, resultó efectivo únicamente a concentración elevada (3.000 nM). Los reactivos según la presente invención presentan tallos de longitud superior a seis nucleótidos e inferior a catorce

pares de bases en la mayoría de casos. Las longitudes menores de catorce pares de bases resultan actualmente preferentes.

La Tabla I también muestra la efectividad de otras modificaciones que incrementan la intensidad de unión en el extremo del tallo. La adición de una pareja de inhibidores Black HoleTM interactivos al tallo del oligómero 9-5 produjo el reactivo 9-5 BHQBHQ, del que únicamente se requirió una concentración de 100 nM para producir la eliminación de los productos no específicos formados debido al errores de cebado defectuoso, y la presencia de únicamente el producto de amplificación específico deseado. La sustitución de dos 2'-O-metilribonucleótidos en cada extremo del oligómero 9-5 produjo el reactivo 9-5 2'OM , para el que sólo se requirió una concentración de 50 nM.

La Tabla I muestra que la longitud del bucle de oligonucleótidos puede modificarse considerablemente. Las longitudes de bucle de tres nucleótidos (reactivo 9-3DD), de cinco nucleótidos (reactivo 9-5 DD) y de veintidós nucleótidos (reactivo 9-22 DD) resultaron todas ellas en reactivos según la presente invención que evitaron el cebado defectuoso a concentraciones de 100 nM o inferiores. Simultáneamente, la Tabla I muestra que resulta necesario algún ajuste por ensayo y error para la optimización. En el caso de que se sustituya una pareja de 2'-Ometilribonucleótidos por los inhibidores dabcilo en la modificación estabilizadora del oligómero 9-5 (en la comparación entre el reactivo 9-5 2'OM4 y el reactivo 9-5 DD), el nivel de efectividad no resulta modificado: sólo se requiere una concentración de 50 nM. Sin embargo, con la misma modificación del oligómero 9-3 modificado (comparando el reactivo 9-3 2'OM4 con el reactivo 9-3DD), el nivel de efectividad, aunque todavía era bueno, se redujo: resultó necesaria una concentración de 300 nM y no de 50 nM. Los mismos datos muestran que el incremento de la longitud de bucle del reactivo 9-3 2'OM4 en dos nucleótidos para crear el reactivo 9-5 2'OM4 mejoró la efectividad: únicamente resultó necesaria una concentración de 50 nM, y no de 300 nM. Los reactivos candidatos pueden evaluarse rutinariamente y ajustarse con ayuda de un ensayo rigoroso, tal como el descrito en el Ejemplo 1.

La Tabla I también muestra que los compuestos que comprenden dos oligonucleótidos complementarios que se mantienen unidos con polaridades opuestas mediante un puente (bucle) no nucleotídico siguen siendo activos tras modificar según la presente invención los extremo libres 3' y 5' de los oligonucleótidos (en las formas de realización sometidas a ensayo con grupos dabcilo). La Tabla I muestra que el tamaño del puente no nucleotídico no es crítico. Los puentes presentados en la Tabla I son conectores químicos que comprenden cadenas lineales de 3 a 6 átomos de carbono, aunque el experto en la materia podrá construir muchas otras variaciones de puentes (bucles) no nucleotídicos. Los datos en la Tabla I sugieren que un puente de una cadena de 3 átomos de carbono es mejor que uno de una cadena de 6 átomos de carbono para el mismo tallo oligonucleótido (activo a una concentración más baja) y, aunque no analizado mediante un ensayo riguroso, los presentes inventores plantean la hipótesis de que esta diferencia refleja la flexibilidad relativa de los puentes y en consecuencia su efecto o capacidad de elevar o reducir la temperatura de fusión del tallo. Los presentes inventores utilizaron conectores neutros (sin carga), que resultan preferidos.

Se ejemplifican en los Ejemplos 2 a 4, a continuación, diferentes aplicaciones de reactivos y método según la presente invención. El Ejemplo 2 describe la utilización del reactivo 9-22 DD en un ensayo LATE-PCR que es un ensayo en tiempo real pero que se demuestra que también resulta adecuado para un ensayo de punto final. El ensayo del ejemplo 2 utiliza una técnica de detección que es el objeto de la solicitud provisional de patente U.S. presentada simultáneamente de los presentes inventores nº 60/619.654, titulada "Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid Amplification". Dicha técnica de detección incluye añadir tanto un pigmento fluorescente de ADN, tal como SYBR-oro, que emite fluorescencia unido al ADN de doble cadena, y una sonda de hibridación marcada con fluoróforo complementaria al amplicón de una sola cadena producido en una amplificación por LATE-PCR tras el agotamiento del cebador limitante, en la que el fluoróforo resulta estimulado por la emisión del pigmento; estimular el pigmento; detectar emisiones tanto del pigmento como del fluoróforo, y calcular la proporción entre la señal del fluoróforo y la señal del pigmento. El Ejemplo 2 muestra, de esta manera, la compatibilidad de los reactivos según la presente invención con sondas y pigmentos fluorescentes, y el bloqueo efectivo del cebado defectuoso al utilizar cualquiera de los dos o ambos.

El Ejemplo 4 describe varias amplificaciones por LATE-PCR multiplex utilizando, dos, tres, cuatro e incluso cinco parejas de cebadores, y muestra la amplificación de los amplicones correctos en todos los casos al añadir el reactivo 9-3DD a la mezcla de reacción. Aunque se analizaron los productos amplificados mediante electroforesis en gel para el propósito del Ejemplo 4, el método multiplex también resulta aplicable a ensayos multiplex, incluyendo ensayos cualitativos y cuantitativos, tales como ensayos en tiempo real, utilizando otros medios de detección, tales como sondas de hibridación fluorescente para los amplicones deseados. Para los ensayos de LATE-PCR en tiempo real, los presentes inventores prefieren utilizar una etapa de detección a baja temperatura tras la etapa de extensión de cebador y sondas de baja temperatura tal como se ilustra, por ejemplo, en el Ejemplo 3.

El Ejemplo 13 ilustra que también pueden utilizarse reacciones de amplificación con mezclas de reacción de amplificación que contienen más de una versión de los reactivos según la presente invención. Por ejemplo, una mezcla de amplificación puede contener tanto un compuesto de la presente invención con una temperatura de fusión elevada, como otro compuesto de la presente invención con una temperatura de fusión reducida, añadiendo cada uno a su propia concentración optimizada. El tallo del compuesto 9-22 DD con una Tm calculada de 81ºC se encuentra en la conformación cerrada al inicio de la reacción y poco después de la reducción de la temperatura

durante cada ciclo térmico, mientras que el compuesto 12-3DD, con una Tm calculada de 58ºC, únicamente se encuentra cerrada a temperaturas relativamente bajas. Por lo tanto, actúa como un "iniciador en caliente" que bloquea el cebado defectuoso en el caso de que la mezcla de reacción se prepare a temperatura ambiente, pero durante los ciclos térmicos posteriores de una amplificación por PCR con una temperatura de hibridación de 60ºC o superior, no se cierra y se une a la polimerasa. Las mezclas de reactivos resultan particularmente útiles para la construcción de reacciones multiplex en las que se combinan múltiples parejas de cebadores con un abanico de temperaturas de hibridación, para la amplificación de múltiples amplicones. La mezcla de reactivos utilizada en el Ejemplo 13 es mejor que cualquiera de los reactivos individuales por sí solo.

El Ejemplo 3 describe una amplificación por LATE-PCR que utiliza el reactivo 9-3DD para preparar producto de una cadena amplificado en cantidad suficiente y suficientemente libre de productos no específicos procedentes del cebado defectuoso para resultar adecuado como material de partida para la secuenciación. La amplificación se extendió en setenta ciclos para garantizar una cantidad suficiente de material de partida. Los presentes inventores encontraron que algunos amplicones presentaban una mayor tendencia a sufrir errores de cebado defectuoso de tipos 2 y 3 que los demás amplicones. En las amplificaciones en las que dicho cebado defectuoso era más probable, los presentes inventores prefieren que el tallo del reactivo según la presente invención se cierre al caer la temperatura de ciclado de la etapa de fusión de cadenas a la etapa de hibridación de cebador. Esto puede conseguirse ajustando la Tm del tallo, la temperatura de hibridación, o ambas. En un trabajo relacionado los presentes inventores han encontrado que la dilución del producto es un método de lavado simple para la utilización con la secuenciación, tal como se da a conocer en la solicitud provisional de patente US mencionada anteriormente, presentada simultáneamente por los presentes inventores.

Los presentes inventores investigaron el funcionamiento y la efectividad de las formas de realización de reactivos de la presente invención comparándolas con oligómeros formadores de horquilla de ADN no modificados y entre sí. Se diseñó un ensayo de polimerización del ADN para determinar la extensión de un cebador marcado por parte de la ADN polimerasa Taq en presencia de un reactivo de ensayo. El ensayo utilizaba cebadores que se habían marcado con fluoróforos que resultaban excitados por la emisión de un pigmento fluorescente, tal como se da a conocer en la anteriormente indicada solicitud provisional de patente U.S. presentada simultáneamente por los presentes inventores. La mezcla de ensayo contenía una concentración de 0,5 μM de un oligonucleótido de ADN molde sintético, una concentración de 1,5 μM de un cebador de ADN complementario al extremo 3' del molde y marcado con Cy5 en su extremo 5', tampón de PCR, MgCl2, ADN polimerasa Taq, una dilución 1:40.000 de pigmento de ADN fluorescente verde SYBR, y el reactivo de ensayo. El inicio controlado de la reacción se consiguió mediante la adición de dNTP. La reacción era isotérmica: transcurría a una temperatura determinada durante un tiempo determinado. Para evaluar el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa, los presentes inventores añadieron a la mezcla de reacción un "bloqueante", es decir, un oligonucleótido que era complementario al extremo 5' del molde, el cual se encontraba bloqueado en su extremo 3' con un fosfato y marcado con ROX en su extremo 5'. Para evaluar el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad de polimerización de la ADN polimerasa se omitió el bloqueante. Para facilitar el análisis de los productos de reacción mediante análisis de la curva de fusión, se diseñaron un molde, un cebador y un bloqueante de manera que fuesen fácilmente distinguibles a partir de sus temperaturas de fusión los híbridos siguientes: cebador-molde, bloqueantemolde, producto de extensión de longitud completa-molde y producto de extensión parcial (hasta el bloqueante)molde. El análisis en tiempo real se consiguió mediante excitación periódica del pigmento y seguimiento periódico de la emisión de fluorescencia del pigmento y de los dos fluoróforos, los cuales resultan excitados indirectamente por la emisión del pigmento. El incremento de fluorescencia del verde SYBR-1 indica polimerización. La reducción de la fluorescencia de ROX indica degradación del bloqueante. El análisis de punto final se realizó deteniendo la reacción mediante adición de EDTA 12 mM, ajustando la dilución de verde SYBR-1 a 1:14.200, y ajustando la concentración del compuesto de ensayo a 800 nM, y después realizando un análisis estándar de la curva de fusión, mediante estimulación del pigmento y realización de un seguimiento de la fluorescencia de cada uno de los dos fluoróforos.

Los presentes inventores evaluaron los compuestos 9-22, 9-22 DD y 9-3DD con incubaciones a 55ºC durante 60 minutos. Se incluyó asimismo, un control sin compuesto de ensayo. Los resultados del control incubado en presencia de bloqueante pero sin compuesto de ensayo indican que la ADN polimerasa Taq extendía el cebador pasando por la región del bloqueante, aunque no por completo bajo dichas condiciones, produciendo producto con prácticamente un único pico de fusión según la fluorescencia de Cy5. De esta manera, el enzima mostraba tanto actividad de polimerización como actividad de exonucleasa 5' a 3'. Los resultados con el compuesto 9-22 DD presente a una concentración de 300 ó 1.000 nM mostraron la producción de un producto de extensión parcial y un efecto sobre la cantidad de bloqueante residual de un modo dependiente de la dosis. De esta manera, el compuesto 9-22 DD inhibió la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa a 55ºC. Se produjo una reducción de la producción de producto de longitud completa, particularmente a la concentración de 1.000 nM, sugiriendo que a la concentración alta el compuesto 9-22 DD empieza a inhibir la polimerización.

Otro ensayo que los presentes inventores han utilizado para investigar las propiedades de los reactivos según la presente invención se describe posteriormente, en el Ejemplo 6. El ensayo detecta la capacidad de un reactivo de ensayo de inhibir la extensión por parte de la ADN polimerasa Taq a 25ºC. Los resultados proporcionados en el Ejemplo 7 muestran que, mientras que los oligonucleótidos de horquilla no modificados 9-22 y 9-3 no presentaron ningún efecto comparado con el control, los reactivos 9-22 DD y 9-3DD inhibieron la extensión de los cebadores de

una manera dependiente de la dosis. De esta manera, incluso a una temperatura suficientemente baja para los reactivos según la presente invención para inhibir la actividad de polimerización a concentraciones bajas, los análogos no modificados de los mismos no presentaron esta propiedad a las mismas concentraciones.

Los presentes inventores utilizaron dos ensayos para investigar el efecto de inhibición de los reactivos según la presente invención sobre la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa. Se describe un ensayo posteriormente, en el Ejemplo 7. El ensayo mide la inhibición de la actividad de exonucleasa 5' a 3' durante el ciclado térmico. La fig. 7 muestra que el reactivo 9-22 DD inhibe la actividad de exonucleasa de una manera dependiente de la dosis a concentraciones bajas comprendidas entre 50 y 300 nM.

El segundo ensayo se describe a continuación, en el Ejemplo 9. Mide cuantitativamente la inhibición de la actividad de exonucleasa 5' a 3' a 25ºC. La fig. 9 muestra la inhibición dependiente de la dosis por parte del reactivo 9-22 DD a concentraciones de entre 50 y 1.000 nM.

A continuación, en el Ejemplo 6, se describe todavía otro ensayo, que mide la inhibición por parte de reactivos de la extensión de cebadores realizada por el fragmento Stoffel de la ADN polimerasa Taq. Tal como en el caso de la polimerasa Taq intacta, la inhibición de la extensión requería la presencia de extremos modificados en los tallos oligonucleótidos y no resultó significativamente afectada por la longitud del bucle en el tallo. Sin embargo, al contrario que en el caso de la polimerasa Taq, el fragmento Stoffel resultó inhibido por el compuesto 6-22 DD, un reactivo que presenta un tallo de únicamente seis nucleótidos. Los presentes inventores concluyeron que el fragmento Stoffel no interactúa con el reactivo del mismo modo que la polimerasa intacta.

Los reactivos según la presente invención resultan útiles para prevenir el cebado defectuoso en ensayos de PCR simétricos, tal como se demuestra posteriormente, en el Ejemplo 8. El ensayo medía la amplificación de una secuencia en el gen de la fibrosis quística utilizando una pareja equimolar de cebadores que presentan valores de Tm muy similares.

Las amplificaciones por PCR y ensayos actualmente utilizados incluyen la preparación de mezclas de reacción de amplificación a temperatura ambiente, que de esta manera requieren la inclusión de reactivos según la presente invención en la mezcla inicial para inhibir el cebado defectuoso de tipo 1. Sin embargo, no es necesariamente de esta manera. Determinados métodos automáticos, por ejemplo métodos de microfluidos, permiten la adición de polimerasa a una mezcla de reacción a temperatura elevada para un inicio en caliente, evitando de esta manera el cebado defectuoso de tipo 1. Con dichos métodos, los reactivos según la presente invención podrían añadirse tras iniciarse la amplificación.

La formación de dímeros de cebadores es una manifestación del cebado defectuoso que puede tener lugar en las reacciones completas, es decir, las que contienen todos los componentes necesarios para la amplificación más secuencias de una diana inicial, así como en reacciones que no contienen secuencias diana. Los dímeros de cebadores típicamente son secuencias cortas de ADN de doble cadena formadas mediante cebado defectuoso de uno o más cebadores en una reacción mediante hibridación y extensión a lo largo de una copia del mismo cebador de una cadena o algún otro cebador presente en la reacción. La formación de dímeros de cebadores en presencia de una secuencia diana se observa en forma de acumulación de dímeros de cebadores además de la acumulación del amplicón esperado. La formación de dímeros de cebadores en ausencia de una secuencia diana se observa como una acumulación del dímero de cebadores sin acumulación de un amplicón específico. Los dímeros de cebadores también pueden formar oligómeros que presentan una secuencia más larga que la del dímero de cebadores básico debido a que contienen copias concatenadas adicionales de uno o ambos cebadores. El proceso de la oligomerización no se conoce por completo, pero se detecta fácilmente mediante electroforesis en gel o análisis del punto de fusión de los productos de reacción. Debido a la formación de dímeros de cebadores, la cantidad de amplicones esperados que se producen durante un número dado de ciclos térmicos se reduce a medida que uno o ambos cebadores se consumen en la generación y acumulación de dímeros de cebadores. Por lo tanto, resulta deseable la eliminación de los dímeros de cebadores debido a que incrementa tanto la especificidad como el rendimiento del producto correcto. Estas características de los dímeros de cebadores, así como su eliminación mediante la adición de los reactivos descritos en la presente invención, se ilustran en el Ejemplo 10.

La probabilidad de formación de dímeros de cebadores resulta incrementada por la homología de secuencia entre el extremo 3' de un cebador y las secuencias internas del mismo cebador o de un cebador diferente, además de muchos otros factores, por ejemplo la elevación de la concentración de cebador, el incremento de la concentración de magnesio, el incremento de la longitud del cebador, la reducción de la temperatura de hibridación del ciclo térmico, y el incremento del número total de cebadores incluidos en la reacción. Además, es bien conocido en la técnica que la probabilidad de formación de dímeros de cebadores es mucho más alta en las reacciones que utilizan polimerasas no de inicio en caliente en comparación con las que utilizan polimerasas de inicio en caliente. Esto se debe a la hibridación de cebador-cebador y la extensión pueden producirse a temperaturas relativamente bajas al mezclar los componentes de la reacción. Los enzimas de inicio en caliente reducen, aunque no eliminan por completo, la generación y acumulación de los dímeros de cebadores. Estas características de los dímeros de cebadores, así como su eliminación mediante adición de los reactivos descritos en la presente invención, se ilustran en el Ejemplo 11.

La formación de los dímeros de cebadores también puede presentar efectos sutiles sobre la cinética de una reacción, y su eliminación mediante adición de los reactivos indicados en la presente memoria puede observarse y optimizarse cinéticamente. El Ejemplo 12 describe una amplificación por LATE-PCR que comprende dos parejas de 5 cebadores y que genera dos productos de una cadena. La acumulación cinética de uno de estos productos se detecta mediante hibridación con una sonda fluorescente, y se muestra en las figs. 13 y 14. Los datos demuestran que la linealidad de la cinética resulta afectada tanto por la composición exacta del tallo del reactivo, debido a su efecto sobre la temperatura de fusión, como por la concentración del reactivo. Además, la utilización óptima y subóptima de los reactivos puede alterar la velocidad de la amplificación lineal en un LATE-PCR y de esta manera, 10 la magnitud de la señal al final de la reacción, sin afectar el valor de CT de la reacción. Las figs. 15 y 16 demuestran que la eficiencia de la amplificación era la misma según los valores de CT en un intervalo de concentraciones iniciales de molde al utilizar el compuesto 9-3DD a una concentración de 150 y de 300 nM, aunque la magnitud de las señales que aparecen con concentraciones iniciales de molde de 100 y 1.000 en presencia de 9-3DD 300 nM era más alta que las obtenidas utilizando 9-3DD 150 nM, probablemente debido a la ausencia de formación de dímeros

15 de cebadores.

Ejemplos

Ejemplo 1. Ensayo riguroso para evaluar los errores de cebado defectuoso.

20 Con el fin de evaluar el cebado defectuoso de tipos 1, 2 y 3, en las reacciones de amplificación por PCR, los presentes inventores llevaron a cabo una amplificación por LATE-PCR utilizando ADN genómico fragmentado e investigaron los productos mediante análisis del punto de fusión y mediante electroforesis en gel. Una amplificación particular que han utilizado los presentes inventores es la siguiente:

A. Sustrato: 10 a 10.000 equivalentes genómicos de ADN genómico fragmentado. El ADN se obtuvo comercialmente y se procesó mediante congelación y descongelación de ADN genómico múltiples veces o mediante cualquier otro método similar conocidos por el experto en la materia para la fragmentación de ADN.

30 B. Mezcla-base para la amplificación por PCR (ver Sánchez et al., PNAS 101:1933-1938, 1994):

Sustrato: 2.000 genomas de ADN genómico fragmentado

1X tampón para PCR 35 Mg2+: a una concentración de 3 milimolar (mM)

dNTP: concentración de 250 micromolar (μM) de cada uno de los cuatro dNTP

40 Cebador en exceso: secuencia 5' CTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEC ID nº 13) a una concentración de 1.000 nanomolar (nM)

Cebador limitante: secuencia 5' CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEC ID nº 14) a una concentración de 50 nM 45 ADN polimerasa: 1,25 unidades por cada 25 microlitros (μl) de mezcla de reacción.

C. Protocolo de amplificación.

50 Incubación a baja temperatura: 35 minutos a temperatura ambiente. Protocolo de amplificación por PCR: enjuague a alta temperatura, a 95ºC durante 15 minutos; 10 ciclos a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 30 segundos; seguido de 70 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 30 segundos.

55 Se estableció un caso de línea base de cebado defectuoso mediante amplificaciones utilizando dos ADN polimerasas termoestables: Taq de Promega y Taq de Invitrogen, sin utilización de ninguna metodología de inicio en caliente. Se llevaron a cabo amplificaciones adicionales utilizando dos ADN polimerasas de inicio en caliente comerciales diferentes: Hot Star Taq de Qiagen y Platinum Taq (Invitrogen). Finalmente, se llevaron a cabo amplificaciones adicionales con la adición de 300 nM de una forma de realización actualmente preferente de un

60 reactivo según la invención. Una forma de realización utilizada en el presente ejemplo es un reactivo al que los presentes inventores hacen referencia como composición 9-22 DD (en la nomenclatura de los presentes inventores "9" es la longitud del tallo, "22" es la longitud del bucle y "DD" se refiere a la modificación estabilizadora, en este caso una pareja de inhibidores dabcilo). El compuesto 9-22DD presentaba una Tm calculada de 81ºC. Presentaba la secuencia mostrada en la Tabla II, que ha sido modificada mediante la adición

65 de grupos dabcilo 5' y 3' terminales.

Los resultados de la electroforesis en gel de las diversas amplificaciones, con tinción con bromuro de etidio, se muestran en la fig. 1, que incluye marcadores de tamaño (diferencias de 100 pares de bases) en las columnas marginales no etiquetadas. Se analizaron muestras por duplicado, de manera que existen dos carriles para el producto de cada amplificación por LATE-PCR. Carriles a: case de línea-base en el que se omitió el ADN; carriles b: caso de línea-base en el que la ADN polimerasa era Taq de Promega; carriles c: caso de línea-base en el que la ADN polimerasa era Taq de Invitrogen; carriles d: sustitución del enzima de inicio en caliente Hot Star Taq de Qiagen; carriles e: sustitución del enzima de inicio en caliente Platinum Taq; carriles f: amplificación con la polimerasa Taq de Promega con la adición del compuesto 9-22 DD; carriles g: amplificación utilizando la polimerasa Taq de Invitrogen y el compuesto 9-22 DD; carriles h: amplificación utilizando la ADN polimerasa Taq Hot Star de Qiagen y el compuesto 9-22 DD; carriles i: amplificación utilizando la polimerasa Platinum Taq y el compuesto 9-22 DD.

En la fig. 1 puede observarse que las ADN polimerasas Taq normales que presentan tanto actividad de polimerización como actividad de exonucleasa 5' a 3' (carriles b y c) rindieron un abanico de tamaños de producto, prácticamente ninguno de los cuales era el amplicón deseado definido por la pareja de cebadores, que era el producto observado en los carriles f-i. El cambio a polimerasas "de inicio en caliente" modificadas (carriles d-e) ayudó, pero todavía no eliminó los productos no específicos formados debido a los errores de cebado defectuoso. En presencia de compuesto 9-22 DD a una concentración de 300 nM, sin embargo, se obtuvo el amplicón deseado sin productos no específicos debidos a errores de cebado defectuoso, tanto en el caso de que el enzima fuese una ADN polimerasa Taq normal (carriles f-g), como en el caso de que el enzima fuese una ADN polimerasa Taq de inicio en caliente (carriles h-i).

Mediante la utilización del ensayo riguroso del presente ejemplo, los presentes inventores compararon varias moléculas de horquilla de ADN no modificadas y modificadas sin estabilización terminal; con desestabilización terminal, tal como la obtenida mediante la adición de nucleótidos idénticos al extremo de cada brazo; con estabilización terminal según la presente invención, y con adiciones terminales no estabilizadoras. Para que la comparación fuese cuantitativa, los presentes inventores llevaron a cabo ensayos de respuesta a dosis utilizando el ensayo para cada compuesto que mostraba actividad de supresión del cebado defectuoso con el fin de determinar la concentración mínima necesaria para producir la eliminación de los productos no específicos formados debido a errores de cebado defectuoso, y la presencia de únicamente el producto específico deseado, obtenido tal como se muestra en la fig. 1 con ADN polimerasa Taq. Se muestran los resultados en la Tabla I, que incluye la Tm de tallo calculada para cada reactivo sometido a ensayo. Las secuencias de los diversos compuestos indicados en la Tabla I se proporcionan en la Tabla II.

TABLA I

Compuesto

Modificaciones Longitud de tallo/Tm (pb/C) Longitud del bucle (pb) Prevención de la amplificación no específica Concentración más baja (nM)

6-22

Ninguna 6/80 22 No

9-3

Ninguna 9/56 3 Sí 1000

9-5

Ninguna 9/93 5 No

9-22

Ninguna 9/81 22 Sí 3000

11-22

Ninguna 11/81 22 Sí 1000

12-3

Ninguna 12/56 3 No

12-C3

Espaciador C3 12/56 3 No

12-C3C3

Espaciador C3 12/56 3 No

6-22DD

Dabcilo en 5' y 3' 6/80 22 Sí 3000

9-3DD

Dabcilo en 5' y 3' 9/56 3 Sí 100

9-3bDD

Dabcilo en 5' y 3' 9/62 3 Sí 100

9-3iDD

Dabcilo en 5' y 3' 9/68 3 Sí 100

9-5DD

Dabcilo en 5' y 3' 9/93 5 Sí 50

9-22DD

Dabcilo en 5' y 3' 9/81 22 Sí 50

9-5 BHQBHQ

Inhibidor Black HoleTM en 5' y 3' 9/93 5 Sí 100

9-3 2’O’M4

Nucleótidos 2'-Ometilo 9/93 3 Sí 300

9-5 2’OM4

Nucleótidos 2'-Ometilo 9/93 5 Sí 50

(continuación)

12-3DD

Dabcilo en 5' y 3' 12/58 3 Sí 50

12-3bDD

Dabcilo en 5' y 3' 12/63 3 Sí 100

12-3cDD

Dabcilo en 5' y 3' 12/68 3 Sí 100

12-C3DD

Espaciador C3 Dabcilo en 5' y 3' 12/56 3 Sí 300

12-C3C3DD

Espaciador C3 Dabcilo en 5' y 3' 12/56 3 Sí 300

9-22-3D

Dabcilo en 3' 9/81 22 Sí 1000

9-22-5D

Dabcilo en 5' 9/81 22 No

9-22FF

5’3’ Fam 9/81 22 No

9-22AA

5’3’ AA 9/85 22 No

9-22TT

5’3’ TT 9/78 22 No

9-22TT 5D

5’3’ TT con dabcilo en 5’ 9/78 22 No

TABLA II

Compuesto

Secuencia SEC ID nº

6-22

GGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGACAGACGCC 1

9-3

CATTATAATGAAATTATAATG 2

9-5

CGCGGCGTCATATAGACGCCGCG 3

9-22

CGCGGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGAGAGACGCCGCG 4

11-22

5

12-3

CTTAATTATAATGAAATTATAATTAAG 6

12-C3

CTTAATTATAAT-(CH2)3-ATTATAATTAAG 7

12-C3C3

CTTAATTATAAT-(CH2)3(CH2)3- ATTATAATTAAG 8

9-3b

CGTTATAATGAAATTATAACG 9

9-3i

CGCTATAATGAAATTATAGCG 10

12-3bDD

CGTAATTATAATGAAATTATAATTACG 11

12-3cDD

CGCTATTATAATGAAATTATAATAGCG 12

La Tabla I compara varias horquillas de ADN, con o sin modificaciones, e identifica varias moléculas de horquilla estabilizadas terminalmente que son reactivos según la presente exposición (amplicón puro sin productos de cebado defectuoso a una concentración inferior a 1.000 nM) o que son reactivos preferidos según la presente invención 10 (amplicón puro sin productos de cebado defectuoso a una concentración no superior a 650 nM). Las horquillas no modificadas se identifican mediante dos números, siendo el primero la longitud del tallo y siendo el segundo la longitud del bucle. Los compuestos según la presente invención que aparecen en la Tabla I presentan varias modificaciones estabilizadoras: un inhibidor dabcilo 5' y un inhibidor dabcilo 3' unidos covalentemente a los nucleótidos terminales mediante un conector comercial (indicado con el sufijo "DD"), un inhibidor 3' Black HoleTM y 15 un inhibidor 5' Black HoleTM unido de manera similar (indicado con el sufijo "BHQBHQ") y dos ribonucleótidos 2'-Ometilo en el extremo 3' y dos ribonucleótidos 2'-O-metilo en el extremo 5' sustituidos por desoxirribonucleótidos en el extremo del tallo (indicados por "2'OM4"). Entre las modificaciones desestabilizadoras en los extremos del tallo se incluyeron la sustitución de una pareja de As o Ts en los extremos 3' y 5' de la molécula. La adición de una pareja de fluoróforos FAM, que no se cree que interactúen entre sí de un modo estabilizador del tallo, era desestabilizadora, al

20 igual que la adición de un único dabcilo en el extremo 5'. Sin embargo, la adición de un único dabcilo en el extremo 3' estabilizó ligeramente la horquilla 9-22, tal como muestra la menor concentración necesaria. La horquilla 9-22 suprimió el cebado defectuoso únicamente a concentración alta (3.000 nM), mientras que 9-22 DD lo hizo a concentración baja (50 nM).

25 Otra de las horquillas preferidas en el contexto de la presente invención, el compuesto 9-3, suprimió el cebado defectuoso únicamente a concentración elevada (1.000 nM), mientras que 9-3DD y 9-3 2'OM4 lo suprimieron a concentración mucho menor (100 a 300 nM). En todavía otra forma de realización, 9-5 DD, 9-5 BHQBHQ y 9-5 2'OM4 también lo suprimieron a concentraciones bajas (50 a 100 nM). El oligonucleótido 9-5 presentaba el mismo tallo que el oligonucleótido 9-22 pero un bucle más corto cuyos nucleótidos eran As y Ts. La Tm calculada del tallo

30 del oligonucleótido9-5 era de 93ºC, 12ºC superior a la Tm calculada del tallo del oligonucleótido 9-22, debido a la influencia de los bucles.

Se obtuvieron resultados similares con un tallo todavía más largo. El compuesto 12-3 no suprimió el cebado defectuoso, mientras que el compuesto 12-3DD resultó efectivo únicamente a la concentración de 50 nM.

La Tabla I muestra que los tallos estabilizados pueden modificarse para cambiar la temperatura calculada de fusión del tallo (Tm). Por ejemplo, el compuesto 9-3DD, Tm de 56ºC, resultaba efectivo a la concentración de 100 nM. Mediante la alteración del contenido de G-C del tallo los presentes inventores crearon los compuestos 9-3bDD (Tm: 62ºC) y 9-3iDD (Tm de 68ºC). Ambos también resultaron efectivos a la concentración de 100 nM. El compuesto 123DD, Tm de 58ºC, resultaba efectivo a la concentración de 50 nM. Los compuestos con tallos alterados, es decir, el compuesto 12-3bDD, Tm de 63ºC, y el compuesto 12-3cDD, Tm de 68ºC, resultaban efectivos a una concentración de 100 nM, que sigue siendo un resultado muy bueno.

Ejemplo 2. Ensayo de punto final de LATE-PCR

La variación estocástica en la cinética de reacción en réplicas de ensayo resulta en la dispersión de la señal de las sondas de hibridación y perjudica al análisis de punto final. La LATE-PCR reduce significativamente este problema. La utilización de un reactivo según la presente invención mejora adicionalmente la capacidad de utilizar la detección de punto final. La fig. 2 presenta los resultados obtenidos en la amplificación de un amplicón que incluía el alelo G269 del gen de la hexosaminidasa A, responsable de la enfermedad de Tay-Sachs. La mezcla de reacción contenía 0,6 μM de sonda de hibridación y 1.000 genomas homocigóticos para la diana de ADN de tipo salvaje (+/+)

o diana de ADN heterocigótico (G269/+). Las réplicas de muestras de cada tipo se amplificaron del modo siguiente: 1x tampón para PCR, MgCl2 3 mM, 250 μM de cada dNTP, 25 nM de cebador limitante que presentaba la secuencia 5' CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC3' (SEC ID nº 15), 1.000 nM de cebador en exceso que presentaba la secuencia 5' TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3' (SEC ID nº 16), 1,25 unidades de polimerasa Taq Platinum (de inicio en caliente), 0,6 μM de sonda de hibridación marcada con Cy5 que presentaba la secuencia 5' Cy5-GGGACCAGGTAAGAA-fosfato 3' (SEC ID nº 17) y una dilución 1:40.000 de SYBR-oro-1 en presencia o en ausencia de 100 nM de la forma de realización 9-22 DD en reacciones de 25 μl. Los parámetros de los ciclos de PCR fueron: 95ºC durante 3 minutos; 25 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 20 segundos, y 30 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 20 segundos, 55ºC durante 20 segundos y 45ºC durante 20 segundos con captación de fluorescencia a 72ºC para SYBR Oro y captación de fluorescencia a 55ºC y a 45ºC para Cry5. Para corregir las variaciones de tubo a tubo en la cinética de reacción, las señales de hibridación se normalizaron respecto a la proporción entre las señales de Cy5 a 55ºC y las señales de SYBR-Oro a 72ºC. Una consecuencia de esta normalización es que se enmascaró cualquier retraso del CT.

La fig. 2, líneas identificadas por el círculo 21 y las líneas identificadas por el círculo 22, muestra los resultados de múltiples réplicas sin adición de un reactivo según la presente invención aunque con polimerasa de inicio en caliente. Las réplicas homocigóticas (círculo 21) y las réplicas heterocigóticas (círculo 22) pueden distinguirse a partir de las pendientes de sus gráficos lineales. La dispersión entre réplicas y los errores de cebado defectuoso en estas muestras, puestas de manifiesto por la caída de la señal de la sonda de hibridación (el "efecto gancho") tras aproximadamente 40 ciclos impide la identificación de punto final de estas muestras. La fig. 2, líneas identificadas por los círculos 23 y 24, muestra los resultados con adición de reactivo según la presente invención, concretamente 9-22 DD 100 nM. Bajo estas condiciones, no se produjeron errores de cebado defectuoso, se conservó la cinética lineal durante el curso del ensayo, se redujo la dispersión, se evitó el efecto gancho y resultó posible la identificación de punto final de muestras homocigóticas y heterocigóticas a los 50 ciclos.

Ejemplo 3. Preparación de muestras de ADN para la secuenciación dideoxi

La LATE-PCR es un método de amplificación no simétrico que genera potencialmente grandes cantidades de ADN monocatenario adecuado para la secuenciación del ADN al llevar a cabo la reacción de amplificación durante 60 o más ciclos térmicos. Sin embargo, este gran número de ciclos de amplificación estimula la aparición de productos del cebado defectuoso, que se cree que incluye la formación de errores de cebado defectuoso de tipos 2 y 3, que se manifiestan en la acumulación de productos no específicos detectables que finalmente se convierten en la especie predominante en la reacción. Los reactivos según la presente invención permiten la síntesis de grandes cantidades de ADN monocatenario adecuado para la secuenciación del ADN en ausencia de productos no específicos tras realizar 70 ó más ciclos de amplificación por LATE-PCR. Las muestras adecuadas para la secuenciación dideoxi mediante electroforesis en gel capilar se prepararon del modo siguiente. En primer lugar se preparó la mezcla de reacción de LATE-PCR en 25 μl que contenían 1X tampón para PCR, Much 3 mM, cebador en exceso 1.000 nM que presentaba la secuencia 5' GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3' (SEC ID nº 18, cebador limitante 25 nM, que presentaba la secuencia: 5' CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3' (SEC ID nº 19), 1,25 unidades de polimerasa Taq Platinum, reactivo 9-3DD 600 nM y 250 μM de cada dNTP. El compuesto 9-3DD presentaba un inhibidor dabcilo añadido en cada nucleótido terminal del oligonucleótido 9-3. La amplificación se llevó a cabo a 95ºC durante 3 minutos; 10 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 20 segundos, y 60 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 20 segundos y 45ºC durante 20 segundos. Se llevaron a cabo reacciones en paralelo con: dilución 1:40.000 de verde SYBR o baliza molecular de baja Tm 2,4 μM que presentaba la secuencia 5' FAM-CGTGCGCTCTGGTAAGGGTTTGCACG-dabcilo 3' (SEC ID nº 20) para realizar el seguimiento de la síntesis de ADN de doble cadena y de una cadena separadamente. Cada

muestra contenía 6 ng (aproximadamente 1.000 genomas) de ADN humano. Además, se analizó un control sin adición de compuesto 9-3DD.

Los resultados de las reacciones de amplificación fueron que el control con ADN polimerasa Taq de inicio en caliente pero sin compuesto 9-3DD mostraron un nivel significativo de cebado defectuoso, tal como pone de manifiesto una segunda elevación de la señal de verde SYBR durante las últimas etapas de la amplificación, tras el agotamiento del cebador limitante. Debido a que el producto era una mezcla, no resultó posible secuenciar el control. Por otra parte, los resultados de la amplificación con el compuesto 9-3DD añadido mostraron la presencia de no sólo el producto específico deseado sin un incremento con retardo de la señal de verde SYBR durante 70 ciclos. Los presentes inventores calcularon, a partir de la concentración del cebador limitante y una eficiencia teórica de la amplificación lineal de 50%, que la reacción generaba 250 fmoles/μl de producto puro. Este producto se envió al centro de secuenciación dideoxi de la Brandeis University para su secuenciación.

La reacción de secuenciación se llevó a cabo utilizando un protocolo estándar, tal como la electroforesis capilar, utilizando un secuenciador de ADN Beckman CEQ 2000. La reacción de secuenciación se llevó a cabo con un alícuota 1/5 del producto amplificado, es decir, con sólo 50 fmoles de producto. La secuencia producida por el secuenciador se presenta en la fig. 3, que muestra la secuencia a lo largo de la parte superior del gráfico, los picos de producto claros e inequívocos a partir de los que se derivó la secuencia y, al fondo, una señal de fondo de nivel muy reducido. Los presentes inventores verificaron que la secuencia producida por el secuenciador era correcta mediante la comparación de la misma con la secuencia conocida del amplicón disponible de GenBank, nº de acceso NT 010235.

Ejemplo 4. Amplificación por PCR múltiplex

La supresión de los errores de cebado defectuoso resulta particularmente crítica en las reacciones multiplex en las que se amplifican simultáneamente múltiples productos. La presencia de varias parejas de cebadores y productos de amplificación incrementa la probabilidad de interacciones de cebado defectuoso entre estas especies reactivas. Las reacciones multiplexadas compuestas de un número creciente de amplicones se llevaron a cabo en ausencia o en presencia de compuesto 9-3DD. Se prepararon reacciones de LATE-PCR de 25 μl de volumen que consistían de muestra, 1X tampón para PCR, MgCl2 3 mM, 100 μM de cada dNTP, cebador en exceso 1.000 nM, cebador limitante 50 nM y 1,25 unidades de polimerasa Taq no de inicio en caliente de Promega, en ausencia y en presencia de 300 nM de reactivo 9-3DD para diferentes combinaciones de las parejas de cebadores indicadas posteriormente. Las muestras se amplificaron utilizando un perfil de ciclado térmico de 95ºC durante 3 minutos, 10 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 30 segundos, y de 40 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 30 segundos. Al final de la reacción, las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3,5% en 0,5X TBE. Los amplicones deseados y parejas de cebadores sometidos a ensayo fueron los siguientes:

Reacción A: dos regiones, TSD 1278 + TSD 1421 del gen Hex-A asociado a la enfermedad de Tay-Sachs.

TSD 1278 cebador en exceso: 5' GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3' (SEC ID nº 21)

TSD 1278 cebador limitante: 5' CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3' (SEC ID nº 22)

TSD 1421 cebador en exceso: 5' CCGGGTCTCTAAGGGAGAACTCCT 3' (SEC ID nº 23)

TSD 1421 cebador limitante: 5' CCGGCCGACAACACAAACCTGGTCC 3' (SEC ID nº 24)

Reacción B: amplicón TSD 1278, amplicón TSD 1421 y una región del gen CFTR, el amplicón del exón 10 de

CF. Esta reacción contenía las mismas parejas de cebadores que la reacción A, además de:

CF ex10 cebador en exceso: 5' GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEC ID nº 25)

CF ex10 cebador limitante: 5' CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEC ID nº 26)

Reacción C: amplicón TSD 1278, amplicón TSD 1421, amplicón del exón 10 de CF y otra región del gen CFTR, el amplicón del exón 11 de CF.

Esta reacción contenía la misma pareja de cebadores que la reacción B, además de:

CF ex11 cebador en exceso: 5' TCGAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3' (SEC ID nº 27)

CF ex11 cebador limitante: 5' TGACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3' (SEC ID nº 28)

Reacción D: amplicones TSD 1278, amplicón TSD 1421, amplicón del exón 10 de CF, amplicón de ex11 de CF y una región del gen beta globina humano.

Esta reacción contenía la misma pareja de cebadores que la reacción C, además de:

Beta globina cebador en exceso: 5' TGGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3' (SEC ID nº 29) Beta globina cebador limitante: 5' GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3' (SEC ID nº 30)

Los geles de electroforesis se tiñeron con bromuro de etidio para detectar los productos de doble cadena producidos durante la etapa exponencial de la reacción de LATE-PCR. La fig. 4 muestra partes pertinentes de geles de los productos procedentes de las reacciones multiplexadas A a D. Las flechas indican los productos de amplificación de doble cadena específicos; las bandas no numeradas corresponden a productos de ADN monocatenario específicos con estructura secundaria, y los asteriscos identifican los productos no específicos. Las parejas A-D del gel corresponden a las reacciones A-D, respectivamente. Cada gel etiquetado como "+" es un producto de amplificación que incluye el compuesto 9-3DD. Cada gel etiquetado como "-" es producto de amplificación sin el compuesto 93DD.

La pareja A de gel muestra que, en ausencia de compuesto 9-3DD, la región TSD 1278 (flecha 41) no resultó amplificada, aunque la región TSD 1421 (flecha 42), sí se amplificó, conjuntamente con un gran número de productos no específicos, predominante o completamente de doble cadena, que aparecieron en el gen en forma de mancha alargada. La adición del compuesto 9-3DD redujo el fondo de productos no específicos y permitió la amplificación tanto de TSD 1278 (flecha 41) como de TSD 1421 (flecha 42) de modo más limpio, demostrando que se habían evitado varias manifestaciones del cebado defectuoso.

La pareja B de gel muestra que, en ausencia de compuesto 9-3DD, las regiones TSD 1278, TSD 1421 y exón 10 de CF (flecha 43) amplificadas conjuntamente con un gran número de productos no específicos que aparecieron en el gel en forma de mancha alargada. La adición del compuesto 9-3DD eliminó los productos no específicos de fondo, y se obtuvieron los tres amplicones esperados.

La pareja C de gel muestra que, en ausencia de compuesto 9-3DD, las regiones TSD 1278, TSD 1421, exón 10 de CF y exón 11 de CF (flecha 44) resultaron amplificadas conjuntamente con un producto no específico, indicado con un asterisco. La adición del compuesto 9-3DD eliminó la síntesis del producto no específico y se obtuvieron los cuatro amplicones esperados.

La pareja D de gel muestra que, en ausencia del compuesto 9-3DD, la región seleccionada del gen beta globina (flecha 45) no resultó amplificada, mientras que sí se amplificaron TSD 1278, TSD 1421, exón 10 de CF y exón 11 de CF, conjuntamente con un producto no específico, indicado con un asterisco. La adición del compuesto 9-3DD eliminó la síntesis del producto no específico y permitió la amplificación de la totalidad de los cinco amplicones esperados.

Los presentes inventores también demostraron la utilización de un compuesto según la presente invención en reacciones multiplex de amplificación y detección en el caso de encontrarse presente únicamente una diana en cualquier muestra de ensayo dada, tal como puede ocurrir en el caso del cribado para un patógeno infeccioso. En este caso, se encuentran presentes múltiples parejas de cebadores (los presentes inventores utilizaron múltiples parejas de cebadores en exceso y cebadores limitantes para las amplificaciones por LATE-PCR), pero únicamente una pareja de cebadores se encuentra activa para una muestra particular. Tal como indica la fluorescencia del verde SYBR y el análisis electroforético posterior a la amplificación, esto es de hecho lo que ocurrió, demostrando que los compuestos de la presente invención inhiben eficazmente el cebado defectuoso en reacciones multiplex en el caso de que no se encuentren presentes todos los sustratos.

Ejemplo 5. Relación entre la Tm del tallo y la temperatura de hibridación.

Se compararon dos protocolos diferentes de amplificación por LATE-PCR utilizando la misma mezcla de amplificación, que incluía la diana. Cada amplificación se llevó a cabo tanto con el compuesto 9-3DD 600 nM como sin compuesto 9-3DD. Tal como se ha indicado anteriormente, la Tm del tallo del compuesto 9-3DD (es decir, la temperatura de fusión calculada del oligonucleótido 9-3 no modificado) era de 56ºC. Se utilizó la ADN polimerasa Taq Platinum de inicio en caliente. Las dos amplificaciones diferían principalmente en la temperatura de hibridación del cebador utilizada, que era de 65ºC (superior a la Tm del tallo) o de 55ºC (inferior a la Tm del tallo). Los parámetros del ciclo de amplificación fueron los siguientes:

Perfil A: 95ºC durante 3 minutos; diez ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 20 segundos; sesenta ciclos de 95ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 20 segundos y 50ºC durante 20 segundos. Perfil B: igual que el perfil A, excepto en que los últimos sesenta ciclos fueron de 95ºC durante 10 segundos, 65ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 20 segundos y 45ºC durante 20 segundos.

Se realizó un seguimiento de las reacciones de amplificación en tiempo real utilizando el pigmento fluorescente verde SYBR-1 para realizar un seguimiento de la síntesis de producto de doble cadena, que alcanza una meseta en una reacción de LATE-PCR tras agotarse el cebador limitante, a menos que el cebado defectuoso provoque una variación en la última parte de la amplificación. Se realizaron lecturas durante la etapa de detección a baja temperatura.

Se presentan los resultados en la fig. 5. El panel A muestra las lecturas de fluorescencia de muestras replicadas del perfil A, en el que se utilizó la temperatura de hibridación de 55ºC tras diez ciclos de extensión, tanto con (círculo 52) como sin (círculo 51) inclusión del compuesto 9-3DD. El panel B muestra las lecturas de fluorescencia de muestras replicadas del perfil B, en el que se utilizó la temperatura de hibridación de 65ºC tras diez ciclos de extensión, tanto con (círculo 54) como sin (círculo 53) inclusión del compuesto 9-3DD.

La fig. 5 muestra que, al utilizar una temperatura de hibridación de cebadores inferior a la Tm de tallo del reactivo de la presente invención (panel A), se observa un retraso de varios ciclos en el ciclo umbral, CT. Sin embargo, al mantener una temperatura de hibridación de cebadores significativamente superior a la Tm del tallo durante la etapa exponencial de la PCR (panel B), se observó poco o ningún retraso de CT. Se advirtió que, para el amplicón particular utilizado en dicha amplificación, no se observaba ningún cebado defectuoso de tipo 2/tipo 3 con o sin compuesto 9-3DD al utilizar Taq de inicio en caliente, demostrando la impredecibilidad de la incidencia de dichos errores de cebado defectuoso. El presente ejemplo demuestra que el tallo del reactivo 9-3DD se encuentra cerrado al caer la temperatura de reacción a 55ºC, y que el reactivo permanece unido a la polimerasa durante la etapa de extensión de temperatura más alta de la reacción.

Ejemplo 6. Efecto sobre la actividad de la ADN polimerasa a 25ºC

Se llevó a cabo una serie de experimentos de extensión de cebador a 25ºC con el fin de evaluar el efecto de reactivos según la presente invención y de análogos oligonucleótidos no modificados de los mismos. Cada mezcla de reacción incluía un molde, un cebador y una ADN polimerasa Taq. La reacción se llevó a cabo durante dos horas en cada caso. El cebador se marcó fluorescentemente con Cy5. Se añadió pigmento fluorescente verde SYBR a la mezcla de reacción. Tras las reacciones de extensión, se realizaron curvas de fusión en las que se estimuló el pigmento y se leyó la emisión del fluoróforo debido a la transferencia FRET del pigmento, tal como se da a conocer en la solicitud de patente provisional US presentada concurrentemente por los presentes inventores, titulada "Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid amplification". Se presentan los resultados en la fig. 6.

La fig. 6, panel A, incluye la curva de fusión 61, obtenida al bloquear la extensión mediante omisión de los dNTP de la mezcla de reacción. De esta manera, la curva 61 es la curva de fusión del híbrido cebador-diana, mostrando una Tm de 58ºC. El panel A también incluía varios controles que contenían dNTP, solos o con el oligonucleótido 9-3 no modificado (300 nM, 1.000 nM) o con 9-22 (50 nM, 100 nM, 300 nM). Las curvas identificadas con el círculo 62 para los controles mostraron extensión en todos los casos, es decir, desapareció el pico de fusión del cebador a 58ºC. La fig. 6, panel B, muestra un efecto dependiente de la dosis de incluir el reactivo 9-22 DD en la mezcla de reacción: curva 63, 50 nM; curva 64, 100 nM; curva 65, 300 nM. Cuanto mayor es el pico a 58ºC, mayor es el efecto de bloquear la extensión mediante polimerización bajo las condiciones de ensayo isotérmicas. La fig. 6, panel C, muestra un efecto dependiente de la dosis de incluir el reactivo 9-3DD en la mezcla de reacción: curva 66, 300 nM; curva 67, 1.000 nM. Nuevamente, cuanto mayor es el pico a 58ºC, mayor es el efecto de bloquear la extensión mediante polimerización bajo las condiciones de ensayo.

Los presentes inventores también investigaron el efecto sobre el fragmento Stoffel (Lawyer et al., PCR Methods and Applications 2:275-287, 1993), una ADN polimerasa que no presenta actividad exonucleasa 5'-3'. Compararon diversos compuestos presentados en la Tabla 1 con un control negativo que sólo contenía molde, cebador marcado fluorescentemente, el fragmento Stoffel y dNTP. En esta serie se llevó a cabo la extensión a 40ºC y se realizaron lecturas de verde SYBR cada 20 segundos durante más de 30 minutos. Se compararon visualmente las curvas; lo que resultó suficientemente fiable, ya que la curva obtenida seguía el control prácticamente de modo absoluto o la curva obtenida difería marcadamente del control. Se añadieron los compuestos de ensayo a las concentraciones de 50 nM, 100 nM y 300 nM. Las horquillas no modificadas 6-22, 9-3, 9-5 y 9-22 no suprimieron el alargamiento por parte del fragmento Stoffel a ninguna de las concentraciones. Los compuestos siguientes no suprimieron el alargamiento a la concentración de 50 ó 100 nM, pero sí suprimieron el alargamiento a la concentración de 300 nM: 9-22 5D, 9-22 3D, 9-5 2'OM4, 9-5BHBHQ y 9-32'OM4.

Ejemplo 7. Efecto sobre la actividad de exonucleasa de Taq en ausencia de actividad de polimerasa

Los presentes inventores han descubierto un ensayo que demuestra la inhibición de la actividad de exonucleasa 5' a 3' en ausencia de síntesis de ADN. El ensayo utilizaba como sustrato una molécula de ADN de doble cadena en la que una cadena se encontraba marcada con un fluoróforo FAM en el extremo 5' y la otra cadena se encontraba marcada en el extremo 3' con un inhibidor dabcilo. El fluoróforo se encontraba muy próximo al inhibidor, y no se producía fluorescencia al estimular el fluoróforo. La desnaturalización e hibridación de cadenas tras el calentamiento y enfriamiento provocó la escisión de la cadena marcada con FAM y la liberación del fluoróforo. Los presentes inventores creen que el ciclado de alguna manera genera un sustrato para la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq. Por lo tanto, el incremento de fluorescencia proporciona una medida de la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq.

Los 25 μl de mezcla de reacción contenían 300 nM de molde de ADN de doble cadena en 1X de tampón para PCR, MgCl2 3 mM, 1,25 unidades (U) de polimerasa Taq y la presencia o ausencia de una concentración apropiada de compuesto 9-22 DD. La reacción no contenía ningún dNTP ni cualquier otro ácido nucleico diana aparte de ADN de

doble cadena. Las secuencias de las cadenas complementarias del molde de ADN de doble cadena eran 5' FAM-AGTGTGATGATGGTGAGG-fosfato-3' (SEC ID nº 31) y 5'-ACTTTCAACTCTGTCT-3'-dabcilo (SEC ID nº 32). Se desnaturalizaron las muestras a 95ºC durante 3 minutos y después se sometieron a ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 67ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos y 45ºC durante 20 segundos. Se captó la fluorescencia durante cada ciclo a 45ºC.

Se proporcionan lecturas de fluorescencia procedentes de la realización del ensayo en varias muestras en la fig. 7, en la que las lecturas se normalizaron respecto a una misma fluorescencia de fondo. La curva 76 es un control que muestra la fluorescencia en ausencia de polimerasa Taq. Se incluyó la polimerasa Taq en las muestras restantes. La curva 71 muestra el incremento de fluorescencia que resulta en el caso de que no se añada reactivo 9-22 DD. L a fluorescencia se incrementó constantemente durante treinta ciclos. Las curvas 72-75 muestran el incremento de fluorescencia con la inclusión de reactivo 9-22 DD a las concentraciones de 50, 100, 200 y 300 nM, respectivamente. La adición de compuesto 9-22 DD a la reacción mencionada anteriormente redujo el incremento observado de la fluorescencia de un modo dependiente de la dosis.

Ejemplo 8. Amplificación por PCR simétrica

Los presentes inventores llevaron a cabo un ensayo de amplificación por PCR en tiempo real utilizando ADN genómico fragmentado y una pareja de cebadores de Tm similar a concentración equimolar. Llevaron a cabo ensayos replicados sin y con adición de reactivo 9-3DD 400 nM. Se evaluaron los efectos del reactivo en términos de la cinética de la acumulación de ADN total mediante tinción con verde SYBR, así como mediante electroforesis en gel con tinción de bromuro de etidio.

La diana deseada para la amplificación era un alelo del gen CFTR presente en el intrón 19 en forma de transición de una sola base (GenBank nº de acceso AC000061). Los 25 μl de mezcla de reacción contenían un sustrato de 120 picogramos (pg) de ADN genómico humano fragmentado, 1X tampón para PCR, MgCl2 5 mM, 250 μM de cada dNTP, una dilución 1:40.000 de verde SYBR, 1.000 nM de cebador directo: secuencia 5' TAATTACAAGAGTCTTCCAT 3' (SEC ID nº 33), Tm: 56,6ºC, y 1.000 nM de cebador inverso: secuencia 5' CATGAATAGAACATTTCCTT 3' (SEC ID nº 34), Tm: 56,3ºC, y 1,25 unidades de polimerasa Taq de Invitrogen de inicio en caliente en ausencia o presencia de 400 nM del reactivo 9-3DD. Las muestras se amplificaron utilizando un perfil de ciclado térmico de 95ºC durante 33 minutos; 60 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos con fluorescencia de verde SYBR-1 seguido a 72ºC, y finalmente un gradiente de temperatura de 54ºC a 96ºC en incrementos de 1ºC durante 30 segundos. Al final de la reacción se analizaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3,0% en 0,5X Tris, ácido bórico y solución EDTA (TBE) varias muestras seleccionadas aleatoriamente de cada conjunto de reacciones.

La fig. 8 presenta los resultados obtenidos. El gráfico de la amplificación en el panel A de la fig. 8 muestra la fluorescencia de verde SYBR-1 para 60 ciclos, siendo las curvas identificadas con el círculo 81 muestras replicadas que no contenían el reactivo 9-3DD y las identificadas con el círculo 82, las muestras replicadas con 400 nM de 93DD. La cinética de las señales de fluorescencia procedentes de los dos conjuntos de muestras demuestra que el ADN de doble cadena total se acumulaba algo más rápido en ausencia de reactivo 9-3DD que en presencia del reactivo, pero la cantidad total de ADN de doble cadena acumulado en 60 ciclos era prácticamente idéntico en los dos conjuntos de reacciones.

El panel B de la fig. 8 muestra los geles electroforéticos con tinción de bromuro de etidio. A la izquierda, el carril a es el marcador de tamaño (diferencias de 50 pares de bases) y los carriles b a i son muestras sin reactivo 9-3DD. A la derecha, los carriles j a q son muestras con 400 nM de 9-3DD, y el carril r es el marcador de tamaño. Los resultados muestran que las reacciones que no contenían el reactivo según la presente invención generaron el producto correcto así como muchos productos no específicos de mayor peso molecular, mientras que las reacciones que contenían el reactivo 9-3DD generaron únicamente el producto correcto. Además, las reacciones que contenían el reactivo 9-3DD generaron aproximadamente el doble de producto correcto que las reacciones que no lo contenían, según las intensidades relativas de la banda de producto correcto en los geles.

En combinación, el análisis cinético y el análisis electroforético revelaron que las reacciones 81 que generaban productos no específicos produjeron señales fluorescentes antes que las reacciones 82 que generaron únicamente el producto correcto. El pigmento verde SYBR se intercala en el ADN de doble cadena con independencia de la especificidad de secuencia. De esta manera, la cinética sigmoidal de las reacciones 82 comparada con la cinética más rectilínea en las reacciones 81 puede utilizarse para evaluar si una reacción simétrica acumula o no únicamente el producto correcto.

Ejemplo 9. Cuantificación de la inhibición de la exonucleasa

El presente ejemplo describe un ensayo riguroso para medir el efecto de inhibición de un reactivo según la presente invención sobre la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq. Este ensayo utiliza un sistema de cebador-molde similar al descrito por M.W. Kaiser, N. Lyamicheva, W. Ma, C. Miller, B. Neri, L. Fors y V.I. Lyamicheva, J. Biol. Chem. 274:21387-21394, 1999, excepto en que el molde se marca con Cy5 en el extremo 5' y

el ensayo se lleva a cabo en presencia de verde SYBR-1, un pigmento del ADN que emite fluorescencia cuando se encuentra unido al ADN de doble cadena. El molde de este ensayo está constituido por la secuencia oligonucleótida:

5’-Cy5-AAAACGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGAAAGACGCTCGT-3’ (SEC ID nº: 35)

hibridada con un cebador con la secuencia de nucleótidos:

5’-ACGAGCGTCTTTC-3’ SEC ID nº: 36).

El oligonucleótido más largo forma una estructura de horquilla con dos cadenas monocatenarias de diferente longitud. La cola 5' más corta del molde contiene el fluoróforo Cy5 y consiste de 4 residuos de adenosina; la cola 3', más larga, del molde actúa como diana para el oligonucleótido cebador, de manera que el cebador se posiciona directamente delante de la cola 5' del molde con un solapamiento de un par de bases. La adición de verde SYBR-1 a este complejo de molde-cebador resulta en la unión del verde SYBR-1 a las regiones de ADN de doble cadena del complejo. Tras la excitación del verde SYBR-1 con un láser de 480 nm, la energía de fluorescencia del pigmento de ADN unido resulta completamente absorbida por Cy5, lo que se cree que se produce mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, y no se observa fluorescencia detectable en la longitud de onda máxima del verde SYBR (longitud de onda de emisión máxima: 521 nm). La hidrólisis de la cola 5' por parte de la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq resulta en la eliminación del grupo Cy5 del complejo de molde-cebador y la restauración de fluorescencia detectable del verde SYBR-1. La cinética de la restauración de la fluorescencia del verde SYBR-1 en presencia de ADN polimerasa Taq proporciona una medida cuantitativa de la actividad de la exonucleasa 5' a 3'. Los reactivos según la presente invención inhiben la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq y retrasan el incremento de la fluorescencia del verde SYBR-1.

El ensayo consistía de 0,5 μM del molde anteriormente indicado y 1,5 μM del cebador anteriormente indicado mezclado en 1X tampón para pCR, MgCl2 3 mM, una dilución 1:40.000 de una solución madre de verde SYBR-1 comercial (Molecular Probes, Eugene, OR), 1,25 U de polimerasa Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) en ausencia o en presencia de compuesto 9-22 DD a una concentración de 50, 100, 300 ó 1.000 nM en un volumen de 25 microlitros (μl). No se añadieron más dNTP a la mezcla de reacción debido a que el ensayo no se basa en la actividad de la ADN polimerasa. La mezcla de reacción menos el molde y el cebador se preparó a 25ºC para estimular la interacción entre el compuesto 9-22 DD y la ADN polimerasa Taq. A continuación, se colocó la muestra sobre hielo, se suplemento con molde y cebadores, y se mantuvo sobre hielo hasta el inicio de la reacción. Los controles negativos no presentaban ADN polimerasa Taq. La reacción se inició mediante incubación de la muestra a 25ºC en un detector de secuencias ABI Prism 7700 durante 60 minutos con captación de la fluorescencia en el canal del verde SYBR-1 cada 30 segundos. Se calculó el promedio de tres ensayos diferentes para cada control y para cada concentración del reactivo 9-22 DD.

La fig.9 presenta los resultados del ensayo. La fluorescencia detectable de verde SYBR-1 proporciona una medida de la magnitud de la actividad de exonucleasa 5' a 3'. El control "nada de Taq" no muestra señal de fluorescencia de SYBR, lo que concuerda con la absorción completa de la fluorescencia del verde SYBR-1 por parte de Cy5 y la ausencia total de actividad de exonucleasa 5' a 3' (línea 96). La adición de polimerasa Taq restaura la fluorescencia del verde SYBR-1 y proporciona una línea base para los niveles máximos de actividad de exonucleasa 5' a 3' bajo las condiciones de ensayo (línea 91). La adición del compuesto 9-22 DD a la mezcla de reacción retrasa la restauración de la fluorescencia de verde SYBR-1 de un modo dependiente de la dosis debido al efecto inhibidor de 9-22 DD sobre la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq (línea 92, 50 nM; línea 93, 100 nM; línea 94, 300 nM; línea 95, 1.000 nM). La Tabla III, posteriormente, cuantifica el porcentaje de inhibición de la actividad de exonucleasa 5' a 3' por parte de diversas concentraciones del compuesto 9-22 DD basado en los niveles relativos de fluorescencia del verde SYBR-1 alcanzados tras una incubación de 60 minutos a 25ºC.

TABLA III

Reacción

Fluorescencia % de inhibición de la exonucleasa 5' a 3'

No 9-22DD

1.378 unidades 0,0

50nM 9-22DD

1315 unidades 4,6

100nM 9-22DD

1155 unidades 16,2

300nM 9-22DD

989 unidades 28,2

1000nM 9-22DD

624 unidades 54,7

Nada de Taq

0 unidades Actividad de exonucleasa 5' a 3' nula

Ejemplo 10. Bloqueo de la formación de dímeros de cebadores y oligomerización en presencia y en ausencia de ADN diana

Se diseñó una serie de reacciones de amplificación por LATE-PCR en presencia o en ausencia de 100 genomas de ADN placentario humano (Sigma, St. Louis, MO) en un volumen final de 25 μl. En el presente experimento, las

reacciones de amplificación por LATE-PCR consistían de 1X tampón para PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCl2 3 mM, dNTP 0,25 mM, cebador en exceso 1.000 nM, cebador limitante 50 nM, 0,25 μM de cadena sonda marcada con FAM, 0,3 μM de cadena complemento inversa marcada con dabcilo, 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia de los cebadores y sondas eran los siguientes:

Cebador en exceso: 5’ GTTTCTITGCTGCCGTGTTC 3’ (SEC ID nº: 37)

Cebador limitante: 5’CCCCAGAGACCCCAGTTGCTAACCAGAC 3’(SEC ID nº: 38)

Cadena sonda marcada con FAM: 5’ [TET] AGACAGAGTTGAAAGTCAGG [Phos] 3’ (SEC ID nº: 39)

Cadena complemento inversa marcada con dabcilo: 5’ ACTTTCAACTCTGTCT [Dabcyl] 3’ (SEC ID nº: 40)

Dichos cebadores y sondas amplificaron y detectaron un amplicón de 488 pares de bases (pb) que comprendía los exones 5 y 6 del gen p53 humano. La amplificación se llevó a cabo en un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, CA) con un perfil térmico que consistía de 1 ciclo de 95ºC durante 3 minutos, 25 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 64ºC durante 30 segundos, 75ºC durante 30 segundos, y de 35 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 64ºC durante 30 segundos, 75ºC durante 30 segundos, 45ºC durante 20 segundos con detección de la fluorescencia en el canal TET durante la etapa de 45ºC.

Los productos de amplificación resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3% en 0,5X tampón TBE durante 2 horas y se tiñeron con bromuro de etidio. Se muestran los resultados en la fig. 10. Las muestras en los carriles 3, 5, 7, 9, 11 habían sido preparados sin ADN genómico. Las muestras en los carriles 2, 4, 6, 8 y 10 habían sido preparadas con ADN genómico. El carril 1 contenía marcadores de tamaño electroforético en una escalera de 100 pares de bases. Se añadió el reactivo 9-22 DD a las reacciones iniciales del modo siguiente: carriles 2 y 3: 0 nM; carriles 4 y 5: 50 nM; carriles 6 y 7: 100 nM; carriles 8 y 9: 200 nM; carriles 10 y 11: 300 nM.

En el lado derecho del gel los presentes inventores han marcado el tamaño del producto correcto y también tamaños que se infiere que son dímeros de cebadores y oligómeros de cebadores. Los resultados presentados en la fig. 10 demuestran que en reacciones iniciadas con ADN genómico, el incremento de la concentración del reactivo 9-22 DD actúa de un modo dependiente de la dosis impidiendo la manifestación de productos no específicos, incluyendo los dímeros de cebadores y los oligómeros de cebadores, e incrementando de esta manera tanto la especificidad como el rendimiento de los productos correctos. El incremento de las concentraciones de reactivo 9-22 DD también bloqueaba la manifestación de dímeros de cebadores y de oligómeros de cebadores en reacciones que no contenían ADN genómico.

Ejemplo 11. Prevención de la formación de dímeros de cebadores en una reacción de dúplex

Se preparó una serie de reacciones de amplificación por LATE-PCR en presencia o en ausencia de 100 genomas de ADN placentario humano (Sigma, St. Louis, MO) en un volumen final de 25 μl. En el presente experimento, las reacciones de amplificación por LATE-PCR consistían de 1X de tampón para PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgCl2 3 mM y dNTP 0,20 mM. Se utilizó polimerasa Taq a razón de 1,25 unidades en cada muestra. Una primera secuencia diana de amplificación (producto 1) era una parte del exón 11 del gen de la fibrosis quística y se amplificó con un cebador limitante: 5' GACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3' (SEC ID nº 41) a una concentración de 100 nM y un cebador en exceso: 5' TCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3' (SEC ID nº 42) a una concentración de 2.000 nM. Una segunda secuencia diana de amplificación (producto 2) era una parte del exón 10 del gen de la fibrosis quística y se amplificó con un cebador limitante: 5' CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEC ID nº 43) a una concentración de 50 nM y un cebador en exceso: 5' GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEC ID nº 44) a una concentración de 1.000 nM.

La amplificación se llevó a cabo en un detector de secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, CA) durante 2 minutos a 95ºC, seguido de 25 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 56ºC durante 15 segundos, 70ºC durante 20 segundos, seguido de 50 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 56ºC durante 15 segundos, 70ºC durante 20 segundos y 45ºC durante 30 segundos con captación de la fluorescencia.

Los productos de amplificación resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3% en 0,5X tampón TBE durante 2 horas y se tiñeron con bromuro de etidio. Se muestran los resultados en la fig. 11. Las reacciones analizadas en los carriles 1 a 6 utilizaron una polimerasa Taq no de inicio en caliente, mientras que las reacciones analizadas en los carriles 7 a 12 utilizaron una polimerasa Taq más un anticuerpo de inicio en caliente. Se añadió el reactivo 9-22 DD a las reacciones analizadas en los carriles 4 a 6 y 10 a 12 en una concentración de 100 nM.

En el lado derecho del gel los presentes inventores añadieron su interpretación de las identidades de los productos de amplificación, incluyendo los amplicones de una cadena (ADNmc) y los amplicones de doble cadena (ADNdc) del producto 1 y del producto 2, así como productos más cortos que se infirió que eran dímeros de cebadores. Otros productos no específicos se encuentran marcados con un asterisco. Las amplificaciones con polimerasa no de inicio

en caliente y sin reactivo según la presente invención, carriles 1 a 3, produjeron dímeros de cebadores y otros productos no específicos. Las amplificaciones con polimerasa de inicio en caliente y sin reactivo según la presente invención, carriles 7 a 9, se observó que globalmente eran algo más puras, aunque todavía mostraban manifestaciones de cebado defectuoso. La adición de reactivo según la presente invención a las amplificaciones de inicio en caliente, carriles 10 a 12, produjo únicamente los productos deseados. La adición del reactivo según la presente invención a las amplificaciones no de inicio en caliente, carriles 4 a 6, eliminó los dímeros de cebadores y en dos de las tres repeticiones (carril 4 y carril 6), todos los demás productos no específicos también, manifestando únicamente una repetición (carril 5) un producto no específico. Los resultados presentados en la fig. 11 demuestran que una concentración baja (100 nM) de reactivo 9-22 DD resultó suficiente para impedir la formación de dímeros de cebadores al utilizar polimerasa Taq no de inicio en caliente o polimerasa Taq de inicio en caliente, y además que la concentración baja de reactivo 9-22 DD resultó prácticamente suficiente para evitar todas las manifestaciones de cebado defectuoso incluso al utilizarla con una polimerasa Taq no de inicio en caliente en amplificaciones de dos dianas con dos parejas de cebadores.

Ejemplo 12. Optimización de la cinética de una PCR dúplex en tiempo real y una PCR en tiempo real mediante el bloqueo de la formación de dímeros de cebadores

Los presentes inventores diseñaron un ensayo LATE-PCR dúplex en tiempo real para la amplificación simultánea de secuencias dentro de exones de los genes murinos Oct4 y Xist (GenBank números de acceso NM_013633 y L04961, respectivamente). Cada reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 μl y contenía los reactivos siguientes: 1X de tampón para PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) que comprendía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, y KCl 50 mM; MgCl2 3 mM, 0,4 mM de cada dNTP, cebador limitante de Oct4 50 nM que presentaba la secuencia 5' TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3' (SEC ID nº 45), 2 μM de cebador en exceso de Oct4 que presentaba la secuencia 5' CAACTTGGGGGACTAGGC 3' (SEC ID nº 46), cebador limitante Xist 100 nM que presentaba la secuencia 5' GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3' (SEC ID nº 47), cebador en exceso Xit 2 μM que presentaba la secuencia 5' TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3' (SEC ID nº 48), baliza molecular Oct4 de baja Tm 1 μM que presentaba la secuencia 5' TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGA AGG CGG-dabcilo 3' (SEC ID nº 49) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq Platinum® acomplejada con anticuerpo (Invitrogen, Carlsbad, CA). También se incluyó en la mezcla para PCR el compuesto 9-3DD o el compuesto 9-3bDD, a las concentraciones indicadas posteriormente. En el presente ejemplo no se añadió una baliza molecular para la detección de los amplicones de Xist. Cada ensayo también contenía los reactivos necesarios para la lisis celular y la transcripción inversa según el protocolo PurAmp (ver Hartshorn et al., BMC Biotechnol. 5:2, 2005), en un volumen de 2,5 μl. En esta LATE-PCR de dúplex, las concentraciones finales de dichos reactivos eran las siguientes: Tris acetato 2,5 mM, pH 8,4, acetato de potasio 3,75 mM y acetato de magnesio 0,4 mM (tampón de síntesis de ADNc diluido, sistema de RT-PCR ThermoScriptTM, Invitrogen, Carlsbad, CA), 50 μM adicionales de cada dNTP, isotiocianato de guanidina 0,13 mM, �-mercaptoetanol 6,7 μM, citrato sódico 0,7 μM, pH 7,0, dimetilsulfóxido al 0,7x10-4 % (v/v) y sarcosilo al 0,2x10-4 %.

También se añadió ADN genómico de ratón (Sigma, St. Louis, MO) a cada ensayo y se proporcionaron los moldes para la amplificación por PCR. El número de genomas añadido a cada tubo se calculó basándose en un tamaño de 6 pg/genoma (ver Vendrely y Vendrely, Experientia 5:327-329, 1949).

Las amplificaciones se llevaron a cabo en un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, CA) con un perfil térmico que comprendía 1 ciclo de 95ºC durante 5 minutos, 15 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 63ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 30 segundos, y 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 25 segundos, 72ºC durante 35 segundos y 45ºC durante 30 segundos, con captación de la fluorescencia a 45ºC en el canal TET.

Al final de la PCR, los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% en 0,5X de tampón TBE durante 2 horas y se tiñeron con bromuro de etidio. Los productos tanto de doble cadena como de una cadena, de los tamaños esperados, eran visibles para los dos genes coamplificados, indicando una LATE-PCR del dúplex eficiente.

La fig. 12 ilustra el efecto de modificar la composición del tallo del reactivo 9-3DD sobre la cinética de la LATE-PCR de dúplex descrita anteriormente, que contenía dos conjuntos de cebadores para la amplificación de dos secuencias no homólogas dentro de los genes Oct4 y Xist. La figura muestra las señales fluorescentes generados por los amplicones de Oct4 acumulados mediante la hibridación con la baliza molecular TET-Oct4. Los resultados demuestran que los valores de CT son muy similares en presencia de 9-3DD 300 nM (líneas con triángulos) o con la misma concentración de su forma modificada, 9-3bDD (líneas gruesas sin triángulos) a cada concentración de genoma analizada (10 genomas, círculo 122; 100 genomas, círculo 123; 1.000 genomas, círculo 124). La cinética de las señales fluorescentes en tiempo real resultó afectada, por el contrario, por la composición del tallo del reactivo. El compuesto 9-3bDD presentaba una Tm más alta del tallo que 9-3DD. De esta manera, los presentes inventores creen que se bloquea óptimamente la formación de dímeros de cebadores, lo que a su vez resulta en señales muy lineales y paralelas a todas las concentraciones de genoma sometidas a ensayo. En presencia del compuesto menos restrictivo 9-3DD, por el contrario, algunas de las señales fluorescentes presentaban una pendiente más pronunciada mientras que otras se saturaban pronto en la reacción, indicando la formación aleatoria de dímeros de

cebadores. Las señales generadas a diferentes concentraciones de molde con el compuesto 9-3DD eran menos paralelas que las obtenidas en presencia del compuesto 9-3bDD (con el tallo modificado). La amplificación lineal que generaba señales perfectamente paralelas (con una pendiente constante) resulta idealmente deseable y particularmente relevante para los análisis de tipo punto final.

El análisis en gel de agarosa de las muestras que contenían 9-3DD reveló bandas particularmente visibles a concentraciones de molde más altas, que podrían ser dímeros de cebadores, y bandas muy reducidas a números de molde más bajos, consistentes con cebadores. Dichas bandas no aparecieron en el análisis del as muestras que contenían 9-3bDD.

La fig. 13 ilustra el efecto de modificar la concentración de reactivo 9-3bDD sobre la LATE-PCR de dúplex descrita en el presente ejemplo y también se utiliza para la fig. 12. En este caso, la reducción de la concentración de reactivo 9-3bDD de 300 nM (líneas gruesas sin triángulos) a 200 nM (líneas con triángulos) nuevamente presentó un efecto sobre la pendiente de la amplificación lineal debido a la formación de dímeros de cebadores, tal como se confirmó mediante análisis en geles de agarosa. En consecuencia, algunas de las muestras que contenían un número inicial bajo de moldes (10 genomas, círculo 132) presentaban una fluorescencia más alta en el último ciclo ("punto final") que las muestras que contenían un número inicial más alto de moldes (100 genomas, círculo 133 y 1.000 genomas, círculo 134).

El efecto de la concentración de los reactivos indicados en la presente solicitud de patente sobre la eficiencia de la PCR también se sometió a ensayo en una LATE-PCR que amplificaba un molde con una pareja de cebadores. El molde amplificado era la misma secuencia de Oct4 murina utilizada en el dúplex indicado en las figs. 12 y 13, y los cebadores y las secuencias de baliza molecular también fueron las mismas que en dicha reacción.

Cada reacción se llevó a cabo en un volumen final de 100 μl y contenía los reactivos siguientes: 1X de tampón para PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) que comprendía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, y KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, 0,25 mM de cada dNTP, cebador limitante de Oct4 50 nM, cebador en exceso de Oct4 2 μM, baliza molecular TET-Oct4 de baja Tm 1 μM y 2 unidades de ADN polimerasa Taq Platinum® acomplejada con anticuerpo (INvitrogen, Carlsbad, CA). También sei ncluyó el compuesto 9-3DD en la mezcla para PCR, a las concentraciones de 150, 300 ó 450 nM. Tal como en el caso del dúplex anteriormente indicado (ver las figs. 12 y 13), cada ensayo también contenía los reactivos necesarios para la lisis celular y la transcripción inversa según el protocolo PurAmp, en un volumen de 10,5 μl. En esta LATE-PCR, las concentraciones finales de dichos reactivos eran las siguientes: Tris acetato 5 mM, pH 8,4, acetato potásico 7,5 mM y acetato de magnesio 0,8 mM (tampón para síntesis de ADNc diluido), 1 ng/μl de hexámeros aleatorios y 100 μM adicionales de cada dNTP (todos los componentes de un sistema de RT-PCR ThermoScriptTM, Invitrogen, Carlsbad, CA), isotiocianato de guanidina 0,4 mM, -mercaptoetanol 20 μM, citrato sódico 2 μM, pH 7,0, dimetilsulfóxido al 2x10-4 % (v/v) y sarcosilo al 0,5x10-4 %.

También se añadió ADN genómico de ratón a cada ensayo y se proporcionaron los moldes para la amplificación por PCR, tal como se ha indicado para la LATE-PCR de dúplex descrita en el presente ejemplo. La amplificación nuevamente se llevó a cabo en un detector de secuencias ABI Prism 7700 con el mismo perfil térmico detallado para la reacción de dúplex. Al final de la PCR, los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3% en 0,5X de tampón TBE durante 2 horas y se tiñeron con bromuro de etidio. Los productos tanto de doble cadena como de una cadena eran visibles en el gel y presentaban los tamaños esperados, indicando que se había realizado una amplificación eficiente mediante LATE-PCR.

Los efectos de las concentraciones crecientes de compuesto 9-3DD sobre la eficiencia de la amplificación del molde de Oct4 también se sometieron a ensayo. Los valores de CT se obtuvieron a partir de ensayos de PCR en tiempo real que contenían 5 genomas (promedio de dos réplicas para cada concentración de 9-3DD sometida a ensayo), 20 genomas (promedio de dos réplicas para cada concentración de 9-3DD sometida a ensayo), 100 genomas y 1.000 genomas, llevados a cabo con cada una de las concentraciones de 9-3DD sometidas a ensayo: 150 nM, 300 nM y 450 nM. La regresión lineal de cada serie de puntos de CT a cada concentración se muestra en la fig. 14, en la que los triángulos son la concentración de 450 nM, los cuadrados blancos, 300 nM, y los cuadrados negros, 150 nM). Resulta inmediatamente evidente a partir de esta figura que 9-3DD 450 nM retrasó en gran medida la aparición de las señales fluorescentes a un nivel superior del umbral, alterando también la dependencia de dosis de la amplificación por PCR (ver los puntos con 10 copias génicas y con 40 copias génicas, apartadas de la línea de regresión). Los valores de CT obtenidos utilizando 9-3DD a las concentraciones de 150 ó 300 nM, por otra parte, eran muy similares y demuestran una relación lineal entre el número de copia del molde y la primera aparición de la señal fluorescente.

Sin embargo, el análisis de los patrones en tiempo real de fluorescencia subraya una diferencia entre las dos condiciones (concentraciones), tal como se ilustra en la fig. 15. La pendiente de las curvas generadas por 100 genomas, círculo 151, o por 1.000 genomas, círculo 152, es más pronunciada al utilizar 9-3DD 300 nM (líneas gruesas sin triángulos) que al utilizar 9-3DD 150 nM (líneas con triángulos), sugiriendo que las condiciones más restrictivas, 300 nM, eliminan los dímeros de cebadores, incrementando de esta manera la eficiencia de la amplificación.

Ejemplo 13. Utilización de múltiples reactivos según la presente invención

Se repararon mezclas de reacción de LATE-PCR con el fin de amplificar cinco secuencias diana diferentes de material inicial de ADN genómico humano de modo individual y con el fin de amplificar las cinco conjuntamente en una reacción multiplex. Cada secuencia diana requería su propia pareja de cebadores limitante y en exceso. Las secuencias diana eran: (1) un alelo de la globina de 191 pares de bases, (2) un alelo G269 de Tay-Sachs de 312 pares de bases, (3) un alelo 1278 de Tay-Sachs de 452 pares de bases y un alelo 1.421, (4) un segmento de 549 pares de bases de región hipervariable mitocondrial 1, y (5) un segmento de 611 pares de bases que comprendía los exones 7 y 8 del gen p53. Las mezclas de reacción de 25 μl contenían 1X de tampón para PCR (Invitrogen), 0,4 mM de dNTP, Mg++ 3 mM, 0,24X verde SYBR y 1,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Invitrogen). Los cebadores se añadieron a una concentración de 50 nM en el caso del cebador limitante y de 1.000 nM en el caso del cebador en exceso. Se añadió la totalidad de las cinco parejas de cebadores a las reacciones multiplex. El ciclado térmico fue de cuarenta y cinco ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 64ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 1 minuto.

Tanto las mezclas de reacción con parejas de cebadores individuales y dianas individuales, como las mezclas de reacción con la totalidad de las cinco parejas de cebadores y la totalidad de las cinco dianas se amplificaron en presencia de una combinación de compuesto 9-22 DD 25 nM y compuesto 12-3DD 100 nM. La mezcla de reacción pentaplex también se amplificó sin adición de ningún reactivo según la presente invención. Los productos de reacción se examinaron mediante electroforesis en gel. Los resultados de la electroforesis en gel de las diversas amplificaciones se muestran en la fig. 16, que incluye marcadores de tamaño (diferentes de 100 pares de bases) en el carril r. Los carriles centrales g a k son los productos de las amplificaciones individuales de las secuencias diana,

(1) a (5), respectivamente. Los carriles l-q son los productos de las seis amplificaciones pentaplex replicadas que incluían la mezcla de compuesto 9-22 DD y compuesto 12-3DD. Los carriles a-f son los productos de seis amplificaciones pentaplex replicadas que no incluían reactivo según la presente invención. La fig. 16 muestra que la mezcla de compuestos incrementó la amplificación (más amplicones deseados y más puros) en comparación con la reacción multiplex sin adición de ningún compuesto, demostrando que pueden utilizarse mezclas de reactivos en kits, amplificaciones y ensayos de la presente invención.

Ejemplo 14. Ensayo de modos de acción

Los presentes inventores diseñaron un ensayo para investigar cuantitativamente la reducción del cebado defectuoso (mejora de la especificidad) y de los efectos inhibidores de polimerasa de los reactivos según la presente invención, que consideran distingue el primer modo del tercer modo de acción. El ensayo es un ensayo de amplificación por PCR esencialmente similar al ensayo descrito en el Ejemplo 1, con las excepciones siguientes: la mezcla de reacción de amplificación contiene la mitad (1.000 genomas) del ADN genómico fragmento, y la parte final del ciclado térmico se reduce de 70 a 40 ciclos. Las amplificaciones se llevaron a cabo con la adición de cantidades variables de reactivo según la presente invención, típicamente 25, 50, 100, 300, 1.500 y 3.000 nM. El ensayo incluía dos análisis: en primer lugar, de especificidad: una curva de fusión del producto amplificado; y en segundo lugar, de inhibición, una curva de fluorescencia en tiempo real del producto de doble cadena que se sintetiza.

Las figs. 17 y 18 presentan partes de los resultados analíticos de los dos reactivos según la presente invención: el compuesto 12-3DD y el compuesto 12-C3DD, respectivamente. En cada figura la columna I presenta las curvas d fusión para varias concentraciones seleccionadas de reactivo, tal como se indica. En cada figura, la columna II presenta las curvas de fluorescencia en tiempo real para las mismas concentraciones, tal como se indica. Haciendo referencia a la fig. 17, columna I, las curvas de fusión muestran que el compuesto 12-3DD alcanzó una especificidad alta (evitando el cebado defectuoso) a concentraciones de 100 nM y superiores (siendo la concentración más baja, de 100 nM, ligeramente más ata que la observada par la reacción indicada en el Ejemplo 1). Haciendo referencia a la fig. 17, columna II, las curvas de fluorescencia en tiempo real mostraron que la inhibición de la polimerasa se incrementó progresivamente a medida que se incrementaron las concentraciones de compuesto 12-3DD en niveles superiores a 100 nM, hasta detenerse esencialmente la reacción a concentraciones superiores a 1.000 nM. La inhibición se refleja en la cantidad más baja de producto o productos de doble cadena totales generados (incluyendo el producto específico deseado y los productos no específicos de cebado defectuoso) indicado por el nivel de saturación de fluorescencia y por el retraso del valor de CT (19,6 para 100 nM y 21,1 para 300 nM y no existente, es decir, por lo menos 40, para 1.500 y 3.000 nM). Haciendo referencia a la fig. 18, columna I, las curvas de fusión mostraban que el compuesto 12-3DD alcanzó una especificidad más alta a concentraciones de 300 nM y superiores (siendo la concentración más baja, de 300 nM, igual a la observada en la reacción indicada en el Ejemplo 1). Con referencia a la fig. 8, columna II, las curvas de fluorescencia en tiempo real mostraron que la inhibición de la polimerasa se incrementó progresivamente a medida que la concentración del compuesto 12-C3DD se incrementó a niveles superiores a 300 nM (los valores de CT eran de 18,8 para 100 nM, 18,8 para 300 nM, 21,1 para 1.500 nM y 24,5 para 3.000 nM) pero la reacción no se detuvo ni siquiera a una concentración de 3.000 nM.

En la comparación entre la fig. 18 y la fig. 18 puede observarse que el rendimiento global del compuesto 12-C3DD eran menos dependiente de la concentración que el rendimiento global del compuesto 12-3DD. De esta manera, para una reacción de amplificación particular, el retraso del CT y la reducción de la saturación de fluorescencia que resulta a medida que se incrementa la concentración del compuesto 12-C3DD de 300 a 1.500 nM, son aproximadamente iguales al resultado observado al incrementar la concentración del compuesto 12-3DD de 100 a 300 nM.

Se han descrito varias formas de realización de la invención.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Reactivo que no contribuye a la fluorescencia de fondo pero que puede evitar por lo menos una manifestación del cebado defectuoso en una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir por lo menos un producto de ADN amplificado cuando es añadido a una concentración no superior a 650 nM a una mezcla de amplificación por PCR que incluye 1,25 unidades de una ADN polimerasa termoestable por 25 μl de mezcla de reacción, siendo dicho reactivo un oligonucleótido no extensible que presenta un extremo 3' y una estructura de tallo-bucle, que no es una sonda de hibridación para dicho por lo menos un producto de ADN amplificado, que presenta un tallo que comprende una región de doble cadena que presenta una longitud superior a seis nucleótidos, y un extremo alejado del bucle que comprende un nucleótido 3' y un nucleótido 5', presentando dicho tallo una temperatura de fusión del tallo (Tm) calculada inferior a 94ºC, en el que:

   (a)

   el extremo 3' no es extensible por dicha ADN polimerasa, y

   (b)

   dicho extremo de tallo resulta estabilizado por unos medios no fluorescentes seleccionados de entre el grupo constituido por grupos no fluorescentes inhibidores de fluoróforo unidos covalentemente a los nucleótidos 3' y 5' de dicho extremo del tallo y nucleótidos no naturales que se unen más fuertemente que un híbrido ADN-ADN natural al extremo del tallo.

2. 2.

   Reactivo según la reivindicación 1, en el que el bucle es (i) un oligonucleótido que comprende por lo menos tres nucleótidos; o (ii) un conector químico no nucleotídico, opcionalmente en el que el conector químico es un puente metileno con 3 a 6 átomos de carbono.

3. 3.

   Reactivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tallo comprende una región de doble cadena de 9 a 12 pares de bases.

4. 4.

   Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tallo presenta extremos romos y no contiene desapareamientos internos.

5. 5.

   Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tallo presenta una temperatura de fusión (Tm) calculada en un intervalo seleccionado de entre el grupo constituido por 72ºC a 85ºC y 50ºC a 71ºC.

6. 6.

   Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de estabilización de tallo son parejas de 2'-O-metilnucleótidos.

7. 7.

   Kit de reactivos para llevar a cabo una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende una ADN polimerasa termoestable, por lo menos una pareja de cebadores de PCR, dNTP y por lo menos un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que opcionalmente el kit comprende además unos reactivos para el aislamiento de ácidos nucleicos.

8. 8.

   Conjunto de oligonucleótidos para llevar a cabo una amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende por lo menos una pareja de cebadores de PCR y por lo menos un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que opcionalmente el conjunto de oligonucleótidos incluye además por lo menos una sonda marcada fluorescentemente que hibrida con el producto amplificado definido por dicha por lo menos una pareja de cebadores de PCR.

9. 9.

   Conjunto según la reivindicación 8, en el que: (i) por lo menos una pareja de cebadores incluye un cebador limitante y un cebador en exceso en una proporción apropiada para llevar a cabo una amplificación por PCR lineal tras exponencial (LATE-PCR); y/o (ii) dicho producto amplificado es monocatenario.