ES2622843T3

ES2622843T3 - Procedimiento para la determinación óptica de al menos un analito en una muestra

Info

Publication number: ES2622843T3
Application number: ES12180529.5T
Authority: ES
Inventors: Frank Vitzthum; Anja Haude-Barten; Herbert Schwarz
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2032-08-15
Also published as: US20180038802A1; WO2014026828A1; EP2698627A1; EP2698627B1; US20150219564A1

Abstract

Procedimiento para la determinación óptica de al menos un analito en una muestra, y en el dicho procedimiento se usa al menos un colorante indicador el cual cambia al menos una propiedad óptica al menos una longitud dada de onda de luz ("longitud de onda de medición") dependiendo de la concentración de un analito dado, en el cual a) se determina al menos una propiedad óptica de la muestra a al menos una longitud de onda de medición, b) se determina al menos una propiedad óptica de la muestra adicionalmente al menos otra longitud de onda de luz ("longitud de onda de referencia"), y c) a partir de ambos valores de medición determinados en los pasos a) y b) se determina un valor aritméticamente calculado, y d) el valor calculado aritméticamente en el paso c) se compara con una curva de referencia que ha sido determinada por medio de valores de medición ("valores de medición de calibración"), los cuales han sido determinados en la medición de al menos una propiedad óptica de las muestras de referencia a la longitud de onda de medición, al menos una, y a la longitud de onda de referencia, al menos una, en cuyo caso las muestras de referencia contienen al igual que la muestra al menos un colorante indicador y concentraciones conocidas del analito, e) y se evalúa una desviación mínima del valor calculado aritméticamente en el paso c) de la curva de referencia como indicio de que la determinación óptica del analito, al menos uno, está distorsionado por defectos de medición.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la determinacion optica de al menos un analito en una muestra Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la determinacion optica de al menos un analito en una muestra en el cual se evalua una desviacion de un valor de referencia o de la curva de referencia como indicio de que la determinacion optica del al menos un analito ha sido distorsionada por defectos de medicion.

Antecedentes de la invencion

Principalmente en el diagnostico cllnico se detectan analitos en una muestra, con frecuencia de manera optica, con ayuda de colorantes indicadores, es decir colorantes que reaccionan con el analito que va a detectarse, por ejemplo formando un complejo y/o mediante una reaccion en la cual el colorante se convierte de una forma en otra. En ambos casos, el colorante cambia sus propiedades espectrales, es decir, por ejemplo, su caracterlstica de absorcion o de fluorescencia. Por lo tanto, el cambio de las propiedades espectrales puede usarse como una medida de la presencia de un analito.

Sin embargo, la interaccion del colorante con el analito que va detectarse con frecuencia no es completamente especlfica. En tales casos, el colorante reacciona tambien con otras sustancias, o clases de sustancias, contenidas en la muestra, y en este caso tambien modifica sus propiedades espectrales. Ademas, el analito que va detectarse tambien puede interactuar con otras sustancias de modo que se perjudica el enlace o la reaccion con el colorante.

Igualmente, una muestra puede contener sustancias que no reaccionan o interactuan con el analito o el colorante, pero si absorben en los intervalos de longitud de onda relevantes y, por lo tanto, influyen en la reaccion de deteccion.

Los materiales o sustancias que interfieren con las determinaciones tambien se denominan materiales de interferencia en lo sucesivo. La presencia de tales materiales de interferencia puede conducir a determinaciones erroneas del analito de modo que la concentration o la actividad del mismo en una muestra es subestimada o sobreestimada. Principalmente en el diagnostico cllnico, esto puede dar lugar a hallazgos incorrectos y, por lo tanto, a un diagnostico incorrecto.

Esto es problematico, por ejemplo, en la determinacion cllnica de albumina, principalmente en la orina. La determinacion de albumina en orina es uno de los parametros mas importantes y usados con mas frecuencia en la qulmica cllnica. Esto aplica tanto para el laboratorio central como tambien para el diagnostico en sitio (point of care o punto de cuidado). Pero las determinaciones de protelna total en la orina o en plasma tambien tienen relevancia cllnica. Ademas, los procedimientos para determinar protelnas y las concentraciones de las mismas son de gran interes general. Por ejemplo, los procedimientos para la determinacion de protelna durante el desarrollo y para control de procesos de purification de protelna son esenciales, y tambien en la investigation fundamental la determinacion del contenido de protelna en una muestra desempena un gran papel.

La especificidad de la deteccion de analitos por medio de colorantes indicadores adecuados puede mejorarse desarrollando colorantes mas especlficos. De esta manera se minimizan las reacciones paralelas de los colorantes. Por ejemplo, para la deteccion de albumina en la orina se usa preferiblemente verde de bromocresol o purpura de bromocresol. Estos colorantes casi no reaccionan con otras protelnas. Esto reduce el riesgo de una determinacion erronea por la presencia de otras protelnas diferentes de albumina. A pesar del uso de colorantes mas especlficos, todavla se presentan, no obstante, determinaciones defectuosas debido a la influencia de materiales de interferencia.

Otro planteamiento para reducir eventuales defectos debido a materiales de interferencia consiste en medir simultaneamente en dos longitudes de onda diferentes. De esta manera, por ejemplo, por una parte puede seleccionarse una longitud de onda a la cual son maximos los cambios dependientes de analito de las propiedades opticas del colorante indicador, y por otra parte puede seleccionarse una longitud de onda a la cual se realiza una medicion de referencia. A manera de ejemplo, pueden interferir cromoforos como la hemoglobina y la bilirrubina, o las turbiedades provocadas por materiales de referencia. Por lo tanto, por ejemplo, se realizan mediciones comparativas en el intervalo de absorcion de hemoglobina y bilirrubina a 540 nm o para determinar turbiedades en el intervalo de ondas largas, por ejemplo hace 300 o 750 nm. Si se sobrepasa un valor llmite determinado, esto indica una turbidez o una influencia de un cromoforo. Si el valor llmite se sobrepasa, la determinacion puede clasificarse como posiblemente incorrecta.

Este planteamiento tampoco puede suprimir completamente defectos debido a materiales de interferencia y, ademas, los valores de medicion distorsionados por defectos que no han sido suprimidos con frecuencia no son reconocibles para el usuario y, por lo tanto, el tiene que percibir los resultados incorrectos de medicion como correctos. Ademas, los cromoforos, por ejemplo, pueden provocar turbidez y de esta manera distorsionar el resultado de la medicion.

Description breve de la invencion

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Un objeto de la presente invencion es reducir la cantidad de determinaciones incorrectas de los analitos. Otro objeto de la presente invencion es incrementar la reproducibilidad de determinaciones opticas de los analitos. Otro objeto de la presente invencion es hacer accesibles para el analisis aquellas muestras, que estan contaminadas con una probabilidad especlfica.

Estos objetos se logran gracias a las caracterlsticas del presente conjunto de reivindicaciones. Las reivindicaciones dependientes indican formas preferidas de realizacion. En este caso puede notarse que las especificaciones de intervalos pueden entenderse en su totalidad como inclusivas de los valores llmites respectivos.

Description detallada de la invencion

De acuerdo con la invencion se proporciona un procedimiento para determinar opticamente al menos un analito en una muestra; en dicho procedimiento se usa al menos un colorante indicador que cambia sus propiedades opticas en al menos una longitud de onda de luz determinada ("longitud de onda de medicion") dependiendo de la concentration de un analito determinado.

En este caso, en un paso a) se determina al menos una propiedad optica de la muestra al menos una longitud de onda de medicion, y en un paso b) se determina al menos una propiedad optica de la muestra adicionalmente al menos otra longitud de onda de luz ("longitud de onda de referenda"). Opcionalmente puede preverse que en un paso c) se determine un valor calculado aritmeticamente a partir de los dos valores de medicion determinados en los pasos a) y b).

Ademas se preve comparar en un paso d) el valor de medicion obtenido en el paso b) por determination de la propiedad optica, al menos una, de la muestra para longitud de onda de referencia o, cuando se presenta, el valor aritmeticamente calculado en el paso c), con un valor de referencia o una curva de referencia que haya sido determinada por medio de valores de medicion ("valores de medicion de calibration") los cuales hayan sido determinados durante la medicion de al menos una propiedad optica de las muestras de referencia a la longitud de onda de medicion, al menos una, y a la longitud de onda de referencia, al menos una. En tal caso, las muestras de referencia contienen o contenlan, igual que la muestra, al menos un colorante indicador as! como concentraciones conocidas del analito.

En un paso e), una desviacion minima del valor de medicion obtenido en el paso b) determinando la propiedad optica, al menos una, a la longitud de onda de referencia, o cuando esta presente, del valor calculado aritmeticamente en el paso c), del valor de referencia o de la curva de referencia se evalua como indicio de que se ha distorsionado la determinacion optica del al menos un analito por defectos de medicion. En el procedimiento mencionado es importante que los pasos procedimentales denominados con los signos de referencia a) - e) no tienen que transcurrir en absoluto en la secuencia mencionada. Tambien estan comprendidos por la protection de la presente solicitud aquellos procedimientos en los cuales es intercambiable la secuencia de los pasos procedimentales.

La longitud de onda de medicion se selecciona preferiblemente de tal manera que los cambios de las propiedades opticas del colorante indicador, que dependen del analito, a la misma longitud de onda, esten en su punto maximo.

Para diferenciar entre valor de referencia y curva de referencia, adviertase que un valor de referencia puede usarse cuando se usa una longitud de onda isosbestica como longitud de onda de referencia. Una curva de referencia se requiere cuando se usa una longitud de onda no isosbestica como longitud de onda de referencia.

Fundamentalmente son concebibles dos variantes del procedimiento los cuales estan enlazados por la misma idea de acuerdo con la invencion. Estas variantes de la invencion se definen en las reivindicaciones independientes 1 y 2.

En la variante 1 se realizan mediciones a la(s) longitud(es) de medicion y de referencia. Por medio de la longitud de onda de medicion resulta un valor de referencia determinado de la curva de referencia. Al usar un punto isosbestico, no se necesita una curva de referencia. El valor de medicion a una longitud de onda de referencia no puede desviarse de este valor de referencia mas alla de una cantidad especlfica, de otra manera esto es un indicio de un defecto de medicion. De acuerdo con la variante 2, las mediciones se realizan a longitud(es) de onda de medicion y longitud(es) de onda de referencia. A partir de los valores de medicion de la(s) longitud(es) de onda de medicion y de las longitudes de onda de referencia se calculan (aritmeticamente) valores. De manera analoga se hace con un procedimiento de curva de calibracion o de referencia. Los valores calculados de las mediciones se comparan con aquellos de la culpa de referencia. Una desviacion minima del valor calculado aritmeticamente, determinado, del valor de referencia se evalua como un indicio de un defecto. De manera preferible en este caso se preve que en la determinacion optica se determina la concentracion de al menos un analito en la muestra.

El analito es de manera particularmente preferida una biomolecula, preferiblemente seleccionada del grupo que contiene proteinas, peptidos, aminoacidos, poli-, oligo- o monosacaridos, acidos poli-, oligo- o mononucleicos, o lipidos.

Aqui se prefieren particularmente proteinas. Principalmente se prefiere la proteina albumina la cual se usa, entre otras, para diagnosticar una proteinuria, a partir de la cual puede concluirse una insuficiencia renal. De esta manera, una

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concentracion de albumina > 20 mg/l de orina indica el desarrollo inicial de una nefropatla y es un marcador temprano de danos glomerulares.

Ademas, preferiblemente se preve que las propiedades opticas del colorante indicador y/o de la muestra que van a determinarse sean la absorcion y/o la extincion.

De manera particularmente preferida se preve que el colorante indicador sea un colorante seleccionado del grupo que contiene

■ azul brillante de Coomassie (CBB por Coomassie brilliant blue)

■ DIDNTB

■ HABA

■ verde de bromocresol (BCG)

■ purpura de bromocresol (BCP)

■ azul de bromofenol (BPB)

■ azul de tetrabromofenol, (TBPB)

■ sulfonnaftalelna de pirogalol.

DIDNTB es bis-(3c,32-diyodo-4c42-dihidroxi-5c5'-dinitrofenil)-3,4,5,6-tetrabromosulfonftalelna (DIDNTB). HABA es acido 2-(4c-hidroxiazobenceno) benzoico (HABA).

Otros colorantes que se toman en cuenta son difenilamina, DABA (acido 3,5-diaminobenzoico diclorhidrato), orcinol y antibioticos de antraciclina tales como adriamicina o mitramicina

De modo particularmente preferido se preve ademas que el defecto de medicion sea causado al menos otro material de interferencia. Tal material de interferencia tambien reacciona con el colorante indicador el cual cambia, como consecuencia, sus propiedades espectrales, interactua con el analito o absorbe en los intervalos de longitud de onda relevantes, e influye con esto la reaccion de deteccion.

Los materiales de interferencia pueden ser clases de sustancias completamente diferentes, por ejemplo compuestos organicos de bajo peso molecular, detergentes, heterociclos o protelnas. A manera de ejemplos, los detergentes tales como SDS y Triton X-100, los heterociclilos tales como NAD, o los compuestos organicos como glicina y HEPES distorsionan las determinaciones de protelna mediante azul brillante de Coomassie Brilliant Blau (CBB). El metodo de la determinacion de albumina por medio de purpura de bromocresol (BCP) puede interfenirse por la presencia de materiales de interferencia con bajo peso molecular tales como la toxina uremica endogena acido 3-carboxi-4-metil-5- propil-2-furanopropanoico (CMPF). Ademas, los cromoforos contenidos en la muestra, tales como por ejemplo hemoglobina o sus productos de descomposicion como la bilirrubina, tambien pueden actuar materiales de interferencia.

De manera particularmente preferida se preve que la longitud de onda de referencia sea una longitud de onda isosbestica con respecto del colorante indicador.

Una longitud de onda isosbestica es una longitud de onda a la cual no cambian, o casi no cambian, las propiedades opticas de un colorante indicador frente a la luz incidente dependiendo del analito especlfico - de manera diferente que la longitud de onda de medicion, a la cual el cambio de las propiedades opticas del colorante indicador cambia de la manera maxima posible (y de manera ideal incluso proporcionalmente) dependiendo del analito especlfico. A una longitud de onda isosbestica, por ejemplo en mediciones de absorcion en muestras que contienen solamente diferentes concentraciones del analito especlfico ademas del colorante indicador, no se obtiene modificacion de la absorcion dependiente de la concentracion, sino siempre una absorcion mas o menos constante que se orienta de manera predominante por la concentracion del colorante indicador. Suponiendo una concentracion dada del colorante indicador, de esta manera puede medirse un valor de referencia con el cual se compara mas tarde los valores de medicion obtenidos concretamente. Especlficamente, si se mide una absorcion que se desvla de este valor, esta se debe a un defecto a causa de un material de interferencia.

En este caso se preve que para determinar la cuestion de si se presenta una desviacion minima del valor medido obtenido en el paso b) mediante determinacion de la propiedad optica, al menos una, de la muestra a la longitud de onda de referencia o, si esta presente, del valor calculado aritmeticamente en el paso c) del valor de referencia, se verifica si

• el valor de medicion o el valor calculado aritmeticamente se encuentra por fuera de la desviacion estandar sencilla o multiple del valor de referencia del estandar de la serie de calibration y/o

• la sensibilidad y/o especificidad del valor medido o del valor calculado aritmeticamente se encuentran por fuera de los valores limites dados.

Ademas, preferiblemente se preve que la longitud de onda de referencia con respecto al colorante indicador sea una longitud de onda a la cual el colorante indicador no tenga un maximo de absorcion ni un minimo de absorcion.

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En este caso se preve preferiblemente que la curva de referenda se haya determinado mediante

■ inter- y/o extrapolation

■ regresion lineal, y/o

■ un polinomio de segundo orden o de un orden superior

de los valores de medicion de calibration obtenidos de acuerdo con el paso d).

De manera particularmente preferida se preve en este caso que para determinar la cuestion si existe una desviacion minima del valor de medicion obtenido en el paso b) mediante determination de la propiedad optica, al menos una, de la muestra a la longitud de onda de referencia o, cuando esta presente, del valor de referencia calculado aritmeticamente en el paso c) del valor de referencia o de la curva de referencia, se verifica si

• el valor de medicion o el valor calculado aritmeticamente se encuentra por fuera de un intervalo de confianza dado del valor de referencia o de la curva de referencia,

• el valor de medicion o el valor calculado aritmeticamente se encuentran por fuera de un intervalo formado por interpolation o regresion de la desviacion estandar sencilla o multiple de los valores de medicion de calibracion individuales del estandar de la serie de calibracion, y/o

• la sensibilidad y/o especificidad del valor de medicion o del valor calculado aritmeticamente se encuentran por fuera de valores llmites dados.

En la practica puede procederse en este caso tal como sigue: primero se prepara una curva de calibracion en la cual se ha medido la absorcion a la longitud de onda de referencia y la longitud de onda de medicion para muestras de concentration conocida libres de materiales de interferencia. Los valores obtenidos se han puesto enfrentados en un sistema de coordenadas y, a continuation, se realiza una regresion lineal y se calculan intervalos de confianza. Las muestras obtenidas en la practica se mezclan ahora de manera similar con el colorante indicador y se miden. Las muestras que contienen materiales de interferencia que influyen esencialmente las mediciones y conducen a defectos de medicion se encuentran por fuera de los intervalos de confianza y por lo tanto pueden considerarse como erroneas. La figura 4 muestra la implementation de este metodo.

Ademas, las desviaciones estandar, sencilla, doble o triple, de los valores de medicion de calibracion pueden usarse con el fin de establecer un intervalo de referencia. Para este proposito, se miden multiples veces los valores de medicion de calibracion y se determinan el valor medio y la desviacion estandar. El valor correspondiente se adiciona al valor medio o se sustrae del mismo. La dependencia de los valores por encima de los valores medios y la de los valores por debajo de los valores medios de la absorcion, por ejemplo, a 594 nm, o un parametro correspondiente se describe por medio de una funcion, por ejemplo una regresion polinomica o una lineal. Esta funcion proporciona entonces las referencias superiores o inferiores o valores llmite. La implementacion se efectua de manera similar a como se muestra en la figura 4, con la diferencia de que ahora se usa la desviacion estandar multiplicada por n, en lugar del intervalo de confianza.

Otra posibilidad de establecer los valores llmite consiste en establecer la sensibilidad que especificidad deseadas del procedimiento. Tal como en casi todos los procedimientos anallticos o diagnosticos, tambien pueden ocurrir estimaciones en el metodo de acuerdo con la invention. Puede ocurrir que en el caso de muestras que no contienen materiales de interferencia se concluya que hay un defecto de medicion debido a material de interferencia ("falso positivo"), y/o que en caso de muestras que contienen materiales de interferencia, estos no sean reconocidos ("falsos negativos").

La sensibilidad de un procedimiento proporciona la information sobre cuantas muestras positivas (es decir muestras que contienen material de interferencia o muestras todavla mas especiales, que contienen material de interferencia que distorsionar la determinacion del propio analito mas alla de una cantidad aceptable) se reconocen como tales. En este caso, la sensibilidad del metodo designarla la fraction de las muestras que tienen material de interferencia o defecto de medicion relacionado con materiales de interferencia, la cual se reconoce correctamente entre todas las muestras medidas con material de interferencia correspondiente. Esto se expresa mediante la ecuacion

Sensibilidad = (muestras detectadas con material de interferencia/cantidad total de las muestras medidas con material de interferencia) (%)

La especificidad de un metodo proporciona un parametro de cuantos falsos positivos pueden esperarse. En este caso esto significa cuantas muestras se clasifican incorrectamente como afectadas por material de interferencia, aunque no se perjudiquen por materiales de interferencia. Esto se expresa mediante la ecuacion

Especificidad = (muestras en las que no ha sido detectado un material de interferencia / cantidad total de las muestras medidas sin material de interferencia) (%)

La sensibilidad y la especificidad del metodo pueden establecerse seleccionando valores llmite. Estos pueden adaptarse dependiendo de los requisitos para la sensibilidad y especificidad y a partir de valores experimentales de

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los materiales de interferencia que pueden esperarse en un colectivo de muestras. Por ejemplo, los valores de medicion de calibracion para muestras de diferente concentracion, que no estan contaminadas con material de interferencia, pueden generarse y compararse con valores de medicion de calibracion para muestras que contienen materiales de interferencia. Los valores llmite para la especificidad y sensibilidad se establecen luego de tal manera que se vuelve posible una discrimination limpia entre muestras distorsionadas y no distorsionadas.

Ademas se preve preferiblemente que la determination optica del analito, al menos uno, y/o la medicion de las propiedades opticas de la muestra de referencia se realice en un recipiente seleccionado del grupo que incluye cubeta, placas de microtitulacion, tubo de ensayo, portaobjetos, chip de detection, etc.

Ejemplos de realizacion

Para los estudios fueron usados los siguientes materiales de las companlas indicadas. Albumina de suero bovino (BSA; A7030-50G; lote 124K0597) y nicotinamida-adenina-dinucleotido (NAD), numero de producto 43410; lote 42606158) eran de Sigma (Taufkirchen, Alemania). Hepes (numero de catalogo 441475K; lote K35477084 647) era de BDH Chemical (Poole, Reino Unido). Triton X 100 (numero de catalogo 1.08603.1000), glicina (numero de catalogo 1.04201.1000; lote K34245201515)) eran de Merck (Darmstadt, Alemania). El concentrado del reactivo CBB (ensayo de protelnas; concentrado de tinte reactivo) (Cat. No. 500-0006; lote no 105341) era de Bio-Rad (Munich, Alemania). PS microplacas de 96 pozos (catalogo No. 655 101; lote 03 26 01 03; F-Form) eran de Greiner Bio-one (Frickenhausen, Alemania). Se uso el espectrofotometro Spectra Max Plus de Molecular Devices. Se realizaron experimentos tal como se describen a continuation:

Se preparo una solution madre acuosa con una concentracion de 100 pg/ml. Se prepararon calibradores de BSA de 100, 80, 60, 40, 20 y 10 pg/ml por medio de diluciones correspondientes con agua. El calibrador sin BSA era agua. Se preparo solucion de CBB mediante una dilution 1:4 del concentrado de CBB con agua. Se cargaron inicialmente 60 pl de muestra a un pozo de un MTP y a continuacion se adicionaron 240 pl de solucion de CBB. Despues de aproximadamente 10 minutos de incubation a temperatura ambiente se realizaron determinaciones espectrofotometricas. Por lo regular los espectros se registraron entre 400 - 650 nm en pasos de 2 pm. En una variante especial de la solucion de CBB se encuentra Triton X-100. Este reactivo es para incrementar la sensibilidad de determinaciones de protelna y ha sido preparado mezclando solucion de CBB con Triton X-100 de tal manera que la concentracion de Triton X-100 fue de 0,008 % (v/v).

Cantidades correspondientes de sustancias de interferencia fueron adicionadas a la BSA o al agua cargadas previamente en la cavidad y a continuacion fueron mezcladas con solucion de CBB. Por medio de la figura 1 se hace claro que los maximos de absorcion o los hombros de absorcion de la formula protonizada doblemente y de la forma desprotonizada una vez se encuentran a aproximadamente 650, 470, 310 y 270 nm. Los puntos isosbesticos en la transition de la forma doblemente protonizada a la forma desprotonizada una vez se encuentran a aproximadamente 550 y 340 nm. En caso de incrementarse adicionalmente el valor de pH, ocurre un desplazamiento hipsocromico, es decir un desplazamiento hacia el rango de ondas cortas debido a la transicion desde la forma desprotonizada una vez a la forma desprotonizada dos veces. Este anion de CBB tiene maximos de absorcion a aproximadamente 580, 400 y 265 nm. Ademas, el hombro de absorcion gana intensidad a aproximadamente 310 nm con el fin de formar finalmente una banda de absorcion separada que tiene un maximo en este intervalo de longitud de onda.

Los puntos isosbesticos en la transicion de la forma desprotonizada una vez a la forma desprotonizada se encuentran en aproximadamente 530 y 330 nm. Esta transicion es decisiva en el enlace del colorante en a la protelna en el caso de usar solucion reguladora tlpica de pH con un valor de pH de aproximadamente 0,77.

1. Determinacion de protelna con CBB

La determinacion de la concentracion de protelna se realiza por medio de una calibracion, por ejemplo por medio de una llnea recta de calibracion. Los valores de absorcion de los calibradores con concentraciones conocidas de BSA se usan para la determinacion de la concentracion de BSA o de protelna en muestras desconocidas. En la determinacion de protelna por medio de CBB por lo regular se usa la absorcion a 595 nm o el cociente de las absorciones a 595 y 470 nm ("proportion inicial").

La tabla 1 muestra la recuperation de una concentracion predefinida de BSA de 40 pg/ml o de una muestra sin BSA por medio de la determinacion de absorcion a 595 nm o el calculo de cociente a 595 nm y 470 nm en ausencia o presencia de diferentes sustancias de diferente concentracion. En los experimentos se empleo CBB estandar. Es claro que sustancias de interferencia como glicina, Hepes, SDS, Triton X-100 o NAD, se recupera bien la concentracion de BSA de una muestra con una concentracion predefinida de BSA de 40 pg/ml o la de una muestra sin BSA. Sin embargo, la presencia de sustancias de interferencia da lugar a determinaciones incorrectas gruesas.

Tabla 1

: VM abs 595 / 470 nm BSA calculado Conc. [pg/ml] BSA “de ref.” [pg /ml] VM abs. 595 nm BSA calculado Conc. [pg/ml] BSA “de ref.” [pg/ml]

sin glicina: 1,29 38,72 40 0,84 44,60 40

glicina de 0,1 M: 1,72 61,23 40 1,08 75,68 40

glicina de 0,2 M: 4,08 182,24 40 1,34 109,14 40

glicina de 0,4 M: 12,23 600,01 40 1,17 87,56 40

sin glicina: 0,55 1,19 0 0,45 -5,31 0

glicina de 0,1 M: 0,83 15,58 0 0,67 22,75 0

glicina de 0,2 M: 3,32 143,31 0 1,32 107,53 0

glicina de 0,4 M: 14,03 692,08 0 1,35 111,27 0

sin Hepes: 1,27 37,89 40 0,83 43,79 40

Hepes de 0,1 M: 2,64 108,40 40 0,97 62,03 40

Hepes de 0,15 M: 3,91 173,12 40 1,05 72,58 40

Hepes de 0,2 M: 6,21 291,52 40 1,10 79,09 40

sin Hepes: 0,55 0,90 0 0,46 -5,04 0

Hepes de 0,1 M: 1,50 49,81 0 0,74 31,87 0

Hepes de 0,15 M: 3,19 136,27 0 1,05 71,88 0

Hepes de 0,2 M: 5,97 278,92 0 1,25 97,60 0

sin SDS: 1,30 39,58 40 0,83 43,60 40

0,1 % SDS: 1,30 39,31 40 0,60 13,06 40

0,2 % SDS: 1,33 41,02 40 0,52 3,55 40

0,4 % SDS: 1,42 45,72 40 0,37 -15,58 40

sin SDS: 0,60 3,38 0 0,46 -3,99 0

0,1 % SDS: 1,24 36,31 0 0,72 29,15 0

0,2 %SDS: 1,33 41,08 0 0,52 3,34 0

0,4 % SDS: 1,42 45,56 0 0,37 -16,56 0

sin Triton: 1,07 44,596 40 1,0014 54,976 40

0,05 % Triton: 3,15 195,637 40 1,831 153,738 40

0,1 % Triton: 9,19 633,231 40 2,6298 248,833 40

0,5% Triton: 20,72 1468,769 40 2,5447 238,702 40

sin Triton: 0,43 -1,517 0 0,4622 -9,214 0

0,05 % Triton: 0,50 3,497 0 0,545 0,643 0

0,1 % Triton: 7,15 485,114 0 2,5668 241,333 0

0,5% Triton: 15,73 1106,703 0 2,5177 235,488 0

sin NAD: 1,051 43,326 40 0,9444 48,190 40

NAD de 0,055 pM: 1,159 51,115 40 0,8857 41,202 40

NAD de 0,278 pM: 1,553 79,708 40 0,9301 46,488 40

NAD de 0,55 pM: 2,380 139,622 40 0,8773 40,202 40

sin NAD: 0,462 0,627 0 0,522 -2,095 0

NAD de 0,055 pM: 2,759 167,097 0 1,6801 135,774 0

NAD de 0,278 pM: 0,547 6,758 0 0,4232 -13,857 0

NAD de 0,55 pM: 0,752 21,680 0 0,4162 -14,690 0

2. Determinacion de protelna con CBB en combinacion con Triton X-100

En una variante especlfica de la determinacion de protelna por medio de CBB se adiciona Triton X-100 al reactivo. Esto es para incrementar la sensibilidad de la determinacion. La tabla 2 muestra la recuperacion de una concentracion 5 predefinida de BSA de 40 pg/ml o de una muestra sin BSA por medio de determinacion de absorcion a 595 nm o calculo de cociente a 595 y 470 nm en ausencia o presencia de diferentes sustancias de diferente concentracion. En los experimentos fue empleado CBB con una concentracion de Triton X 100 de 0,008%. Es claro que sin otras sustancias de interferencia, se recupera bien la concentracion de BSA de una muestra con una concentracion predefinida de PSA de 40 pg/ml o la de una muestra sin BSA. Aunque Triton X-100 esta presente en el reactivo, la

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presencia de mas cantidades de Triton X-100 en la muestra puede dar lugar nuevamente a determinaciones incorrectas gruesas.

Tabla 2

: VM abs. 595 / 470 nm BSA calculado Conc. [pg/ml] BSA “de ref.” [pg/ml] VM abs. 595 nm BSA calculado Conc. [pg/ml] BSA “de ref.” [pg/ml]

sin Triton: 0,98 35,82 40 0,85 40,65 40

0,02 % Triton: 6,56 393,92 40 2,45 129,92 40

0,05 % Triton: 12,62 782,32 40 2,94 161,54 40

0,1 % Triton: 16,55 1034,08 40 3,02 166,93 40

sin Triton: 0,46 2,50 0 0,49 4,45 0

0,02 % Triton: 5,85 348,21 0 2,40 127,10 0

0,05 % Triton: 12,46 771,82 0 2,90 159,24 0

0,1 % Triton: 14,06 874,68 0 2,88 158,04 0

Fundamentalmente, las muestras que tienen valores de absorcion particularmente altos ya son notables per se. En el caso de muestras que exceden una absorcion de X, generalmente se realiza una dilucion y se realiza una vez mas una medicion puesto que la conducta de absorcion por encima de este umbral ya no se comporta linealmente en relacion con la concentracion del indicador respectivo.

Sin embargo, los defectos de medicion causado por materiales de interferencia pueden detectarse generalmente solo si el valor de absorcion de los mismos se encuentra afuera del intervalo de valores que habla sido establecido mediante calibracion previa usando muestras de contenido conocido, en cuyo caso estos valores de calibracion tienen que reflejar las concentraciones maximas o mlnimas que se esperan del analito.

Dibujos

Fig. 1: dependencia del espectro de Coomassie azul brillante (CBB) del valor de pH del medio.

Las determinaciones de protelna o de albumina usando CBB por lo regular se realizan a una longitud de onda de aproximadamente 595 nm. La diferencia de la absorcion entre dos formas de CBB, la forma libre y la forma enlazada con protelna es la mas grande aqul. Se describe que el colorante se enlaza a las protelnas por medio de interacciones de van-der-Waals e interacciones hidrofugas y principalmente por medio de interacciones con aminoacidos basicos como arginina, lisina e histidina. La cantidad de moleculas de colorante debe correlacionarse con la cantidad de cargas positivas de las protelnas. Los aminoacidos libres, los peptidos y las protelnas de bajo peso molecular, de menos de 3000 g por mol, generalmente no reaccionan con CBB.

A excepcion de otras influencias en las propiedades espectrales en el caso de enlace de los colorantes a las protelnas, se supone que el cambio de las propiedades espectrales esta acompanado principalmente por una reaccion que es mediada por protelnas. Debido a la interaccion con protelnas ocurre un cambio del equilibrio protolltico de los colorantes. Esta reaccion acido-base dependiente de la protelna esta acompanada por un cambio ostensible de propiedades espectrofotometrica as de CBB.

CBB se encuentra presente en el medio acuoso fuertemente acido como cation doblemente protonizado (AH2+). En el caso de CBB, puede ocurrir, por lo tanto, una desprotonizacion de dos etapas. Los valores de pK de estas reacciones se encuentran uno junto a otro. En este caso en dos pasos se desprotoniza CBB de un cation (AH2+) rojo (470 nm) cargado positivamente una vez a pH 0,3 por medio de una sustancia neutra verde (650 nm) (AH) a un anion (A-) azul (595 pm) que tiene una carga negativa simple a pH 1,3.

Las mediciones se efectuaron con un espectrofotometro usando cubetas de cuarzo. Se titularon paso a paso 3 ml de una solucion de azul brillante de Coomassie con un valor de pH de 0,76 adicionando 150 a 300 pl de hidroxido de sodio de 1N hasta un valor de pH de 1,55. La temperatura se incremento de 21 a 31 °C en este caso. La muestra se diluyo en aproximadamente 40%. Ademas, se acidificaron paso a paso 3 ml de una solucion de azul brillante de 5 Coomassie con un valor de pH de 0,76 adicionando 150 a 200 pl de solucion de acido clorhldrico de 10 N hasta un valor de pH de 0,18. La temperatura se incremento en este caso de 21 a 29 °C la muestra se diluyo en aproximadamente 23%. Las mediciones se efectuaron aproximadamente 10 minutos despues de adicionar la solucion de hidroxido de sodio o la solucion de acido clorhldrico. La influencia del cambio de temperatura puede despreciarse. Puede verse bien que la reaccion de indicador tiene puntos isosbesticos o un intervalo isosbestico en el intervalo de 10 aproximadamente 340 nm y en el intervalo de 520 - 520 nm. Como longitudes de onda de medicion se usan en terminos generales 594 nm y/o 470 nm. Con frecuencia se mide tambien a ambas longitudes de onda de modo simultaneo o sucesivo y se forma un cociente de ambos valores de medicion ("proporcion inicial"). En un ejemplo de realization, como longitud de onda de referencia se usa 540 nm. Esta longitud de onda es apropiada principalmente puesto que los aparatos habituales en este ramo con frecuencia usan filtros que permiten mediciones a la longitud de onda de 540 15 nm.

Fig. 2: recuperation de muestras con 0 y 40 mg/L de BSA por medio de determination de absorcion a 595 nm en ausencia o presencia de glicina.

Primero se preparo una curva de calibration usando concentraciones conocidas de BSA (reactivo de CBB, 595 nm). Esto da lugar a que la proporcion entre la absorcion a 595 nm y la concentration de BSA no sea completamente lineal. 20 Los valores de referencia (sin glicina) para 0 mg/l y 40 mg/l de BSA estan marcados con rectangulos. Adicionando glicina de 0,1 M (triangulo), de 0,2 M (estrella) y de 0,4 M (diamante) se incrementan los valores de absorcion tanto en la muestra sin BSA como tambien en la muestra con BSA. La presencia de glicina de 0,1 conduce ya a una fuerte desviacion del valor de referencia a 0 y 40 mg/l de BSA. Para el caso en el cual los valores de medicion concretos estan ostensiblemente por fuera del intervalo de absorcion a esperar con base en la curva de calibracion, puede 25 deducirse un defecto de medicion por materiales de interferencia. Para el caso en que los valores de medicion concretos no se encuentren ostensiblemente por fuera del intervalo de absorcion a esperarse con base en la curva de calibracion, no se nota un defecto de medicion por materiales de interferencia.

Fig. 3: recuperacion de muestras con 0 y 40 mg/L de BSA mediante determinacion doble a 595 nm y 470 nm (longitudes de onda de medicion) en ausencia o presencia de glicina.

30 Fig. 3 muestra resultados similares que en la Fig. 2. Los valores de referencia (sin glicina) estan marcados con triangulos. Adicionando glicina de 0,1 M (triangulo), de 0,2 M (estrella) y de 0,4 M (diamante) se incrementa el cociente abs [595/470] de manera creciente tanto de la muestra sin BSA, como tambien en la muestra con BSA. Incluso la presencia de glicina de 0,1 conduce a una fuerte desviacion del valor de referencia en 0 y 40 mg/l de BSA. En contraste con la Fig. 2, en la Fig. 3 se realizaron determinaciones dobles a 595 nm y 470 nm tanto para la calibracion como 35 tambien para las mediciones concretas y se expresaron como el cociente abs [595/470]. En tal caso, en contraste con la determinacion solo a 595 nm, resulta una proporcion lineal entre los cocientes y la concentracion de BSA.

Las Figs. 2 y 3 dejan claro que el hecho que un valor de medicion concreto se encuentre dentro del intervalo de absorcion que debe esperarse con base en una curva de calibracion no ofrece una posibilidad de excluir mediciones erroneas. Si de acuerdo con la invention, no obstante, se realiza adicionalmente una medicion a al menos una longitud 40 de onda de referencia (vease mas abajo), pueden excluirse mejor las mediciones erroneas.

Fig. 4: relation entre absorcion a 440 nm (longitud de onda de referencia) y absorcion a 594 nm (longitud de onda de medicion que se usa para la determinacion de la concentracion de BSA) y la influencia del material de interferencia glicina.

En la Fig. 4 se preparo primero una curva de calibracion a la cual se habla medido la absorcion a 440 nm (longitud de 45 onda de referencia) y 594 nm (longitud de onda de medicion) para muestras de concentracion conocida (CBB + 0, 10, 20, 30, 60, 80 y 100 mg/ml de BSA), libres de material de interferencia. Los valores fueron calibrados enfrentados y a continuation se realizo un ajuste de curva lineal y se calculo el intervalo de confianza. A continuation, se midieron de manera dirigida muestras contaminadas de manera similar a 440 nm (longitud de onda de referencia) y 594 nm (Longitud de onda de medicion). Las muestras que contienen material de interferencia (glicina de 0,1 M) (clrculo) se 50 encuentran por fuera de un intervalo de confianza y de esta manera se identifican correctamente como erroneas.

El intervalo de confianza es el intervalo de confianza al 95% o el intervalo de prediction al 95% en el cual habla sido determinado por medio de una regresion lineal (y=-0,37x + 1,12; R =-,99687).

El intervalo de prediccion superior al 95% puede describirse mediante un polinomio de segundo orden (Y =A + B1x + B2x2) con la ecuacion y = 1, 15664-0,40253x + 0,01693x2. El intervalo inferior de prediccion al 95% puede escribirse 55 mediante un polinomio de segundo orden con la ecuacion y = 1,08494 - 0,34598 x + 0,01693 x2.

Para efectos de simpleza, en este caso el intervalo superior de prediccion al 95% puede describirse aproximadamente bien mediante una regresion lineal (Y = A+ B ' X) con la ecuacion y = -0,3729 x + 1,145. Para el intervalo inferior de

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prediccion al 95%, una regresion lineal proporciona la ecuacion y = -0,3756 x + 1,096. Los coeficientes de correlacion R de ambas regresiones lineales son de -0,99993.

Es decisivo que los valores que se encuentran por encima o por debajo de los intervalos de referencia correspondientes indiquen determinaciones erroneas. Esto se muestra claramente en la realization descrita manera de ejemplo con las muestras que tienen factor de interferencia (por ejemplo, glicina de 0,1 M). Se reconocen las determinaciones erroneas de 22,75 o 75,68 pg/mL de BSA en lugar de 0 y 40 pg/ml de BSA (vease tabla 1).

Si se selecciona el intervalo de referencia antes mencionado, por ejemplo con una absorcion de 0,72 a 594 nm de la muestra sin BSA y glicina de 0,1 M, con el algoritmo de referencia con base en la regresion lineal, la absorcion a 440 nm debe encontrarse entre

y = -0,3729 * 0,72 + 1, 145 = 0,877

y

y = -0,3756 * 0,72 + 1,096 = 0,826

Sin embargo, este no es el caso con un valor de absorcion a 440 nm de 0,7.

Tambien es concebible que se usen otros algoritmos. Por ejemplo, las desviaciones estandar sencillas, dobles o triples de los calibradores individuales del estandar de la serie de calibration pueden usarse para establecer un intervalo de referencia. El valor correspondiente se adiciona al valor medio o se sustrae del mismo. La dependencia de la absorcion, por ejemplo 594 nm, o de un parametro correspondiente de los valores por encima de los valores medios y de los valores por debajo de los valores medios, se describe por medio de una funcion, por ejemplo una regresion polinomica o una lineal. Esta funcion proporciona luego las referencias superiores y las referencias inferiores o los valores llmite.

Fig. 4: relation entre absorcion a 440 nm (longitud de onda de referencia) y cociente abs [595/470] (proportion inicial de dos longitudes de onda de medicion) en ausencia o presencia del material de interferencia glicina.

Fig. 5 muestra resultados similares a los de la Fig. 4, aunque para la preparation de la curva de calibracion aqul, la absorcion a 440 nm (longitud de onda de referencia) fue graficada frente al cociente abs [595/470] (proporcion inicial de dos longitudes de onda de medicion). Las muestras que contienen material de interferencia (glicina de 0,1 M) (clrculo, tambien se encuentran por fuera de los intervalos de confianza y de esta manera se identifican correctamente como erroneas.

Fig. 6: dependencia de la absorcion a una longitud de onda isosbestica de 530 nm de la concentration de BSA e influencia de diferentes concentraciones de Triton X-100

Las concentraciones de Triton X-100 fueron de 0 % (▲), 0,02 % (*), 0,05 % (O) y 0,1 % (◊). Se uso azul brillante de Coomassie (CBB) que contenla 0,008 % de Triton X-100. No se encontro Triton X-100 en las muestras cuyos resultados de medicion se representan con triangulos. Las barras de error ilustran la desviacion estandar simple de una determination triple. Se realizo una regresion lineal y se determino un intervalo de prediccion de 95%. Esto significa que el 95% de los valores a esperarse se encuentran dentro de este intervalo de prediccion. 530 nm, tal como puede reconocerse en la Fig. 1, es una longitud de onda isosbestica para azul brillante de Coomassie (CBB), es decir una longitud de onda a la cual la absorcion de CBB frente a la luz incidente no cambia dependiendo de la protelna enlazada. Es decir que de manera diferente que a 440 nm, por ejemplo, a 530 nm en muestras que ademas de CBB contienen solamente diferentes concentraciones de BSA, no se obtiene un cambio de absorcion dependiente de concentracion, sino siempre una absorcion mas o menos constante que esta orientada de manera predominante a la concentracion del colorante indicador CBB y en el presente ejemplo se encuentra a aproximadamente 0,675. Las muestras que estan contaminadas con materiales de interferencia, tales como Triton X-100, tienen, a igual concentracion de CBB, una desviacion de este valor, que en el presente caso se encuentran por encima de la desviacion minima determinada por el intervalo de prediccion de 95% y por lo tanto se evalua como indicio de que la determinacion optica esta distorsionada por defectos de medicion.

La ensenanza de la invention puede implementarse entonces de tal manera, tal como puede reconocerse en lo expresado previamente, tanto

a) con un valor de referencia (especlficamente cuando este fue medido a una concentracion dada del colorante indicador a una longitud de onda isosbestica), como tambien

b) con una curva de referencia (especlficamente cuando esta fue medida a una concentracion dada de colorante indicador a una longitud de onda no isosbestica).

La election de si la medicion se realiza a una longitud de onda isosbestico o una longitud de onda no isosbestica depende, entre otras cosas, de las longitudes de onda de medicion disponibles en el respectivo dispositivo de medicion.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la determinacion optica de al menos un analito en una muestra, y en el dicho procedimiento se usa al menos un colorante indicador el cual cambia al menos una propiedad optica al menos una longitud dada de onda de luz ("longitud de onda de medicion") dependiendo de la concentration de un analito dado, en el cual

a) se determina al menos una propiedad optica de la muestra a al menos una longitud de onda de medicion,

b) se determina al menos una propiedad optica de la muestra adicionalmente al menos otra longitud de onda de luz ("longitud de onda de referenda"), y

c) a partir de ambos valores de medicion determinados en los pasos a) y b) se determina un valor aritmeticamente calculado,

y

d) el valor calculado aritmeticamente en el paso c) se compara con una curva de referencia que ha sido determinada por medio de valores de medicion ("valores de medicion de calibration"), los cuales han sido determinados en la medicion de al menos una propiedad optica de las muestras de referencia a la longitud de onda de medicion, al menos una, y a la longitud de onda de referencia, al menos una, en cuyo caso las muestras de referencia contienen al igual que la muestra al menos un colorante indicador y concentraciones conocidas del analito,

e) y se evalua una desviacion minima del valor calculado aritmeticamente en el paso c) de la curva de referencia como indicio de que la determinacion optica del analito, al menos uno, esta distorsionado por defectos de medicion.
2. Procedimiento para la determinacion optica de al menos un analito en una muestra, y en dicho procedimiento se usa al menos un colorante indicador que cambia al menos una propiedad optica al menos una longitud dada de onda de luz ("longitud de onda de medicion") dependiendo de la concentracion de un analito dado, en el cual

a) se determina al menos una propiedad optica de la muestra a al menos una longitud de onda de medicion,

b) se determina al menos una propiedad optica de la muestra adicionalmente a al menos otra longitud de onda de luz ("longitud de onda de referencia"), que es una longitud de onda isosbestica con respecto al colorante indicador, y

el valor de medicion obtenido en el paso b) mediante determinacion de la propiedad optica, al menos una, de la muestra a la longitud de onda de referencia se compara con un valor de referencia que habla sido determinada por medio de valores de medicion ("valores de medicion de calibracion"), que hablan sido determinados en la medicion de al menos una propiedad optica de las muestras de referencia a la longitud de onda de medicion, al menos una, y a la longitud de onda de referencia, al menos una, en cuyo caso las muestras de referencia contienen, igualmente que la muestra, al menos un colorante indicador as! como concentraciones conocidas del analito,

y una desviacion minima del valor de medicion, obtenido en el paso b) mediante determinacion de la propiedad optica, al menos una, de la muestra a la longitud de onda de referencia, del valor de referencia se evalua como indicio de que la determinacion optica del analito, al menos uno, se ha distorsionado por defectos de medicion.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, en el cual durante la determinacion optica se determina la concentracion de al menos un analito en la muestra.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el analito es al menos una biomolecula preferiblemente seleccionada del grupo que contiene proteinas, peptidos, aminoacidos, poli-, oligo- o mono sacaridos, acidos poli-, oligo- o mononucleicos, o lipidos.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual las propiedades opticas que van a determinarse para el colorante indicador y/o la muestra son absorcion y/o extincion.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el colorante indicador es un colorante seleccionado del grupo que contiene

azul brillante de Coomassie (CBB)

DIDNTB

HABA

verde de bromocresol (BCG) purpura de bromocresol (BCP) azul de bromofenol (BPB) azul de tetrabromofenol (TBPB), y/o sulfoneftaleina de pirogalol.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el defecto de medicion es causado por al menos un material de interferencia.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el cual la longitud de onda de referenda con respecto al colorante indicador es una longitud de onda a la cual el colorante indicador no es un maximo de absorcion ni un mlnimo de absorcion.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el cual la curva de referencia habla sido obtenida mediante

5 • inter- y/o extrapolation

• regresion lineal, y/o

• ajuste de curva por medio de un polinomio de segundo orden o de orden superior de los valores de medicion de calibration obtenidos de acuerdo con el paso d).
10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual la determination optica del 10 analito, al menos uno, y/o la medicion de las propiedades opticas de la muestra de referencia se realizan en un

recipiente seleccionado del grupo que contiene cubeta, placa de microtitulacion, tubo de ensayo, portaobjetos y chip de deteccion.