ES2344076T3 - Procedimiento para determinar la concentracion de hierro. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de medir la concentración de hierro en una muestra, que se caracteriza por poner en contacto el hierro contenido en la muestra con un indicador metalocrómico para hierro en presencia de 0,05 a 100 mM de ion de litio y determinar la concentración de hierro sobre la base del grado de coloración resultante.

Description

Procedimiento para determinar la concentración de hierro.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento de medir la concentración de hierro en una muestra mediante un procedimiento directo usando un indicador metalocrómico para hierro, en la que el procedimiento se lleva a cabo en presencia de ion litio.
Técnica anterior
La medición de la concentración de hierro en suero y plasma se ha utilizado para el diagnóstico de anemia, anemia ferropénica, cirrosis hepática, y es uno de los elementos importantes que se deben medio en el campo del diagnóstico clínico.
Como procedimiento de medición de la concentración de hierro habitualmente se ha empleado, por ejemplo, el análisis colorimétrico usando varios indicadores metalocrómicos tales como, por ejemplo, dipiridilo y o-fenantrolina. Desde los puntos de vista de sensibilidad, especificidad, solubilidad etc., más habitualmente se ha usado un indicador metalocrómico para el hierro tal como batofenantrolina, 2-nitroso-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol (nitroso-PSAP), sal disódica de 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina, tripiridil-triazina y ferrozina.
Dado que todos estos indicadores metalocrómicos sólo pueden reaccionar con hierro bivalente, es necesario usar un agente reductor con el fin de reducir el hierro trivalente cuando se usan dichos indicadores metalocrómicos. Como agentes reductores para hierro trivalente se conocen ácido L-ascórbico, ácido tioglicólico, clorhidrato de hidroxilamina, hidroquinona, hidrosulfito, sulfito sódico, sulfato de hidrazina y metabisultito (pirosulfito).
Todos los átomos de hierro en suero existen en forma unida a la transferrina, que es un tipo de serogloblulina. Por tanto, con el fin de medir la concentración total de hierro en suero, es necesario liberar el hierro de la transferrina y generar hierro libre antes de realizar la medición de la concentración de hierro. En cuanto a un procedimiento de liberación del hierro unido de la transferrina, se conocen, por ejemplo, el Procedimiento Estándar Internacional, en el que se ha incorporado un procedimiento de extracción proteica (Manual of Clinical Laboratory Method, ed. de Masamitsu Kanehara, rev. 32 ed., pág. 579, publicado el 20 de febrero de 2005 por Kanehara & Co., Ltd.) y el método modificado de Matsubara, que se ha destacado como dato básico durante el procedimiento para establecer el Procedimiento Estándar Internacional (Manual of Clinical Laboratory Method, ed. de Masamitsu Kanehara, rev. 32 ed., 1^{er} número, pág. 580-581, publicado el 20 de febrero de 2005 por Kanehara & Co., Ltd.). De acuerdo con estos procedimientos, después de extraer la proteína en una muestra en la que se va a medir la concentración de hierro, se añade a la muestra un indicador metalocrómico para medir la absorbancia y, por tanto, se puede medir la concentración total de hierro en una muestra.
Además, en los últimos años, asociado con el desarrollo de analizadores automáticos se está realizando actualmente de forma habitual una prueba clínica de laboratorio usando un analizador automático. El uso de dicho analizador automático es económico porque los volúmenes de la muestra y de la solución de reactivo para la medición pueden reducirse y tiene una ventaja en cuanto a la capacidad de procesar un gran número de muestras al mismo tiempo. En consecuencia, se desea que la medición de la concentración de hierro en suero también se realice usando un analizador automático. No obstante, dado que el Procedimiento Estándar Internacional y el método modificado de Matsubara requieren un tratamiento de extracción proteica antes de realizar la medición de hierro, existe el problema de que es difícil aplicar estos procedimientos a la medición usando un analizador automático.
Por otro lado, existe un procedimiento de medir la concentración de hierro denominado "procedimiento colorimétrico directo" (en lo sucesivo denominado "p directo"), en el que la medición de la concentración de hierro se realiza añadiendo un agente reductor y un indicador metalocrómico directamente a una muestra (por ejemplo, la referencia 1 que no es una patente: Manual of Clinical Laboratory Method, ed. de Masamitsu Kanehara, rev. 32 ed., 1er número, p. 579, publicado el 20 de febrero de 2005 por Kanehara & Co., Ltd.). Dado que, al contrario que el Procedimiento Estándar Internacional descrito en lo que antecede, este procedimiento no requiere el tratamiento de extracción de proteínas, se puede aplicar al sistema usando un analizador automático. Por tanto, en el campo de los análisis clínicos de laboratorio, se ha extendido el uso del método directo de medir la concentración de hierro usando un analizador automático
No obstante, sigue existiendo el problema de que el valor medido obtenido mediante el método directo usando un analizador automático es menor en comparación con el obtenido por el Procedimiento Estándar Internacional. En el Procedimiento Estándar Internacional, en una muestra se puede liberar el hierro de la transferrina completamente (100%) porque la muestra se somete al tratamiento de extracción de proteína, mientras que el hierro no se puede liberar completamente de la transferrina en el método directo usando un analizador automático, y se ha notificado que el porcentaje de hierro liberado (grado de liberación) está en un intervalo de aproximadamente 93 a 95% (51 Congreso Plenario de la Sociedad Japonesa de Medicina de Laboratorio, presentación Nº 0-76, 2004) y esto se ha considerado una de las causas que dan lugar a un problema como el descrito en lo que antecede.
Por tanto, en la situación actual, se ha deseado el establecimiento de un procedimiento para medir la concentración de hierro que pueda proporcionar el mismo nivel de valor medido que el obtenido mediante el Procedimiento Estándar Internacional y que se pueda aplicar al sistema de analizador automático.
Documento 1 que no es una patente: Manual of Clinical Laboratory Method, ed. de Masamitsu Kanehara, rev. 32 ed., 1er número, pág. 579, publicado el 20 de febrero de 2005 por Kanehara & Co., Ltd.
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Divulgación de la invención Problemas que ha de resolver la invención
La presente invención se ha realizado a la luz de la situación anterior y tiene un objeto de proporcionar un procedimiento para medir la concentración directa mediante un método directo, que pueda proporcionar un valor medido equivalente al obtenido mediante el Procedimiento Estándar Internacional, y un reactivo y un kit para usar en el procedimiento.
Medios para resolver problemas
La presente invención se ha realizado para alcanzar el objeto descrito en lo que antecede y comprende los aspectos siguientes:
(1)
Un procedimiento de medir la concentración de hierro en una muestra, que se caracteriza por poner en contacto el hierro contenido en la muestra con un indicador metalocrómico para hierro en presencia de 0,05 a 100 mM de ion de litio y determinar la concentración de hierro sobre la base del grado de coloración resultante.
(2)
Un kit para medir la concentración de hierro, que comprende una primera solución de reactivo que contiene un agente reductor y una segunda solución de reactivo que contiene un indicador metalocrómico para hierro, y el ion litio está contenido en al menos una de la primera solución de reactivo o la segunda solución de reactivo, en la que la concentración del ion litio en una solución de reacción para medir la concentración de hierro es 0,05 a 100 mM.
Es decir, los presentes autores han estudiado de forma intensiva un modo para resolver el problema descrito en lo que antecede y han encontrado que al realizar la medición de la concentración de hierro mediante el método directo en presencia de ion litio se estimula la liberación de hierro de la transferrina y la reacción del hierro con un indicador metalocrómico para hierro procede estequiométricamente y, por tanto, se consigue la presente invención.
Hasta ahora, como indicador metalocrómico para el hierro habitualmente se han usado sales de sodio, tales como batofenantrolinasulfonato de sodio, sal de 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina disódica, pero un efecto tal como el proporcionado por la presente invención no se ha obtenido con estas sales de sodio. Asimismo, no se ha encontrado ningún ejemplo práctico que use una sal de litio como sal de estos indicadores metalocrómicos para hierro. Por tanto, fue un hallazgo inesperado el hecho de que se pueda obtener un efecto como el descrito en lo que antecede cuando está presente un ion derivado de litio que pertenece al mismo elemento metal alcalino que el sodio. El documento WO 01/81930 trata de un procedimiento para medir el hierro sérico (es decir, hierro unido a transferrina). En general se describen tampones alcalinos junto con la determinación de hierro en muestras de plasma que contienen de forma secundaria Li unido a heparina, pero este documento no menciona efectos especiales del Li en la determinación de hierro o un intervalo de concentraciones específico.
El documento US-A-4588695 proporciona de forma similar una solución tampón para acortar el tiempo de formación de color en el método de Schade, mediante, por ejemplo, el uso de un hidroxiácido. El litio se menciona simplemente como contraion para ciertos componentes.
El documento JP03-056425-B2 presenta N-heterociclos, bifenilos y tiourea para la estabilización de la hemoglobina y la reducción del margen de error en las mediciones de hierro en suero. El litio se menciona como contraion en soluciones tampón, pero no hay referencia a efectos específicos resultantes del mismo o del uso en el intervalo de concentraciones especificadas en el mismo.
Efectos de la invención
Al realizar el procedimiento de medición de la concentración de hierro de la presente invención se resuelve el problema convencional de que el valor medido es menor en comparación con el obtenido mediante el Procedimiento Internacional Estándar; no se requieren procedimientos complicados, tales como el tratamiento de extracción de proteínas; se permite la medición de la concentración de hierro con un analizador automático; y se posibilita una medición más precisa, dado que el valor medido obtenido mediante el presente procedimiento está muy cerca del obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional.
Mejor modo para realizar la invención
El procedimiento de medir la concentración de hierro de acuerdo con la presente invención es un "procedimiento de medir la concentración de hierro en una muestra, que se caracteriza por poner en contacto el hierro contenido en la muestra con un indicador metalocrómico para hierro en presencia de ion litio y determinar la concentración de hierro sobre la base del grado de coloración resultante".
El indicador metalocrómico para hierro que se va a usar en la presente invención puede ser un indicador metalocrómico para hierro bivalente, que tiene una absorción específica al unirse al hierro. Por ejemplo, pueden usarse
per se los indicadores metalocrómicos para hierro usados en el método directo de medición de la concentración de hierro bien conocidos.
Ejemplos específicos del indicador metalocrómico para hierro incluyen, por ejemplo, ácido batofenantrolinasulfónico o sus sales, 2-nitroso-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol y 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina o sales de la misma.
Las sales del ácido batofenantrolinasulfónico o de 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina incluyen, por ejemplo, sales con un metal alcalino, tal como sodio, potasio y litio.
Una cantidad del indicador metalocrómico para hierro de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitada y puede medirse dependiendo de las propiedades del indicador metalocrómico para hierro.
Por ejemplo, cuando se usa ácido batofenantrolinasulfónico o una sal del mismo, su concentración en la solución de reactivo está en un intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 mM, preferentemente de aproximadamente 1 a 2 mM, y una concentración final en la solución de reacción está en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 1 mM, preferentemente de aproximadamente 0,2 a 0,5 mM.
Cuando se usa 2-nitroso-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol, la concentración del mismo en la solución reactiva está en un intervalo de aproximadamente 0,2 a 1 mM, preferentemente de aproximadamente 0,3 a 0,6 mM, y una concentración final en la solución de reacción está en un intervalo de aproximadamente 0,06 a 0,4 mM, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,2 mM.
Cuando se usa 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina o una sal de la misma, la concentración en la solución reactiva está en un intervalo de aproximadamente 1 a 5 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 1 a 3 mg/ml, y una concentración final en la solución de reacción está en un intervalo de aproximadamente 0,2 a 1 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,3 a 0,7 mg/ml.
La concentración del ion litio de acuerdo con la presente invención en la solución de reacción no está particularmente limitada y la cantidad de la misma puede también determinarse en función del tipo del indicador metalocrómico para hierro que se va a usar en el mismo sistema de medición. No obstante, la concentración en la solución de reactivo está, como ion litio, en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 100 mM, preferentemente de aproximadamente 1 a
100 mM, y una concentración final en la solución de reacción está en un intervalo de aproximadamente 0,05 a
100 mM, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 100 mM.
Dado que el procedimiento de medición de acuerdo con la presente invención usa un indicador metalocrómico para hierro bivalente, el hierro trivalente que se une a la transferrina en la muestra debe liberarse de la transferrina y reducirse a hierro bivalente. Como agente reductor para hierro trivalente que se va a usar para este propósito se puede usar cualquier tipo de agente reductor usado normalmente en este campo, incluido ácido ascórbico, glutatión, pirosulfito sódico, ácido tioglicólico, clorhidrato de hidroxilamina y compuestos de tiol. Entre ellos, habitualmente se usa ácido ascórbico.
La cantidad del agente reductor no se puede especificar de forma categórica, porque varía en función del tipo de agente reductor y del indicador metalocrómico para hierro que se va a usar, el pH en uso y, también, la cantidad necesaria del mismo aumenta con el incremento del pH, pero puede seleccionarse del intervalo que normalmente se usa en este campo. La concentración del agente reductor en la solución de reactivo está en un intervalo de aproximadamente 0,0006 a 400 mM, preferentemente de aproximadamente 1 a 150 mM, y una concentración final en la solución de reacción está en un intervalo de aproximadamente 0,0005 a 300 mM, preferentemente de aproximadamente 10 a
100 mM.
Para realizar el procedimiento de medir la concentración de hierro de la presente invención, el procedimiento se puede llevar a cabo de acuerdo con las condiciones de medición (por ejemplo, tiempo de reacción, medición de la longitud de onda etc.) y el procedimiento de realizar el procedimiento directo bien conocido por sí mismo normalmente realizado en el campo de las pruebas de laboratorio clínico, a excepción de que la medición se lleva a cabo usando un indicador metalocrómico para hierro mediante el procedimiento directo bien conocido por sí mimo en presencia de ion litio.
Cuando el procedimiento de medición de la concentración de hierro se realiza mediante el método directo, el procedimiento de de hacer presente al ion litio no está particularmente limitado siempre que se puede obtener finalmente una solución que contiene una muestra, un agente reductor, ion litio y un indicador metalocrómico. No obstante, es preferible añadir el ion litio después de que se trate la muestra con un agente reductor o simultáneamente junto con un agente reductor a la muestra. Además, el indicador metalocrómico para hierro se añade, preferentemente, tras la adición del ion litio o simultáneamente junto con el ion litio, pero no se limita a ello. No obstante, a este respecto, es indeseable añadir a la muestra el indicador metalocrómico para hierro antes de añadir el ion litio.
Además, en cuando al procedimiento de hacer que el ion litio esté presente en el sistema de medición del procedimiento directo, el uso de ion litio en forma de una sal del mismo es normalmente el modo más sencillo pero no está particularmente limitado al mismo. El tipo de sal a usar en este procedimiento no está particularmente limitado, siempre que la sal no inhiba la estabilidad del reactivo presente en la solución o no inhiba el desarrollo del color del indicador metalocrómico para hierro e incluye, por ejemplo, sales con ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico y ácido nítrico; sales con átomo de halógeno (haluros) tales como cloro, bromo y yodo; sales con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido propiónico y ácido pantoténico; y sales con el indicador metalocrómico para hierro descrito en lo que antecede.
Cuando se realiza el procedimiento de medir la concentración de hierro mediante el método directo, el procedimiento específico de hacer presente el ion litio incluye, por ejemplo, los procedimientos siguientes:
(1)
Un procedimiento, en el que una solución de un agente reductor, una solución que contiene ion litio y una solución de un indicador metalocrómico para hierro se preparan con antelación y estas soluciones se añaden a la muestra en el orden de la solución de un agente reductor, la solución que contiene el ion litio y, después, la solución de un indicador metalocrómico para hierro;
(2)
Un procedimiento en el que se preparan una solución que contiene un agente reductor e ion litio y una solución de un indicador metalocrómico para hierro, y, después, estas soluciones se añaden a la muestra en el orden de la solución que contiene un agente reductor e ion litio y, después, la solución de un indicador metalocrómico para hierro;
(3)
Un procedimiento en el que se preparan una solución de un agente reductor y una solución que contiene ion litio y un indicador metalocrómico para hierro, y, después, estas soluciones se añaden a la muestra en el orden de la solución de un agente reductor y la solución que contiene el ion litio y un indicador metalocrómico para hierro; y
(4)
Un procedimiento en el que se prepara una solución que contiene un agente reductor, ion litio y un indicador metalocrómico para hierro y, después, la solución se añade a la muestra, lo que permite que estos componentes reaccionen al mismo tiempo.
Entre los procedimientos descritos en lo que antecede, en vista de la eficiencia operativa el procedimiento (2) es habitual y preferible.
Asimismo, productos comerciales para medir la concentración de hierro usando un indicador metalocrómico para hierro, que normalmente se usa en la prueba de laboratorio clínico, se pueden usar mediante la adición de ion litio a uno cualquiera de los reactivos constituyentes del producto comercial de modo que se produzca la condición descrita en lo que antecede.
En cuanto a la solución para disolver un indicador metalocrómico para hierro, ion litio y un agente reductor, dado que, deseablemente, la medición de la concentración de hierro se lleva a cabo al intervalo de pH óptimo para el indicador metalocrómico para hierro, es preferible una solución tampón.
El intervalo de pH preferible en la medición de acuerdo con el procedimiento de medición de la presente invención es el pH de 1 a 7, más preferentemente el pH de 2 a 6. Como agente tampón componente de la solución tampón que se va a usar para ajustar el valor de pH dentro del intervalo descrito en lo que antecede, se puede usar cualquier agente tampón de uso normal en este campo. Específicamente, incluye, por ejemplo, glicina, ácido acético, ácido cítrico y ácido tartárico.
Adicionalmente, además de estos reactivos, no hace falta mencionar que pueden estar presentes un agente de superficie activa, varios tipos de agentes antisépticos, un estabilizante, un agente de activación, un agente para evitar el efecto secundario de las sustancias coexistentes y de las sustancias normalmente usadas para los diagnósticos clínicos. Aunque el intervalo de la concentración etc. de estos reactivos se puede seleccionar según sea adecuado a partir del intervalo de la concentración, etc. usado normalmente en el procedimiento de medición bien conocido por sí mismo, es deseable seleccionar el intervalo que proporcione estabilidad elevada y que no inhiba el desarrollo del color del indicador metalocrómico para hierro en el intervalo de pH óptimo del indicador metalocrómico para hierro que se va a usar en el procedimiento de medición de la concentración de hierro en la presente invención.
En cuanto al agente de superficie activa que se va a usar para el procedimiento de medición de acuerdo con la presente invención, se puede usar cualquier agente de superficie activa no iónico, agente de superficie activa catiónico, agente de superficie activa aniónico o agente de superficie activa anfotérico, siempre que no inhiba el desarrollo del color del indicador metalocrómico para hierro. El agente de superficie activa se puede usar seleccionando según sea adecuado en función de las propiedades de desarrollo del color del indicador metalocrómico para hierro que se va a usar.
Por ejemplo, la concentración del agente de superficie activa descrito en lo que antecede puede seleccionarse según sea adecuado del intervalo usado habitualmente en este campo. Normalmente, la concentración en la solución de reactivo es de aproximadamente 0,0001 a 10% (p/v), preferentemente de aproximadamente 0,001 a 5% (p/v) y, normalmente, una concentración final en la solución de reacción es de aproximadamente 0,001 a 10% (p/v) y, preferentemente, de aproximadamente 0,01 a 5% (p/v).
Después de permitir que el indicador metalocrómico para hierro y el ion litio reaccionen con la muestra, la medición del desarrollo de color producido mediante la acción del indicador metalocrómico para hierro se puede llevar a cabo de acuerdo con el método directo bien conocido por sí mismo. En cuanto a los otros reactivos, un analizador automático, un espectrofotómetro para usar en la medición, se puede usar uno cualquier normalmente usado en este campo sin excepciones. Además, no hace falta mencionar que el cambio de la absorbancia se puede medir por medio de fotometría de longitud de onda dual empleando una longitud de onda principal y una sublongitud de onda.
A este respecto, la longitud de onda para la medición de la absorbancia se puede seleccionar según sea adecuado en función del tipo de indicador metalocrómico para hierro que se va a usar. Cuando como indicador metalocrómico para hierro se usa ácido batofenantrolinasulfónico o una sal del mismo y la medición se realiza usando dos longitudes de onda , la medición se lleva a cabo, preferentemente, a aproximadamente 540 nm para la longitud de onda principal y a aproximadamente 600 nm para la sublongitud de onda.
La muestra que se va a usar en el procedimiento de la presente invención incluye, por ejemplo, componentes de la sangre tales como suero y plasma.
El procedimiento de medir la concentración de hierro de la presente invención se explicará específicamente de acuerdo con el procedimiento descrito en lo que antecede (2) (un procedimiento en el que se preparan una solución que contienen un agente reductor e ion litio y una solución de un indicador metalocrómico para hierro y, después, estas soluciones se añaden a la muestra en el orden de la solución que contiene un agente reductor e ion litio y, después, la solución de un indicador metalocrómico para hierro) como ejemplo, del siguiente modo.
En primer lugar, una muestra en la que se va a medir la concentración de hierro, tal como sangre, suero y plasma, se mezcla con una primera solución de reactivo (pH 2-6) que contiene un agente reductor, ion litio, un agente tampón y, si es necesario, un agente de superficie activo, y se deja reaccionar, generalmente, de 10 a 50ºC, preferentemente a 20 a 40ºC, durante, generalmente, de 2 a 10 minutos, preferentemente durante aproximadamente 5 minutos. Después, la solución de reacción obtenida se mezcla con una segunda solución de reactivo (pH 2-10) que contiene un indicador metalocrómico para hierro, un agente tampón y, en caso necesario, un agente tampón, un agente antiséptico, un agente de superficie activa, y se deja reaccionar a, generalmente, de 10 a 50ºC, preferentemente a de 20 a 40ºC, durante, generalmente, de 2 a 15 minutos, preferentemente durante aproximadamente 10 minutos. El color desarrollado mediante la acción del indicador metalocrómico para hierro se mide en forma de una absorbancia. La concentración de hierro en la muestra se determina mediante la aplicación del valor medido a la curva de calibración, que muestra la relación entre la concentración de hierro y la absorbancia, que previamente se obtiene mediante la realización de la misma medición usando soluciones patrón de hierro con concentraciones conocidas.
Es obvio que la medición de la concentración de hierro como se ha descrito en lo que antecede puede llevarse a cabo por medios manuales y no hace falta mencionar que la medición también se puede realizar usando un analizador automático, ya que el procedimiento de la presente invención se puede aplicar al sistema de medición que usa un analizador automático. A este respecto, la combinación de los reactivos en la medición por medios manuales o usando un analizador automático no está particularmente limitada y puede seleccionarse de acuerdo con las circunstancias, otros factores, del analizador automático que se va a aplicar.
El kit para medir la concentración de hierro de la presente invención puede ser uno cualquiera que comprenda un reactivo que contiene un indicador metalocrómico para hierro e ion litio como reactivo constituyente. Una forma de realización preferible, un ejemplo específico, la concentración en uso de cada componente son como se ha descrito en lo que antecede.
Además, en cada reactivo del kit, por ejemplo un agente tampón, un agente antiséptico, un agente de superficie activa, un estabilizante normalmente usado en este campo, puede estar contenido dentro de los intervalos normalmente usados en este campo. Además, el kit puede contener, en caso necesario, una solución patrón de hierro en combinación.
Además, cuando el kit está compuesto por una pluralidad de soluciones de reactivo, los reactivos necesarios para la medición del analito tienen que estar contenidos en cada solución de reactivo, pero estos reactivos pueden estar distribuidos adecuadamente en una cualquiera de las soluciones de reactivo de modo que la reacción para la medición del analito se inicia cuando cada solución de reactivo se mezclan juntas. Las concentraciones en uso de los reactivos que constituyen estas soluciones de reactivo pueden seleccionarse según sea adecuado a partir de los intervalos usados normalmente en este campo.
\newpage
La forma de realización específica del kit de la presente invención incluye, por ejemplo, las composiciones siguientes:
(1)
Una que comprende una solución de reactivo como reactivo constituyente que contiene un agente reductor, ion litio y un indicador metalocrómico para hierro, y el ion litio está contenido en al menos una de la primera solución de reactivo o la segunda solución de reactivo.
(2)
Una que comprende una solución de reactivo como reactivo constituyente que contiene un agente reductor, ion litio y un indicador metalocrómico para hierro.
En lo sucesivo en la presente memoria, la presente invención se explicará adicionalmente con detalle haciendo referencia a los ejemplos y ejemplos comparativos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo de referencia 1
Las concentraciones de hierro en las mismas muestras de suero 1 a 5 se midieron mediante el Procedimiento Estándar Internacional, el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional (en el Procedimiento Estándar Internacional, el volumen de la muestra se pierde debido al tratamiento de extracción de proteínas. En este procedimiento, para el propósito de su corrección, las mediciones se llevan a cabo usando las muestras añadidas con 3 concentraciones diferentes de hierro y la concentración de hierro en la muestra se obtiene a partir del punto de intersección en el eje X de la fórmula de regresión) y el procedimiento directo convencional usando un analizador automático, y el valor medido para cada muestra se comparó entre sí.
(1) Procedimiento Estándar Internacional
De acuerdo con el procedimiento descrito en el Manual of Clinical Laboratory Method, ed. de Masamitsu Kanehara, rev. 32 ed., 1^{er} número, pág. 580, publicado el 20 de febrero de 2005 por Kanehara & Co., Ltd., la medición se llevó a cabo del siguiente modo.
Preparación de reactivos
\bullet
Reactivo para extracción de proteínas: 98 g de ácido tricloroacético (de grado especial) se disolvieron en 600 ml de agua, después, a la solución se añadieron 30 ml de ácido tioglicólico y 83 ml de ácido clorhídrico (de grado especial) y se mezclaron. Posteriormente, la solución se llevó hasta 1000 ml con agua y se almacenó en un frasco de color marrón.
\bullet
Reactivo de color: 250 mg de ácido batofenantrolinasulfónico (reactivo Dotite) se añadieron a 1000 ml de solución acuosa 1,5M de acetato de sodio (de grado especial) para su disolución en ella.
\bullet
Solución patrón de hierro (200 \mug/dl): 1 ml de la solución patrón de hierro (Fe 1000) (producida por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) se diluyó hasta 100 ml con agua (1 mg/dl). Esta solución se diluyó después por cinco con agua para usar.
Medición de la concentración de hierro en suero
1)
Se tomaron dos ml de cada muestra de suero 1 a 5 e introdujeron en un contenedor y al mismo se añadieron 2 ml del reactivo de extracción de proteínas y se mezclaron suficientemente usando un mezclador.
Después, la mezcla se calentó a 56ºC durante 15 minutos y después se mezcló de nuevo y se centrifugó.
2)
Se obtuvieron 2,0 ml de sobrenadante y al mismo se añadieron 2,0 ml del reactivo de color y se dejaron durante 10 minutos.
3)
Para el agua (para la prueba blanco) y la solución patrón de hierro se llevaron a cabo los mismos procedimientos que se han indicado en lo que antecede 1) y 2) para la muestra de suero (a excepción de que no se realizó centrifugación).
4)
Se midió la absorbancia a 535 nm para cada una de las muestras de suero, la solución patrón de hierro y la muestra para la prueba blanco, usando agua como control, y los valores medidos se expresaron como E_{a}, E_{s} y E_{b}, respectivamente. Las concentraciones de hierro en suero en cada muestra se midieron mediante la ecuación siguiente:
Concentración de hierro en suero= 200 x (E_{a}-E_{b})/(E_{s}-E_{b}) \mug/dl
Los resultados se muestran en la tabla 1.
(2) Procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional
En el Procedimiento Estándar Internacional, el volumen de la muestra se pierde debido al tratamiento de extracción de proteínas. En este procedimiento, para el propósito de su corrección, se llevan a cabo mediciones usando muestras añadidas con 3 concentraciones diferentes de hierro y la concentración de hierro en la muestra se obtiene a partir del punto de intersección en el eje X de la fórmula de regresión.
Preparación de soluciones de reactivos y muestras
Se tomaron dos ml de cada una de las muestras de suero 1 a 5 iguales a las usadas en el Procedimiento Estándar Internacional e introdujeron en 4 contenedores, a tres de los cuales se añadió la solución patrón de hierro de modo que la concentración de hierro se convierte en 50 \mug/dl, 100 \mug/dl y 150 \mug/dl, respectivamente. Estas tres muestras y otra muestra, a la que no se añadió la solución patrón de hierro, se usaron como las soluciones de la muestra.
Los reactivos usados fueron los mismos que se usaron en el Procedimiento Estándar Internacional descrito en lo que antecede (1).
Medición de la concentración de hierro en suero
La medición de la absorbancia se llevó a cabo para las soluciones de muestra preparadas como se ha descrito en lo que antecede mediante los mismos procedimientos que los usados en el Procedimiento Estándar Internacional descrito en lo que antecede (1).
Se preparó un gráfico que muestra la relación entre la absorbancia y la concentración de hierro obtenida y la concentración de hierro en la muestra se midió a partir de la distancia entre el punto de intersección en el eje X de la fórmula de regresión y el punto original.
Los resultados se muestran juntos en la tabla 1.
(3) Procedimiento de medición mediante el procedimiento directo convencional usando un analizador automático
Las concentraciones de hierro en las muestras de suero 1 a 5 se midieron usando los kit comercialmente disponibles para medir la concentración de hierro mediante el procedimiento directo (producido por Company A, B y C, y denominado kit A, kit B y kit C, respectivamente), en el que cada uno tiene la composición siguiente de acuerdo con los procedimientos estándar descritos en las instrucciones de cada kit y fijando cada parámetro de medición del siguiente modo.
Los resultados se muestran juntos en la tabla 1.
A este respecto, las mediciones se llevaron a cabo usando el Hitachi Autoanalyzer Model 7170S (producido por Hitachi, Ltd.), y la concentración de hierro se determine aplicando los valores de absorbancias a la curva de calibración que muestra la relación entre la concentración de hierro y la absorbancias, que previamente se obtuvo mediante la realización de las mismas mediciones usando las muestras con concentraciones conocidas en lugar de la muestra de suero.
Kit A
(R-1) Solución tampón: Tampón glicina 400 mM (pH 3,5) que contiene ácido ascórbico 40 mM y un agente de superficie activa.
(R-2) Reactivo de color: Tampón glicina 40 mM (pH 3,0) que contiene sulfonato de batofenantrolina sódica 1,86 mM y un agente de superficie activa.
Procedimiento de medición; final 2 puntos [16]-[34],
Volumen de la muestra; 12 \mul,
R-1; 160 \mul,
R-2; 40 \mul,
Medición de la longitud de onda; 600/546 nm,
Medición de la temperatura; 37ºC,
Concentración de la solución patrón de hierro; 200 \mug/dl.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Kit B
(R-1) Solución del agente reductor: una solución que contiene ácido L-ascórbico.
(R-2) Reactivo de color: Una solución que contiene 2-nitroso-5-(N-propil)-N-sulfopropilamino)-fenol 0,45 mM.
Procedimiento de medición; final 2 puntos [16]-[34],
Volumen de la muestra; 15 \mul,
R-1; 150 \mul,
R-2; 60 \mul,
Medición de la longitud de onda; 750/600 nm,
Medición de la temperatura; 37ºC,
Concentración de la solución patrón de hierro; 200 \mug/dl.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit C
(R-1) Solución tampón: composición desconocida.
(R-2) Reactivo de color: Una solución que contiene 2,47 mg/ml de sal 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazinadisódica y otras.
Procedimiento de medición; final 2 puntos [16]-[34],
Volumen de la muestra; 12 \mul,
R-1; 180 \mul,
R-2; 45 \mul,
Medición de la longitud de onda; 700/600 nm,
Medición de la temperatura; 37ºC,
Concentración de la solución patrón de hierro; 200 \mug/dl.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 que se expone a continuación. En la tabla 1, suponiendo que el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional es 100, los porcentajes de los valores medidos obtenidos mediante el Procedimiento Estándar Internacional o el procedimiento directo usando el kit A, B o C se muestran entre paréntesis bajo cada valor medio, respectivamente.
TABLA 1
1
Como queda claro a partir de la tabla 1, todos los valores medidos obtenidos mediante la medición sobre la base del procedimiento directo convencional son menores en comparación con los obtenidos mediante el Procedimiento Estándar Internacional y el procedimiento de adición estándar.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Preparación de soluciones de reactivo (R-1) Solución tampón
Tampón glicina 400 mM (ph 3,5) que contiene cloruro de litio, cloruro sódico, cloruro potásico o cloruro de cesio 10 mM (10 mM en forma de ion de metal alcalino), ácido ascórbico 40 mM y un agente de superficie activa.
(R-2) Solución de reactivo de color
Tampón glicina 40 mM (pH 3,0) que contiene sulfonato de batofenantrolina sódica 1,86 mM y un agente de superficie activa.
Medición de la concentración de hierro en suero
La medición se realizó en las muestras de suero 6 a 10 usando las soluciones de reactivo descritas en lo que antecede y el analizador Hitachi Autoanalyzer Model 7170S (producido por Hitachi, Ltd.).
Condiciones de medición
La concentración de hierro en cada muestra de suero se midió fijando los parámetros de medición del siguiente modo;
Procedimiento de medición; final 2 puntos [16]-[34],
Volumen de la muestra; 12 \mul,
R-1; 160 \mul,
R-2; 40 \mul,
Medición de la longitud de onda; 600/546 nm,
Medición de la temperatura; 37ºC,
Concentración de la solución patrón de hierro; 200 \mug/dl.
Las concentraciones de hierro se determinaron mediante la aplicación de los valores de absorbancia a la curva de calibración que muestra la relación entre la concentración de hierro y la absorbancia, que se obtuvo previamente mediante la realización de las mismas mediciones usando las muestras con una concentración conocida en lugar de la muestra de suero.
A este respecto, la concentración del ion de metal alcalino en la medición fue de aproximadamente 7,5 mM.
Resultados
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Como control, se llevó a cabo la medición mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional como se describe en el Ejemplo de Referencia 1 usando las mismas muestras de suero. Los resultados se muestran juntos en la tabla 2.
En la tabla 2, los porcentajes de los valores medios obtenidos mediante el procedimiento directo en presencia de varios iones de metal alcalino cuando el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional que se ha asumido que es de 100 se muestran entre paréntesis bajo cada valor medio, respectivamente,
Además, la diferencia entre "porcentaje (%) del valor medido obtenido mediante el procedimiento directo en presencia de varios iones de metal alcalino, cuando el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional se asume que es de 100" y el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional (100%) se mostró en conjunto como "la diferencia entre el de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional y el procedimiento de adición estándar" en la Tabla 2.
TABLA 2
2 
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Como queda claro a partir de la tabla 2, cuando el procedimiento directo se lleva a cabo en presencia de un ion de metal alcalino tal como sodio, potasio y cesio, los valores medidos fueron inferiores a los obtenidos mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional. Por el contrario, sólo cuando el mismo procedimiento directo se lleva a cabo en presencia del ion litio, los valores medidos estaban cercanos a los obtenidos mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional y se encontró que se podía alcanzar el objeto de la presente invención. Se supone que cuando los átomos de hierro se liberan de la transferrina, todos los hierros libres se pueden unir a un indicador metalocrómico para hierro para desarrollar el color únicamente en presencia del ion litio.
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Ejemplo 2
La medición de las concentraciones de hierro en las muestras de suero 11 a 15 se llevó a cabo mediante el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 1 usando los mismos reactivos preparados como en el ejemplo 1, a excepción de que se añadió cloruro de litio a la "(R-1) solución tampón" de modo que la concentración del mismo pasó a ser de 0,1 mM, 1 mM, 10 mM o 100 mM (una concentración final de ion litio en la medición fue de 0,075 mM, 0,75 mM, 7,5 mM o 75 mM, respectivamente).
Los resultados se muestran en la tabla 3.
Como control, se llevó a cabo la medición mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional como se describe en el Ejemplo de Referencia 1 usando las mismas muestras de suero. Los resultados se muestran juntos en la tabla 3.
En la tabla 3, los porcentajes de los valores medios obtenidos mediante el procedimiento directo en presencia de varias concentraciones de cloruro de litio cuando el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional que es de 100 se muestran entre paréntesis bajo cada valor medio, respectivamente,
TABLA 3
4 
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Como queda claro a partir de la tabla 3, la medición de la concentración de hierro se puede realizar con más exactitud mediante la presencia de ion litio. En particular, cuando la concentración de ion litio presente en la medición es de 0,075 mM o mayor, preferentemente dentro de un intervalo de 0,075 a 75 mM, no se observaron diferencias entre los valores medidos, y los valores medidos también concordaban bien con el valor obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional.
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Ejemplo 3
La medición de las concentraciones de hierro en las muestras de suero 16 a 20 se llevó a cabo mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo de Referencia 1, a excepción de que en "(3) Procedimiento de medición mediante el procedimiento directo convencional usando un analizador automático" en el Ejemplo de Referencia 1, la solución tampón o la solución del agente reductor de cada kit, en el que se añadió cloruro de litio de modo que la concentración de la misma pasó a ser de 10 mM (una concentración final de ion litio en la medición fue de 7,5 mM para los kit a y C, y 6,7 mM para el kit B) se usó como "(R-1) Solución tampón". Los resultados se muestran como "Añadidos" en la tabla 4.
Asimismo, la medición de las concentraciones de hierro en suero en la misma muestra de suero se llevó a cabo mediante "(3) Procedimiento de medición mediante procedimiento directo convencional usando un analizador automático" en el Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran juntos como "No añadidos" en la tabla 4.
Además, como control, se llevó a cabo la medición mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional como se describe en el Ejemplo de Referencia 1 usando las mismas muestras de suero. Los resultados se muestran juntos en la tabla 4.
A este respecto, en la tabla 4, los porcentajes de los valores medios obtenidos mediante el procedimiento directo en presencia o ausencia de cloruro de litio (ion litio) cuando el valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional que es de 100 se muestran entre paréntesis bajo cada valor medio, respectivamente, Además, los porcentajes de los valores medidos obtenidos en presencia de cloruro de litio usando los mismos kit cuando el valor medido obtenido en ausencia de cloruro de litio son 100 también se muestran juntos como "En relación con no añadidos" en la tabla 4.
TABLA 4
5 
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Como queda claro a partir de la tabla 4, aunque el grado del efecto varía en función del tipo de indicador metalocrómico para hierro, los valores medidos obtenidos mediante el procedimiento directo usando los kit para medir la concentración de hierro fueron mayores cuando la medición se llevó a cabo en presencia de cloruro de litio (ion litio) en comparación con los obtenidos mediante los mismos procedimientos en ausencia de cloruro de litio y, además, se acercaban al valor medido obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un procedimiento de medir la concentración de hierro mediante el procedimiento directo, que puede proporcionar un valor medido equivalente al Procedimiento Estándar Internacional y un kit que se va a usar en el procedimiento. Al realizar el procedimiento de medición de la concentración de hierro de la presente invención, se resuelve el problema convencional de que el valor medido es menor en comparación con el obtenido mediante el Procedimiento Internacional Estándar; no se requieren procedimientos complicados, tales como el tratamiento de extracción de proteínas; se permite la medición de la concentración de hierro con un analizador automático; y se posibilita una medición más precisa, dado que el valor medido obtenido mediante el presente procedimiento está muy cerca del obtenido mediante el procedimiento de adición estándar de acuerdo con el Procedimiento Estándar Internacional.

Claims (9)

1. Un procedimiento de medir la concentración de hierro en una muestra, que se caracteriza por poner en contacto el hierro contenido en la muestra con un indicador metalocrómico para hierro en presencia de 0,05 a 100 mM de ion de litio y determinar la concentración de hierro sobre la base del grado de coloración resultante.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el indicador metalocrómico para hierro es ácido batofenantrolinasulfónico o una sal del mismo, 2-nitroso-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol o 3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(ácido 5-furilsulfónico)]-1,2,4-triazina o una sal de los mismos.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ion litio deriva de una sal de litio.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el indicador metalocrómico para hierro es ácido batofenantrolinasulfónico o una sal del mismo.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que el hierro contenido en una muestra se reduce a ion bivalente mediante la presencia de un agente reductor.
6. Un kit para medir la concentración de hierro, que comprende una primera solución de reactivo que contiene un agente reductor y una segunda solución de reactivo que contiene un indicador metalocrómico para hierro, y el ion litio está contenido en al menos una de la primera solución de reactivo o la segunda solución de reactivo, en la que la concentración del ion litio en una solución de reacción para medir la concentración de hierro es de 0,05 a 100 mM.
7. El kit de la reivindicación 6, en el que dicho kit comprende una primera solución de reactivo que contiene un agente reductor e ion litio y una segunda solución de reactivo que contiene un indicador metalocrómico para hierro.
8. El kit de la reivindicación 6, en el que el indicador metalocrómico para hierro es ácido batofenantrolinasulfónico o una sal del mismo.
9. El kit de la reivindicación 6, en el que la concentración de ion litio en la primera solución de reactivo o la segunda solución de reactivo es 0,1-100 mM.
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