ES2624546T3 - Composiciones basadas en MVA y métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra la influenza - Google Patents

Abstract

Una composición adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T frente a un virus de la influenza en un vertebrado, comprendiendo dicha composición un vector viral que comprende ácidos nucleicos que codifican epítopos de proteínas internas del virus de la influenza, en donde dicho vector viral es un vector de MVA, en donde dicha composición comprende un ácido nucleico que codifica al menos dos de dichos epítopos, siendo al menos un epítopo de cada una de dos o más proteínas internas del virus de la influenza, en donde dichas proteínas internas comprenden nucleoproteína y proteína 1 de la matriz, en donde dichos epítopos se proporcionan en forma de una fusión de nucleoproteína - proteína 1 de la matriz, en donde dichas proteínas internas proceden del subtipo A/Panama/2007/99 de la cepa de la influenza H3N2, para su uso en el refuerzo de las respuestas de células T preexistentes contra la influenza.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones basadas en MVA y metodos para inducir una respuesta inmunitaria contra la influenza Campo de la invencion

La invencion se refiere a composiciones y metodos para inducir una respuesta inmunitaria contra la influenza, en particular una respuesta inmunitaria mediada por celulas T.

Antecedentes de la invencion

Las estrategias de vacunacion contra la influenza han sido relativamente constantes durante al menos aproximadamente 20 anos. Tfpicamente, cada vacuna comprende partmulas de virus de la gripe inactivadas de aproximadamente tres cepas diferentes. Estas vacunas se administran para inducir respuestas basadas en anticuerpos. Cada ano, la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) selecciona las cepas que considera que representan la mayor amenaza para la salud humana en ese momento. Normalmente se presentan dos decisiones por ano, una para cepas del hemisferio norte y una para cepas del hemisferio sur. Despues del anuncio, los fabricantes tienen un penodo corto de tiempo para elaborar las formulaciones de la vacuna de ese ano. Esta estrategia conduce a una serie de problemas.

En primer lugar, debido a la corta ventana de fabricacion, pueden surgir complicaciones en la produccion. Se pueden producir retrasos en el sistema, por ejemplo cuando las cepas particulares no estan disponibles o cuando es necesario realizar sustituciones. Por otra parte, esta estrategia presenta problemas de nivel superior. Por ejemplo, esta estrategia representa efectivamente una apuesta estadfstica sobre los serotipos particulares de la influenza que pueden representar la mayor amenaza para la salud humana. Sin embargo, las diversas poblaciones de virus de la gripe cambian dinamicamente con el tiempo. Por lo tanto, el retraso entre la eleccion de las cepas y la vacunacion despues de la fabricacion puede significar que las formulaciones de la vacuna pueden no representar ya las formulaciones optimas incluso en el momento de la administracion. Ademas, la escasez de la vacuna es muy comun. La razon es que los fabricantes no pueden vender almuotas en exceso de la vacuna ya que la formulacion de la vacuna se actualiza cada ano y no hay mercado para la composicion del ano anterior. Esta sola razon significa que no se puede vacunar a toda la poblacion. Las vacunas tienden a centrarse en los grupos considerados de riesgo. Uno de estos grupos de riesgo son los ancianos. Sin embargo, esta estrategia en sf misma puede ser defectuosa, ya que los estudios que comparan los efectos de la vacunacion de los ancianos en riesgo con los efectos de la vacunacion de los mismos sujetos junto con cada uno de los individuos con los que tienen contacto demuestran que para ser eficaces, es necesario vacunar a los individuos con los que entran en contacto los pacientes de riesgo para que la estrategia sea eficaz.

Ademas de lo anterior, la biologfa de los virus de la influenza significa que las protemas externas del virus cambian con el tiempo. Esto forma parte del comportamiento natural de evasion de defensa del anfitrion del virus. Ademas, los nuevos serotipos llegan a los seres humanos procedentes de otras especies, tales como especies aviares, por ejemplo, mediante redistribucion u otros mecanismos geneticos. Esto conduce nuevamente a serotipos con diferentes protemas externas. Claramente, con las protemas externas del virus cambiando continuamente, las esperanzas de un diseno convencional de vacunas que sigan siendo eficaces de ano en ano son remotas.

Las vacunas actuales para la influenza A actuan estimulando la produccion de anticuerpos contra la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). Dado que estas protemas son altamente polimorficas, hay muy poca o ninguna proteccion de subtipo cruzado (o heterosubtfpica) y una proteccion limitada de cepa cruzada incluso dentro de los subtipos. Como se ha senalado anteriormente, son necesarios un rediseno y una refabricacion constantes que aumentan el coste de las vacunas, imponen limitaciones en el suministro y lo mas importante representan que las vacunas para cepas recien surgidas solo se pueden producir una vez que las secuencias HA y NA de los virus que presentan la mayor amenaza para la salud humana hayan sido identificadas. La influenza aviar en los seres humanos se trata actualmente con el farmaco antiviral oseltamivir, y este farmaco se esta almacenando para su uso en futuras pandemias. Sin embargo, se ha aislado ahora el virus H5N1 resistente al oseltamivir despues de la infeccion en seres humanos, por lo que el uso de este farmaco solo puede no ser suficiente para tratar a individuos infectados o limitar la propagacion del virus si se transmite de ser humano a ser humano.

De los 59 casos humanos conocidos de influenza H5N1 es sorprendente que la mayona de las infecciones se hayan encontrado en jovenes y que la tasa de letalidad entre los menores de 15 anos de edad fuera del 89%.

La infeccion natural con el virus de la influenza da como resultado respuestas de celulas T a NP y M1, pero las vacunas de subunidades que consisten en HA y NA no pueden inducir estas respuestas. En Rusia y en los Estados Unidos se ha concedido la licencia de una vacuna de virus atenuado vivo, adaptado al fno (ca, por sus siglas en ingles), para la inmunizacion intranasal. Se ha demostrado que las vacunas producidas de esta manera inducen alguna inmunidad de proteccion cruzada. Se llevaron a cabo pruebas en ninos seronegativos vacunados con un virus ca. El nivel de seroconversion a la cepa de la vacuna vario de 41 a 89%, oscilando el nivel de seroconversion a diferentes cepas de 5 a 55%. Por lo tanto, la reactividad cruzada es baja y, al igual que con las vacunas de

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subunidades, se utiliza una nueva mezcla de cepas de virus para producir una vacuna cada ano. Ademas, los problemas de seguridad relacionados con la expulsion y liberacion ("shedding") de la cepa de la vacuna han dado como resultado que esta vacuna sea aprobada solamente para el grupo de edad 5-49 en los Estados Unidos. Esto excluye dos grupos de riesgo principales que son mas mayores o mas jovenes que el rango de edad definido, asf como pacientes inmunodeficientes y mujeres embarazadas.

El riesgo de una pandemia mundial de influenza aviar ha generado una preocupacion generalizada y justificada. La vacunacion presenta una posible medida de control, pero no hay vacuna contra la influenza H5N1 y pruebas recientes de nuevas vacunas para H5N1 en investigacion sugieren que se necesitana una cantidad 12 veces mayor de antfgeno por vacuna que con otras vacunas contra la gripe. Esto ha desalentado el desarrollo de nuevas vacunas debido a que las partes productoras estan preocupadas porque si no ocurre una pandemia, se quedaran con suministros no vendidos. Otros intentos para resolver estos problemas se han centrado en el uso de coadyuvantes para reducir la cantidad de antfgeno necesario. Ademas, la alta tasa actual de diversificacion de las cepas H5N1 sugiere que las vacunas fabricadas ahora pueden diferirtanto en su secuencia de H5 de cualquier cepa pandemica que emerja, que estas vacunas tendnan poca o ninguna eficacia.

Se ha demostrado que los ratones inmunizados con vacunas de ADN que expresan la nucleoprotema (NP) y la matriz (M1) del virus H1N1 estan protegidos contra la exposicion letal con una cepa H5N1 (Kreijtz et al. 2007 Journal of Infectious Disease vol 195 pag.1598). Utilizando un regimen de induccion de ADN/ refuerzo de adenovirus con vacunas que expresan NP, en ratones se ha demostrado una proteccion dependiente de celulas T contra numerosos subtipos de influenza A incluyendo H5N1. Sin embargo, en seres humanos, las vacunas de ADN no son buenos inmunogenos y no refuerzan las respuestas preexistentes.

Recientemente se ha demostrado que los MVA recombinantes que expresan HA o NP de la influenza equina administrados con o sin una induccion de vacuna de ADN inducen anticuerpos, linfoproliferacion y produccion de interferon gamma en ponis (Breathnach et al. 2004 Veterinary Immunology and Immunopatology vol. 98 pags. 127136). Sin embargo, se utilizaron dos dosis de refuerzo de MVA, no se revelaron estudios de sensibilizacion y no se demostro eficacia.

D1 (documento WO2007092792) describe INFLUENZA VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF

D2 (documento WO2007016598) describe YEAST-BASED VACCINE FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE JIMENEZ G S et al. Human Vaccines 200709 vol. 3, num. 5 paginas 157 - 164 describen vacunas de ADN de influenza formuladas con vaxfectina (TM) que codifican protemas virales NP y M2 que protegen a ratones contra la exposicion viral letal.

D3 (DORRELL L et al. Vaccine (20000915), vol. 19, num. 2-3 paginas 327 - 336) describen virus vaccinina Ankara Modificado que reestimula eficazmente los linfocitos T citotoxicos humanos in vitro.

D4 (DONNELLY J J et al., VACCINE (19970601) vol. 15, num. 8 paginas 865 - 868) describen una proteccion adicional contra la deriva antigenica del virus de la influenza en un modelo de huron mediante vacunacion con ADN.

D5 (KREIJTZ JOOST H C M et al. Journal Of Infectious Diseases (20070601) vol. 195, num. 11 paginas 1598 - 1606) describen vacunas basadas en virus vaccinia Ankara modificados recombinantes que inducen inmunidad protectora en ratones contra la infeccion por el virus de la influenza H5N1.

D6 (SCHNEIDER J et al. NATURE MEDICINE (19980401) vol. 4, num. 4 paginas 397 - 402) describen un aumento de la inmunogenicidad para la induccion de celulas T CD8+ y la eficacia protectora completa de la vacunacion con ADN de malaria reforzando con virus vaccinia Ankara modificado"

La invencion pretende superar el problema o los problemas asociados con la tecnica anterior.

Compendio de la invencion

La tecnica anterior se ha referido a la generacion de respuestas de anticuerpos contra el virus de la influenza. Estos enfoques de la tecnica anterior se han basado logicamente en la eleccion como diana de los antfgenos externos de las partfculas vmcas. Sin embargo, esos antfgenos externos cambian constantemente a traves del tiempo por medio de fenomenos tales como el cambio antigenico, la deriva antigenica, y la introduccion de nuevos serotipos, por ejemplo, mediante mecanismos basados en la re-distribucion. Por lo tanto, los enfoques basados en la tecnica anterior tfpicamente no logran generar una reactividad cruzada protectora de cepa a cepa. Ademas, debido al numero limitado de cepas que pueden incluirse en cualquier vacuna determinada dada, en el mejor de los casos la proteccion conferida omite un gran numero de virus potencialmente amenazantes. Adicionalmente, los retrasos entre la seleccion de las cepas potencialmente mas amenazantes en un ano dado y la fabricacion de la vacuna correspondiente significan que los disenadores de vacunas estan luchando constantemente para mantenerse al dfa, ya que los cambios en las poblaciones virales habran tenido lugar incluso antes de que las vacunas elegidas sean fabricadas y administradas.

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En contraste con los enfoques de la tecnica anterior, los autores de la presente invencion se han centrado en la generacion de inmunidad basada en celulas. Ademas de elegir un enfoque de inmunidad basado en celulas, los autores de la presente invencion ilustran que las protemas internas del virus de la influenza deben utilizarse como componentes de la vacuna. A priori, no se esperana que tales enfoques funcionaran. Una razon es que al elegir los antigenos internos, es mas diffcil dirigir el virus ya que esos antigenos a menudo estanan "enterrados" o enmascarados por el resto de la estructura del virus. Lo que es mas importante, no se espera que la inmunidad basada en celulas trate eficazmente la patogenicidad de la influenza. La razon es que, en contraste con los enfoques basados en anticuerpos, las celulas T no atacan al virus libre tal como el virus en el torrente sangumeo o el tracto respiratorio superior. La inmunidad mediada por celulas T depende de las celulas inmunitarias que atacan a las celulas en el sujeto que realmente estan infectadas con el virus. Por lo tanto, en el mejor de los casos se podna esperar que un enfoque basado en celulas pudiera conducir a una reduccion de la gravedad de una infeccion particular, pero no se esperana que previniera o mejorara la enfermedad o la infeccion en sf. Sin embargo, los autores de la presente invencion han demostrado sorprendentemente que tanto estos como otros inconvenientes esperados con un enfoque que implica antfgenos internos e inmunidad basada en celulas se superan con exito y se produce una vacuna extremadamente eficaz.

La presente invencion se basa en estos descubrimientos sorprendentes.

De este modo, en un aspecto, la invencion proporciona una composicion adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por celulas T frente a un virus de la influenza en un vertebrado, comprendiendo dicha composicion un vector viral que comprende acido nucleico que codifica uno o mas epftopos de una o mas protemas internas del virus de la influenza, en donde dicho vector viral es un vector de MVA, en donde dicha composicion comprende acido nucleico que codifica al menos dos de dichos epftopos, siendo al menos un epftopo de cada una de dos o mas protemas internas del virus de la influenza, en donde dichas protemas internas comprenden nucleoprotema y protema 1 de la matriz, en donde dichos epftopos se proporcionan en forma de una fusion de nucleoprotema- protema 1 de la matriz, en donde dichas protemas internas proceden de la cepa de la influenza H3N2 subtipo A/Panama/2007/99, para su uso en el refuerzo de respuestas de celulas T preexistentes contra la influenza.

Convenientemente dichas protemas estan dispuestas en el orden N terminal - nucleoprotema - protema 1 de la matriz - C terminal.

Convenientemente, dichas nucleoprotema y protema 1 de la matriz estan separadas mediante una secuencia conectora.

Convenientemente, dicha secuencia conectora tiene la secuencia de aminoacidos GGGPGGG.

Convenientemente, la secuencia codificante de la secuencia de acido nucleico que codifica dichas protemas internas y/o polipeptidos conectores ha sido sometida a optimizacion de codones para el uso de codones humanos.

Convenientemente, dichos epftopos se proporcionan en forma de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1.

Convenientemente, dichos epftopos estan codificados por un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos del SEQ ID NO: 2.

Convenientemente, la composicion comprende ademas un coadyuvante.

Convenientemente, la composicion induce respuestas de celulas T a los antfgenos tanto NP como M1.

Convenientemente, la composicion de dichas respuestas de celulas T son respuestas de celulas T CD8+.

En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de una composicion como la descrita anteriormente en la preparacion de un medicamento para reforzar las respuestas de celulas T preexistentes contra la influenza.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un kit que comprende una composicion como la descrita anteriormente para reforzar las respuestas de celulas T de memoria preexistentes a la influenza.

Convenientemente dicha composicion induce (o es capaz de inducir (una vez administrada) respuestas de celulas T a los antfgenos tanto NP como M1. Convenientemente, esto significa la induccion de una respuesta de celulas T a al menos un epftopo NP y a al menos un epftopo M1. Convenientemente dichas respuestas se presentan en un vertebrado. Mas convenientemente dichas respuestas ses presentan en un primate.

Tambien se describe el uso de una composicion como la descrita anteriormente en medicina.

En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de una composicion como la descrita anteriormente en la preparacion de un medicamento para la influenza.

Tambien se describe un metodo para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo dicho metodo

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administrar a dicho sujeto una composicion como la descrita anteriormente.

Tambien se describe un metodo como se ha descrito anteriormente que comprende administrar una primera composicion que comprende un vector basado en adenovirus y una segunda composicion que comprende un vector basado en MVA.

Convenientemente dicho sujeto es una especie de primate o aviar. Convenientemente dicho sujeto es un primate tal como un ser humano.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Una cepa particular del virus de la influenza puede estar sujeta a la deriva antigenica y/o al cambio antigenico. El efecto de cualquiera de estos fenomenos es la alteracion de los diversos antigenos mostrados por ese virus. En particular, la deriva antigenica se refiere a la situacion en la que se producen mutaciones puntuales unicas u otras alteraciones geneticas menores en la secuencia codificante de dichos antigenos. Por el contrario, el desplazamiento antigenico se refiere a la redistribucion de una o mas de las ocho moleculas de ARN que constituyen colectivamente el genoma del virus de la influenza. Esto tiende a conducir a un intercambio mas drastico o al por mayor o al salto de antigenos que los efectos de menor transcedencia mediados por la deriva antigenica. Es importante observar que dentro de una cepa particular, se pueden observar muchas variantes individuales.

Una ventaja de la invencion es que al proporcionar una excelente reactividad cruzada, cada variante dentro de una cepa particular es asumida por la respuesta inmunitaria resultante. Esta ventaja deriva del uso de antfgenos conservados, tales como NP y/o M1.

La respuesta inmunitaria inducida se puede caracterizar facilmente de acuerdo con mecanismos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el peptido o los peptidos exactos utilizados en la inmunizacion se pueden emplear para evaluar la respuesta inmunitaria. Alternativamente, se pueden utilizar otras cepas, tales como cepas estrechamente relacionadas o variantes de la cepa sobre la que se basaron los antigenos, para evaluar la reactividad cruzada o la amplitud de cobertura proporcionada por la inmunizacion.

En un aspecto, los antfgenos utilizados comprenden (p. ej., consisten en) o derivan de la secuencia de esos antfgenos en la cepa H3N2. Este aspecto tiene varias ventajas, tales como la disponibilidad del virus H3N2 como una solucion de partida de BPF para experimentos de sensibilizacion. Ademas, esta cepa es la cepa de influenza humana mas comun. Esta cepa se aislo por primera vez en 1999 y, por lo tanto, es un producto aislado ventajosamente reciente.

El termino "derivado de" tiene su significado natural en la tecnica. En otras palabras, significa que el epftopo o antfgeno se basan o se toman del material de origen del que "derivan". Esto puede ser mediante clonacion y manipulacion directa de acido nucleico a partir del material de origen, o es mas probable que implique la derivacion de la secuencia de nucleotidos o aminoacidos del material de origen. En semejante realizacion, el epftopo o antfgeno "derivado" del material de origen si comparten identidad de secuencia suficiente con el material de origen, p. ej., si comparten una identidad de secuencia de al menos 60% a nivel de aminoacidos a lo largo de al menos 10 aminoacidos contiguos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 70% a nivel de aminoacidos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 80% a nivel de aminoacidos, una identidad de secuencia de al menos 90% a nivel de aminoacidos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 95% a nivel de aminoacidos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 98% a nivel de aminoacidos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 99% a nivel de aminoacidos, adecuadamente una identidad de secuencia de al menos 100% a nivel de aminoacidos. Convenientemente esto se evalua a lo largo de al menos 10 aminoacidos contiguos, adecuadamente al menos 20 aminoacidos, adecuadamente al menos 40 aminoacidos, adecuadamente al menos 60 aminoacidos, adecuadamente al menos 80 aminoacidos, adecuadamente al menos 100 aminoacidos, adecuadamente al menos 150 aminoacidos, adecuadamente al menos 200 aminoacidos, adecuadamente al menos 300 aminoacidos, adecuadamente a lo largo de toda la longitud de la secuencia de interes. Para los acidos nucleicos, se aplican los mismos criterios a la identidad de nucleotidos y a los tramos de nucleotidos contiguos. De manera adecuada, se puede tener en cuenta por consiguiente la degeneracion del codigo genetico.

Una ventaja de la invencion es que los antfgenos utilizados, tales como antfgenos internos, estan mucho mas conservados que los antfgenos proteicos externos. Esto tiene el efecto beneficioso de que la eficacia anual de una vacuna de este tipo es significativamente mas alta que la de una vacuna basada en antfgenos externos.

Los terminos antfgenos "internos" y "externos" tienen su significado normal en la tecnica. En pocas palabras, se refieren a las localizaciones de los antfgenos en/sobre la estructura del virus de tipo salvaje. Un antfgeno interno se encuentra tfpicamente en el nucleo viral o la matriz. Un antfgeno externo es uno que esta al menos parcialmente expuesto en la superficie de la partfcula viral, tal como un antfgeno en una superficie disponible o accesible en la superficie. Los antfgenos externos se utilizan tfpicamente para intentar generar respuestas basadas en anticuerpos. Preferiblemente, la invencion excluye el uso de antfgenos externos. Convenientemente, los antfgenos o epftopos de la invencion son antfgenos o epftopos internos.

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Convenientemente los antigenos o epftopos externos se excluyen espedficamente de las composiciones de la invencion. Convenientemente, el acido o los acidos nucleicos de la invencion no codifican antfgenos o epftopos externos. Convenientemente, el acido o los acidos nucleicos de la invencion no codifican protemas externas del virus de la influenza.

Es una ventaja de la invencion que los componentes de la vacuna no necesitan ser cambiados o alterados de un ano a otro. Las vacunas basadas en antigenos externos de la tecnica anterior requieren una actualizacion constante de los componentes de la vacuna, tipicamente cambiando completamente cada ano.

Es una ventaja de la presente invencion que la exposicion natural al virus de la influenza se explote ventajosamente mediante las realizaciones de refuerzo de la invencion. En otras palabras, los autores de la presente invencion ilustran que los individuos con respuestas de celulas T significativas contra la influenza no se infectan. De hecho, se muestra que este efecto es independiente de si tambien estan presentes o no respuestas de anticuerpos detectables. Por lo tanto, los efectos generados en la presente invencion estan completamente separados de los que han sido el foco de la tecnica anterior hasta la fecha.

Una ventaja de la invencion es que se proporciona proteccion cruzada entre las cepas. De hecho, al generar respuestas a la nucleoprotema de influenza, se obtiene un efecto protector.

Aproximadamente 85% de la poblacion humana en general tiene respuestas de celulas T contra los antigenos de la gripe. Despues de aproximadamente 2 a 4 anos, las respuestas caen por debajo de un nivel de proteccion. Estos individuos, por lo tanto, vuelven a ser susceptibles de nuevo y son vulnerables a la infeccion/reinfeccion una vez que su respuesta ha disminuido por debajo de los niveles protectores. Un aspecto de la invencion implica el refuerzo de las respuestas de celulas T preexistentes contra el virus de la influenza a niveles protectores o superiores.

Otro aspecto de la invencion se refiere al refuerzo de las respuestas de celulas T frente a antigenos de influenza a un nivel superior al normal. Por "nivel normal" se entiende el nivel tfpico o medio de respuestas en un individuo despues de la infeccion. La ventaja de este aspecto es que la respuesta tarda mas en decaer o disminuir y por lo tanto la ventana durante la cual el individuo permanece protegido (es decir, mantiene una respuesta de celulas T en o por encima del nivel de proteccion) se prolonga ventajosamente. Esto tiene el beneficio de aumentar el intervalo entre los refuerzos que se requieren para mantener una proteccion eficaz.

Induccion-Refuerzo

Algunos aspectos de la invencion implican regfmenes de vacunacion de inductor-refuerzo. Tales mecanismos son bien conocidos en la tecnica. En lrneas generales, el induccion-refuerzose refiere al proceso de inicio de una respuesta inmunitaria ('induccion') y posteriormente estimulacion/potenciacion/ampliacion de esa respuesta ('refuerzo').

Adecuadamente se obtienen mejores resultados cuando los antfgenos para la induccion y el refuerzo se solapan (es decir, tienen uno o mas antfgenos o epftopos en comun) o son los mismos.

Se pueden llevar a cabo apropiadamente inducciones-refuerzos homologos. Esto significa que los vectores y/o formulaciones para la induccion y el refuerzo o los refuerzos son adecuadamente iguales. Los vectores basados en Vaccinia Ankara Modificado (MVA) se adaptan bien al induccion-refuerzohomologo ya que no replican en celulas de mairftfero y por lo tanto tfpicamente no inducen respuestas inmunitarias anti-vector problematicas en el sujeto. Esto tiene la ventaja de que las dosis subsiguientes (refuerzos) siguen siendo eficaces en lugar de ser mejoradas por las respuestas anti-vector en el sujeto.

Adecuadamente la induccion refuerzo heterologa puede proporcionar respuestas mejoradas. La induccion-refuerzo heterologa describe la administracion de diferentes vectores y/o formulaciones para la induccion y el refuerzo o los refuerzos. Muy adecuadamente la induccion-refuerzo heterologa se refiere a la administracion de diferentes vectores para la induccion y el refuerzo o los refuerzos. Un beneficio clave de la induccion-refuerzo heterologa es la evitacion o la reduccion de las respuestas anti-vector, lo que a menudo conduce a una mejor respuesta a los refuerzos (heterologos) que en los enfoques de induccion-refuerzo homologos, particularmente cuando las inmunizaciones de induccion y el refuerzo se dan en el margen de unas pocas semanas el uno del otro. En enfoques de induccion- refuerzo heterologos, adecuadamente un vector es un vector basado en adenovirus, y el otro vector es un vector basado en MVA. Convenientemente en los enfoques de induccion-refuerzo heterologos, adecuadamente la primera composicion comprende un vector basado en adenovirus, y la segunda composicion comprende un vector basado en MVA.

Se pueden aplicar multiples refuerzos. Por ejemplo, una unica induccion puede estar seguida de un refuerzo, o de dos refuerzos, o detres refuerzos, o incluso mas. Algunos regfmenes pueden comprender una induccion seguida de un mayor numero de refuerzos, por ejemplo, refuerzos regulares administrados en momentos espedficos (p. ej., cada 3 anos, cada 5 anos, cada 10 anos) a lo largo de la vida del sujeto. Alternativamente, algunos regfmenes pueden comprender una induccion seguida de un mayor numero de refuerzos, por ejemplo refuerzos regulares administrados bajo condiciones espedficas (p. ej., cuando una respuesta ha disminuido a un nivel predeterminado tal como por debajo del umbral de proteccion) a lo largo de la vida del sujeto.

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En algunos aspectos, la invencion se refiere a regfmenes de vacunacion de 'solo refuerzo'. En estos aspectos, el sujeto tiene una respuesta preexistente en algun nivel, sea o no protector. Esta respuesta preexistente puede haber sido adquirida por una infeccion previa o actual, o puede haber sido adquirida por vacunacion previa. El punto importante es que el sujeto muestra algun tipo de respuesta inmunitaria contra la influenza, de modo que se considera que la vacunacion proporcionada de acuerdo con la presente invencion es un 'refuerzo'. El MVA es particularmente adecuado para reforzar las respuestas de celulas T preexistentes, de manera que el vector es adecuadamente MVA. Se considera que una 'induccion' es una vacunacion administrada a un paciente que nunca ha estado expuesto al virus de la influenza o que no presenta una respuesta detectable contra la influenza (un sujeto 'no sometido a sensibilizacion previa' - discutido con mas detalle mas adelante).

Los refuerzos multiples pueden ser homologos o pueden ser heterologos como se ha explicado anteriormente.

Una ventaja consiste en que la invencion dirige las respuestas inmunitarias contra antigenos conservados y proporciona proteccion cruzada. Juntos, estos efectos proporcionan ventajosamente una proteccion amplia y una proteccion estable contra la infeccion por el virus de la influenza.

Sujetos no sometidos a sensibilizacion previa

Algunos individuos de la poblacion no poseen una inmunidad preexistente al virus de la influenza. Estos individuos pueden ser bebes, o pueden ser adultos que nunca se han enfrentado al virus. Alternativamente, puede haber adultos que se hayan enfrentado previamente al virus, pero para los cuales ha transcurrido tanto tiempo desde que se enfrentaron al virus por ultima vez que la respuesta ha decafdo hasta el punto de ser indetectable. Se considera que tales individuos no han sido sensibilizados previamente.

Evidentemente, un enfoque solo de refuerzo puede no ser apropiado para producir inmunidad protectora en tales sujetos. Convenientemente se adopta un enfoque de induccion-refuerzo cuando se vacuna individuos no sensibilizados previamente. Esto puede adoptar adecuadamente la forma de una pluralidad de inmunizaciones basadas en MVA, o puede adoptar la forma de una induccion basada en adenovirus seguida de un refuerzo basado en MVA. Se puede emplear cualquier otra combinacion adecuada de induccion-refuerzo.

Una ventaja de la invencion es que una sola vacunacion (p. ej., una induccion o refuerzo) contra uno o varios antfgenos conservados de la influenza puede dar lugar a una respuesta de celulas T protectora. Este hallazgo inesperado no se preve a partir de estudios de la tecnica anterior, por ejemplo en el caso de la malaria puede requerir anos de exposicion incluso para producir un efecto semi-protector.

Con el fin de determinar si un individuo "ha sido sensibilizado previamente" o no con respecto a la exposicion al virus de la influenza, se determina la respuesta de las celulas T a los antfgenos de la gripe. Si el individuo no tiene respuestas positivas de celulas T a ningun antfgeno de la influenza, se considerara que esa persona no ha sido sensibilizada previamente. Una respuesta positiva se describe como una respuesta en un analisis ELISPOT que es mayor que la media de la respuesta no espedfica (de fondo) mas tres veces el error tfpico de la respuesta no espedfica.

Ventajas

Para el criterio de los autores de la presente invencion, los enfoques y materiales descritos en la presente memoria no se han generado previamente y representan un cambio de etapa con respecto a los enfoques basados en la tecnica anterior. Se cree que los enfoques basados en anticuerpos de la tecnica anterior neutralizan el virus antes de que se produzca la infeccion (es decir, el virus ha entrado en el tracto respiratorio superior pero no ha infectado una celula). Se cree que este es un objetivo clave en la proteccion de los individuos contra los efectos de una infeccion por influenza, o incluso en la proteccion de los mismos frente a la infeccion en sf. Para ser el sujeto de una respuesta basada en celulas T, las propias celulas del sujeto deben ser infectadas. Por lo tanto, la vision en la tecnica es que una respuesta inmunitaria mediada por celulas T no puede prevenir la infeccion, ya que la infeccion por una celula anfitriona se considera un requisito previo para la accion de esa respuesta.

Se debe observar que de las aproximadamente 50 o mas vacunas en el mercado actual, a lo sumo una de ellas parece estar funcionando a traves de respuestas basadas en celulas T. La unica vacuna candidata que podna estar funcionando a traves de este mecanismo es la vacuna BCG para la tuberculosis, que claramente no es relevante para la influenza.

La mayor parte de la actividad en la generacion de vacunas contra la influenza de la tecnica anterior se ha centrado en antfgenos de superficie, que son extremadamente variables. Los unicos intentos de utilizar antfgenos conservados se basan en la protema de la matriz M2. La secuencia de aminoacidos de la protema de la matriz M2 no esta de ninguna manera relacionada con la de la protema de la matriz M1. La protema M1 consiste en 252 aminoacidos, mientras que la protema M2 consiste solo en 97 aminoacidos y por lo tanto contiene pocos epttopos potenciales de celulas T. La protema M1 es interna en el virus de la influenza mientras que la protema M2, que es una protema del canal ionico, se extiende hasta la superficie del virus. Ademas, los unicos intentos de utilizar antfgenos conservados en una vacuna contra la influenza se han referido a una generacion de respuestas basadas en anticuerpos.

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En la tecnica anterior, se considera que las respuestas basadas en celulas T implican una fase de retardo diffcil de manejar. Se cree que la razon de esto es que las celulas T requieren tiempo para multiplicarse. La clara expectativa de una comprension de la tecnica anterior es que no se podna predecir que las celulas T apropiadas alcanzaran el pulmon lo suficientemente rapido como para prevenir la muerte del sujeto. Por el contrario, las respuestas de anticuerpos son tipicamente mucho mas rapidas en cuanto a su acumulacion. Por otra parte, se considera que las respuestas de anticuerpos se despliegan mas rapidamente que las respuestas basadas en celulas T. Se considera que las celulas T son lentas, particularmente en la migracion hacia o la localizacion del sitio de accion. Por lo tanto, a partir de una comprension de la tecnica anterior, en el mejor de los casos la expectativa podna ser que la inmunidad basada en celulas T podna limitar la gravedad de una infeccion, pero se considerana incapaz de prevenir o proteger de manera significativa dicha infeccion. Por el contrario, los autores de la presente invencion han demostrado que la inmunidad basada en celulas T representa una excelente estrategia de vacunacion contra la influenza. Ademas, es una ventaja de la invencion que, aunque el tejido o los tejidos diana de la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna sean la mucosa respiratoria, se da el caso de que no es necesario aplicar la vacuna a la mucosa sino que se puede utilizar una via de vacunacion intramuscular o intradermica convencional.

Dosificacion/administracion

La dosificacion puede ser variada por el operario experto. El experto en la tecnica puede manejar diferentes regfmenes de dosificacion. El trabajador experto puede desplegar diferentes regfmenes de induccion-refuerzo, particularmente en la vacunacion de individuos no sometidos a sensibilizacion previa.

Adecuadamente se utilizan vacunas de dosis unica.

Adecuadamente, no se administra coadyuvante con las composiciones de la invencion. Convenientemente, las composiciones de la invencion no comprenden coadyuvante.

Convenientemente, las composiciones descritas en la presente memoria pueden comprender virus suspendidos (partmulas de vectores virales) portadores de acido nucleico que codifica los antigenos/epftopos de la influenza de la invencion. De manera adecuada, el vector viral no comprende polipeptidos de influenza o secuencias de influenza distintos de los que codifican los epftopos/antigenos de interes.

Convenientemente, las composiciones comprenden componentes tamponadores en una cantidad eficaz para mantener la integridad del vector o los vectores virales de la invencion.

Los excipientes para facilitar la liofilizacion del virus o para permitir el almacenamiento a temperatura ambiente de la vacuna pueden formar parte de las composiciones adicionalmente.

En un aspecto, las partmulas virales se pueden mezclar o coadministrar (p. ej., en la misma muestra y/o en el mismo sitio y/o al mismo tiempo) con una o mas protemas tales como HA (hemaglutinina) o NA (neuraminidasa) de influenza. En este aspecto, las composiciones de la invencion se pueden mezclar con una o mas vacunas contra la influenza convencionales para producir una nueva composicion. Estos aspectos tienen la ventaja de inducir una respuesta de anticuerpo paralela que da como resultado una respuesta mixta de anticuerpos basada en celulas. De ese modo, tambien se describen composiciones como las descritas anteriormente que comprenden ademas uno o mas antfgenos de influenza externos. Por lo tanto, tambien es posible modificar las composiciones de la invencion para que tambien induzcan anticuerpos contra una o mas protemas externas del virus. Se ha demostrado que MVA colabora con las respuestas de anticuerpos a las protemas inyectadas con ella y las vacunas vectorizadas con adenovirus de replicacion deficiente inducen anticuerpos contra las protemas expresadas por la vacuna. De este modo, sena posible combinar la amplia proteccion cruzada obtenida por las celulas T que reconocen antfgenos conservados con la proteccion completa contra la infeccion proporcionada por anticuerpos contra los antfgenos externos. La combinacion de la proteccion mediada por celulas T y por anticuerpos en una vacuna debe proporcionar una eficacia equivalente de la vacuna contra la influenza estacional a las vacunas en uso actualmente, con el beneficio adicional de una proteccion sustancial contra nuevos subtipos a traves de las celulas T que reconocen y destruyen las celulas infectadas por virus. Los vectores virales tales como MVA pueden tener un efecto coadyuvante. Sin embargo, se puede proporcionar ventajosamente otro coadyuvante - convenientemente tales composiciones mixtas pueden comprender ademas un coadyuvante tal como un coadyuvante basado en aluminio, p. ej., alumina o hidroxido de aluminio.

Cuando el epttopo o el acido nucleico que lo codifica estan comprendidos por un vector viral, se administran adecuadamente 1x106 a 1x109 ufp (unidades formadoras de placas) en una sola dosis. Mas adecuadamente se administran 1x107 o mas ufp en una dosis unica, lo que tiene la ventaja de aumentar la inmunogenicidad. Mas adecuadamente se administran 5x108 o menos ufp en una sola dosis, lo que tiene la ventaja de evitar los posibles efectos secundarios de las dosis mas altas. De ese modo, adecuadamente se administran 1x107 a 5x108 ufp en una sola dosis. Mas adecuadamente se administran 5x107 a 2,5 x 108 ufp en una sola dosis. Adecuadamente se administran 5 x 107 ufp en una sola dosis. Adecuadamente se administran 2,5 x 108 ufp en una sola dosis.

Adecuadamente dichas dosis son para primates adultos tales como seres humanos. Las dosis para otros sujetos tales como especies aviares o cnas de primates tales como seres humanos se pueden determinar a partir de la grna proporcionada.

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Adecuadamente, la administracion se realiza por cualquier via adecuada conocida por el experto en la tecnica, por ejemplo por medio de una aguja o por medio de la administracion de parches transdermicos. Adecuadamente la administracion es por medio de una aguja.

Adecuadamente, la administracion no es intravenosa.

Adecuadamente, la administracion es subcutanea, intradermica o intramuscular. Adecuadamente, la administracion es intradermica o intramuscular, ya que estas muestran una mejor inmunogenicidad. Adecuadamente, la administracion es intradermica. Lo mas adecuadamente, la administracion es intradermica por medio de una aguja.

La secuencia concreta de los antigenos utilizados puede variar, por ejemplo si se detecta una "mutacion de escape" en un virus de interes. En este escenario, sena deseable cambiar la secuencia espedfica de uno o mas de los antfgenos utilizados en la vacunacion con el fin de volver a cartografiar la respuesta inmunitaria sobre la variante de escape. Tfpicamente esto podna implicar el reemplazo de la secuencia de antigeno por una secuencia que incorpora la variante de escape.

Convenientemente, se utilizan dos o mas antigenos conservados en las composiciones de la invencion y dichos antigenos conservados comprenden uno o mas de los polipeptidos de la nucleoprotema (NP) y de la matriz 1 (M1) de la influenza y dichos antigenos conservados comprenden polipeptidos tanto de la nucleoprotema (NP) como de la matriz 1 (M1) de la influenza y dichos antigenos conservados comprenden al menos un epttopo de los polipeptidos de la nucleoprotema (NP) como de la matriz 1 (M1) de la influenza.

En principio, se puede emplear cualquier secuencia o secuencias de nucleoprotema/protema 1 de la matriz capaces de inducir las respuestas de la invencion.

Una ventaja de los diversos constructos de la invencion es que ambos antigenos se expresan eficazmente.

Una ventaja de la invencion es que los constructos antigenicos no tienen marcadores. La eliminacion de genes marcadores tales como la beta-galactosidasa puede desestabilizar los vectores virales. Por ejemplo, los vectores basados en la viruela aviar pueden ser susceptibles de desestabilizacion mediante la eliminacion de los marcadores de beta-galactosidasa que se incluyen tfpicamente en ellos. Sin embargo, los autores de la presente invencion han mostrado sorprendentemente que los vectores sin marcador de acuerdo con la presente invencion son de hecho estables y proporcionan una expresion eficaz de los antfgenos internos de interes.

Ventajosamente, los antfgenos son de la cepa de influenza H3N2 y los antfgenos son del subtipo A/Panama/2007/99 de la cepa de influenza H3N2.

Ventajosamente, los antfgenos comprenden una o varias secuencias de antfgenos del listado de secuencias.

Ventajosamente, los antfgenos estan dispuestos en el orden (extremo N - protema nuclear - protema 1 de la matriz - extremo C) de la protema de fusion de la invencion.

Ventajosamente, los antfgenos se proporcionan en forma de un unico polipeptido ('protema de fusion'). Esto asegura que los antfgenos sean coexpresados.

Ventajosamente, los antfgenos de la invencion estan separados por una secuencia conectora. Esto permite un plegamiento superior de la cadena polipeptfdica, y ventajosamente da como resultado la presentacion correcta de los antfgenos de interes.

La mayona de vectores de la tecnica anterior implican una secuencia lfder. Esto se utiliza tfpicamente en vectores basados en la tecnica anterior, por ejemplo para proporcionar una senal de secrecion para asegurar que el antfgeno esta disponible para el sistema inmunitario. Alternativamente, se emplean secuencias lfder para proporcionar una expresion mejorada. Sin embargo, por el contrario, los constructos de la presente invencion no comprenden adecuadamente una secuencia lfder. Los constructos de la invencion no comprenden adecuadamente una senal de secrecion. Es sorprendente que se obtengan una antigenicidad y una expresion de polipeptidos excelentes incluso en ausencia de una secuencia lfder.

En la tecnica anterior, es practica habitual la eliminacion de todos los sitios potenciales de glicosilacion de los antfgenos de interes. Sin embargo, por el contrario, los autores de la presente invencion ilustran que los sitios de glicosilacion se deben mantener. De este modo, adecuadamente, los antfgenos de la invencion conservan sus sitios de glicosilacion naturales.

Una ventaja de la invencion es que no se utilizan secuencias terminadoras en los constructos de la invencion.

Convenientemente, el constructo (p. ej., insertos que codifican el epttopo/antigeno) de la invencion que incluye los antfgenos de interes se puede sintetizar in vitro. Por sintetizar in vitro se entiende que el acido nucleico que codifica los antfgenos de interes se sintetiza de novo, en lugar de estar derivados mediante tecnicas basadas en la clonacion de una secuencia de acido nucleico viral real. De manera adecuada, se utiliza la secuencia de aminoacidos deseada como base para sintetizar artificialmente el acido nucleico de la invencion. Tambien se describen uno o varios

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constructos (p. ej., insertos codificantes de un epttopo/antigeno) como tales, p. ej., como casetes de acido nucleico, esten o no presentes en un vector capaz de dirigir su expresion en una celula animal. Tambien se describen la protema o las protemas de fusion descritas en la presente memoria.

Ventajosamente, se utiliza la optimizacion de codones humanos.

Otra ventaja de la secuencia conectora es que el conector es susceptible a la proteasa. Esto permite ventajosamente separar los dos o mas epftopos/antigenos, aliviando ventajosamente de ese modo los efectos de inmunodominancia que se pueden crear mediante el acoplamiento de antigenos.

Con respecto a los antigenos escogidos, o en particular con respecto a las secuencias antigenicas elegidas, claramente se consideran dentro del alcance de la invencion las variantes de las secuencias que se han ilustrado. Por ejemplo, se podnan crear moleculas quimericas que impliquen partes del antigeno o los antigenos de diferentes subtipos. Alternativamente, se podnan introducir mutaciones puntuales con el objetivo de capturar "variantes de escape" del virus como se describe en la presente memoria.

Generalmente se considerara que una respuesta inmunitaria ha sido generada por la presente invencion si conduce a una duplicacion de la respuesta de celulas T preexistente medida despues de la vacunacion, o aumenta en mas de 200 celulas espedficas por millon por celulas mononucleares de sangre periferica. En otras palabras, la fuerza de una respuesta de celulas T se puede medir en un sujeto antes de la vacunacion. Despues de la vacunacion, la respuesta se mide de nuevo. Si esa respuesta al menos se ha duplicado o ha aumentado en mas de 200 celulas espedficas por millon por celulas mononucleares de sangre periferica, se considerara generalmente que la vacunacion ha producido una respuesta inmunitaria de acuerdo con la presente invencion.

Una ventaja de la invencion es que se utilizan al menos dos antfgenos de influenza conservados.

Una ventaja de la invencion es que no se utilizan antfgenos de influenza externos.

Una ventaja de la invencion es que se genera una respuesta de celulas T "pura".

Una ventaja de la invencion es que las respuestas inmunitarias generadas son mejores de lo que se podna haber previsto. De hecho, es este sorprendente efecto el que constituye la base de la presente invencion.

Es una ventaja de la invencion que los constructos de vector que expresan los antfgenos de interes se pueden producir sin que se encuentren presentes secuencias marcadoras engorrosas.

Tambien se describe una vacunacion de induccion basada en ADN seguida por una vacunacion de refuerzo basada en MVA.

Una ventaja de la invencion es que se evitan los efectos de inmunodominancia. En la tecnica anterior, a menudo se experimentan problemas en la generacion de buenas respuestas a partir de la vacunacion simultanea con dos o mas antfgenos. Es un beneficio sorprendente de la presente invencion que se observen respuestas inmunitarias robustas frente a cada uno de los antfgenos utilizados en la vacunacion.

Tambien se describe una vacuna contra la influenza para la proteccion heterosubtfpica.

Virus de la influenza

Los virus de la influenza son miembros de la familia de virus de ARN Orthomyxoviridae. Se clasifican como tipo A, B o C basandose en las diferencias de antfgeno en su nucleoprotema (NP) y protema de matriz (M1), y los virus de tipo A se subtipifican adicionalmente basandose en la antigenicidad de las glicoprotemas de la superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Actualmente hay 16 subtipos de HA y 9 de Na, y todos los subtipos se mantienen en las poblaciones de aves acuaticas. El genoma de la influenza A consiste en ocho moleculas de ARN de sentido negativo de hebra sencilla, que codifican 11 protemas.

Las infecciones causadas por el virus de la influenza no suelen producir enfermedades en las poblaciones de aves silvestres, pero pueden transferirse de ellas a aves de corral domesticas, donde pueden producirse enfermedades que a veces son mortales, y tambien pueden causar infecciones en seres humanos. Si el virus despues muta o se redistribuye con otro subtipo capaz de transferirse entre los seres humanos, puede surgir una nueva cepa a la que los seres humanos no tienen inmunidad y causar una pandemia. Al menos 40 millones de personas murieron en 1918-19 de 'gripe espanola' causada por un virus H1N1. Las pandemias subsiguientes en 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) y 1977 (H1N1) fueron causadas cada vez por nuevas cepas surgidas. El virus de 1968 tema segmentos de HA y PB1 aviares, pero todos los otros segmentos habfan sido previamente identificados en los seres humanos. Recientemente, solo las cepas previamente encontradas en las poblaciones de aves (subtipos H5N1, H9N2 y H7N7) se han transmitido directamente a los seres humanos. Todavfa hay poca evidencia de la transferencia de humano a humano de estos subtipos, pero es probable que surjan nuevas cepas y den como resultado una nueva pandemia.

Se ha descubierto que el virus vaccinia Ankara modificado recombinante (MVA) induce un aumento drastico de las respuestas de celulas T preexistentes, sin embargo, se generaron inicialmente. Se refuerzan las respuestas tanto

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CD4+ como CD8+. Por lo tanto, se puede utilizar MVA en la invencion para reforzar las respuestas de memoria CD8+ existentes que se han inducido mediante la exposicion a la influenza. La infeccion o la vacunacion dan como resultado una induccion rapida de las celulas T efectoras que pueden controlar la infeccion. Esto esta seguido de una fase de contraccion con apoptosis de celulas efectoras y generacion de celulas T de memoria. Es esta poblacion de memoria la que luego se expande para producir una nueva poblacion de celulas efectoras para controlar cualquier infeccion subsiguiente. Es importante destacar que la magnitud de la respuesta efectora determina la magnitud de la memoria. Cuando ya existe una respuesta de memoria, el refuerzo con una vacuna altamente inmunogenica no solo da lugar a una respuesta de celulas T efectoras, sino que 'restablece' la respuesta de memoria a un nivel superior, dando lugar a un mayor grado de proteccion en la exposicion siguiente.

La mayona de los adultos de EE.UU. y del Reino Unido tienen niveles detectables de respuestas de celulas T a los antfgenos de la influenza incluyendo NP y M1. De hecho, la alta frecuencia media de celulas T CD8+ de 0,39% medida por citometna de flujo (y la alta frecuencia de CD27 en estas celulas que refleja una activacion limitada) sugieren que debenan ser facilmente reforzables por MVA que codifican antfgenos de influenza de acuerdo con la presente invencion. Incluso las respuestas que pueden ser demasiado bajas para ser cuantificadas de forma fiable por los analisis disponibles actualmente pueden todavfa ser reforzadas a niveles elevados mediante una unica dosis de MVA recombinante. La expansion de la respuesta de memoria existente de esta manera dara como resultado una mayor respuesta de memoria despues de la vacunacion con MVA. Una aplicacion de la invencion es el refuerzo de las respuestas de nivel muy bajo en la mayona de la poblacion a niveles protectores, de manera que la mayona de la poblacion esta protegida contra la infeccion en lugar del 33% que se encontraba protegido en un estudio de exposicion a influenza . En otra realizacion, mediante el refuerzo de otros individuos (p. ej., 33% de la poblacion con una proteccion medible), se pueden amplificar ventajosamente de manera adicional sus respuestas de celulas T dando lugar a una proteccion mas fuerte y mas duradera.

Vectores

Se describen vectores virales no replicantes adecuados para su uso en primates, tales como seres humanos. El vector o vectores deben tener la capacidad de dirigir la produccion de epftopos (polipeptidos) en una o mas celulas anfitrionas del sujeto en el que se introducen. Esto es importante en la produccion de la respuesta inmunitaria mediada por celulas correctas ya que los epftopos de interes se deben suministrar (p. ej., producidos dentro) en dichas celulas, y preferiblemente no se exportan o secretan significativamente, para que se alcancen los efectos inmuntarios correctos de acuerdo con la invencion. Adecuadamente, el vector es el vector MVA.

MVA es una excelente eleccion del vector de la vacuna. Como no se reproduce en seres humanos, es incapaz de causar una infeccion diseminada y no plantea problemas de seguridad. Se fabrica en fibroblastos de embrion de pollo (CEF). Dado que los huevos embrionados y los CEF son ampliamente utilizados en la fabricacion de otras vacunas hay una disponibilidad inmediata de CEF, y el proceso de fabricacion de MVA recombinante es simple y ampliable. El uso de MVA recombinante en numerosas pruebas, que han incluido ninos pequenos e individuos positivos para el VIH e individuos latentemente infectados con TB, ha dado lugar a una gran acumulacion de datos de seguridad y experiencia de fabricacion y uso de MVA que expresan diferentes antfgenos, todos los cuales apoyan el uso de mVa recombinante como una vacuna de refuerzo de las celulas T segura e inmunogenica (Moorthy, Imoukhuede et al., 2004, Dorrell, Yang et al., 2005, Webster, Dunachie et al. 2005, Bejon, Mwacharo et al., 2006).

Convenientemente, el vector MVA utilizado es el MVA convencional producido por Anton Mayr despues de 570 pases en CEF que se utiliza mas comunmente en la tecnica.

Se puede utilizar cualquier vector basado en adenovirus adecuado, tal como los descritos en los documentos WO2005/071093 o WO2006/048215. Adecuadamente, el vector basado en adenovirus utilizado es un adenovirus de simio, evitando de este modo la atenuacion de la respuesta inmunitaria despues de la vacunacion por anticuerpos preexistentes a entidades humanas comunes tales como AdHu5.

Los vectores de adenovirus de simio adecuados incluyen AdCh63 (numero de patente WO/2005/071093) o AdCh68 (Cohen et al., J. Gen Virol 2002 83: 151), pero tambien se pueden utilizar otros. Adecuadamente, el vector de adenovirus tendra la region E1 suprimida, haciendolo de replicacion deficiente en celulas humanas. Otras regiones del adenovirus tales como E3 y E4 tambien pueden ser suprimidas.

De este modo, la invencion proporciona un MVA recombinante que expresa antfgenos de influenza internos como se define en las reivindicaciones, y el uso del mismo para reforzar las respuestas de las celulas T a niveles protectores. Aunque la respuesta de las celulas T efectoras generada despues de la inmunizacion con MVA alcanza un pico rapidamente y luego disminuye durante un penodo de semanas, la memoria de celulas T continua aumentando durante un penodo de seis meses y es esta respuesta de memoria la que protegera a los vacunados de la infeccion subsiguiente y es la respuesta inmunitaria preferida de la invencion. Tambien se describe una vacuna de dosis unica que proporciona proteccion cruzada y de subtipo cruzado contra la infeccion diseminada que proviene tanto de la influenza humana como de la influenza aviar o, al menos, reduce considerablemente tanto los smtomas como la expulsion y liberacion del virus si se produce una infeccion, siempre que algunas respuestas de las celulas T de memoria hayan sido inducidas por exposicion previa (o por vacunacion por induccion).

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Para la vacunacion de individuos no expuestos previamente a influenza, se utilizan adecuadamente dos o tres inmunizaciones con MVA recombinante, o una inmunizacion por induccion con un vector de vacuna alternativo seguido de refuerzo con MVA. Se puede utilizar el uso repetido del mismo MVA recombinante para 'volver a reforzar' las respuestas efectoras. Puesto que el MVA no se replica en celulas humanas, las respuestas inmunitarias al vector son bajas, y ventajosamente no impiden la reutilizacion de la misma vacuna.

Convenientemente, el acido nucleico que codifica los epftopos/antigenos se inserta en el locus TK de MVA.

Convenientemente, el acido nucleico que codifica los epftopos/antigenos esta bajo el control del promotor P7.5 de vaccinia.

Respuestas inmunitarias

Un elemento clave del enfoque de la invencion es que la respuesta inmunitaria se ve obligada a una respuesta mediada por celulas. Esta es una caractenstica del uso de vectores virales para el suministro de los epftopos/antigenos de interes. Los procedimientos de la tecnica anterior se basan en la presentacion del antigeno directamente en preparaciones de protema con o sin coadyuvante. Este tipo de presentacion del antigeno conduce a respuestas basadas en anticuerpos. Sin embargo, las composiciones de la invencion dirigen la produccion de epftopos o antigenos dentro de las celulas del sujeto anfitrion. Esto conduce a su presentacion a las celulas T y por lo tanto a la inmunidad mediada por celulas. Esta es una distincion basica sobre los enfoques basados en la tecnica anterior que no producen inmunidad protectora basada en celulas y que operan a traves de la produccion de anticuerpos.

La proteccion mediada por las celulas T no prevendra la infeccion inicial de las vfas respiratorias superiores por la influenza, lo que la proteccion dependiente de anticuerpos puede hacer. Sin embargo, tras la vacunacion (refuerzo) de acuerdo con la presente invencion, la respuesta de las celulas T de memoria es capaz de expandirse rapidamente para producir celulas efectoras que destruyen las celulas infectadas con virus, prevenir la propagacion de la infeccion y limitar los smtomas de la enfermedad.

Tambien se describe una vacuna de cepa cruzada y de subtipo cruzado basada en antfgenos de influenza internos. Esta se puede fabricar y utilizar ampliamente porque puede proteger contra la influenza humana (H1N1 y H3N2), asf como contra una posible pandemia de H5N1, o una pandemia causada por cualquier subtipo que se encuentra actualmente solo en especies de aves. Dicha vacuna inductora de celulas T, por lo tanto, encuentra aplicacion en la industria por lo menos por estas razones.

Adecuadamente, la respuesta inmunitaria esta en un animal, mas adecuadamente en un vertebrado, mas apropiadamente en una especie aviar (p. ej., aves tales como pollos u otras especies avmolas de la cabana aviar o domesticas) o un primate, mas apropiadamente en un primate tal como un ser humano. Convenientemente el sujeto o los sujetos sobre los que se pone en practica la invencion son vertebrados, mas adecuadamente especies avmolas o primates, mas adecuadamente primates tales como seres humanos. Convenientemente, los metodos descritos tienen el proposito de inducir respuestas inmunitarias en vertebrados, mas adecuadamente en especies avmolas o primates, mas adecuadamente en primates tales como seres humanos.

Tambien se describe el uso de las composiciones de la invencion, tales como composiciones de vacunas, en aves. Cuando se utiliza la composicion o las composiciones en aves tales como pollos, dicha composicion se administra o se suministra adecuadamente in ovo o mediante inyeccion en pollos.

Preferiblemente, las respuestas inmunitarias de la invencion son respuestas mediadas por celulas tales como respuestas mediadas por celulas T.

En un aspecto, la invencion no se aplica adecuadamente a especies equinas. En este aspecto, las especies equinas adecuadas se excluyen de la invencion.

Por supuesto, se debe observar que diferentes individuos responden a epftopos diferentes debido a la restriccion del MHC. Por lo tanto, una ventaja de la invencion consiste en la utilizacion de los polipeptidos NP completos y/o M1 completos, es decir, polipeptidos de longitud completa de manera que estan abarcados todos los epftopos presentes naturalmente. Los epitopos o antfgenos de una o mas proteinas de la influenza adicionales se pueden anadir ventajosamente a las composiciones de la invencion. Por ejemplo, se puede anadir una protema de influenza no estructural adicional. Sin embargo, una ventaja de la invencion es que la inclusion tanto de NP como de M1 proporciona la cobertura mas amplia posible de respuestas naturales, mientras que se minimiza el numero de antfgenos utilizados y por lo tanto representa una formulacion optima de acuerdo con la invencion.

Otras aplicaciones

Tambien se describe una composicion para generar una respuesta inmunitaria contra un virus de influenza, comprendiendo dicha composicion uno o mas epftopos de una o mas proteinas internas del virus de la influenza. Tambien se describe una composicion adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por celulas T contra un virus de influenza, comprendiendo dicha composicion uno o mas epftopos de una o mas proteinas internas

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del virus de la influenza. En tales aspectos es importante asegurar que la respuesta es efectivamente la respuesta mediada por celulas de la invencion. Por lo tanto, los epftopos o antigenos deben ser suministrados a las celulas del sujeto en lugar de suministrarse simplemente de una manera que solo podna inducir una respuesta de anticuerpos. De este modo, los epftopos o antigenos se suministran adecuadamente en una forma que permite el cruce de la membrana celular o la entrada a las celulas por otros medios. Esto puede implicar la presentacion de los epftopos como protemas de fusion fusionadas a uno o mas dominios de transporte capaces de suministrar los epftopos a la celula o las celulas del sujeto.

Tambien se describen vacunas de dosis unica tales como kits que comprenden una composicion de la invencion para reforzar las respuestas a la influenza de las celulas T de memoria preexistentes.

Tambien se describen vacunas de dosis multiples tales como kits que comprenden dos o mas composiciones de la invencion para su administracion a sujetos no inducidos o que no han sido previamente expuestos.

Las respuestas inmunitarias inducidas por la composicion o las composiciones inmunogenicas descritas pueden tener otras utilidades ademas de la induccion de inmunidad protectora. Estas incluyen la generacion de reactivos tales como celulas T utiles en analisis de diagnostico, la generacion de celulas T utiles en protocolos de transferencia adoptivos, p. ej. para inmunoprofilaxis y/o inmunoterapia, y el uso de la composicion o las composiciones inmunogenicas para evaluar la inmunocompetencia del sujeto al que se administran.

La invencion se describe a continuacion a modo de ejemplos. Estos ejemplos pretenden ser ilustrativos y no pretenden limitar las reivindicaciones adjuntas. Se hace referencia a los siguientes dibujos:

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleotidos del SEQ ID NO: 2, cuya secuencia de nucleotidos codifica la secuencia de aminoacidos de A/Panama/2007/99 del SEQ ID NO: 1. La secuencia de acido nucleico ha sido optimizada para el uso de codones humanos. La estructura consiste en la nucleoprotema (NP) seguida por el conector (secuencia de aminoacidos gggpggg) seguido por la matriz 1 (M1).

Las Figuras 2 y 3 muestran diagramas de barras de la inmunogenicidad de MVA-NP+M1 en ratones. La Figura 2 muestra la inmunogenicidad de la region NP de la fusion NP+M1. La Figura 3 muestra la inmunogenicidad de dos epftopos, peptidos 57 y 64, en la secuencia codificante de M1, que sorprendentemente tambien induce una respuesta de celulas T a pesar de estar fusionada con el extremo C de la secuencia codificante de NP mediante una secuencia conectora no natural.

La Figura 4 muestra un diagrama de flujo del procedimiento FDP para producir vectores de Adenovirus.

La Figura 5 muestra una fotograffa de productos de PCR visualizados.

La Figura 6 muestra un diagrama de barras de respuesta inmunitaria.

La Figura 7 muestra un diagrama de barras de respuesta inmunitaria.

Ejemplos

Ejemplo 1: Vacunas inductoras de celulas T para la gripe Fundamento:

Identidad de la nucleoproteina (NP)

92% entre las cepas H3N2 y H1N1 91% entre las cepas H3N2 y H5N1

Identidad de M1 (matriz)

95% entre las cepas H3N2 y H1N1 93% entre las cepas H3N2 y H5N1

Diseno de la vacuna: MVA-gripe

Antfgeno: protema de fusion NP:M1

Secuencia H3N2 utilizada

Conector flexible entre NP y M1

Secuencia codificante total de 758 aminoacidos

Insertado en el locus TK de MVA

Promotor P7.5 de Vaccinia

Ningun gen marcador

La mayona de los adultos han estado expuestos a la influenza y tienen cierta memoria de celulas T contra NP y M1. La inmunizacion con MVA recombinante que expresa NP y M1 refuerza estos a niveles potencialmente protectores.

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La vacuna esta fabricada con BPF.

La prueba en Fase I utiliza voluntarios sanos, somete a ensayo las respuestas de las celulas T antes y despues de la inmunizacion con MVA.

Comparacion de dosis 5 x 107 ufp i.d. (n = 12) y 2,5 x 108 ufp i.d. (n = 12)

Estudio en Fase IIa

Elegir la dosis de inmunizacion de acuerdo con lo indicado mas arriba.

Inmunizar a 12 personas con bajos tftulos de anticuerpos

Sensibilizar estos 12 mas 12 controles utilizando H3N2, cepa disponible sensible a oseltamivir. Medir la expulsion y liberacion de virus en lavados nasales.

La vacuna se puede formular como un producto combinado.

Ejemplo 2: Constructo de epftopo preferido

El constructo del epftopo se prepara de acuerdo con la secuencia mostrada en la Figura 1. En este ejemplo, el acido nucleico se sintetiza in vitro y a continuacion esta listo para la clonacion en un sistema de suministro tal como un vector viral, p. ej., MVA.

Ejemplo 3: Inmunogenicidad de MVA-NP+M1 en ratones.

Se inmunizaron grupos de cuatro ratones BALB/c con 1 x 106 ufp de MVA-NP+M1 intradermicamente, o 50 |jg de una vacuna de ADN que expresaba el mismo inserto NP+M1 intramuscularmente seguido de 1 x 106 ufp de MVA- NP+M1 intradermicamente dos semanas mas tarde. Dos semanas despues de la inmunizacion con MVA, se sometieron a ensayo los bazos para determinar las respuestas de celulas T al peptido inmunodominante TYQRTRALV (residuos de aminoacidos 147-155 de NP) en un analisis ELISPOT de interferon gamma como describen Schneider, J., et al., (1998) Nat Med 4, 397-402.

Los resultados se representan en la Figura 2 como la media de cuatro ratones, y la respuesta generada por la vacunacion para el peptido TYQRTRALV (peptido de la gripe) se muestra en comparacion con la respuesta de fondo no espedfica (sin peptido). En estos ratones que no han sido previamente expuestos a la influenza, MVA es capaz de inducir una respuesta de celulas T a NP, como se muestra por el grupo con MVA solo. En ratones que se inducen primero utilizando una vacuna de ADN, la respuesta es reforzada a un nivel mas alto por MVA-NP+M1.

Tambien se miden las respuestas a dos peptidos adicionales, ambos derivados de M1 (Figura 3). El peptido 57 contiene el epftopo VFAGKNTDL y el peptido 64 contiene el epftopo LYRKLKREI. "Neto" indica la respuesta espedfica del peptido menos el fondo.

Por lo tanto, los autores de la presente invencion demuestran que en la misma cepa de raton se pueden inducir respuestas de celulas T tanto al antfgeno NP como al antfgeno M1 utilizando el constructo NP-M1 de acuerdo con la presente invencion en un vector MVA. Asf, a pesar del conector artificial entre los antfgenos y a pesar de la posibilidad de que se produzca la competicion antigenica, los autores de la presente invencion demuestran que ambos antfgenos son ventajosamente inmunogenicos para la induccion de celulas T y, en particular, con el vector MVA.

Ejemplo 4: Medicion de las respuestas de celulas T a NP y M1 en pruebas clmicas Medicion de inmunogenicidad de MVA-NP+M1 en voluntarios:

Las respuestas de las celulas T a la nucleoprotema y a la protema 1 de la matriz de la influenza A se pueden medir utilizando un analisis ELISPOT para enumerar las celulas T secretoras de interferon gamma (INF-gamma) de muestras de celulas de sangre periferica, despues de la estimulacion con reservas de peptidos solapantes que abarcan la secuencia completa de NP y M1. Las respuestas espedficas a cada una de las reservas se anaden juntas para alcanzar la respuesta total de las celulas T a estos dos antfgenos. La respuesta promedio a estos dos antfgenos en adultos del Reino Unido se encuentra en la region 100 - 200 celulas secretoras de INF-gamma por millon de PBMC.

Durante la prueba clmica de MVA-NP+M1, la respuesta preexistente a NP+M1 se mide en dos puntos temporales previos a la vacunacion, a continuacion una semana despues de la vacunacion ademas de puntos temporales posteriores. El refuerzo satisfactorio de la respuesta de las celulas T mediante la vacunacion dara como resultado el aumento de esta respuesta tfpicamente en mas de 200 celulas secretoras de INF-gamma por millon de PMBC a tfpicamente mas de 500 celulas secretoras de INF-gamma por millon de PMBC.

Ejemplo 5: Una nueva vacuna contra la influenza para la inmunidad heterosubtfpica.

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Vision de conjunto:

El riesgo de una pandemia mundial de influenza aviar ha generado una preocupacion generalizada y justificada. Las vacunas disenadas para inducir anticuerpos contra la hemaglutinina H5 presentan una evidente medida potencial de control, pero la actual alta tasa de diversificacion de las cepas H5N1 sugiere que las vacunas elaboradas actualmente pueden diferir tanto en su secuencia de H5 de cualquier cepa pandemica que emerja que estas vacunas tendnan poca o ninguna eficacia.

Sin embargo, las celulas T citotoxicas espedficas para las protemas internas NP y M1 muestran una elevada reactividad cruzada entre las cepas y entre los subtipos, lo que refleja la conservacion de 92-94% de las protemas internas. Las celulas T protectoras son inducidas por la infeccion por influenza, y 90% de la poblacion adulta del Reino Unido tiene celulas T de memoria contra 'antigenos de la gripe', pero el nivel de celulas efectoras disminuye rapidamente por debajo de lo necesario para la proteccion.

Los autores de la presente invencion realizaran una prueba clmica utilizando virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) que exprese antigenos internos de la gripe para reforzar las respuestas de memoria preexistentes de nuevo a niveles protectores. Las pruebas clmicas anteriores con MVA que expresan antfgenos de la malaria y de la tuberculosis han demostrado que es seguro y altamente eficaz en el refuerzo de las respuestas de las celulas T en los seres humanos. Durante la prueba, se evaluaran las respuestas de reaccion cruzada para determinar el potencial de la nueva vacuna para proteger contra H5N1, asf como contra H3N2 y H1N1.

Ejemplo 6: Fabricacion y prueba

El MVA recombinante puede ser construido como anteriormente, y fabricado comercialmente por IDT, Alemania. Diseno experimental y metodos: Diseno de vacunas

La composicion de este ejemplo es un virus MVA recombinante que expresa la nucleoprotema (NP) de influenza A fusionada a la protema de matriz (M1) a traves de un conector flexible (GGGPGGG) para formar un solo marco de lectura abierto (NPM1). Hay muy poco polimorfismo de estas secuencias entre los productos aislados de influenza A. NP es 92% identica entre las cepas H3N2 y H1N1, y 91% identicas entre las cepas H3N2 y H5N1. M1 es 95% identica entre las cepas H3N2 y HlN1, y 93% identica entre las cepas H3N2 y H5N1. Este bajo nivel de variacion parece permitir una fuerte reactividad cruzada de las celulas T. Para la comparacion, la secuencia del antfgeno TRAP utilizado en la vacuna contra la malaria de los autores de la presente invencion difiere en 8% de la secuencia de la cepa de sensibilizacion, y se observaron una reactividad cruzada inmunologica y una proteccion cruzada entre cepas excelentes. Sin embargo, los autores de la presente invencion eligieron la secuencia de H3N2 para esta prueba, ya que esta es la secuencia para la que la mayona de las personas tendran respuestas de celulas T de memoria. Los autores de la presente invencion midieron las respuestas inmunitarias a NP y M1 de este subtipo, al otro subtipo H1N1 humano comun y al subtipo H5N1 aviar.

La expresion del antfgeno es dirigida por el promotor temprano/tardm de Vaccinia P7.5 y el antfgeno se inserta en el locus de la timidina quinasa (TK) de MVA. Tales constructos similares han sido ampliamente sometidos a ensayo para determinar la estabilidad genetica y no se ha detectado evidencia de inestabilidad. Cuatro vacunas de mVa recombinantes existentes expresan todas la beta-galactosidasa de Escherichia coli como un gen marcador, insertado adyacente al antfgeno y expresado a partir del promotor tardm P11 de Vaccinia. Esto permite la identificacion del virus recombinante para la seleccion de la placa durante el aislamiento inicial del virus recombinante, y como es dirigido por un promotor tardm no se expresa bien en celulas de mairnfero despues de la inmunizacion. Sin embargo, los autores de la presente invencion han desarrollado ahora metodologfas utilizando la seleccion dominante transitoria de marcadores de protemas fluorescentes que permiten el aislamiento de MVA recombinante carente de cualquier marcador, y de esta manera se produce el constructo NPM1. Esto requiere despues la adaptacion de los analisis de control de calidad existentes para su uso con virus sin marcador.

Una empresa de fabricacion de BPF (Imstoffwerke Dessau Tornau (IDT), Alemania) puede producir MVA-NPM1 bajo contrato y cualquier nuevo analisis que se requiera para la produccion llevada a cabo de un MVA sin marcadores.

Fabricacion

Se genera MVA-NPM1 como antes, y se caracteriza por secuenciacion del inserto y de las regiones flanqueantes del virus. La inmunogenicidad del constructo se comprueba mediante un analisis de potencia en ratones, en el que se comprueban las respuestas a un epftopo de celulas T conocido en ratones (el peptido restringido H-2Kd NP 147-155 TYQRTRALV). A continuacion se puede suministrar una provision de siembra del virus a IDT, que prepara un banco maestro de semillas del virus y produce un lote clmico en viales listos para su uso. El control de calidad de la vacuna se puede llevar a cabo por IDT, y los estudios de toxicologfa se pueden llevar a cabo por una organizacion de investigacion contractual conforme a las BPL. Estos estudios generan los datos requeridos para una Aplicacion de Pruebas Clmicas (CTA) a MHRA, que puede ser respaldada por extensos datos de seguridad de pruebas clmicas previas de vacunas de MVA recombinante.

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Estudio de seguridad e inmunogenicidad

Los voluntarios adultos sanos pueden ser reclutados de la poblacion local. No es necesario que estos sean seleccionados para el estado de inmunizacion frente a vaccinia ya que se ha descubierto que la inmunizacion previa contra la varicela > 20 anos antes tiene efectos mmimos sobre la inmunogenicidad para MVA. En estudios de seguridad e inmunogenicidad, 12 personas recibiran una dosis de 5 x 107 ufp intradermica, y 12 recibiran una dosis de 2,5 x 108 ufp. El grupo de dosis baja se completara y recibira la aprobacion del control de seguridad independiente de la prueba antes de comenzar el grupo de dosis alta. En las pruebas con voluntarios con MVA 85A (tuberculosis) que habfan recibido previamente la vacuna BCG y a continuacion se les habfa administrado una dosis unica de MVA 85A de 5 x 107 ufp, la respuesta de celulas T al antigeno 85A se reforzo a niveles extremadamente altos y permanecio elevada durante mas de un ano (McShane, Pathan et al., 2004). Sin embargo, en las pruebas de vacunas contra la malaria, las dosis mas altas de MVA dieron como resultado respuestas de celulas T mas altas (McConkey, Reece et al., 2003). Por lo tanto, este estudio inicial pondra a prueba si una sola dosis baja, o una sola dosis alta, de MVA-NPM1 provoca un refuerzo significativo en las respuestas de celulas T a los antfgenos codificados en ella, en una poblacion de estudio que se espera que tenga alguna inmunidad preexistente a la influenza A (veanse las consideraciones estadfsticas a continuacion).

Ademas de los analisis de seguridad sangumea de rutina (como los utilizados en muchos de los estudios con MVA anteriores de los autores de la presente invencion) se llevaran a cabo analisis ELISPOT con IFN-gamma tanto ex vivo (para medir la respuesta efectora) como en cultivo (para medir la respuesta de memoria) sobre sangre extrafda de los voluntarios en su visita de seleccion y el dfa de la inmunizacion, para tener dos medidas separadas de las respuestas pre-existentes en los voluntarios. Despues de la vacunacion se tomara sangre de los voluntarios 1, 3, 8 y 24 y 52 semanas despues de la vacunacion y de nuevo se llevaran a cabo analisis ELISPOT con IFN-gamma ex vivo y en cultivo asf como citometna de flujo. Preferiblemente se llevan a cabo los analisis de calidad BPCL completos para estas respuestas de celulas T. Para los epftopos seleccionados, se dispone de tetrameros de tipos HLA de clase I y estos se utilizaran para fenotipificar las celulas T CD8+ inducidas. Los autores de la presente invencion evaluan la reactividad cruzada de subtipos agrupando peptidos que estan completamente conservados entre los subtipos H3N2, H1N1 y H5N1 y elaborando grupos espedficos de los subtipos para permitir la cuantificacion de las reacciones cruzadas de subtipos.

Estudio de eficacia

Siempre que se observe un refuerzo significativo de las respuestas inmunitarias despues de la inmunizacion, los autores de la presente invencion procederan a continuacion a un estudio de eficacia, tambien en voluntarios sanos. Los estudios de sensibilizacion con influenza fueron realizados de manera segura por la Common Cold Research Unit en Salisbury durante muchos anos y proporcionan una opcion para la evaluacion rapida de la eficacia de las nuevas vacunas. La dosis de MVA-NPM1 que se va a utilizar se elige despues de revisar los datos de seguridad e inmunogenicidad y las discusiones con el supervisor de seguridad de la prueba. Los voluntarios que tienen niveles de anticuerpos muy bajos o ausentes para la cepa de virus de sensibilizacion seran seleccionados, con el fin de minimizar la confusion del estudio de eficacia por anticuerpos preexistentes. Los voluntarios se inmunizaran y controlaran como para el estudio de inmunogenicidad, y luego se les administrara el virus de la influenza A infecciosa intranasalmente tres semanas despues de la inmunizacion. Hay instalaciones en el Center for Clinical vaccinology and Tropical Medicine (CCVTM), Oxford, para albergar a seis voluntarios en habitaciones para pacientes de presion negativa contenida en cualquier momento. Por lo tanto, cuatro grupos de seis voluntarios (tres inmunizados, tres controles) seran sensibilizados y seguidos por separado. El virus utilizado para la sensibilizacion sera del subtipo H3N2, y sera sensible al oseltamivir. El lote que se utilice se habra producido bajo condiciones BPF por Berna Biotech, y ya se ha proporcionado con seguridad a 200 personas.

Un estudio estadounidense reciente describio irregularidades cardfacas clmicamente insignificantes en voluntarios jovenes sanos sometidos a una sensibilizacion con influenza (Ison, Campbell et al., 2005). El estudio se llevo a cabo despues de que un sujeto en un estudio previo desarrollara una disfuncion miocardica temporal despues de la sensibilizacion con influenza. Se dijo que este sujeto no tema antecedentes de anomalfas cardiacas, pero de hecho debena haber sido identificado en situacion de riesgo debido al tratamiento con antraciclinas que habfa recibido. Teniendo esto en cuenta, los autores de la presente invencion solamente reclutaran voluntarios menores de 40 anos. El escrutinio de voluntarios incluira una historia medica personal y de farmacos, asf como una historia familiar para identificar cualquier riesgo residual de problemas del musculo cardiaco o del canal heredados.

Los lavados nasales se tomaran de los voluntarios a la misma hora cada dfa durante seis dfas y la cantidad de expulsion y liberacion de virus se medira tanto por metodos de cultivo viral como por PCR en tiempo real. Los voluntarios tendran acceso 24 horas al cuidado del medico y la enfermera de la prueba, y seguiran teniendo acceso al personal de la prueba despues de regresar a casa el dfa 10 de la prueba. Todos los voluntarios seran tratados con oseltamivir los dfas 9 y 10 o antes, si existe alguna preocupacion clmica. Se tomara sangre para los analisis ELISPOT 8 y 24 semanas despues de la vacunacion (5 y 21 semanas despues de la sensibilizacion) para examinar el efecto de la infeccion sobre las respuestas de celulas T de los voluntarios tanto inmunizados como de control.

Para maximizar la cantidad de informacion obtenida de las pruebas de sensibilizacion de influenza, se mediran las respuestas de celulas T a todos los antfgenos de la gripe en muestras de sangre tomadas en tres puntos temporales

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(antes de la inmunizacion, despues de la inmunizacion y despues de la sensibilizacion). Al estudiar la respuesta total de las celulas T a la gripe, asf como a los antigenos incluidos en la vacuna utilizando las tecnicas actualmente disponibles, los autores de la presente invencion se basaran en los estudios realizados hace 20 anos para aumentar la comprension y confirmar la validez del enfoque de vacunacion de los autores de la presente invencion y/o determinar la conveniencia de incluir un antfgeno diferente en la vacuna como se ha descrito anteriormente.

Vietnam

Como NP y M1 estan tan altamente conservadas entre las cepas de la influenza A, se espera que si la vacuna protege contra la sensibilizacion con las cepas que han circulado en los seres humanos, tambien protegera contra la influenza aviar. Dado que la sensibilizacion con cepas H5N1 no se llevara a cabo por razones de seguridad y eticas, un enfoque alternativo para abordar esta cuestion es probar si MVA-NPM1 reforzara las respuestas de celulas T en los supervivientes de la gripe aviar, lo que indicana que los epftopos conservados o con reactividad cruzada pueden ser reforzados por la vacuna. En colaboracion con la Wellcome Trust Unit en Ho Chi Minh City, Vietnam, dirigida por Jeremy Farrar, que ha tratado y estudiado una gran proporcion de casos de influenza aviar en el mundo hasta la fecha, los autores de la presente invencion llevaran a cabo un estudio de inmunogenicidad en Vietnam en el que 12 supervivientes de la gripe aviar y 12 individuos que han tenido recientemente gripe humana seran inmunizados. Los analisis ELISPOT se llevaran a cabo en reservas de peptidos, agrupados en epftopos conservados, epftopos espedficos de H1N1 y epftopos espedficos de H5N1, para evaluar la reactividad cruzada asf como la respuesta total.

Consideraciones estadfsticas

Para los estudios iniciales de seguridad e inmunogenicidad, se requerina un grupo de 12 voluntarios para detectar un aumento de 400 unidades formadoras de manchas por millon de celulas (ufm/millon) medidas mediante el analisis ELISPOT con interferon gamma, a partir de un valor de referencia (por ejemplo por debajo de 200 a 600, con un nivel de significacion de 5% y una potencia de 90%), si la desviacion tfpica de los cambios es inferior a 420 (como cabna esperar basandose en los datos generados en las pruebas de vacunas contra la malaria y la tuberculosis). Para cada dosis, los autores de la presente invencion someteran a ensayo si un aumento en las respuestas de las celulas T sigue a la vacunacion. Utilizando esta informacion y los datos sobre los efectos secundarios en cada una de las dosis, los autores de la presente invencion seleccionaran a continuacion la dosis que se vaya a utilizar en el estudio de eficacia.

Para el estudio de eficacia, el analisis inicial se basara en la division de los sujetos en 'excretores' y 'no excretores' basandose en la deteccion del virus de la influenza en los lavados nasales. Un estudio de 12 pacientes en cada brazo tendna un poder de 80% (nivel de significacion de 5%) para detectar un cambio de excrecion de 90% en los controles con respecto a solo 16% en el brazo vacunado (es decir, una eficacia de la vacuna superior a 83%). El estudio tendna mayor poder para detectar cambios en la duracion de la excrecion.

Ejemplo 7: Preparacion de vacunas de AdCh que expresan la protema de fusion NP+M1

Generacion de vectores adenovirales que expresan la protema de fusion NP+M1

Los vectores adenovirales de replicacion defectuosa son vectores extremadamente potentes para el suministro de vacunas geneticas. Tambien son vectores seguros ya que solo pueden replicar en lrneas celulares que expresan la protema E1 de adenovirus (p. ej., HEK 293). Infectan celulas de mamferos y expresan el antfgeno insertado, pero no pueden propagarse a otras celulas y causar una infeccion diseminada. Los vectores de Ad pueden producirse en condiciones bPf a gran escala mediante cultivo en celulas 293 y purificacion del virus mediante cromatograffa o centrifugacion en gradiente de cloruro de cesio. Los vectores de Ad son altamente eficaces en la induccion de respuestas de celulas T de novo (Maeda, West et al., 2005).

De los mas de 50 subtipos de adenovirus humanos conocidos, el mas utilizado es el serotipo 5, un adenovirus del subgrupo C (adenovirus humano 5), que induce rapidamente respuestas inmunitarias protectoras de vida prolongada. Es probable que la inmunogenicidad excepcional de estos vectores de Ad refleje su capacidad para expresar altos niveles de productos transgenicos (dirigidos en la mayona de los vectores por el potente promotor de CMV), para activar las celulas del sistema inmunitario innato, para transducir las celulas dendrfticas inmaduras que conducen su maduracion en celulas presentadoras de antfgenos, para lograr una presentacion de antfgenos de larga duracion al no inducir la apoptosis de las celulas transducidas. Sin embargo, la inmunidad anti-adenovirus preexistente y en particular los anticuerpos neutralizadores que reducen la absorcion celular de los vectores adenovirales, puede reducir significativamente las respuestas de la vacuna y representa una limitacion importante para el uso satisfactorio de serotipos comunes de Adenovirus (Fitzgerald, Gao et al., 2003 Shiver 2003). La infeccion adenoviral es endemica en la poblacion humana y mas de 50% de los sujetos humanos tienen anticuerpos neutralizadores del Adenovirus 5. Para superar este obstaculo, se ha construido un gran numero de vectores de Ad del mismo propietario novedosos derivados de chimpances que: i) tienen una baja o nula seroprevalencia en la poblacion humana; ii) pueden cultivarse eficazmente en lrneas celulares productoras derivadas de seres humanos; iii) tienen una potencia inmunologica comparable a la del Adenovirus humano del grupo C en ratones y primates (Solicitud de Patente: "Chimpanzee Adenovirus vaccine carriers". PCT: WO 2005/071093 A2; Prioridad: 2004-

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Los autores de la presente invencion generaran dos vectores de Ad de chimpances que no presentan reactividad cruzada que codifican la fusion NP+M1 de la influenza bajo el control de un promotor fuerte - tal como IE de CMV - y con la secuencia de poliadenilacion (AdCh-NP+MI). Las senales de Kozak y terminacion de latraduccion optimas se introduciran para aumentar la expresion. Los vectores se someteran a ensayo para determinar la productividad, la estabilidad, la capacidad para dirigir la expresion de la fusion NP+M1 tras la infeccion de lmeas celulares susceptibles y la inmunogenicidad en ratones.

Para comprobar la expresion de los antigenos seleccionados, las celulas HeLa se infectaran con los vectores, se prepararan extractos celulares y se analizaran mediante transferencia Western. Para comprobar la estabilidad genetica, el ADN de los clones independientes de los vectores se extraera despues de pases seriados en las lmeas celulares susceptibles y se analizara mediante analisis de restriccion. Se seleccionara a continuacion un vector de Ad para la produccion mediante BPF, despues de que se disponga de informacion sobre estabilidad, rendimiento e inmunogenicidad de los dos constructos.

Produccion y caracterizacion de lotes pre-BPF y BPF de vacunas de adenovirus

Se prepararan y caracterizaran lotes preclmicos y clmicos de vectores de Ad. La produccion del lote de calidad clmica del vector AdCh-NP+MI se realizara en condiciones BPF (Buenas Practicas de Fabricacion). El cultivo de celulas y virus se establecera con el procedimiento Wave Bioreactor® (Wave Biotech), un biorreactor patentado para cultivo celular. En este dispositivo, el cultivo celular se realiza en bolsas de plastico pre-esteriles. Estas bolsas - llamadas Cellbags®- son biorreactores de un solo uso. Este diseno elimina la necesidad de limpieza, esterilizacion y validacion asociada, haciendo de este un sistema ideal para aplicaciones BPF. Se utilizara un sencillo procedimiento de fabricacion que implique la expansion celular en Cellbags®.

Purificacion de un lote BPF de AdCh-NP+M1. El objetivo del desarrollo del procedimiento de purificacion es establecer un procedimiento escalable y rentable capaz de producir adenovirus de alta calidad con bajo contenido de ADN residual (<100 pg/dosis) y altamente infeccioso (<100 pv/UI). Se utilizara un procedimiento altamente robusto y suficientemente bien comprendido utilizando el vector hAd6 (Adenovirus 6 humano) que codifica las protemas no estructurales (NS) del VHC. Se pueden requerir cambios menores (y se podnan aplicar rapidamente) para purificar otros serotipos. Debido a que la suspension celular esta planeada para originarse a partir de biorreactores Wave (2x10 L), los autores de la presente invencion utilizaran el procedimiento de purificacion definido como Procedimiento de Desarrollo Final (PDF) (Figura 4). En resumen, el procedimiento consiste en la lisis con detergente para liberar el vector de Ad de las celulas y potencialmente para inactivar agentes adventicios. Ademas, la presencia de detergente durante todo el procedimiento minimiza la asociacion del virus con el ADN de la celula anfitriona.

A continuacion, el ADN de la lmea celular (HEK 293) se hace precipitar de manera selectiva utilizando un detergente cationico. El producto lisado precipitado se aclara a continuacion mediante filtracion en profundidad. En la siguiente etapa, las protemas de la celula anfitriona, los componentes del virion sin ensamblar, las micelas de detergente y la nucleasa se eliminan parcialmente mediante ultrafiltracion utilizando la filtracion de flujo tangencial. A continuacion se utiliza la cromatograffa de intercambio anionico para purificar el virus a partir de componentes celulares y virales residuales. La etapa final de filtracion de flujo tangencial intercambia el virus al tampon de formulacion y sirve como una etapa de refinado, eliminando de manera eficaz las protemas residuales y el ADN cuando es necesario. A continuacion, se podna utilizar una etapa de cromatograffa de flujo ortogonal para proporcionar una liberacion teorica adicional de priones/virus. La filtracion en condiciones esteriles completa el procedimiento. Se toman muestras del producto purificado para las pruebas de control de calidad y se congela hasta su formulacion.

Pruebas analfticas para lotes BPF de vacunas de Adenovirus. Se desarrollaran pruebas espedficas para comprobar la identidad, la potencia, la pureza y el caracter de la vacuna AdCh-NP+M1, despues del cultivo y la purificacion.

(1) Identidad. La identidad del vector de Ad se confirmara mediante analisis con endonucleasa de restriccion del ADN viral purificado y mediante ELISA de celulas de mairnfero infectadas con virus cultivadas in vitro. Para el analisis de restriccion, el ADN viral digerido se marcara en el extremo con P33-dATP, se fraccionara por tamano mediante electroforesis en gel de agarosa, y se visualizara por autorradiograffa.

(2) Potencia. Se desarrollara un analisis de potencia mediante la tecnologfa QPCR (Reaccion en cadena de la Polimerasa Cuantitativa). Este analisis podna ofrecer las ventajas de precision, rendimiento y simplicidad. La concordancia de este analisis con el analisis DICT50 clasico ya se demostro para los vectores basados en hAd6.

(3) Pureza y residuos. Los lotes BPF se someteran a ensayo para determinar el ADN residual, con un analisis capaz de cuantificar con precision los niveles bajos del ADN de la lmea celular en los graneles de vacunas y en los recipientes finales. El caracter y el funcionamiento de este analisis tienen un interes considerable para los organismos reguladores cuya concurrencia con el uso de la lmea celular susceptible con un fenotipo transformado esta dotada del transgen E1A que proporciona la transcomplementacion requerida para el E1A del vector. Los datos derivados de este analisis se complementaran con estudios que caracterizan el ADN residual para determinar la presencia de secuencias de E1A completas. El enfoque de los autores de la presente invencion para la caracterizacion de las secuencias de E1A completas residuales consiste en centrar el analisis sobre el ADN de los

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graneles antes y despues de la adicion de la nucleasa Benzonasa utilizando la tecnologfa de PCR anidada de un solo tubo para proporcionar una cuantificacion de la multiplicidad de aclaramiento de E1A completa residual.

(4) Caracter. Los adenovirus se caracterizaran por una variedad de metodos virologicos clasicos, incluyendo microscopfa electronica de transmision, sedimentacion por gradiente de densidad, SDS/PAGE. Las preparaciones purificadas deben estar exentas de contaminacion externa por microscopfa electronica, compuesta de partmulas virales esencialmente intactas con un componente menor de capsides virales vadas cuando se analizan por centrifugacion en gradiente de densidad.

Estudios de toxicologfa con vacunas de adenovirus. El lote de BPF de vector de Ad se sometera a ensayo para determinar la seguridad en un panel de analisis que incluiran los que se enumeran a continuacion. Cada estudio implicara la inyeccion intramuscular de la vacuna utilizando una concentracion de aproximadamente 1011 partmulas virales/mL, o la concentracion mas alta que se vaya a utilizar clmicamente.

(A) Distribucion en tejidos en rata. Este analisis esta disenado para investigar la distribucion en el tejido del vector. Se administrara una dosis unica de vector de Ad a un numero constante de ratas inyectando en cada cuadriceps 250 |jl de una suspension que contiene 1011 partmulas virales/ml en cada cuadriceps. Un dfa y 8 dfas despues, los animales seran sacrificados para realizar la evaluacion por necropsia de la distribucion de la vacuna en el tejido. Los niveles de ADN del vector en diversos tejidos se determinaran mediante PCR convencional y PCR cuantitativa con fluorescencia en tiempo real (TaqMan®).

(B) Estudio de toxicidad de dosis unica y repetida en ratas. El analisis esta disenado para investigar la toxicidad potencial que surge de la administracion unica o repetida de la vacuna. Se administraran tres dosis de vector de Ad, separadas 2 semanas entre sf, a un numero constante de ratas inyectando 250 jl de una suspension que contiene 1011 partmulas/ml en cada cuadriceps. Catorce dfas despues de la tercera dosis se realizaran una necropsia completa y un examen histologico, junto con un analisis hematologico.

Optimizacion de la produccion de la vacuna de MVA y preparacion del virus de la influenza

Optimizacion de la produccion de MVA NP+M1.

La vacuna MVA-NP+M1 se construye como anteriormente. Se ha demostrado que esto es inmunogenico en ratones (vease mas arriba). La vacuna se puede producir utilizando fibroblastos de embrion de pollo primarios cultivados en botellas rodantes, con purificacion de la vacuna con almohadilla de sacarosa. Estos son metodos que se han utilizado anteriormente en la tecnica y permiten la optimizacion de un procedimiento escalable. La produccion de la vacuna tambien se puede realizar utilizando una lmea celular inmortal y un procedimiento de purificacion escalable (Filtracion de Flujo Tangencial o FFT). Esto permitira el desarrollo clinico adicional de la vacuna para proceder sin impedimento, y tambien generara material bien caracterizado para su uso en los estudios preclmicos descritos en esta solicitud. El cambio de produccion para utilizar una lmea celular inmortal tiene una clara ventaja ya que el fabricante de la vacuna ya no dependera de un suministro de huevos SPF que podnan no estar disponibles en caso de una infeccion mas extensa por el virus de la influenza aviar en las aves de corral en Europa. La nueva lmea celular, CR-PIX-S esta actualmente en plena calificacion para la fabricacion de vacunas humanas.

Fabricacion de un virus de siembra de trabajo (WSV) derivado de CR-PIX-S

Para el procedimiento de desarrollo se debe fabricar un nuevo virus de siembra de trabajo basado en la Provision de partida de siembra maestra/Solucion de partida de siembra de trabajo (MCS/WCS) CR-S-PIX. El esquema de pases de esa siembra de trabajo debe permitir la fabricacion a gran escala. Para obtener la cantidad necesaria de WSV se debe implementar un pase intermedio entre MSV y WSV. El esquema de pases debe reflejar el procedimiento de fabricacion posterior y corresponder a los ciclos de replicacion necesarios para preparar suficiente virus de siembra.

Numero de pases:

MSV = 1 pase

WSV = 3 pases

Producto final = 4 pases

Desarrollo del procedimiento - Fabricacion aguas arriba.

Para la propagacion de MVA-NP+M1 en celulas CEF o CR-PIX-S se deben utilizar diferentes tecnologfas de cultivo. En IDT la vacuna se fabrica primero en CEF con tecnologfa de botellas rodadoras. La nueva tecnologfa celular utilizando MVA-NP+M1 se basa en el cultivo en suspension. La siguiente tabla resume los problemas:

Parametro

Tecnologfa rodadora con CEF Tecnologfa de suspension utilizando CR-PIX-S Observaciones

Datos disponibles

Los parametros del procedimiento son conocidos Solo se conocen parametros basicos para el crecimiento celular. La replicacion del virus en CR-PIX-S se debe desarrollar y optimizar

Medio de cultivo celular

Crecimiento celular en medio libre de suero Crecimiento celular en medio libre de suero El medio de cultivo celular para el crecimiento celular y la replicacion del virus en CR-PIX-S puede ser optimizado

Densidad celular de siembra diana

1 - 2 x 106 celulas/ml 2 - 6 x 105 celulas/ml Se debe optimizar para CR-PIX-S

Densidad celular objetivo en la infeccion

2 - 5 x 106 celulas/ml 4 - 6 x 106 celulas/ml Se debe optimizar para CR-PIX-S

MOI diana

0,01 -0,1 0,01 -0,1 Se debe optimizar para CR-PIX-S

Tiempo de infeccion (TOI) diana

24h despues de la siembra celular 24 - 48 h despues de la siembra celular Se debe optimizar para CR-PIX-S

Tiempo de cosecha (TOH) diana

42 - 48 h despues de la infeccion 42 - 48 h despues de la infeccion Se debe optimizar para CR-PIX-S

Tamano final del lote de la cosecha del virus para el desarrollo del procedimiento

20 l - 50 l 20 l- 50 l Esta previsto un aumento a escala en la dimension de 20 l - 50 l.

Cosecha de virus diana por celula

10-40 ufp/celula Al menos 10-40 ufp/celula El posible rendimiento viral por celula en cultivo en suspension es TBC.

Evaluacion de ambas tecnologfas:

Parametro

Tecnologfa rodadora (RB) Tecnolog^a de suspension CR-PIX-S Observaciones

Etapas del procedimiento

Preparacion de celulas Siembra de celulas Intercambio de medio Inoculacion de virus Adicion de medio Preparacion de celulas Siembra de celulas Inoculacion de virus Adicion de medio Cosecha de virus Las etapas del procedimiento para las celulas en suspension se pueden disenar asepticamente en sistemas cerrados.

Cosecha de virus

Escala

baja alta El procedimiento de suspension no esta limitado en terminos de escalabilidad

Rendimiento por celula

alto alto

Costes materiales

altos bajos Los costes para el medio de cultivo de celulas RB son 5 x superiores. Los costes para RB son 2 x mas altos

Duracion del procedimiento

72 h 96 h La duracion del procedimiento de suspension es tbc.

Costes totales del procedimiento

altos bajos RB es en terminos de duracion, medio

Costes y costes laborales mas caros.

La evaluacion resumida de los dos procedimientos indica que el procedimiento de suspension es mas escalable y tiene costes de funcionamiento mas bajos. Sin embargo, la tecnologfa de suspension incurre en mayores costes de 5 inversion inicial.

Fabricacion aguas abajo

La tecnologfa existente de botella rodadora se basa en etapas de centrifugacion para la purificacion del producto. Esta tecnologfa de fabricacion es solo modestamente escalable y tiene varias desventajas en terminos de reproducibilidad y diseno aseptico del procedimiento. La tecnologfa mas avanzada se basa en una tecnologfa FFT 10 combinada que incluye la eliminacion de las impurezas de las celulas anfitrionas.

La siguiente tabla resume las diferentes tecnologfas:

Parametro

Tecnologfa de centrifugacion (TC) Tecnologfa FFT (FFT) Observaciones

Datos disponibles

Los parametros del procedimiento son conocidos Se necesita el desarrollo de cosechas de virus derivados de CR-PIX-S y la optimizacion.

Duracion del procedimiento de fabricacion

Al menos 72 h Dependiente de la escala No mas de 48 h El menor tiempo de procesamiento es una ventaja para el procedimiento de TFF para la tecnologfa CR-PIX-S.

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Evaluacion de ambas tecnologfas:

Parametro

Tecnologfa de centrifugacion (TC) Tecnologfa FFT (FFT) Observaciones

Escalabilidad

ninguna sf La evaluacion se revisa para la purificacion de MVA-NP-M1.

Procedimiento aseptico

limitado sf

Reproducibilidad

baja alta

Aceptacion reglamentaria de los estudios de fase III

ninguna sf

Produccion de virus de la influenza para estudios de sensibilizacion

Retroscreen Virology Limited tiene existencias de virus de influenza BPF adecuadas para estudios de sensibilizacion en seres humanos. El virus utilizado para la sensibilizacion es del subtipo H3N2, es sensible al oseltamiviry ya se ha administrado de forma segura a 200 personas. Se necesitara mas virus para los estudios de sensibilizacion descritos anteriormente, y este se producira utilizando el lote BPF existente como solucion de partida de siembra, en una planta de fabricacion de BPF poseida y administrada por la Universidad de Oxford. Los huevos embrionados SPF seran adquiridos de un proveedor reconocido (Charles River) e inoculados con el virus. Despues de la incubacion durante varios dfas, el contenido de los huevos se eliminara, se centrifugara para eliminar el material solido y se sellara en viales esteriles. Un huevo producira hasta 20 viales de virus. Se produciran doscientos viales de virus para la sensibilizacion, ademas un extra para permitir la prueba de control de calidad de la preparacion. Esta incluira la titulacion en celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK), pruebas de esterilidad y deteccion de virus adventicios. Para el uso en estudios de sensibilizacion, el virus se diluira en solucion salina (una vez que se conozca el tftulo, la cantidad de dilucion requerida se puede determinar exactamente pero es probable que sea del orden de 1 en 100) y se aplicara gota a gota en la nariz de los voluntarios.

Estudios preclmicos en ratones y primates no humanos

Estudios de inmunogenicidad de Adenovirus y MVA, incluyendo estudios de sensibilizacion, en ratones.

• Examinar la induccion de inmunidad duradera por los vectores de MVA y Ad (AdCh-NP+MI) que expresan NP+M1 individualmente y en los regfmenes de inmunizacion de induccion-refuerzo de AdCh-NP+M1/MVA- NP+M1

• Examinar la induccion de inmunidad protectora duradera en ratones no expuestos previamente por vectores de MVA y Ad que expresan NP+M1 despues de la inmunizacion de dosis unica y en el regimen de inmunizacion de induccion-refuerzo AdCh-NP+MI/MVA y desarrollar el control basado en la PCR

• Someter a ensayo las vacunas en ratones que han sido previamente expuestos a una cepa de influenza heterosubtfpica, para evaluar la capacidad de las vacunas para restablecer la inmunidad protectora en los ratones previamente expuestos.

• Examinar la induccion de proteccion de subtipo cruzado por estas vacunas contra una cepa de influenza altamente patogena.

• Optimizar el suministro de la vacuna a traves de parches transdermicos

Es bien conocida la capacidad de las vacunas de adenovirus de replicacion deficiente y MVA que expresan muchos antfgenos diferentes para inducir respuestas de celulas T frente a los antfgenos codificados, y hay muchos ejemplos en la bibliograffa de regfmenes de induccion-refuerzo utilizando estos vectores de vacunas virales en ratones, asf como en primates no humanos y humanos. Esta parte del estudio permitira a los autores de la presente invencion evaluar multiples regfmenes de vacunacion en ratones, examinar la duracion de la inmunidad protectora, someter a ensayo la inmunidad heterosubtfpica, identificar correlaciones de inmunidad protectora en ratones y llevar a cabo una evaluacion del potencial de la utilizacion de parches de microagujas para el suministro transdermico de vacunas vectorizadas virales.

Los virus de la influenza no son patogenos naturales de los ratones, sin embargo, una infeccion localizada en el tracto respiratorio se observa facilmente en el plazo de 24 horas desde la infeccion murina. La mayor parte del trabajo en modelos murinos hasta la fecha ha utilizado experimentos de induccion y sensibilizacion utilizando dos subtipos de influenza A; A/PR8/34 (PR8, H1N1) y A/HKx31 (HKx31, H3N2) en ratones C57/BL6J o BALB/c. HKx31

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es relativamente avirulenta y es un redistribuidor de laboratorio de PR8 y A/HK/168 que expresa HA y NA de A/HK/168 y los seis genes internos de PR8 mas virulento. Este virus redistribuido no puede, por lo tanto, ser neutralizado por los anticuerpos contra la HA y la NA de PR8 (H1N1) y la proteccion cruzada esta mediada por inmunidad a los antigenos internos. El modelo de sensibilizacion respiratorio se caracteriza por una neumoma aguda, transitoria y localizada, con aclaramiento del virus en torno al dfa 10 despues de la infeccion. La viremia esta localizada en el sistema respiratorio y no hay replicacion viral en otros tejidos (Doherty y Christensen 2000). Los ratones infectados con PR8 y sensibilizados intranasalmente un mes despues con HKx31 aclaran el virus 1-2 dfas antes que los ratones no sensibilizados previamente y demuestran solo una perdida de peso transitoria. El modelo de sensibilizacion respiratoria con influenza de raton, utilizando infecciones heterosubtipicas primarias y secundarias, ha sido ampliamente utilizado para comprender las caractensticas de las celulas T CD8+ efectoras y de memoria (Flynn, Riberdy et al., 1999, Doherty y Christensen 2000, Kedzierska, La Gruta et al., 2006). La poblacion de celulas T CD8+ de memoria, inducida por infeccion primaria, se contrae a lo largo de 3 semanas despues de la infeccion primaria hasta 10% de su nivel maximo (Flynn, Riberdy et al., 1999).

Esta poblacion de memoria es muy estable y se conserva indefinidamente, aunque a muy bajas frecuencias en el pulmon, el tracto respiratorio (medido en el lavado broncoalveolar [BAL]) y el tejido linfoide, con niveles mas altos que no se han contrafdo en el mismo grado en el bazo (Hogan, Usherwood et al., 2001). La presencia de la respuesta de las celulas T CD8+ de memoria generada por infeccion primaria por virus o por vacunacion puede mediar la recuperacion de HKx31 (Flynn, Riberdy et al., 1999), o la proteccion limitada contra la infeccion por H7N7 (Christensen, Doherty et al., 2000) cuando esta sensibilizacion ocurre un mes despues de la infeccion primaria. Aunque la poblacion CD8+ de memoria, generada por una infeccion viral primaria, se mantiene durante largos penodos de tiempo, la eficacia frente a la sensibilizacion heterosubtfpica disminuye con el tiempo; ratones inmunes sensibilizados 20 semanas despues de la infeccion primaria muestran tttulos virales similares en el pulmon a ratones desafiados no sensibilizados previamente (Liang, Mozdzanowska et al., 1994). La exposicion secundaria al virus da como resultado la proliferacion clonal masiva y la distribucion de las celulas T CD8+ de memoria a los tejidos linfoides y no linfoides, incluyendo el pulmon, el hugado y la medula osea (Flynn, Riberdy et al., 1999; Kedzierska, La Gruta et al., 2006).

La fuerza de la respuesta de las celulas T de memoria y su capacidad para controlar y aclarar una sensibilizacion secundaria pueden verse afectadas por la eleccion de la ruta y la dosis del virus primario (Liang, Mozdzanowska et al., 1994; Flynn, Riberdy et al. 1999). Este estudio determinara, en un modelo murino, si las respuestas de celulas T suficientemente fuertes y duraderas son inducidas por vacunacion con MVA y adenovirus de simio que expresan NP y M1, en lugar de por infeccion, que protegeran de manera cruzada contra los subtipos estacionales y virulentos del virus de la influenza, y si la inmunidad protectora puede ser inducida por dosis repetidas de la misma vacuna (refuerzo homologo) o requiere una inmunizacion de induccion-refuerzo heterologa para conseguir inmunidad protectora. Esto es relevante para el desarrollo clmico de las vacunas para su uso en individuos sin sensibilizacion previa por influenza.

Examinar la induccion de la inmunidad duradera por vectores MVA y de Ad que expresan NP+M1 en dosis unica y en regfmenes de inmunizacion de induccion-refuerzo AdCh-NP+M1/MVA-NP+M1

Los estudios iniciales estableceran la inmunogenicidad de una unica inmunizacion con las vacunas AdCh-NP+M1 y MVA-NP+M1. Los autores de la presente invencion definiran el regimen de refuerzo de adenovirus homologo mas potente, asf como el examen del regimen de vacunas de induccion-refuerzo heterologo de los cuatro regfmenes de vacuna heterologos en ratones C57/BL6J no sensibilizados previamente utilizando el primer adenovirus de chimpance para la induccion seguido de un refuerzo de MVA (AdChA/MVA), el segundo adenovirus de chimpance con MVA (AdChB/MVA); o induccion-refuerzo de adenovirus (AdChA/AdChB y AdChB/AdChA) heterologo. Los experimentos de inmunogenicidad inicial se centraran en el examen, por medio de tincion de citoquinas intracelulares y analisis de citometna de flujo, de las respuestas de celulas T en el bazo y el pulmon a los antfgenos NP y M1 en ratones vacunados con las vacunas individuales y con estrategias de induccion-refuerzo. Los autores de la presente invencion han encontrado previamente que las vacunas basadas en adenovirus pueden inducir respuestas a epftopos CD4+ y CD8+ adicionales que no se detectan despues de la inmunizacion por vacunas basadas en poxvirus. Los autores de la presente invencion examinaran esto mediante la estimulacion de las celulas del bazo in vitro, a partir de ratones inmunizados con vacunas simples o de induccion/refuerzo, con reservas de peptidos solapantes de los antfgenos NP y M1 completos y elucidacion de la amplitud y dominancia de la respuesta inmunitaria. La magnitud y cinetica de las celulas T efectoras y de memoria central inducida por la vacunacion se evaluara por citometna de flujo utilizando marcadores fenotfpicos de uso comun, por ejemplo, CD27, CD43, CD62L, CCR7, CD127 e IL-2.

Examinar la induccion de la inmunidad protectora duradera por vectores de MVA y Ad que expresan NP+M1 en dosis unica y regfmenes de inmunizacion de induccion-refuerzo AdCh-NP+M1/MVA-NP+M1 y desarrollar un control basado en la PCR

La induccion de inmunidad protectora por las vacunas vectorizadas virales individuales y por regfmenes de induccion-refuerzo se evaluara en ratones no sensibilizados previamente. Los autores de la presente invencion compararan la proteccion inducida por estas vacunas con el modelo de sensibilizacion con virus de la influenza heterosubtipico bien caracterizado (Doherty y Christensen 2000), utilizando la cepa A/HKx31 (HKx31, H3N2) para

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infectar ratones. Se realizaran estudios de sensibilizacion rigurosos utilizando una inoculacion intranasal de una dosis alta (2 x 106 DICTso/raton) del virus de la influenza, cepa A/PR8/34 (PR8, H1N1) un mes despues de la vacunacion o despues de la infeccion con una infeccion heterosubtipica primaria usando la cepa A/HKx3l (HKx31, H3N2).

Los autores de la presente invencion examinaran la durabilidad de la proteccion llevando a cabo la sensibilizacion 10-15 semanas despues de la vacunacion o la infeccion post primaria. La proteccion contra la sensibilizacion se controlara midiendo los tttulos de virus en el pulmon en la fase aguda despues de la sensibilizacion (dfas 1-14). Los autores de la presente invencion tambien examinaran la expansion y el fenotipo de las poblaciones de celulas T despues de la sensibilizacion y su re-distribucion en BAL y pulmon. Se tomaran muestras de los bazos, los ganglios linfaticos mediastmicos y el BAL al mismo tiempo que se cosechan los pulmones para los analisis de titulacion del virus despues de la sensibilizacion. Los autores de la presente invencion investigaran si la vacunacion da como resultado una aparicion mas rapida de celulas T espedficas del antigeno (CD4+ y CD8+) en el BAL y los ganglios linfaticos mediastmicos en comparacion con la infeccion viral primaria, que generalmente infiltran el pulmon alrededor de los dfas 5-7 dfas despues de la infeccion intranasal por influenza (Flynn, Riberdy et al., 1999). Los tftulos de virus pulmonar, de tejidos recolectados en los dfas 1-12 se utilizaran para medir el aclaramiento de virus en ratones infectados. En algunos experimentos, las secciones de tejido pulmonar de ratones inmunizados sensibilizados seran examinadas histologicamente para detectar cualquier signo de inmunopatologfa, un riesgo teorico de las respuestas de celulas T CD8+ muy potentes al virus de la influenza.

La PCR cuantitativa en tiempo real de genomas virales se establecera como un metodo alternativo a los metodos de titulacion de virus tradicionales en celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK) como una medida de la infeccion por virus. Los experimentos iniciales normalizaran estos metodos, de manera similar a las publicaciones anteriores en el sistema modelo de sensibilizacion rigurosa (Atmar, Baxter et al., 1996). Los autores de la presente invencion han demostrado previamente que un metodo de PCR cuantitativa para el control de la infeccion de malaria es altamente sensible y puede traducirse a grandes estudios clmicos en el campo (Andrews, Andersen et al., 2005). Por lo tanto esta tarea a) identificara los regfmenes de vacunas que induzcan una proteccion duradera en ratones no sensibilizados previamente frente a una exposicion rigurosa con subtipos de virus de influenza que se usan comunmente como modelo de infeccion en seres humanos b) establecen la cinetica de la infeccion y el aclaramiento del virus en ratones vacunados, no sensibilizados previamente y expuestos previamente, c) identificar las correlaciones de la proteccion inducida por la vacuna y d) verificar y normalizar un metodo rapido y robusto de control de la infeccion y el aclaramiento del virus que puede trasladarse a otras sensibilizaciones por influenza descritas en la presente memoria.

En los experimentos de sensibilizacion inicial se evaluara la desviacion tfpica y el nivel de significacion y se realizaran calculos de potencia para identificar el tamano de muestra requerido para detectar una eficacia de la vacuna de 80% en comparacion con los ratones no vacunados de control. Los autores de la presente invencion procuraran minimizar el numero de animales utilizados mientras se utilizan numeros adecuados para obtener datos estadfsticamente significativos, maximizando la cantidad de datos utiles de cada animal. Por lo tanto, este estudio de inmunogenicidad y sensibilizacion debe aportar valiosos conocimientos sobre la capacidad de estas vacunas basadas en MVA y adenovirus para inducir fenotipos inmunitarios espedficos y sobre como los subconjuntos de celulas T inducidas por la vacuna contribuyen a prevenir o aclarar una infeccion del tracto respiratorio.

Someter a ensayo las vacunas en ratones que han sido previamente expuestos a una cepa de influenza heterosubtfpica, para evaluar la capacidad de las vacunas para restablecer la inmunidad protectora en ratones previamente expuestos.

La mayor parte de la inmunogenicidad de la vacuna de influenza preclmica y los estudios de sensibilizacion se evaluan en ratones no sensibilizados previamente que pueden no reflejar con precision la situacion clmica de los adultos inmunizantes que poseen respuestas de celulas T de memoria a la influenza. Los autores de la presente invencion van a examinar estos problemas y comparar sus resultados con los generados por las pruebas clmicas descritas en esta solicitud, con el objetivo de optimizar un modelo de raton adecuado para someter a ensayo la capacidad de las vacunas para reforzar las respuestas de celulas T adquiridas por la exposicion natural. Se establecera un modelo de preexposicion en la tarea 2. Los ratones se infectaran intranasalmente con una dosis baja de la cepa HKx31 de influenza A como modelo de la preexposicion humana natural. Las respuestas de celulas T en el bazo, los ganglios linfaticos mediastmicos y los pulmones se evaluaran a corto (10 dfas) y largo (8 y 15-20 semanas) plazo despues de la infeccion para establecer una respuesta inmunitaria basal despues de la infeccion primaria. Los ratones inmunes a HKx31 seran sensibilizados mucosalmente con una dosis alta de PR8 a las 8, 15 y 20 semanas para establecer cuando se pierde la proteccion. Esto establecera la longevidad de la proteccion contra la sensibilizacion heterosubtfpica; de acuerdo con los hallazgos publicados, la proteccion contra la sensibilizacion en algunos sistemas modelo se pierde aproximadamente 20 semanas despues de la infeccion primaria (Liang, Mozdzanowska et al., 1994). En esta tarea, los ratones expuestos previamente seran vacunados con las vacunas individuales y con el regimen de induccion-refuerzo mas inmunogenico en el momento en que la proteccion haya disminuido.

Las respuestas de celulas T efectoras y de memoria se examinaran 2 y 8 semanas despues de la inmunizacion de la manera descrita para los ratones no sensibilizados previamente. Tambien se analizaran la magnitud y el fenotipo de

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las celulas T en tejido de pulmon y BAL. En comparacion con los ratones no sensibilizados previamente, se espera que la magnitud de la respuesta en todos los tejidos sea mayor en los ratones previamente expuestos y las respuestas deben ser detectadas en el tejido pulmonar y BAL. Los ratones vacunados previamente expuestos y los ratones no vacunados previamente expuestos se someteran a una sensibilizacion rigurosa con la cepa PR8 de influenza A a las 8 o 20 semanas de la inmunizacion para identificar la eficacia protectora y la durabilidad de estos regfmenes de vacuna. Finalmente, los autores de la presente invencion correlacionaran el fenotipo de las celulas T que responden con su distribucion linfoide o no linfoide con la proteccion contra la sensibilizacion heterosubtipica en animales vacunados previamente expuestos y no sensibilizados previamente para definir una correlacion de la proteccion dentro del compartimento de celulas T. El resultado de este estudio demostrara que vacunas pueden inducir una inmunidad protectora, duradera en un entorno de preexposicion.

Examinar la induccion de la proteccion de subtipo cruzado por estas vacunas contra una cepa de influenza altamente patogena.

Una vacuna de subtipo cruzado altamente eficaz sena una poderosa herramienta para combatir una epidemia o pandemia de influenza. En este estudio, los autores de la presente invencion examinaran la capacidad de las vacunas basadas en MVA-NP+M1 y AdCh-NP+MI para proteger a los ratones contra una sensibilizacion altamente virulenta con influenza A. Los virus de influenza equina muestran una alta virulencia en los ratones, comparable a la que resulta de la infeccion por la influenza aviar (H5N1) (Epstein, Kong et al., 2005), sin embargo, los virus de la influenza equina pueden ser manejados en una instalacion de bioseguridad de nivel 2, en comparacion con la bioseguridad de nivel 3+ para la influenza aviar (Christensen, Doherty et al., 2000, Epstein, Kong et al., 2005). Por lo tanto, los autores de la presente invencion planean determinar si la vacuna mas prometedora, que demuestra la mayor eficacia en animales no sensibilizados previamente y expuestos previamente, tambien puede inducir inmunidad protectora contra la influenza equina altamente virulenta. La morbilidad y la mortalidad se utilizaran como criterios de valoracion en un estudio inicial. En un estudio de seguimiento, se examinara el control de la replicacion del virus y la eliminacion del virus en ratones inmunizados con el regimen de vacuna mas protector, identificado en el experimento inicial.

Suministrar la vacuna a traves de parches transdermicos

Las vacunas vectorizadas virales que se van a utilizar en este estudio se administran por inyeccion intradermica o intramuscular. Sin embargo, los autores de la presente invencion tambien evaluaran el uso de parches transdermicos para suministrar estas vacunas. Este metodo de suministro tiene el potencial de simplificar en gran medida la administracion de la vacuna. Se preve que en ultima instancia los parches previamente preparados se podnan fabricar con la vacuna cargada sobre los parches. Para su uso se aplicaran a continuacion a la piel del vacunado, haciendolos adecuados para su uso en ninos o en zonas donde hay escasez de profesionales sanitarios capaces de administrar inyecciones. Se ha demostrado que el suministro transdermico de plasmidos de ADN es posible utilizando parches de microagujas disenados a medida. Estas matrices de microagujas se fabrican a partir de silicio o polfmero y tienen tfpicamente de 90-290 pm de longitud; suficiente para penetrar en el estrato corneo impermeable, la capa externa de la piel, sin ser demasiado profundas para penetrar en los receptores del dolor en la dermis. Cuando se aplica el parche de microagujas a la piel, se crean micro-canales que permiten que los farmacos y las vacunas de plasmido de ADN sorteen el estrato corneo. Se ha demostrado que el antfgeno codificado por el ADN suministrado transdermicamente se expresa en la piel humana ex vivo (Birchall, Coulman et al., 2005). En los estudios preliminares que han realizado los autores de la presente invencion, han realizado observaciones in vivo similares utilizando vectores de virus, lo que demuestra que el suministro transdermico tiene un gran potencial como una estrategia de vacunacion simple y eficaz. Se sabe que tanto las vacunas de adenovirus como vectorizadas con MVA son altamente inmunogenicas cuando se suministran por via intradermica, haciendolas particularmente adecuadas para este tipo de suministro. Los estudios iniciales compararan las respuestas inmunitarias en ratones inmunizados por parche transdermico o inmunizacion intradermica, utilizando ambos tipos de vectores de vacunas virales. A contimuacion se podna llevar a cabo un estudio clmico para replicar los hallazgos en seres humanos.

Estudios de inmunogenicidad de las vacunas de adenovirus reforzadas con el adenovirus heterologo o con MVA en primates no humanos

Los estudios de inmunogenicidad se realizaran en macacos Rhesus. Los autores de la presente invencion seguiran un enfoque de dos etapas. Esto permitira reducir al mmimo el numero de animales experimentales. Ademas, los autores de la presente invencion tendran la posibilidad de comparar 2 vectores de Ad diferentes y 3 diferentes estrategias de induccion-refuerzo heterologas con solo 5 grupos de 3 macacos.

En la Etapa 1 los autores de la presente invencion realizaran un estudio de respuesta de dos dosis con cada uno de los dos diferentes vectores AdCh-NP+M1 (AdChA-NP+M1; AdChB-NP+M1). Todos los experimentos se llevaran a cabo en animales sanos que seran previamente evaluados para determinar la presencia de inmunidad pre-existente contra los vectores de Ad. El programa de inmunizacion se basara en dos inyecciones intramusculares en la semana 0 y en 4 de cada uno de los dos vectores, administrados a dosis de 109 y 1010 pp de cada vector:

Se inscribiran 12 macacos Rhesus y se dividiran en 4 grupos de 3 animales:

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- El Grupo 1 incluira 3 animales que recibiran AdChA-NP+M1a 109 partfculas virales totales/dosis en la semana 0 y 4

- El Grupo 2 incluira 3 animales que recibiran AdChA-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 0 y 4

- El Grupo 3 incluira 3 animales que recibiran AdChB-NP+M1 a 109 partfculas virales totales/dosis en la semana 0y4

- El Grupo 4 incluira 3 animales que recibiran AdChB-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 0 y 4

El seguimiento de la inmunogenicidad se realizara a las 2, 4, 6, 8 semanas de la primera vacunacion. Estos datos diran cual es el vector AdCh-NP+M1 mas potente.

En la Etapa 2, los autores de la presente invencion utilizaran el vector mas potente para el experimento con MVA, a la dosis mas alta:

- El Grupo 5 incluira 3 animales que recibiran el AdCh-NP+MI mas potente a 1010 partfculas virales totales/dosis en las semanas 0 y 4 y MVA a 2 x 108 ufp/dosis en la semana 24

El seguimiento de la inmunogenicidad se realizara en la semana 0, 4, 8, 12, 18, 24, 27, 32, 40 y 48 despues de la primera vacunacion. El ensayo de inmunogenicidad mas importante sera a las 2, 4, 6, 8, 27 semanas. La respuesta efectora pico se produce una semana despues del refuerzo de MVA, por lo tanto, el ensayo se realizara a las 27 y no a las 28 semanas en este experimento.

Paralelamente, los autores de la presente invencion reforzaran los grupos inducidos en la Etapa 1 con el AdCh- NP+M1 heterologo a la dosis mas alta en la semana 24:

- Los 3 animales del Grupo 1 - que recibieron AdChA-NP+M1 a 109 partfculas virales totales/dosis en las semanas 0 y 4 - recibiran AdChB-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 24

- Los 3 animales del Grupo 2 - que recibieron AdChA-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en las semanas 0 y 4 - recibiran AdChB-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 24

- Los 3 animales del Grupo 3 - que recibieron AdChB-NP+M1 a 109 partfculas virales totales/dosis en la semana 0 y 4 - recibiran AdChA-NP+M1a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 24

- Los 3 animales del Grupo 4 - que recibieron AdChB-NP+M1 a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 0 y 4 - recibiran AdChA-NP+M1a 1010 partfculas virales totales/dosis en la semana 24

El seguimiento de la inmunogenicidad se realizara en las semanas 12, 18, 24, 26, 28, 32, 40 y 48 despues de la primera vacunacion. En este caso, el ensayo de inmunogenicidad mas importante sera en las semanas 24, 26, 28.

Se recogeran muestras de sangre de los animales antes de la vacunacion para aislar suficientes PBMC y sueros con el fin de utilizarlos como muestras de referencia durante el curso del estudio para que las respuestas a la vacuna puedan evaluarse mejor en comparacion con una referencia. Tambien se realizara un escrutinio de vectores virales (serologfa de adenovirus) antes de la vacunacion. Los ensayos incluiran los siguientes analisis: ELISA, ELIspot IFNy, Tincion Intracelular de Citoquinas (ICS) IFNy, Tetramero de Clase I del MHC, proliferacion de celulas T.

Estudios de inmunopatologfa tras la exposicion al virus de la influenza en macacos rhesus

El objetivo de esta parte del estudio es examinar la seguridad de la presencia de una fuerte respuesta de celulas T a los antfgenos de la influenza en el momento de la infeccion con influenza. La evaluacion inmunopatologica se realizara en macacos rhesus. Los autores de la presente invencion compararan la seguridad de las vacunas, el desarrollo de respuestas inmunitarias celulares (ICS), la expulsion y liberacion virales y la patologfa en los tejidos respiratorios en tres grupos de animales. Todos los experimentos se llevaran a cabo en animales sanos previamente seleccionados para determinar la ausencia de respuestas inmunitarias a los vectores virales que se van a utilizar (AdCh, asf como MVA). Se evaluaran dos regfmenes de vacunacion, asf como un grupo de control no vacunado.

El Grupo 1 incluira 6 animales que recibiran dos inyecciones intramusculares de AdCh-NP+M1 en las semanas 0 y 4 con una dosis inmunogenica optima como se establece en los estudios de inmunogenicidad. Estos animales seran reforzados con MVA-NP+M1 en la semana 24 (regimen altamente inmunogenico).

El Grupo 2 incluira 6 animales que recibiran dos inyecciones intramusculares de AdCh-NP+M1 en las semanas 20 y 24 con una dosis inmunogenica optima como se establece en los estudios de inmunogenicidad (regimen moderadamente inmunogenico). El Grupo 3 incluira 6 animales que no recibiran inyecciones (ninguna respuesta a los antfgenos de la gripe).

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La inmunogenicidad se analizara en celulas estimuladas ex vivo por citoquinas intracelulares y tincion con marcador de superficie. Se incluiran los siguientes: CD3, CD4, CD8, IFN-y, IL-2, IL-5, IL-10, IL-17, TNF-a, perforina y granzima. Las evaluaciones de inmunolog^a para los grupos 1 y 3 se realizaran en muestras tomadas en las semanas 0, 2, 4, 6, 20, 24, 26 y cuando se sacrifiquen. Para el grupo 2 se realizaran evaluaciones de inmunologfa en muestras obtenidas en las semanas 20, 24, 26 y cuando se sacrifiquen.

La seguridad se evaluara en cada inmunizacion mediante la inspeccion de los sitios de inyeccion (eritema y edema), asf como la qmmica clmica (rinon, hngado, protemas y electrolitos) y la hematologfa (recuento de globulos rojos, recuento de globulos blancos y diferenciacion). Las muestras para la qmmica clmica y la hematologfa se tomaran en el momento de la vacunacion y 1 dfa despues de la vacunacion, la inspeccion de los sitios de inyeccion tambien se llevara a cabo en estos puntos temporales.

Todos los animales seran sensibilizados por instilacion intratraqueal de 107 DICT del virus de sensibilizacion en la semana 26.

Los hisopos nasales y farmgeos se recogeran los d^as 2, 4 y 10 despues de la sensibilizacion. Los hisopos se analizaran para determinar el tttulo de virus utilizando metodos virologicos convencionales.

Todos los animales seran sacrificados el dfa 10 despues de la infeccion, se llevara a cabo una necropsia completa con especial atencion a la patologfa respiratoria. Las laminas histologicas seran preparadas a partir de una variedad de tejidos respiratorios (nasales, farmgeos, asf como varias muestras de los pulmones) y evaluadas por un patologo veterinario entrenado.

Estudios clmicos con vacunas AdCh y MVA

Aumento a escala de la dosis de la fase I con AdChNP+M1

Esto examinara la seguridad e inmunogenicidad de AdChNP+M1 en seres humanos y servira tambien para determinar la dosis que se vaya a utilizar en el estudio de Fase IIa descrito mas adelante.

Este estudio seguira el mismo enfoque que el planificado para un estudio de aumento de la dosis en la Fase I con AdCh63 que expresa un antfgeno de malaria. Ambos estudios tendran lugar en el Centre for Clinical Vaccinology and Tropical Medicine, Oxford, donde se han llevado a cabo de manera satisfactoria muchos otros estudios de Fase I y Fase IIa. El estudio de la vacuna contra la malaria sera un estudio de Primeros Ensayos en Ser Humano ("First Time in Man") para una vacuna vectorizada con adenovirus de simio de replicacion defectuosa. En la actualidad se esta buscando la aprobacion reguladora y etica para este estudio (a partir de abril de 2007) aunque despues de las discusiones preliminares con el MHRA se espera que el permiso sea concedido. Se espera que el estudio tenga lugar durante el segundo semestre de 2007. Si se requieren mas informacion o medidas de seguridad, esta informacion se tendra en cuenta al solicitar permiso para el estudio de AdChNP+M1, y los datos de seguridad del estudio de la vacuna contra la malaria se utilizaran para apoyar el estudio de la vacuna contra la gripe.

Grupos de Estudio

Este sera un estudio abierto de aumento de dosis de Fase 1 en voluntarios sanos. Habra 4 grupos de estudio, cada uno con 8 voluntarios. El reclutamiento de grupos sera secuencial.

Observaciones

Las observaciones que se documentaran son el pulso, la presion arterial y la temperatura.

Analisis de sangre

Se extraera sangre para las siguientes pruebas de laboratorio:

1. En Oxford Radcliffe Hospitals NHS Trust Laboratories, utilizando los procedimientos convencionales del NHS:

• Hematologfa; Recuento de sangre completa

• Bioqmmica; Sodio, Potasio, Urea, Creatinina, Albumina, Pruebas de funcion hepatica, Glucosa

• Serologfa diagnostica; Anticuerpos de adenovirus, HBsAg, anticuerpos de VHC, anticuerpos contra el VIH (se proporcionara asesoramiento antes de la prueba de sangre para estos virus transmitidos por la sangre)

• Inmunologfa; Tipificacion de antfgeno leucocitario humano (HLA)

2. En los laboratorios de investigacion de la Universidad de Oxford:

• Inmunologfa Exploratoria; Se realizaran analisis Elispot ex vivo para determinar el interferon gamma.

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Se pueden llevar a cabo, a discrecion de los investigadores, otros analisis inmunologicos exploratorios, incluyendo analisis Elispot para interleuquina-2, analisis de citometna de flujo, analisis de anticuerpos y factor de necrosis tumoral alfa. Estos pueden incluir estudios de expresion genica.

Analisis de orina

La orina se sometera a ensayo para el escrutinio de protemas y glucosa. Para mujeres voluntarias solamente, se sometera a ensayo la orina para determinar gonadotropina corionica beta-humana (HCG) en el escrutinio e inmediatamente antes de cada vacunacion.

Vacunas

Antes de cada vacunacion, se revisara la elegibilidad continuada del voluntario. Se administrara la vacuna, se cubrira el sitio de inyeccion con un aposito esteril y el voluntario permanecera en el CCVTM durante media hora, en caso de eventos adversos inmediatos. Las observaciones se tomaran 30 minutos despues de la vacunacion y se retirara el aposito esteril y se inspeccionara el sitio de la inyeccion. Se entregara un termometro oral, cinta metrica y tarjeta de diario a cada voluntario, con instrucciones de uso.

El grupo 1 recibira una dosis unica de 1 x 108 pv

El grupo 2 recibira una dosis unica de 1 x 109 pv

El grupo 3 recibira una dosis unica de 1 x 1010 pv

El grupo 4 recibira una dosis unica de 5 x 1010 pv

Siguiendo las nuevas pautas de MHRA, en cada grupo, el primer voluntario sera vacunado 48 horas antes que cualquier otro voluntario para evitar un evento adverso grave previamente insospechado que afecte a multiples voluntarios. El voluntario sera vacunado intradermicamente y luego observado durante 30 minutos antes del alta. Los autores de la presente invencion vistaran a este voluntario a las 48 horas y despues, siempre que no haya problemas de seguridad, vacunaran a otros 2 voluntarios de este grupo de dosificacion. Estos voluntarios seran visitados despues de 48 horas. Si todavfa no hay problemas de seguridad, entonces vacunaran a los 5 miembros restantes de la cohorte. Todos los voluntarios recibiran el numero de telefono y de buscapersonas de los investigadores y se les animara a contactar con los investigadores si hay algun problema. Los investigadores estaran disponibles las 24 horas del dfa.

La respuesta de celulas T efectoras y de memoria a los antfgenos NP y M1 se determinara utilizando peptidos solapantes en analisis Elispot (tanto ex vivo como en celulas cultivadas) en la muestra de sangre de escrutinio del voluntario y en una muestra adicional tomada el dfa de la inmunizacion. Las visitas de seguimiento tendran lugar los dfas 2, 14, 28, 90. Los voluntarios seran evaluados para determinar eventos adversos locales y sistemicos, usando una tarjeta de diario, historia intermedia, examen ffsico y analisis de sangre en los momentos temporales indicados en el programa de asistencia. Tambien se tomara sangre para analisis de inmunologfa exploratoria, incluyendo analisis Elispot de IFN-y ex-vivo y cultivado, asf como citometna de flujo. Se ha logrado un progreso sustancial hacia analisis de calidad BCLP completos para estas respuestas de celulas T. Para los epftopos seleccionados, se dispone de tetrameros de tipos de HLA de clase I y estos se utilizaran para fenotipificar las celulas T CD8+ inducidas. Los autores de la presente invencion evaluaran la reactividad cruzada de subtipos reuniendo peptidos que estan completamente conservados entre los subtipos H3N2, H1N1 y H5N1 y elaborando reservas espedficas de los subtipos para permitir la cuantificacion de reacciones cruzadas entre subtipos.

La seguridad sera evaluada por la frecuencia, incidencia y naturaleza de los eventos adversos y eventos adversos graves que surjan durante el estudio. Despues de cada intervalo de dosis se llevara a cabo una revision de seguridad. Esta sera interna y consistira en una revision de todos los efectos adversos en voluntarios antes de proceder al siguiente intervalo de dosificacion. Finalmente, se revisaran los datos de seguridad e inmunogenicidad y se elegira una dosis para el estudio de fase IIa.

Se describen dos estudios de sensibilizacion de influenza de Fase IIa, empleando cada uno una unica vacunacion con MVA-NP+M1 o AdChNP+M1, a la dosis determinada durante los estudios de fase I para cada vacuna.

Estudios de sensibilizacion

El concepto de infeccion de voluntarios se inicio en la Unidad de Resfriado Comun, Salisbury en 1948 (Tyrrell y Fielder 2002). Se alojaron grupos de 20 a 30 voluntarios en edificios con vigilantes separados y se aislaron ffsicamente tanto del personal como de los otros voluntarios. Se ha establecido una unidad de cuarentena en Londres capaz de infectar hasta 100 voluntarios (Fries, Lambkin et al., 2004).

La eficacia protectora de las vacunas MVA-NP+M1 y AdCh-NP+M1 se sometera a ensayo en un estudio de sensibilizacion con seres humanos. El analisis de esta prueba debe proporcionar una prueba de principio.

Se preparara un protocolo de pruebas clmicas para todo el estudio, incorporando informacion de las pruebas de fase

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I con las dos vacunas. La aprobacion etica y reglamentaria se obtendra del comite de etica correspondiente (local) y de la agencia nacional de licencias, la Agencia Reguladora de Medicamentos y Productos Sanitarios. Para cada estudio se reclutaran 30 jovenes voluntarios sanos. Estos seran seleccionados para asegurar bajos tftulos de anticuerpos anti-gripe. A los voluntarios se les administrara una dosis unica de la vacuna (dosis determinada durante los estudios de fase I) o de un placebo, y a continuacion se sensibilizaran con una dosis infecciosa para seres humanos de 0,50 a 0,75 dos semanas mas tarde. Esto producira smtomas clmicos en aproximadamente 50-75% de los voluntarios. Se controlaran los signos clmicos completos, sistemicos y locales.

Se tomaran muestras de sangre y fluidos orales e hisopos de garganta para determinar la recuperacion del virus diariamente (muestras de lavado nasal) y despues de la sensibilizacionn (p. ej., 9-10 dfas). Las muestras de sangre, lavado nasal y fluido oral se utilizaran en los ensayos inmunologicos mas relevantes identificados durante los estudios de fase I. Las respuestas de celulas T y de anticuerpos a todos los antfgenos de influenza se mediran en todos los voluntarios, para obtener una mayor comprension de la respuesta inmunitaria aguda a la infeccion por gripe.

Se llevara a cabo analisis serologicos (p. ej. HI, SRH, VN, MN, ELISA).

Todos los voluntarios seran tratados con oseltamivir al final de la prueba y seran devueltos a la unidad 2 semanas y 6 meses despues para chequeos medicos y se recogeran muestras de sangre, lavado nasal y fluido oral para investigar la respuesta inmunitaria utilizando analisis inmunologicos apropiados.

Los datos clmicos y las muestras inmunologicas de estos estudios se utilizaran para evaluar la eficacia protectora de las nuevas vacunas. Las pruebas clmicas cubriran la brecha entre los estudios clmicos y preclmicos y permitiran someter a ensayo la prueba de principio en seres humanos. Al analizar los datos obtenidos los autores de la presente invencion seran capaces de evaluar la capacidad de una respuesta de celulas T a NP y M1 para reducir tanto la expulsion y liberacion virales como los smtomas de la enfermedad. Estos datos les permitiran evaluar el impacto que las nuevas vacunas podnan tener si fueran ampliamente desplegadas.

Ejemplo 8: Fabricacion y ensayo de lotes clmicos

Se ha fabricado un lote clinico. Los ensayos de control de calidad revelan que cumple con las expectativas. Los autores de la presente invencion presentan los resultados de los diversos analisis realizados.

En particular, este ejemplo presenta un analisis de identidad y pureza de MVA-NP+M1. MVA-NP+M1 fue fabricado por IDT como se describe en la presente memoria. En este ejemplo, la muestra de ensayo era el lote 010907, (llenado en humedo) vial 12.

Seccion experimental:

Se llevaron a cabo analisis de PCR para determinar la identidad y la pureza del lote clmico fabricado por IDT, (lote 010907) del vial 12 de MVA-NP+M1.

Procedimiento:

Los analisis se realizaron de acuerdo con SOP FM001. Se realizaron tres reacciones de PCR, para detectar NP+M1, o protema fluorescente roja (RFP), o virus de tipo salvaje, en cinco muestras cada uno.

Muestra

Descripcion Producto de PCR esperado con

Peso

RFP NP+M1

Muestra de ensayo

Muestra de ensayo

- - +

MVA tipo salvaje

Control + - -

MVA-Rojo

Control - + -

MVA-NP+M1

Control - - +

Agua destilada esteril

Control - - -

La Figura 5 muestra los resultados de los experimentos de PCR. Ejemplo 9: Inmunogenicidad del lote clinico

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El lote clmico de MVA-NP+M1 fabricado como se ha indicado anteriormente se examino utilizando un analisis de inmunogenicidad. Con mas detalle, se sometio a ensayo MVA-NP+M1 fabricado por el Lote 010907 de IDT, (llenado en humedo) vial 12.

Seccion experimental:

Se llevo a cabo un ELISPOT de IFN-y de raton para determinar la inmunogenicidad del lote clmico fabricado por IDT (lote 010907) del vial 12 de MVA-NP+M1.

Procedimiento:

Se vacunaron cuatro ratones por via intradermica con 107 ufp de MVA-NP+M1 (llenado en humedo) producido por el Lote num. 010907 de IDT. Catorce dfas mas tarde los ratones fueron sacrificados y los bazos cosechados para un analisis IFN-y ELISPOT realizado de acuerdo con SOP FM003.

El fondo se definio como el numero de celulas formadoras de manchas (UFM) por millon de esplenocitos observadas cuando las celulas fueron estimuladas solamente con 10% de MEM (MEM + 10% FCS + 1% L-Glut + 1% Pen-strep).

Resultados:

Las celulas se cultivaron en placas por duplicado para cada raton y se sometieron a recuento los pocillos que conteman 5 x 105 celulas. Esto se utilizo a continuacion para calcular las UFM medias/millon de esplenocitos.

Medios Peptido de la gripe Gripe neta

M1

32 219 187

M2

51 190 139

M3

56 257 201

M4

37 246 209

Promedio

44 222 184

DT

11 30 31

Conclusion:

El analisis de potencia demostro que el Lote 010907 fabricado por IDT provocaba una respuesta inmunitaria fuerte, con un numero medio de celulas formadoras de manchas por millon de esplenocitos en el analisis ELISPOT mayor de 15, y no mas de un raton que no respondiera de los cuatro sometidos a ensayo. El ftmite inferior de deteccion del analisis es de 5 manchas por millon de esplenocitos. Los datos ilustrativos se muestran en la Figura 6.

Ejemplo 9: Estudios adicionales de inmunogenicidad

Los autores de la presente invencion tambien demuestran respuestas inmunitarias a los epftopos tanto de NP como de M1 en ratones.

En este ejemplo, se utilizo una dosis unica de 106 ufp. La administracion fue intradermica.

Las respuestas inmunitarias se evaluaron mediante el ELISPOT de bazo a los 14 dfas:

NP: TYQRTRALV M1: LYRKLKREI

Los resultados se muestran en la Figura 7 que ilustra que se generan respuestas inmunitarias a epftopos espedficos dentro de las diferentes partes de material compuesto (NP/M1) del inmunogeno de acuerdo con la presente invencion.

Ejemplo 10: Estudios clmicos adicionales

El primer voluntario se va a vacunar 24 h antes de continuar con el resto del grupo

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Los otros voluntarios vacunados el mismo dfa pueden ser vacunados a partir del mismo vial (en el grupo 1)

- el numero maximo vacunado de un vial es probable que sea 3

Cada grupo probablemente sera vacunado durante un penodo de varias semanas

- debido a las limitaciones de reclutamiento

- los autores sugieren un maximo de tres vacunados por dfa para mayor seguridad

• se encuentran disponibles cuatro becarios de investigacion clrnica y una enfermera de investigacion si se encuentran disponibles varios voluntarios el mismo dfa

- Se utilizara el registro de delegacion

• Se incluyen el ensayo para MVA wt en QC

• La preparacion de CEF primarios es convencional en la fabricacion de la vacuna y el QC completo se incluye en las celulas, asf como el virus.

• Estudio de tox de dos dosis de BPL

- cada dosis es de 1,5 x 107 ufp

- el IMP fue bien tolerado

- ningun animal mostro reacciones adversas al IMP

• Solo FCS Norteamericano utilizado en la preparacion del virus recombinante

- no se utiliza FCS durante la fabricacion BPF

• Los voluntarios no seran evaluados para determinar la infeccion actual por la gripe A.

Ejemplo 11: Estudio de Fase IIa

• Cuando la prueba de fase I demuestra buena seguridad e inmunogenicidad de MVA-NP+M1

- sigue un futuro estudio de vacunacion y sensibilizacion (Fase IIa)

• La dosis para la fase IIa se elige basandose en los resultados de la Fase I

• Los voluntarios van a ser escrutados para determinar anticuerpos contra la gripe de baja patogenicidad,

- controles y vacunados sensibilizados con H3N2

- respuestas de Ab y de celulas T a todos los antfgenos de la gripe que se van a controlar en todos los participates antes y despues de la sensibilizacion

• Tambien se puede llevar a cabo la Fase IIb (infeccion por exposicion natural).

Ejemplo 12: Inmunogenicidad para todos los inmunogenos

Se llevaron a cabo experimentos similares a los presentados en los ejemplos precedentes (tales como los Ejemplos 8 y 9) sobre un conjunto completo de peptidos solapantes en ratones.

Identificacion de nuevos epftopos de celulas T inducidos por MVA-NPM1:

Los autores de la presente invencion han demostrado que la vacuna MVA-NPM1 puede inducir respuestas de celulas T a epftopos de celulas T dominantes en NP y M1. Para examinar la amplitud de la respuesta inmunitaria y para examinar si esta vacuna puede inducir respuestas de celulas T a nuevos epftopos, se inmunizaron ratones hembra C57/BL6 o Balb/c con 1 x 107 ufp/ml de MVA - NPM1. La amplitud de la respuesta inmunitaria se evaluo dos semanas despues de una unica inmunizacion mediante la reestimulacion de las celulas del bazo con una matriz de reservas de peptidos solapantes (Tobery et al., J. Imm. Methods, 2001, 254, 59-66) en un analisis ELISPOT de IFN- Y. Ademas de los epftopos previamente sometidos a ensayo (vease mas arriba) en ratones Balb/c, 12 epftopos en Np y 8 epftopos en M1 fueron reconocidos por las celulas T de ratones inmunizados con MVA-NPM1. En ratones C57/BL6 las celulas T respondieron a 4 epftopos en NP y 2 epftopos en M1.

Los resultados de este experimento con matriz demuestran en dos cepas diferentes de ratones que (i) el constructo NPM1 es inmunogenico, (ii) se induce una amplia respuesta de celulas T y (iii) se induce una respuesta de celulas T a las protemas NP y M1. De ese modo se demuestra la efectividad de la invencion.

Los datos demuestran que la invencion produce una respuesta amplia contra ambos antigenos en dos cepas de ratones.

Asf, en general, los datos presentados en la presente memoria sobre el producto clmico de la invencion demuestran una inmunogenicidad excelente, muestran que la secuencia del inserto esta confirmada, demuestran la presencia de 5 antfgeno y la ausencia de MVA de tipo salvaje confirmada e ilustran que la vacuna es geneticamente estable.

Diversas modificaciones y variaciones de los aspectos y realizaciones descritos de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica. Aunque la presente invencion se ha descrito en conexion con realizaciones preferidas espedficas, debe entenderse que la invencion se define en las reivindicaciones.

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion adecuada para inducir una respuesta inmunitaria mediada por celulas T frente a un virus de la influenza en un vertebrado, comprendiendo dicha composicion un vector viral que comprende acidos nucleicos que codifican epftopos de protemas internas del virus de la influenza, en donde dicho vector viral es un vector de MVA, en donde dicha composicion comprende un acido nucleico que codifica al menos dos de dichos epftopos, siendo al menos un epftopo de cada una de dos o mas protemas internas del virus de la influenza, en donde dichas protemas internas comprenden nucleoprotema y protema 1 de la matriz, en donde dichos epftopos se proporcionan en forma de una fusion de nucleoprotema - protema 1 de la matriz, en donde dichas protemas internas proceden del subtipo A/Panama/2007/99 de la cepa de la influenza H3N2, para su uso en el refuerzo de las respuestas de celulas T preexistentes contra la influenza.
2. 2. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dichas protemas estan dispuestas en el orden extremo N - nucleoprotema - protema 1 de la matriz - extremo C.
3. 3. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde dicha nucleoprotema y protema 1 de la matriz estan separadas por una secuencia conectora.
4. 4. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicha secuencia conectora tiene la secuencia de aminoacidos GGGPGGG.
5. 5. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde la secuencia codificante de la secuencia de acido nucleico que codifica dichas protemas internas y/o polipeptidos conectores ha sido optimizada para los codones para el uso de codones humanos.
6. 6. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde dichos epftopos se proporcionan en forma de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1.
7. 7. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde dichos epftopos estan codificados por un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos del SEQ ID NO: 2.
8. 8. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que comprende adicionalmente un coadyuvante.
9. 9. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que induce respuestas de celulas T a los antfgenos tanto NP como M1.
10. 10. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde dichas respuestas de celulas T son respuestas de celulas T CD8+.
11. 11. El uso de una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparacion de un medicamento para reforzar las respuestas de celulas T preexistentes contra la influenza.
12. 12. Un kit que comprende una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para reforzar las respuestas de celulas T de memoria preexistentes a la influenza.

    Figura 1

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    Inmunogenicidad de MVA-NP+M1 en r atones balb/c

    imagen1

    120D

    10M

    pepbao

    sin

    600

    pepbao

    gnpe

    2W

    MVA

    ADM

    MVA

    Regimen

    Respuesta neta en ELISPOT de bazo

    100

    imagen2

    Figura4

    Procedimiento Purificacion (PDF)

    Suspension celular biorreactor (20 L)

    a

    Li sis Triton [in svfrr)

    4

    Precipitacion detergente [in srfrr)

    A

    Filtracion profunda

    £

    Ultrafiltracion.'Tratamiento nucleasa

    (20X Concentration nucleasa (15 U/mL Benzonase™) Diafiltracion

    4

    Cromatograffa Intercambio Anionico

    $

    Ultrafiltracion

    4

    Crofirsiogratfs CrtogorrsJ flt^'o-drrecfo psra sc^ramrerrio prionfis'nai

    4

    Filtracion Esteril

    3

    ~10L* particulas virales

    l 2 3 4 5 6 7 S 91011 12 13 14 15 16 17 IS 19 20

    imagen3

    1 SmarlLadder

    2 wl PCR: Ensayo

    3 wtPCFL: wtMVrt

    4 M PCR: MV A

    5 wt PCR: MVA-

    5 wPCtt: destilado

    7 bianco a RFP PCR:

    5 RFP PCR: *1

    10 RFP PCR: MVA

    11 RFP PCR: MVA-

    12 RfP'PCfi: destilado

    13 bianco 19 bianco

    14 NP1-M1 PCR: 20 NEB 100kb

    15 RP*Mt PCR: wl 15 NP^Ml PCR: MVA \7 RP-1M1 PCR: MVA-

    15 WP+MlPCR: destilado

    HKUIl1! I

    Inmunogenicidad de MVA Gripe

    sqo

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    W ~k..

    50

    Medio

    Peptido gripe

    imagen4

    Epftopo NP

    -----------------------------------------------------------------------------------,

    Respuestas tanto a NP como a M1

    ufm/millon celulas

    m.

    SW»':

    Epitopo M1