ES2625479T3 - Composición para la reparación de tejido cartilaginoso y un método de producción de la misma - Google Patents

Abstract

Un método de producción de una composición para la reparación del tejido cartilaginoso, que comprende las etapas de (a) disolver fibrinógeno liofilizado en una solución de aprotinina: (b) disolver trombina liofilizada en una solución estabilizante; (c) mezclar una solución de colágeno enriquecido con la trombina y la solución estabilizante; y colocar la solución de fibrinógeno (a) en un lado de un kit dual y la solución (c) que contiene el colágeno en el otro lado y después mezclar (a) y (c), en donde el tiempo de gelificación después de mezclar (a) y (c) es de 3 minutos y la tensión máxima es superior a 10 N medida con un reómetro CR-500DX, en donde la concentración de fibrinógeno varía de 35 a 55 mg/L, la concentración de solución de aprotinina es 1500 KIU/mL, la concentración de trombina es 29,41 IU/mL, la concentración de la solución estabilizante es 0,65 mg/mL, y la concentración de colágeno es 13,23 mg/mL, en donde la solución estabilizante se prepara por la adición de cloruro de calcio al medio de cultivo DMEM para cultivo de células de cartílago y el medio de cultivo DMEM comprende sales, aminoácidos y vitaminas.

Description

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DESCRIPCION

Composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso y un metodo de produccion de la misma Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso y a un metodo de produccion de la misma, mas precisamente, se mezclan biomateriales, tales como colageno y fibrina para permitir que el tejido cartilaginoso danado sea reparado hasta un estado que permite el trasplante sobre el tejido, y se induce una regeneracion eficiente, haciendo posible de este modo reducir la tension relacionada con la cirugfa en las personas y los animales, a la vez que se induce la reparacion y regeneracion del cartflago de modo relativamente rapido y eficiente, y, como resultado, haciendo posible mejorar sustancialmente la calidad y la fiabilidad del producto y causar una buena impresion a los pacientes.

Descripcion de la tecnica relacionada

El cartflago articular que se encuentra en muchas superficies de articulaciones es un material extremadamente resbaladizo y brillante que funciona para reducir la friccion y la resistencia al desgaste de las articulaciones durante el funcionamiento de las articulaciones. La friccion del cartflago articular se incrementa cuando el cartflago articular esta danado, y los cartflagos articulares se desgastan y erosionan, y aparecen el dolor y los trastornos funcionales, y el dano del cartflago en la articulacion se convierte en osteoartritis. Las causas de los danos del cartflago son traumatismos tales como cafdas, golpes directos o fuerza de giro, o enfermedades tales como artritis, osteonecrosis, artritis inflamatoria u osteocondritis disecante, y los smtomas son dolor, edema, y bloqueo. Durante decenas de anos, se han realizado muchos estudios para la regeneracion fisiologica del cartflago articular para tratar el dano del cartflago articular y se han utilizado diversos tratamientos.

Sin embargo, segun las publicaciones, hasta ahora, se utiliza un tratamiento comun tal como una terapia ffsica o un tratamiento con farmacos para el tratamiento del dano del cartflago articular debido a que los tejidos del cartflago articular no se pueden regenerar. Se utilizan tratamientos quirurgicos y no quirurgicos. Las compresas calientes y fnas y medicamentos tales como los AINE, y la inyeccion intraarticular de esteroides son ejemplos del tratamiento no quirurgico que solamente alivia los smtomas y no debilita la enfermedad. Procedimientos reparadores tales como desbridamiento, microfractura, artroplastia de perforacion/abrasion, trasplante osteocartilaginoso autologo, implantacion de condrocitos, y sustitucion del cartflago articular son ejemplos del tratamiento quirurgico.

Recientemente, hay varios intentos de un tratamiento quirurgico en el que se aplican biomateriales sobre la region defectuosa del cartflago.

Los biomateriales son compatibles con el cuerpo humano y no presentan ningun rechazo. Estos biomateriales pueden reemplazar o regenerar el tejido y los organos danados hasta tejido normal y organos normales. Por lo tanto, ha aumentado la atencion que se presta a los biomateriales que se pueden utilizar para reemplazar o regenerar el tejido y los organos danados.

El cuerpo humano rechaza el material extrano en su cuerpo. Por lo tanto, la sustitucion de una parte de un organo humano con otros materiales es muy diffcil. Los biomateriales contribuyen al progreso de la cirugfa medica porque los biomateriales tienen afinidad biologica con el cuerpo humano.

Hay dos tipos de biomateriales, biomateriales sinteticos y naturales que se pueden utilizar para la fabricacion de dispositivos medicos de implantacion para diagnostico y tratamiento.

Los metales, materiales inorganicos, ceramicas, polfmeros sinteticos pertenecen a los biomateriales sinteticos que no presentan rechazo, pero que no tienen vitalidad.

Se han desarrollado y comercializado biomateriales naturales, tales como fibrina, colageno, acido hialuronico y quitosano.

Los materiales que forman el cuerpo humano y mantienen la vida son polfmeros y celulas biologicos. Los polisacaridos y protemas que se encuentran en el cuerpo humano son ejemplos representativos. Si no tienen ningun rechazo inmunitario, pueden estar en un estado similar a un estado natural y esperado para la regeneracion de organos humanos que tienen la funcion de crecimiento. Los tejidos naturales se pueden utilizar para un biomaterial medico que puede conferir funciones biologicas a los materiales polimericos inorganicos y sinteticos. La biocompatibilidad entre los tejidos circundantes y los biomateriales inorganicos trasplantados en un cuerpo humano puede ser establecida por los tejidos naturales, y ademas, los tejidos naturales pueden conferir funciones biologicas a los biomateriales inorganicos.

La fibrina biocompatible y biodegradable se utiliza como un adhesivo natural y un agente antihemorragico. La fibrina es absorbida en varias semanas durante la cicatrizacion de las heridas. Se ha descrito que la fibrina no tiene efectos secundarios tales como inflamacion, respuesta inmunitaria, necrosis del parenquima, e hipertrofia de las fibras.

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La fibrina que tiene una forma de soporte natural para las celulas fibroblastos tiene un papel importante en la cicatrizacion de las heridas.

La concepcion de productos de fibrina se establecio en la decada de 1970 y el primer producto industrial de fibrina fue comercializado en Europa en 1982 y se ha seguido comercializando hasta ahora. Estudios recientes han demostrado que la fibrina se puede utilizar como soporte para la ingeniena tisular, y la optimizacion se lleva a cabo en varios campos de la medicina, tales como ortopedia, dentistas, y neurocirugfa.

El colageno es un grupo de protemas y se encuentra en la dermis, tendones/ligamentos, vasos sangumeos, huesos y cartflagos. Un tercio de la protema total de los mairnferos es colageno.

Se han descrito mas de 20 tipos diferentes de colageno, entre ellos la cantidad de colageno tipo I que se encuentra en la piel, tendones/ligamentos y huesos es aproximadamente el 90 % del colageno total.

El colageno esta compuesto de una triple helice, cuyo peso molecular es 300.000 dalton (100.000 dalton cada helice). El aminoacido mas pequeno glicina se encuentra en cada tercera posicion (-GXY-; X e Y son otros aminoacidos) de la molecula de colageno. Por lo tanto, la glicina total en el colageno es un tercio de los aminoacidos totales. El colageno tiene hidroxiprolina y el contenido de hidroxiprolina es el 10 % de los aminoacidos totales. La hidroxiprolina se utiliza para el analisis cuantitativo de colageno.

El colageno se utiliza en diversos campos de la medicina, tal como un astringente, aposito para heridas, vascular artificial, y agentes para reduccion de arrugas. El primer astringente de colageno Aviten que tiene forma de polvo extrafdo de la piel de vaca se desarrollo en 1974 y se sigue utilizando hasta ahora.

Hay 3 modos de uso del colageno como materia prima. Se utilizan colageno puro, colageno procesado que se procesa a traves de un procedimiento acelular/descelular de tejido, y colageno alterado.

El colageno puro tiene baja resistencia a la traccion, por lo que no se recomienda su utilizacion para suturas, a pesar de su alta estabilidad y pureza. El colageno tiene una resistencia a la traccion y al desgarro mas baja que otros polfmeros, de modo que se anaden al colageno otros materiales tales como GAG o polfmeros sinteticos biocompatibles (PGA/pLa) para mejorar su resistencia.

El colageno tiene muchas ventajas tales como baja antigenicidad, alta biocompatibilidad, y bioabsorbabilidad, adhesion de celulas, crecimiento celular, induccion de la diferenciacion celular, coagulacion sangumea, efecto astringente, y biocompatibilidad con otros polfmeros.

Sin embargo, las propiedades y caractensticas ffsicas para mantener el volumen son inferiores y el colageno puro es caro.

La fibrina tiene propiedades moderadas en volumen, elasticidad y adhesividad, y tambien tiene efecto astringente. Por lo tanto, la fibrina es un biomaterial eficaz para la reparacion y regeneracion del tejido cartilaginoso.

El cartflago articular es un tejido avascular y sin nervios, y tiene una capacidad muy limitada de autocicatrizacion a diferencia de los otros tejidos mesenquimatosos. Por lo tanto, uno de los objetivos de la presente invencion es proporcionar nutrientes que se utilizan para la regeneracion del tejido cartilaginoso mediante la adicion de componentes del medio para el cultivo de condrocitos.

Cuando el tejido del cartflago de una articulacion es danado una vez, no se puede regenerar normalmente en el cuerpo. El paciente sufre limitaciones en su vida diaria con dolor intenso, y cuando este se convierte en cronico induce a una osteoartritis fatal que hace que la vida normal del paciente se haga imposible. Hay mas de 500.000 casos de artroplastia y de cirugfa de sustitucion de una articulacion completa en los Estados Unidos y Europa, respectivamente.

Por lo tanto, es necesario un procedimiento sencillo para el tratamiento de la region defectuosa del cartflago mediante el uso o el trasplante de biomateriales tales como colageno y fibrina. Estos metodos de tratamiento de la region defectuosa del cartflago son muy eficaces en la etapa temprana del dano del cartflago. Y cuando dicho tratamiento se lleva a cabo en la fase precoz del dano del cartflago, el numero de pacientes que necesitan cirugfa de sustitucion de rodilla se puede reducir. Mediante este tratamiento preventivo se reducira tambien el numero de osteoartritis.

En el pasado, no se ha descrito ninguna composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso mediante el uso de biomateriales tales como colageno y adhesivo de fibrina ni los metodos para aplicarlos en el tratamiento.

El documento WO 2005/060987 A1 se dirige a una composicion terapeutica para el cartflago que comprende una mezcla de condrocitos, y trombina y una matriz de fibrinogeno que contiene fibrinogeno. El documento WO 01/37889 A2 se dirige a un material sustituto del hueso, que comprende una matriz blanda, celulas vivas y una matriz de curacion.

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Sumario de la invencion

La presente invencion se destina a resolver los problemas de la tecnica anterior. El primer objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso, compuesta de una solucion de fibrinogeno y aprotinina, trombina y una solucion estabilizante, y una solucion de colageno. El segundo objetivo es la regeneracion eficaz del tejido cartilaginoso danado mediante una forma trasplantable compuesta de biomateriales tales como colageno y fibrinogeno. Este tratamiento reduce la carga de la cirugfa, y se induce la regeneracion y restauracion de la region defectuosa del cartflago. El tercer objetivo es que este metodo constituya un tratamiento sencillo de la posible region defectuosa del cartflago. El cuarto objetivo es la reduccion del numero de pacientes que requieren cirugfa de una articulacion gracias al tratamiento precoz de la region defectuosa del cartflago. El quinto objetivo es la reduccion del numero de pacientes que requieren cirugfa de una articulacion gracias al tratamiento preventivo. El sexto objetivo es proporcionar una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso y un metodo de preparacion de la composicion, para que la mejor calidad y fiabilidad del producto transmita una buena imagen a los pacientes.

Para alcanzar los objetivos, la presente invencion proporciona un metodo de preparacion de una composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso, que comprende las etapas de (a) disolver fibrinogeno liofilizado en una solucion de aprotinina; (b) disolver trombina liofilizada en una solucion estabilizante; (c) mezclar una solucion de colageno enriquecido con la trombina y la solucion estabilizante; y colocar la solucion de fibrinogeno (a) en un lado de un kit dual y la solucion (c) que contiene la solucion de colageno en el otro lado, y despues mezclar (a) y (c), en donde el tiempo de gelificacion despues de la mezcla de (a) y (c) es de 3 minutos y la tension maxima es superior a 10 N, cuando se mide con un reometro CR-500DX, en donde la concentracion de fibrinogeno vana de 35 a 55 mg/L, la concentracion de la solucion de aprotinina es 1500 KlU/mL, la concentracion de trombina es 29,41 lU/mL, la concentracion de la solucion estabilizante es 0,65 mg/mL, y la concentracion de colageno es 13,23 mg/mL, en donde la solucion estabilizante se prepara por la adicion de cloruro de calcio al medio de cultivo DMEM para el cultivo de las celulas de cartflago, y el medio de cultivo DMEM comprende sales, aminoacidos y vitaminas.

La presente invencion proporciona la regeneracion efectiva de tejido cartilaginoso danado mediante una forma trasplantable compuesta de biomateriales tales como colageno y fibrinogeno, y este metodo reduce la carga de la cirugfa, e induce la regeneracion y restauracion rapida y eficaz de la region defectuosa del cartflago.

La presente invencion proporciona un metodo sencillo para el tratamiento de la region defectuosa del cartflago.

La presente invencion proporciona la reduccion del numero de pacientes que requieren cirugfa de una articulacion gracias al tratamiento precoz de la region defectuosa del cartflago.

Ademas, la presente invencion proporciona la reduccion del numero de pacientes que necesitan cirugfa de una articulacion gracias al tratamiento preventivo.

La presente invencion proporciona una mejor calidad y fiabilidad del producto que transmite una buena imagen a los pacientes.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 presenta un metodo de produccion de una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso segun la presente invencion.

La figura 2 presenta una fotograffa de aplicacion del kit dual que contiene la composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso segun la presente invencion.

La figura 3 presenta una fotograffa de aplicacion de la composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso segun la presente invencion a una region defectuosa del cartflago de un animal (cerdo).

La figura 4 presenta fotograffas que muestran las observaciones visuales de los resultados experimentales de una aplicacion de la composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso segun la presente invencion a una region defectuosa del cartflago de un animal (conejo).

La figura 5 presenta fotograffas que muestran las observaciones histopatologicas de los resultados experimentales de una aplicacion de la composicion para la reparacion de tejido cartilaginoso segun la presente invencion a una region defectuosa del cartflago de un animal (conejo).

Las figuras 6A y 6B presentan fotograffas de gelificacion de una solucion segun la presente invencion y segun la tecnica anterior, respectivamente.

Las figuras 7A y 7B presentan fotograffas con microscopio de fluorescencia de la viabilidad de las celulas del cartflago.

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Descripcion detallada de la invencion

De aqu en adelante, se describiran las realizaciones de la presente invencion en detalle con las figuras adjuntas.

En las figuras 1-5 se muestran una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso y un metodo de preparacion de la composicion segun la presente invencion, y las aplicaciones de los mismos.

Cuando una explicacion detallada referida a una tecnica y configuracion tecnica relacionadas conocidas confunde innecesariamente el sentido general de la presente invencion, se omite la explicacion detallada.

Las definiciones en la presente invencion se deben interpretar a partir de los contenidos de la presente invencion debido a que los terminos pueden ser interpretados segun la intencion del productor o del usuario.

En primer lugar, la presente invencion proporciona un material solido utilizando biomateriales tales como colageno y fibrinogeno, y tambien proporciona la preparacion y el uso de una solucion estabilizante que aporta nutricion a un entorno para la regeneracion del cartflago, y despues proporciona una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso que se prepara siguiendo varias etapas.

En detalle, las etapas para la preparacion de una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso se componen de:

(a) disolver el fibrinogeno liofilizado en una solucion de aprotinina;

(b) disolver la trombina liofilizada en una solucion estabilizante;

(c) mezclar una solucion de colageno enriquecido con la trombina y la solucion estabilizante;

y poner la solucion de fibrinogeno (a) en un lado de un kit dual y la solucion (c) que contiene el colageno en el otro lado, y despues mezclar (a) y (c),

en donde el tiempo de gelificacion despues de mezclar (a) y (c) es de 3 minutos y la tension maxima es superior a 10 N, medida con un reometro CR-500DX,

en donde la concentracion de fibrinogeno vana de 35 a 55 mg/mL, la concentracion de la solucion de aprotinina es 1500 KlU/mL, la concentracion de trombina es 29,41 lU/mL, la concentracion de la solucion estabilizante es 0,65 mg/mL, y la concentracion de colageno es 13,23 mg/mL

en donde la solucion estabilizante se prepara por la adicion de cloruro de calcio al medio de cultivo DMEM para el cultivo de celulas de cartflago, y el medio de cultivo DMEM comprende sales, aminoacidos y vitaminas,

e inyectar en el tejido cartilaginoso danado.

La solucion estabilizante tiene un contenido de cloruro de calcio de 0,26 mg/mL.

La concentracion final de cloruro de calcio en la solucion estabilizante vana de 0,1 a 0,5 mg/mL.

Y la concentracion final de cloruro de calcio en la composicion para reparacion de tejido cartilaginoso vana de 2,78 a 3,12 mg/mL.

La produccion de la solucion estabilizante en la presente invencion se explica en detalle a continuacion.

- Se anade cloruro de calcio al medio de cultivo DMEM utilizado en el cultivo de condrocitos para preparar la solucion estabilizante. El medio de cultivo DMEM contiene sales, aminoacidos y vitaminas. La concentracion de cloruro de calcio vana de 0,2 a 6 mg/mL.

- La concentracion final de cloruro de calcio en el colageno y la solucion estabilizante vana de 0,1 a 0,5 mg/mL.

- La concentracion de cloruro de calcio en la solucion estabilizante se determina por el tiempo de gelificacion y el intervalo de tension maxima. El tiempo de gelificacion es de 3 minutos y la tension maxima es superior a 10 N.

- El intervalo mmimo de la solucion estabilizante es el intervalo mmimo utilizado para las condiciones de cultivo, y 0,5 mg/mL de cloruro de calcio es el intervalo maximo probado para la estabilizacion. La concentracion final de cloruro de calcio utilizada en el adhesivo de fibrina comercial vana de 2,78 a 3,12 mg/mL, lo que afecta a las celulas.

El colageno concentrado se prepara como sigue;

Es preferible utilizar colageno altamente enriquecido.

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El colageno (a menos de 5 mg/mL) se esteriliza utilizando un filtro de 0,22 pm y despues se concentra con manipulacion aseptica.

El peso molecular del colageno es aproximadamente 300.000 dalton, y la longitud de la molecula de colageno es aproximadamente 300 nm de modo que la filtracion es diffcil cuando la concentracion de colageno es superior a 5 mg/mL.

El colageno se concentra en el intervalo de 5 a 100 mg/mL.

La concentracion de colageno empieza a 5 mg/L y es posible continuar hasta 100 mg/mL (concentracion soluble y medible).

Se utiliza dialisis y diafiltracion para la concentracion de colageno, o se utiliza un metodo de centrifugacion a pH y temperatura determinados. El colageno concentrado se pone en una jeringa para su uso posterior.

La mezcla de colageno, fibrinogeno, y solucion estabilizante se ilustra en la figura. 2.

- Se disuelve el fibrinogeno liofilizado contenido en un producto adhesivo de fibrina en 2 cm3 de solucion de aprotinina y despues se pone la solucion en una jeringa.

- Se disuelve la trombina liofilizada en 2 cm3 de solucion estabilizante y despues se pone la solucion en una jeringa de 0,4 cm3.

- Se mezcla la solucion concentrada de colageno (al 3 %, 3 cm3) con la solucion de trombina, y despues se pone la solucion en una jeringa de 2 cm3.

- Se colocan la solucion de fibrinogeno/aprotinina y la solucion de colageno/trombina en un kit dual y despues se aplican a la region defectuosa del cartflago.

- Hay diferentes productos de fibrinogeno (adhesivo de fibrina) comercializados en varios pafses, y los productos utilizados en Corea se listan en la tabla 1.

Tabla 1

Nombre de producto

GreenPlast

Beriplast Tissucol/Tisseel

Fabricacion

Green Cross ZLB Behring GmbH Baxter AG

Pafs

Republica de Corea Alemania Austria

Factor de coagulacion

Fibrinogeno de plasma humano mg/mL 71,5~126,5 65~115 70~110

Trombina de plasma humano

IU/mL 400~600 400~600 500

Factor XIII de plasma humano

U/mL 44~88 40~80 10~50

Catalizador de coagulacion

Cloruro de calcio mg/mL 5,56~6,24 5,9 5,88

Inhibidor de trombolisis

aprotinina KIU/mL 1000 1000 3000

Tambien estan disponibles en otros pafses, Hemassel (Canada), Quixil (Israel), Bolheal (Japon), Biocol (Francia), y Vanguard (Estados Unidos).

Las realizaciones de una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso y un metodo de produccion de la misma se explican como sigue.

En primer lugar, la presente invencion proporciona biomateriales tales como colageno y fibrina que se mezclan con el fin de permitir que el tejido cartilaginoso danado sea reparado hasta un estado que permite el trasplante sobre el tejido, y se induce una regeneracion eficiente, lo que hace posible reducir el estres relacionado con la cirugfa en las personas y en los animales, a la vez que se induce la reparacion y regeneracion relativamente rapida y eficiente del cartflago. De aqrn en adelante, se describiran en detalle las realizaciones de la presente invencion.

Realizacion 1

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Un metodo para aplicar colageno y adhesivo de fibrina a una region defectuosa del carfflago de un animal (objetivo: confirmar la posibilidad de una aplicacion de colageno y adhesivo de fibrina a una region defectuosa del carfflago de un cerdo).

- Una vez que se ha fijado la pata del cerdo sobre un soporte, se dana el carfflago mediante un taladro (2 x 1,5 cm2).

- Se llenan Thera Fill (colageno enriquecido) y Greenplast (adhesivo de fibrina) en la region defectuosa del carfflago. El metodo de llenado es como sigue.

1) Abrir el Greenplast y anadir despues el fibrinogeno a una solucion de aprotinina mediante inyeccion.

2) Anadir una trombina liofilizada a una solucion de calcio.

3) Mezclar 0,1 mL de solucion de trombina/calcio con 1 cm3 de Thera Fill utilizando un adaptador.

4) Las soluciones 1) y 3) se colocan en un kit dual y despues se aplican a la region defectuosa del carfflago. Despues de la aplicacion, se observa la region defectuosa del carfflago durante 15 minutos.

(Resultado: despues de la aplicacion de Thera Fill/adhesivo de fibrina a la region defectuosa del carfflago, se forman materiales solidos antes de 10 minutos y los materiales solidos tienen buenas caracteffsticas para los profesionales sanitarios. Vease la figura 3)

Realizacion 2

Un experimento de aplicacion de colageno y adhesivo de fibrina a una region defectuosa del carfflago de un conejo (objetivo: confirmar la regeneracion del carfflago del conejo utilizando colageno y adhesivo de fibrina).

Una vez que se ha inducido un defecto del carfflago de 4 mm en la region del surco rotuliano de un conejo NZW, se aplican colageno y adhesivo de fibrina a la region defectuosa y despues, pasadas 4 semanas de la aplicacion se realizan observaciones a simple vista y observaciones de histopatologfa (figuras 4 y 5). Se utilizan para el experimento, colageno (Thera Fill de Sewoncellontech) y fibrina (Tisseel de Baxter).

Para la tincion en las observaciones de histopatologfa, se utilizan hematoxilina-eosina, safranina-O, azul alcian, tincion tricromica de Masson, y colageno tipo I/II.

(Resultado: se confirmo por la observacion a simple vista que los tejidos de la region defectuosa se restauran, y por la observacion de histopatologfa se confirmo que los tejidos de la region defectuosa se regeneran como tejidos de carfflago)

Las propiedades ffsicas de la solucion estabilizante que dependen de la concentracion de cloruro de calcio se miden y se resumen como sigue:

A. Medida del tiempo de gelificacion y de las propiedades ffsicas segun la concentracion de cloruro de calcio en la solucion estabilizante.

1) Concentracion de cloruro de calcio

Concentracion final (mg/mL)

0,26

0,20 0,10 0,05 0,01 0

Concentracion de la solucion estabilizante

4,4 3,38 1,69 0,845 0,169 0

2) Metodo de aplicacion

- Preparar una solucion de colageno (al 3 %, 3 cm3) y un adhesivo de fibrina (de Greenplast).

- El fibrinogeno de Greenplast se mezcla con una aprotinina (1 cm3).

- La trombina se mezcla con la solucion estabilizante (1 cm3).

- La solucion de colageno (3 cm3) se mezcla con la trombina (3 cm3) y con la solucion estabilizante (0,4 cm3).

- Colocar la solucion de fibrinogeno (1 cm3) y la solucion de colageno (1 cm3) en un kit dual y despues poner la mezcla en un molde cilmdrico (0 12 X 15 mm) para preparar una materia solida.

3) Concentracion de cloruro de calcio / tiempo de gelificacion y gelificacion.

Concentracion (mg/mL)

Tiempo de gelificacion (min) / Gelificacion

0,5

1 1,5 2 3

0,26

* * ** ** ***

0,2

* * ** *** ***

0,1

* * ** ** ***

0,05

* * * * **

0,01

* * * * **

0

* * * * **

*: incluye fase ffquida **: en curso de gelificacion

***:. gelificacion terminada

Medida de las propiedades ffsicas que dependen de la concentracion de cloruro de calcio 5 - Se utiliza el reometro, CR-500DX, para medir las propiedades ffsicas del material solido.

- Elementos de medida: la tension maxima, la resistencia del gel, y la resistencia a la traccion.

- Distancia de entrada: 50 % de la altura de la muestra, 7,5 mm.

- Velocidad: 50 mm/min, tension maxima: 10 kg

- Adaptador: No.1, 20 mm de diametro

Concentracion de cloruro de calcio (mg/mL) (concentracion en el producto final)

Tension maxima (Max 1) Resistencia del gel Resistencia a la traccion

N

gcm g/cm

0,26

19,3 1212,9 2493,7

0,2

20,1 1246,6 2591,1

0,1

14,9 918,8 1920,3

0,05

6,1 303,1 789,9

0,01

6,9 366,7 888,6

0

5,4 281,6 691,1

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Metodo de mezcla de colageno y adhesivo de fibrina con la solucion estabilizante en la region defectuosa del carfflago, y medida de las propiedades ffsicas, y confirmacion de la degradabilidad (objetivo: se bloquea la nutricion cuando los carfflagos han sido danados. Se anade medio de cultivo DMEM que se utiliza para cultivar celulas de carfflago para ayudar a la restauracion del carfflago, y el producto que contiene colageno mantiene la forma durante

15 largo tiempo).

1) Preparacion de una solucion estabilizante que es un medio de cultivo DMEM que se utiliza para el cultivo de

celulas de carfflago fortalecido con cloruro de calcio. El medio de cultivo DMEM contiene sales, aminoacidos y

vitaminas. La solucion estabilizante es una solucion fortalecida con cloruro de calcio, y la concentracion vaffa de

0,2 a 6 mg/mL.

20 2) La concentracion de cloruro de calcio vaffa de 0,1 a 0,5 mg/mL en el uso final.

3) Este experimento se lleva a cabo como sigue.

- Preparar solucion de colageno (al 3 %, 3 cm1 * 3), y adhesivo de fibrina (Greenplast)

- El fibrinogeno de Greenplast se mezcla con una aprotinina (1 cm3).

- La trombina se mezcla con la solucion estabilizante (1 cm3).

25 - La solucion de colageno (3 cm3) se mezcla con la trombina/solucion estabilizante (0,4 cm3).

- El adhesivo de fibrina que no contiene colageno se utiliza para un grupo de comparacion.

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- Colocar la solucion de fibrinogeno (1 cm2 3) y la solucion de colageno (1 cm3 *) en un kit dual y despues poner

la mezcla en un molde cilmdrico (0 12 X 15 mm) para preparar una materia solida. La concentracion final

de cloruro de calcio es de 0,26 mg/mL.

4) Medida de las propiedades ffsicas

- Se utilizo un reometro, CR-500DX, para medir las propiedades ffsicas del material solido.

- Elementos de medida: la tension maxima, la fuerza de gel, y la resistencia a la traccion.

- Distancia de entrada: 50 % de la altura de la muestra, 75 mm.

- Velocidad: 50 mm/min, tension maxima: 10 kg.

- Adaptador: No.1, 0 20 mm.

- Los resultados son como sigue. Un material solido que contiene colageno muestra un color opaco similar al color del carfflago, y un producto de adhesivo de fibrina es un material solido translucido.

Colageno/solucion estabilizante (la presente invencion) Producto de adhesivo de fibrina (tecnica anterior)

Fotograffas de gelificacion (gelificacion en 3 minutos)

Figura 6A Figura 6B

5) Confirmacion de la degradabilidad

- El material solido se pone en el medio de cultivo (DMEM) y se observa durante un mes a 37 grados Celsius.

- El medio de cultivo se cambia todos los dfas o cada 2 dfas.

- El producto de adhesivo de fibrina que no contiene colageno se descompone en 2 a 3 semanas, pero el material solido que contiene colageno mantiene su forma mas de un mes.

El siguiente es un experimento sobre la viabilidad celular de las celulas del carfflago en la composicion de mezcla de

colageno y fibrinogeno.

A) Preparacion de una composicion de colageno y fibrinogeno que contiene celulas de carfflago.

1) El fibrinogeno en adhesivo de fibrina (Tisseel) se disuelve en una solucion de aprotinina (2 cm3).

2) Se disuelve una trombina liofilizada en la solucion estabilizante.

3) Se mezcla una solucion de colageno (Thera Fill, 3 cm3) con la trombina/solucion estabilizante (0,4 cm3) utilizando un adaptador.

4) Se ponen 1,5 cm3 de la solucion de mezcla de colageno/trombina/solucion estabilizante en una jeringa, y despues se mezcla la solucion con las celulas del carfflago (0,5 cm3 (6,0 x 106 celulas/0,5 cm3)). La concentracion final de cloruro de calcio es 0,24 mg/mL.

5) Las mezclas 1) y 4) se colocan respectivamente, en un kit dual, y despues se ponen en una placa de Petri de 100 mm.

B) Experimento de confirmacion de la viabilidad de las celulas de carfflago en la composicion.

1) El producto de gel separado se transfiere a una placa de Petri de 35 mm, y se anaden 3 mL de medio de cultivo DMEM a la placa de Petri, y despues se pone en marcha una incubacion con CO2 a 37 grados Celsius.

2) El medio de cultivo se cambia dos veces al dfa, y se incuba durante 3 dfas. La composicion de medio de cultivo esta compuesta de DMEM/F12, 1 % de gentamicina, 5 mg/mL de ITS + Premix, 50 pg/mL de acido ascorbico, piruvato de sodio 1 mM, y 100 ng/mL de BMP-2.

3) Para el analisis se utiliza el metodo de calcema-AM.

Analisis de calcema-AM

- Metodo: Se prepara una solucion de trabajo de la viabilidad celular, celulas vivas/celulas muertas, que

contiene 10 mL de PBS, 5 pL de calcema-AM 4 mM y 20 pL de EthD-1 2 mM.

Se elimina el medio de cultivo de la composicion de incubacion, y despues se anaden 3 mL de solucion de trabajo de la viabilidad celular, celulas vivas/celulas muertas. Se incuba 1 hora a temperatura ambiente, y despues se traslada a un portaobjetos de vidrio. Se observa en el microscopio de fluorescencia.

Las celulas vivas se tinen de verde, y las celulas muertas se tinen de rojo.

5 - Resultado: Fotograffas del microscopio de fluorescencia de la viabilidad de las celulas del carfflago por

analisis de calcema-AM.

Las fotograffas del microscopio de fluorescencia se muestran en la figura 7A (inicial (40X)) y figura 7B (3 dfas de incubacion (40X))

Despues de 72 horas en la composicion, la observacion confirma que el 90 % de las celulas estan vivas.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de produccion de una composicion para la reparacion del tejido cartilaginoso, que comprende las etapas de (a) disolver fibrinogeno liofilizado en una solucion de aprotinina: (b) disolver trombina liofilizada en una solucion estabilizante; (c) mezclar una solucion de colageno enriquecido con la trombina y la solucion estabilizante; y 5 colocar la solucion de fibrinogeno (a) en un lado de un kit dual y la solucion (c) que contiene el colageno en el otro lado y despues mezclar (a) y (c), en donde el tiempo de gelificacion despues de mezclar (a) y (c) es de 3 minutos y la tension maxima es superior a 10 N medida con un reometro CR-500DX,

   en donde la concentracion de fibrinogeno vana de 35 a 55 mg/L, la concentracion de solucion de aprotinina es 1500 KlU/mL, la concentracion de trombina es 29,41 lU/mL, la concentracion de la solucion estabilizante es 0,65 mg/mL, y 10 la concentracion de colageno es 13,23 mg/mL,

   en donde la solucion estabilizante se prepara por la adicion de cloruro de calcio al medio de cultivo DMEM para cultivo de celulas de cartflago y el medio de cultivo DMEM comprende sales, aminoacidos y vitaminas.