ES2625751T3 - Productos de consumo con variantes de proteasa - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa de agua fría, en donde dicha variante de proteasa consiste en la SEQ ID NO: 1 con uno de los siguientes conjuntos de mutaciones: T022R-S024R T022R-G115R S009A-T022R S009A-T022R-S212F-W241R G020R-T022R-S242RG020R- T022R-N043RG020R- T022R-W241RG020R- T022R-S078R-S242RS009A- T022R-N043R-S078R G020R-T022R-S212F-W241RG020R- T022R-S078R-W241RG020R- T022R-N043R-W241RG020R- T022R-S024R-S242RS009A- T022R-S078R-S212F S009A-T022R-S078R-S212F-W241R G020R-T022R-E271L G020R-T022R-N043R-S212FV004R- S009A-T022R-S078R-S212FG020R- T022R-S078R-S212F-W241RG020R- T022R-N269RT022R- S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R N018R-T022R-S024R-N076D-H249R N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R en donde las posiciones de aminoácidos de la variante de proteasa se numeran de acuerdo con la numeración de las correspondientes posiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEQ ID NO: 2, siendo dicha composición un producto de consumo.

Description

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DESCRIPCION

Productos de consumo con variantes de proteasa Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a productos de consumo que comprenden proteasas, asi como a metodos de uso de dichos productos de consumo.

Antecedentes de la invencion

Los fabricantes de detergentes incorporan proteasas en sus productos para proporcionar una buena limpieza de manchas (tales como sangre). Por ejemplo, el documento WO99/20771 se refiere a multiples variantes de proteasa sustituidas con carga neta alterada para su uso en detergentes. Sin embargo, por motivos de sostenibilidad y de la tendencia de los consumidores a reducir las temperaturas de lavado, esta resultando cada vez mas dificil ofrecer beneficios aceptables al consumidor y sigue habiendo una necesidad de mejorar el perfil de limpieza y de frescura de estas composiciones de detergentes para el lavado de ropa. Los inventores han descubierto que la incorporacion de, ademas, determinadas proteasas en productos de consumo, por ejemplo, una composicion de detergente el lavado de ropa que puede, en un aspecto, comprender un agente de matizado, un abrillantador soluble en agua fria, un catalizador de blanqueo, una lipasa de primer lavado, una celulasa bacteriana de limpieza, un tensioactivo no ionico de Guerbet y/o una capsula de perfume, mejora uno o mas del perfil de limpieza, de blancura, de percepcion de blancura y/o de frescor de dichos productos de consumo.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a productos de consumo que comprenden proteasas, particularmente proteasas de agua fria y a procesos para usar dichos productos. Dichas composiciones proporcionan una limpieza y frescor mejorados. Dichas proteasas se obtienen a partir de una enzima parental, subtilisina, obtenida a partir de Bacillus lentus, por sustitucion, insercion y/o eliminacion de uno o mas de los aminoacidos de las enzimas parentales. La invencion de refiere a una composicion que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa de agua fria, en donde dicha variante de proteasa consiste en la SEQ ID NO: 1 con uno de los siguientes conjuntos de mutaciones:

T022R-S024R T022R-G115R S009A-T022R

S009A-T022R-S212F-W241 R

G020R-T022R-S242R-

G020R-T022R-N043R-

G020R-T022R-W241 R

G020R-T022R-S078R-S242R-

S009A-T022R-N043R-S078R

G020R-T022R-S212F-W241 R-

G020R-T022R-S078R-W241 R-

G020R-T022R-N043R-W241 R-

G020R-T022R-S024R-S242R-

S009A-T022R-S078R-S212F

S009A-T022R-S078R-S212F-W241 R

G020R-T022R-E271L

G020R-T022R-N043R-S212F-

V004R-S009A-T022R-S078R-S212F

G020R-T022R-S078R-S212F-W241 R-

G020R-T022R-N269R-

T022R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R

N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R

N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R

T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R

T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R

N018R-T022R-S024R-N076D-H249R

N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R

N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R

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N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R

en donde las posiciones de aminoacidos de la variante de proteasa se numeran de acuerdo con la numeracion de las posiciones de aminoacidos correspondientes en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN’ de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEQ ID NO: 2, siendo dicha composicion un producto de consumo.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 proporciona una alineacion de las proteasas de referencia maduras que incluyen: subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 2) y proteasa GG36 de subtilisina de B. lentus (SEQ ID NO: 1). Cada posicion de aminoacido de cada variante de proteasa descrita en la presente memoria, incluida cada variante de proteasa de agua fria, esta numerada de acuerdo con la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la Figura 1, determinada por la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

La Figura 2 muestra el plasmido de expresion pHPLT-GG36.

La Figura 3 muestra el plasmido de expresion pRA68.

La Figura 4 muestra el plasmido de expresion pRA96.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

En la presente memoria, “producto de consumo” significa producto para el cuidado de tejidos y del hogar.

En la presente memoria, la expresion “producto para el cuidado de tejidos y del hogar” se refiere a productos para el cuidado de tejidos y del hogar y/o generalmente destinados a ser usados o consumidos en la forma en la que se venden y que son para tratar tejidos, superficies duras y cualesquiera otras superficies, y sistemas de limpieza para el cuidado y limpieza de superficies inanimadas, asi como productos acondicionadores de tejidos y otros productos disenados especificamente para el cuidado y mantenimiento de tejidos y productos para el cuidado del aire, que incluyen: cuidado del aire incluidos ambientadores y sistemas de liberacion de perfume, cuidado del coche, cuidado de mascotas, cuidado del ganado, cuidado personal, cuidado de joyas, lavado de la vajilla, acondicionamiento de tejidos (incluidos suavizado y/o refrescado), detergente para el lavado de ropa, aditivo y/o cuidado de aclarado y de lavado de ropa, composiciones de limpieza de pre-tratamiento, limpieza y/o tratamiento de superficies duras, incluidos limpiadores para suelos y tazas de inodoro, limpiadores y/o tratamientos para vidrios, limpiadores y/o tratamientos para azulejos, limpiadores y/o tratamientos para ceramica y otros limpiadores para uso del consumidor o institucional. En algunas realizaciones, los productos para el cuidado de tejidos y del hogar son adecuados para su uso sobre heridas y/o la piel. “Productos para el cuidado de tejidos y del hogar” incluye productos para el consumidor e institucionales. Esta definicion no incluye los productos (a) destinados a usarse para limpiar lentes de contacto o membranas de ultrafiltracion o (b) en curar heridas o para el tratamiento medico de afecciones de la piel. Dichos productos para el cuidado de tejidos y del hogar estan destinados, en general, a ser usados o consumidos en la forma en que se venden.

En la presente memoria, la expresion “composicion de limpieza y/o tratamiento” es un subconjunto de productos para el cuidado de tejidos y del hogar. Dichos productos incluyen, aunque no de forma limitativa, productos para el tratamiento de tejidos, superficies duras y cualquier otra superficie en el campo del cuidado de tejidos y del hogar, que incluye: cuidado del aire incluidos ambientadores y sistemas de liberacion de perfume, cuidado del automovil, lavado de vajilla, acondicionado de tejidos (incluidos suavizado y/o refrescado), detergente para el lavado de ropa, aditivos para el lavado de ropa y el aclarado y/o el cuidado de la misma, limpieza y/o tratamiento de superficies duras, incluidos limpiadores para suelos y tazas de inodoro, agentes de lavado multiuso en forma granular o en polvo o de “limpieza intensiva”, especialmente detergentes de limpieza; agentes para el lavado liquidos, en forma de gel o pasta universales, especialmente los tipos liquidos denominados de limpieza intensiva; detergentes liquidos para tejidos delicados; agentes para el lavado manual de vajillas o agentes para el lavado de vajillas de accion suave, especialmente los de tipo muy espumante; agentes para el lavado en lavavajillas, incluidos los diversos tipos en pastilla, granulado, liquido y coadyuvante de aclarado para uso domestico e institucional: champus para automoviles o moquetas, limpiadores para cuartos de bano, incluidos limpiadores de inodoros; asi como sustancias auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y “barras antimanchas” o de tipo tratamiento previo, productos cargados de sustratos tales como toallitas anadidas a la secadora de ropa.

En la presente memoria, el termino “composicion limpiadora y/o tratante para telas y/o superficies duras” es un subgrupo de composiciones limpiadoras y tratantes que incluye, salvo que se indique lo contrario, agentes para el lavado granulados

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o en polvo universales o “de limpieza intensiva”, especialmente detergentes de limpieza; agentes para el lavado liquidos, en forma de gel o pasta universales, especialmente los tipos liquidos denominados de limpieza intensiva; detergentes liquidos para tejidos delicados; agentes para el lavado manual de vajillas o agentes para el lavado de vajillas de accion suave, especialmente los de tipo muy espumante; agentes para el lavado en lavavajillas, incluidos los diversos tipos en pastilla, granulado, liquido y coadyuvante de aclarado para uso domestico e institucional; agentes liquidos para limpieza y desinfeccion, champus para coches o moquetas, limpiadores de bano incluidos limpiadores de inodoros; productos de acondicionamiento de tejidos incluidos suavizantes y/o agentes refrescantes que pueden estar en forma liquida, solida y/o toallitas para la secadora de ropa; asi como sustancias auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y “barras antimanchas” o de tipo tratamiento previo, productos cargados de sustratos tales como toallitas anadidas a la secadora de ropa. Todos estos productos que se pueden aplicar pueden estar en forma estandar, concentrada o incluso altamente concentrada, hasta tal punto que dichos productos en algun aspecto determinado pueden no ser acuosos.

En la presente memoria, la expresion “variante de proteasa de agua fria” significa una variante de una proteasa parental, siendo la secuencia de dicha proteasa parental al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, teniendo dicha variante una o mas de las siguientes caracteristicas:

a) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 2 de al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos

1.4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2; de 1,1 a aproximadamente 10, de 1,1 a aproximadamente 8 o incluso de 1,1 a aproximadamente 5;

b) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 3 de al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos

1.4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2; de 1,1 a aproximadamente 10, de 1,1 a aproximadamente 8 o incluso de 1,1 a aproximadamente 5;

c) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 4 de al menos 1,0, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2, de 1,0 a aproximadamente 10, de 1,0 a aproximadamente 8 o incluso de 1,0 a aproximadamente 5;

d) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 6 de al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos

1.4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2; de 1,1 a aproximadamente 10, de 1,1 a aproximadamente 8 o incluso de 1,1 a aproximadamente 5,

en donde cada posicion de aminoacido esta numerada de acuerdo con la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. Las proteasas de agua fria preferidas adecuadas para su uso en la presente invencion tienen las caracteristicas de acuerdo con el metodo de ensayo 6 tal como se ha definido en d) anteriormente.

El metodo de ensayo 2, el metodo de ensayo 3, el metodo de ensayo 4 y el metodo de ensayo 6 se describen explicitamente mas adelante en la seccion titulada “METODOS DE ENSAYO”.

En la presente memoria, la expresion “variante de proteasa” significa una variante de una proteasa parental, siendo dicha secuencia de proteasa parental al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 % o 100 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, en donde cada posicion de aminoacido esta numerada de acuerdo con la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

En la presente memoria, los articulos tales como “un” y “una” cuando se usan en una reivindicacion, se refieren a uno o mas de aquello que se reivindica o que se describe.

En la presente memoria, las expresiones “incluyen”, “incluye” e “incluidos” deben entenderse como no limitativas.

En la presente memoria, el termino “solido” incluye productos en forma granular, polvo, pastilla y comprimidos.

En la presente memoria, el termino “fluido” incluye productos en forma de liquido, gel, pasta y gas.

En la presente memoria, el termino “sitio” incluye tejidos, prendas de vestir y/o superficies duras.

Salvo que se indique lo contrario, todos los niveles del componente o de la composicion se refieren a una parte activa de ese componente o composicion, y son excluyentes de impurezas, por ejemplo, disolventes residuales o subproductos, que puedan estar presentes en las fuentes comerciales de dichos componentes o composiciones.

Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso, a menos que se indique de cualquier otra manera. Todos los porcentajes y relaciones se calculan sobre la base de la composicion total a menos que se indique de cualquier otra manera.

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Se entendera que cada limitacion numerica maxima dada en esta especificacion incluye toda limitacion numerica inferior, como si las limitaciones numericas inferiores estuvieran expresamente escritas en la presente descripcion. Cada limitacion numerica minima proporcionada a lo largo de esta memoria descriptiva incluira cada limitacion numerica superior, como si dichas limitaciones numericas superiores estuvieran expresamente escritas en la presente memoria. Cada intervalo numerico proporcionado a lo largo de esta memoria descriptiva incluira cada intervalo numerico mas limitado que se encuentra dentro de dicho intervalo numerico mas amplio, como si todos los citados intervalos numericos mas limitados estuviesen expresamente escritos en la presente memoria.

Productos de consumo

Tal como se describe en la presente memoria, los productos de consumo que comprenden las proteasas variantes divulgadas en la presente memoria encuentran uso particular en la industria de la limpieza, por ejemplo, detergentes para el lavado de ropa y detergentes para vajilla. Estas aplicaciones colocan a las enzimas bajo varias tensiones ambientales. Las proteasas variantes empleadas en la presente invencion proporcionan ventajas con respecto a muchas enzimas usadas actualmente, debido, al menos en parte, a su estabilidad en diversas condiciones.

Claramente, existe una variedad de condiciones para lavado que incluyen la variacion de formulaciones de detergentes, volumenes de agua para lavado, temperaturas del agua para lavado y periodos de tiempo de lavado, a los cuales se exponen las proteasas involucradas en el lavado. Adicionalmente, las formulaciones detergentes usadas en distintas areas geograficas tienen distintas concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, los detergentes europeos tienen, tipicamente, aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado, mientras que los detergentes japoneses tienen, tipicamente, aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado. En Norteamerica, particularmente, en los EE. UU., los detergentes tienen, tipicamente, aproximadamente 975 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

Un sistema con concentracion detergente baja incluye detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de los componentes detergentes estan presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses se consideran, tipicamente, sistemas con concentracion detergente baja debido a que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Una concentracion media de detergente incluye detergentes en donde los componentes detergentes estan presentes en el agua de lavado a entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm. Los detergentes de Norteamerica se consideran, generalmente, sistemas con concentracion detergente media debido a que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene, tipicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema con concentracion de detergente alta incluye detergentes en donde mas de aproximadamente 2000 ppm de los componentes detergentes estan presentes en el agua de lavado. Generalmente, se considera que los detergentes europeos son sistemas con concentracion de detergente alta debido a que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

Los detergentes latinoamericanos son, generalmente, mejoradores de detergente de fosfato con contenido alto de espuma y la concentracion de los detergentes usados en Latinoamerica puede ser tanto media como alta debido a que se encuentran en el intervalo de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se menciono anteriormente, Brasil tiene, tipicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras regiones con mejoradores de detergente de fosfato con contenido alto de espuma no limitadas a otros paises de America Latina, pueden tener sistemas con concentracion de detergente alta de hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

En vista de lo anterior, es evidente que las concentraciones de composiciones detergentes en las soluciones tipicas de lavado en todo el mundo varian desde menos de aproximadamente 800 ppm de composicion detergente (“regiones con concentracion baja de detergente”), por ejemplo, aproximadamente 667 ppm en Japon, hasta entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm (“regiones con concentracion media de detergente”), por ejemplo, aproximadamente 975 ppm en los EE. UU. y aproximadamente 1500 ppm en Brasil hasta mas de aproximadamente 2000 ppm (“regiones con concentracion alta de detergente”), por ejemplo, de aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en regiones con mejoradores de fosfato con contenido alto de espuma.

Las concentraciones de las soluciones de lavado tipicas se determinan empiricamente. Por ejemplo, en los EE. UU. una lavadora automatica tipica soporta un volumen de aproximadamente 64,4 l de solucion de lavado. Por consiguiente, para obtener una concentracion de aproximadamente 975 ppm de detergente dentro de la solucion de lavado se debe agregar aproximadamente 62,79 g de composicion detergente a los 64,4 l de solucion de lavado. Esta cantidad es la cantidad tipica que determina el consumidor en el agua de lavado con el uso de la taza medidora provista con el detergente.

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Como ejemplo adicional, las distintas regiones usan temperaturas de lavado diferentes. En Japon, la temperatura del agua de lavado es, tipicamente, inferior a la temperatura que se usa en Europa. Por ejemplo, la temperatura del agua de lavado en Norteamerica y Japon es, tipicamente, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 0C (p. ej., aproximadamente 20 °C), mientras que la temperatura del agua de lavado en Europa es, tipicamente, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60 0C (p. ej., aproximadamente 40 0C). Sin embargo, con el proposito de ahorrar energia, muchos consumidores ahora realizan el lavado con agua fria. Ademas, en algunas otras regiones, el agua fria se usa, tipicamente, para el lavado de ropa, asi como ademas en aplicaciones para el lavado de vajilla. En algunas realizaciones, el “lavado con agua fria” de la presente invencion utiliza lavados a temperaturas de aproximadamente 10 0C a aproximadamente 40 °C o de aproximadamente 20 0C a aproximadamente 30 0C o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 0C, asi como todas las demas combinaciones dentro del intervalo de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 35 0C y todos los intervalos dentro de 10 °C a 40 °C.

Como un ejemplo adicional, las distintas geografias tienen, tipicamente, durezas del agua diferentes. La dureza del agua se describe, normalmente, en terminos de partes por millon (granos por galon) de Ca2+/Mg2+ mezclados. La dureza es una medida de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayor parte del agua en los EE. UU. es dura, pero el grado de dureza varia. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121181 ppm) tiene de 60 a 181 partes por millon (partes por millon convertidas a granos por galon de EE. UU. es num. de ppm dividido por 17,1 equivalente a granos por galon) de minerales de dureza.

Agua

Granos por galon Partes por millon

Blanda

Inferior a 1,0 Inferior a 17

Ligeramente dura

de 1,0 a 3,5 de 17 a 60

Moderadamente dura

de 3,5 a 7,0 de 60 a 120

Dura

de 7,0 a 10,5 de 120 a 180

Muy dura

superior a 10,5 superior a 180

La dureza del agua en Europa es tipicamente superior a 179,5 (por ejemplo de aproximadamente 179,5 a aproximadamente 342) partes por millon (superior a aproximadamente 10,5 (por ejemplo aproximadamente 10,5 a aproximadamente 20,0) granos por galon) de Ca2+/Mg2+ mezclados (p. ej., aproximadamente 256,5 partes por millon (aproximadamente 15 granos por galon) de Ca2+/Mg2+ mezclados). La dureza del agua en Norteamerica es, tipicamente, superior a la dureza del agua japonesa, pero inferior a la dureza del agua en Europa. Por ejemplo, la dureza del agua en Norteamerica puede ser de entre aproximadamente 51,3 a aproximadamente 171 partes, aproximadamente 51,3 a aproximadamente 136,8 partes o aproximadamente 102,6 partes (entre aproximadamente 3 a aproximadamente 10 granos, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 granos o aproximadamente 6 granos). La dureza del agua en Japon es tipicamente mas baja que la dureza del agua de Norteamerica, usualmente inferior a aproximadamente 68,4, por ejemplo, aproximadamente 51,3 partes por millon (inferior a aproximadamente 4, por ejemplo, aproximadamente 3 granos por galon) de Ca2+/Mg2+ mezclados.

Consecuentemente, en algunas realizaciones, la presente invencion proporciona productos de consumo que muestran un rendimiento de lavado sorprendente en al menos un grupo de condiciones de lavado (p. ej., temperatura del agua, dureza del agua y/o concentracion de detergente).

En particular, la presente invencion comprende un metodo de lavado como se define en las reivindicaciones anexas.

En algunas realizaciones, los productos de consumo de la presente invencion son comparables en cuanto a su rendimiento de lavado con otros productos de consumo que comprenden otras proteasas subtilisinas. En algunas realizaciones, los productos de consumo de la presente invencion muestran un mejor rendimiento de lavado en comparacion con productos de consumo que comprenden proteasas subtilisinas actualmente disponibles en el mercado. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente invencion, los productos de consumo que comprenden las proteasas variantes proporcionadas en la presente memoria, muestran una limpieza mejorada debido, al menos en parte, a una mejora de la estabilidad oxidativa, una mejora de la estabilidad termica, una mejora de las capacidades de limpieza en diversas condiciones y/o una mejora de la estabilidad quelante de las enzimas empleadas.

Productos de consumo

En todas sus formas, las composiciones divulgadas en la presente memoria son productos de consumo.

En un aspecto, se divulga una composicion que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa de agua fria, siendo dicha composicion un producto de consumo.

El metodo de ensayo 2, el metodo de ensayo 3, el metodo de ensayo 4 y el metodo de ensayo 6 se describen mas adelante en la seccion titulada “METODOS DE ENSAYO”.

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En un aspecto, dicha proteasa parental se puede seleccionar del grupo que consiste en las enzimas disponibles en el mercado con los nombres comerciales Savinase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme® de Novozymes A/S (Dinamarca), aquellas comercializadas con el nombre comercial de Maxacal®, Properase®, Purafect®, FN3®, FN4®, Excellase® y Purafect OXP® de Genencor International y aquellas disponibles de Henkel/Kemira, concretamente, BLAP (secuencia mostrada en la Figura 29 del documento Us-5.352.604 con las siguientes mutaciones S99D + S101R + S103A + V104I + G159S, en lo sucesivo denominado BLAP) y BLAP X (BLAP con S3T + V4I + V205I).

En un aspecto de dicha composicion, dicho material adyuvante puede comprender un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en: un encapsulado que comprende un perfume, un agente matizante, tensioactivos, aditivos reforzantes de la detergencia, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de colorantes, dispersantes, enzimas adicionales, estabilizadores enzimaticos, materiales cataliticos, activadores de blanqueo, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos preformados, agentes dispersantes polimericos, agentes de eliminacion/anti-redeposicion de manchas de arcilla, abrillantadores, supresores de espuma, colorantes, perfumes, agentes elastizantes de estructura, suavizantes de tejidos, vehiculos, hidrotropos, coadyuvantes de elaboracion, disolventes, pigmentos y mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion puede comprender un material adyuvante seleccionado del grupo que consiste en:

a) encapsulados de perfume;

b) agentes de matizacion de tejidos;

c) abrillantadores solubles en agua fria;

d) un catalizador de blanqueo que puede comprender un catalizador metalico tal como un catalizador de metal de transicion, o mas preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en cationes de iminio, poliones de iminio; iones hibridos de iminio; aminas modificadas; oxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dioxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas azucaradas ciclicas y mezclas de las mismas;

e) lipasas de primer lavado;

f) celulasas bacterianas de limpieza;

g) tensioactivos no ionicos de Guerbet; y

h) mezclas de los mismos.

En otro aspecto, los inventores han descubierto que las proteasas preferidas comprenden al menos una o dos o mas mutaciones cargadas seleccionadas del grupo que consiste en N018R, G020K/R, S024R, N043R, Q245R, H249R y/o N269R. Dichas proteasas son particularmente preferidas para su incorporacion en composiciones detergentes adecuadas para su adicion al agua para preparar un licor de lavado que tenga preferiblemente una alta fuerza ionica o una alta concentracion de detergente. Por ejemplo, estas proteasas preferidas pueden formar parte de una composicion detergente que se anade al agua, ya sea para lavado a mano o lavado a maquina, tipicamente en una lavadora, para formar un licor de lavado, cuya conductividad es de por encima de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

En un aspecto adicional, dichas proteasas que comprenden al menos una o dos o incluso mas mutaciones cargadas seleccionadas del grupo que consiste en N018R, G020K/R, S024R, N043R, Q245R, H249R y/o N269R, tienen una carga de 0, +1, +2, +3, +4 o +5, preferiblemente, de +1, +2 o +3, mas preferiblemente de +2 en relacion con la enzima de la SEQ ID NO: 1. Las mutaciones preferidas para conseguir una carga neta deseada comprenden una, dos o mas mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: N043D, R045T, N076D y/o A230E.

Las proteasas particularmente preferidas:

(a) comprenden una o dos o mas mutaciones cargadas seleccionadas del grupo que consiste en N018R, G020K/R, S024R, N043R, Q245R, H249R y/o N269R; y/o

(b) tienen una carga de 0, +1, +2, +3, +4 o +5, preferiblemente, de +1, +2 o +3, mas preferiblemente, de +2 en relacion con la enzima de la SEQ ID NO: 1; y/o

(c) comprenden mutaciones para conseguir una carga neta deseada seleccionada del grupo que consiste en N043D, R045T, N076D y/o A230E.

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Preferiblemente, estas proteasas forman parte de una composicion detergente que se anade al agua, ya sea para un proceso de lavado a mano o a maquina, tipicamente en una lavadora, para formar un licor de lavado, cuya conductividad es de por encima de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

Sin pretender imponer ninguna teoria, se cree que estas mutaciones para conseguir una carga neta deseada, proporcionan un mejor rendimiento global de la proteasa en condiciones de alta fuerza ionica o de alta concentracion de detergente. Es solo mediante la combinacion cuidadosa de determinadas mutaciones, de las cuales estas son preferidas, que se pueden obtener dichas proteasas preferidas.

Estas variantes de proteasas son variantes de proteasas altamente preferidas para su uso en metodos para tratar y/o limpiar superficies en las que (i) se pone en contacto la superficie con una composicion que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa en un licor de lavado acuoso; y (ii) despues, se aclara y/o se seca la superficie, en la que el licor de lavado acuoso tiene, preferiblemente, una alta fuerza ionica y/o alta concentracion de detergente.

En un aspecto de dicha composicion, dicha variante de proteasa comprende uno de los siguientes conjuntos de mutaciones: G020R-T022R-N269R+ G020R-T022R-S078R-S212F-W241R, N018R-T022R-S024R-N076D-S101A- N116A-N183D-G211Q-H249R o V004R-S009A-T022R-S078R-S212F. Estas variantes de proteasas son variantes de proteasas utiles para su uso en metodos para tratar y/o limpiar superficies en las que (i) se pone en contacto la superficie con una composicion que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa en un licor de lavado acuoso; y (ii) despues, se aclara y/o se seca la superficie, en la que el licor de lavado acuoso tiene, preferiblemente, una alta fuerza ionica y/o alta concentracion de detergente.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende una variante de proteasa, que comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 en no mas de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 mutaciones seleccionadas del grupo de A1R, A230E, E271L, G115R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121E, V244R, V28E, V30E, V4R y W241R y comprende opcionalmente, al menos, una mutacion seleccionada del grupo de S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D y N252K, en donde las posiciones de aminoacidos de la variante de proteasa se numeran de acuerdo con la numeracion de las correspondientes posiciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN’ de Bacillus amyloliquefaciens que se muestra en la SEQ ID NO: 2 tal como se determina por alineacion de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la BPN’ de Bacillus amyloliquefaciens.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende una variante de proteasa, en donde dicha variante de proteasa es una forma madura que tiene actividad proteolitica y que comprende secuencias de aminoacidos que comprenden sustituciones de aminoacidos seleccionadas de: T22R, G20R-T22R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241R, G20R-T22R-N43R-S212F, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R- S78R-S212F, G20R-T22R-S24R-N43R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F y T22R-S24R- N43R, en donde las posiciones de aminoacidos de la variante de la subtilisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN’ de Bacillus amyloliquefaciens expuesta como la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende una segunda proteasa no inmunoequivalente seleccionada del grupo que comprende:

a) subtilisinas (EC 3.4.21.62);

b) proteasas similares a tripsina o similares a quimiotripsina;

c) metaloproteasas; y

d) mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende una segunda proteasa no inmunoequivalente seleccionada del grupo que comprende:

a) subtilisinas (EC 3.4.21.62) derivadas de B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii;

b) tripsina proteasas y/o quimiotripsina proteasas de Cellumonas;

c) metaloproteasas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens; y

d) mezclas de los mismos.

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En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, celobiosa deshidrogenasas, xiloglucanasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mananasas, pectato liasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, liquenasas glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, amilasas y mezclas de las mismas.

En un aspecto de dicha composicion, dicha enzima adicional se selecciona del grupo que consiste en:

a) lipasas de primer lavado;

b) alfa-amilasas;

c) celulasas bacterianas de limpieza; y

d) mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion, con respecto a dicho(s) material(es) adyuvante(s), en dicha composicion

a) dicho encapsulado comprende un perfume que comprende una microcapsula de perfume;

b) dicho agente de matizado comprende un material seleccionado del grupo que consiste en tintes basicos, acidos, hidrofobos, directos y polimericos y tintes conjugados que tienen una longitud de onda de absorcion maxima de 550 nm a 650 nm y mezclas de los mismos;

c) dicho tensioactivo detersivo comprende un material seleccionado del grupo que consiste en tensioactivos detersivos anionicos, tensioactivo detersivo no ionico, tensioactivos detersivos cationicos, tensioactivos detersivos de ion hibrido y tensioactivos detersivos anfoteros y mezclas de los mismos;

d) dicho aditivo reforzante de la detergencia comprende un material seleccionado del grupo que consiste en zeolitas, fosfatos y mezclas de los mismos;

e) dicha sal de silicato comprende un material seleccionado del grupo que consiste en silicato de sodio, silicato de potasio y mezclas de los mismos;

f) dicho abrillantador comprende, preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en abrillantadores solubles en agua fria y mezclas de los mismos;

g) dicho polimero de carboxilato comprende un material seleccionado del grupo que consiste en copolimero aleatorio de maleato/acrilato u homopolimero de poliacrilato y mezclas de los mismos;

h) dicho polimero de desprendimiento de la suciedad comprende un material seleccionado del grupo que consiste en copolimeros de tereftalato y mezclas de los mismos;

i) dicho polimero celulosico comprende un material seleccionado del grupo que consiste en alquilcelulosa, alquilalcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquilcarboxialquilcelulosa y mezclas de los mismos;

j) dicho catalizador de blanqueo comprende un catalizador de metal de transicion o un ligando para la formacion de un catalizador de metal de transicion, o, preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en cationes iminio, poliiones de iminio; iones hibridos de iminio; aminas modificadas; oxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dioxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas azucaradas ciclicas y mezclas de las mismas;

k) dicho activador de blanqueo comprende un material seleccionado del grupo que consiste en dodecanoil oxibenceno sulfonato, decanoil oxibenceno sulfonato, acido decanoil oxibenzoico o sus sales, 3,5,5-trimetil hexanoiloxibenceno sulfonato, tetraacetil etilendiamina (TAED), nonanoiloxibenceno sulfonato (NOBS) y mezclas de los mismos;

l) dicha fuente de peroxido de hidrogeno comprende un material seleccionado del grupo que consiste en sales inorganicas de perhidrato, incluidas sales de metales alcalinos tales como sales sodicas de perborato (generalmente mono- o tetra-hidrato), de percarbonato, de persulfato, de perfosfato, de persilicato y mezclas de las mismas;

m) dicho quelante comprende un material seleccionado del grupo que consiste en DTPA (acido dietilentriaminopentaacetico), HEDP (acido hidroxietano difosfonico), DTPMP (acido

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dietilentriaminopenta(metilenfosf6nico)), acido etilendiaminodisuccfnico (EDDS), sal hidratada disodica del acido 1,2-dihidroxibenceno-3,5-disulfonico y derivados de dichos quelantes; y (n) mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende un agente de matizado de tejidos seleccionado del grupo que consiste en

a) tintes;

b) conjugados de tinte-arcilla que comprenden al menos un tinte cationico-basico y una arcilla de esmectita; y

c) mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion, dicha composicion comprende un agente de matizado de tejidos seleccionado del grupo que consiste en

a) colorantes de molecula pequena; tintes polimericos y mezclas de los mismos;

b) conjugados de tinte-arcilla que comprenden al menos un tinte cationico-basico y una arcilla de esmectita; y

c) mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicha composicion detergente solida para el lavado de ropa, dicha composicion comprende, basandose en el peso total de la composicion:

a) de aproximadamente un 0,0005 % en peso a aproximadamente un 0,1 % en peso, de aproximadamente un 0,001 % en peso a aproximadamente un 0,05 % en peso, o incluso de aproximadamente un 0,002 % en peso a aproximadamente un 0,03 % en peso de dicha variante de proteasa; y

b) uno o mas de los siguientes:

(i) de aproximadamente un 0,00003 % en peso a aproximadamente un 0,1 % en peso del agente de matizado de tejidos;

(ii) de aproximadamente un 0,001 % en peso a aproximadamente un 5 % en peso de capsulas de perfume;

(iii) de aproximadamente un 0,001 % en peso a aproximadamente un 1 % en peso de abrillantadores solubles en agua fria;

(iv) de aproximadamente un 0,00003 % en peso a aproximadamente un 0,1 % en peso de catalizadores de blanqueo;

(v) de aproximadamente un 0,00003 % en peso a aproximadamente un 0,1 % en peso de lipasas de primer lavado;

(vi) de aproximadamente un 0,00003 % en peso a un 0,1 % en peso de celulasas bacterianas de limpieza;

(vii) de aproximadamente un 0,05 % en peso a aproximadamente un 20 % en peso de tensioactivos no ionicos de Guerbet.

Se divulga una composicion de acuerdo con cualquiera de los productos de consumo divulgados en la presente memoria, en donde dicha composicion es una dosis unitaria unica o de varios compartimientos.

Una composicion de acuerdo con cualquiera de los productos de consumo desvelados en la presente memoria, en donde dicha composicion es una dosis unitaria de varios compartimientos, en donde la variante de proteasa se encuentra en un compartimento diferente a cualquier fuente de peroxido de hidrogeno y/o quelante.

Un licor de lavado que comprende un producto de consumo que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa que comprende uno o mas de los siguientes conjuntos de mutaciones T022R-S024R, T022R-G115R y S009A-T022R, teniendo dicha variante de proteasa una carga neta total de 0, + 1, +2, +3, + 4 o +5, teniendo, preferiblemente, una carga neta total positiva, mas preferiblemente +1, +2 o +3, con respecto a la proteasa

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subtilisina GG36 de B. lentus que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1; y se divulga dicho licor de lavado de detergente para el lavado de ropa que tiene una conductividad superior a de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

En un aspecto, dicho producto de consumo puede ser un detergente para el lavado de ropa granulado o en polvo.

En un aspecto, cualquiera de los productos de consumo divulgados en la presente memoria puede estar en forma de una dosis unitaria de varios compartimentos. En un aspecto de dicha dosis unitaria de varios compartimentos, la variante de proteasa puede estar en un compartimento diferente al de cualquier enzima y/o quelante adicional.

En un aspecto, dichas composiciones pueden ser un detergente liquido para el lavado de ropa, un producto para lavar vajilla y/o un detergente granulado o en polvo.

En un aspecto, cualquiera de los productos de consumo divulgados en la presente memoria puede estar en forma de una dosis unitaria de varios compartimentos. En un aspecto de dicha dosis unitaria de varios compartimentos, la proteasa puede estar en un compartimento diferente al de cualquier enzima y/o quelante adicional.

El producto de consumo puede adoptar cualquier forma incluyendo un liquido o un solido. El producto de consumo puede estar en forma de una bolsa de dosis unitaria, especialmente cuando esta en forma de liquido y tipicamente, el producto de consumo esta al menos parcialmente o incluso completamente, encerrado por una bolsa soluble en agua.

En uno o mas aspectos del producto de consumo mencionado anteriormente, dicho producto de consumo puede tener cualquier combinacion de parametros y/o caracteristicas detalladas anteriormente.

Divulgacion adicional de proteasa

Las variantes de proteasa adecuadas incluyen enzimas derivadas de una proteasa parental, siendo dicha secuencia de proteasa parental al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o un 100 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ED NO: 1, teniendo dicha variante una o mas de las siguientes caracteristicas:

a) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 2 de al menos 1,1, de al menos 1,2, de al menos 1,3, de al menos 1,4, de al menos 1,5, de al menos 1,6, de al menos 1,7, de al menos 1,8, de al menos 1,9; de al menos 2; de 1,1 a aproximadamente 10, de 1,1 a aproximadamente 8 o incluso de 1,1 a aproximadamente 5;

b) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 3 de al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, al menos 2; de 1,1 a aproximadamente 10, de 1,1 a aproximadamente 8 o incluso de 1,1 a aproximadamente 5;

c) un indice de rendimiento del metodo de ensayo 4 de al menos 1,0, de al menos 1,1, de al menos 1,2, de al menos 1,3, de al menos 1,4, de al menos 1,5, de al menos 1,6, de al menos 1,7, de al menos 1,8, de al menos 1,9, de al menos 2, de 1,0 a aproximadamente 10, de 1,0 a aproximadamente 8 o incluso de 1,0 a aproximadamente 5.

Teniendo las variantes de proteasa preferidas las caracteristicas definidas de acuerdo con el metodo de ensayo 2 anterior.

Las proteasas adecuadas pueden derivarse de subtilisinas, particularmente las derivadas de la subtilisina de Bacillus lentus de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, las proteasas adecuadas incluyen subtilisinas, particularmente de Bacillus lentus de SEQ ID NO: 1, que pueden comprender varios de los siguientes conjuntos de mutaciones, inserciones o eliminaciones: T022R-S024R, T022R-G115R y S009A-T022R

En un aspecto, se divulga que dicha proteasa es una variante de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicha variante una o mas mutaciones, y teniendo una carga neta total de -5, -4, -3, -2, -1 o 0 en relacion con la subtilisina GG36 de tipo silvestre.

En un aspecto, dichas variantes de proteasa son proteasas de baja fuerza ionica. Dichas proteasas de baja fuerza ionica son variantes de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dichas variantes una o mas mutaciones, preferiblemente como se definio anteriormente y teniendo una carga neta total de cero o negativa, de - 5, -4, -3, -2, -1 o 0, preferiblemente 0, -1, -2 o -3, en relacion con la subtilisina GG36 de tipo silvestre. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, se proporciona un proceso de lavado para tejidos que comprende lavar el tejido en un licor de lavado acuoso, que comprende dicha proteasa de carga total neta cero o negativa y un material adyuvante, teniendo dicho licor de lavado, una baja fuerza ionica. Por fuerza ionica baja se entiende licor de lavado, cuya conductividad es de aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente

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0,3 mS/cm a aproximadamente 2,5 mS/cm, o incluso de aproximadamente 0,5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm. Preferiblemente, dichas variantes de proteasa se usaran en composiciones detergentes de baja concentracion.

En un aspecto, las proteasas de baja fuerza ionica anteriores forman parte de una composicion detergente que se diluye en agua, tipicamente, dentro de una lavadora, para formar un licor de lavado, cuya conductividad es de aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente 0,3 mS/cm a aproximadamente 2,5 mS/cm o incluso de aproximadamente 0,5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm.

En un aspecto, dichas variantes de proteasas son proteasas de alta fuerza ionica. Dichas proteasas de alta fuerza ionica son variantes de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dichas variantes dos o mas mutaciones, preferiblemente, como se definio anteriormente y teniendo una carga neta total de +5, +4, +3, +2, +1 o 0, preferiblemente, una carga neta total positiva, mas preferiblemente, +1, +2 o +3, en relacion con la subtilisina GG36 de tipo silvestre. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, se proporciona un procedimiento de lavado para tejidos que comprende el lavado de tejidos en un licor de lavado acuoso que comprende dicha proteasa de carga neta cero o positiva y un material adyuvante, teniendo dicho licor de lavado una alta fuerza ionica. Por alta fuerza ionica se entiende licor de lavado, cuya conductividad es de por encima de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

En esta realizacion, las mutaciones en las proteasas se seleccionan preferiblemente de: uno o varios de los siguientes conjuntos de mutaciones T022R-S024R, T022R-G115R, S009A-T022R.

En un aspecto, las anteriores proteasas de alta fuerza ionica forman parte de una composicion detergente que se diluye en agua, tipicamente dentro de una lavadora, para formar un licor de lavado, cuya conductividad es de por encima de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

La carga de las variantes de proteasa se expresa en relacion a la proteasa de la subtilisina GG36 de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. Los aminoacidos que confieren una sola carga negativa son D y E y los que confieren una unica carga positiva son R, H y K. Cualquier cambio de aminoacido en comparacion con la SEQ Id NO: 1 que cambia una carga se usa para calcular la carga de la variante de proteasa. Por ejemplo, la introduccion de una mutacion de carga negativa a partir de una posicion neutra de tipo silvestre, anadira una carga neta de -1 a la variante de proteasa, mientras que la introduccion de una mutacion de carga negativa (D o E) a partir de un resto de aminoacido positivo de tipo silvestre (R, H o K) anadira una carga neta de -2. Sumando los cambios de carga de todos los restos de aminoacidos que son diferentes para la variante de proteasa en comparacion con la proteasa de la subtilisina GG36 de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, proporciona el cambio de carga de la variante de proteasa.

El intervalo de cargas preferidas para proteasas que se usa en soluciones detergentes de lavado de ropa de baja conductividad es de -5, -4, -3, -2, -1,0, particularmente -2, -1;

El intervalo de cargas preferidas para proteasas que se usa en soluciones detergentes de lavado de ropa de alta conductividad es de +5, +4, +3, +2, +1, 0, particularmente +2, +1. Al seleccionar correctamente la carga, se puede obtener de forma inesperada una mejora de los niveles de rendimiento de limpieza.

Las soluciones de baja conductividad se definen por tener una conductividad de aproximadamente 0,1 mS/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente 0,3 mS/cm a aproximadamente 2,5 mS/cm o aproximadamente 0,5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm.

Las soluciones de alta conductividad se definen por tener una conductividad de aproximadamente aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3,5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

Metodos para preparar proteasas de agua fria

Se conocen en la tecnica varios metodos adecuados para generar secuencias de polinucleotidos modificados, incluidos, aunque no de forma limitativa, la mutagenesis por saturacion de sitios, mutagenesis de barrido, mutagenesis de insercion, mutagenesis por eliminacion, mutagenesis aleatoria, mutagenesis de sitio dirigido y de evolucion dirigida, asi como otros diversos enfoques de recombinacion. Los metodos usados comunmente incluyen barajado de ADN (vease, Stemmer, Proc Natl Acad Sci U S A. 25:10747-51 [1994]), metodos basados en la recombinacion no homologa de genes (p. ej., ITCHY) (Ostermeier y col., Bioorg Med Chem. 7:2139-44 [1999]), SCRATCHY (Lutz y col. Proc Natl Acad Sci USA. 98:11248-53 [2001]), SHIPREC (Sieber y col., Nat Biotechnol., 19:456-60 [2001]), y NRR (Bittker y col., Nat Biotechnol., 20:1024-9 [2001]; Bittker y col., Proc Natl Acad Sci. USA. 101:7011-6 [2004]) y metodos que se basan en el uso de oligonucleotidos para insertar mutaciones, eliminaciones y/o inserciones aleatorias y dirigidas (Ness y col., Nat Biotechnol. 20:1251-5 [2002]; Coco y col., Nat Biotechnol., 20:1246-50 [2002]; Zha y col., Chembiochem. 3:34-9 [2003], Glaser y col., J Immunol., 149:3903-13 [1992], Sondek y Shortle, Proc Natl Acad Sci USA 89:3581-5 [1992],

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Yanez y col., Nucleic Acids Res., 32:e158 [2004], Osuna y col., Nucleic Acids Res., 32:e136 [2004], Gaytan y col., Nucleic Acids Res., 29:E9 [2001], y Gaytan y col., Nucleic Acids Res., 30:e84 [2002]).

En algunas realizaciones, el polinucleotido parental de longitud completa se une a un plasmido de expresion adecuado y se usa el siguiente metodo de mutagenesis para facilitar la construccion de la proteasa modificada, aunque se pueden usar otros metodos. El metodo se basa en el descrito por Pisarchik y col. (Pisarchik y col., Prot. Eng. Des. Select., 20:257-265 [2007]). En algunas realizaciones, se proporciona una ventaja anadida, en tanto que la enzima de restriccion usada en la presente memoria corta por fuera de su secuencia de reconocimiento, lo que permite la digestion de practicamente cualquier secuencia de nucleotidos y previene la formacion de una cicatriz en el sitio de restriccion. En primer lugar, como se describe en la presente memoria, se obtiene un gen de origen natural que codifica la proteasa de longitud completa, se secuencia y se barre para determinar uno o mas puntos en los que se desea efectuar una mutacion (eliminacion, insercion, sustitucion o una combinacion de las mismas) en uno o mas aminoacidos. La mutacion del gen para cambiar su secuencia para conformarlo a la secuencia deseada se consigue mediante la extension del cebador, de acuerdo con los metodos normalmente conocidos. Los fragmentos a la izquierda y a la derecha del punto o puntos de mutacion deseados se amplifican mediante PCR y para incluir el sitio de restriccion £am1104I. Los fragmentos izquierdo y derecho se digieren con £am1104I, para generar una pluralidad de fragmentos que tienen salientes complementarios de tres bases, que se agrupan y ligan a continuacion, para generar una biblioteca de secuencias modificadas que contienen una o mas mutaciones. Este metodo previene la aparicion de mutaciones de desplazamiento de fase. Ademas, este metodo simplifica el procedimiento de mutagenesis, debido a que todos los oligonucleotidos se pueden sintetizar, de forma que tengan los mismos sitios de restriccion y no se requieran conectores sinteticos para crear los sitios de restriccion, como se requieren en algunos otros metodos.

En los ejemplos 31 a 43 se proporciona un conjunto no limitante de metodos para producir las proteasas de agua fria.

Agentes de matizado de tejidos adecuados

Los abrillantadores opticos fluorescentes emiten, al menos, algo de luz visible. En cambio, los agentes de matizado de tejidos pueden alterar el tinte de una superficie puesto que absorben, al menos, una parte del espectro de la luz visible. Los agentes de matizado de tejidos adecuados incluyen tintes, conjugados de tinte- arcilla, y pigmentos que satisfacen las necesidades del Metodo de ensayo 1 en la seccion de metodos de ensayo de la presente memoria descriptiva. Los tintes adecuados incluyen pequenas moleculas de tinte y moleculas polimericas. Los tintes de moleculas pequenas adecuados tintes seleccionados del grupo que consiste en tintes que se encuentran en las clasificaciones de indice de color (C.I.) de Azul Directo, Rojo Directo, Violeta Directo, Azul Acido, Rojo Acido, Violeta Acido, Azul Basico, Violeta Basico y Rojo Basico o mezclas de los mismos.

Los colorantes matizantes se formulan para depositarse sobre los tejidos a partir del licor de lavado para mejorar la percepcion de blancura del tejido. En un aspecto, el colorante del agente matizante es azul o violeta. En un aspecto, el colorante o colorantes de sombreado pueden tener una longitud de onda de absorcion maxima de 550 nm a 650 nm o en un aspecto, de 570 nm a 630 nm. Una combinacion de tintes, que en conjunto, tienen efecto visual sobre el ojo humano, como un colorante unico que tiene una longitud de onda de absorcion maxima sobre poliester de 550 nm a 650 nm, o de 570 nm a 630 nm. Esto puede proporcionarse, por ejemplo, mezclando un tinte rojo y un tinte verde-azulado para obtener una tonalidad azul o violeta.

Los colorantes son moleculas organicas coloreadas que son solubles en medios acuosos que contienen tensioactivos. Los colorantes se describen en “Industrial Dyes”, Wiley VCH 2002, K. Hunger (editor). Los colorantes se enumeran en el indice internacional del color, publicado por la Sociedad de tintoreros y coloristas y la asociacion americana de quimicos y coloristas textiles. Los colorantes se seleccionan tipicamente de las clases de colorantes basicos, acidos, hidrofobos, directos y polimericos y conjugados de colorantes. Los expertos en la tecnica de formulacion de detergentes son capaces de seleccionar tintes de matizado adecuados a partir de estas publicaciones. Los colorantes de matizacion polimericos estan disponibles en el mercado, por ejemplo, de Milliken, Spartanburg, Carolina del Sur, EE. UU.

Los ejemplos de colorantes adecuados son el Violeta Directo 7, el Violeta Directo 9, el Violeta Directo 11, el Violeta Directo 26, el Violeta Directo 31, el Violeta Directo 35, el Violeta Directo 40, el Violeta Directo 41, el Violeta Directo 51, el Violeta Directo 66, el Violeta Directo 99, Violeta Acido 50, Azul Acido 9, Violeta Acido 17, Negro Acido 1, Rojo Acido 17, Azul Acido 29, Violeta Disolvente 13, Violeta Disperso 27 Violeta Disperso 26, Violeta Disperso 28, Violeta Disperso 63 y Violeta Disperso 77, Azul Basico 16, Azul Basico 65, Azul Basico 66, Azul Basico 67, Azul Basico 71, Azul Basico 159, Violeta Basico 19, Violeta Basico 35, Violeta Basico 38, Violeta Basico 48; Azul Basico 3, Azul Basico 75, Azul Basico 95, Azul Basico 122, Azul Basico 124, Azul Basico 141, Tintes de Tiazolio, Azul Reactivo 19, Azul Reactivo 163, Azul Reactivo 182, Azul Reactivo 96, Liquitint® Violeta CT (Milliken, Spartanburg, EE. UU.) y Azo-CM-Celulosa (Megazyme, Bray, Republica de Irlanda).

Los agentes de matizado de tejidos anteriormente mencionados pueden usarse en combinacion (puede usarse cualquier mezcla de agentes de matizado de tejidos). Pueden adquirirse agentes de matizado de tejidos adecuados de Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.; Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suiza; BASF, Ludwigshafen, Alemania; Dayglo Color Corporation, Mumbai, India; Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, EE. UU.; Dystar,

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Frankfurt, Alemania; Lanxess, Leverkusen, Alemania; Megazyme, Wicklow, Irlanda; Clariant, Muttenz, Suiza; Avecia, Manchester, Reino Unido y/o segun los ejemplos contenidos en la presente memoria.

Se describen otros agentes matizantes adecuados con mas detalle en el documento US-7.208.459 B2.

Encapsulados

En un aspecto del producto de consumo mencionado anteriormente, dicho producto de consumo puede comprender, basandose en el peso total del producto de consumo, de aproximadamente un 0,001 % en peso a aproximadamente un 5 % en peso, de aproximadamente un 0,01 % en peso a aproximadamente un 2 % en peso o incluso de aproximadamente un 0,03 % en peso a aproximadamente un 0,5 % en peso de dicho encapsulado que comprende un perfume, dicho perfume encapsulado, en un aspecto, comprende una microcapsula de perfume. Los encapsulados adecuados comprenden tipicamente un nucleo y una envoltura que tiene una superficie interna y externa, recubriendo dicha envoltura a dicho nucleo. En un aspecto de dicho encapsulado, dicho nucleo puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en perfumes; abrillantadores; tintes; repelentes de insectos; siliconas; ceras; agentes saborizantes; vitaminas; agentes suavizantes de tejidos; agentes para el cuidado de la piel, en un aspecto, parafinas; enzimas; agentes antibacterianos; blanqueadores; estimulantes sensoriales; y mezclas de los mismos; y dicha envoltura puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenos; poliamidas; poliestirenos; poliisoprenos; policarbonatos; poliesteres; poliacrilatos; aminoplastos, en un aspecto, dicho aminoplasto puede comprender poliureas, poliuretano, y/o poliureauretano, en un aspecto, dicha poliurea puede comprender polioximetilenurea y/o melamina formaldehido; poliolefinas; polisacaridos, en un aspecto dicho polisacarido puede comprender algunato y/o quitosana; gelatina; goma laca; resinas epoxi; polimeros de vinilo; compuestos inorganico insolubles en agua; silicona; y mezclas de los mismos.

En un aspecto de dicho encapsulado, dicho nucleo puede comprender perfume.

En un aspecto de dicho encapsulado, dicha envoltura puede comprender melamina formaldehido y/o melamina formaldehido reticulada.

En un aspecto, los encapsulados adecuados pueden comprender un material de nucleo y una envoltura, rodeando dicha envoltura al menos parcialmente dicho material de nucleo, que se describe. Al menos un 75 %, un 85 % o incluso un 90 % de dichos encapsulados pueden tener una resistencia a la fractura de aproximadamente de 0,2 MPa a aproximadamente 10 MPa, de aproximadamente 0,4 MPa a aproximadamente 5 MPa, de aproximadamente 0,6 MPa a aproximadamente 3,5 MPa o incluso de aproximadamente 0,7 MPa a aproximadamente 3 MPa; y un escape de agente beneficioso de 0 % a aproximadamente 30 %, de 0 % a aproximadamente 20 %, o incluso de 0 % a aproximadamente 5 %.

En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o incluso 90 % de dichos encapsulados pueden tener un tamano de particulas de aproximadamente 1 micrometros a aproximadamente 80 micrometros, de aproximadamente 5 micrometros a 60 micrometros, de aproximadamente 10 micrometros a aproximadamente 50 micrometros, o incluso de aproximadamente 15 micrometros a aproximadamente 40 micrometros.

En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o incluso 90 % de dichos encapsulados pueden tener un espesor de pared de la particula de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 180 nm, o incluso de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 160 nm.

En un aspecto, dicho material de nucleo de los encapsulados puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en una materia prima de perfume y/u opcionalmente un material seleccionado del grupo que consiste en aceite vegetal, que incluye aceites vegetales puros y/o mezclados incluidos aceite de ricino, aceite de coco, aceite de algodon, aceite de orujo de uva, colza, aceite de soja, aceite de maiz, aceite de palma, aceite de lino, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de coco, aceite de almendra de palma, aceite de ricino, aceite de limon y mezclas de los mismos; esteres de aceites vegetales, esteres, incluidos adipato de dibutilo, ftalato de dibutilo, benciladipato de butilo, octiladipato de bencilo, fosfato de tricresilo, fosfato de trioctilo y mezclas de los mismos; hidrocarburos de cadena lineal o ramificada, incluidos aquellos hidrocarburos de cadena lineal o ramificada que tienen un punto de ebullicion superior a aproximadamente 80 °C; terfenilos parcialmente hidrogenados, ftalatos de dialquilo, alquilbifenilo, incluido monoisopropilbifenilo, naftaleno alquilado, incluido dipropilnaftaleno, sustancias volatiles procedentes del petroleo incluidos queroseno, aceite mineral y mezclas de los mismos; disolventes aromaticos, incluidos benceno, tolueno y mezclas de los mismos; aceites de silicona; y mezclas de los mismos.

En un aspecto, dicho material de la pared de los encapsulados puede comprender una resina que incluye el producto de reaccion de un aldehido y una amina, los aldehidos adecuados incluyen formaldehido. Las aminas adecuadas incluyen melamina, urea, benzoguanamina, glicolurilo, y mezclas de los mismos. Las melaminas adecuadas incluyen metilol melamina, metilol melamina metilada, iminomelamina y mezclas de los mismos. Las ureas adecuadas incluyen dimetilol urea, dimetilol urea metilada, urea-resorcinol, y mezclas de los mismos.

En un aspecto, los eliminadores de formaldehido adecuados se pueden emplear con los encapsulados, por ejemplo, en una suspension acuosa de capsulas y/o se anaden al producto de consumo antes, durante o despues de anadir los encapsulados a dicho producto de consumo.

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Las capsulas adecuadas se pueden preparar siguiendo las ensenanzas de USPA 2008/0305982 A1; y/o de USPA 2009/0247449 A1. Alternativamente, las capsulas adecuadas se pueden adquirir de Appleton Papers Inc. de Appleton, Wisconsin EE. UU.

Ademas, los materiales para fabricar los encapsulados anteriormente mencionados se pueden obtener de Solutia Inc. (St Louis, Missouri EE. UU.), Cytec Industries (West Paterson, New Jersey EE. UU.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri EE. UU.), CP Kelco Corp. de San Diego, California, EE. UU.; BASF AG de Ludwigshafen, Alemania; Rhodia Corp. de Cranbury, Nueva Jersey, EE. UU.; Hercules Corp. de Wilmington, Delaware, EE. UU.; Agrium Inc. de Calgary, Alberta, Canada, ISP de New Jersey EE. UU., Akzo Nobel de Chicago, IL, EE. UU.; Stroever Shellac Bremen de Bremen, Alemania; Dow Chemical Company de Midland, MI, EE. UU.; Bayer AG de Leverkusen, Alemania; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, EE. Uu.

Metodo para preparar una variante de la proteasa parental

En los ejemplos 31 a 43 se proporciona un conjunto no limitante de metodos para producir las proteasas.

Numeracion de aminoacidos de proteasa, nomenclatura de enzimas y definiciones adicionales

La numeracion de las posiciones de aminoacidos usada en esta patente es el sistema de numeracion de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. Cada posicion de aminoacido de cada variante de proteasa, incluida cada variante de proteasa, esta numerada de acuerdo con la numeracion de la posicion de aminoacido correspondiente en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la Figura 1, que se determina por alineacion de la secuencia de aminoacidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.

Un esquema de numeracion alternativo es numerar la secuencia de aminoacidos especifica de la proteasa de la subtilisina GG36 de B. lentus, que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. Ninguna de las posiciones de aminoacidos de las variantes de proteasa, incluidas las variantes de proteasa descritas en la presente memoria, se numeran usando este esquema de numeracion alternativo.

En la descripcion de las variantes de proteasa en la presente memoria, se usa la siguiente nomenclatura para facilitar la referencia: Aminoacido(s) original(es):posicion (posiciones) del (de los) aminoacido(s) sustituido(s).

Las mutaciones se nombran mediante el codigo de una letra para el aminoacido parental, seguido de un numero de posicion de tres digitos y a continuacion, el codigo de una letra para la variante del aminoacido. Por ejemplo, la mutacion de glicina (G) en la posicion 87 a serina (S) se representa como “G087S” o “G87S”. Las mutaciones multiples se indican mediante la insercion de “-” entre las mutaciones. Las mutaciones en las posiciones 87 y 90 se representan como “G087S-A090Y” o “G87S-A90Y” o “G87S + A90Y” o “G087S + A090Y”. Para las deleciones se usa el codigo de una sola letra “Z”. Para una insercion con relacion a la secuencia genitora, el codigo de una sola letra “Z” se encuentra a la izquierda del numero de la posicion. Para una delecion, el codigo de una sola letra “Z” se encuentra a la derecha del numero de la posicion. Para inserciones, el numero de la posicion es el numero de la posicion antes del aminoacido o aminoacidos insertados, mas 0,01 por cada aminoacido. Por ejemplo, una insercion de tres aminoacidos alanina (A), serina (S) y tirosina (Y) entre la posicion 87 y la 88 se muestra como “Z087.01A- Z087.02S-Z087.03Y”. Por lo tanto, la combinacion de todas las mutaciones mencionadas anteriormente mas una delecion en la posicion 100 es: “G087S- Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”.

En todos los casos, se emplea la abreviatura de aminoacidos de una sola letra o en triplete aceptada por la IUPAC. La letra X sola se refiere a cualquiera de los 20 aminoacidos.

La expresion “de tipo silvestre”, con referencia a una secuencia de aminoacidos o a una secuencia de acidos nucleicos, indica que la secuencia de aminoacidos o la secuencia de acidos nucleicos es una secuencia nativa o de origen natural. En la presente memoria, la expresion “de origen natural” se refiere a cualquier elemento (p. ej., proteinas, aminoacidos o secuencias de acidos nucleicos) que se encuentran en la naturaleza (es decir, no se han manipulado por medio de procedimientos recombinantes). En la presente memoria, la expresion “de origen no natural” se refiere a cualquier cosa que no se encuentra en la naturaleza (p. ej., acidos nucleicos recombinantes producidos en el laboratorio).

Como se usa en la presente descripcion con respecto a las posiciones de residuos de aminoacidos, “correspondiente a” o “corresponde a” o “corresponde” se refiere a un residuo de aminoacido en la posicion enumerada en una proteina o peptido o un residuo de aminoacido que es analogo, homologo o equivalente a un residuo enumerado en una proteina o peptido. En la presente memoria, “region correspondiente” se refiere, generalmente, a una posicion analoga en una proteina relacionada o en una proteina de referencia.

Las expresiones “derivado de” y “obtenido a partir de” se refieren no solamente a una proteasa producida o que pueda producirse por medio de una cepa del organismo en cuestion, sino tambien, a una proteina codificada por una secuencia de ADN aislada a partir de dicha cepa y producida en un organismo hospedador que contiene dicha secuencia de ADN.

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Ademas, la expresion se refiere a una proteasa codificada por una secuencia de ADN de origen sintetico y/o de ADNc y que tiene las caracterfsticas de identificacion de la proteasa en cuestion. Como ejemplo, “proteasas derivadas de Bacillus” se refiere a aquellas enzimas que tienen actividad proteolftica producidas de forma natural por Bacillus, ademas de serina proteasas como las producidas por fuentes de Bacillus, pero que a traves del uso de tecnicas de ingenierfa genetica son producidas por otros organismos no Bacillus transformados con un acido nucleico que codifica las serina proteasas.

El termino “identico” en el contexto de dos secuencias de acidos nucleicos o polipeptidos se refiere a los restos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para obtener la correspondencia maxima, que se mide usando una de las siguientes comparaciones de secuencias o algoritmos de analisis.

En la presente memoria, “genes homologos” se refiere a un par de genes de especies diferentes, pero por lo general relacionadas, que se corresponden entre sf y que son identicas o muy similares entre sf. La expresion abarca genes que estan separados por especiacion (es decir, el desarrollo de nuevas especies) (p. ej., genes ortologos), asf como genes que han sido separados por duplicacion genetica (p. ej., genes paralogos).

El termino forma “madura” de una protefna, polipeptido o peptido se refiere a la forma funcional de la protefna, polipeptido o peptido sin la secuencia del peptido senal y sin la secuencia del propeptido.

En la presente memoria, “homologfa” se refiere a similitud o identidad de secuencia, siendo preferida identidad. La homologfa se puede determinar usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica (vease, p. ej., Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970\; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; programas informaticos tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux y col., Nucl. Acid Res. 12:387-395 [1984]). Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP. PILEUP crea una alineacion de multiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos por pares. Tambien puede representar un arbol que muestra las relaciones de agrupacion usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng y Doolittle (vease Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351360 [1987]). El metodo es similar al descrito por Higgins y Sharp (vease Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Los parametros utiles de PILEUP incluyen una ponderacion de hueco por defecto de 3,00, una ponderacion por longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos terminales ponderados. Otro ejemplo de un algoritmo util es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul y col., (vease Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; y Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Un programa BLAST particularmente util es el programa WU-BlAsT-2 (vease, Altschul y col., Meth. Enzymol. 266:460-480 [1996]). WU-BlAST-2 usa varios parametros de busqueda, la mayorfa de los cuales se establecen en los valores por defecto. Los parametros ajustables se ajustan con los valores siguientes: longitud de solapamiento =1, fraccion de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = 11. Los parametros HSP S y HSP S2 son valores dinamicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composicion de la secuencia particular y de la composicion de la base de datos concreta contra la que se busca la secuencia de interes. Sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.

El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia de referencia y una secuencia de prueba de interes se puede determinar facilmente por el experto en la tecnica. El porcentaje de identidad compartido por las secuencias de polinucleotidos o polipeptidos se determina por comparacion directa de la informacion de la secuencia entre las moleculas mediante alineacion de las secuencias y determinacion de la identidad por metodos conocidos en la tecnica. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, (vease, Altschul, y col, J. Mol. Biol., 215:403-410 [1990]). El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del centro nacional de informacion biotecnologica. Este algoritmo implica en primer lugar, identificar pares de secuencias de alta puntuacion (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuacion umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Estos aciertos de la palabra vecina iniciales actuan como puntos de partida para encontrar HSP mas largos que los contienen. Los aciertos de palabras se expanden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan, para que se pueda aumentar en lo que respecta a la puntuacion de alineacion acumulativa. La extension de los aciertos de palabras se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulativa se reduce en una cantidad X desde un valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulativa llega a cero o menos; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLAST usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease, Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1992]) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N'-4 y una comparacion de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza entonces un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, p. ej, Karlin y Altschul, anteriormente citado). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos se producirfa por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a un acido nucleico de la serina proteasa de esta divulgacion si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de ensayo con un acido nucleico de la serina proteasa es inferior a aproximadamente 0,1, mas preferiblemente, inferior a aproximadamente 0,01 y mas preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001. Cuando el acido nucleico de prueba codifica un polipeptido de serina proteasa, se considera similar a un acido nucleico

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de la serina proteasa especificada si la comparacion da lugar a una probabilidad de suma mas pequena de menos de aproximadamente 0,5 y mas preferiblemente de menos de aproximadamente 0,2.

El porcentaje “identico” o de “identidad” en el contexto de dos o mas secuencias de acidos nucleicos o de polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de acidos nucleicos o restos de aminoacidos, respectivamente, que son iguales, cuando se comparan y se alinean en busca de la maxima similitud, como se determina usando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. El “porcentaje de identidad de secuencia” o “% de identidad” o “% de identidad de secuencia” o “% de identidad de secuencia de aminoacidos” de una secuencia de aminoacidos objeto respecto de una secuencia de aminoacidos de referencia (es decir, de consulta), significa que la secuencia de aminoacidos objeto es identica (es decir, basandose en aminoacido por amino acido) en un porcentaje especificado, a la secuencia de amino acidos de consulta sobre una longitud de comparacion, cuando se alinean las secuencias de manera optima. Por lo tanto, un 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos o un 80 % de identidad con respecto a dos secuencias de aminoacidos, significa que el 80 % de los restos de aminoacidos de dos secuencias de aminoacidos alineadas de manera optima son identicos.

El “porcentaje de identidad de secuencia” o “% de identidad” o “% de identidad de secuencia” o “% de identidad de secuencia de nucleotidos” de una secuencia en cuestion de acidos nucleicos respecto de una secuencia de acidos nucleicos de referencia (es decir, de consulta), significa que la secuencia en cuestion de acidos nucleicos es identica (es decir, basandose en nucleotido por nucleotido para una secuencia de polinucleotidos), en un porcentaje especificado, a la secuencia de consulta en una longitud de comparacion, cuando se alinean las secuencias de manera optima. Por lo tanto, un 80 % de identidad de secuencia de nucleotidos o un 80 % de identidad con respecto a dos secuencias de acido nucleico, significa que el 80 % de los restos de nucleotidos en dos secuencias de acido nucleico alineadas optimamente son identicos. En algunos aspectos, el porcentaje de identidad de secuencia o el % de identidad de secuencia de una secuencia en cuestion respecto de una secuencia de consulta se puede calcular mediante la alineacion optima de las dos secuencias y la comparacion de las dos secuencias optimamente alineadas sobre la longitud de comparacion. Se determina el numero de posiciones en la alineacion optima en la que se producen restos identicos en ambas secuencias, proporcionando de este modo el numero de posiciones coincidentes y despues, se divide el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones de la longitud de comparacion (que, a menos que se especifique otra cosa, es la longitud de la secuencia de consulta). El numero resultante se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia en cuestion a la secuencia de consulta.

“Alineacion optima” u “optimamente alineadas” se refiere a la alineacion de dos (o mas) secuencias que dan el mayor porcentaje de puntuacion de identidad. Por ejemplo, el alineamiento optimo de dos secuencias de proteinas se puede lograr mediante la alineacion manual de las secuencias, de tal manera que se alinea entre si el numero maximo de restos de aminoacidos identicos en cada secuencia o mediante el uso de programas o procedimientos de software descritos en la presente memoria o conocidos en la tecnica. El alineamiento optimo de dos secuencias de acidos nucleicos se puede lograr mediante la alineacion manual de las secuencias, de tal manera que el numero maximo de restos de nucleotidos identicos en cada secuencia estan alineados entre si o mediante el uso de programas o procedimientos de software descritos en la presente memoria o conocidos en la tecnica. En algunos aspectos, dos secuencias de polipeptidos se consideran “optimamente alineadas” cuando se alinean usando parametros definidos, tales como una matriz de sustitucion de aminoacidos definida, penalizacion por existencia de huecos (tambien denominado penalizacion por apertura de huecos) y penalizacion por extension de huecos, a fin de lograr la mayor puntuacion de similitud posible para ese par de secuencias. Con frecuencia, se usa la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease, Henikoff y Henikoff, anteriormente citado) como matriz de sustitucion de puntuacion por defecto en los algoritmos de alineacion de secuencias de polipeptidos (p. ej., BLASTP). La penalizacion por existencia de hueco se impone por la introduccion de un unico hueco para un aminoacido en una de las secuencias alineadas y la penalizacion por extension de hueco se impone para cada posicion de los restos en el hueco. Los parametros de alineacion ejemplares empleados son: matriz de puntuacion BLOSUM62, penalizacion por existencia de hueco = 11 y penalizacion por extension de hueco = 1. La puntuacion de alineacion se define por las posiciones de los aminoacidos de cada secuencia en la que la alineacion comienza y termina (p. ej., la ventana de alineacion) y, opcionalmente, por la insercion de un hueco o multiples huecos en una o ambas secuencias, a fin de lograr la puntuacion de similitud mas alta posible.

El alineamiento optimo entre dos o mas secuencias se puede determinar manualmente mediante inspeccion visual o mediante el uso de un ordenador, tal como, aunque no de forma limitativa por ejemplo, el programa BLASTP para secuencias de aminoacidos y el programa BLASTN para secuencias de acidos nucleicos (vease, p. ej., Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); vease tambien, el sitio web del centro nacional de informacion biotecnologica (NCBI)).

Enzimas no inmunoequivalentes y/o enzimas adicionales

Los productos de consumo pueden comprender una o mas enzimas que proporcionan beneficios en el rendimiento de limpieza y/o en el cuidado de tejidos. Los ejemplos de enzimas adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mananasas, pectato liasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas,

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tannasas, pentosanasas, malanasas, p-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de los mismos. Una combinacion tipica es un coctel enzimatico que puede comprender, por ejemplo, una proteasa y lipasa en conjuncion con amilasa. Cuando estan presentes en un producto de consumo, las enzimas adicionales antes mencionadas, pueden estar presentes a niveles de aproximadamente un 0,00001 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,0001 % a aproximadamente un 1 % o incluso de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 % de la proteina enzimatica por peso del producto de consumo.

En un aspecto, las enzimas adecuadas incluirian una proteasa. Las proteasas adecuadas incluyen metaloproteasas y serina proteasas, incluidas serina proteasas neutras o alcalinas, tales como subtilisinas (EC 3.4.21.62). Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. En un aspecto, dicha proteasa adecuada puede ser de origen microbiano. Las proteasas adecuadas incluyen mutantes modificados quimica o geneticamente de las proteasas adecuadas anteriormente mencionadas. En un aspecto, la proteasa adecuada puede ser una serina proteasa, tal como una proteasa alcalina microbiana o/y una proteasa de tipo tripsina. Los ejemplos de proteasas neutras o alcalinas adecuadas incluyen:

(a) subtilisinas (EC 3.4.21.62), incluidas las derivadas de Bacillus tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus y B. gibsonii descritas en los documentos US 6.312.936 B1, US 5.679.630, US 4.760.025, US 7.262.042 y WO09/021867.

(b) proteasas similares a tripsina o quimiotripsina, tales como tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino), incluida la proteasa de Fusarium descrita en el documento US-5288627 y las quimiotripsina proteasas derivadas de Cellumonas descritas en la patente US-2008/0063774A1.

(c) metaloproteasas, incluidas las derivadas de Bacillus amyloliquefaciens descritas en la patente US- 2008/0293610A1.

Las proteasas adecuadas incluyen las derivadas de Bacillus gibsonii o Bacillus Lentus.

Las enzimas proteasas adecuadas comerciales incluyen las que se venden con los nombres comerciales Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® y Esperase® por Novozymes A/S (Dinamarca), las que se venden con el nombre comercial Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® y Purafect OXP® por Genencor International, las que se venden con el nombre comercial Opticlean® y Optimase® por Solvay Enzymes, las comercializadas por Henkel/ Kemira, especialmente BLAP (secuencia mostrada en la Figura 29 de US-5.352.604 con las siguientes mutaciones S99D + S101 R + S103A + V104I + G159S, denominada a continuacion como BLAP), BLAP R (BLAP con S3T + V4I + V199M + V205I + L217D), BLAP X (BLAP con S3T + V4I + V205I) y BLAP F49 (BLAP con S3T + V4I + A194P + V199M + V205I + L217D) - todas de Henkel/Kemira; y KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus con mutaciones A230V + S256G + S259N) de Kao.

En un aspecto, el producto de consumo puede comprender una proteasa que no es inmunoequivalente a la proteasa de esta invencion. Para los fines de esta invencion, una proteasa inmunoequivalente tendra un alto grado de identidad (>80 %) con BPN' y presentara reaccion cruzada con el mismo anticuerpo. Las enzimas no inmunoequivalentes adecuadas incluiran las derivadas de Bacillus lentus, Bacillus gibsonii y la metaloproteasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens.

Las alfa-amilasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fungico. Se incluyen los mutantes modificados quimica o geneticamente (variantes). Una alfa-amilasa alcalina adecuada puede derivarse de una cepa de Bacillus, tal como Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis u otras Bacillus sp. tales como Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 (USP 7.153.818) DSM 12368, DSMZ n.° 12649, KSM AP1378 (US-6.979.731), KSM K36 o KSM K38 (US-6.916.645). Las amilasas adecuadas incluyen:

(a) las variantes descritas en los documentos WO 94/02597, US-6.297.037, US-7.378.264 y US-5.763.385, especialmente las variantes con sustituciones en una o mas de las siguientes posiciones en comparacion con la enzima nombrada como SEQ ID NO: 2 en el documento US-7.378.264: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391,408 y 444.

(b) las variantes descritas en los documentos USP 5.856.164 y US-6.673.589, US-6.093.562, US-6.187.576 y la patente US-2008/0193999A1, especialmente las variantes con una o mas sustituciones en las siguientes posiciones en comparacion con la enzima AA560 nombrada como SEQ ID NO: 12 en el documento US PA 2008/0193999A1:

26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231,256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311, 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361, 378, 383, 419, 421, 437, 441, 444, 445, 446, 447, 450, 461, 471, 482, 484, preferiblemente que contienen tambien las deleciones de D183* y G184*.

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(c) variantes que muestran al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 en la patente US-2008/0193999A1, la enzima de tipo silvestre procedente de Bacillus sp.722, especialmente variantes con eliminaciones en las posiciones 183 y 184 y las variantes descritas en el documento US-6.187.576

(d) variantes que muestran al menos un 95 % de identidad con la enzima de tipo silvestre procedente de Bacillus sp.707 (SEQ ID NO: 7 en el documento US-6.093.562), especialmente las que comprenden una o mas de las siguientes mutaciones M202, M208, S255, R172, y/o M261. En un aspecto, dicha amilasa comprende una o mas de M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, M202W, S255N y/o R172Q. Son especialmente adecuadas aquellas que comprenden las mutaciones M202L o M202T.

Las alfa-amilasas adecuadas comerciales incluyen DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL® y BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Viena Austria, RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS® y PURASTAR OXAM® (Genencor International Inc., Palo Alto, California) y KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku Tokyo 103-8210, Japon). En un aspecto, las amilasas adecuadas incluyen NATALASE®, STAINZYME® y STAINZYME PLUS® y mezclas de las mismas.

En un aspecto, dicha enzima adicional se puede seleccionar del grupo que consiste en: lipasas, incluidas “lipasas de primer ciclo”, tales como las descritas en las patentes US-6.939.702 B1 y US-2009/0217464. En un aspecto, la lipasa es una lipasa de primer lavado, en un aspecto, una variante de la lipasa de tipo silvestre procedente de Thermocyces lanuginosus que comprende las mutaciones T231R y N233R. La secuencia de tipo silvestre tiene los 269 aminoacidos (aminoacidos 23-291) del numero de registro Swissprot, Swiss-Prot O59952 (derivada de Thermocyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)). Lipasas adecuadas incluirian las comercializadas con los nombres comerciales Lipex®, Lipolex® y Lipoclean® de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.

En un aspecto, la composicion comprende una variante de la lipasa de Thermocyces lanuginosa que tiene > 90 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de tipo silvestre y que comprende una sustitucion o sustituciones en T231 y/o N233, en un aspecto, T231R y N233R.

En un aspecto, otras enzimas incluyen celulasas de origen bacteriano o fungico. Se incluyen los mutantes modificados quimicamente u obtenidos mediante ingenieria de proteinas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los generos Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej., las celulasas fungicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum divulgadas en los documentos US-4.435.307, US-5.648.263, US-5.691.178, US-5.776.757 y US-5.691.178. Las celulasas adecuadas incluyen las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Los ejemplos de dichas celulasas son las celulasas descritas en los documentos US-5.520.838, US-5.948.672, US-5.919.691, US- 6.001.639 y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa, tales como las descritas en los documentos US-6.114.296, US-5.457.046, US-5.457.046, US-5.686.593, US-5.763.254, US-6.117.664, US PA 2009/0170747A1 y PCT/DK98/00299. Las celulasas disponibles en el mercado incluyen CELLUZYME®, y CAREZYME® (Novozymes A/S), CLAZINASE®, y PURADAX HA® (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)® (Kao Corporation).

En un aspecto, la celulasa puede ser una celulasa bacteriana de limpieza. Dichas celulasas bacterianas de limpieza son endo beta 1,4-glucanasas y tienen una estructura que no comprende un modulo de union a carbohidrato de clase A (MUC). Una MUC de clase A se define de acuerdo con A. B Boraston y col. Biochemical Journal 2004, Volumen 382 (parte 3), paginas 769-781. En particular, la celulasa no comprende una CBM de clase A procedente de las familias 1, 2a, 3, 5 y 10.

En un aspecto, la celulasa bacteriana de limpieza puede ser una glicosil hidrolasa que tiene actividad enzimatica hacia sustratos de celulosa amorfa, en donde la glicosil hidrolasa se selecciona de familias 5, 7, 12, 16, 44 o 74 de GH. En un aspecto, la celulasa puede ser una glicosil hidrolasa seleccionada de la familia 5 de GH. En un aspecto, la celulasa puede ser Celluclean®, suministrada por Novozymes. Esta celulasa se describe con mas detalle en el documento US-7.141.403. La definicion de la familia de la glicosil hidrolasa (GH) se ha descrito con mas detalle en Biochem J. 1991, v280, 309-316.

Otra celulasa bacteriana de limpieza adecuada es una glicosil hidrolasa que tiene actividad enzimatica hacia sustratos tanto de xiloglucano como de celulosa amorfa, en donde la glicosil hidrolasa se selecciona de familias 5, 12, 44 o 74 de GH. En un aspecto, la glicosil hidrolasa se selecciona de la familia 44 de GH. La enzima glicosil hidrolasa puede pertenecer a la familia de la glicosil hidrolasa 44.

Las glicosil hidrolasas adecuadas se pueden seleccionar del grupo que consiste en: glicosil hidrolasas de la familia 44 de GH de Paenibacillus polyxyma (natural), tal como, XYG1006 descrita en el documento US-7.361.736 o son variantes de la misma; glicosil hidrolasas de la familia 12 de Bacillus licheniformis (natural) como, por ejemplo, Sec. n.° Id.: 1 descritas en el documento US-6.268.197 o son variantes de la misma; glicosil hidrolasas de la familia 5 de Bacillus agaradhaerens (natural) o variantes de las mismas; glicosil hidrolasas de la familia 5 de GH de Paenibacillus (de tipo silvestre) tal como, XYG1034 y XYG 1022 descritas en el documento US-6.630.340

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o variantes de las mismas; glicosil hidrolasas de la familia 74 de GH de Paenibacillus polyxyma (de tipo silvestre) tal como, XYG1020 descrita en el documento WO 2002/077242 o variantes de la misma; y glicosil hidrolasas de la familia 74 de GH de Trichoderma Reesei (de tipo silvestre) tal como la enzima descrita con mas detalle en el identificador de secuencia numero 2 del documento US-7.172.891 o variantes de la misma.

Las glicosil hidrolasas adecuadas se pueden seleccionar del grupo que consiste en: Glicosil hidrolasas de la familia 44 de Paenibacillus polyxyma (natural) como, por ejemplo, XYG1006 o variantes de la misma

Las celulasas bacterianas de limpieza se comercializan bajo los nombres comerciales Celluclean® y Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

En un aspecto, la composicion puede comprender una celulasa fungica de limpieza que pertenece a la familia glicosil hidrolasa 45 que tiene un peso molecular de 17 kDa a 30 kDa, por ejemplo, las endoglucanasas comercializadas bajo el nombre comercial Biotouch® NCD, DCC y DCL (AB Enzymes, Darmstadt, Alemania).

Otras enzimas adecuadas incluyen las pectato liasas comercializadas bajo los nombres comerciales Pectawash®, Pectaway® y las mananasas comercializadas bajo los nombres comerciales Mannaway® (todas de Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y Purabrite® (Genencor International Inc., Palo Alto, California).

En un aspecto, la composicion comprende un tensioactivo no ionico de Guerbet. El tensioactivo no ionico de Guerbet es un tensioactivo detersivo a base de alcohol secundario que tiene la formula:

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en donde R1 = alquilo C2-8 lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, saturado o insaturado;

en donde R2 = alquilo C2-8 lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, saturado o insaturado,

en donde el numero total de atomos de carbono presente en los restos R1 + R2 esta en el intervalo de 7 a 13; en

donde OE/OP son restos alcoxi seleccionados de etoxi, propoxi o mezclas de los mismos;

en donde n es el grado medio de alcoxilacion y esta en el intervalo de 4 a 10.

Aditivos reforzantes de la detergencia

Los detergentes para lavado de ropa comerciales comprenden un aditivo reforzante de la detergencia inorganico fuerte, tanto con agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato, de forma tipica tripolifosfato sodico (STPP), o con zeolita, de forma tipica agentes reforzantes de la detergencia de tipo aluminosilicato sodico, usado como aditivo reforzante de

la detergencia fuerte predominante. Generalmente, dichos aditivos reforzantes de la detergencia fuertes estan

presentes a niveles relativamente altos como, por ejemplo, de 15 % a 20 % en peso o incluso superiores, por ejemplo, hasta 40 % en peso. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invencion, la cantidad de aditivo reforzante de la detergencia fuerte seleccionado de un aditivo reforzante de la detergencia de tipo fosfato y/o de tipo zeolita no es superior al 10 % en peso, con respecto al peso total de la composicion detergente, preferiblemente inferior al 8 % en peso, o incluso mas preferiblemente inferior a 5 o 4 o 3 o 2 o 1 % en peso.

Por lo tanto, composiciones preferidas de la invencion son composiciones bajas en aditivos reforzantes de la detergencia que comprenden del 0 % en peso al 10 % en peso de agente reforzante de la detergencia de tipo zeolita y del 0 % en peso al 10 % en peso de agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato, no siendo la cantidad total de fosfato y/o de zeolita superior al 10 % en peso y, preferiblemente, inferior al 10 % en peso, segun se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, las composiciones de la invencion comprenden del 0 % en peso al 8 % en peso o del 0 % en peso al 5 % o 4 % en peso o del 0 % en peso al 3 % o incluso menos del 2 % en peso de aditivo reforzante de la detergencia de tipo zeolita. Puede preferirse incluso que la composicion este practicamente exenta de aditivo reforzante de la detergencia de tipo zeolita. Por “practicamente exenta” de agente reforzante de la detergencia de tipo zeolita quiere decirse, tipicamente, que la composicion no comprende agente reforzante de la detergencia de tipo zeolita anadido deliberadamente. Esto se prefiere especialmente cuando es deseable que la composicion sea muy soluble, para minimizar la cantidad de residuos insolubles en agua (por ejemplo, que pueden depositarse sobre las superficies de los tejidos), y tambien cuando resulta muy deseable tener una solucion de lavado transparente. Los agentes reforzantes de la detergencia de tipo zeolita incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita MAP.

Las composiciones de la invencion pueden comprender de 0 % en peso a 10 % en peso de agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato. La composicion comprende preferiblemente del 0 % en peso al 8 % en peso o del 0 % en peso al 5 % o 4 % en peso o del 0 % en peso al 3 % o incluso un 2 % en peso de agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato. Puede preferirse incluso que la composicion este practicamente exenta de aditivo reforzante de la detergencia de tipo fosfato. Por “practicamente exenta” de agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato quiere decirse, tipicamente, que la composicion no comprende aditivo reforzante de la detergencia de tipo fosfato anadido

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deliberadamente. Esto resulta especialmente preferido cuando es deseable que la composicion tenga un perfil medioambiental muy bueno. Los agentes reforzantes de la detergencia de tipo fosfato incluyen tripolifosfato sodico.

En otro aspecto preferido de la invencion, el nivel total de aditivos reforzantes de la detergencia debiles, seleccionados de silicato laminar (SKS-6), acido citrico, sales citrato y acido nitrilotriacetico o sal del mismo es inferior al 15 % en peso, mas preferiblemente inferior al 8 % en peso, mas preferiblemente inferior al 4 % en peso o incluso inferior al 3 o 2 % en peso con respecto al peso total de la composicion detergente. Tipicamente, el nivel de cada silicato laminar, acido citrico, sales citrato y acido nitrilotriacetico o sal del mismo sera inferior al 10 % en peso o incluso inferior al 5 % en peso o a un % en peso con respecto al peso total de la composicion.

Aunque los aditivos reforzantes de la detergencia proporcionan diversas ventajas al formulador, su principal papel es secuestrar iones de metal divalentes (como, por ejemplo, iones calcio y magnesio) de la solucion de lavado que interactuarian si no de forma negativa con el sistema tensioactivo. Los aditivos reforzantes de la detergencia son tambien eficaces en la eliminacion de iones de metal y suciedad inorganica de la superficie del tejido, proporcionando una mejor retirada de manchas ocasionadas por solidos en forma de particulas y manchas ocasionadas por bebidas. Cabria esperar, por lo tanto, que la reduccion de sus niveles tenga un impacto negativo en la capacidad limpiadora y, por lo tanto, la preparacion de composiciones detergentes eficaces con los niveles reducidos reivindicados de agente reforzante de la detergencia de tipo fosfato y zeolita es sorprendente.

Alcalinidad de reserva

En la presente memoria, el termino “alcalinidad de reserva” es una medida de la capacidad tamponadora de la composicion detergente (g/NaOH/100 g de composicion detergente) determinada valorando una solucion 1 % (peso/volumen) de composicion detergente con acido clorhidrico a pH 7,5, es decir, para calcular la alcalinidad de reserva segun se define a continuacion:

Alcalinidad de reserva (hasta pH 7,5) como % de alcali en g de NaOH/100 g de producto = T x M x 40 x vol

10 x p x alicuota

T =

valoracion (ml) a pH 7,5

M =

Molaridad de HCl = 0,2

40 =

Peso molecular de NaOH

Vol =

Volumen total (es decir, 1000 ml)

W =

Peso de producto (10 g)

Alicuota =

(100 ml)

Obtener una muestra de 10 g pesada con una exactitud de dos decimales, de composicion detergente totalmente formulada. La muestra deberia obtenerse usando un muestreador Pascall en un compartimento estanco al polvo. Anadir la muestra de 10 g a un vaso de precipitados de plastico y anadir 200 ml de agua desionizada exenta de dioxido de carbono. Agitar usando un agitador magnetico sobre una placa de agitacion a 150 rpm hasta que se disuelva completamente y durante, al menos, 15 minutos. Transferir el contenido del vaso de precipitados a un matraz aforado de 1 litro y enrasar a 1 litro con agua desionizada. Mezclar bien y tomar inmediatamente una alicuota de 100 ml ± 1 ml usando una pipeta de 100 ml. Medir y registrar el pH y la temperatura de la muestra usando un pH-metro capaz de leer a ±0,01 unidades de pH, asegurandose, con agitacion, que la temperatura es de 21 °C +/- 2 °C. Valorar volumetricamente con agitacion con acido clorhidrico 0,2 M hasta que el pH mida exactamente 7,5. Anotar los mililitros de acido clorhidrico usados. Tomar el titulo promedio de tres repeticiones identicas. Realizar los calculos anteriormente descritos para calcular RA a pH 7,5.

La RA de las composiciones detergentes de la invencion puede ser preferiblemente superior a 7,5 y, preferiblemente, superior a 8. La RA puede ser superior a 9 o incluso superior a 9,5 o 10, o superior. La RA puede ser de hasta 20 o superior.

Puede proporcionarse una reserva adecuada de alcalinidad, por ejemplo, mediante uno o mas de los silicatos de metal alcalino (excluyendo el silicato laminar cristalino), de forma tipica sales silicatos amorfas, generalmente sales sodicas en una relacion de 1,2 a 2,2 de metal alcalino de forma tipica carbonato, bicarbonato y/o sesquicarbonatos sodicos. Los STPP y las persales como, por ejemplo, los perboratos y los percarbonatos tambien contribuyen a la alcalinidad. Es necesario un tamponador para mantener un pH alcalino durante el proceso de lavado que contrarreste la acidez de la suciedad, especialmente los acidos grasos liberados por la enzima lipasa.

La composicion detergente preferiblemente comprende de 0 % en peso a 50 % en peso de sal silicato, de forma mas habitual de 5 % a 30 % en peso de sal silicato, o de 7 % a 20 % en peso de sal silicato, de forma habitual silicato sodico.

Para proporcionar la alcalinidad de reserva preferida, las composiciones detergentes de la invencion pueden comprender una sal de carbonato, tipicamente del 1 % en peso al 70 % en peso o del 5 % en peso al 50 % en peso o del 10 % en peso al 30 % en peso de sal de carbonato. Las sales carbonato preferidas son carbonato sodico y/o bicarbonato sodico y/o sesquicarbonato sodico. La sal carbonato puede incorporarse a la composicion detergente completa o parcialmente

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mediante sal mezclada como, por ejemplo, Burkeita. Una sal de carbonato muy preferida es carbonato sodico. Preferiblemente, la composicion puede comprender de 5 % en peso a 50 % en peso de carbonato sodico, o de 10 % a 40 % en peso o incluso de 15 % a 35 % en peso de carbonato sodico. Puede desearse tambien que la composicion comprenda de 1 % en peso a 20 % en peso de bicarbonato sodico, o incluso de 2 % a 10 % u 8 % en peso.

Si esta presente la zeolita, puede desearse que la relacion en peso de carbonato sodico y/o silicato sodico a aditivo reforzante de la detergencia de tipo zeolita sea, al menos, 5:1, preferiblemente al menos 10:1 o, al menos 15:1 o, al menos 20:1 o incluso al menos 25:1

La sal de carbonato, o al menos parte de la misma, esta tipicamente en forma de particulas, que tienen tipicamente un tamano medio de particula ponderado en el intervalo de 200 a 500 micrometros. No obstante, puede ser preferente que la sal de carbonato, o al menos parte de la misma, este en forma de particulas micronizadas, que tienen tipicamente un tamano de particulas promedio en el intervalo de 4 a 40 micrometros; esto resulta especialmente preferido cuando la sal de carbonato, o al menos parte de la misma, esta en forma de mezcla de coparticulas con un tensioactivo detersivo, tal como un tensioactivo detersivo anionico alcoxilado.

Para proporcionar la alcalinidad de reserva requerida, preferiblemente los niveles de sales carbonato y/o silicato, de forma tipica carbonato sodico y silicato sodico seran de 10 % a 70 % en peso, o de 10 % o incluso 15 % a 50 % en peso con respecto al peso total de la composicion. Materiales adyuvantes

Ademas de los materiales previamente divulgados en la presente memoria y aunque no son esenciales para los fines de la presente invencion, los adyuvantes de la lista no limitativa que se ilustra a continuacion son adecuados para su uso en los presentes productos de consumo y pueden incorporarse deseablemente en determinadas realizaciones de la invencion, por ejemplo, para ayudar o mejorar la capacidad limpiadora, para tratar el sustrato que se desea limpiar o para modificar la estetica del producto de consumo, como en el caso de perfumes, colorantes, tintes o similares. Los niveles de cualquiera de dichos adyuvantes incorporados en cualquier producto de consumo son, ademas, cualquiera de los materiales citados anteriormente para su incorporacion. La naturaleza exacta de estos componentes/adyuvantes adicionales y los niveles de incorporacion de los mismos dependeran de la forma fisica del producto de consumo y de la naturaleza de la operacion de limpieza para la cual se usan. Los materiales adyuvantes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, tensioactivos, aditivos reforzantes de la detergencia, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de colorantes, dispersantes, enzimas adicionales, y estabilizadores de enzimas, materiales cataliticos, activadores del blanqueador, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos formados previamente, agentes dispersantes polimericos, inhibidores de redeposicion/eliminacion de manchas de arcilla, abrillantadores, supresores de las jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastizantes de la estructura, suavizantes de tejidos, vehiculos, hidrotropos, mejoradores del proceso, disolventes y/o pigmentos. Ademas de la descripcion siguiente, ejemplos adecuados de otros adyuvantes de este tipo y niveles de uso se encuentran en US-5.576.282, US-6.306.812 B1 y US-6.326.348 B1.

Como se ha indicado, los ingredientes adyuvantes no son esenciales para los productos de consumo de los solicitantes. Por lo tanto, determinados aspectos de los productos de consumo de los solicitantes no contienen uno o mas de los siguientes materiales adyuvantes: tensioactivos, aditivos reforzantes de la detergencia, agentes quelantes, agentes inhibidores de la transferencia de colorantes, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzimas, materiales cataliticos, activadores del blanqueador, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos preformados, agentes dispersantes polimericos, agentes de eliminacion/anti redeposicion de manchas de arcilla, abrillantadores, supresores de aguas de lavado, tintes, perfumes, agentes elastizantes de la estructura, suavizantes de tejidos, vehiculos, hidrotropos, adyuvantes del proceso, disolventes y/o pigmentos. Sin embargo, cuando uno o mas adyuvantes estan presentes, este uno o mas adyuvantes pueden estar presentes como se describe a continuacion:

Agentes blanqueantes: los productos de consumo de la presente invencion pueden comprender uno o mas agentes blanqueantes. Los agentes blanqueantes adecuados que no sean catalizadores del blanqueador incluyen, fotoblanqueadores, activadores del blanqueador, peroxido de hidrogeno, fuentes de peroxido de hidrogeno, peracidos preformados y mezclas de los mismos. En general, cuando se usa un agente blanqueante, los productos de consumo de la presente invencion pueden comprender de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 50 % o incluso de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 25 % de agente blanqueante en peso del producto de consumo de la invencion. Ejemplos de agentes blanqueantes adecuados incluyen:

(1) fotoblanqueantes, por ejemplo, ftalocianina de cinc sulfonada, ftalocianinas de aluminio sulfonada, tintes de xanteno y mezclas de los mismos;

(2) peracidos formados previamente: Los peracidos formados previamente adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, compuestos seleccionados del grupo que consiste en sales y acidos percarboxilicos, sales y acidos percarbonicos, sales y acidos perimidicos, sales y acidos peroximonosulfuricos, por ejemplo, Oxone®, y mezclas de los mismos. Acidos percarboxilicos adecuados incluyen peracidos hidrofobos e hidrofilos que tienen la formula R-(C=O)O-O-M, en la que R es un grupo alquilo, de forma opcional ramificado, que tiene, si el peracido es hidrofobo, de 6 a 14 atomos de carbono, o de 8 a 12 atomos de carbono y, si el peracido es hidrofilo, menos de 6 atomos de carbono o incluso menos de 4 atomos de carbono; y M es un contraion, por ejemplo, sodio, potasio o hidrogeno;

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(3) fuentes de peroxido de hidrogeno, por ejemplo, sales inorganicas perhidratadas, incluidas sales de metal alcalino tales como sales sodicas de perborato (habitualmente monohidratado o tetrahidratado), sales percarbonato, persulfato, perfosfato, persilicato y mezclas de las mismas. En un aspecto de la invencion, las sales inorganicas perhidratadas se seleccionan del grupo que consiste en sales sodicas de perborato, percarbonato y mezclas de las mismas. Cuando se emplean, las sales inorganicas perhidratadas estan tipicamente presentes en cantidades del 0,05 al 40 % en peso o del 1 al 30 % en peso del producto de consumo global y se incorporan tipicamente a estas composiciones como un solido cristalino que puede ser recubierto. Los recubrimientos adecuados incluyen sales inorganicas tales como silicato de metal alcalino, sales carbonato o borato o mezclas de las mismas o materiales organicos tales como polimeros, ceras, aceites o jabones grasos solubles o dispersables en agua; y

(4) activadores del blanqueador que tienen R-(C=O)-L en donde R es un grupo alquilo, de forma opcional ramificado, que tiene, cuando el activador del blanqueador es hidrofobo, de 6 a 14 atomos de carbono, o de 8 a 12 atomos de carbono y, cuando el activador del blanqueador es hidrofilo, menos de 6 atomos de carbono o incluso menos de 4 atomos de carbono; y L es un grupo saliente. Ejemplos de grupos salientes adecuados son acido benzoico y derivados del mismo - especialmente bencenosulfonato. Los activadores del blanqueador adecuados incluyen dodecanoil oxibenceno sulfonato, decanoil oxibenceno sulfonato, acido decanoiloxibenzoico o sales del mismo, 3,5,5-trimetilhexanoiloxibenceno sulfonato, tetraacetil etilendiamina (TAED) y nonanoiloxibenceno sulfonato (NOBS). Tambien se divulgan activadores del blanqueador adecuados en el documento US-6.380.144. Aunque puede emplearse cualquier activador del blanqueador adecuado, en un aspecto de la invencion, el producto de consumo en cuestion puede comprender NOBS, TAED o mezclas de los mismos.

Si esta presente, el peracido y/o el activador del blanqueador esta generalmente presente en el producto de consumo en una cantidad de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 60 % en peso, de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 40 % en peso o incluso de aproximadamente un 0,6 a aproximadamente un 10 % en peso, con respecto al producto de consumo. Pueden utilizarse uno o mas peracidos hidrofobos o precursores de los mismos junto con uno o mas peracidos hidrofilos o precursores de los mismos.

Las cantidades de fuente de peroxido de hidrogeno y peracido o activador del blanqueador pueden ser seleccionadas de manera que la relacion molar entre oxigeno disponible (de la fuente de peroxido) y peracido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1.

Tensioactivos - Los productos de consumo segun la presente invencion pueden comprender un tensioactivo o sistema tensioactivo en donde el tensioactivo puede seleccionarse de tensioactivos no ionicos, tensioactivos anionicos, tensioactivos cationicos, tensioactivos anfoliticos, tensioactivos de ion hibrido, tensioactivos no ionicos semipolares y mezclas de los mismos. Si esta presente, el tensioactivo esta presente tipicamente a un nivel de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 50 % o incluso de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 % en peso del producto de consumo de la invencion.

Los tensioactivos detersivos anionicos adecuados incluyen tensioactivos detersivos de tipo sulfato y sulfonato.

Los tensioactivos detersivos de tipo sulfonato adecuados incluyen, alquilbenceno sulfonato, en un aspecto, alquilbenceno sulfonato C10-13. Se puede obtener alquilbenceno sulfonato (LAS) adecuado, sulfonando alquilbenceno lineal (LAB) comercial; los LAB adecuados incluyen LAB con bajo contenido en 2-fenilo, tales como los suministrados por Sasol bajo el nombre comercial Isochem® o los suministrados por Petresa bajo el nombre comercial Petrelab®, otros LAB adecuados incluyen LAB con alto contenido en 2-fenilo, tales como los suministrados por Sasol bajo el nombre comercial Hyblene®. Un tensioactivo detersivo anionico es un alquilbenceno sulfonato que se obtiene mediante el proceso catalizado DETAL, aunque tambien pueden ser adecuadas otras rutas sinteticas, como HF.

Los tensioactivos detersivos de tipo sulfato adecuados incluyen alquilsulfato, en un aspecto, sulfato de alquilo C8- 18 o predominantemente sulfato de alquilo C12.

Otro tensioactivo detersivo de tipo sulfato adecuado es el sulfato alcoxilado de alquilo, en un aspecto, sulfato etoxilado de alquilo, en un aspecto, un sulfato alcoxilado de alquilo C8-18, en un aspecto, un sulfato etoxilado de alquilo C8-18, tipicamente el sulfato alcoxilado de alquilo tiene un grado de alcoxilacion promedio de 0,5 a 20 o de 0,5 a 10, tipicamente el sulfato alcoxilado de alquilo es un sulfato etoxilado de alquilo C8-18 que tiene un grado de etoxilacion promedio de 0,5 a 10, de 0,5 a 7, de 0,5 a 5 o incluso de 0,5 a 3.

El alquilsulfato, el sulfato alcoxilado de alquilo y los alquilbenceno sulfonatos pueden ser lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos.

El tensioactivo detersivo puede ser un tensioactivo detersivo ramificado de cadena media, en un aspecto, un tensioactivo detersivo anionico ramificado de cadena media, en un aspecto, un sulfato de alquilo ramificado de cadena media y/o un

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alquilbenceno sulfonato ramificado de cadena media, por ejemplo, un sulfato de alquilo ramificado de cadena media. En un aspecto, las ramificaciones de cadena media son grupos alquilo C1-4, tfpicamente, grupos metilo y/o etilo.

Los tensioactivos detersivos no ionicos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en: alquiletoxilatos Ce-Cie, tales como tensioactivos no ionicos NEODOL® de Shell; alquil-fenol-alcoxilatos C6-C12, en donde las unidades alcoxilato pueden ser unidades etilenoxi, unidades propilenoxi o una mezcla de las mismas; productos de condensacion de alcohol C12-C18 y alquilfenol C6-C12 con polfmeros de bloque de oxido de etileno/oxido de propileno como, por ejemplo, Pluronic® de BASF; alcoholes C14-C22 ramificados de cadena media; alcoxilatos de alquilo ramificados de cadena media C14-C22, tfpicamente que tengan un grado de alcoxilacion promedio de 1 a 30; alquilpolisacaridos, en un aspecto, alquilpoliglucosidos; polihidroxiamidas de acido graso; tensioactivos de alcohol poli(oxialquilado) terminalmente protegido con eter; y mezclas de los mismos.

Los tensioactivos detersivos no ionicos adecuados incluyen alquilpoliglucosido y/o un alcohol alcoxilado de alquilo.

En un aspecto, los tensioactivos detersivos no ionicos incluyen alcoholes alcoxilados de alquilo, en un aspecto, alcohol alcoxilado de alquilo Ce-18, por ejemplo, un alcohol etoxilado de alquilo Ce-18, el alcohol alcoxilado de alquilo puede tener un grado medio de alcoxilacion de 1 a 50, de 1 a 30, de 1 a 20 o de 1 a 10. En un aspecto, el alcohol alcoxilado de alquilo puede ser un alcohol etoxilado de alquilo Ce-18 que tiene un grado medio de etoxilacion de 1 a 10, de 1 a 7, mas de 1 a 5 o de 3 a 7. El alcohol alcoxilado de alquilo puede ser lineal o ramificado y sustituido o no sustituido.

Los tensioactivos detersivos cationicos adecuados incluyen compuestos de alquilpiridinio, compuestos de alquilamonio cuaternario, compuestos de alquilfosfonio cuaternario, compuestos de alquilsulfonio ternario y mezclas de los mismos.

Los tensioactivos detersivos cationicos adecuados son compuestos de amonio cuaternario que tienen la formula general:

(R)(R1)(R2)(R3)N+ X-

en donde R es un resto alquilo o alquenilo C6-18 lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, R1 y R2 se seleccionan independientemente de restos metilo o etilo, R3 es un resto hidroxilo, hidroximetilo o hidroxietilo, X es un anion que proporciona neutralidad de carga, los aniones adecuados incluyen haluros, por ejemplo, cloruro; sulfato; y sulfonato. Los tensioactivos detersivos cationicos adecuados son cloruros de mono-alquil C6-18 mono- hidroxietil dimetilamonio cuaternario. Los tensioactivos detersivos cationicos altamente adecuados son cloruro de mono-alquil Ce-10 mono-hidroxietil dimetilamonio cuaternario, cloruro de mono-alquil C10-12 mono-hidroxietil dimetilamonio cuaternario y cloruro de mono-alquil C10 mono-hidroxietil dimetilamonio cuaternario.

Aditivos reforzantes de la detergencia - Los productos de consumo de la presente invencion pueden comprender uno o mas aditivos reforzantes de la detergencia o sistemas de aditivos reforzantes de la detergencia. Cuando se usa un aditivo reforzante de la detergencia, el producto de consumo en cuestion comprendera tfpicamente al menos aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 60 % o incluso de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 % de aditivo reforzante de la detergencia en peso del producto de consumo de la invencion. La composicion puede incluso estar sustancialmente exenta de aditivo reforzante de la detergencia; sustancialmente exenta significa “sin adicion deliberada” de aditivo reforzante de la detergencia de tipo zeolita y/o fosfato. Los aditivos reforzantes de la detergencia de tipo zeolita tfpicos incluyen, zeolita A, zeolita P y zeolita MAP. Un aditivo reforzante de la detergencia de tipo fosfato tfpico es el tri-polifosfato sodico.

Agentes quelantes - Los productos de consumo de la presente invencion pueden contener un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen agentes quelantes de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos. Si se utiliza un agente quelante, el producto de consumo sujeto puede comprender de aproximadamente 0,005 % a aproximadamente 15 % o incluso de aproximadamente 3,0 % a aproximadamente 10 % de agente quelante en peso del producto de consumo. Los quelantes adecuados incluyen DTPA (acido dietilen-triamino-pentaacetico), HEDP (acido hidroxietano difosfonico), DTPMP (dietilen-triamino-penta(acido metilenfosfonico)), sal disodica hidratada del acido 1,2- dihidroxibenceno-3,5-disulfonico, etilendiamina, dietilen triamina, acido etilendiaminadisuccfnico (EDDS), acido N- hidroxietiletilendiaminotriacetico (HEDTA), acido trietilentetraaminahexaacetico (TTHA), acido N-hidroxietiliminodiacetico (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), acido etilendiaminotetrapropionato (EDTP) y derivados de los mismos.

Agentes inhibidores de la transferencia de tintes - Los productos de consumo de la presente invencion tambien pueden incluir uno o mas agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Los agentes polimericos inhibidores de la transferencia de tintes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, polfmeros de polivinilpirrolidona, polfmeros de N-oxido de poliamina, copolfmeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos. Cuando estan presentes en un producto de consumo en cuestion, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes a niveles de aproximadamente un 0,0001 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 5 % o incluso de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 3 % en peso del producto de consumo.

Abrillantadores - Los productos de consumo de la presente invencion tambien pueden contener componentes adicionales que pueden tenir los artfculos que se limpian, tales como abrillantadores fluorescentes.

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La composicion puede comprender abrillantador fluorescente C.I. 260, preferiblemente en forma alfa-cristalina que tiene la siguiente estructura:

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En un aspecto, el abrillantador es un abrillantador soluble, tal como el abrillantador fluorescente C.I. 260 en forma alfa-cristalina.

En un aspecto, el abrillantador esta predominantemente en forma alfa-cristalina, lo que significa que tipicamente al menos un 50 % en peso, al menos un 75 % en peso, al menos un 90 % en peso, al menos un 99 % en peso o incluso sustancialmente todo el abrillantador fluorescente C.I. 260 esta en forma alfa-cristalina.

El abrillantador esta preferiblemente en forma de particulas micronizadas, con un tamano de particula primaria promedio de 3 a 30 micrometros, de 3 micrometros a 20 micrometros o de 3 a 10 micrometros.

La composicion puede comprender abrillantador fluorescente C.I. 260 en forma beta-cristalina y la relacion en peso de: (i) abrillantador fluorescente C.I. 260 en forma alfa-cristalina, a (ii) abrillantador fluorescente C.I. 260 en forma beta-cristalina puede ser al menos 0,1 o al menos 0,6.

El documento BE680847 refiere a un procedimiento para la fabricacion del abrillantador fluorescente C.I. 260 en forma alfa-cristalina.

Los niveles de abrillantador fluorescente adecuados incluyen niveles reducidos desde aproximadamente el 0,01, desde aproximadamente el 0,05, desde aproximadamente el 0,1 o incluso desde aproximadamente el 0,2 % en peso hasta niveles superiores del 0,5 o incluso el 0,75 % en peso.

Poifmero de carboxilato - Los productos de consumo de la presente invencion pueden incluir tambien uno o mas polimeros de carboxilato tales como un copolimero aleatorio de maleato/acrilato o un homopolimero de poliacrilato. En un aspecto, en polimero de carboxilato es un homopolimero de poliacrilato que tiene un peso molecular de 4000 Da a 9000 Da, o de 6000 Da a 9000 Da.

Poifmero para la iiberacion de la suciedad - Los productos de consumo de la presente invencion pueden incluir tambien uno o mas polimeros para la liberacion de la suciedad que tienen la estructura que se define mediante una de las siguientes estructuras (I), (II) o (III):

(I) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d

(II) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e

(III) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f

en donde:

a, b y c son de 1 a 200; d, e y f son de 1 a 50;

Ar es un fenileno sustituido en 1,4;

sAr es fenileno sustituido en 1,3 en la posicion 5 con SO3Me;

Me es Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, amonio, mono-, di-, tri-, o tetraalquilamonio en donde los grupos alquilo son alquilo C1-C18 o hidroxialquilo C2-C10, o mezclas de los mismos;

R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se selecciona independientemente de H o C1-C18 n-alquilo o iso-alquilo; y

R7 es un alquilo C1-C18 lineal o ramificado o un alquenilo C2-C30 lineal o ramificado o un grupo cicloalquilo con de

5 a 9 atomos de carbono o un grupo arilo C8-C30 o un grupo arilalquilo C6-C30.

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Los polimeros para la liberation de la suciedad adecuados son los polimeros para la liberation de la suciedad de poliester tales como los polimeros Repel-o-tex, incluidos Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP6 suministrados por Rhodia. Otros polimeros de liberacion de suciedad adecuados incluyen los polimeros Texcare, incluidos Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325 comercializados por Clariant. Otros polimeros de liberacion de suciedad adecuados son los polimeros Marloquest tales como Marloquest SL suministrado por Sasol.

Poifmero celulosico - Los productos de consumo de la presente invention pueden incluir tambien uno o mas polimeros celulosicos incluidos los seleccionados de alquilcelulosa, alquil alcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquil carboxialquilcelulosa. En un aspecto, los polimeros celulosicos se seleccionan del grupo que comprende carboximetilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, metil carboximetilcelulosa, y mezclas de los mismos. En un aspecto, la carboximetilcelulosa tiene un grado de sustitucion de carboximetilo de 0,5 a 0,9 y un peso molecular de 100.000 Da a 300.000 Da.

Catalizadores de blanqueo - los productos de consumo de la presente invencion tambien pueden incluir uno o mas catalizadores de blanqueo, tales como catalizadores de metal de transition, por ejemplo, como se describe en el documento EP-1109965 o EP-1240378 o 9 o catalizadores de blanqueo capaces de aceptar un atomo de oxigeno de un peroxiacido y/o sal del mismo y transferir el atomo de oxigeno a un sustrato oxidable. Los catalizadores del blanqueador adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, cationes y poliiones de iminio; iones hibridos de iminio; aminas modificadas; oxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dioxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas ciclicas de azucar y mezclas de las mismas, como se describe en la patente US-2007/0173430 A1.

En otro aspecto, la composition detergente para el lavado de ropa comprende un ingrediente blanqueador, el ingrediente blanqueador tiene un logPo/w no superior a 0, no superior a -0,5, no superior a -1,0, no superior a -1,5, no superior a -2,0, no superior a -2,5, no superior a -3,0 o incluso no superior a -3,5. El metodo para determinar logPo/w se describe mas detalladamente a continuation.

Tipicamente, el ingrediente blanqueador es capaz de generar una especie blanqueadora que tiene un valor de Xso de 0,01 a aproximadamente 0,30, de 0,05 a aproximadamente 0,25 o incluso de aproximadamente 0,10 a 0,20. El metodo para determinar Xso se describe mas detalladamente a continuacion. Por ejemplo, los ingredientes blanqueadores que tienen una estructura de isoquinolinio pueden generar una especie blanqueadora que tiene una estructura de oxaziridinio. En este ejemplo, el Xso es el de la especie blanqueadora de oxaziridinio.

Sin pretender imponer ninguna teoria, los inventores creen que el control de la electrofilicidad e hidrofobicidad de la forma anteriormente descrita permite que el ingrediente blanqueador se suministre sustancialmente solamente a las zonas del tejido que sean mas hidrofobas, y que contengan suciedad rica en electrones, incluidos cromatoforos visibles, que son susceptibles al blanqueo mediante oxidantes muy electrofilos.

En un aspecto, el catalizador del blanqueador tiene una estructura que corresponde a la formula general siguiente:

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en donde R13 se selecciona del grupo que consiste en 2-etilhexilo, 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2- hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, iso-nonilo, iso-decilo, iso-tridecilo e iso-pentadecilo;

Metodo para determinar logPo/w

El log Po/w se determina de acuerdo con el metodo descrito en Brooke, D. N., Dobbs, A. J., Williams, N, Ecotoxicology and Environmental Safety (1986) 11(3): 251 -260.

Metodo para determinar Xso

El parametro Xso se determina de acuerdo con el metodo descrito en Adam, W., Haas, W., Lohray, B. B. Journal of the American Chemical Society (1991) 113(16) 6202-6208.

Sales de silicato - Los productos de consumo de la presente invencion tambien pueden contener sales de silicato, tales como silicato de sodio o de potasio. La composicion puede comprender de un 0 % en peso a menos de un 10 % en peso de la sal de silicato, a un 9 % en peso o a un 8 % en peso o a un 7 % en peso o a un 6 % en peso o a un 5 % en peso o a un 4 % en peso o a un 3 % en peso o incluso a un 2 % en peso y preferiblemente de mas de un 0 % en peso o de un 0,5 % en peso o incluso de 1 % en peso de sal de silicato. Una sal de silicato adecuada es silicato de sodio.

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Dispersantes - Los productos de consumo de la presente invencion tambien pueden contener dispersantes. Los materiales organicos solubles en agua adecuados incluyen los acidos homopolimericos o copolimericos o sus sales, en los que el acido policarboxilico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre si por no mas de dos atomos de carbono.

Estabilizantes de enzimas - Para su uso en detergentes, las enzimas pueden estabilizarse mediante distintas tecnicas. Las enzimas empleadas en la presente memoria, pueden estabilizarse mediante la presencia de fuentes solubles en agua de iones de calcio y/o magnesio en los productos de consumo terminados que proporcionan dichos iones a las enzimas. En el caso de productos de consumo acuosos que comprenden proteasa, se puede anadir un inhibidor reversible de la proteasa, tal como un formato de calcio, formato de sodio y 1,2 propanodiol, para mejorar mas la estabilidad.

Complejos de metales cataliticos - Las composiciones de los solicitantes pueden incluir complejos de metales cataliticos. Un tipo de catalizador del blanqueador que contiene metal es un sistema catalizador que comprende un cation de metal de transicion con actividad catalitica del blanqueador definida, tales como cation de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso, un cation de metal auxiliar que tiene poca o ninguna actividad catalitica del blanqueador, tales como cation de cinc o aluminio, y un secuestrante que tiene constantes de estabilidad definidas para los cationes de metal auxiliares y cataliticos, especialmente acido etilendiamino tetraacetico, acido etilendiaminotetra (metilenfosfonico) y sales solubles en agua de los mismos. Dichos catalizadores se divulgan en el documento US-4.430.243.

Si se desea, las composiciones de la presente invencion pueden catalizarse mediante un compuesto de manganeso. Dichos compuestos y sus niveles de uso son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, los catalizadores basados en manganeso divulgados en el documento US-5.576.282.

Se conocen catalizadores del blanqueador de tipo cobalto utiles en la presente invencion, y se describen, por ejemplo, en las patentes US-5.597.936; US-5.595.967. Estos catalizadores de tipo cobalto se preparan facilmente mediante procedimientos conocidos como los descritos, por ejemplo, en las patentes US-5.597.936 y US-5.595.967.

Las composiciones de la presente memoria tambien pueden incluir de manera adecuada un complejo de metal de transicion de ligandos, tales como bispidonas (documento US-7.501.389) y/o ligandos rigidos macropoliciclicos - abreviados como “MRL”. Como cuestion practica, y no de forma limitante, las composiciones y procesos de la presente memoria se pueden ajustar para proporcionar del orden de al menos una parte por cien millones de MRL activo, especies en el medio de lavado acuoso, y de forma tipica proporcionan de aproximadamente 0,005 ppm a aproximadamente 25 ppm, de aproximadamente 0,05 ppm a aproximadamente 10 ppm, o incluso de aproximadamente 0,1 ppm a aproximadamente 5 ppm, del MRL en la solucion de lavado.

Los metales de transicion adecuados en los catalizadores de metales de transicion del blanqueo de la presente invencion incluyen, por ejemplo, manganeso, hierro y cromo. MRL adecuados incluyen 5,12-dietil-1,5,8,12- tetraazabiciclo[6.6.2]hexadecano.

Los MRL de metales de transicion adecuados se preparan facilmente mediante procedimientos conocidos como los ensenados, por ejemplo, en el documento US-6.225.464.

Disolventes - Los disolventes adecuados incluyen agua y otros disolventes, tales como fluidos lipofilos. Ejemplos de fluidos lipofilos adecuados incluyen siloxanos, otras siliconas, hidrocarburos, eteres de glicol, derivados de glicerina tales como eteres de glicerina, aminas perfluoradas, disolventes perfluorados y de tipo hidrofluoreter, disolventes organicos no fluorados de baja volatilidad, disolventes tipo diol, otros disolventes inocuos para el medio ambiente y mezclas de los mismos.

Procesos para preparar productos de consumo

Los productos de consumo de la presente invencion pueden formularse de cualquier forma adecuada y pueden prepararse mediante cualquier proceso elegido por el formulador, de los cuales se describen ejemplos no limitativos, en los ejemplos de los solicitantes y en los documentos US-4.990.280; US-20030087791A1; US-20030087790A1; US-20050003983A1; US-20040048764A1; US-4.762.636; US-6.291.412; US-20050227891A1; EP-1070115A2; US- 5.879.584; US-5.691.297; US-5.574.005; US-5.569.645; US-5.565.422; US-5.516.448; US-5.489.392; US-5.486.303.

Metodo de uso

La presente invencion incluye un metodo para limpiar y/o tratar un sitio entre otros, una superficie de un tejido, como se define en las reivindicaciones. Dicho metodo incluye las etapas de poner en contacto una realizacion del producto de consumo de limpieza de los solicitantes, en un licor de lavado acuoso, con, al menos, una parte de un sitio y aclarar y/o secar la superficie. El sitio puede someterse a una etapa de lavado previa a la etapa de aclarado anteriormente mencionada. Para los fines de la presente invencion, el lavado incluye, aunque no de forma limitativa, frotado y agitacion mecanica. Por tanto, la presente divulgacion, incluye un metodo para lavar un tejido. El metodo comprende las etapas de poner en contacto un tejido que se va a lavar con dicha solucion limpiadora para lavado de ropa que

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comprende, al menos, una realizacion del producto de consumo de los solicitantes. El tejido puede comprender la mayoria de los tejidos capaces de ser lavados en condiciones normales de uso por parte del consumidor. La solucion tiene tipicamente un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 11. Los productos de consumo pueden emplearse a concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15.000 ppm, en disolucion. Las temperaturas del agua, tipicamente, estan comprendidas en el intervalo de aproximadamente 5 0C a aproximadamente 90 °C. La relacion de agua a tejido es, preferiblemente, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.

En un aspecto, se divulga un sitio tratado con cualquiera de los productos de consumo divulgados en la presente memoria.

Metodos de ensayo

Metodo de ensayo 1

A continuacion se indica un protocolo para definir si un material de tinte o de pigmento es un agente de matizado de tejidos para el fin de la presente invencion:

1.) Llenar dos recipientes de tipo Tergotometer con 800 ml de agua de la red de suministro urbano de Newcastle upon Tyne, Reino Unido (~205,2 partes por millon (~12 granos por galon americano) de dureza total, suministrada por Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, Reino Unido).

2) Insertar los recipientes en el aparato Tergotometer, con la temperatura de agua controlada a 30 0C y la agitacion fijada en 40 rpm durante el tiempo que dura el experimento.

3) Anadir 4,8 g de detergente IEC-B (detergente tipo B para una lavadora de referencia base IEC 60456), suministrado por wfk, Bruggen-Bracht, Alemania, a cada recipiente.

4) Al cabo de dos minutos, anadir 2,0 mg de colorante activo al primer recipiente.

5) Al cabo de un minuto, anadir 50 g de chaleco de algodon liso (suministrado por Warwick Equest, Consett, County Durham, Reino Unido), cortado en muestras de 5 cm x 5 cm, a cada recipiente.

6) Al cabo de 10 minutos, vaciar los recipientes y volverlos a llenar con agua fria (16 0C) con un grado de dureza de 14,4 grados ingleses de dureza Clark con una relacion molar de calcio a magnesio de 3:1.

7) Al cabo de 2 minutos de aclarado, retirar los tejidos.

8) Repetir las etapas 3-7 durante tres ciclos mas usando los mismos tratamientos.

9) Recoger y tender los tejidos en un recinto cerrado durante 12 horas para que se sequen.

10) Analizar las muestras usando un espectrometro Hunter Miniscan equipado con iluminante D65 y filtro de UVA para obtener valores Hunter a (eje rojo-verde) y Hunter b (eje amarillo-azul).

11) Promediar los valores Hunter a y Hunter b para cada conjunto de tejidos. Si los tejidos tratados con colorante sometidos a valoracion muestran una diferencia de tono promedio superior a 0,2 unidades en el eje a o en el eje b, se considera que es un agente de matizado de tejidos para el proposito de la invencion.

Metodos de ensayo 2-6

Cualquier desviacion de los protocolos proporcionados, se indican en los ejemplos pertinentes.

Los ensayos se realizaron usando un robot Biomek FX (Beckman Coulter) o una pipeta multicanal (p. ej., Rainin PipetLite, Mettler-Toledo) y un lector de MTP SpectraMax (tipo 340; Molecular Devices).

Ensayo TCA para la determinacion del contenido de proteina en placas de microtitulacion de 96 pocillos

Se cultivaron cultivos de B. subtilis 2-3 dias a 37 °C, agitando a 250-300 rpm con aireacion humidificada. Las celulas se separaron del sobrenadante del cultivo que contenia la enzima, por centrifugacion y/o filtracion. La concentracion de proteasa se determino usando un ensayo de precipitacion TCA. Se transfirio una alicuota (20-25 ul) de sobrenadante de cultivo a una placa de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos (MTP; placa de poliestireno transparente de union media Costar 9017) que contiene 100 pl/pocillo de HCl 0,25 N. La lectura “basal” se determino mediante lectura de la dispersion/absorbancia de la luz a 405 nm despues de 5 s de mezcla. Se anadieron 100 pl/pocillo de acido tricloroacetico (TCA) al 30 % (p/v) a la placa que contenia HCl y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente para facilitar la precipitacion de proteinas. La dispersion/absorbancia de la luz a 405 nm de esta placa “de ensayo” se determino despues de 5 s de mezcla. La turbidez/aumento de la dispersion de la luz en las muestras se correlaciona con la cantidad total de proteina precipitable en el sobrenadante de cultivo. Los calculos se realizaron restando la

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lectura “basal” (obtenida despues de la adicion de HCl) a la lectura “de ensayo” (obtenida despues de la adicion de TCA), para proporcionar una medida relativa de la protema total presente. Si se desea, se puede crear una curva patron calibrando las lecturas de TCA con ensayos de proteasa AAPF (vease mas adelante) de clones con actividad especffica conocida. Sin embargo, los resultados de TCA son lineales con respecto a la concentracion de protema de 50 a 500 partes por millon (ppm) de protema (en donde 1 ppm corresponde a 1 mg/l) y por lo tanto se pueden trazar directamente en funcion del rendimiento de la enzima, con el fin de escoger variantes con el rendimiento deseado.

Ensayo de proteasa AAPF en placas de microtitulacion de 96 pocillos

Con el fin de determinar la actividad de proteasa de las variantes de serina proteasa, se midio la hidrolisis de N- succinil-L- alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). Las soluciones de reactivos usados fueron: Tris/HCl 100 mM, pH 8,6, que contiene TWEEn®-80 al 0,005 % (tampon de dilucion de Tris); tampon Tris 100 mM, pH 8,6, que contiene CaCl2 1 mM y TWEEN®-80 al 0,005 % (tampon de Tris/Ca); y 160 mM de suc-AAPF-pNA en DMSO (solucion madre suc- AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar una solucion de trabajo de suc-AAPF-pNA, se anadio 1 ml de solucion madre suc-AAPF-pNA a 100 ml de tampon Tris/Ca y se mezclo bien durante al menos 10 segundos. El ensayo se realizo mediante la adicion de 10 pl de solucion de proteasa diluida a cada pocillo de una MTP de 96 pocillos, inmediatamente seguido de la adicion de 190 pl de solucion de trabajo de suc-AAPF-pNA a 1 mg/ml. Las soluciones se mezclaron durante 5 s y se realizo la lectura del cambio de absorbancia en el modo de cinetica (25 lecturas en 5 minutos) a 405 nm en un lector de MTP, a 25 0C. La actividad de la proteasa se expreso como UA (actividad = AOD^min-1 ml-1).

Ensayo de inhibicion de eglina C

Como se describe en la presente memoria, la concentracion de proteasa y la actividad especffica se determinaron por titulacion con un inhibidor denominado eglina C. La eglina C, obtenida de la sanguijuela Hirudo medicinalis es un inhibidor de protema de union estrecha de subtilisinas y proteasa ASP (Heinz y col, Biochemistry, 31: 8755-66 [1992]) y por lo tanto se puede usar para medir la concentracion de enzima proteasa, que permite, a su vez, calcular la actividad especffica. El gen de la eglina C se sintetizo y se expreso en E. coli mediante metodos estandar. Sus propiedades y su capacidad inhibitoria eran las mismas que eglina C adquirida de Sigma.

(i) Determinacion de la concentracion de una solucion madre de eglina C

Se diluyo una muestra de la subtilisina de Bacillus lentus de actividad especffica conocida en tampon Tris 100 mM, pH 8,6, que contiene CaCl2 1 mM y TWEEN®-80 al 0,005 % (tampon Tris/Ca), a una concentracion adecuada para el ensayo de proteasa AAPF descrito anteriormente. Se prepararon varias diluciones de la solucion madre de eglina C en el tampon de Tris/Ca. Se mezclo una alfcuota de cada solucion diluida de eglina C con un volumen igual de la solucion de subtilisina de Bacillus lentus diluida. Se mezclo tambien una alfcuota del tampon Tris/CA, solo, sin eglina C, con un volumen igual de la solucion de subtilisina de Bacillus lentus diluida, con el fin de medir la actividad de subtilisina sin inhibicion en ausencia de eglina C. Las soluciones mezcladas se incubaron a temperatura ambiente durante 1530 minutos y a continuacion, se midio la actividad de proteasa de cada muestra por el ensayo AAPF descrito anteriormente. Usando la actividad especffica conocida de subtilisina de Bacillus lentus, se determino la concentracion de proteasa activa en cada muestra. A continuacion, se calculo la concentracion de eglina C en cada muestra, basandose en la disminucion de la actividad de proteasa observada, en comparacion con la muestra de subtilisina sin inhibicion que se mezclo solo con tampon Tris/Ca (sin eglina C). Por lo tanto, usando diluciones y volumenes conocidos de las soluciones con eglina C, se determino la concentracion de eglina C en la solucion madre.

(ii) Determinacion de la concentracion y actividad especffica de variantes de subtilisina

Se diluyeron muestras de variantes de subtilisina en tampon Tris 100 mM, pH 8,6, que contiene CaCl2 1 mM y TWEEN®- 80 al 0,005 % (tampon de Tris/Ca). Se prepararon tambien varias diluciones de la solucion madre de eglina C de concentracion conocida en el tampon de Tris/Ca. Se mezclo una alfcuota de cada solucion diluida de eglina C con un volumen igual de una solucion de una variante de subtilisina. Las soluciones mezcladas se incubaron a temperatura ambiente durante 15-30 minutos y a continuacion, se midio la actividad de proteasa de cada muestra mediante el ensayo AAPF. Usando la disminucion observada de la actividad de la proteasa despues de la adicion de cada muestra de eglina C y la concentracion conocida de la eglina C, se calculo la concentracion de la eglina C necesaria para la inhibicion completa de cada variante de enzima subtilisina. Esta concentracion es equivalente a la concentracion de enzima en la muestra. Se mezclo tambien una alfcuota del tampon Tris/Ca solo, sin eglina C, con cada muestra de variante de subtilisina y se midio la actividad de la proteasa en ausencia de eglina C mediante el ensayo AAPF. A continuacion, se calculo la actividad especffica de las variantes de subtilisina, usando las concentraciones de enzima como se determino anteriormente.

Ensayo de micromuestras de tela SLT (ensayo SLT)

Se obtuvieron micromuestras de tela preaclaradas y troqueladas manchadas con sangre, leche y tinta (SLT) (EMPA116) con un diametro circular de 5,5 milfmetros en placas de microtitulacion de 96 pocillos (MTP; Corning 3641) del centro de materiales de ensayo BV (Vlaardingen, Pafses Bajos).

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Los detergentes se prepararon mezclando durante al menos 30 minutos en carbonato de sodio 2 mM, tamponado a pH 10,3 con el nivel adecuado de dureza del agua (3:1 de Ca:Mg. - CaC^: MgC^6H2O) en agua Milli-Q como se describe en la Tabla 1-1 y en la Tabla 6-4. Los detergentes se dividen en alicuotas en tubos conicos (Falcon) de 50 ml, se centrifugo para eliminar el precipitado y se enfrio sobre hielo durante 30 minutos antes de su uso.

Se igualaron las concentraciones de enzima a una concentracion fija deseada que oscila entre 20-50 ppm en relacion a un nivel de GG36 purificada (enzima de la SEQ ID NO: 1). La actividad especifica de GG36 usando AAPF como sustrato se uso para convertir los valores de TCA a los que se han restado los basales en la concentracion de enzima en ppm. Una vez que se determino la concentracion de enzima en ppm, se uso una formula sencilla para calcular el volumen de cada variante que se requeria anadir a un volumen fijo de tampon (300-600 pl) con el fin de conseguir la concentracion de enzima madre deseada:

x = (ppm objetivo) (vb)/(y-ppm objetivo)

En donde x = volumen de la enzima, y = concentracion de la enzima, vb = volumen de tampon

Se uso un robot Perkin-Elmer Janus con un brazo de 8 canales Versispan para dispensar volumenes variables de enzima a partir de la placa fuente (placa de pocillos Axygen de media profundidad con variantes recogidas agrupadas usadas en el ensayo TCA de la concentracion de enzima) en la placa de destino llena de tampon, usando puntas conductoras. Las muestras se mezclaron tres veces pipeteando arriba y abajo. Se valido la precision de las diluciones de enzima mediante la medicion de la actividad de AAPF de la placa igualada y comparandola con la de la placa fuente, para verificar que se habian preparado las diluciones correctas.

Despues de la igualacion, se anadieron 5-15 pl de solucion de enzima a una placa de micromuestras de tela llena de detergente para alcanzar un volumen final de ~200 pl. En algunos casos, las muestras de enzima no se igualaron y en cambio se diluyeron todas por igual a partir de la placa madre para proporcionar un intervalo de trabajo de 0,1-5 ppm. Se determinaron las concentraciones diana optimas para cada ensayo a partir de una curva de respuesta a la dosis que mide la actividad de limpieza en este intervalo para un detergente dado.

La MTP se sello con film (Bio-Rad) y se incubo en incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) preajustado a 16 0C en un ambiente frio ajustado a 4 0C o a 32 0C en la mesa de trabajo durante 30 minutos a 1400 rpm. Despues de la incubacion, se transfirieron 120 pl del sobrenadante a una MTP nueva (Corning 9017) y se realizo la lectura a 600 nm usando el lector SpectraMax. Las lecturas de absorbancia reales se obtuvieron restando un control de blanco (sin enzima) a cada valor.

Se calculo un indice de rendimiento (IR) para cada variante. El indice de rendimiento es la relacion de la absorbancia del sobrenadante producido por la variante de enzima de limpieza a la absorbancia producida por la GG36 de limpieza a una concentracion de enzima fija. Para las placas igualadas, se calcularon los valores de IR dividiendo la absorbancia de una variante entre la del control en una placa dada. Para las placas no igualadas, se genera una curva patron (p. ej., modelo de ajuste de regresion no lineal de Langmuir o de cuatro parametros), a partir de la actividad y concentracion de enzima de los controles. Usando esta curva patron, se puede comparar el rendimiento de las variantes directamente con el control a cualquier concentracion de enzima. El IR se determina dividiendo la absorbancia de las variantes entre la absorbancia calculada para el control a la misma concentracion de enzima.

Un indice de rendimiento (IR) que es superior a 1 (IR> 1), indica una limpieza superior por una variante, en comparacion con el patron (p. ej., GG36), mientras que un IR de 1 (IR = 1) identifica una variante que rinde igual que el patron y un IR que es inferior a 1 (IR <1), identifica una variante con un rendimiento inferior al del patron.

TABLA 1-1: Con tampon usadas

centraciones finales de detergente, de dureza del agua y de para los ensayos con micromuestras de tela SLT

Detergente

Concentracion final de detergente (g/l) Dureza final del agua* (ppm (gpg)) Concentracion final de tampon de carbonato de sodio (mM)

Ejemplo 26

0,808 102,6 (6) 2

Ejemplo 27

1 51,3 (3) 2

Ejemplo 28

2,3 205,2 (12) 2

Ejemplo 29

5,9 205,2 (12) 2

Ejemplo 30

8,3 205,2 (12) 2

* Concentracion (Ca:Mg 3:1) como se detalla en el texto.

METODO DE ENSAYO 2 - Para el metodo de ensayo 2, se lleva a cabo el ensayo de micromuestras de tela SLT usando el detergente del Ejemplo 29. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 205,2 ppm (12 gpg) y se ajusta a una temperatura de 16 qC. Despues, se determina el rendimiento de las enzimas variantes de acuerdo con el ensayo de micromuestras de tela SLT descrito. El indice de rendimiento se determina comparando el rendimiento de la variante con

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el de la enzima de la SEQ ID NO: 1, siendo en todos los casos el intervalo de dosificacion de la enzima de 0,1-5 ppm. Las enzimas que tienen un fndice de rendimiento de 1,1 o superior, se consideran proteasas de agua frfa.

METODO DE ENSAYO 3 - Para el metodo de ensayo 3, se lleva a cabo el ensayo de micromuestras de tela SLT usando el detergente del Ejemplo 26. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 102,6 ppm (6 gpg) y se ajusta a una temperatura de 16 °C. Despues, se determina el rendimiento de las enzimas variantes de acuerdo con el ensayo de micromuestras de tela SLT descrito. El fndice de rendimiento se determina comparando el rendimiento de la variante con el de la enzima de la SEQ ID NO: 1, siendo en todos los casos el intervalo de dosificacion de la enzima de 0,1-5 ppm. Las enzimas que tienen un fndice de rendimiento de 1,1 o superior, se consideran proteasas de agua frfa.

METODO DE ENSAYO 4 - Para el metodo de ensayo 4, se lleva a cabo el ensayo de micromuestras de tela SLT usando el detergente del Ejemplo 26. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 102,6 ppm (6 gpg) y se ajusta a una temperatura de 16 °C. Despues, se determina el rendimiento de las enzimas variantes de acuerdo con el ensayo de micromuestras de tela SLT descrito. El fndice de rendimiento se determina comparando el rendimiento de la variante con el de la enzima de referencia, siendo dicha enzima de referencia la enzima de la SEQ ID NO: 1 que comprende la mutacion A158E, siendo en todos los casos el intervalo de dosificacion de la enzima de 0,1-5 ppm. Las enzimas que tienen un fndice de rendimiento de 1,0 o superior, se consideran proteasas de agua frfa.

METODO DE ENSAYO 5 - Se ensaya la conductividad electrica de una solucion acuosa, de acuerdo con el metodo estandar ASTM D1125 y se presenta en unidades de miliSiemens/cm, abreviado a mS/cm en esta patente.

METODO DE ENSAYO 6 - Para el metodo de ensayo 6, se lleva a cabo el ensayo de micromuestras de tela SLT usando uno de los detergentes de los Ejemplos 36a - 36n. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza segun lo especificado en la Tabla 6-4 y se ajusta a una temperatura de 16 0C. Despues, se determina el rendimiento de las enzimas variantes, de acuerdo con el ensayo de micromuestras de tela SLT descrito. El fndice de rendimiento se determina comparando el rendimiento de la variante con el de la enzima de la SEQ ID NO: 1, siendo en todos los casos el intervalo de dosificacion de la enzima de 0,1-5 ppm. Las enzimas que tienen un fndice de rendimiento de 1,1 o superior, se consideran proteasas de agua frfa.

Ejemplos

Ejemplos 1-8

Composiciones detergentes lfquidas para lavado de ropa adecuadas para lavadoras de carga frontal.

Ingrediente

(% en Composicion peso de la composicion)

1

2 3 4 5 6 7 8

Acido alquilbenceno sulfonico

7 11 4,5 1,2 1,5 12,5 5,2 4

Alquil C12-14 etoxi 3 sulfato sodico

2,3 3,5 4,5 4,5 7 18 1,8 2

Alquil C14-15 8-etoxilato

5 8 2,5 2,6 4,5 4 3,7 2

Oxido de alquildimetilamina C12

- - 0,2 - - - - -

Cloruro de alquilhidroxietildimetilamonio C12-14

- - - 0,5 - - - -

Acido graso C12-18

2,6 4 4 2,6 2,8 11 2,6 1,5

Acido cftrico

2,6 3 1,5 2 2,5 3,5 2,6 2

Proteasa*

0,05 0,03 0,04 0,03 0,04 0,03 0,03 0,02

Amilasa (Natalase®)

0,1 0,2 0,15 - 0,05 0,5 0,1 0,2

Mananasa (Mannaway®)

0,05 0,1 0,05 - - 0,1 0,04 -

Copolfmero injertado al azar1

1 0,2 1 0,4 0,5 2,7 0,3 1

Un compuesto que tiene la siguiente estructura general: bis((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+- CxH2x-N+-(CHs)- bis((C2HsO)(C2H4O)n), en donde n = de 20 a 30, y x = de 3 a 8, o variantes sulfatadas o sulfonadas del mismo

0,4 2 0,4 0,6 1,5 1,8 0,7 0,3

Polietilenimina etoxilada 2

- - - - - 0,5 - -

Polfmero anfifflico alcoxilado para limpiar grasa 3

0,1 0,2 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3

Polfmero para la liberacion de la suciedad con bloques cortos de

- - - - - - 0,3 -

politereftalato de 1,2 propileno dietoxilado.

Dietilentriaminpenta (Acido metilenfosfonico)

0,2 0,3 - - 0,2 - 0,2 0,3

Acido hidroxietano difosfonico

- - 0,45 - - 1,5 - 0,1

FWA

0,1 0,2 0,1 - - 0,2 0,05 0,1

Disolventes (1,2 propanodiol, etanol), estabilizantes

3 4 1,5 1,5 2 4,3 2 1,5

Estructurante derivado del aceite de ricino hidrogenado

0,4 0,4 0,3 0,1 0,3 - 0,4 0,5

Acido borico

1,5 2,5 1,5 1,5 0,5 1,5 1,5

Formiato sodico

- - - 1 - - - -

Inhibidor de proteasa reversible 4

- - 0,002 - - - - -

Perfume

0,5 0,7 0,5 0,5 0,8 1,5 0,5 0,8

Suspension acuosa de microcapsulas de perfume (30 %am)

0,2 0,3 0,7 0,2 0,05 0,4 0,9 0,7

Tinte de matizado de tiofeno etoxilado 5

0,005 0,007 0,010 0,008 0,008 0,007 0,007 0,008

Tampones (hidroxido sodico, monoetanolamina)

Hasta pH 8,2

Agua y componentes minoritarios (antiespumante, estetica)

Hasta 100 %

Ejemplos 9-16

Composiciones detergentes liquidas para lavado de ropa adecuadas para lavadoras de carga superior. 5

Ingrediente

(% en Composicion peso de la composicion)

9 10 11 12 13 14 15 16

Alquil C12-15 etoxi (1,8)sulfato

20,1 15,1 20,0 15,1 13,7 16,7 10,0 9,9

Alquilbencenosulfonato Cue

2,7 2,0 1,0 2,0 5,5 5,6 3,0 3,9

Sulfato de alquilo ramificado C16-17

6,5 4,9 4,9 3,0 9,0 2,0

Alquil C12-14 -9-etoxilato

0,8 0,8 0,8 0,8 8,0 1,5 0,3 11,5

Oxido de dimetilamina C12

0,9

Acido citrico

3,8 3,8 3,8 3,8 3,5 3,5 2,0 2,1

Acido graso C12-18

2,0 1,5 2,0 1,5 4,5 2,3 0,9

Proteasa*

0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Amilasa (Natalase®)

0,7 0,3 0,6 0,3 0,6 0,4

Amilasa (Termamyl Ultra®)

1,1

Mananasa (Mannaway®)

0,1 0,1

Pectato Liasa (Pectawash®)

0,1 0,2

Borax

3,0 3,0 2,0 3,0 3,0 3,3

Na & formiato de Ca

0,2 0,2 0,2 0,2 0,7

Un compuesto que tiene la siguiente estructura general: bis((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x- N+-(CH3)-bis((C2H5O)(C2H4O)n), en donde n = de 20 a 30, y x = de 3 a 8, o variantes sulfatadas o sulfonadas del mismo

1,6 1,6 3,0 1,6 2,0 1,6 1,3 1,2

Copolimero injertado al azar1

0,4 0,2 1,0 0,5 0,6 1,0 0,8 1,0

Acido dietilentriamino pentaacetico

0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0,3 0,8

Tinopal AMS-GX

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,1

Tinopal CBS-X

0,1 0,2

Polimero anfifilico alcoxilado para limpiar grasa 3

1,0 1,3 1,3 1,4 1,0 1,1 1,0 1,0

Texcare 240N (Clariant)

1,0

Etanol

2,6 2,6 2,6 2,6 1,8 3,0 1,3

Propilenglicol

4,6 4,6 4,6 4,6 3,0 4,0 2,5

Dietilenglicol

3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,7 3,6

Polietilenglicol

0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,3 0,1 1,4

Monoetanolamina

2,7 2,7 2,7 2,7 4,7 3,3 1,7 0,4

Trietanolamina

0,9

NaOH

hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,3 hasta pH 8,5

Supresor de las iabonaduras

Tinte

0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,0

Perfume

0,5 0,5 0,5 0,5 0,7 0,7 0,8 0,6

Suspension acuosa de microcapsulas de perfume (30 %am)

0,2 0,5 0,2 0,3 0,1 0,3 0,9 1,0

Tinte de matizado de tiofeno etoxilado 5

0,003 0,002 0,002 0,005 0,002 0,004 0,004 0,003

Agua

Resto Resto Resto Resto Resto Resto Resto Resto

Ejemplos 17-22

Las siguientes son composiciones detergentes granuladas producidas de acuerdo con la divulgacion, adecuadas 5 para el lavado de tejidos.

17 18 19 20 21 22

Alquilbencenosulfonato lineal con una longitud de cadena de carbono alifatico de C11-C12

15 12 20 10 12 13

Otros tensioactivos

1,6 1,2 1,9 3,2 0,5 1,2

Agente(s) reforzante(s) de la detergencia de tipo fosfato

2 3 4

Zeolita

1 1 4 1

Silicato

4 5 2 3 3 5

Carbonato sodico

2 5 5 4 0 3

Poliacrilato (PM 4500)

1 0,6 1 1 1,5 1

Carboximetilcelulosa

(Finnfix BDA de CPKelco)

1 - 0,3 - 1,1 -

Celluclean® (15,6 mg/g)

0,23 0,17 0,5 0,2 0,2 0,6

Proteasa*

0,23 0,17 0,05 0,2 0,03 0,1

Stainzyme Plus® (14 mg/g)

0,23 0,17 0,5 0,2 0,2 0,6

Mannaway 4.0T (4 mg/g)

0,1 0,1 0,1

Lipex 100T (18,6 mg/g)

0,2 0,1 0,3

Abrillantador(es) fluorescente(s)

0,16 0,06 0,16 0,18 0,16 0,16

Acido dietilentriaminopentaacetico o acido etilendiaminotetraacetico

0,6 0,6 0,25 0,6 0,6

MgSO4

1 1 1 0,5 1 1

Blanqueador(es) y activador(es) del blanqueador

6,88 6,12 2,09 1,17 4,66

Tinte de matizado de tiofeno etoxilado 5

0,002 0,001 0,003 0,003 - -

Direct Violet 9 ex Ciba Specialty Chemicals

0,0006 0,0004 0,0006

Sulfato/acido citrico/bicarbonato sod ico/humectante/perfume

Resto hasta 100 %

1

El copolimero de injerto al azar es un copolimero de poli(oxido de etileno) injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de poli(oxido de etileno) y multiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal del poli(oxido de etileno) es de aproximadamente 6000 y la relacion de peso del poli(oxido de etileno) a acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no hay mas de 1 punto de injerto por 50 unidades de oxido de etileno.

Polietilenimina (PM = 600) con 20 grupos etoxilados por -NH.

El polimero limpiador de grasa anfifilico alcoxilado es una polietilenimina (PM = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH

Inhibidor de la proteasa reversible de estructura:

imagen4

5

5 El tinte de matizado de tiofeno etoxilado es como se describe en el documento US-7.208.459 B2.

* Observation: todos los niveles enzimaticos se expresan como % de materia prima enzimatica, excepto para la proteasa (de esta invention), que se expresa como % de proteina activa anadida al producto.

Ejemplos 23-25

10

Las siguientes son composiciones detergentes liquidas para lavado de ropa adecuadas para lavadoras (23 y 24) automaticas de carga superior y lavadoras (25) de carga frontal.

Ingrediente

Composicion (% en peso de la composicion)

23 24 25

Alquil C12-15 etoxi (1,8)sulfato

14,7 11,6

Alquilbencenosulfonato Cn,8

4,3 11,6 8,3

Sulfato de alquilo ramificado C16-17

1,7 1,29

Alquil C12-14 -9-etoxilato

0,9 1,07

Oxido de dimetilamina C12

0,6 0,64

Acido citrico

3,5 0,65 3

Acido graso C12-18

1,5 2,32 3,6

Borato sodico (Borax)

2,5 2,46 1,2

Alquil C12-14 etoxi 3 sulfato sodico

2,9

Alquil C14-15 7-etoxilato

4,2

Etoxilato-7 de alquilo C12-14

1,7

Formiato de Ca

0,09 0,09

Un compuesto que tiene la siguiente estructura general: bis((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)- bis((C2H5O)(C2H4O)n), en donde n = de 20 a 30, y x = de 3 a 8, o variantes sulfatadas o sulfonadas del mismo

1,2

Copolimero injertado al azar 1

1,46 0,5

Polietilenimina etoxilada 2

1,5 1,29

Acido dietilentriamino pentaacetico

0,34 0,64

Acido dietilentriamina penta(metilenfosfonico)

0,3

Tinopal AMS-GX

0,06

Tinopal CBS-X

0,2 0,17

Polimero anfifilico alcoxilado para limpiar grasa 3

1,28 1 0,4

Etanol

2 1,58 1,6

Propilenglicol

3,9 3,59 1,3

Dietilenglicol

1,05 1,54

Polietilenglicol

0,06 0,04

Monoetanolamina

3,05 2,41 0,4

NaOH

2,44 1,8

Sulfonato de cumeno sodico

1

Formiato sodico

0,11

Agua, componentes esteticos (Tintes, perfumes) y componentes minoritarios (enzimas, disolventes, estructurantes)

Resto Resto Resto

El copolimero de injerto al azar es un copolimero de poli(6xido de etileno) injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de poli(6xido de etileno) y multiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal del poli(6xido de etileno) es de aproximadamente 6000 y la relaci6n de peso del poli(6xido de etileno) a acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no hay mas de 1 punto de injerto por 50 unidades de 6xido de etileno.

Polietilenimina (PM = 600) con 20 grupos etoxilados por -NH.

El polimero limpiador de grasa anfifilico alcoxilado es una polietilenimina (PM = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH

10

Ejemplos 26-30

2

3

Las siguientes son composiciones detergentes granulares para lavado de ropa adecuadas para lavadoras (26-28) automaticas de carga superior y lavadoras (29-30) de carga frontal.

15 La proteasa de esta invenci6n se anade por separado a estas formulaciones.

26 27 28 29 30

Tensioactivos

Sulfato de alquilo ramificado C16-17

3,55

Sulfato de alquilo C12-14

1,5

Alquilbencenosulfonato de sodio lineal con una longitud de cadena alifatica C11-C12

9,6 15,8 10,6 7,5 9

Alcohol etoxi Cu/15-3-sulfato de sodio

1,15 2,88

Alquil C14/15 sulfato de sodio

2,37

Etoxilado de alcohol C14/15 con un promedio de etoxilaci6n de 7 moles

1,17 1

Cloruro de mono-alquil C8-10 mono-hidroxietil- dimetil-amonio cuaternario

0,45

Cloruro de dimetil-hidroxil-etil-lauril-amonio

0,18

Zeolita A

13,9 4,7 0,01 2,9 1,8

Silicato de sodio a una relaci6n de 1,6

4 0,2 4 4

Silicato de sodio a una relaci6n de 2,35

8

Acido citrico

2,5 1,4

Tripolifosfato de sodio

5

Carbonato s6dico

24,1 30 16,9 24,4 21

Nonanoiloxibencenosulfonato

5,78 2,81 0,96

Potenciador de blanqueo a base de oxaciridina

0,03 0,017

Etilendiamino-S,S-disuccinato de tetrasodio

0,2

Sal heptas6dica del acido dietilentriamino penta (metilen fosf6nico)

0,61 0,33

Acido hidroxietano dimetileno fosf6nico

0,29 0,45

Tetraacetato de etilendiamina

0,27

MgSO4

0,47 0,5994 0,782

Percarbonato de sodio

7 4,4 15,9 19,1

Tetraacetil etilendiamina

3,3 4,6

Perborato de sodio monohidratado

1,2

Carboximetilcelulosa

(p. ej. Finnfix BDA de CPKelco)

0,1 0,17 1,69 0,23

Copolimero de acido acrilico/acido maleico (70/30) de sodio

0,0236 3,8 2 2,5

Poliacrilato s6dico (Sokalan PA30 CL)

4 0,84

Polimero de tereftalato

0,23

Copolimero de injerto aleatorio de polietilenglicol/acetato de vinilo

0,89 0,89 0,91

Fotoblanqueante - tetrasulfonato de ftalocianina de cinc

0,005 0,001 0,002

Abrillantador fluorescente C.I. 260

0,11 0,15 0,04 0,23 0,15

Abrillantador fluorescente C.I. 351 (Tinopal ® CBS)

0,1

Granulo supresor de las jabonaduras

0,25 0,07 0,04

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Carboximetilcelulosa modificada hidrofobamente (Finnifix ® SH-1)

0,019 0,028

Bentonita

8,35

Miscelaneos (tintes, perfumes, adyuvante de proceso, humectantes y sulfato sodico)

Resto Resto Resto Resto Resto

Notas para los Ejemplos 26-30:

Los ingredientes tensioactivos pueden obtenerse de BASF, Ludwigshafen, Alemania (Lutensol®); Shell Chemicals, Londres, Reino Unido; Stepan, Northfield, Illinois, Estados Unidos; Huntsman, Huntsman, Salt Lake City, Utah, Estados Unidos; Clariant, Sulzbach, Alemania (Praepagen®).

La zeolita puede obtenerse de Industrial Zeolite (UK) Ltd, Grays, Essex, Reino Unido.

El acido citrico y el citrato de sodio pueden obtenerse de Jungbunzlauer, Basilea, Suiza.

El percarbonato sodico, el carbonato sodico, el bicarbonato sodico y el sesquicarbonato sodico pueden obtenerse de Solvay, Bruselas, Belgica.

Los copolimeros de acrilato/maleato se pueden obtener de BASF, Ludwigshafen, Alemania.

La carboximetilcelulosa y carboximetilcelulosa modificada hidrofobamente se pueden obtener de CPKelco, Arnhem, Paises Bajos. El abrillantador fluorescente

C.I. 260 se puede obtener de 3V Sigma, Bergamo, Italia como Optiblanc® Optiblanc® 2M/G, Optiblanc® 2MG/LT Extra u Optiblanc® Ecobright.

El etilendiamino-S,S-disuccinato de tetrasodio se puede obtener de Innospec, Ellesmere Port, Reino Unido.

El copolimero de tereftalato puede obtenerse de Clariant con el nombre comercial Repelotex SF 2.

El acido 1 -hidroxietano-1,1-difosfonico puede obtenerse de Thermphos, Vlissingen - Oost, Paises Bajos.

El reforzador de blanqueo basado en oxaziridinio tiene la siguiente estructura, en donde R1 = 2-butiloctilo, y se produjo segun el documento US-2006/0089284A1.

imagen5

Las enzimas Natalase®, Termamyl®, Stainzyme Plus®, Celluclean® y Mannaway®, se pueden obtener de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.

El tetrasulfonato de ftalocianina de zinc se puede obtener de Ciba Specialty Chemicals, Basilea, Suiza, como Tinolux® BMC.

El granulo supresor de espuma se puede obtener de Dow Corning, Barry, Reino Unido.

El copolimero de injerto aleatorio es un copolimero de oxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de oxido de polietileno y multiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal del poli(oxido de etileno) es de aproximadamente 6000 y la relacion de peso del poli(oxido de etileno) a acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no hay mas de 1 punto de injerto por 50 unidades de oxido de etileno.

Ejemplo 31

Generation de bibliotecas de evaluation de sitios (SEL) de GG36

La construction de SEL de GG36 descrita en este ejemplo fue realizada por GENEART usando sus metodos patentados y su plataforma tecnologica para la optimization de genes, sintesis genica, generacion y analisis de bibliotecas (en el documento WO 2004/059556A3, EP-0 200 362 y EP-0 201 184; y en la patente US-4.683.195, US-4.683.202 y US- 6.472.184). Las SEL GG36 se produjeron en posiciones pre-seleccionadas por los inventores, usando el plasmido de expresion pHPLT-GG36 de B. subtilis (vease la Fig. 2). Este plasmido de expresion de B. subtilis contiene el casete de expresion de GG36 que se muestra a continuation, el promotor LAT de B. licheniformis (Plat) y elementos adicionales de pUB110 (McKenzie y col., Plasmid, 15:93-103 1986), que incluyen un gen replicasa (reppUB), un gen de resistencia a la neomicina (neo)/kanamicina y un marcador de resistencia a la bleomicina (bleo) (Figura 4 de la patente US-6.566.112).

Secuencia de ADN de GG36 (la secuencia senal se muestra en letras minusculas, el propeptido en minusculas con texto subrayado y la secuencia madura de GG36 en letras mayusculas)

gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaatt

ggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcat

gaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgagctcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaagtaacgac

aatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTC

TGGTGT AAAAGTTGCT GTCCTCGAT ACAGGT ATTT CCACT CAT CCAGACTT AAAT ATT CGTGGTGGCGCTAG CTT

TGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

AACAATTCGATTGGCGTTCTT GGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACT AT ACGCT GTT AAAGT ATT AGGGGCGAGCG

GTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTG

AGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTT

GTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCG

GAGCT ACT GACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTAT GGCGCAGGGCTT GACATT GTCGCACCAGGT

GTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTT

GCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAAT

ACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA

La SEC ID NO: 4 es la secuencia completa, incluidos el propeptido y el peptido de senal.

Secuencia de protema de GG36 (se muestra la secuencia senal en letras minusculas, el propeptido, en minusculas con texto subrayado y la secuencia de proteasa madura de GG36 en letras mayusculas)

vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekvliafneaeavsefveaveandevailseeeeveiellhefetipvlsvelspedvdaleldpaisvieedaevtt

mAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALN

NSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAA

SGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAA

ALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia madura y la SEC ID NO: 3 incluye tambien la senal y el propeptido.

El procedimiento de mutagenesis se baso en el enfoque de mutacion especffica de codon, en el que todas las posibles sustituciones de aminoacidos se crean simultaneamente en un codon de interes especffico, usando cebadores de mutagenesis directos e inversos que contienen un codon degenerado, NNS ((A, C, T o G), (A, C, T o G), (C o G)) en el sitio de interes. Para construir cada una de las SEL de GG36, se realizaron tres reacciones de PCR: dos reacciones de mutagenesis (PCR1 y PCR2 primarias) para introducir el codon de interes mutado en la secuencia de ADN de GG36 madura, usando los cebadores de mutagenesis directos e inversos de NNS (25-45 nucleotidos de longitud) y una tercera reaccion para fusionar los dos productos de PCR de mutagenesis juntos, para construir el vector de expresion pHPLT-GG36 que tiene los codones mutados deseados en la secuencia de GG36 madura.

Las secuencias de cebadores usadas en este ejemplo se proporcionan a continuacion:

CGCGCTTGAGCTCGATCCAGCGATTTC

SacI-Fw

GTCTCCAAGCTTTAACGAGTTGCAG

HindIII-Rv

GCAATTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC

pHPLT-BglII-Fw

GCATCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC

pHPLT-BglII-Rv

Se uso el ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (n.° de catalogo Finnzymes F-530L) para todas las PCR y se ejecutaron las reacciones de acuerdo con los protocolos del fabricante que se suministraron con la polimerasa. En particular, para la PCR primaria 1, se usaron 1 pl (10 pM) de cada uno de los cebadores pHPLT-BgIII-Fw y un cebador de mutagenesis inverso nNs y para la PCR primaria 2, se usaron 1 pl (10 pM) del cebador pHPLT-BgIII- Rv y un cebador de mutagenesis directo NNS. Cada reaccion tambien incluyo 1 pl del ADN molde del plasmido pHPLT-GG36 (0,1-1 ng/pl). Se uso un termociclador Peltier PTC-200 de MJ Research para las PCR. Las reacciones produjeron dos fragmentos de aproximadamente 2 a 3 kb que tenfan aproximadamente 30 nucleotidos superpuestos que rodeaban el codon de GG36 de interes. Los fragmentos obtenidos se fusionaron en una tercera PCR similar a las descritas anteriormente usando 1 pl de mezcla de reaccion de PCR 1 primaria, 1 pl de mezcla de reaccion de PCR 2 primaria y 1 pl (10 pM) de cada uno de los cebadores Sacl-Fw y HindIII-Rv directos e inversos. Se purifico el fragmento lineal amplificado de 859 pb que codifica el gen de la variante GG36, (usando el kit de purificacion PCR QIAGEN® Qiaquick) y se digirio con las enzimas de restriccion Sacl y HindIIII para crear extremos cohesivos a ambos lados del fragmento de fusion. Despues de la digestion con Sacl y HindIIII, tambien se purificaron aproximadamente 50 ng del plasmido pHPLT-GG36, dando como resultado un fragmento de la estructura del vector de 3,9 kb. El fragmento del vector digerido, se ligo con 50 ng del fragmento digerido de 859 pb que codifica la enzima variante, usando el ADN ligasa T4 (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante para la clonacion de extremos cohesivos. Posteriormente, se uso la mezcla de ligacion para transformar celulas de B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE:'[xylR,pxylA-comK]), como se describe (documento WO 2002/014490).

Para expresar las protefnas variantes para analisis bioqufmicos adicionales, las cepas de B. subtilis que portaban los plasmidos variantes de GG36 se inocularon en placas de microtitulacion que contenfan 150 pl de medio de caldo Luria complementado con 10 pg/ml de neomicina. Se cultivaron las placas durante una noche a 37 °C con agitacion a 300 rpm y un 80 % de humedad, usando tapas Enzyscreen para placas de microtitulacion (Enzyscreen). Se usaron diez microlitros de la placa de cultivo durante una noche para inocular una nueva placa de microtitulacion que contenfa 190 pl de medio MBD (un medio definido basado en MOPS) con 10 pg/ml de neomicina. Se preparo medio MBD esencialmente como se conoce en la tecnica (vease Neidhardt y col., J. Bacteriol., 119: 736-747, [1974]), salvo que se omitieron NH4Cl, FeSO4 y CaCl2 del medio base, se usaron 3 mM de K2HPO4 y el medio de base se complemento con urea 60 mM y 100 ml de una solucion compuesta por 210 g/l de glucosa y 350 g/l de maltodextrina. Los micronutrientes se prepararon como una solucion madre 100X que contenfa en un litro 400 mg de FeSO4.7H2O, 100 mg de MnSO4.H2O, 100 mg de ZnSO4.7H2O, 50 mg de CuCl2.2H2O, 100 mg de CoCl2.6H2O, 100 mg de NaMoO4.2H2O, 100 mg de Na2B4Oz.10H2O, 10 ml de CaCl2

1 M y 10 ml de citrato sodico 0,5 M. Se incubaron las placas de microtitulacion que contenian medio MDB durante 68 horas a 37 °C, 300 rpm y 80 % de humedad usando tapas Enzyscreen (Enzyscreen) para determinar la expresion proteica. Al dia siguiente, los cultivos se filtraron a traves de una placa de micro-filtrado (0,22 pm; Millipore) y el filtrado resultante se uso para analisis bioquimicos. Se llevaron a cabo los ensayos en micromuestras de tela de TCA, LAS/EDTA 5 y SLT como se describe en la seccion de Metodos de ensayo. Asimismo, se calcularon los indices de rendimiento como se describe en la descripcion del ensayo SLT en la seccion de Metodos de ensayo y se muestran en la Tabla 2-1.

TABLA 2-1: Valores del indice de rendimiento (IR) de las variantes de GG36 con respecto a GG36 en el ensayo de micromuestras de tela de SLT usando el Metodo de ensayo 3

10

Mutacion en comparacion con la SEQ ID NO: 1 (numeracion de BPN’)

SLT, detergente del Ejemplo 26, 16C, IR

Q2S

1,1

V4R

1,1

V4S

1,1

R10S

1,1

P14K

1,1

A16S

1,1

T22A

1,1

T22R

1,1

S24R

1,2

G25V

1,1

V26F

1,1

L42I

1,2

P52F

1,2

P52E

1,1

P52N

1,1

N62E

1,1

N62Q

1,1

V68A

1,1

V68C

1,1

T71G

1,2

I72C

1,2

A74C

1,1

L75A

1,1

L75F

1,1

S78R

1,1

E89P

1,2

E89T

1,2

E89G

1,1

E89H

1,1

E89W

1,1

Y91N

1,3

K94N

1,1

G100S

1,1

S101A

1,2

S101N

1,1

S101G

1,1

S101D

1,1

S103G

1,3

S103N

1,2

V104L

1,1

V104I

1,1

A108I

1,1

L111V

1,5

E112V

1,2

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   5

   1. Una composicion que comprende un material adyuvante y una variante de proteasa de agua fria, en donde dicha variante de proteasa consiste en la SEQ ID NO: 1 con uno de los siguientes conjuntos de mutaciones:

   T022R-S024R______________________________________________

   T022R-G115R______________________________________________

   S009A-T022R______________________________________________

   S009A-T022R-S212F-W241 R_________________________________

   G020R-T022R-S242R-_______________________________________

   G020R-T022R-N043R-______________________________________

   G020R-T022R-W241 R-______________________________________

   G020R-T022R-S078R-S242R-________________________________

   S009A-T022R-N043R-S078R_________________________________

   G020R-T022R-S212F-W241 R-________________________________

   G020R-T022R-S078R-W241 R-________________________________

   G020R-T022R-N043R-W241 R-_______________________________

   G020R-T022R-S024R-S242R-________________________________

   S009A-T022R-S078R-S212F_________________________________

   S009A-T022R-S078R-S212F-W241 R__________________________

   G020R-T022R-E271L_______________________________________

   G020R-T022R-N043R-S212F-________________________________

   V004R-S009A-T022R-S078R-S212F-__________________________

   G020R-T022R-S078R-S212F-W241 R-_________________________

   G020R-T022R-N269R-______________________________________

   T022R-S101G-S103A-V1041-A232V-Q245R____________________

   N018R-T022R-S024R-N076D-S101A-N116A-N183D-G211Q-H249R

   N018R-T022R-S024R-N043R-N076D-H249R___________________

   T022R-N043R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R______________

   T022R-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R______________

   N018R-T022R-S024R-N076D-H249R__________________________

   N018R-T022R-S024R-N043D-N076D-H249R___________________

   N018R-T022R-S024R-N076D-S087D-H249R____________________

   N018R-T022R-S024R-N076D-V150L-H249R____________________

   T022R-S087D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R______________

   T022R-S101G-S103A-V104I-V150L-A232V-Q245R

   en donde las posiciones de aminoacidos de la variante de proteasa se numeran de acuerdo con la numeracion de las correspondientes posiciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de la subtilisina BPN’ de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEQ ID NO: 2, siendo dicha composicion un producto de consumo.

   10
2. 2. Una composicion segun la reivindicacion 1, en donde dicho material adyuvante comprende uno o mas seleccionados de:

   15

   20

   a. un encapsulado que comprende un perfume, comprendiendo preferiblemente dicho encapsulado, una microcapsula de perfume;

   b. un agente de matizado que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en tintes basicos, acidos, hidrofobos, directos y polimericos y tintes conjugados que tienen una longitud de onda de absorcion maxima de 550 nm a 650 nm y mezclas de los mismos;

   c. tensioactivo detersivo que comprende preferiblemente un material seleccionado del grupo que consiste en tensioactivos detersivos anionicos, tensioactivos detersivos no ionicos, tensioactivos detersivos cationicos, tensioactivos detersivos de ion hibrido y tensioactivos detersivos anfoteros y mezclas de los mismos;

   d. aditivo reforzante de la detergencia que comprende preferiblemente un material seleccionado del grupo que consiste en zeolitas, fosfatos y mezclas de los mismos;

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45 3.

   50 4.
3. 5.

   55
4. 6.

   e. una sal de silicato que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en silicato de sodio, silicato de potasio y mezclas de los mismos;

   f. abrillantador que comprende un material seleccionado del grupo que consiste en abrillantadores solubles en agua fria y mezclas de los mismos;

   g. un polimero de carboxilato que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en copolimero aleatorio de maleato/acrilato u homopolimero de poliacrilato y mezclas de los mismos;

   h. un polimero de desprendimiento de la suciedad que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en copolimeros de tereftalato y mezclas de los mismos;

   i. un polimero celulosico que comprende preferiblemente un material seleccionado del grupo que consiste en alquilcelulosa, alquilalcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquilcarboxialquilcelulosa y mezclas de los mismos;

   j. un catalizador de blanqueo que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en cationes iminio y poliiones iminio; iones hibridos de iminio; aminas modificadas; oxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dioxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas ciclicas de azucar y catalizadores de metales de transicion o ligandos para la formacion de los mismos o mezclas de los mismos;

   k. un activador de blanqueo que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en dodecanoil oxibenceno sulfonato, decanoil oxibenceno sulfonato, acido decanoil oxibenzoico o sus sales, 3,5,5-trimetil hexanoiloxibenceno sulfonato, tetraacetil etilendiamina (TAED), nonanoiloxibenceno sulfonato (NOBS) y mezclas de los mismos;

   l. una fuente de peroxido de hidrogeno que comprende preferiblemente, un material seleccionado del grupo que consiste en sales de perhidrato inorganicas, incluidas sales de metales alcalinos tales como sales de perborato sodico (generalmente mono o tetra-hidrato), sales de percarbonato, de persulfato, de perfosfato, de persilicato y mezclas de las mismas;

   m. un quelante que comprende preferiblemente un material seleccionado del grupo que consiste en DTPA (acido dietilentriamino pentaacetico), HEDP (acido hidroxietano difosfonico), DTPMP (acido dietilentriamino penta [metilenfosfonico]), acido etilendiamino disuccinico (EDDS), sal hidratada disodica del acido 1,2-dihidroxibenceno-3,5-disulfonico y derivados de dichos quelantes;

   n. una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en: (a) lipasas de primer lavado; (b) celulasas bacterianas de limpieza; (c) alfa-amilasas; y (d) mezclas de las mismas; y

   o mezclas de los mismos.

   Una composicion segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde se proporciona dicha composicion en forma de dosis unitaria unica o de varios compartimentos, preferiblemente, una dosis unitaria de varios compartimentos, en donde la variante de proteasa esta preferiblemente en un compartimento diferente a cualquier fuente de peroxido de hidrogeno y/o quelante.

   Un metodo para tratar y/o limpiar una superficie, preferiblemente, una superficie de tejido que comprende las etapas de (i) poner en contacto dicha superficie con una composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un licor de lavado acuoso y (ii) enjuagar y/o secar la superficie.

   Un metodo segun la reivindicacion 5, en donde el licor acuoso comprende de 0,1 g/l a 3 g/l de tensioactivo.

   Un metodo segun la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en donde la temperatura del licor de lavado acuoso es de 5 a 25 0C.
5. 7.

   60

   Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el licor de lavado comprende un licor de lavado de detergente para el lavado de ropa y tiene una conductividad de 0,1 mS/cm a 3 mS/cm, de 0,3 mS/cm a 2,5 mS/cm o incluso de 0,5 mS/cm a 2 mS/cm.

   Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el licor de lavado comprende un licor de lavado de detergente para el lavado de ropa y tiene una conductividad de por encima de 3 mS/cm a 30 mS/cm, de 3,5 mS/cm a 20 mS/cm o incluso de 4 mS/cm a 10 mS/cm.

   FIGURA1 - alineamiento de las proteasas maduras de referenda de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 2) y proteasa GG36 de subtilisina de B. lentus (SEQ ID NO: 1).

   BPN' 1 AQSVPYGVSQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLKVAGGASM VPSETNPFQD

   GG3 6 1 AQSVPWGISR VQAPAAHNRG LTGSGVKVAV LDTGIS-THP DLNIRGGASF VPGEPST-QD

   BPN' 61 NNSHGTHVAG TVAALNNSIG VLGVAPSASL YAVKVLGADG SGQYSWIING IEWAIANNMD

   GG3 6 5 9 GNGHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVAPSAEL YAVKVLGASG SGSVSSIAQG LEWAGNNGMH

   BPN' 121 VINMSLGGPS GSAALKAAVD KAVASGWW AAAGNEGTSG SSSTVGYPGK YPSVIAVGAV

   GG3 6 119 VANLSLGSPS PSATLEQAVN SATSRGVLW AASGNSGAGS----ISYPAR YANAMAVGAT

   BPN' 181 DSSNQRASFS QYGPELDVMA PGVSIQSTLP GNKYGAYNGT SMASPHVAGA AALILSKHPN

   GG3 6 175 DQNNNRASFS QYGAGLDIVA PGVNVQSTYP GSTYASLNGT SMATPHVAGA AALVKQKNPS

   BPN' 241 WTNTQVRSSL ENTTTKLGDS FYYGKGLINV QAAAQ

   GG3 6 235 WSNVQIRNHL KNTATSLGST NLYGSGLVNA EAATR

   imagen1

   imagen2

   imagen3