ES2625848T3 - Ingredientes activos de matricaria (tanacetum parthenium) libres de partenolida y proceso para su producción - Google Patents
Ingredientes activos de matricaria (tanacetum parthenium) libres de partenolida y proceso para su producción Download PDFInfo
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Abstract
Un método para aislar una fracción bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y que está sustancialmente libre de γ-lactonas α-insaturadas, dicho método comprende: proporcionar biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium); procesar la biomasa fresca bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de jugo celular es decir por lo menos sustancialmente libres de γ-lactonas α-insaturadas y una fracción de membrana que contiene γ-lactonas α- insaturadas, dicho procesamiento de la biomasa fresca comprende: (i) separar la biomasa fresca en un componente de jugo celular y un material enriquecido con fibra; y (ii) sujetar el componente de jugo celular a un ajuste de pH y etapa de tratamiento de microondas para producir el sobrenadante de jugo celular es decir por lo menos sustancialmente libres de γ-lactonas α-insaturadas; tratar el sobrenadante de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un primer sobrenadante de suero de jugo celular y un precipitado de fracción de citoplasma; y aislar el precipitado de fracción de citoplasma, en el que dicho precipitado de fracción de citoplasma es una fracción bioactiva que está sustancialmente libre de γ-lactonas α-insaturadas, en la que dichas γ-lactonas α-insaturadas comprenden partenolida.
Description
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DESCRIPCION
Ingredientes activos de matricaria (tanacetum parthenium) libres de partenolida y proceso para su produccion Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona con un metodo para elaborar ingredientes bioactivos que incluyen fracciones bioactivas aisladas derivadas de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). Las fracciones bioactivas son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida) y tienen actividad antiinflamatoria y antioxidante. La solicitud divulga metodos para elaborar los ingredientes bioactivos y una composicion bioactiva que incluye una mezcla de una o mas de las fracciones bioactivas aisladas.
Antecedentes de la invencion
La Tanacetum parthenium L. Schulz-Bip. (sin. Chrysanthemum parthenium, Leicanthemum parthenium, Matricaria parthenium, Pyrethrum parthenium) es una planta que pertenece a la familia Compositae (Asteraceae, Matricaria o margarita). La Tanacetum parthenium se conoce bajo los siguientes nombres comunes: altamisa, amargosa, aciano, gamaza, gamazon, plantas febnfugas, matricaria, chapote, camomila grande, manzanilla, matricaria, margarita de verano, madrehuela, Santa Maria, y varadika. De estos nombres comunes, el nombre “matricaria” se utiliza con mayor frecuencia.
La matricaria es una planta perenne corta que crece 15-80 cm de altura. Los tallos crecen verticales hacia arriba y son surcados y peludos. Las hojas son hojas verdes plumosas divididas dobles tienen margenes serrados. La flor tiene petalos con rayas blancas y un centro de color amarillo que es plano. El olor de la planta cuando se aplasta es fuerte, aromatico, y amargo. La matricaria se ha cultivado durante por lo menos 2.000 anos y es oriunda de la peninsula de los Balcanes y las montanas del Caucaso. En la actualidad, la matricaria crece en Europa, America del Norte, America del Sur, Africa del Norte, China, Japon y Australia. Las condiciones optimas para el cultivo de matricaria son: suelo bien drenado que tiene un pH = 6.0... 6.7 (pH optimo = 6.3); pleno sol o sombra parcial; adecuado para resistir en zonas de temperatura USDA de nueve a cinco sin proteccion. El mejor clima para la matricaria es zonas de cinco y siete. Con proteccion se puede cultivar la matricaria en las zonas tres y cuatro, aunque en un clima continental (por ejemplo, Kansas, EE.uU., Saskatchewan, Canada) la matricaria a veces se considera una planta anual.
Los antiguos griegos y primeros europeos utilizaron la Matricaria para tratar la fiebre, inflamacion e hinchazon, asf como para repeler insectos y para tratar mordeduras y picaduras. En los ultimos 20 anos, la matricaria ha suscitado un gran interes para el tratamiento de migranas, artritis y enfermedades inflamatorias. Las partes de la planta que se utilizan son hojas secas o frescas y partes aereas de la floracion. La matricaria se utiliza en forma de una hierba cruda, polvo seco, hoja fresca, capsula de hoja secada por congelacion, capsula de hoja seca, capsula de gelatina blanda, tintura, infusion (por ejemplo, te), extractos, e ingredientes de bebidas funcionales. Aparentemente, la planta entera de matricaria actua de una manera similar a los agentes antiinflamatorios no esteroides. Sin embargo, los extractos de matricaria actuan bastante similares a la cortisona (vease, por ejemplo, Feverfew. Botanical Monograph, American Journal of Natural Medicine 4(6):28-29 (1997)).
Dichas actividades de discrepancia y de amplio espectro atraen la atencion e investigacion de los ingredientes activos de la planta y sus derivados. Los principales productos qmmicos activos conocidos en la matricaria son lactonas sesquiterpenicas (contenido total < 1.8%) y aceites esenciales (contenido total de < 0.07%). La lista de los compuestos activos de matricaria incluyen los siguientes: (i) lactonas sesquiterpenicas (que incluyen artecanina, canina, 10- epicanina, crisantemolida, crisantemonina, epoxiartemorina, 1p-hidroxiarbusculina, 3p-hidroxipartenolida, 8p- hidroxireinosina, magnoliolida, partenolida, reinosina, santamarina, seco-tanapartenolida A, tanapartina, tanapatina-1a, 4a-epoxido, tanapartina-1p,4p-epoxido); (ii) sesquiterpenos (que incluyen alcanfor, p-farneseno, y germacreno); (iii) monoterpenos; (iv) flavonoles (que incluyen tanetina, kaempferoles, quercetagetinas, apigenina, luteolina, y crisoeritol); y (v) poliinas eter espiroacetalico enol.
El grupo mas abundante de estos compuestos es un grupo de Y-lactonas a-insaturadas; particularmente, partenolida, que representa ~85% de Y-lactonas a-insaturadas. La partenolida, que aparentemente es ubica en celulas de la superficie de la hoja de matricaria es la mas conocida y bien estudiada (vease, por ejemplo, Smith et al., J. Chromatogr., 627:255 (1992); y Smith, R.M., LC GC Int., (Jan. 8-15, 1996)). Las Y-lactonas a-insaturadas, que incluyen partenolida, se consideran que son los ingredientes fundamentales responsables de las actividades biologicas de la matricaria, pero son tambien los mismos ingredientes a menudo responsables de reacciones alergicas provocadas por los derivados de matricaria.
Por ejemplo, las preparaciones de matricaria utilizados en los ensayos clmicos exitosos teman un contenido de partenolida de 0.4% a 0.66%, que supera las concentraciones capaces de iniciar ulceracion, dermatitis exudativa, y efectos patologicos que surgen del contacto externo (vease, por ejemplo, Awang, D.V.C., “Feverfew,” Can. Pharm. J., 122:266-270 (1989)). Al mismo tiempo, aproximadamente 10-18% de los usuarios de matricaria han reportado algunos
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efectos adversos generalmente leves y reversibles (vease, por ejemplo, Ernst et al., “The efficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): una actualizacion de una revision sistematica, “Public Health Nutrition, 3(4a):509-514 (2000); Porter et al., “Feverfew in Saskatchewan”,
www.agr.gov.sk.ca/DOCS/crops/special_crops/feverfew.asp?firstPick=&secondpck=&thirdpick=Production% 20Information) (2004)) y la partenolida puede ser responsable de estos efectos adversos. La capacidad de las Y- lactonas a-insaturadas (que incluyen partenolida) para activar muchas reacciones alergicas esta bien documentada (vease, por ejemplo, Arch. Dermatol. Forsch, 251(3):235-244 (1975); Arch. Dermatol. Forsch, 255(2):111-121 (1976); Contact Dermatitis, 38(4):207-208 (1988); Am. J. Contact Dermatol., 1:49-50 (1998-1999); Br. J. Dermatol, 132(4)543- 547 (1995)).
En los ultimos anos, se han dirigido esfuerzos hacia la preparacion de extractos de matricaria, que pretenden ser sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas y, mas particularmente, sustancialmente libres de partenolida (vease, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,224,875 y Patente Estadounidense No. 6,479,080). Cabe senalar que “sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas” y “sustancialmente libre de partenolida” significa un extracto que tiene un contenido en peso de Y-lactonas a-insaturada o partenolida, respectivamente, por debajo de aproximadamente 0.1%, mas preferiblemente por debajo de 0.1%, mas preferiblemente por debajo de aproximadamente 0.09%, y mas preferiblemente por debajo de 0.07%. Debido a que los contenidos superiores son mas bajos que en una fitomasa de matricaria promedio que tiene 0.4 a 1.8% de partenolida (vease, por ejemplo, Marino L., “The effect of clonal micropropagation on partenolida content in two genotypes of feverfew, Tanacetum parthenium,” AgroFarm Technologies Feverfew Report, London, Ontario (2004)), se requieren muchas etapas de extraccion de complejo que utilizan diversos solventes organicos y purificacion, incluyendo la evaporacion completa de los solventes y la utilizacion de resina de intercambio ionico, para producir extractos que tiene contenido reducido de Y-lactonas a-insaturadas y particularmente partenolida.
Los extractos de solventes organicos mencionados anteriormente se obtienen de la fitomasa de matricaria seca utilizando un proceso que comprende las siguientes etapas: (a) extraer una cantidad de material vegetal de la porcion aerea de la planta con acetona, alcoholes o una mezcla de estos solventes con agua; (b) extraer el material de la etapa (a) con un solvente de hidrocarburo; (c) extraer la fase de no hidrocarburo restante con un solvente no polar; (d) evaporar el extracto de solvente no polar y redisolver el residuo en solucion alcoholica de agua, y luego tratar el residuo se redisuelto con una resina basica fuerte; (e) eluir la resina con un alcohol y retirar la solucion eluida; (f) tratar la resina con una solucion alcoholica o acuosa- alcoholica de un acido, concentrar la solucion y extraer el residuo resultante con un solvente no polar; (g) evaporar el solvente no polar de la etapa (f) para formar un residuo que se agrega al residuo de la evaporacion del extracto de hidrocarburo de la etapa (b) y a la fase acetonica o alcoholica obtenida despues de la extraccion con el solvente no polar de la etapa (c); y (h) evaporar el solvente y secar el residuo restante.
Los solventes preferidos para las diversas etapas de extraccion incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: para la etapa (a): acetona, metanol, etanol o mezclas de los mismos con agua; para la etapa (b): hexano, n-pentano, eter de petroleo, ligroma; para la etapa (c): cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo, preferiblemente cloruro de metileno; y para la etapa (f): acetato de etilo.
De acuerdo con las Patentes Estadounidenses Nos. 6,224,875 y 6,479,080, este extracto “sustancialmente libre de partenolida” tiene propiedades farmacologicas favorables junto con un riesgo reducido de inducir reacciones alergicas. Sin embargo, el extracto anterior se afsla con tratamiento secuencial utilizando solventes organicos, que pertenecen a cuatro grupos diferentes, y que puede tener compatibilidad limitada con muchos componentes convencionales de formulaciones para el cuidado de la piel. Por lo tanto, la aplicabilidad del extracto anterior como ingrediente para productos de cuidado de la piel tiene ciertos lfmites (por ejemplo, no son facilmente solubles en agua). La Patente Estadounidense No. 2003/0175235 ensena un metodo para extraer fracciones bioactivas de las especies de plantas en el que el jugo de celula vegetal se extrae de la biomasa vegetal fresca al separar la fraccion de membrana y el sobrenadante de jugo celular utilizando tratamiento con microondas. El sobrenadante de jugo celular se procesa para separar efectivamente la fraccion de citoplasma y la fraccion de suero celular que se refina adicionalmente para producir un filtrado de fraccion de suero que contiene los ingredientes bioactivos. En el metodo divulgado en la presente solicitud, un ajuste de pH y la etapa de tratamiento por microondas se realizan en el jugo celular con el fin de producir un sobrenadante de jugo celular en el que las Y-lactonas a-insaturadas se han fraccionado de plantas de matricaria.
Aunque el extracto de matricaria descrito es “sustancialmente libre de partenolida”, no esta realmente libre de material de partenolida debido al contenido de partenolida residual permitido. Las actividades espedficas altas bien conocidas de partenolida en sf pueden contribuir a las propiedades farmacologicas y alergenicidad residual del extracto, especialmente cuando se utiliza en altas concentraciones. Es importante que las propiedades farmacologicas del extracto anterior sean limitadas por actividades de solo aquellos ingredientes de matricaria que se solubilizan en ciertos solventes en ciertas condiciones. Por lo tanto, dichos extractos representan solo una parte de los componentes activos existentes en plantas de matricaria vivas. Por ejemplo, las hojas de matricaria secas por congelacion y hojas secas demostraron un efecto beneficioso significativo en comparacion con un placebo, pero los extractos de etanol de la matricaria fueron inefectivos (vease, por ejemplo, Ernst et al., “The efficacy and safety of feverfew (Tanacetum parthenium L.): una actualizacion de una revision sistematica,” Public Health Nutrition, 3(4a):509-514 (2000)).
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Con respecto a la comparacion de las actividades espedficas que se encuentran en diferentes formas de productos de matricaria, cabe senalar que se ha demostrado que la preparacion de hojas secas enteras es mas efectiva que sus extractos, y, adicionalmente, los extractos de matricaria seca y fresca tienen marcadas diferencias en la potencia y perfiles farmacologicos (vease, por ejemplo, Barsby et al., “Feverfew and vascular smooth muscle: Extracts from fresh and dried plants show opposing pharmacological profiles, dependent upon sesquiterpene lactone content,” Planta Medica, 59:20-25 (1993)). Por lo tanto, en relacion y en contraste con los extractos de hoja de matricaria secos, los extractos de hojas frescas tienen: (a) corriente de potasio dependiente de voltaje con inactivacion reducida de una manera relacionada con concentracion; (b) inhibicion dependiente de dosis de produccion de leucocitos de tromboxano B2 y leucotrieno B4; y (c) respuesta muscular inhibida a triptamina, tromboxano, y relajacion inducida por acetilcolina reducida.
Curiosamente, el fuerte deseo de maximizar la eficacia de los productos de matricaria llevo recientemente a una produccion mayor de productos que contienen todos los componentes vegetales que se afectan mmimamente por el procesamiento de la planta. Entre estos productos se presentan preparaciones de hojas de matricaria secadas por congelamiento, aunque dicho material es adecuado para aplicaciones limitadas, y el cuidado de la piel no esta entre ellas.
Adicionalmente, las actividades de los extractos de matricaria y el nivel de partenolida en estos extractos dependen de la seleccion metodo de extraccion de solvente final (vease, por ejemplo, Kaplan, M., “Comparison of Supercritical Fluid and Solvent Extraction of Feverfew (Tanacetum parthenium),” Turk J. Chem, 26:473-480 (2002)). Por lo tanto, difieren el material extrafdo mediante extraccion con solvente y la extraccion con fluido supercntico. Por ejemplo, los extractos de CO2 de fluidos supercnticos tienen mayor contenido partenolida que los extractos de cloroformo, y despues de eso mas que los extractos de acetona.
La composicion de matricaria vana significativamente, dependiendo de la fuente de material vegetal y condiciones de cultivo y cosecha. Se han encontrado variaciones enormes en la cantidad de partenolida. Por ejemplo, las plantas de crecimiento americanas contienen < 50% de la concentracion de partenolida encontrada en la matricaria cultivada en Inglaterra y Francia. Los contenidos de partenolida fueron mas altos para tierra seca en comparacion con la matricaria irrigada. Se encontro que al someter la matricaria a un unico evento de estres de agua puede aumentar el contenido de partenolida (Fonseca et al., “Partenolide and abscisic acid synthesis in feverfew are associated but environmental factors affect them dissimilarly,” J. Plant Physiology, 162,:485-494 (2005)). Las flores conteman mayores niveles de partenolida, mientras que los tallos conteman menos partenolida. El contenido de partenolida en flores aumento y el contenido de tallos y hojas disminuyo a medida que se retardo la cosecha. La matricaria cosechada durante la tarde contema significativamente mas partenolida que las plantas cosechadas en la manana y la exposicion de la matricaria a la luz ultravioleta (UV) resulto en una disminucion significativa del contenido de partenolida. Cabe senalar que la amplia variacion en la cantidad de partenolida en los derivados de matricaria podna ser el resultado esencial de la interaccion de dos factores principales: las condiciones de cultivo y metodos de procesamiento. Desafortunadamente, las Patentes Estadounidenses Nos. 6,224,875 y 6,479,080 no proporcionan ninguna informacion relativa a la reproducibilidad del extracto de matricaria “sustancialmente libre de partenolida”. Sin embargo, como se describio anteriormente, una gran variabilidad de la materia prima puede tener un impacto significativo sobre las propiedades del extracto.
Por lo tanto, existen muchos factores geneticos, geograficos, climaticos y tecnologicos, que conducen a mala reproducibilidad y a menos calidad totalmente optima de productos y extractos de matricaria convencionales (vease, por ejemplo, Hepinstall et al., “Partenolida content and bioactivity of feverfew (Tanacetum parthenium (L.) Schultz-Bip.). Estimation of commercial and authenticated feverfew products,” J. Pharm. Pharmacol., 44:391-395 (1992); Draves, A.H. and S.E. Walker, “Partenolide Content of Canadian Commerical Feverfew Preparations: Label Claims are Misleading in Most Cases,” Canadian Pharm J., 136(10):23-30 (Dec. 2003/Jan. 2004)) y estos factores crean serios problemas para una amplia utilizacion de los derivados de matricaria en la medicina natural y el cuidado de la piel.
Por lo tanto, subsiste la necesidad de un metodo de produccion de derivados de matricaria libres de partenolida y altamente reproducibles que tengan un amplio espectro de actividades biologicas deseables, que no esten limitadas por solo aquellas actividades que tienen afinidad a ciertos solventes, es decir, que estan de otro modo no sujetas a las limitaciones de extraccion qdmica convencional.
Resumen de la invencion
La solicitud divulga ingredientes bioactivos que incluyen fracciones bioactivas aisladas derivadas de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). Las fracciones bioactivas son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Adicionalmente, las fracciones bioactivas tienen actividad antiinflamatoria y antioxidante.
La presente invencion se relaciona con un metodo para aislar fracciones bioactivas que se derivan de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y que son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Este metodo involucra proporcionar biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). La biomasa fresca se procesa bajo condiciones efectivas para producir un
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sobrenadante de jugo celular y una fraccion de membrana. El sobrenadante de jugo celular se trata bajo condiciones efectivas para producir un primer sobrenadante de suero de jugo celular y un precipitado de fraccion de citoplasma. El precipitado de fraccion de citoplasma luego se afsla como una fraccion bioactiva es decir por lo menos sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas. La solicitud tambien divulga un ingrediente bioactivo que incluye el precipitado de fraccion de citoplasma producido por este metodo, y que tiene actividad antiinflamatoria y antioxidante.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para preparar una fraccion de suero de jugo celular estabilizado que es una fraccion bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Este metodo implica clarificar el primer sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un segundo sobrenadante de suero de jugo celular. Se mezcla un agente de estabilizacion con el segundo sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular estabilizado. La fraccion de suero de jugo celular estabilizado es una fraccion bioactiva es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas. La solicitud tambien divulga un ingrediente bioactivo que incluye la fraccion de suero de jugo celular estabilizado producido por este metodo, y que tiene actividad antiinflamatoria y antioxidante.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para preparar una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado que es una fraccion bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Este metodo involucra concentrar la fraccion de suero de jugo celular estabilizado bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de suero de jugo celular concentrado. Un agente de estabilizacion se mezcla con el sobrenadante de suero de jugo celular concentrado bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado. La fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado es una fraccion bioactiva es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas. La solicitud tambien divulga un ingrediente bioactivo que incluye la fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado producida por este metodo, y que tiene actividad antiinflamatoria y antioxidante.
La solicitud divulga adicionalmente una composicion bioactiva que incluye una mezcla de una o mas de las fracciones bioactivas aisladas de la presente invencion.
La presente invencion es util en que proporciona un medio para la fabricacion de derivados de matricaria altamente reproducibles y libres de partenolida o sustancialmente libres de partenolida que tienen un amplio espectro de actividades biologicas deseables (por ejemplo, actividades antiinflamatorias y antioxidantes). Una ventaja de la presente invencion sobre la tecnica anterior es que el metodo de la presente invencion no requiere el uso de solventes organicos fuertes para aislar las fracciones bioactivas de la presente invencion. Los ingredientes bioactivos divulgados en la solicitud son utiles como ingredientes activos en varias aplicaciones topicas y orales a mairnferos (que incluyen humanos). Estas formulaciones se pueden utilizar para inhibir la actividad inflamatoria en el tejido de la piel y para proteger el tejido de la piel del dano inducido por luz ultravioleta. Los ingredientes bioactivos divulgados aqrn tambien se pueden utilizar para la normalizacion de trastornos de la piel en el tejido de la piel de un mamffero.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un dibujo esquematico que demuestra una realizacion del proceso para preparar los ingredientes bioactivos de la presente invencion.
La Figura 2 es un cromatograma de cromatograffa lfquida de alta presion (“HPLC”) de la biomasa fresca de matricaria utilizada en una realizacion del proceso de la presente invencion. La flecha hacia abajo muestra el pico de partenolida.
La Figura 3 es un cromatograma de HPLC del material enriquecido con fibra aislado por una realizacion del proceso de la presente invencion. La flecha hacia abajo muestra el pico de partenolida.
La Figura 4 es un cromatograma de HPLC del Precipitado I aislado por una realizacion del proceso de la presente invencion. La flecha hacia abajo muestra el pico de partenolida.
La Figura 5 es un cromatograma de HPLC del Precipitado II (Ingrediente Bioactivo A) aislado por una realizacion del proceso de la presente invencion. La flecha hacia abajo muestra el pico de partenolida.
La Figura 6 es un cromatograma de HPLC del Sobrenadante Final (Ingrediente Bioactivo B) aislado por una realizacion del proceso de la presente invencion.
La Figura 7 es un cromatograma de HPLC del Sobrenadante Final Concentrado (Ingrediente Bioactivo C) aislado por una realizacion del proceso de la presente invencion.
Descripcion detallada de la invencion
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La presente invencion se refiere a ingredientes bioactivos que incluyen fracciones bioactivas aisladas derivadas de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). Las fracciones bioactivas son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas, y mas particularmente ya sea libre de o sustancialmente libre de partenolida. Como se utiliza aqm, el termino “fraccion bioactiva” e “ingrediente bioactivo” se pueden utilizar de forma intercambiable. En vista de la presente especificacion, el experto comun en la tecnica sabra cuando dicho uso intercambiable de los terminos es apropiado. Los ingredientes bioactivos divulgados en la solicitud tienen actividades favorables, que incluyen, sin limitacion, actividades antiinflamatorias y antioxidantes.
Como se utiliza aqm, el termino “matricaria” es el nombre comun de la planta “Tanacetum parthenium”.
Como se utiliza aqm, los terminos “sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas” y “sustancialmente libre de partenolida” se refieren a un ingrediente bioactivo o fraccion bioactiva de matricaria que tiene un contenido en peso de Y-lactonas a-insaturadas o partenolida, respectivamente, igual a o menor de aproximadamente 0.01%, pero aun dentro del lfmite detectable de Y-lactonas a-insaturadas o partenolida utilizando ensayos analtticos de cromatograffa lfquida de alta presion estandar (“HPLC”) bien conocidos en la tecnica. Como se utiliza aqm, todos los porcentajes utilizados para referirse al contenido de peso o concentracion de Y-lactonas a-insaturadas o partenolida en los ingredientes bioactivos/fracciones bioactivas de la presente invencion, a menos que se indique lo contrario, se refieren al porcentaje en peso (comunmente abreviado por el sfmbolo “% en peso” o la frase “por ciento en peso”).
Como se utiliza aqm, los terminos “libre de Y-lactonas a-insaturadas” y “libre de partenolida” se refieren a un ingrediente bioactivo o fraccion bioactiva de matricaria que tiene un contenido en peso de Y-lactonas a-insaturadas o partenolida, respectivamente, que esta por debajo del lfmite detectable para Y-lactonas a-insaturadas o partenolida utilizando HPLC estandar ensayos analtticos bien conocidos en la tecnica. En una realizacion, los bioactivos fracciones ingredientes/bioactivos que estan libres de partenolida tienen un contenido en peso de partenolida que es menor que 0.00007% en peso. Aquellos expertos comunes en la tecnica reconocenan que los ingredientes bioactivos/fracciones bioactivas de la presente invencion que son “libres de Y-lactonas a-insaturadas” o “libres de partenolida” se caracterizan como “completamente libres de Y-lactonas a-insaturadas” o “completamente libres de partenolida”, respectivamente.
Un metodo adecuado para detectar una cantidad de partenolida se describe adicionalmente en el Ejemplo 6 (infra). En pocas palabras, dicho metodo para detectar partenolida implica la deteccion a 225 nm, donde las concentraciones de partenolida se determinan utilizando una curva de calibracion de multiples puntos desarrollada con seis estandares de partenolida (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) que vanan desde 30 |jg de partenolida/gramo de muestra a 900 |jg de partenolida/gramo de muestra. En una realizacion, el lfmite de deteccion de partenolida en estas condiciones es de 0.7 jg de partenolida/mL de muestra (es decir, 0.00007%). Aproximadamente 30 jg de partenolida/gramo de muestra (es decir, 0.003%) se pueden cuantificar utilizando este grupo de condiciones.
Un ingrediente bioactivo divulgado en la solicitud corresponde a un “precipitado de fraccion de citoplasma” como se define aqm. En referencia al esquema del proceso descrito en la Figura 1, el “precipitado de fraccion de citoplasma” incluye una categona de ingrediente bioactivo a la cual pertenece el “Precipitado II 36”. Adicionalmente, como se describe en la seccion de Ejemplos (infra), este “precipitado de fraccion de citoplasma” incluye una categona de ingrediente bioactivo al cual pertenece el “Ingrediente Bioactivo A”. Como se demuestra en los Ejemplos, se mostro que el Ingrediente Bioactivo A como se divulga aqm contema aproximadamente 0.01% en peso de partenolida, y por lo tanto calificana como sustancialmente libre de partenolida. Tambien se divulga, que el ingrediente bioactivo que corresponde al “precipitado de fraccion de citoplasma”, puede tener un perfil de HPLC correspondiente al perfil mostrado en la Figura 5, o similares.
Otro ingrediente bioactivo divulgado en la solicitud corresponde a una “fraccion de suero de jugo celular estabilizado” como se define aqm. En referencia a la seccion de Ejemplos (infra) y el esquema del proceso descrito en la Figura 1, esta “fraccion de suero jugo celular estabilizado” incluye una categona de ingrediente bioactivo a la que pertenece el “Ingrediente Bioactivo B” e “Ingrediente Bioactivo B 60”. Como se demuestra en los Ejemplos, se mostro que el Ingrediente Bioactivo B como se divulga aqm fue contema por debajo de 0.00007% en peso de partenolida, y por lo tanto se define como libre de partenolida. En otras palabras, se encontro que la cantidad de partenolida en este ingrediente bioactivo esta por debajo del lfmite de deteccion del procedimiento analttico utilizado para detectar partenolida (vease el Ejemplo 6, “Metodo para Determinacion de Contenido de Partenolida”). El ingrediente bioactivo correspondiente a la “fraccion de suero de jugo celular estabilizado” puede tener un perfil de HPLC correspondiente al perfil mostrado en la Figura 6, o similares. El ingrediente bioactivo es facilmente soluble en agua.
Un ingrediente bioactivo adicional divulgado en la solicitud corresponde a una “fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado” como se define aqm. En referencia a la seccion de Ejemplos (infra) y el esquema del proceso descrito en la Figura 1, este “fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado” incluye una categona de ingrediente bioactivo a la que pertenecen el “Ingrediente Bioactivo C” e “Ingrediente Bioactivo C 80”. Como se demuestra en los Ejemplos, se mostro que el Ingrediente Bioactivo C divulgado aqm contema por debajo de 0.00007% en peso de partenolida, y por lo tanto se define como libre de partenolida. En otras palabras, se encontro que la cantidad de partenolida en este ingrediente bioactivo esta por debajo del lfmite de deteccion del procedimiento analttico utilizado para detectar partenolida (vease el Ejemplo 6, infra). El ingrediente bioactivo que corresponde a la “fraccion de
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suero de jugo celular concentrado estabilizado” puede tener un perfil de HPLC correspondiente al perfil mostrado en la Figura 7, o similares. El ingrediente bioactivo es facilmente soluble en agua.
La fraccion bioactiva de lo divulgado en la solicitud tiene actividad antiinflamatoria y antioxidante.
Con respecto a la actividad antiinflamatoria, dicha actividad se puede determinar utilizando un ensayo de inhibicion de elastasa (vease, por ejemplo, Ejemplo 6, “Metodo para Determinacion de la Actividad Inhibidora de la Elastasa”). El ingrediente bioactivo divulgado aqrn tiene una actividad antiinflamatoria expresada en valores de IC50 que vanan de aproximadamente 0.1% (v/v) a aproximadamente 2.0% (v/v), particularmente desde aproximadamente 0.3% (v/v) a aproximadamente 1.7% (v/v). Como se utiliza aqrn para definir la actividad antiinflamatoria, el termino “valor IC50” se refiere a la concentracion de ingrediente bioactivo requerida para reducir la velocidad de la reaccion enzimatica de la elastasa en un 50%. Como se muestra en las Tablas 4, 7, 10 y 13, la actividad antiinflamatoria (en valores IC50) de los ingredientes bioactivos identificados se puede expresar en terminos de volumen (por ejemplo, microlitros, jL), y luego se vuelve a calcular en terminos de una concentracion volumen por volumen (v/v). Los datos antiinflamatorios mostrados en las Tablas 4, 7, 10, y 13 se basan en un volumen de 3.0 mL de mezcla de reaccion.
Con respecto a la actividad antioxidante, dicha actividad se puede determinar utilizando un ensayo de depuracion de superoxidos (vease por ejemplo, Ejemplo 6, “Metodo para la Determinacion de Actividad de Depuracion de Superoxidos”). El ingrediente bioactivo divulgado aqrn tiene una actividad antioxidante expresada en valores IC50 que vanan de aproximadamente 0.007% (v/v) y aproximadamente 1.0% (v/v), particularmente de aproximadamente 0.067% (v/v) a aproximadamente 0.27% (v/v). Como se utiliza aqrn para definir la actividad antioxidante, el termino “valor IC50” se refiere a la concentracion de ingrediente bioactivo requerida para disminuir la velocidad de la reduccion del citocromo c en un 50%. Como se muestra en las Tablas 4, 7, 10 y 13, la actividad antioxidante (en valores de IC50) de los ingredientes bioactivos identificados se puede expresar en terminos de volumen (por ejemplo, microlitros, jl), y luego se vuelve a calcular en terminos de una concentracion volumen por volumen (v/v). El antioxidante mostrado en las Tablas 4, 7, 10, y 13 se basa en un volumen de 3.0 mL de mezcla de reaccion.
El ingrediente bioactivo se pueden utilizar para aplicaciones topicas con o sin un agente estabilizador. Los agentes estabilizadores adecuados son aquellos utilizados convencionalmente en la tecnica, y pueden incluir, sin limitacion, un emulsionante, un conservante, un antioxidante, una matriz polimerica, y mezclas de los mismos.
Como se utiliza aqrn, “aplicacion topica” se refiere en general a las tecnicas relacionadas con la colocacion directamente sobre o difusion de los ingredientes bioactivos o formulaciones que contienen estos ingredientes bioactivos sobre la piel exterior, por ejemplo, mediante el uso de las manos o un aplicador tal como una toallita.
Los ingredientes bioactivos (y formulaciones que los contienen) son “cosmeticamente aceptables”. Como se utiliza aqrn, el termino “cosmeticamente aceptable” se refiere a ingredientes bioactivos, formulaciones, agentes cosmeticamente activos, o ingredientes inertes que son adecuados para uso en contacto con tejidos de mairnferos (por ejemplo, la piel de humanos) sin excesiva toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritacion, respuesta alergica, y similares, acorde con una relacion beneficio/riesgo razonable.
Los ingredientes bioactivos (y formulaciones que los contienen) son utiles para aplicacion topica y oral a humanos, y se pueden aplicar en una “cantidad segura y efectiva”. Como se utiliza aqrn, el termino “cantidad segura y efectiva” se refiere a una cantidad de ingrediente bioactivo o formulacion suficiente para inducir una modificacion significativamente positiva en la afeccion que se va a regular o tratar, pero suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves. La cantidad segura y efectiva del ingrediente bioactivo o formulacion que contiene el ingrediente bioactivo variara con la afeccion particular que se esta tratando, edad y condicion ffsica del usuario final, gravedad de la afeccion que se va a tratar/prevenir, duracion del tratamiento, naturaleza de la terapia concurrente, ingrediente bioactivo espedfico o formulacion empleada, el portador topico cosmeticamente aceptable particular utilizado, y factores similares.
Las formulaciones que contienen los ingredientes bioactivos divulgados aqrn se pueden preparar utilizando metodologfa que es bien conocida por un experto en la tecnica.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para aislar fracciones bioactivas que se derivan de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y que son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Este metodo involucra proporcionar biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). La biomasa fresca adecuada puede incluir cualquier parte de la planta de matricaria, que incluye, por ejemplo, sus hojas, flores, brotes, tallos, y rafces. La biomasa fresca se procesa bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de jugo celular y una fraccion de membrana. El sobrenadante de jugo celular se trata bajo condiciones efectivas para producir un primer sobrenadante de suero de jugo celular y un precipitado de fraccion de citoplasma. En una realizacion, el “precipitado de fraccion de citoplasma” corresponde al ingrediente bioactivo A (vease Figura 1 y la seccion de Ejemplos). El precipitado de fraccion de citoplasma luego se afsla como una fraccion bioactiva que esta sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente sustancialmente libres de partenolida.
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Una realizacion para procesar la biomasa fresca bajo condiciones efectivas para producir el sobrenadante de jugo celular y la fraccion de membrana es como sigue: (i) la biomasa fresca se separa en un componente de jugo celular y un material enriquecido con fibra; (ii) el componente de jugo celular se clarifica para producir un componente de jugo celular clarificado; y (iii) el componente de jugo celular clarificado se separa en el sobrenadante de jugo celular y la fraccion de membrana.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para preparar una fraccion de suero de jugo celular estabilizado que es una fraccion bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas (por ejemplo, partenolida). Este metodo involucra clarificar el primer sobrenadante de suero de jugo celular (descrito anteriormente) bajo condiciones efectivas para producir un segundo sobrenadante de suero de jugo celular. Un agente de estabilizacion (cuyos ejemplos adecuados se describen aqrn) se mezcla con el segundo sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular estabilizado. La fraccion de suero de jugo celular estabilizado es una fraccion bioactiva es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente libres de partenolida. En una realizacion, la “fraccion de suero de jugo celular estabilizado” corresponde al ingrediente bioactivo B (vease Figura 1 y la seccion de Ejemplos).
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para preparar una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado que es una fraccion bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente libres de partenolida. Este metodo involucra concentrar la fraccion de suero de jugo celular estabilizado (descrita anteriormente) bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de suero de jugo celular concentrado. Un agente de estabilizacion (cuyos ejemplos adecuados se describen aqrn) se mezcla con el sobrenadante de suero de jugo celular concentrado bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado. La fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado es una fraccion bioactiva es decir libre de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente libre de partenolida. En una realizacion, la “fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado” corresponde al ingrediente bioactivo C (vease Figura 1 y la seccion de Ejemplos).
La solicitud tambien divulga ingredientes bioactivos elaborados a partir de los metodos descritos anteriormente, que incluyen, por ejemplo, los ingredientes bioactivos que contienen (i) el precipitado de fraccion de citoplasma producido por los metodos divulgados aqrn; (ii) la fraccion de suero de jugo celular estabilizado producida por los metodos divulgados aqrn; y (iii) la fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado producida por los metodos divulgados aqrn. Estos ingredientes bioactivos tienen actividad antiinflamatoria y antioxidante.
Por via de ejemplo, una realizacion del proceso general para preparar los ingredientes bioactivos de la presente invencion (por ejemplo, ingrediente bioactivo A, ingrediente bioactivo B, e ingrediente bioactivo C) se muestra esquematicamente en la Figura 1. Los detalles de las etapas de este proceso se describen adicionalmente adelante en esta Descripcion Detallada y en los Ejemplos.
Como se representa en la Figura 1, se proporciona la matricaria 10 fresca (es decir, la biomasa fresca de matricaria). En una realizacion, la etapa descrita en este parrafo corresponde a la etapa definida como “proporcionar biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium)”.
La matricaria 10 fresca se somete a trituracion, maceracion, y prensado 12 bajo condiciones efectivas para separar la matricaria 10 fresca en el jugo 16 celular y material enriquecido con fibra 14. El jugo 16 celular luego se somete a clarificacion 18 bajo condiciones efectivas para producir jugo 20 celular clarificado. El jugo 20 celular clarificado se somete a ajuste de pH/tratamiento 22 con microondas y luego enfriamiento/centrifugacion 24 bajo condiciones efectivas para producir el Precipitado I 26 (fraccion de membrana) y el Sobrenadante I 30 (sobrenadante de jugo celular). Esta etapa es efectiva en someter a particion una cantidad sustancial de las Y-lactonas a-insaturadas (particularmente partenolida) en el Precipitado I 26, que tambien incluye gran parte del material de membrana encontrado en el jugo 20 celular clarificado. Cuando se utiliza para describir la cantidad de Y-lactonas a-insaturadas (particularmente partenolida) contenida en el Precipitado I 26, el termino “cantidad sustancial” se refiere a un contenido de Y-lactonas a-insaturadas (particularmente partenolida) que excede 0.01% en peso y/o que es comparable con el contenido de Y-lactonas a- insaturadas (particularmente partenolida) en la matricaria fresca. De esta manera, el Sobrenadante I 30 que se produce por esta etapa incluye jugo celular, es decir por lo menos sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente por lo menos sustancialmente libres de partenolida. En una realizacion, la etapa descrita en este parrafo corresponde a la etapa definida como “procesar la biomasa fresca bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de jugo celular y una fraccion de membrana”.
El Sobrenadante I 30 se somete a precipitacion isoelectrica 32 y despues de esto centrifugacion 34 bajo condiciones efectivas para producir el Sobrenadante II 40 (por ejemplo, primer sobrenadante de suero de jugo celular) y el Precipitado II 36 (por ejemplo, precipitado de fraccion de citoplasma). En una realizacion, la etapa descrita en este parrafo corresponde a la etapa definida como “tratar el sobrenadante de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un primer sobrenadante de suero de jugo celular y un precipitado de fraccion de citoplasma”.
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Luego se afsla el Precipitado II 36. En una realizacion, Precipitado II 36 corresponde al ingrediente bioactivo A, y es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente sustancialmente libres de partenolida. En una realizacion, la etapa descrita en este parrafo corresponde a la etapa definida como “aislar el precipitado de fraccion de citoplasma”. El Precipitado II 36 (Ingrediente Bioactivo A) tambien tiene diversas bioactividades favorables, que incluyen, pero no se limitan a, actividad antiinflamatoria y antioxidante.
El Sobrenadante II 40 (por ejemplo, primer sobrenadante de suero de jugo celular) se somete a ajuste de pH 42 y despues de esto se somete a clarificacion 44 bajo condiciones efectivas para el Sobrenadante 50 Final (tambien mencionado en una realizacion el “segundo sobrenadante de suero de jugo celular”). El Sobrenadante 50 Final luego se somete a mezcla con el estabilizador 52 bajo condiciones efectivas para producir el ingrediente bioactivo B 60 (tambien mencionado en una realizacion como la “fraccion de suero de jugo celular estabilizado”). El ingrediente bioactivo B 60 es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente sustancialmente libre de partenolida. En una realizacion, las etapas colectivas descritas en este parrafo corresponden a las etapas definidas como (i) “clarificar el primer sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un segundo sobrenadante de suero de jugo celular”; y (ii) “mezclar un agente de estabilizacion con el segundo sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular estabilizado”. El ingrediente bioactivo B 60 tambien tiene diversas bioactividades favorables, que incluyen, pero no se limitan a, actividad antiinflamatoria y antioxidante.
El ingrediente bioactivo B 60 se somete a evaporacion 62 bajo condiciones efectivas para concentrar el ingrediente bioactivo B 60 para producir el Sobrenadante Final Concentrado 70 (tambien mencionado en una realizacion como el “sobrenadante de suero de jugo celular concentrado”). En una realizacion, esta etapa corresponde a la etapa definida como “concentrar la fraccion de suero de jugo celular estabilizado bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de suero de jugo celular concentrado”. El Sobrenadante Final Concentrado 70 luego se somete a mezclar con estabilizador 72 bajo condiciones efectivas para producir ingrediente bioactivo C 80 (tambien se menciona en una realizacion como la “fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado”). En una realizacion, esta etapa corresponde a la etapa de “mezclar un agente de estabilizacion con el sobrenadante de suero de jugo celular concentrado bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado”. El ingrediente bioactivo C 80 es libre de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente libre de partenolida. El ingrediente bioactivo C 80 tambien tiene diversas bioactividades favorables, que incluyen, pero no se limitan a, actividad antiinflamatoria y antioxidante.
Los ingredientes bioactivos divulgados en la solicitud incluyen todo el jugo celular derivado de fracciones bioactivas representadas en la Figura 1, a saber, las fracciones bioactivas representadas por lo siguiente: (i) Sobrenadante I 30; (ii) Sobrenadante II 40; (iii) Precipitado II 36 (Ingrediente Bioactivo A); (iv) Sobrenadante 50 Final; (v) ingrediente bioactivo B 60; (vi) Sobrenadante Final Concentrado 70; y (vii) ingrediente bioactivo C 80. Las fracciones bioactivas representadas por aquellas enumeradas en este parrafo son cada una ya sea libres de o sustancialmente libres de y- lactonas a-insaturadas, y particularmente libre de o sustancialmente libres de partenolida. Adicionalmente, las fracciones bioactivas representadas por aquellas enumeradas en este parrafo cada una tiene actividad antiinflamatoria y antioxidante.
La solicitud tambien divulga composiciones bioactivas que incluyen una mezcla de una o mas fracciones bioactivas aisladas derivadas de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium). Las fracciones bioactivas adecuadas pueden incluir, sin limitacion, cualquiera de las fracciones bioactivas divulgadas aqrn. En particular, las fracciones bioactivas adecuadas son cada una ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente libres de o sustancialmente libres de partenolida. Adicionalmente, las fracciones bioactivas adecuadas tienen actividad antiinflamatoria y antioxidante. La composicion bioactiva puede incluir, sin limitacion, una mezcla de una o mas de las fracciones bioactivas/ingredientes bioactivos descritos en la Figura 1, a saber, el Sobrenadante I 30, el Sobrenadante II 40, Precipitado II 36 (Ingrediente Bioactivo A), el Sobrenadante 50 Final, ingrediente bioactivo B 60, el Sobrenadante Final Concentrado 70, y/o ingrediente bioactivo C 80. Las composiciones bioactivas son ya sea libres de o sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas, y particularmente libres de o sustancialmente libres de partenolida. Las composiciones bioactivas tambien tienen actividad antiinflamatoria y antioxidante. La composicion bioactiva tambien puede incluir un agente de estabilizacion. Los metodos para combinar una o mas fracciones bioactivas para producir las composiciones bioactivas son bien conocidos en la tecnica, y se contemplan dentro de esta divulgacion.
Los ingredientes bioactivos y composiciones bioactivas divulgadas en la solicitud se pueden utilizar en diversos metodos para mamfferos (que incluyen humanos). Adicionalmente, debido a la baja concentracion de partenolida (o la ausencia de partenolida en total) en los ingredientes bioactivos, los metodos para utilizar los ingredientes bioactivos pueden incluir aplicaciones que son seguras no solo para adultos, pero tambien para ninos de todas las edades (que incluyen, sin limitacion bebes, ninos pequenos, y jovenes, y adolescentes).
Se resumen adelante realizaciones adicionales de los ingredientes bioactivos de la presente invencion.
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En una realizacion, los ingredientes bioactivos se derivan de biomasa aerea fresca de matricaria en cualquier etapa de crecimiento, que incluye, pero no se limita por, las etapas que proporcionan rendimiento maximo: desde la etapa temprana de la floracion completa (10% de flores) hasta la etapa de floracion completa (100% de flores).
En una realizacion, los ingredientes bioactivos se pueden derivar de fitomasa fresca, que se puede recolectar de plantas cultivadas en el primer ano y/o los siguientes anos de crecimiento.
En otra realizacion, los ingredientes bioactivos se pueden derivar de fitomasa fresca, que se cultiva en los campos y/o en los invernaderos y/o en fitotron y/o en cultivos de tejido y/o en callos.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de una celula vegetal, que no tiene union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de una celula vegetal que tengan propiedades inflamatorias y no tengan union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de la celula vegetal que tengan actividad inhibidora contra las proteinasas liberadas durante la respuesta inflamatoria en tejidos humanos. Las proteinasas anteriores pueden incluir, pero no se limitan a, elastasa de neutrofilo humano, que es una de las enzimas mas destructivas entre proteinasas. Debido a que la elastasa puede degradar diversos componentes de la matriz extracelular de tejidos humanos, los inhibidores de la elastasa son considerados como importantes bioactivos capaces de reducir el dano de tejido asociado con una amplia variedad de afecciones inflamatorias. Aunque en sf misma la partenolida purificada demuestra cierta actividad antielastasa, se encontro inesperadamente que los ingredientes bioactivos sustancialmente libres de partenolida y completamente libres de partenolida tienen una mayor actividad inhibidora de la elastasa, que aproximadamente tiene dos ordenes de magnitud mayor que la actividad de la partenolida purificada
Se encontro que los ingredientes bioactivos que no tienen union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida, tienen una actividad antielastasa que es superior a la actividad de la partenolida pura.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de celulas vegetales que tienen propiedades inhibidoras de elastasa y no tienen union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
Los ingredientes bioactivos adecuados de la presente invencion puede incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de celula vegetal que tengan propiedades antioxidantes y no tengan union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
La solicitud tambien divulga ingredientes bioactivos, que son (i) sustancialmente o completamente libres de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, y tienen propiedades (ii) antiinflamatorias, y (iii) antioxidantes deseables para el cuidado de la piel que incluyen aplicaciones topicas y orales.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de celula vegetal que tengan propiedades antiinflamatorias y antioxidantes y no tengan union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
Los ingredientes bioactivos adecuados pueden incluir, sin limitacion, cualesquier componentes de celula vegetal que tienen propiedades inhibidoras y antioxidantes de elastasa y no tienen union y/o afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente a partenolida.
La solicitud tambien divulga un metodo para aislar a partir del jugo celular de biomasa fresca de una matricaria (Tanacetum parthenium) los ingredientes bioactivos para el cuidado de la piel, que son (i) sustancialmente o completamente libres de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, y que poseen propiedades (ii) antiinflamatorias, y/o (iii) antioxidantes.
La presente invencion tambien se relaciona con un metodo para aislar del jugo celular obtenido de la biomasa fresca de una matricaria (Tanacetum parthenium) los ingredientes bioactivos para el cuidado de la piel, que son (i) sustancialmente o completamente libres de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, y que poseen (ii) propiedades inhibidoras , y/o (iii) antioxidantes de elastasa.
En una realizacion, el metodo de la presente invencion involucra biomasa fresca de una matricaria (Tanacetum parthenium). La biomasa fresca luego se separa en el jugo celular y un material enriquecido con fibra.
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Cabe senalar que, dependiendo de las condiciones de cultivo de la matricaria, ano de crecimiento, y en particular de la cosecha, el contenido de materia seca de la biomasa de la planta puede variar significativamente y puede afectar a la consistencia de las propiedades del jugo celular y por lo tanto la reproducibilidad de los ingredientes bioactivos derivados de jugo celular. La presente invencion permite la estandarizacion de las propiedades de jugo celular para mejorar la reproducibilidad de ingredientes bioactivos.
En una realizacion, la normalizacion de las propiedades del jugo celular se mejora mediante la exploracion de condiciones uniformes de cultivo y cosecha de matricaria.
En otra realizacion, el ajuste adecuado de los regfmenes de trituracion, maceracion, y prensado de matricarias frescas permite la obtencion de jugo celular que tiene un contenido de materia seca que se vana en un rango relativamente estrecho (por ejemplo, 7.0 ± 1.6%). Por ejemplo, si el contenido de materia seca de la biomasa de la planta se reduce debido a un impacto ambiental, la trituracion fina de la matricaria y mayor presion permite que el contenido de la materia seca en el jugo celular aumente y mejore su reproducibilidad. Si el contenido de materia seca en la biomasa vegetal aumenta, se puede utilizar el proceso de trituracion y prensado mas bajo.
En otra realizacion, se proporciona la normalizacion de jugo celular sin aumento indeseable de su temperatura.
Cabe senalar que los ajustes anteriores abordan la reproducibilidad de jugo celular, y no necesariamente disminuyen el contenido de Y-lactonas a-insaturadas, en particular de partenolida, en el jugo celular cuando se compara en una base de materia seca con matricaria fresca o con material enriquecido por fibra. Aunque aparentemente se concentra la partenolida en las celulas de aceite, que se localizan en la superficie de la hoja de la matricaria (vease, por ejemplo,
Smith et al., J. Chromatogr., 627:255 (1992); y Smith, R.M., LC GC Int., Jan. 8-15, 1996, que se incorporan aqu
mediante referencia en su totalidad), se encontro inesperadamente que la partenolida no se concentra
predominantemente en el material enriquecido con fibra sino mas bien se distribuye entre el material superior y el jugo celular.
En una realizacion, el material enriquecido con fibra se seca o se puede almacenar en condiciones de congelacion.
En otra realizacion, la partenolida que contiene material enriquecido con fibra se utiliza para aplicaciones
convencionales de derivados de matricaria que se utilizan comunmente en la tecnica.
El jugo celular de matricaria fresca es una dispersion coloidal relativamente estable que tiene un color verde oscuro. Este color se debe a los cloroplastos y sus fragmentos, que se dispersan en la fase continua de jugo celular que tiene color marron y enriquecida con otros componentes del citoplasma. Se encontro inesperadamente que en esta dispersion coloidal las Y-lactonas a-insaturadas, en particular partenolida, tienen una fuerte union y/o afinidad con los cloroplastos y sus fragmentos.
En una realizacion, la eliminacion de los cloroplastos y sus fragmentos del jugo celular permite la obtencion de una fase de jugo celular continua, que es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, en particular de partenolida. La eliminacion de estos compuestos no deseables del jugo celular se puede lograr mediante diferentes tratamientos, que incluyen, pero no se limitan a, ajuste de pH, tratamiento termico, radiacion de microondas, centrifugacion, microfiltracion, ultrafiltracion y combinaciones de los mismos.
En una realizacion, el jugo celular de matricaria fresca se separa en un precipitado de pasta verde oscura que consiste de cloroplastos y un sobrenadante lfquido marron, que es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida.
En otra realizacion, se puede lograr la separacion anterior por medio de centrifugacion a media velocidad o alta velocidad (> 15.000 g). Como resultado, todos los cloroplastos y sus fragmentos se pueden concentrar en un precipitado (en adelante Precipitado I), y el sobrenadante aislado (en adelante Sobrenadante I) permanece completamente libre de clorofila. Como resultado, casi todo el agrupamiento de partenolida de esta dispersion coloide se concentra en el Precipitado I y de esta manera el Sobrenadante I tiene < 20 veces menor contenido de partenolida (por ejemplo, 0.03%) en comparacion con el jugo celular inicial, es decir, el Sobrenadante I anterior de la presente invencion se debe categorizar como sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida. (El sobrenadante de la presente invencion tiene contenido de partenolida residual significativamente reducido en comparacion con el nivel de la realizacion preferida en el extracto de matricaria como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,224,875 y 6,479,080, que se incorporan en la presente mediante referencia en su totalidad).
Las centrifugaciones de media y alta velocidad tienen ciertas limitaciones tecnicas y/o economicas especialmente a una gran escala industrial. En una realizacion, el jugo celular de matricaria fresca se trata para reducir la estabilidad de cloroplastos y sus fragmentos, y luego el jugo celular desestabilizado se separa efectivamente utilizando centrifugacion a baja velocidad (< 3.000 g). El criterio de separacion efectiva es la ausencia de maxima clorofila caractenstica en el espectro del Sobrenadante I.
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La presente invencion incluye diversos tratamientos para reducir la estabilidad de fase del jugo celular de matricaria que inicia la coagulacion de cloroplastos y sus fragmentos. En una realizacion, se puede reducir la estabilidad del jugo celular utilizando tratamiento de congelacion descongelacion (> 1 ciclo), tratamiento de calor (> 40°C), ajuste de pH (pH = 3.0...4.0), y/o combinaciones de los mismos. Los tratamientos anteriores de jugo celular de matricaria con centrifugacion a baja velocidad posterior permiten obtener sobrenadante de jugo celular I que contiene 6.5-7.3% de materia seca y solo 0.01-0.035% de partenolida. La separacion de cloroplastos y sus fragmentos permiten la produccion del Sobrenadante I, que es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida.
En una realizacion, se puede aumentar el contenido de materia seca en el Sobrenadante I sin cambios significativos en su contenido de partenolida. De esta manera, antes de la separacion, el jugo celular se trata con agitacion intensa (por ejemplo, utilizando rotostato) u homogenizacion (por ejemplo, utilizando homogenizador de politron) o con tratamiento ultrasonico o con radiacion de microondas, y/o combinaciones de los mismos para permitir que parte de los componentes de cloroplastos no tengan union y/o afinidad fuerte de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, para moverse en fase continua (soluble) de dispersion. El proceso anterior permite aumento adicional del contenido de materia seca en el Sobrenadante I sin elevacion del contenido de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida. Como resultado, los cloroplastos separados y sus fragmentos pueden capturar en el Precipitado I solo 15-20% del jugo celular de materia seca total y de esta manera 80-85% de la materia seca total permanece en el sobrenadante de jugo celular I enriquecido.
En una realizacion, el Precipitado I enriquecido con Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, se almacena a temperatura < -20°C. En otra realizacion, el Precipitado I se seca (por ejemplo, utilizando liofilizador o secador de pulverizacion o secador de lecho fluido). En otra realizacion, se conserva el Precipitado I (por ejemplo, con 0.75% de Lactona Glucono Delta y 0.25% de Eritrobato de Sodio o con 1.0% de Phenonip) y luego se almacena en condiciones refrigeradas.
La partenolida que contiene el Precipitado I se utiliza para aplicaciones convencionales de derivados de matricaria que se utilizan comunmente en la tecnica.
Aunque el Sobrenadante I es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, la presente invencion permite eliminacion cuantitativa de los componentes no deseados del sobrenadante sin reducir sus bioactividades deseables.
En una realizacion, la eliminacion cuantitativa de las Y-lactonas a-insaturadas residuales, particularmente de partenolida, se logra al utilizar diferentes tratamientos adicionales del Sobrenadante I. Estos tratamientos incluyen, pero no se limitan por, los siguiente: (i) aumento en el pH del Sobrenadante I (6.0 < pH < 10.0), que inicia precipitacion isoelectrica de los componentes que tienen afinidad a Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida; (ii) separacion de componentes precipitados utilizando centrifugacion y/o filtracion para permitir concentracion de los componentes anteriores en el Precipitado II; (iii) ajuste de pH del Sobrenadante II obtenido al valor de pH inicial del jugo celular; y (iv) clarificacion adicional del Sobrenadante II utilizando centrifugacion y/o filtracion o micro-filtracion (< 0.22 pm de tamano de poro) o ultrafiltracion (corte de peso molecular > 10.000 Dalton) para permitir la obtencion de Sobrenadante Final. Lo anterior resulta en el aislamiento del Sobrenadante Final, que esta completamente libre de Y-lactonas a-insaturadas, particularmente de partenolida, pero contiene todas las bioactividades deseables.
En una realizacion, el Precipitado II resultante se seca (por ejemplo, utilizando liofilizador o secador de pulverizacion o secador de lecho fluido). En otra realizacion, el Precipitado II se almacena en condiciones de congelacion.
En una realizacion, la estabilizacion del Sobrenadante Final se completo al agregar conservantes como se ha descrito previamente en la Publicacion de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2003/0175235, que se incorpora aqrn mediante referencia en su totalidad, e incubar la mezcla hasta que se logra la solubilizacion completa. Los conservantes utilizados fueron los siguientes: Sorbato de potasio al 0.1%, benzoato de sodio al 0.1%, metil parabeno de sodio al 0.1%, metabisulfito de sodio al 0.1%, y 0.1% de acido cttrico al 75%. El Sobrenadante Final conservado se almacena en condiciones ambientales.
En una realizacion, el Sobrenadante Final se concentra utilizando evaporacion o dialisis o electrodialisis u osmosis inversa o combinacion de los mismos. La evaporacion se selecciono como tecnica preferible debido a que permite la integridad de los ingredientes bioactivos que se van a conservar sin eliminacion indeseable de cualquiera de los componentes distintos del agua.
En otra realizacion, el Sobrenadante Final Concentrado, que es una suspension de color marron oscuro opalescente inestable capaz de formar espontaneamente precipitado de color beige claro, se mezcla con el estabilizador, que incluye, pero no se limitan por, > 5.0% de glicerina o pentilenglicol (1,2-pentanodiol o 1,2-Dihidroxipentano).
La presente invencion se refiere adicionalmente a los ingredientes bioactivos aislados, que son sustancialmente libres o completamente libres de Y-lactonas a-insaturadas, en particular de partenolida, y tienen bioactividades deseables:
Precipitado II (Ingrediente Bioactivo A), Sobrenadante Final (Ingrediente Bioactivo B), y Sobrenadante Final Concentrado (Ingrediente Bioactivo C).
Los ingredientes bioactivos aislados se pueden combinar con un agente estabilizador. Los agentes estabilizadores adecuados en particular pueden incluir, sin limitacion, un conservante, un antioxidante, y/o mezclas de los mismos.
5 Los ingredientes bioactivos aislados se pueden concentrar y luego estabilizar para posterior utilizacion en el cuidado de la piel para aplicaciones orales y topicas.
Los ingredientes bioactivos adicionalmente pueden incluirse en sistemas de suministro que se utilizan comunmente en la tecnica.
Todos los ingredientes bioactivos se pueden utilizar como soluciones, suspensiones, dispersiones, pastas o polvos 10 secos incorporados en productos de cuidado de la piel, incluyendo aplicaciones topicas y orales.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos estan destinados a ilustrar las realizaciones particulares de la presente invencion, pero de ninguna manera son destinados a limitar el alcance de la presente invencion.
Ejemplo 1 - Preparacion de ingredientes bioactivos derivados de matricaria fresca
15 A continuacion se presenta una descripcion de los aspectos pertinentes de una realizacion del metodo de la presente invencion.
Se cosecho una cantidad suficiente de partes aereas de matricaria fresca (Tanacetum parthenium) en la etapa de de crecimiento de floracion completa para producir aproximadamente 100 kg de materia seca. El nivel de materia seca en la matricaria fresca que se midio fue 23.77%, lo que requiere cosechar aproximadamente 420.7 kg de fitomasa de planta 20 fresca para producir 100 kg de materia seca. El cromatograma de HPLC de la matricaria utilizado se presenta en la Figura 2.
Se tuvo cuidado de conservar el contenido de humedad inherente de la matricaria fresca y para evitar el marchitamiento debido a la perdida de humedad. La cosecha se realizo de tal manera que se evito o minimizo el picado, maceracion, y trituracion de la matricaria fresca recogida. Todas las etapas se completaron en el menor tiempo posible. Esto se hizo 25 para minimizar la exposicion de la matricaria fresca al sol, alta temperatura y otros factores ambientales negativos.
Luego, se realizo la etapa de lavado para eliminar las partfculas de tierra y otros residuos de las plantas antes del procesamiento adicional. Este se logro mediante el lavado de la matricaria cosechada durante < 5 minutos en agua a presion < 1 kg/cm2. El lavado con agua residual no contiene cualesquier pigmentos verdes o marrones, lo que indica la presion del agua adecuada y la duracion del lavado. El exceso de agua se elimina de la fitomasa lavada.
30 La matricaria lavada se sometio a trituracion, maceracion, y prensado para obtener el contenido intracelular (es decir, el jugo celular) y para separarlo del material enriquecido con fibra. Un molino de martillos (Modelo VS 35, Vincent Corporation, Tampa, FL) que tiene motor de 5 HP y un grupo de tamices se utiliza para moler la biomasa para producir partfculas de tejido de matricaria de adecuadamente pequeno tamano en una cantidad mas corta de tiempo y sin aumento significativo de la temperatura de biomasa. El molino de martillos se establecio para producir el tamano 35 maximo de partfculas de plantas maceradas de < 2.0 centimetres durante < 10 segundos de tratamiento. La temperatura de la biomasa solo se incremento < 5°C.
Una prensa de tornillo continuo horizontal (Prensa Compacta CP-6, Vincent Corporation, Tampa, FL), equipada con cono soportado por aire comprimido, se utilizo inmediatamente para obtener jugo celular de matricaria macerada. La presion en el cono se mantuvo a un nivel de > 20 kg/cm2, con una velocidad de tornillo de 12 rpm y solo un aumento de 40 temperatura de < 5°C.
Este tratamiento produjo material enriquecido con fibra y el jugo celular. Las partreulas residuales pequenas de fibra se retiraron adicionalmente de jugo celular utilizando para su aclaracion semiautomatica centnfuga de flujo continuo (Modelo 12-413V, AML Industries, Inc., Hatboro, PA) a < 3000 rpm y tiempo de retencion > 30 segundos. El precipitado se recolecto y se combino con material enriquecido con fibra obtenido despues del prensado de la matricaria.
45 Los procesos descritos anteriormente permiten la produccion de 217.2 kg de jugo celular matricaria tiene nivel de materia seca 8.20% y 203.5 kg de material enriquecido con fibra que tiene el nivel de materia seca 40.39%. El cromatograma de HPLC de material enriquecido con fibra se presenta en la Figura 3.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
El jugo celular luego se sometio a diversos tratamientos, que incluyen ajuste de pH, radiacion de microondas y separacion. El pH de jugo celular de matricaria fresca (pH inicial = 5.3) se ajusto utilizando un metodo de titulacion utilizando 3.6 litros de Acido Clorlmdrico 5.0 N (HCl) para reducir el pH del jugo celular a 3.5. Luego el jugo celular ajustado se expuso inmediatamente a radiacion de microondas utilizando el sistema de flujo continuo especialmente disenado que tiene 2.45 GHz de frecuencia y 3.200 vatios de potencia de salida (Microwave Research & Applications, Inc., Laurel, MD). Este sistema se equipo con agitador de velocidad constante BDC 1850 (Caframo Ltd., Wiarton, Ontario, Canada) y una sonda de control de temperatura. Este tratamiento continuo hasta que la temperatura del jugo celular en la camara de microondas alcanzo 92°C y luego el jugo celular tratado se bombeo inmediatamente a traves de un dispositivo de flujo continuo que se conecto con un enfriador 1 de recirculacion de HP (Modelo 6106 P, Polyscience Corporation, Niles, IL).
Despues de que se redujo la temperatura del jugo celular tratado a < 30°C, el material se separo utilizando una centnfuga de flujo continuo CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemania) a 15.000 rpm y tiempo de retencion > 30 seg. La separacion de 220.8 kg de jugo celular tratado produjo 19.2 kg de precipitado de pasta de color verde oscuro (en adelante Precipitado I) que tiene un contenido de materia seca de 26.2% y 201.6 kg del sobrenadante lfquido ligeramente opalescente de color marron (en adelante el Sobrenadante I) que tiene contenido de materia seca de 6.34%.
El cromatograma de HPLC del Precipitado I se presenta en la Figura 4. Es de destacar que el perfil de HPLC mostrado en la Figura 4 para Precipitado I es significativamente diferente del perfil de HPLC del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6.479,080 (vease Figura 1). Por lo tanto, la composicion del precipitado I y del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 son significativamente diferentes.
El sobrenadante I luego se sometio a un tratamiento adicional, que incluye ajustes de pH y separaciones. El primer ajuste de pH se indujo utilizando un metodo de titulacion que utiliza 1.07 litros de hidroxido de potasio (KOH) al 50% para aumentar el pH del Sobrenadante I del jugo celular desde 3.5 hasta 9.0. Este tratamiento resulto en opalescencia desarrollada y color mas oscuro del material que se clarifico inmediatamente utilizando centnfuga de flujo continuo CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemania) a 15.000 rpm y tiempo de retencion > 30 seg. La separacion anterior produjo 0.55 kg de precipitado de pasta de color beige oscuro (en adelante Precipitado II) que tiene un contenido de materia seca de 38.2% y 202.12 kg de sobrenadante ligeramente opalescente de color marron (en adelante Sobrenadante II) que tiene un contenido de materia seca de 6.22%.
El cromatograma de HPLC del Precipitado II se presenta en la Figura 5. Es de destacar que el perfil de HPLC mostrado en la Figura 5 para el Precipitado II es significativamente diferente del perfil de HPLC del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 (vease Figura 1). Por lo tanto, la composicion del precipitado II y del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 son significativamente diferentes.
El Precipitado II contema 0.01% de partenolida segun se determina mediante analisis de HPLC representa el Ingrediente Bioactivo A, que es sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, en particular de partenolida.
El Sobrenadante II se sometio a titulacion isoelectrica utilizando Acido Clorlmdrico (HCl) 5.0 N para devolver el valor de pH a pH = 3.5 que existfa en el sobrenadante I. Dicho tratamiento inicial lleva a una ligera mayor opalescencia del material, pero se clarifico efectivamente utilizando centnfuga de flujo continuo CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Alemania) a 15.000 rpm y tiempo de retencion > 60 seg. El material clarificado (en adelante sobrenadante final) contema <0.00007% de partenolida segun se determina por analisis de HPLC y, por lo tanto, de acuerdo con los lfmites de deteccion, el Sobrenadante Final anterior se debe considerar libre de partenolida, y en particular completamente libre de partenolida.
La estabilizacion del Sobrenadante Final se logro al agregar conservantes y antioxidantes e incubar la mezcla hasta que se consiguio completa solubilizacion. Los conservantes y antioxidantes utilizados incluyen los siguientes: sorbato de potasio al 0.1%, benzoato de sodio al 0.1%, metilparabeno de sodio al 0.1%, y metabisulfito de sodio al 0.2%. Esta preparacion resulto en la produccion de 201.6 kg de Ingrediente Bioactivo B que contiene 6.8% de materia seca. El rendimiento de Ingrediente Bioactivo B de 100 kg de Materia Seca de la biomasa de matricaria inicial es de aproximadamente 12.5 kg de Materia Seca.
El cromatograma de HPLC de Ingrediente Bioactivo B se presenta en la Figura 6. Es de destacar que el perfil de HPLC mostrado en la Figura 6 para el Ingrediente Bioactivo B es significativamente diferente del perfil de HPLC del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 (vease Figura 1). Por lo tanto, la composicion de Ingrediente Bioactivo B y del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 son significativamente diferentes.
El Ingrediente Bioactivo B tambien se concentro utilizando el sistema de evaporacion de vacfo Vap rapido (Labconco, Kanzas City, MO) equipado con ocho tubos de 0.6 litros, trampa de lfquido de 2.550 litros y bomba de vacfo de diafragma (modelo 2018B-01, Welch Rietsche Thomas, Skokie, IL). Utilizando presion de trabajo = 100 mbar,
temperatura = 60°C y velocidad de vortice = 40%, el Ingrediente Bioactivo B se concentro en ciclos de 90 minutos para producir 63.16 litros totales (o 70.11 kg) de material concentrado que tiene un contenido de materia seca de 19.89%. Luego 5.0% (w/w) de pentilenglicol se agrego al material concentrado y despues de mezclado moderado durante > 60 segundos se produjo el lfquido transparente de color marron oscuro resultante: Ingrediente Bioactivo C. El Ingrediente 5 Bioactivo C contema <0.00007% de partenolida segun se determina por analisis de HPLC y, por lo tanto, de acuerdo con los lfmites de deteccion, el Ingrediente Bioactivo C anterior se debe considerar libre de partenolida, y en particular totalmente libre de partenolida.
El cromatograma de HPLC del Ingrediente Bioactivo C se presenta en la Figura 7. Es de destacar que el perfil de HPLC mostrado en la Figura 7 para el Ingrediente Bioactivo C es significativamente diferente del perfil de HPLC del extracto de 10 matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 (vease Figura 1). Por lo tanto, la composicion de Ingrediente Bioactivo C y del extracto de matricaria descrito en la Patente Estadounidense No. 6,479,080 son significativamente diferentes.
Ejemplo 2 - Caractensticas y propiedades del Ingrediente Bioactivo B
El Ingrediente Bioactivo B se preparo de acuerdo con el proceso descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Se realizaron 15 analisis de Ingrediente Bioactivo B para determinar sus diversas caractensticas fisicoqmmicas, qmmicas, y microbianas.
Las caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas seleccionadas del Ingrediente Bioactivo B se presentan a continuacion en la Tabla 1.
Tabla 1 - Caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas seleccionadas del Ingrediente Bioactivo B
- Parametro
- Resultados
- Apariencia
- Lfquido amarillo-marron
- Olor
- Caractenstico
- Color (Escala Gardner)
- 11.5
- Materia seca, %
- 6.6
- Gravedad espedfica, g/cm3
- 1.030
- indice refractivo, nD
- 1.3112
- pH
- 4.1
- UV maxima, nm
- 269
- Partenolida, %
- < 0.00007
20 El Ingrediente Bioactivo B es facilmente soluble en agua en cualquier proporcion.
La Tabla 2 a continuacion describe las caractensticas microbianas del Ingrediente Bioactivo B. Estos datos demuestran que el Ingrediente Bioactivo B satisface los requisitos de la industria para el cuidado de la piel con respecto al conteo de placa total, el conteo de moho y levadura, y la ausencia de patogenos.
Tabla 2 - Caractensticas microbianas del Ingrediente Bioactivo B
- Parametro
- Resultados
- Conteo de placa total, CFU*/g
- < 100
- Moho y levadura, CFU*/g
- < 10
- Escherichia coli
- Negativo
- Salmonella sp.
- Negativo
- Staphylococcus aureus
- Negativo
- Pseudomonas sp.
- Negativo
- *Unidades formadoras de colonia
Los resultados de la prueba de efectividad antimicrobiana presentados en la Tabla 3 a continuacion indican, que el Ingrediente Bioactivo B tiene un sistema efectivo de conservantes.
Tabla 3 - Resultados de la prueba de efectividad antimicrobiana del Ingrediente Bioactivo B
- Microorganismo
- Unidades formadoras de colonia, CFU/g
- Conteo inicial
- Dfa 7 Dfa 14 Dfa 21 Dfa 28
- Staphylococcus aureus
- 1.13 x 109 < 10 < 10 < 10 < 10
- Escherichia coli
- 4.16 x 108 < 10 < 10 < 10 < 10
- Pseudomonas aeruginosa
- 8.0 x 108 < 10 < 10 < 10 < 10
- Candida albicans
- 5.28 x 107 < 10 < 10 < 10 < 10
- Aspergillus niger
- 5.5 x 107 < 10 < 10 < 10 < 10
- Burkholderia cepacia
- 7.56 x 108 < 10 < 10 < 10 < 10
5
La Tabla 4 incluye los datos relacionados con las actividades antiinflamatorias y antioxidantes del Ingrediente Bioactivo B. La actividad antiinflamatoria se determino utilizando ensayo de elastasa de neutrofilos humana y la actividad antioxidante se determino utilizando el ensayo de reduccion de citocromo c.
Tabla 4 - Actividades antiinflamatorias y antioxidantes del Ingrediente Bioactivo B
- Parametro
- Resultados
- Actividad antiinflamatoria (IC50), Ml
- 48.3
- Actividad antioxidante (IC50), Ml
- 7.5
10
Se determino que el Ingrediente Bioactivo B era estable (es decir, que mantiene la integridad ffsica y qmmica) durante por lo menos 12 meses, mientras que se almacena a una temperatura de entre 15 y 25°C en un recipiente cerrado protegido de la luz.
Ejemplo 3 - Caractensticas y propiedades del Ingrediente Bioactivo C
15 El Ingrediente Bioactivo C se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 anterior. Se realizaron analisis del Ingrediente Bioactivo C para determinar sus diversas caractensticas de bioactividad fisicoqmmicas, qmmicas y microbianas.
Las caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas seleccionadas del Ingrediente Bioactivo C se presentan a continuacion en la Tabla 5.
Tabla 5. Caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas seleccionadas del Ingrediente Bioactivo C
- Parametro
- Resultados
- Apariencia
- Lfquido rojo marron
- Olor
- Caractenstico
- Color (Escala Gardner)
- 18.5
- Materia seca, %
- 19.82
- Gravedad espedfica, g/cm3
- 1.117
- fndice refractivo, nD
- 1.3770
- pH
- 4.1
- UV maxima, nm
- 255
- Partenolida, %
- < 0.00007
5 El Ingrediente Bioactivo C es facilmente soluble en agua en cualquier proporcion.
La Tabla 6 a continuacion describe las caractensticas microbianas del Ingrediente Bioactivo C. Estos datos demuestran que el Ingrediente Bioactivo C satisface los requisitos de la industria del cuidado de la piel con respecto a conteo final, conteo de moho y levadura, y la ausencia de patogenos.
Tabla 6 - Caractensticas microbianas del Ingrediente Bioactivo C
- Parametro
- Resultados
- Conteo de placa Total, CFU*/g
- < 100
- Moho y levadura, CFU*/g
- < 10
- Escherichia coli
- Negativo
- Salmonella sp.
- Negativo
- Staphylococcus aureus
- Negativo
- Pseudomonas sp.
- Negativo
- *Unidades formadoras de colonia.
La Tabla 7 se refiere a las actividades antiinflamatorias y antioxidantes del Ingrediente Bioactivo C. La actividad antiinflamatoria se determino utilizando el ensayo de elastasa de neutrofilos humana y la actividad antioxidante se determino utilizando el ensayo de reduccion de citocromo c.
Tabla 7 -Actividades biologicas del Ingrediente Bioactivo C
- Parametro
- Resultados
- Actividad antiinflamatoria (IC50), Ml
- 15.2
- Actividad antioxidante (IC50), Ml
- 3.1
Se determino que el Ingrediente Bioactivo C era estable (es decir, que mantiene la integridad ffsica y qmmica) durante por lo menos 12 meses, mientras que se almacena a una temperature de entre 15 y 25°C en un recipiente cerrado protegido de la luz.
5 Ejemplo 4 - Caractensticas y propiedades del Ingrediente Bioactivo A
El Ingrediente Bioactivo A se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Se realizaron analisis de Ingrediente Bioactivo A para determinar sus diversas caractensticas de bioactividad fisicoqmmicas, qmmicas, y microbianas.
Las caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas del Ingrediente Bioactivo A seleccionado se presentan a continuacion en la 10 Tabla 8.
Tabla 8 - Caractensticas fisicoqmmicas y qmmicas del Ingrediente Bioactivo A
- Parametro
- Resultados
- Apariencia
- Pasta beige oscuro
- Olor
- Caractenstico pesado
- Color (Valor L*)
- 27.83
- Color (valor a*)
- 0.57
- Color (valor b*)
- 8.24
- Materia seca, %
- 38.2
- Gravedad espedfica, g/cm3
- 1.087
- pH
- 9.0
- Partenolida, %
- 0.01
La Tabla 9 a continuacion se describe las caractensticas microbianas de Ingrediente Bioactivo A. Estos datos demuestran que EL Ingrediente Bioactivo A satisface los requerimientos de la industria del cuidado de la piel con 15 respecto al conteo en placa total, conteo de moho y levadura, y ausencia de patogenos.
Tabla 9 - Caractensticas microbianas del Ingrediente Bioactivo A
- Parametro
- Resultados
- Conteo de placa total, CFU*/g
- < 100
- Moho y levadura, CFU*/g
- < 10
5
10
15
20
25
30
- Escherichia coli
- Negativo
- Salmonella sp.
- Negativo
- Staphylococcus aureus
- Negativo
- Pseudomonas sp.
- Negativo
- *Unidades formadoras de colonia
La Tabla 10 se refiere a las actividades antiinflamatorias y antioxidantes del Ingrediente Bioactivo A. La actividad antiinflamatoria se determino utilizando el ensayo de elastasa de neutrofilos humana y la actividad antioxidante se determino utilizando el ensayo de reduccion de citocromo c.
Tabla 10 -Actividades biologicas del Ingrediente Bioactivo A
- Parametro
- Resultados
- Actividad antiinflamatoria (IC50), Ml
- 11.2
- Actividad antioxidante (IC50), Ml
- 2.2
Se determino que el Ingrediente Bioactivo A es estable (es decir, que mantiene la integridad ffsica y qmmica) durante por lo menos l2 meses, mientras que se almacena en el congelador en un recipiente cerrado protegido de la luz.
Ejemplo 5 - Comparacion de Ingredientes Bioactivos obtenidos de la matricaria recolectada en diferentes cosechas y en diferentes estaciones
Se analizo la reproducibilidad de los Ingredientes Bioactivos utilizando matricaria fresca que se recolecto en dos estaciones consecutivas de los mismos campos. Adicionalmente la matricaria fresca se cosecho dos veces por estacion en la misma etapa de crecimiento. Todas las muestras de biomasa de matricaria fresca a anteriores se procesaron utilizando el metodo descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Los datos relacionados con la comparacion del rendimiento, caractensticas y propiedades seleccionadas de los Ingredientes Bioactivos B y C se presentan a continuacion. (Los datos relacionados con el Ingrediente Bioactivo A no se incluyen en el ejemplo, porque este ingrediente resulto en rendimiento muy pequeno).
Se encontro, que a partir de la cantidad de matricaria para producir 100 kg de materia seca de aproximadamente se produjeron 12.4 ± 2.1 kg de materia seca de los Ingredientes Bioactivos. Se podna obtener la materia seca promedio en la biomasa de matricaria fresca ~20% y por lo tanto ~190 kg de Ingrediente Bioactivo B o ~62 kg de Ingrediente Bioactivo C.
No se encontro diferencia significativa entre el rendimiento de los Ingredientes Bioactivos obtenidos de la primera y segunda cosecha (valor de p = 0.8893) y entre los Ingredientes Bioactivos obtenidos en dos estaciones consecutivas (valor de p = 0.6531). Adicionalmente no se encontro ninguna diferencia significativa entre el contenido de materia seca en los Ingredientes Bioactivos (valor de p = 0.5334) y el contenido de partenolida en los ingredientes anteriores (valor de p = 0.9923).
Las caractensticas ffsicoqmmicas y qmmicas seleccionadas de los Ingredientes Bioactivos, que se obtuvieron de la matricaria fresca recolectada de diferentes cosechas y en diferentes estaciones, se presentan a continuacion en la Tabla 11 lo que sugiere una alta reproducibilidad del Ingrediente Bioactivo B e Ingrediente Bioactivo C.
Tabla 11 - Reproducibilidad de los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de matricaria recolectada en diferentes cosechas y en diferentes estaciones
- Parametro
- Ingrediente Bioactivo B Media ± desviacion estandar Ingrediente Bioactivo C Media ± desviacion estandar
- Apariencia
- Lfquido amarillo-marron Lfquido rojo marron
- Olor
- Caractenstico Caractenstico
- Color (Escala Gardner)
- 10 ±2 > 18
- Materia seca, %
- 6.6 ± 1.8 19.8 ± 2.3
- Gravedad espedfica, g/cm3
- 1.035 ± 0.01 1.117 ± 0.02
- indice refractivo, nD
- 1.3112 ± 0.004 1.3704 ± 0.01
- pH
- 3.85 ± 0.4 3.95 ± 0.3
- UV maxima, nm
- 259 ± 3 256 ± 4
- Partenolida, %
- < 0.00007 < 0.00007
Cabe senalar, que el contenido de partenolida en los Ingredientes Bioactivos estaba por debajo del Umite de deteccion del procedimiento analftico de HPLC utilizado.
La Tabla 12 a continuacion describe las caractensticas microbianas de los Ingredientes Bioactivos. Estos datos 5 demuestran que los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de la matricaria recolectada de diferentes cosechas y en diferentes estaciones satisfacen los requisitos para el cuidado de la piel de la industria con respecto a la concentracion de germenes totales, conteo de mohos y levaduras, y ausencia de agentes patogenos.
Tabla 12 - Caractensticas microbianas de los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de la matricaria recolectada de diferentes cosechas y en diferentes estaciones
- Parametro
- Ingrediente Bioactivo B Ingrediente Bioactivo C
- Conteo de placa total, CFU*/g
- < 100 < 100
- Moho y levadura, CFU*/g
- < 10 < 10
- Escherichia coli
- Negativo Negativo
- Salmonella sp.
- Negativo Negativo
- Staphylococcus aureus
- Negativo Negativo
- Pseudomonas sp.
- Negativo Negativo
- *Unidades formadoras de colonia.
10
La Tabla 13 se refiere a las actividades antiinflamatorias y antioxidantes de los Ingredientes Bioactivos. La actividad antiinflamatoria se determino utilizando el ensayo de elastasa de neutrofilos humana y la actividad antioxidante se determino utilizando el ensayo de reduccion de citocromo c. No se encontro diferencia significativa entre las actividades anteriores de los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de la matricaria fresca recolectada de diferentes cosechas y 15 en diferentes estaciones lo que sugiere una alta reproducibilidad del Ingrediente Bioactivo B y el Ingrediente Bioactivo C.
Tabla 13 -Reproducibilidad de las Actividades biologicas de los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de la matricaria recolectada de diferentes cosechas y en diferentes estaciones
- Parametro
- Ingrediente Bioactivo B Media ± desviacion estandar Ingrediente Bioactivo C Media ± desviacion estandar
- Actividad antiinflamatoria (IC50), pl
- 48 ±6 14 ± 3
- Actividad antioxidante (IC50), pl
- 7.5 ± 2.4 3.1 ± 0.5
Los Ingredientes Bioactivos obtenidos a partir de la matricaria recolectada de diferentes cosechas y en diferentes temporadas se determinant que son estables (es decir, que mantienen la integridad ffsica y qmmica) durante por lo menos 12 meses, mientras que se almacena en el congelador en un recipiente cerrado protegido de la luz.
5 Ejemplo 6 - Protocolos utilizados para determinar ciertas caractensticas de los Ingredientes Bioactivos
Lo siguiente son diversos metodos utilizados para la determinacion de ciertas caractensticas de los Ingredientes Bioactivos. Se hace referencia a estos metodos a traves de los Ejemplos anteriores. Las referencias a continuacion para los “productos probados” o las “muestras de ensayo” se refieren a Ingredientes Bioactivos.
Metodo para determinacion de materia seca:
10 El procedimiento para determinacion de materia seca incluye la evaporacion del producto probado en el bano de agua a 100°C hasta la evaporacion completa del agua, almacenamiento en horno de la muestra a 105°C durante 3 horas, enfriamiento a temperatura ambiente, y determinacion inmediata del peso del recipiente con la materia solida.
Metodo para la determinacion de Valores L* a* b*:
El procedimiento para la determinacion de valores L* a* b* utiliza el colonmetro de geometna fija Hunter Labscan con 15 medicion de la geometna de 0°/45°. Se utilizo el iluminante estandar D65 con la ventana de vision hacia arriba. El recipiente con el ingrediente bioactivo probado se coloco en la ventana de visualizacion y se midio a traves de la parte inferior. Se utilizaron las siguientes ecuaciones de CIELAB:
C* - (a*' 4 b*2 ) ;
DE* = [(DL)2 + (Da*)' - (Db*)2]!"
DH = [('DE*): - <DL*r - (DC*)2]’1
Metodo para Determinacion de contenido de partenolida:
20 Las muestras fueron se extrajeron con metanol y tratamiento con ultrasonidos de 30 min. La columna de fase inversa C18 se utilizo como la fase estacionaria y se utilizo acetonitrilo al 44%: agua al 56% y acido fosforico al 0.1% como fase movil. La deteccion de partenolida fue a 225 nm y las concentraciones de partenolida se determinaron utilizando una curva de calibracion de multiples puntos desarrollada con seis estandares de partenolida (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) que vana desde 30 pg/g hasta 900 pg/g. El lfmite de deteccion en estas condiciones es de 0.7 pg/ml. 25 Aproximadamente de 30 pg/g de partenolida se puede cuantificar utilizando este grupo de condiciones.
Metodo para determinacion de caractensticas microbiologicas:
Se determinaron las caractensticas microbiologicas de las muestras probadas de acuerdo con el metodo UPS XXVII de la Farmacopea de Estados Unidos (USP), NF 22, <61>, Pruebas de Lfmite Microbiologico, que se incorporan aqrn mediante referencia en su totalidad. Las pruebas anteriores incluyen conteo total aerobio, mohos y levaduras totales 30 (conteo en placa aerobica), determinacion de Salmonella (sp.), E. coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas sp.
Se realizaron estudios de inoculacion de conservantes, utilizando el metodo USP XXVII, NF 22, <51>, Antimicrobial Effective Testing, pp. 2148-2150, que se incorpora aqrn mediante referencia en su totalidad. La incubacion de los artfculos de prueba inoculados se llevo a cabo a 20 a 25°C y se ensayo en los intervalos de tiempo de 7, 14, 21 y 28 dfas.
Metodo para determinacion de actividad inhibidora de elastasa:
Se determino la actividad inhibidora de elastasa de ingredientes bioactivos probados utilizando el ensayo, que emplea elastasa de neutrofilos humana (Elastin Products Company, Inc., Owenswille, MO) y el sustrato soluble de peptido sintetico N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-NA (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO). Este ensayo incluye el 5 procedimiento modificado como se describe en el Elastin Products Company's Catalog, “Determination of human elastase activity,” Research Biochemical Catalog, Elastin Product Company, Inc., Owensville, MO, en la pagina 84 (2004), que se incorpora aqrn mediante referencia en su totalidad. La division enzimatica del sustrato se midio a 410 nm y 25°C utilizando regulador de Tris-HCl 0.1 M de pH 7.5 que contiene NaCl 50 mM. El volumen total del medio de reaccion en la cubeta del espectrofotometro fue de 3.0 mL. Cada ingrediente bioactivo probado se ensayo a 10 concentraciones necesarias para lograr inhibicion del 50% (IC50) de la velocidad de reaccion enzimatica.
Metodo para determinacion de actividad de depuracion de superoxido:
El metodo utilizado se baso en el procedimiento descrito en el artfculo de Quick et al., “Rapid microplate assay formulacion superoxide scavenging efficiency,” J. Neuroscience Methods, 97:139-144 (2000), que se incorpora aqrn mediante referencia en su totalidad.
15 Este ensayo permite prueba rapida y precisa de los ingredientes bioactivos para determinar la actividad antioxidante comparativa de la depuracion de superoxido. El ensayo incluyo hipoxantina, xantina oxidasa y citocromo c. La hipoxantina sirvio como el sustrato y se metabolizo por la xantina oxidasa en un proceso de dos etapas, produciendo dos aniones de superoxido. Estos aniones libres reducen el citocromo c, lo que resulta en el aumento de pico notable a 550 nm. El volumen total del medio de reaccion en la cubeta del espectrofotometro fue de 3.0 mL.
20 Aunque las realizaciones preferidas se han representado y descrito en detalle aqrn, sera evidente para aquellos expertos en la tecnica pertinente que se puede realizar diversas modificaciones, adiciones, sustituciones, y similares sin apartarse del espmtu de la invencion y por lo tanto se considera que estan dentro del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones que siguen.
Claims (5)
- 5101520253035Reivindicaciones1. Un metodo para aislar una fraccion bioactiva que se deriva de jugo celular de biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium) y que esta sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, dicho metodo comprende:proporcionar biomasa fresca de una planta de matricaria (Tanacetum parthenium);procesar la biomasa fresca bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de jugo celular es decir por lo menos sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas y una fraccion de membrana que contiene Y-lactonas a- insaturadas, dicho procesamiento de la biomasa fresca comprende:(i) separar la biomasa fresca en un componente de jugo celular y un material enriquecido con fibra; y(ii) sujetar el componente de jugo celular a un ajuste de pH y etapa de tratamiento de microondas para producir el sobrenadante de jugo celular es decir por lo menos sustancialmente libres de Y-lactonas a-insaturadas;tratar el sobrenadante de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un primer sobrenadante de suero de jugo celular y un precipitado de fraccion de citoplasma; yaislar el precipitado de fraccion de citoplasma, en el que dicho precipitado de fraccion de citoplasma es una fraccion bioactiva que esta sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, en la que dichas Y-lactonas a-insaturadas comprenden partenolida.
- 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la etapa de procesar la biomasa fresca comprende adicionalmente:clarificar el componente de jugo celular para producir un componente de jugo celular clarificado antes de sujetar el componente de jugo celular al ajuste de pH y a la etapa de tratamiento de microondas.
- 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 comprende adicionalmente:clarificar el primer sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir un segundo sobrenadante de suero de jugo celular;mezclar un agente de estabilizacion con el segundo sobrenadante de suero de jugo celular bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular estabilizado,en el que dicha fraccion de suero de jugo celular estabilizado es una fraccion bioactiva que esta sustancialmente libre de Y-lactonas a-insaturadas, dichas Y-lactonas a-insaturadas comprenden partenolida.
- 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3 comprende adicionalmente:concentrar la fraccion de suero de jugo celular estabilizado bajo condiciones efectivas para producir un sobrenadante de suero de jugo celular concentrado.
- 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 comprende adicionalmente:mezclar un agente de estabilizacion con el sobrenadante de suero de jugo celular concentrado bajo condiciones efectivas para producir una fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado,en la que dicha fraccion de suero de jugo celular concentrado estabilizado es una fraccion bioactiva es decir libre de y- lactonas a-insaturadas, dichas Y-lactonas a-insaturadas comprenden partenolida.
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