ES2625941T3 - Secuencias de reconocimiento para meganucleasas derivadas de i-crei y sus usos - Google Patents

Secuencias de reconocimiento para meganucleasas derivadas de i-crei y sus usos Download PDF

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Abstract

Un método ex vivo para escindir un ADN de doble cadena, que comprende: (a) identificar en dicho ADN al menos un sitio de reconocimiento para una meganucleasa derivada de I-Crel racionalmente diseñada con especificidad alterada en relación a I-Crel, en donde dicho sitio de reconocimiento no se escinde mediante una I-Crel de origen natural, en donde dicho sitio de reconocimiento se identifica basándose en la presencia de una secuencia central de cuatro pares de bases seleccionada entre el grupo que consiste en TTGT, TTAT, TTTC, TTCC, TTAG, TTAC y TTGC; (b) proporcionar dicha meganucleasa racionalmente diseñada; y (c) poner en contacto dicho ADN con dicha meganucleasa racionalmente diseñada; por lo cual dicha meganucleasa racionalmente diseñada escinde dicho ADN.

Description

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Tal como se usa en el presente documento, con respecto a una proteína, el término “recombinante” significa que tiene una secuencia de aminoácidos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética a ácidos nucleicos que codifican la proteína, y células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término “recombinante” significa que tiene una secuencia de ácidos nucleicos alterada como
5 resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR y de clonación de ADN; transfección, transformación y otras tecnologías de transferencia de gen; recombinación homóloga; mutagénesis dirigida a sitio; y fusión de gen. De acuerdo con esta definición, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de origen natural, pero producida por clonación y expresión en un hospedador heterólogo, no se considera recombinante.
Tal como se usa en el presente documento, el término “genéticamente modificado” se refiere a una célula u organismo en el cual, o en un predecesor del cual, una secuencia de ADN genómico se ha modificado deliberadamente por tecnología recombinante. Tal como se usa en el presente documento, el término “genéticamente modificado” abarca el término “transgénico”.
15 Tal como se usa en el presente documento, el término “tipo natural” se refiere a cualquier forma de origen natural de una meganucleasa. El término “tipo natural” no pretende significar la variante alélica más común de la enzima en la naturaleza si no, más bien, cualquier variante alélica de origen natural. Las meganucleasas de tipo natural se distinguen de las meganucleasas recombinantes o que no son de origen natural.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio-sitio de la secuencia de reconocimiento” o simplemente “medio-sitio” significa una secuencia de ADN de 9 pares de bases que se reconoce por un monómero de meganucleasa, en el caso de una meganucleasa dimérica, o por un dominio de una meganucleasa de cadena sencilla.
25 Tal como se usa en el presente documento, el término “secuencia de reconocimiento” se refiere a un par de mediositios que se unen y se escinden por una meganucleasa. Una secuencia de reconocimiento comprende un par de medio-sitios de 9 pares de bases invertidos separados por cuatro pares de bases. Por lo tanto, la secuencia de reconocimiento es de 22 pares de bases de longitud. Los pares de bases de cada medio-sitio se denominan -9 a -1, siendo la posición -9 la más distal del sitio de escisión y siendo la posición -1 adyacente a la secuencia central de 4 pares de bases, cuyos pares de bases se denominan +1 a +4. La cadena de cada medio-sitio que se orienta 5’ a 3’ en la dirección desde -9 a -1 (es decir, hacia el sitio de escisión), se denomina la cadena “sentido”, y la cadena opuesta se denomina la “cadena antisentido”, aunque ninguna cadena puede codificar proteína. Por tanto, la cadena “sentido” de un medio-sitio es la cadena antisentido (opuesta) del otro medio-sitio. Véase, por ejemplo, la Figura 1a.
35 Tal como se usa en el presente documento, el término “secuencia central” se refiere a los cuatro pares de bases que separan medio-sitios en la secuencia de reconocimiento de meganucleasa. Estas bases se numeran +1 a +4 en la Figura 1a. La secuencia central comprende las cuatro bases que llegan a ser los salientes de cadena sencilla 3’ después de escisión por meganucleasa. “Secuencia central” puede referirse a la secuencia de la cadena sentido o la cadena antisentido (opuesta).
Tal como se usa en el presente documento, el término “especificidad” se refiere a la capacidad de una meganucleasa de reconocer y escindir moléculas de ADN de doble cadena solamente en un subconjunto particular de todas las posibles secuencias de reconocimiento. El conjunto de secuencias de reconocimiento compartirá ciertas
45 posiciones o motivos de secuencia conservados, pero pueden degenerarse en una o más posiciones. Una meganucleasa más específica es capaz de unir y escindir un subconjunto más pequeño de las posibles secuencias de reconocimiento, mientras que una meganucleasa menos específica es capaz de unir y escindir un subconjunto mayor de las posibles secuencias de reconocimiento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “palindrómico” se refiere a una secuencia de reconocimiento que consiste en repeticiones invertidas de medio-sitios idénticos. Sin embargo, en este caso, la secuencia palindrómica no necesita ser palindrómica con respecto a la secuencia central, que no está contactada por la enzima. En el caso de meganucleasas diméricas, las secuencias de ADN palindrómicas se reconocen por homodímeros en los cuales los dos monómeros hacen contactos con medio-sitios idénticos.
55 Tal como se usa en el presente documento, el término “pseudopalindrómico” se refiere a una secuencia de reconocimiento que consiste en repeticiones invertidas de medio-sitios no idénticos o imperfectamente palindrómicos. En este caso, la secuencia pseudopalindrómica no necesita ser palindrómica con respecto a la secuencia central, y también puede desviarse de una secuencia perfectamente palindrómica entre los dos mediositios. Las secuencias de ADN pseudopalindrómicas son típicas de los sitios de ADN naturales reconocidos por meganucleasas homodiméricas de tipo natural en las cuales dos monómeros enzimáticos idénticos hacen contactos con diferentes medio-sitios.
Tal como se usa en el presente documento, el término “no palindrómico” se refiere a una secuencia de
65 reconocimiento compuesta de dos medio-sitios no relacionados de una meganucleasa. En este caso, la secuencia no palindrómica no necesita ser palindrómica ni respecto a la secuencia central ni a los dos medio-sitios de
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9
A G A T +
10
A G C T -
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A G G T +
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A G T T -
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A T A T ++
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A T C T +
15
A T G T ++
16
A T T T +
Coherente con el modelo realizado por ordenador, se encontró que los cuatro sustratos plásmidos con una base de purina en N+2 y una base de pirimidina en N+3 (números de secuencia 2, 4, 10 y 12) no se cortaron eficazmente por DJ1.
5 A continuación, se realizó una evaluación más completa de la preferencia de secuencia central. Hay 44 o 256 posibles secuencias centrales. De estas, 25 %, o 64, tienen una base de purina en N+2 y pirimidina en N+3 y, por lo tanto, se eliminaron como secuencias centrales basándose en el experimento anteriormente descrito. De las restantes 192, 92 son redundantes debido a que las meganucleasas son simétricas y reconocen bases igualmente
10 sobre tanto la cadena sentido como antisentido. Por ejemplo, la secuencia A+1A+2A+3A+4 en la cadena sentido es reconocida por la meganucleasa como T+1T+2T+3T+4 en la cadena antisentido y, por tanto, A+1A+2A+3A+4 y T+1T+2T+3T+4 son funcionalmente equivalentes. Teniendo en cuenta estas redundancias, así como los conflictos N+2/N+3 anteriormente mencionados, quedaban 100 posibles secuencias centrales. Para determinar cuáles de estas eran preferidas por las meganucleasas, los inventores produjeron 100 sustratos plásmidos que portaban estas 100
15 secuencias centrales flanqueadas por medio-sitios de reconocimiento invertidos para la meganucleasa DJ1. A continuación, DJ1 se incubó con cada uno de los 100 plásmidos y se evaluó la actividad de escisión como se describió anteriormente. Estos resultados se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Secuencias centrales escindibles
Nº Sec
N+1 N+2 N+3 N+4 Actividad
1
T T T T +
2
T T G T ++
3
T T C T +
4
T T A T ++
5
T G G T +
6
T G A T +
7
T C T T ++
8
T C G T ++
9
T C C T +
10
T C A T ++
11
T A G T +
12
T A A T +
13
G T T T ++
14
G T G T +++
15
G T C T ++
16
G T A T +++
17
G G G T +
18
G G A T ++
19
G A G T ++
20
G A A T ++
21
C T T T +
22
C T G T +
23
C T C T +
24
C T A T +
25
C G G T +
26
C G A T +
27
C C T T +
28
C C G T +
29
C C C T +
30
C C A T +
31
C A G T +
32
C A A T +
33
A T T T +
34
A T G T ++
35
A T C T +
36
A G G T +
37
A C T T +
38
T T T G +
39
T T G G +
40
T T C G +
41
T T A G +++
42
T G G G +
43
T G A G +
44
T C T G +
45
T C G G +
46
T C C G +
47
T C A G +
48
T A G G +
49
T A A G +
50
G T T G +
51
G T G G +
52
G T C G +
53
G T A G +++
54
G G G G +
55
G G A G +
56
G A G G +
57
G A A G +
58
C T T G +
59
C T G G +
60
C T C G +
61
C G G G +
62
C C T G +
63
T T T C ++
64
T T C C ++
65
T T A C +++
66
T G A C ++
67
T C T C +++
68
T C C C +
69
T C A C +++
70
T A A C ++
71
G T T C ++
72
G T C C +++
73
T T T A +
74
T T G A +
75
T T C A +
76
T G G A +
77
T C T A +
78
A T A T ++
79
A C G T +
80
C T A G +
81
C C G G +
82
G T A C +++
83
T C G A ++
84
T T A A ++
85
T C G C +++
86
A A G C +++
87
G A G C +++
88
G C G C +++
89
G G G C ++
90
G T G C +++
91
T A G C +++
92
T G G C +
93
T T G C +++
94
A C G C ++
95
A G G C +
96
A T G C +++
97
C A G C +
98
C C G C ++
99
C G G C +
100
C T G C ++
Para mayor claridad, cada una de las secuencias centrales enumeradas en la Tabla 2 es equivalente a su secuencia de cadena opuesta debido al hecho de que la meganucleasa I-Crel une su secuencia de reconocimiento como un homodímero simétrico. Por tanto, la secuencia número 100 en la Tabla 2, C+1T+2G+3C+4, es equivalente a su
5 secuencia de cadena opuesta, G+1C+2A+3G+4. A partir de estos datos, surge un conjunto general de reglas de preferencia de secuencia central. Estas reglas, que no se suponen que sustituyen la Tabla 1 o la Tabla 2, incluyen:
1. Secuencias centrales con una base de purina en N+2 y una base de pirimidina en N+3 cortadas muy escasamente, como mucho.
10 2. G se prefiere en N+1. Esto es equivalente a C en N+4. Todas las secuencias centrales más preferidas tienen G en N+1 y/o C en N+4.
3.
C se prefiere en N+2. Esto es equivalente a G en N+3.
4.
Hay una preferencia para las secuencias centrales con una base de pirimidina en N+2 y una base de purina en N+3.
15 5. Hay una preferencia para las secuencias con al menos 1 par de bases A-T en la secuencia central.
Por tanto, en general, las secuencias centrales preferidas tienen la forma G+1Y+2R+3X+4 en la que Y es una pirimidina (C o T), R es una purina (A o G), y X es cualquier base (A, C, G, o T).
20 2.2 Aplicaciones in vitro usando secuencias centrales preferidas
Las meganucleasas modificadas por ingeniería genética tienen numerosas aplicaciones in vitro potenciales incluyendo el mapeo de restricción y la clonación. Estas aplicaciones son conocidas en la técnica y se comentan en el documento WO 2007/047859.
25 Una ventaja de usar las meganucleasas modificadas por ingeniería genética más que las enzimas de restricción convencionales para aplicaciones tales como clonación es la posibilidad de cortar el ADN para dejar un amplio intervalo de diferentes salientes 3’ (“extremos adhesivos”) que sean compatibles con, por ejemplo, los salientes 3’ producidos por escisión de una vector particular de interés. Por tanto, hay ocasiones cuando es deseable escindir
30 una secuencia de reconocimiento de meganucleasa con una secuencia central subóptima para crear un saliente deseado.
Debido a que las condiciones de escisión de ADN in vitro son, en general, menos estrictas que las condiciones in vivo, el uso de secuencias centrales subóptimas puede ser aceptable para tales aplicaciones. Por ejemplo, en relación a aplicaciones in vivo, digestiones in vitro usando meganucleasas modificadas por ingeniería se pueden realizar a una relación superior de meganucleasa y ADN, generalmente hay menos ADN no específico (genómico) 5 que compita por la meganucleasa, y las condiciones de solución se pueden optimizar para favorecer la escisión por meganucleasa (por ejemplo, usando tampón SA como se describió anteriormente). Por tanto, un mayor número de secuencias centrales son adecuadas para aplicaciones in vitro que para aplicaciones in vivo. Todas las secuencias centrales enumeradas en la Tabla 2 son adecuadas para aplicaciones in vitro, pero las secuencias centrales preferidas y las más preferidas para las aplicaciones in vitro se enumeran en la Tabla 3 y la Tabla 4,
10 respectivamente, con sus secuencias de cadena opuesta.
Tabla 3. Secuencias centrales preferidas para aplicaciones in vitro
Nº Sec.
N+1N+2N+3N+4 Secuencia de cadena opuesta
1
TTGT ACAA
2
TTAT ATAA
3
TCTT AAGA
4
TCGT ACGA
5
TCAT ATGA
6
GTTT AAAC
7
GTCT AGAC
8
GGAT ATCC
9
GAGT ACTC
10
GAAT ATTC
11
ATGT ACAT
12
TTTC GAAA
13
TTCC GGAA
14
TGAC GTCA
15
TAAC GTTA
16
GTTC GAAC
17
ATAT ATAT
18
TCGA TCGA
19
TTAA TTAA
20
GGGC GCCC
21
ACGC GCGT
22
CCGC GCGG
23
CTGC GCAG
Tabla 4. Las secuencias centrales más preferidas para aplicaciones in vitro
Nº Sec.
N1N2N3N4 Secuencia de cadena opuesta
1
GTGT ACAC
2
GTAT ATAC
3
TTAG CTAA
4
GTAG CTAC
5
TTAC GTAA
6
TCTC GAGA
7
TCAC GTGA
8
GTCC GGAC
9
GTAC GTAC
10
TCGC GCGA
11
AAGC GCTT
12
GAGC GCTC
13
GCGC GCGC
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