ES2626410T3 - Composiciones de radiotrazadores peptídicos - Google Patents

Abstract

Un agente formador de imágenes que comprende un péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F, en donde dicho péptido cíclico unido a c-Met es un péptido cíclico de 18 a 30 meros de Fórmula I: Z1-[cMBP]-Z2 (I) en donde: cMBP tiene la Fórmula II: -(A)x-Q-(A')y- (II) en donde Q es la secuencia de aminoácidos (SEQ-1): -Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6- en donde X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; X4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr; X6 es Asp o Glu; y Cysa-d son cada uno residuos de cisteína, de tal modo que los residuos a y b, así como c y d están ciclizados formando dos enlaces disulfuro separados; A y A' son independientemente cualquier aminoácido distinto de Cys, con la condición de que al menos uno de A y A' esté presente y sea Lys; x e y son independientemente números enteros de valor 0 a 13, y se eligen de tal manera que [x + y] >= 1 a 13; Z1 está unido al extremo N de cMBP y es H o MIG; Z2 está unido al extremo C de cMBP y es OH, OBc o MIG, donde Bc es un catión biocompatible; cada MIG es independientemente un grupo inhibidor del metabolismo que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime in vivo el metabolismo del péptido cMBP, bien en el extremo amino (Z1) o en el extremo carboxi (Z2) y que se elige de: para el extremo amino del péptido: grupos N-acilados, -NH(C>=O)RG, donde el grupo acilo -(C>=O)RG tiene RG elegido de: grupos alquilo de C1-6 o arilo de C3-10 o comprende un bloque de construcción de polietilenglicol (PEG); para el extremo carboxi del péptido: carboxamida, éster terc-butílico, éster bencílico, éster ciclohexílico, aminoalcohol o un bloque de construcción de polietilenglicol (PEG); en donde cMBP está marcado en el residuo Lys de los grupos A o A' con 18F.

Description

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Los sustituyentes radiofluorados preferidos -(L)n-18F tienen n = 1, es decir, está presente un grupo enlazador sintético como se ha definido anteriormente. Dichos sustituyentes más preferidos comprenden el radiomarcador 18F unido a un grupo fenilo, es decir, el sustituyente tiene la fórmula:

18F

-(A)xC6H4

donde: A es como se ha definido anteriormente,

x es un número entero de valor 0 a 5.

Dichos sustituyentes más preferidos provienen de la acilación en N del residuo amino de Lys con un éster activo fluorado, o de la condensación de un derivado aminooxi del residuo amino de Lys con un benzaldehído fluorado, y tienen las fórmulas:

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Los agentes formadores de imágenes del primer aspecto se pueden preparar como se describe en el quinto aspecto (más adelante).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición de un agente formador de imágenes que comprende:

(i)

el péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F del primer aspecto;

(ii)

un péptido cíclico de unión a c-Met no marcado;

donde: dicho péptido cíclico de unión a c-Met tiene la misma secuencia de aminoácidos en (i) y (ii)

y en donde el péptido cMBP no marcado está presente en dicha composición en no más de 50 veces la cantidad molar de dicho péptido cMBP marcado con 18F.

Las realizaciones preferidas del péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F en el segundo aspecto es como se ha descrito en el primer aspecto (anteriormente).

El término “composición” tiene su significado convencional, es decir, una mezcla de los componentes especificados. La composición puede estar en forma sólida o líquida/en solución.

Por el término “no marcado” se entiende que el péptido cíclico de unión a c-Met es no radiactivo, es decir no está radiomarcado con 18F, o cualquier otro radioisótopo. Uno o más de dichos péptidos pueden estar presentes en la composición, y dichos péptidos no marcados incluyen principalmente los precursores no radiactivos del cuarto aspecto (más adelante). El término “no marcado” excluye el péptido cíclico de unión a c-Met marcado con 19F, donde dicho 19F está presente en el fluoruro con 18F usado para radiomarcar dicho péptido cíclico de unión a c-Met y es, por tanto, un producto de la misma reacción de radiomarcaje. Como es sabido en la técnica, si dos compuestos sustituidos con flúor difieren solamente en los isótopos del átomo de flúor, se comportarán químicamente de una manera casi idéntica, y por tanto su separación será extremadamente difícil. El péptido o precursor cíclico de unión a c-Met no marcado tiene preferiblemente los grupos Z1 y/o Z2 ya incluidos. Los autores de la presente invención han encontrado que, cuando un aldehído marcado con 18F se usa para ser conjugado con un precursor del péptido cMBP funcionalizado con aminooxi, las impurezas aldehídicas no radiactivas son las principales fuentes de productos secundarios. Una impureza aldehídica importante del 18F-benzaldehído es DMAP (es decir, (4-dimetilamino)benzaldehído). Por tanto, los productos de conjugación de aldehídos no radiactivos (tales como DMAP) con el péptido cMBP funcionalizado con aminooxi están también dentro del alcance de la expresión “péptido cíclico de unión a c-Met no marcado”.

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Preferiblemente, el péptido cíclico de unión a c-Met no marcado está presente en dicha composición hasta 30, más preferiblemente hasta 20, más preferiblemente menos de 10 veces la cantidad molar del péptido marcado con 18F correspondiente.

La composición del segundo aspecto está preferiblemente en forma de solución, en donde los componentes (i) y (ii) están ambos presentes en solución. Más preferiblemente, la solución es un disolvente biocompatible, o una mezcla de dos o más de dichos disolventes. Los disolventes biocompatibles preferidos se describen en el tercer aspecto (más adelante), y preferiblemente comprenden un disolvente acuoso.

Los autores de la presente invención han encontrado que, a concentraciones de radiotrazadores -un intervalo de concentración aproximado de 1 a 50 μg/mL -el péptido cMBP marcado con 18F de la invención presenta una unión no deseada a una variedad de materiales. Puesto que el radiotrazador está presente a tan baja concentración, incluso una pequeña cantidad química de adsorción puede representar un porcentaje significativo del radioisótopo presente. Esa concentración de radiotrazador debe compararse, por ejemplo, con los péptidos de unión a c-Met marcados con colorante de cianina correspondientes, donde la concentración sería de aproximadamente 2 a 10 mg/mL, un factor casi mil veces mayor. En dichos casos, la pérdida de cantidades en μg de material por adsorción sería un porcentaje insignificante de los péptidos marcados con colorante todavía en solución. Los materiales en los que se ha observado la adherencia del radiotrazador incluyen plásticos, vidrio y sílice. En el caso de los filtros, esto puede significar un alto porcentaje de pérdidas de radiactividad cuando se realiza una filtración estéril.

Los autores de la presente invención han encontrado que el fenómeno de adherencia anterior proviene del hecho de que el péptido cMBP precipita en condiciones ácidas (particularmente a temperaturas menores). Por tanto, se prefiere mantener la composición a un pH de 7,5 o superior, más preferiblemente a pH 8,0 o superior con el fin de mantener el péptido de unión a c-Met marcado con 18F deseado en solución y evitar así la pérdida de material. Como alternativa, o además del uso de pH controlado, se puede incluir un solubilizante.

Por el término “solubilizante” se entiende un aditivo presente en la composición que aumenta la solubilidad del agente formador de imágenes en el disolvente. Dicho disolvente preferido es un medio acuoso, y por tanto el solubilizante mejora preferiblemente la solubilidad en agua. Dichos solubilizantes adecuados incluyen: alcoholes de C1-4; glicerina; polietilenglicol (PEG); propilenglicol; monooleato de sorbitán polioxietilenado; monooloeato de sorbitán; polisorbatos; copolímeros de bloques poli(oxietileno)poli(oxipropileno)poli(oxietileno) (Pluronics™); ciclodextrinas (por ejemplo, ciclodextrina alfa, beta o gamma, hidroxipropil-β-ciclodextrina o hidroxipropil-γ-ciclodextrina) y lecitina.

Los solubilizantes preferidos son ciclodextrinas, alcoholes de C1-4 y Pluronics™, más preferiblemente ciclodextrinas y alcoholes de C2-4. Cuando el solubilizante es un alcohol, es preferiblemente etanol o propanol, más preferiblemente etanol. El etanol tiene un doble papel potencial, puesto que también puede actuar como radioprotector. Cuando el solubilizante es una ciclodextrina, es preferiblemente una ciclodextrina, más preferiblemente hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD). La concentración de ciclodextrina puede ser de 0,1 a 40 mg/mL, preferiblemente entre 5 y 35 mg/mL, más preferiblemente de 20 a 30 mg/mL, lo más preferiblemente 25 mg/mL. Cuando se utiliza un único solubilizante, es preferiblemente etanol o hidroxipropil-β-ciclodextrina, más preferiblemente etanol. Cuando se usa una combinación de solubilizantes, es preferiblemente etanol e hidroxipropil-β-ciclodextrina.

Preferiblemente, la composición del segundo aspecto se mantiene a un pH igual o superior a 7,5, opcionalmente con 510% v/v de etanol como solubilizante.

La composición de agente formador de imágenes del segundo aspecto comprende además preferiblemente uno o más radioprotectores. Por el término “radioprotector” se entiende un compuesto que inhibe las reacciones de degradación, tales como procesos redox, atrapando radicales libres altamente reactivos, tales como radicales libres que contienen oxígeno que surgen de la radiólisis del agua. Se puede utilizar una combinación de dos o más radioprotectores diferentes. Los radioprotectores de la presente invención se eligen adecuadamente entre: etanol; ácido ascórbico; ácido paraaminobenzoico (es decir, ácido 4-aminobenzoico o pABA); ácido gentísico (es decir, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) y, cuando sea aplicable, sales de dichos ácidos con un catión biocompatible como se ha definido anteriormente. El radioprotector de la presente invención comprende preferiblemente ácido para-aminobenzoico o para-aminobenzoato de sodio.

Una composición de agente formador de imágenes más preferida de la presente invención comprende el péptido cMBP de SEQ-7 que tiene unidos Z1 = Z2 = MIG y una combinación del radioprotector ácido para-aminobenzoico y el radioprotector/solubilizante etanol en tampón acuoso. Un péptido preferido de SEQ-7 en dichas composiciones preferidas es el Péptido 1 y un péptido cMBP marcado con 18F preferido es el Compuesto 3. La concentración radiactiva es preferiblemente inferior a 350 MBq/mL, con una concentración de pABA de 2 mg/mL y etanol a 5-10% vol/vol, preferiblemente 6,5-7,5% vol/vol.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el agente formador de imágenes del primer aspecto, o la composición de agente formador de imágenes del segundo aspecto, junto con un vehículo biocompatible, en una forma estéril adecuada para la administración a mamíferos.

Los aspectos preferidos del agente y la composición formadores de imágenes en el tercer aspecto son como se han definido en los aspectos primero y segundo, respectivamente.

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El "vehículo biocompatible” es un fluido, especialmente un líquido, en el que el agente formador de imágenes puede estar en suspensión o preferiblemente disuelto, de manera que la composición sea fisiológicamente tolerable, es decir, se pueda administrar al cuerpo de un mamífero sin toxicidad ni malestar indebidos. El vehículo biocompatible es adecuadamente un vehículo líquido inyectable, tal como agua estéril, exenta de pirógenos, para inyección; una solución acuosa, tal como una solución salina (que se puede equilibrar ventajosamente de modo que el producto final para inyección sea isotónico); una solución tampón acuosa que comprende un agente tamponador biocompatible (por ejemplo, tampón de fosfato); una solución acuosa de una o más sustancias ajustadoras de la tonicidad (por ejemplo, sales de cationes del plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), azúcar-alcoholes (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol) u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo, polietilenglicoles, propilenglicoles). Preferiblemente, el vehículo biocompatible es agua exenta de pirógenos para inyección, solución salina isotónica o tampón de fosfato. Se prefiere el uso de un tampón con el fin de controlar el pH.

Los agentes formadores de imágenes y el vehículo biocompatible se suministran cada uno en viales o envases adecuados que comprenden un recipiente herméticamente cerrado que permite mantener la integridad estéril y/o la seguridad radiactiva, más opcionalmente un gas inerte en el espacio en cabeza (por ejemplo nitrógeno o argón), que permite mientras la adición y retirada de soluciones por jeringa o cánula. Dicho recipiente preferido es un vial sellado con una membrana, en el que el cierre hermético a los gases es ajustado con un precinto (típicamente de aluminio). El cierre es adecuado para punción única o múltiple con una aguja hipodérmica (por ejemplo, un cierre hermético con una membrana ajustada) mientras se mantiene la integridad estéril. Dichos recipientes tienen la ventaja adicional de que el cierre puede soportar el vacío si se desea (por ejemplo, para cambiar el gas del espacio en cabeza o las soluciones de desgasificación) y resistir los cambios de presión, tales como reducciones de la presión sin permitir la entrada de gases atmosféricos externos, tal como oxígeno o vapor de agua.

Los recipientes de dosis múltiples preferidos comprenden un único vial (por ejemplo con un volumen de 10 a 30 cm3) que contiene dosis para múltiples pacientes, con lo que se pueden retirar dosis para un solo paciente por jeringas de calidad clínica a diversos intervalos de tiempo durante la vida útil viable de la preparación para adaptarse a la situación clínica. Las jeringas precargadas están diseñadas para que contengan una sola dosis para un ser humano, o “unidosis” y por consiguiente son preferiblemente una jeringa desechable u otra jeringa adecuada para uso clínico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen preferiblemente una dosificación adecuada para un solo paciente y se proporcionan en una jeringa o recipiente adecuado, como se ha descrito anteriormente.

La composición farmacéutica puede contener otros excipientes adicionales, tales como: un conservante antimicrobiano, un agente ajustador del pH, una carga, un radioprotector, un solubilizante o un agente ajustador de la osmolalidad. Los términos “radioprotector” y “solubilizante” y sus realizaciones preferidas son como se ha descrito en el segundo aspecto (anteriormente). Por la expresión “conservante antimicrobiano” se entiende un agente que inhibe el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos, tales como bacterias, levaduras o mohos. El conservante antimicrobiano también puede presentar algunas propiedades bactericidas, dependiendo de la dosificación empleada. El papel principal del (de los) conservante(s) antimicrobiano(s) de la presente invención es inhibir el crecimiento de cualquier microorganismo en la composición farmacéutica. Sin embargo, el conservante antimicrobiano también se puede usar opcionalmente para inhibir el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos en uno o más componentes de los kits utilizados para preparar dicha composición antes de su administración. El(los) conservante(s) antimicrobiano(s) adecuado(s) incluye(n): los parabenos, es decir, metil-, etil-, propil-o butil-parabeno o sus mezclas; alcohol bencílico; fenol; cresol; cetrimida y tiomersal. El (los) conservante(s) antimicrobiano(s) preferido(s) son los parabenos.

La expresión “agente ajustador del pH” significa un compuesto o mezcla de compuestos útiles para asegurar que el pH de la composición está dentro de límites aceptables (pH 4,0 a 10,5) para administración a seres humanos o a mamíferos. Dichos agentes ajustadores del pH adecuados incluyen tampones farmacéuticamente aceptables, tales como tricina, fosfato o TRIS [es decir, tris(hidroximetil)aminometano], y bases farmacéuticamente aceptables, tales como carbonato de sodio, bicarbonato de sodio o sus mezclas. Cuando la composición se emplea en forma de kit, el agente ajustador del pH se puede proporcionar opcionalmente en un vial o recipiente separado, de modo que el usuario del kit pueda ajustar el pH como parte de un procedimiento de múltiples etapas.

Por el término “carga” se entiende un agente de carga farmacéuticamente aceptable que puede facilitar la manipulación del material durante su producción y liofilización. Cargas adecuadas incluyen sales inorgánicas, tal como cloruro de sodio, y azúcares solubles en agua o azúcar-alcoholes, tales como sacarosa, maltosa, manitol o trehalosa.

Las composiciones farmacéuticas del tercer aspecto se pueden preparar bajo condiciones de fabricación asépticas (es decir, una sala blanca) para proporcionar el producto no pirógeno estéril deseado. Se prefiere que los componentes clave, especialmente los reactivos asociados más las partes del aparato que van a estar en contacto con el agente formador de imágenes (por ejemplo, los viales) sean estériles. Los componentes y reactivos se pueden esterilizar por métodos conocidos en la técnica, que incluyen: filtración estéril, esterilización terminal usando por ejemplo irradiación gamma, tratamiento en autoclave, calor seco o tratamiento químico (por ejemplo, con óxido de etileno). Se prefiere esterilizar algunos componentes con antelación, de manera que se realice el número mínimo de manipulaciones necesarias. Como precaución, sin embargo, se prefiere incluir como etapa final al menos una etapa de filtración estéril en la preparación de la composición farmacéutica.

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Como se ha indicado anteriormente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se mantienen preferiblemente a pH 7,5 o superior y/o comprenden un solubilizante, de modo que se pueda usar una etapa de filtración estéril sin pérdida indebida de la radiactividad adsorbida por el material filtrante. Consideraciones similares se aplican a manipulaciones de las composiciones farmacéuticas por jeringas de calidad clínica, o la utilización de tubos de plástico, donde la adsorción puede causar pérdida de radiactividad sin el uso de un solubilizante.

La composición farmacéutica se prepara preferiblemente como se describe en el sexto aspecto (más adelante).

La composición farmacéutica del tercer aspecto se puede preparar opcionalmente a partir de un kit. Dichos kits comprenden el péptido de unión a c-Met de Fórmula I como se ha descrito en el primer aspecto o el precursor del cuarto aspecto en forma apirógena estéril, de tal modo que, por reacción con un suministro estéril del radioisótopo 18F en un disolvente adecuado, se produzca un radiomarcaje para obtener el péptido de unión al c-Met marcado con 18F deseado.

Para el kit, el péptido o precursor de unión a c-Met, más otros excipientes opcionales como se ha descrito anteriormente, se proporcionan preferiblemente como un polvo liofilizado en un vial o recipiente adecuado. A continuación se diseña el agente para que sea reconstituido bien directamente con 18F en un vehículo biocompatible (es decir, como una reconstitución), o se realiza una primera reconstitución del kit con un vehículo biocompatible, seguido por la reacción con un suministro de 18F.

Una forma estéril preferida del péptido o precursor de unión a c-Met es un sólido liofilizado. La forma sólida estéril se suministra preferiblemente en un recipiente de calidad farmacéutica, como se ha descrito para la composición farmacéutica (anteriormente). Cuando el kit se liofiliza, la formulación puede comprender opcionalmente un crioprotector seleccionado entre un sacárido, preferiblemente manitol, maltosa o tricina.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un precursor, útil en la preparación del péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F del tercer aspecto, o de la composición del primer o segundo aspectos, que comprende:

(i) el péptido cíclico de unión a c-Met de Fórmula I como se ha definido en el primer aspecto, en donde Z1 = Z2 =

MIG

; o

(ii) un péptido cíclico de unión a c-Met funcionalizado con aminooxi.

Por la expresión “péptido cíclico de unión a c-Met funcionalizado con aminooxi” se entiende el péptido cíclico de unión a c-Met de Fórmula I que tiene conjugado covalentemente un grupo funcional aminooxi. Dichos grupos aminooxi son de fórmula -O-NH2, preferiblemente -CH2O-NH2 y tienen la ventaja de que la amina del grupo aminooxi es más reactiva que un grupo amino de Lys en reacciones de condensación con aldehídos para formar éteres de oxima. Dichos grupos aminooxi se unen adecuadamente al residuo Lys del cMBP, como se describe más adelante.

El precursor es no radiactivo y está diseñado para que se pueda obtener en un alto grado de pureza química. También está diseñado de manera que, por reacción con una fuente adecuada de 18F, se produzca la reacción eficazmente con una pureza radioquímica satisfactoria (PRQ). La “fuente adecuada de 18F” depende de la naturaleza del precursor. Cuando el precursor comprende el péptido de unión a c-Met no marcado de Fórmula I, el grupo amino del residuo lisina (Lys) del péptido no marcado está diseñado para que sea el sitio de radiomarcaje. Los extremos del péptido cMBP están protegidos, puesto que Z1 = Z2 = MIG. Dichos péptidos de unión a c-Met y los grupos Z1/Z2 preferidos son como se han descrito en el primer aspecto. Así, la fuente adecuada de 18F está diseñada para que reaccione tan eficazmente como sea posible con el grupo amino de lisina, preferiblemente el grupo amino épsilon de Lys.

Para la preparación de la composición farmacéutica del tercer aspecto, el precursor está preferiblemente en forma estéril, más preferiblemente un sólido liofilizado.

El precursor del cuarto aspecto es preferiblemente un péptido de unión a c-Met funcionalizado con aminooxi.

Los péptidos de unión a c-Met de Fórmula I, es decir, Z1-[cMBP]-Z2 de la presente invención se pueden obtener por un método de preparación que comprende:

(i)

síntesis de péptidos en fase sólida de un péptido lineal que tenga la misma secuencia peptídica que el péptido cMBP deseado y en el que los residuos Cysa y Cysb estén sin proteger y los residuos Cysc y Cysd tengan grupos protectores tiol;

(ii)

tratamiento del péptido de la etapa (i) con una base acuosa en solución para obtener un péptido monocíclico con un primer enlace disulfuro que una Cysa y Cysb;

(iii) eliminación de los grupos protectores tiol de Cysc y Cysd y ciclización para obtener un segundo enlace disulfuro que una Cysc y Cysd, que es el producto peptídico bicíclico deseado, Z1-[cMBP]-Z2.

Por el término “grupo protector” se entiende un grupo que inhibe o suprime las reacciones químicas indeseables, pero que está diseñado para ser suficientemente reactivo para que se pueda escindir del grupo funcional en cuestión en condiciones suficientemente suaves que no modifiquen el resto de la molécula. Después de la desprotección se obtiene el producto deseado. Los grupos protectores de amina son bien conocidos por los expertos en la técnica y se seleccionan

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adecuadamente entre: Boc (donde Boc es terc-butiloxicarbonilo), Fmoc (donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo] o Npys (es decir, 3-nitro-2-piridinasulfenilo). Los grupos protectores tiol adecuados son Trt (Tritilo), Acm (acetamidometilo), t-Bu (terc-butilo), terc-butiltio, metoxibencilo, metilbencilo o Npys (3-nitro-2-piridina-sulfenilo). El uso de otros grupos protectores está descrito en 'Protective Groups in Organic Synthesis', 4th Edition, Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]. Los grupos protectores de amina preferidos son Boc y Fmoc, más preferiblemente Boc. Los grupos protectores de amina preferidos son Trt y Acm.

Los ejemplos 1 y 2 proporcionan otros detalles específicos. Otros detalles de la síntesis de péptidos en fase sólida están descritos por P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997. Los péptidos cMBP se almacenan mejor en atmósfera inerte y se mantienen en un congelador. Cuando se usan en solución, es mejor evitar un pH por encima de 7 ya que se corre el riesgo de perturbar los puentes disulfuro.

Los péptidos de unión a c-Met funcionalizados con aminooxi se pueden preparar por los métodos de Poethko et al., [J. Nucl. Med., 45, 892-902 (2004)], Schirrmacher et al., [Bioconj. Chem., 18, 2085-2089 (2007)], Solbakken et al., [Bioorg. Med. Chem. Lett, 16, 6190-6193 (2006)] o Glaser et al., [Bioconj. Chem., 19, 951-957 (2008)]. El grupo aminooxi se puede conjugar opcionalmente en dos etapas. En primer lugar, se conjuga el ácido aminooxi-carboxílico protegido en N

o el éster activado con aminooxi protegido en N con el péptido de unión a c-Met. En segundo lugar, se desprotege el péptido de unión a c-Met funcionalizado con aminooxi protegido en N intermedio para obtener el producto deseado [véanse los documentos de Solbakken y Glaser citados anteriormente]. Los ácidos aminooxi-carboxílicos protegidos en N, tales como Boc-NH-O-CH2(C=O)OH están comercialmente disponibles, por ejemplo de Novabiochem.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación del péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F del primer aspecto, que comprende:

(i)

la provisión del precursor del cuarto aspecto;

(ii)

cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de unión a c-Met no marcado de Fórmula I, en donde Z1 = Z2 = MIG, la reacción bien con un éster activado marcado con 18F o con un ácido carboxílico marcado con 18F en presencia de un agente activante, para obtener el péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F conjugado por medio de un enlace amida en el residuo Lys del cMBP de dicho péptido cíclico;

(iii) cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de unión a c-Met funcionalizado con aminooxi, la reacción bien con:

(a)

un éster activado marcado con 18F o un ácido marcado con 18F en presencia de un agente activante, para obtener el péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F conjugado por medio de un enlace amida en la posición aminooxi de dicho péptido funcionalizado; o

(b)

un aldehído marcado con 18F para obtener el péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F conjugado por medio de un enlace éter de oxima en la posición aminooxi de dicho péptido funcionalizado.

Por la expresión “éster activado” o “éster activo” se entiende un derivado éster del ácido carboxílico asociado que está diseñado para que sea un mejor grupo eliminable y por tanto permita una reacción más fácil con nucleófilos, tales como aminas. Ejemplos de ésteres activos adecuados son: N-hidroxisuccinimida (NHS); éster sulfo-succinimidílico; pentafluorofenol; pentafluorotiofenol; para-nitrofenol; hidroxibenzotriazol y PyBOP (es decir, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinfosfonio). Los ésteres activos preferidos son N-hidroxisuccinimida o ésteres de pentafluorofenol, especialmente ésteres de N-hidroxisuccinimida.

Por el término “agente activante” se entiende un reactivo usado para facilitar el acoplamiento entre una amina y un ácido carboxílico para generar una amida. Dichos agentes activantes adecuados son conocidos en la técnica e incluyen carbodiimidas, tal como EDC [N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida] y N,N'-dialquilcarbodiimidas, tal como diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida; y triazoles, tales como HBTU [hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)N,N,N',N'-tetrametiluronio], HATU [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio] y PyBOP [hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio]. Se dan más detalles en “March's Advanced Organic Chemistry”, 5th Edition, pages 508-510, Wiley Interscience (2001). Dicho agente activante preferido es EDC.

Los ésteres activados marcados con 18F, tal como [18F]SFB se pueden preparar por el método de Glaser et al., y las referencias contenidas en dicho documento [J. Lab. Comp. Radiopharm., 52, 327-330 (2009)], o el método automatizado de Marik et al., [Appl. Rad. Isot., 65 (2), 199-203 (2007)]:

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Los ácidos carboxílicos marcados con 18F se pueden obtener por el método de Marik et al., citado anteriormente. Los aldehídos alifáticos marcados con 18F de fórmula 18F(CH2)2O[CH2CH2O]qCH2CHO, donde q es 3, se pueden obtener por el método de Glaser et al., [Bioconj. Chem., 19(4), 951-957 (2008)]. El 18F-fluorobenzaldehído se puede obtener por el

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método de Glaser et al., [J. Lab. Comp. Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]. El precursor Me3N+-C6H4-CHO.CF3SO3 se obtiene por el método de Haka et al., [J. Lab. Comp. Radiopharm., 27, 823-833 (1989)].

La conjugación de los aldehídos marcados con 18F a los péptidos c-Met funcionalizados con aminooxi se realiza preferiblemente en presencia de un catalizador de anilina, como ha sido descrito por Flavell et al., [J. Am. Chem. Soc., 130(28), 9106 -9112 (2008)]. Aunque es posible utilizar como precursores péptidos c-Met con aminooxi protegido (tal como el Compuesto 1), se prefiere el derivado aminooxi libre (tal como el Compuesto 2). Esto se debe a que toda la síntesis es más susceptible a la automatización, mientras que con el precursor protegido, se requiere típicamente una etapa de desprotección manual.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de la composición del agente formador de imágenes del segundo aspecto, o su composición farmacéutica del tercer aspecto, que comprende:

(i)

la preparación del péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F como se ha definido en el método de preparación del quinto aspecto;

(ii)

la separación cromatográfica del péptido cíclico de unión a c-Met no marcado del péptido cíclico de unión a c-Met radiomarcado con 18F.

Los aspectos preferidos de la composición del agente formador de imágenes y de la composición farmacéutica en el sexto aspecto son los descritos en el segundo y tercer aspectos, respectivamente.

La separación cromatográfica de la etapa (ii) puede ser realizada por HPLC o SPE (extracción en fase sólida) usando uno o más cartuchos de SPE. Se prefiere la SPE cuando se utiliza un sintetizador automatizado y se prefiere la HPLC en otras circunstancias. El Ejemplo 5 proporciona un método de HPLC adecuado para el Compuesto 3 de la presente invención.

El método del sexto aspecto se usa preferiblemente para obtener la composición farmacéutica del tercer aspecto. Cuando el método se utiliza para preparar la composición farmacéutica del tercer aspecto, el método de preparación se realiza preferiblemente usando un aparato sintetizador automatizado.

Por la expresión “sintetizador automatizado” se entiende un módulo automatizado basado en el principio de operaciones unitarias, como ha sido descrito por Satyamurthy et al., [Clin. Positr. Imag., 2(5), 233-253 (1999)]. La expresión “operaciones unitarias” significa que los procesos complejos se reducen a una serie de operaciones o reacciones simples, que se pueden aplicar a una gama de materiales. Dichos sintetizadores automatizados se prefieren para el método de la presente invención especialmente cuando se desea una composición radiofarmacéutica. Están comercialmente disponibles en una gama de proveedores [Satyamurthy et al., anteriormente citado], que incluyen: GE Healthcare; CTI Inc; Ion Beam Applications S.A. (Chemin du Cyclotron 3, B-1348 Louvain-La-Neuve, Bélgica); Raytest (Alemania) y Bioscan (EE.UU.).

Los sintetizadores automatizados comerciales también proporcionan recipientes adecuados para los desechos radiactivos líquidos generados como resultado de la preparación radiofarmacéutica. Los sintetizadores automatizados generalmente no están provistos de protección frente a la radiación, puesto que están diseñados para ser empleados en una celda de trabajo radiactivo configurada adecuadamente. La celda de trabajo radiactivo proporciona una protección frente a la radiación adecuada para proteger al operador de la posible dosis de radiación, así como ventilación para eliminar vapores químicos y/o radiactivos. El sintetizador automatizado comprende preferiblemente un casete. Por el término “casete” se entiende una pieza de un aparato diseñada para encajar de forma amovible e intercambiable en un aparato sintetizador automatizado (tal como se define más adelante), de tal modo que el movimiento mecánico de las partes móviles del sintetizador controla el funcionamiento del casete desde el exterior del casete, es decir, externamente. Los

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casetes adecuados comprenden una disposición lineal de válvulas, cada una unida a un puerto donde se pueden sujetar reactivos o viales, ya sea por punción con aguja de un vial invertido cerrado herméticamente con una membrana, o por juntas de empalme herméticas a los gases. Cada válvula tiene una unión machihembrada que está conectada con un brazo móvil correspondiente del sintetizador automatizado. La rotación externa del brazo controla así la apertura o el cierre de la válvula cuando el casete está unido al sintetizador automatizado. Las partes móviles adicionales del sintetizador automatizado están diseñadas para sujetarse a las puntas del émbolo de la jeringa y, por tanto, elevar o descender los cilindros de la jeringa.

El casete es versátil, teniendo típicamente varias posiciones donde se pueden fijar los reactivos y varias adecuadas para la sujeción de viales de jeringas de reactivos o cartuchos de cromatografía (por ejemplo, SPE). El casete comprende siempre un vaso de reacción. Dichos vasos de reacción tienen preferiblemente un volumen de 1 a 10 cm3, lo más preferiblemente de 2 a 5 cm3 y están configurados de manera que 3 o más puertos del casete estén conectados a él, para permitir la transferencia de reactivos o disolventes desde varios puertos al casete. Preferiblemente, el casete tiene de 15 a 40 válvulas en una disposición lineal, lo más preferiblemente de 20 a 30, siendo especialmente preferido 25. Las válvulas del casete son preferiblemente idénticas, y lo más preferiblemente son válvulas de 3 vías. Los casetes están diseñados para que sean adecuados para la fabricación de radiofármacos y por tanto fabricados a partir de materiales que son de calidad farmacéutica e idealmente también son resistentes a la radiólisis.

Los sintetizadores automatizados preferidos de la presente invención son los que comprenden un casete desechable o de uso único que contiene todos los reactivos, vasos de reacción y aparatos necesarios para realizar la preparación de un lote dado de radiofármacos radiofluorados. El término casete se refiere a que el sintetizador automatizado tiene la flexibilidad de ser capaz de preparar una variedad de diferentes radiofármacos con un riesgo mínimo de contaminación cruzada, simplemente cambiando el casete. El empleo de un casete también tiene las ventajas de: un equipo simplificado y por tanto un riesgo reducido de error del operador; mejor cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación (GMP); capacidad multitrazadora; cambio rápido entre las fases de producción; chequeo de diagnóstico automatizado previo a la operación del casete y los reactivos; chequeo adicional automatizado de los códigos de barras de los reactivos químicos con relación a la síntesis que se ha de realizar; trazabilidad de los reactivos; un único uso y por tanto sin riesgo de contaminación cruzada, alteración y resistencia al mal uso.

Se incluye en este aspecto de la invención, el uso de un aparato sintetizador automatizado para preparar la composición farmacéutica del segundo aspecto.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para la formación de imágenes del cuerpo de un mamífero in vivo para obtener imágenes de sitios de sobreexpresión o localización de c-Met, comprendiendo dicho método la formación de imágenes de dicho cuerpo al que se había administrado previamente el agente formador de imágenes del primer aspecto, la composición del agente formador de imágenes del segundo aspecto o la composición farmacéutica del tercer aspecto.

Los aspectos preferidos del agente formador de imágenes, la composición del agente formador de imágenes y la composición farmacéutica del séptimo aspecto son los descritos en los aspectos primero, segundo y tercero, respectivamente.

Preferiblemente, el mamífero es el cuerpo de un mamífero intacto in vivo, y más preferiblemente es un ser humano. El agente formador de imágenes se puede administrar al cuerpo del mamífero de una manera mínimamente invasiva, es decir, sin riesgo sustancial para la salud del sujeto mamífero, incluso cuando lo realiza un experto médico profesional. Dicha administración mínimamente invasiva es preferiblemente una administración intravenosa en una vena periférica de dicho sujeto, sin necesidad de anestesia local ni general.

Preferiblemente, se utiliza la composición farmacéutica del tercer aspecto. En el método para la formación de imágenes del séptimo aspecto, el sitio de sobreexpresión o localización de c-Met es preferiblemente un tumor canceroso o metástasis. Se pretende que el agente sirva para uso en la formación de imágenes de la expresión de c-Met tanto en tumores precancerosos como cancerosos o metástasis, permitiendo potencialmente la selección de la terapia. Además, la formación de imágenes repetida con dicho agente formador de imágenes tiene también la posibilidad de monitorizar rápida y eficazmente la respuesta individual de un sujeto a pautas terapéuticas nuevas y establecidas, permitiendo con ello la interrupción de un tratamiento ineficaz. Además, como la sobreexpresión de c-Met es un atributo potencial de los tumores agresivos, se prevé que el agente formador de imágenes c-Met tiene la posibilidad de ser usado en la diferenciación entre los cánceres agresivos y menos agresivos en una etapa temprana de su desarrollo.

Se incluye en este aspecto el agente formador de imágenes para uso en un método de diagnóstico de sitios de sobreexpresión o localización de c-Met dentro del cuerpo de un mamífero in vivo, que comprende el método para la formación de imágenes del séptimo aspecto.

La invención es ilustrada por los Ejemplos detallados a continuación. El Ejemplo 1 proporciona la síntesis de un péptido cMBP de la invención que tiene grupos inhibidores del metabolismo (Z1 = Z2 = MIG) en ambos extremos (Péptido 1). El Ejemplo 2 proporciona la síntesis de un precursor protegido de la invención (Compuesto 1). El Ejemplo 3 proporciona la síntesis del homólogo fluorado (es decir, 19F) no radiactivo del péptido c-Met marcado con flúor (Compuesto 3A). El

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PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

p.i.:

post-inyección

PyBOP:

hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio

tBu:

terc-butilo

5

TFA: Ácido trifluoroacético

TIS:

Triisopropilsilano

Trt:

Tritilo.

Compuestos de la invención.

Nombre

Estructura

Péptido 1

Puentes disulfuro en Cys 4-16 y Cys 6-14; o Ac -AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK -NH2

Compuesto 1

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Compuesto 2

imagen10

Compuesto 3

n = 19 Compuesto 3A; n = 18 Compuesto 3B.

donde:

10 los Compuestos 1, 2 y 3 están funcionalizados en el grupo amina en épsilon de Lys del extremo carboxi del Péptido 1; Boc = terc-butiloxicarbonilo.

15

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Se disolvieron ácido (Boc-aminooxi)acético (Sigma-Aldrich, 138 mg, 0,72 mmol), EDC (138 mg, 0,72 mmol) y Nhidroxisuccinimida (83 mg, 0,72 mmol) en DMF (1 mL). La solución se agitó durante 25 minutos y a continuación se añadió a una solución del Péptido 1 (1,0 g, 0,36 mmol) en DMF (5 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 minutos. Se añadió entonces sim-colidina (239 μL, 1,80 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua (5 mL) y el producto se purificó por RP-HPLC preparativa.

Condiciones de HPLC: Waters Prep 4000 System, disolvente A = H2O/TFA al 0,1% y disolvente B = ACN/TFA al 0,1%; gradiente: B al 20-40% durante 60 min; caudal = 50 mL/min; columna: Phenomenex Luna 10 µm C18 (2) 250 x 50 mm; detección: UV 214 nm.

Rendimiento del Compuesto 1 purificado: 690 mg (65%); m/z encontrado: 1478,4, MH22+ esperado: 1478,1.

Ejemplo 3 Síntesis del Compuesto 3A.

Etapa (a): Preparación de ácido N-(4-fluorobencilideno)aminooxiacético.

Se disolvieron ácido (Boc-aminooxi)acético (96 mg, 0,50 mmol) y 4-fluorobenzaldehído (53 μL, 0,50 mmol) en ácido fórmico (0,5 mL) y la mezcla de reacción se agitó durante 135 minutos. A continuación se diluyó la mezcla de reacción con ACN al 20%/agua/TFA al 0,1% (7 mL) y el producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa.

Condiciones de HPLC: Beckman System Gold; disolvente A = H2O/TFA al 0,1% y disolvente B = ACN/TFA al 0,1%; gradiente: B al 25-35% durante 40 min; caudal = 10 mL/min; columna: Phenomenex Luna 5 µm C18 (2) 250 x 21,2 mm; detección: UV 214 nm.

Rendimiento 92 mg (93%).

Etapa (b): Preparación del Compuesto 3A.

Se disolvieron ácido N-(4-fluorobencilideno)aminooxiacético [de la etapa (a), 43 mg, 0,22 mmol] y PyBOP (112 mg, 0,22 mmol) en DMF (2 mL). Se añadió una solución de DIPEA (157 µL, 0,90 mmol) en DMF (10 mL) y la mezcla se agitó durante 1 minuto. A continuación se añadió la solución a una solución del Péptido 1 (500 mg, 0,18 mmol) en DMF (10 mL) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se diluyó entonces con agua (20 mL) y el producto se purificó por HPLC preparativa.

Las condiciones de HPLC son como las del Ejemplo 2, excepto: disolvente A = H2O/acetato de amonio al 0,1% y disolvente B = ACN. Rendimiento 291 mg (55%) de material puro; m/z encontrado: 988,6, MH33+ esperado: 987,7.

Ejemplo 4: Síntesis del Compuesto 3B a partir del Compuesto 1.

Etapa (a): Desprotección del Compuesto 1 para obtener el Compuesto 2.

El Compuesto 1 (7 mg, 2,37 μM) en un vial de reacción de 5 mL se trató con agua (10 μL) y ácido trifluoroacético (190 μL) y a continuación se sumergió dentro de un vial cerrado herméticamente en un baño sónico durante 10 minutos. A continuación se retiró a vacío el TFA acuoso (aproximadamente 30 minutos) y el residuo se reconstituyó en tampón de citrato (pH 2,6, 1,7 mL) y se cargó en un casete de sintetizador automatizado (FastLab™, GE Healthcare Ltd) en la posición 14.

Etapa (b): Síntesis y purificación de 18F-benzaldehído.

Se produjo [18F]-fluoruro utilizando un ciclotrón GEMS PETtrace con una diana de plata por medio de la reacción nuclear [18O](p, n)[18F]. Se utilizaron volúmenes totales de la diana de 1,5 -3,5 mL. El radiofluoruro fue atrapado en un cartucho QMA de Waters (pre-acondicionado con carbonato) y el fluoruro se eluyó con una solución de Kryptofix2.2.2. (4 mg, 10,7 µM) y carbonato de potasio (0,56 mg, 4,1 µM) en agua (80 µL) y acetonitrilo (320 µL). Se usó nitrógeno para conducir la solución del cartucho QMA al recipiente de reacción. El [18F]-fluoruro se secó durante 9 minutos a 120ºC bajo una corriente estacionaria de nitrógeno y vacío. Se añadió triflato de trimetilamonio-benzaldehído, [Haka et al., J. Lab. Comp. Radiopharm., 27, 823-833 (1989)] (3,3 mg, 10,5 µM) en dimetilsulfóxido (1,1 mL) a [18F]-fluoruro secado y la mezcla se calentó a 105ºC durante 7 minutos para producir 4-[18F]fluorobenzaldehído. La eficiencia del marcaje fue 69 ± 3% de desintegración corregida.

A continuación se diluyó la mezcla de marcaje en bruto con solución de hidróxido de amonio y se cargó en un cartucho MCX+ SPE (preacondicionado con agua como parte de la secuencia FASTlab). El cartucho se lavó con agua, se secó con nitrógeno gaseoso antes de la elución de 4-[18F]fluorobenzaldehído de vuelta al recipiente de reacción en etanol (1 mL). Aproximadamente el 13% (desintegración corregida) de [18F]fluorobenzaldehído permaneció atrapado en el cartucho.

Etapa (c): Condensación del aldehído con derivado de aminooxi (Compuesto 2).

Se transfirió el Compuesto 2 (5 mg, 1,8 μmol) al recipiente de reacción FASTlab antes de que la elución de 4[18F]fluorobenzaldehído fuera devuelta desde el cartucho MCX+. La mezcla se calentó luego a 70ºC durante 17 minutos. La HPLC analítica confirmó que la RCP del producto del compuesto 3B era 63 ± 9%.

La mezcla de reacción en bruto se diluyó con agua (10 mL) y se cargó en HPLC preparativa. Un sistema de acetato de

5 amonio 10 mM frente a acetonitrilo proporcionó una separación completa entre los 3 posibles componentes radiactivos de la mezcla de reacción en bruto, a saber [18F]-fluoruro (TR= 0,5 min), [18F]-Compuesto 3B (TR= 6 min) y 4-[18F]fluorobenzaldehído (TR= 9 min). La recuperación de la radiactividad del sistema de HPLC fue buena, con una eficacia de recuperación del 97%. El producto purificado se obtuvo con un tiempo de retención de aproximadamente 6 minutos.

Ejemplo 5: Separación por HPLC de un péptido cíclico c-Met marcado con nF a partir de un péptido no marcado.

10 El Compuesto 3A se preparó de acuerdo con el Ejemplo 3.

(i) Condiciones analíticas de la HPLC.

Columna: XBridge Shield RP 18 (4,6x50) mm, 2,5 µm

Fase móvil acuosa A: NH4Ac 10 mM (tampón) pH aprox. 6,8

Fase móvil orgánica B: Acetonitrilo

Temperatura de la columna: 25ºC

Caudal: 1,2 mL/min

Gradiente:

Minutos

0 1 16 19 22 22,1 26

% de B

20 20 40 100 100 20 20

15 (ii) Condiciones de la HPLC preparativa Columna: XBridge Shield RP 18 (10x100) mm, 5 µm Fase móvil acuosa A: NH4Ac 10 mM (tampón) pH aprox. 6,8 Fase móvil orgánica B: Etanol (90%) Fase móvil A (10%). Temperatura de la columna: 25ºC Caudal: 4 mL/min

Gradiente:

Minutos

0 1 16 20 25 26

% de B

15 15 40 100 100 15

(iii) Resultados de las HPLC analítica y preparativa.

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18

5

10

15

20

25

30

35

Compuesto

HPLC analítica HPLC preparativa

Tiempo de retención (minutos)

Tiempo de retención (minutos)

Hidrocloruro de anilina

1,8 3

Fluorobenzaldehído

4,3 13

Compuesto 2

4,8 no definido

Péptido 1

5,1 no definido

Compuesto 3A

8,8 19

Ejemplo 6: Biodistribución del péptido c-Met marcado con 18F (Compuesto 3B) en ratones atímicos portadores de tumores.

Se alojaron ratones atímicos machos CD-1 (de aproximadamente 20 g) en jaulas individuales ventiladas, con acceso ad libitum a alimentos y agua. Se desarrollaron células HT-29 (ATCC, nº de Cat. HTB-38) en un medio 5a de McCoy (Sigma nº M8403) suplementado con suero fetal de bovino al 10% y penicilina/estreptomicina. Las células se dividieron 1:3 dos veces por semana, a una confluencia de 70-80% usando tripsina al 0,25% y se incubaron en CO2 al 5% a 37ºC. A los ratones se le inyectó por vía s.c. bajo anestesia con gas ligero (isoflurano) la suspensión de células HT-29 en un sitio (nuca) con una dosis nominal de 106 células por inyección en un volumen de 100 μL utilizando una aguja de calibre fino (25 G). A continuación se dejó que los tumores se desarrollaran durante 20 días, o hasta un volumen de al menos 200 mm3 (para su inclusión en el estudio).

Después de un tiempo de desarrollo de 20 días, se inyectó a los animales el Compuesto 3B (0,1 mL, 1-5 MBq/animal) en forma de un bolo intravenoso a través de la vena de la cola. En varios momentos después de la inyección los animales se sacrificaron, disecaron y extrajeron los siguientes órganos y tejidos:

La absorción por el tumor fue 2,3% de dosis inyectada (di)/g a los 2 minutos, alcanzando un máximo a los 30 minutos (3,8% di/g) y disminuyendo con el tiempo hasta 1,9% di/g a 120 minutos p.i. La retención global dentro del tumor fue 83%. Se observó una eliminación razonablemente rápida en la sangre con el tiempo (en la sangre inicial a los 2 minutos era 9,2% di/g disminuyendo hasta 0,81% di/g a los 120 minutos p.i.). El tejido fundamental clave (por ejemplo, pulmones e hígado) siguió el perfil de la eliminación en sangre con el tiempo, con absorción a 120 min p.i. de 1,1% di/g (hígado) y 1,56% di/g (pulmones).

Ejemplo 7: Estudio del bloqueo del receptor del Compuesto 3B en ratones atímicos portadores de tumores.

El estudio del Ejemplo 6 se repitió con una inyección conjunta de un exceso de 100 y 1000 veces del análogo no radiactivo, Compuesto 3A, (exceso de ~1,5 μg y 15 μg por animal), a animales disecados a los 120 minutos post-inyección. Todos los animales de este estudio tenían un peso similar (intervalo de 25 a 30 g). Los datos demostraron que se logró una reducción estadísticamente significativa (p<0,01) en la absorción por el tumor del Compuesto 3B con un exceso de 1000 veces a la del péptido no marcado (la absorción por el tumor HT-29 descendió de 1,9 a 1,1% di/g; una reducción del 40%).

Ejemplo 8: Formación de imágenes por PET de primates con el Compuesto 3B.

La biodistribución del Compuesto 3B en tres monos cinomolgos hembras se midió por PET. En cada ocasión se realizaron dos inyecciones del trazador:

(a)

3 MBq/kg de trazador solo (Compuesto 3B) (estudio en el punto de partida);

(b)

9 MBq/kg de trazador con una inyección conjunta de 0,15 mg/kg del Compuesto 3A (estudio de bloqueo) cuatro horas después de la inyección en el punto de partida.

El trazador se inyectó como una dosis en forma de bolo en 1-3 mL seguido de 1 mL de solución salina.

Se tomaron muestras de sangre (0,2 mL) para la determinación de la radiactividad a intervalos de hasta 210 minutos después de la administración. En los estudios dinámicos se señalaron regiones de interés en hueso, corazón, riñón,

imagen12

Ejemplo 12: Formulación y liofilización del precursor.

El precursor peptídico, Compuesto 2 (2,5 ó 5 mg), se mezcló con un tampón de formulación (hidrogenofosfato disódico dihidrato y ácido cítrico monohidrato, pH 2,8) y se agitó hasta que se obtuvo una suspensión homogénea. Cada uno de

5 los viales de 13 mm de un aparato sintetizador automatizado FASTlab™ (GE Healthcare Ltd) con tapones para liofilización se rellenaron con 1 mL de suspensión. A continuación se congelaron los viales en la unidad de liofilización y se sometieron a un ciclo de liofilización de 4 días.

Todos los viales que contenían péptido proporcionaban tortas liofilizadas satisfactorias. Se encontró que el precursor liofilizado se disolvía mucho más rápidamente que el Compuesto 2 distribuido en seco.

10 Ejemplo 13: Efecto del pH sobre la solubilidad.

El Compuesto 3B se preparó en un sintetizador FASTlab™ y se recogió el eluyente del producto (~ 6 mL) en un vial que contenía 2 mL de tampón de formulación (pABA, tampón cítrico, pH 7). Se observó una solución turbia. La solución (8 mL) se filtró fácilmente por un pre-filtro (filtro Pall de 25 mm con membrana Supor de 0,2 μm con banda repelente hidrófoba, nº de pieza 6124211), obteniéndose una solución transparente.

15 La solución filtrada se dividió en 4 muestras de 2 mL y el pH de las 4 muestras se ajustó con fosfato (sólido, de modo que no cambie el volumen) como sigue:

Vial 1 pH 7,5 (solución original, sin ajustes)

Vial 2 pH 6,1

Vial 3 pH 8,6

Vial 4 pH 9,1

Todas las muestras se conservaron en la oscuridad a temperatura ambiente. Para evaluar la agregación/precipitación potencial, las 4 muestras fueron sometidas a dispersión con luz estática durante 28 días. Se observó lo siguiente:

20 -a pH 6,1 mostró precipitado visual el día 10;

-no se observó ninguna indicación de agregación a pH≥7,5 después de 28 días.

Ejemplo 14: Estudios en seres humanos.

La formación de imágenes con el Compuesto 3B se estudió en 6 pacientes humanos a los que se había diagnosticado previamente carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. El agente fue bien tolerado (sin efectos adversos). 5

25 de los 6 pacientes tuvieron una absorción moderada/alta del trazador y 1 paciente la tuvo baja (similar al lado contralateral). Esto coincide con los informes de la bibliografía del 80% de los pacientes que sobreexpresan c-Met.

Claims (1)

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