ES2627321T3 - Una lisina de bacteriófago quimérica con actividad contra bacterias estafilocócicas - Google Patents

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Abstract

Una lisina de bacteriófago quimérica que comprende un dominio catalítico de una primera lisina de fago específica de Staphylococcus y un dominio de unión de una segunda lisina de fago específica de Staphylococcus, en la que el dominio de unión no es un dominio dirigido a la pared celular similar a SH3b.

Description

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isoeléctrico teórico de 9,17, y fue purificada mediante una cromatografía en columna en dos etapas hasta >90% de homogeneidad. CIyS tiene una masa molecular de aproximadamente 31 kDa mediante SDS/PAGE (figura 6), que fue confirmada mediante una cromatografía de filtración en gel, lo cual sugiere que la proteína existe como un monómero y no está proteolíticamente procesada (los datos no se muestran).
La actividad en unidades de CIyS se define midiendo la pérdida espectrofotométrica de turbidez, que es indicativa de la lisis celular, de células de S. aureus 8325-4 tras añadir diluciones en serie de CIyS. En estos ensayos, 5 microgramos de CIyS se corresponden con 1 U de actividad lítica. Cuando se añaden 50 U de CIyS a células 8325-4 en crecimiento exponencial, la DO600 disminuye hasta la línea de base en 5 min (figura 7). Para confirmar que la lisis celular observada se corresponde con la muerte celular, se determinó la viabilidad estafilocócica enumerando partes alícuotas de la reacción lítica en diversos momentos. Se observa una disminución en la viabilidad de aproximadamente 3 unidades logarítmicas en 30 min (figura 7).
El efecto lítico sobre células 8325-4 de S. aureus expuestas a 50 U de CIyS durante 1-3 min se visualizó mediante microscopía electrónica de transmisión. Típico de la actividad lisina observada previamente, se observó una degradación localizada de la pared celular en un solo sitio (figura 8A) o en múltiples sitios (figura 8B). Sin embargo, a diferencia de otras lisinas, los sitios de degradación en la célula no se limitan a posiciones septales o polares, sino que se distribuyeron al azar. Esto produce extrusiones y la ruptura de la membrana celular (figura 8C) y la posterior pérdida de los contenidos citoplásmicos y la formación de células fantasma (figura 8D).
Se determinó el efecto del pH sobre la actividad de CIyS midiendo la disminución en la DO600 o la viabilidad de las células a diferentes valores de pH. Se observó que CIyS es activa a través de un amplio intervalo de valores de pH, pero es más activa entre pH 9 y 10. Sin embargo, CIyS conserva una actividad parcial, aunque significativa, a pH fisiológico (figura 9A). De modo similar, también se determinó el efecto de la concentración salina sobre la actividad de CIyS. CIyS muestra actividad en un amplio intervalo de concentraciones salinas (figura 9B). Aunque la actividad se deteriora por encima de NaCl 400 mM, CIyS funciona bien a concentraciones fisiológicas.
Se ensayó la actividad muralítica de CIyS en una serie de cepas bacterianas que representan una diversidad de especies que se dividieron en conjuntos (tabla 1 y figura 10). El conjunto I consiste en cepas de S. aureus, que incluyen S. aureus (MSSA) sensibles a meticilina y MRSA. CIyS es activa contra MSSA y MRSA, aunque se observaron algunas diferencias entre las cepas de S. aureus. El conjunto Il consiste en diferentes especies de estafilococos, que incluyen S. epidermidis, S. simulans y S. sciuri. CIyS es activa no solo contra S. epidermidis, que incluye la cepa formadora de biopelícula RP62A, sino que también es activa contra S. simulans y S. sciuri, lo cual sugiere que CIyS reconoce un epitopo sobre la pared celular que está presente en todas las células estafilocócicas. El conjunto III consiste en una mezcla de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, que incluyen representantes de estreptococos de los grupos A, B, C y E, especies estreptocócicas orales que incluyen S. gordonii y S. salivarius, así como S. uberis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa y E. coli. CIyS no muestra actividad contra ninguno de estos organismos.
En otra realización, un péptido quimérico comprende un polipéptido aislado que comprende un dominio de endopeptidasa de la lisina Twort de S. aureus cadena arriba del dominio CWT de lifostafina. Un ejemplo de una lisina de este tipo se proporciona en SEQ ID NO:3 (AD119).
En otra realización, las composiciones líticas pueden comprender una mezcla de dos o más lisinas. La mezcla puede incluir un primer polipéptido y un segundo péptido, en la que uno o ambos polipéptidos pueden carecer del nivel deseado de actividad lítica, pero la mezcla proporciona una actividad lítica deseablemente específica y eficaz contra una bacteria de interés. Por ejemplo, una composición puede incluir un primer polipéptido aislado que comprende un dominio de endopeptidasa de la lisina Twort de S. aureus cadena arriba del dominio CWT de lifostafina, combinado con un segundo polipéptido aislado que comprende un dominio de amidasa de la autolisina de
S. epidermidis cadena arriba del dominio CWT de lisostafina. Un ejemplo de una composición de este tipo comprende una mezcla de SEQ ID NO:3 (AD119) y SEQ ID NO:4 (AD112).
En algunos ejemplos, la presente descripción se refiere a enzimas líticas como tratamiento profiláctico para prevenir una infección en sujetos que probablemente hayan estado expuestos a bacterias de S. aureus, o como tratamiento terapéutico para aquellos sujetos que ya han enfermado como consecuencia de la infección. Las enzimas líticas asociadas a fagos descritas en la presente son específicas de bacterias de S. aureus y preferiblemente degradan, de forma eficaz, la pared celular de bacterias de S. aureus.
Los polipéptidos de las enzimas líticas quiméricas descritos en la presente también pueden emplearse como agente terapéutico. Los polipéptidos de las enzimas líticas de la presente invención pueden formularse según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las que el producto de la enzima lítica se combina mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que puede utilizarse para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una infección por bacterias de S. aureus también incluyen la enzima reordenada y/o quimérica y un medio de aplicación (tal como un sistema vehículo o un modo de administración oral) al revestimiento mucósico de la cavidad oral y nasal, de modo que la enzima se introduce en el sistema vehículo o modo de administración oral para que alcance al revestimiento mucósico.
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En un aspecto de la invención, la lisina quimérica se administra en combinación con un antibiótico, tal como vacomicina u oxaxilina. Una lisina quimérica de Staphylococcus, tal como una lisina de SEQ ID NO:2 (CIyS), se administra en forma de una composición antibacteriana en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. En un aspecto de la invención, la lisina quimérica se administra mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable en forma de una composición farmacéutica. En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende además vancomicina u oxacilina. En ciertas realizaciones, la cantidad de lisina de bacteriófago quimérica presente es una cantidad terapéuticamente eficaz. Los "vehículos", tal como se emplean en la presente, incluyen vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a ellos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa con pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones, tales como tampón fosfato, citrato y de otros ácidos orgánicos; antioxidantes, que incluyen el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™. Estas composiciones antimicrobianas/farmacéuticas pueden administrarse de modo local o sistémico.
Las vías de administración incluyen la vía tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), oral, parenteral, vaginal y rectal. También es posible la administración desde implantes. Los compuestos de la invención también pueden administrarse por vía tópica a la piel o las mucosas, es decir, por vía dérmica o transdérmica. Las formulaciones típicas para este objetivo incluyen geles, hidrogeles, lociones, disoluciones, cremas, ungüentos, polvos secantes, vendajes, espumas, películas, parches dérmicos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendas y microemulsiones. También pueden emplearse liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Pueden incorporarse potenciadores de la penetración [véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci., 88 (10), 955-958, de Finnin y Morgan (octubre de 1999)].
Los compuestos de la invención también pueden administrarse directamente a la corriente sanguínea, al músculo o a un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores con aguja (que incluyen microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión. Los compuestos de la invención también pueden administrarse por vía intranasal u oral mediante inhalación, generalmente en forma de un aerosol. Así, en un aspecto de la invención, se formula una composición farmacéutica que comprende una lisina de la invención mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración tópica o para la administración intranasal u oral mediante inhalación.
Las formas de preparaciones antimicrobianas adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos revestido, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, microemulsiones, definidas como sistemas termodinámicamente estables ópticamente isotrópicos que consisten en agua, aceite y tensioactivo, fases cristalinas líquidas, definidas como sistemas que se caracterizan por una ordenación de largo alcance pero un desorden de corto alcance (los ejemplos incluyen fases laminares, hexagonales y cúbicas, continuas en agua o en aceite), o sus homólogos dispersados, geles, ungüentos, dispersiones, suspensiones, cremas, aerosoles, gotas o una disolución inyectable en forma de ampolla, y también preparaciones con una liberación prolongada de los compuestos activos, en cuya preparación se emplean habitualmente excipientes, diluyentes, adyuvantes o vehículos, tal como se describió anteriormente. La composición farmacéutica también puede proporcionarse en vendas o en suturas o similares.
Muchos cirujanos ortopédicos consideran que los seres humanos con articulaciones prostéticas podrían ser considerados para una profilaxis con antibióticos. La infección profunda tardía por S. aureus es una complicación grave que a veces conduce a la pérdida de la articulación prostética y viene acompañada de una morbilidad y mortalidad significativas. Por tanto, es posible extender el uso de la lisina de bacteriófago quimérica descrita en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO:2) como sustituto de antibióticos profilácticos, o para su uso en combinación con estos, en esta situación. La lisina de bacteriófago quimérica puede administrarse mediante inyección con un vehículo adecuado directamente al sitio del dispositivo ortopédico in situ para eliminar la infección, o sobre una superficie del dispositivo antes de la implantación. Pueden utilizarse otras vías de inyección, tales como la vía subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Otros medios alternativos para la administración incluyen la administración transmucósica y transdérmica empleando penetrantes, tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otro compuesto de la presente invención puede formularse en una formulación entérica o encapsulada, también es posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de bálsamos, pastas, geles y similares.
Antes o al mismo tiempo que la enzima se introduce en el sistema vehículo o modo de administración oral, puede resultar deseable administrar o formular un péptido quimérico descrito en la presente en un entorno de tampón estabilizante, que mantiene un intervalo de pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,5. Antes o al
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mismo tiempo que el péptido quimérico se introduce en el sistema vehículo o modo de administración oral, la enzima puede estar en un entorno de tampón estabilizante para mantener un intervalo de pH adecuado, tal como entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0, que incluye un pH de aproximadamente 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 o cualquier intervalo de pH de 0,05 entre ellos, o cualquier intervalo que sea un múltiplo de 0,05 entre ellos, que incluyen unos valores de pH de 5,2, 6,5, 7,4, 7,5 y 8,5.
Existen una serie de ventajas en utilizar enzimas líticas para tratar infecciones bacterianas. El diseño modular de las lisinas, con sus dominios catalíticos y de unión diferenciados, las convierte en ideales para experimentos de intercambio de dominios, en los que las especificidades bacterianas y las actividades catalíticas pueden mejorar o adaptarse para su uso contra patógenos alternativos. Puesto que las dianas catalíticas y de unión de las lisinas (peptidoglicanos y carbohidratos asociados, respectivamente) son en gran medida fundamentales para la viabilidad, la resistencia a la lisina será rara.
El "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o frenar (disminuir) el trastorno o afección patológica diana. Los sujetos que necesitan tratamiento incluyen los sujetos que ya presentan el trastorno, así como los sujetos que son propensos a padecer el trastorno o los sujetos en los que el trastorno debe prevenirse.
Un "mamífero", para los objetivos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de uso deportivo o mascotas, tales como perros, gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo preferiblemente son estériles. Esto se logra con facilidad mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de una liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas de la presente en general se introducen en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para disoluciones intravenosas o un vial que tiene un tapón que puede ser atravesado por una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración tópica
o por medio de sistemas de liberación sostenida. Cuando se trata una infección o exposición bacteriana, la enzima lítica puede administrarse de cualquier forma adecuada, que incluye por vía parenteral o a través de la cavidad oral
o nasal.
Las dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso concreto previsto. La determinación de la dosificación o vía de administración deseadas está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica médica. Los experimentos con animales proporcionan una orientación fiable para la determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. Puede realizarse una conversión interespecífica de las dosis eficaces siguiendo los principios indicados por Mordenti, J. y Chappell, W., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., eds., Pergamon Press, Nueva York, 1989, pp. 42-96.
Cuando se emplea la administración in vivo de un péptido de lisina quimérica, las cantidades de dosificación normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta 1000 mg/kg de peso corporal del mamífero o más diarios, o de aproximadamente 1 μg/kg/día hasta 10000 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. A continuación también se proporciona una orientación con respecto a las dosificaciones y los métodos de administración concretos, que también pueden obtenerse en la bibliografía. Se prevé que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, y la que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar un transporte diferente que el empleado para otro órgano o tejido.
Las cantidades o proporciones de dosificaciones eficaces del péptido quimérico para ser administradas por vía parenteral y la duración del tratamiento dependerán, en parte, de la gravedad de la infección, del peso del paciente, de la duración de la exposición del receptor a la bacteria infecciosa, de la gravedad de la infección y de una diversidad de otras variables. La composición puede aplicarse de una a varias veces diarias, y puede aplicarse durante un periodo de tiempo corto o largo. La utilización puede durar días o semanas. Cualquier forma de dosificación empleada debe proporcionar un número mínimo de unidades para una cantidad mínima de tiempo. La concentración de las unidades activas de un péptido quimérico que se cree que proporcionan una cantidad o dosificación eficaz de una enzima puede estar en el intervalo de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
o 100 unidades/ml hasta aproximadamente 10.000,000 unidades/ml de la composición, en un intervalo de aproximadamente 1000 unidades/ml a aproximadamente 10.000.000 unidades/ml, y de aproximadamente 10.000 a
10.000.000 unidades/ml.
Además, pueden emplearse una serie de métodos para ayudar a transportar la enzima a través de la membrana celular. La enzima puede ser transportada en un liposoma, "insertándose" la enzima en los liposomas por medio de técnicas conocidas. De modo similar, la enzima puede estar dentro de una micela inversa. La enzima también puede
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