ES2627486T3

ES2627486T3 - Biomoléculas sililadas

Info

Publication number: ES2627486T3
Application number: ES11701110.6T
Authority: ES
Inventors: Pierre Weiss; Jérome GUICHEUX; Emilie REDERSTORFF; Samia LAIB; Gildas Rethore
Original assignee: Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER); Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Nantes Université
Priority date: 2010-01-25
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2031-01-25
Also published as: EP2529226B1; EP2529226A1; US20130004460A1; WO2011089267A1; US9285360B2

Abstract

Procedimiento de preparación de un hidrogel que comprende las etapas de: a) poner en contacto una biomolécula sililada que tiene la fórmula (I) siguiente:**Fórmula** donde: - A es una biomolécula seleccionada de entre una proteína, un ácido desoxirribonucleico, un ácido ribonucleico, pectina, quitosano, ácido hialurónico y un glicolípido, - m es un número entero que varía de 1 a 6, - p y q son independientemente 0 o 1, - X es un grupo seleccionado de entre -NHCONH-, -OCONH- y -CONH- y - R1, R2 y R3 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6 con una base o un ácido en un medio acuoso; b) ajustar el pH del medio acuoso de la etapa a) a un pH de entre 3,5 y 12,4 en el cual las biomoléculas sililadas autocondensan por formación de enlaces covalentes -Si-O-Si-, y opcionalmente recuperar el hidrogel.

Description

DESCRIPCION

Biomoleculas sililadas

5 [0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento de sililacion de biomoleculas para la preparacion

de hidrogeles.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

10 [0002] El desarrollo de tecnicas quirurgicas lo menos invasivas posible es una necesidad actual en la

medicina regenerativa para reducir la morbilidad y la duracion del tiempo de hospitalizacion. En este sentido, es necesario el desarrollo de nuevas matrices inyectables. Estas matrices deberlan ser capaces de endurecer, una vez implantadas, para adquirir la forma deseada y deberlan presentar propiedades mecanicas similares a las del tejido al que se van a fijar.

15

[0003] Los hidrogeles se utilizan en muchos campos, concretamente como sustitutos de tejidos, por ejemplo,

sustitutos del hueso, o para cirugla oftalmologica. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de hidrogeles que presenten propiedades interesantes en terminos de inyectabilidad, autoendurecimiento y estabilidad.

20 [0004] En este sentido, Bourges et al. (Advances in Colloid and Interface Science 99, 215-228, 2002)

describen la preparacion de un hidrogel hecho de eter de celulosa hidrosoluble sililada (HPMC). Mas concretamente, la HPMC sililada se sintetizo por reaccion de la HPMC con 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMS). A continuacion, se preparo un hidrogel mediante introduccion de la HPMC sililada en un medio basico y neutralizacion posterior. Sin embargo, este metodo es un procedimiento de tres etapas (premezcla de HPMC y NaOH, reaccion con GPTMS y

25 enfriamiento rapido de la reaccion con acido acetico) y requiere una alta temperatura de reaccion (80-100 °C).

[0005] Sin embargo, las celulas no se adhieren bien a un hidrogel a base de HPMC sililada. Por lo tanto,

dicho hidrogel no es adecuado para celulas que requieren adhesion para su crecimiento. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de nuevos hidrogeles que puedan ser usados para todo tipo de celulas, en particular, hidrogeles a base 30 de una biomolecula distinta de la HPMC. Sin embargo, la mayorla de las biomoleculas son sensibles a la temperatura y se destruirlan o desnaturalizarlan con el uso del procedimiento a base de GPTMS descrito anteriormente, que requiere una temperatura de reaccion elevada. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de otras biomoleculas sililadas que permitan la produccion de hidrogeles.

35 Resumen de la invencion

[0006]

hidrogel.

40 [0007]

En el presente documento se describen biomoleculas sililadas

Segun un primer aspecto, se describe una biomolecula sililada que

imagen1

utiles para la preparacion de un tiene la formula (I) siguiente:

donde:

45

A es una biomolecula seleccionada de entre una protelna, un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico, pectina, quitosano, acido hialuronico y un glicolipido, m es un numero entero que varla de 1 a 6, p y q son independientemente 0 o 1,

X es un grupo seleccionado de entre -NHCONH-, -OCONH- y -CONH-, y R1, R2 y R3 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6.

[0008] Segun un segundo aspecto, se describe el procedimiento de preparacion de dicha biomolecula

sililada.

[0009] Segun un tercer aspecto, se describe el uso de una biomolecula sililada para funcionalizar la superficie

de un soporte.

5 [0010] Segun un cuarto aspecto, la invencion se ocupa de un procedimiento de preparation de un hidrogel

que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una biomolecula sililada, tal y como se define en el presente documento, con una base o un acido en un medio acuoso;

10 b) ajustar el pH del medio acuoso de la etapa a) a un pH de entre 3,5 y 12,4, en el cual las biomoleculas

sililadas autocondensan por formation de enlaces covalentes -Si-O-Si- y, opcionalmente, recuperar el hidrogel.

[0011] Segun un quinto aspecto, la invencion se refiere al hidrogel obtenible mediante el procedimiento

15 descrito anteriormente.

[0012] Segun un sexto aspecto, la invencion se ocupa del hidrogel como sustituto de un tejido biologico.

[0013] Segun un septimo aspecto, la invencion se refiere a una composition que comprende un hidrogel 20 como el descrito anteriormente en un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

[0014] Segun un octavo aspecto, la invencion se ocupa de dicha composicion para la liberation de principio activo.

25 Descripcion detallada de la invencion

[0015] Estos y otros objetivos, caracterlsticas y ventajas de la invencion se describiran en la descripcion

detallada siguiente.

30 [0016] Tal y como se ha utilizado anteriormente, y a lo largo de la descripcion de la invencion, los terminos

siguientes, a menos que se indique lo contrario, se entendera que tienen los significados siguientes:

[0017] Tal y como se usa en el presente documento, el termino "sililacion" significa introduction de una funcion sililo en dicha biomolecula, mas concretamente una funcion alcoxisilano.

35

[0018] Tal y como se usa en el presente documento, y excepto si se define de otra manera, el termino "biomolecula" significa cualquier molecula organica que es producida por un organismo vivo o que es un derivado de la misma, incluyendo moleculas polimericas grandes tales como protelnas (naturales o sinteticas), polisacaridos (naturales o sinteticos) y acidos nucleicos, as! como moleculas pequenas tales como metabolitos primarios,

40 metabolitos secundarios y productos naturales. Como ejemplos de biomoleculas, cabe hacer mention a:

45

50

derivados de llpidos tales como fosfollpidos, glicoll pidos y esteroles, mensajeros qulmicos tales como hormonas y neurotransmisores, vitaminas,

derivados del azucar tales como carbohidratos, disacaridos, oligosacaridos y polisacaridos (celulosa incluida),

protelnas (dichas protelnas contienen aminoacidos naturales y/o no estandar),

derivados de nucleotidos tales como nucleotidos y pollmeros biologicos tales como el acido desoxirribonucleico (ADN) y el acido ribonucleico (ARN),

biopollmeros tales como lignina, protelnas, ADN, ARN, oligosacaridos y polisacaridos.

[0019] Preferentemente, la biomolecula es un polisacarido o una protelna.

[0020] Tal y como se usa en el presente documento, el termino "polisacarido" significa un pollmero formado 55 por muchos monosacaridos unidos mediante enlaces glicosldicos. Se incluyen los polisacaridos naturales y

sinteticos. Ejemplos de polisacaridos son la celulosa, la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), la hidroxietilcelulosa (HEC), la carboximetilcelulosa (CMC), la pectina, el quitosano y el acido hialuronico.

[0021] Tal y como se usa en el presente documento, el termino "protelna" significa un pollmero hecho de

aminoacidos dispuestos en una cadena lineal y unidos mediante enlaces peptldicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoacidos adyacentes. Se incluyen las glicoprotelnas y las protelnas que contienen aminoacidos naturales y/o no estandar. La albumina, laminina, gelatina, fibronectina, vitronectina y el colageno son ejemplos de protelnas.

5

[0022] Tal y como se usa en el presente documento, el termino "peptido" significa tambien un pollmero hecho

de aminoacidos dispuestos en una cadena lineal y unidos por enlaces peptldicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoacidos adyacentes. Se incluyen los peptidos que contienen aminoacidos naturales y/o no estandar. Generalmente, los peptidos contienen menos de 50 aminoacidos, mientras que las protelnas contienen 10 mas de 50.

[0023] Tal y como se usa en el presente documento, un alquilo es una cadena hidrocarbonada saturada lineal

o ramificada de 1 a 6 atomos de carbono, preferentemente de 1 a 4 atomos de carbono.

15 [0024] Tal y como se usa en el presente documento, el termino “hidrogel” significa una red de cadenas

polimericas que son insolubles en agua, en las cuales el agua es el medio de dispersion.

[0025] Tal y como se usa en el presente documento, la expresion "medio acuoso" significa un medio donde el agua es el solvente principal.

20

[0026] Segun un primer aspecto, se describe una biomolecula sililada que tiene la formula (I) siguiente:

25 donde:

imagen2

30

[0027] En una realizacion, A de la biomolecula sililada se selecciona de entre un oligopeptido, una protelna,

35 un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico, pectina, acido hialuronico y un glicolipido. De hecho, estas biomoleculas son sensibles a la temperatura.

[0028] En una realizacion preferida, A de la biomolecula sililada se selecciona de entre el grupo acido hialuronico, pectina, colageno, gelatina y quitosano.

40

[0029] Segun un segundo aspecto, se describe un procedimiento de preparacion de una biomolecula sililada como la descrita anteriormente. En el presente documento se describen dos procedimientos, dependiendo de si la biomolecula usada como material de partida lleva una funcion amina o una funcion alcohol por una parte (procedimiento 1), o una funcion acido carboxllico por otra parte (procedimiento 2).

45

[0030] Se describe un procedimiento 1 de preparacion de una biomolecula sililada de formula (I) como la descrita anteriormente, que comprende la etapa de hacer reaccionar una biomolecula que lleva una funcion amina o alcohol, preferentemente seleccionada de entre una protelna, un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico, pectina, quitosano, acido hialuronico y un glicolipido con un agente de sililacion que tiene la formula (II) siguiente:

imagen3

donde:

5 - m es un numero entero que varla de 1 a 6,

- p y q son independientemente 0 o 1 y

- R1, R2 y R3 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6.

[0031] Las biomoleculas sililadas de formula (I), donde X es un grupo -NHCONH- o -OCONH-, se obtienen

10 mediante el procedimiento 1. Durante el procedimiento, la funcion amina o alcohol de la biomolecula reaccionan con la funcion isocianato del agente de sililacion de formula (II), llevando a la formacion de un enlace urea (-NHCONH-) (si la biomolecula lleva una funcion amina) o un enlace carbamato (-OCONH-) (si la biomolecula lleva una funcion alcohol) segun el esquema siguiente:

15

imagen4

imagen5

[0032] En una realizacion del procedimiento 1, la biomolecula lleva una funcion alcohol y se selecciona

20 preferentemente de entre un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico, pectina, quitosano, acido hialuronico,

un glicollpido y, opcionalmente, una protelna, donde dicha protelna comprende un grupo (por ejemplo, un aminoacido) que lleva una funcion alcohol.

[0033] En otra realizacion del procedimiento 1, la biomolecula lleva una funcion amina y se selecciona

25 preferentemente de entre una protelna, un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico y quitosano. La

biomolecula usada en el procedimiento tambien puede llevar tanto una funcion alcohol como una funcion amina, por ejemplo cuando la molecula es el quitosano.

[0034] En una realizacion preferida del procedimiento1, el agente de sililacion usado en el procedimiento es 30 el 3-isocianatopropiltrietoxisilano.

[0035] Preferentemente, cuando la molecula lleva funciones amina, parte de dichas funciones amina no estan protonadas en el medio de reaccion. De hecho, el par solitario de la amina tiene que estar disponible para atacar a la funcion isocianato.

35

[0036] La temperatura de la reaccion del procedimiento 1 no es crltica y puede variar en un amplio rango.

Generalmente, la reaccion se lleva a cabo a una temperatura de -15 °C a 40 °C, preferentemente de 0 °C a 30 °C, mas preferentemente de 15 °C a 25 °C, lo cual es ventajoso, ya que no se produce desnaturalizacion de la biomolecula. Preferentemente, el procedimiento 1 se lleva a cabo en atmosfera inerte, por ejemplo, de argon o nitrogeno.

5

[0037] Normalmente, el tiempo de reaccion es de una hora a una semana, preferentemente de doce horas a cinco dfas, mas preferentemente de uno a tres dfas.

[0038] Generalmente, el procedimiento 1 se lleva a cabo en un solvente. No hay ninguna restriccion particular 10 sobre la naturaleza del solvente que se debe usar, siempre y cuando no tenga un efecto adverso sobre la reaccion o

sobre los reactivos implicados. Se prefieren solventes organicos o mezclas de solventes organicos con una solucion acuosa, habitualmente agua. Entre los ejemplos de solventes organicos adecuados se incluyen, entre otros, el acetonitrilo, la acetona, la dimetilformamida y el dimetilsulfoxido.

15 [0039] En una realizacion, el procedimiento 1 se lleva a cabo en un solvente anhidro, tal como acetonitrilo

anhidro, acetona anhidra, dimetilformamida anhidra o dimetilsulfoxido anhidro, y en presencia de una base, preferentemente una base organica, normalmente una base organica que contiene un atomo de nitrogeno que se puede protonar, por ejemplo, trietilamina, piridina o trimetilamina.

20 [0040] En otra realizacion, el procedimiento 1 se lleva a cabo en una mezcla que comprende una solucion

acuosa y un solvente miscible en agua, tal como acetonitrilo, acetona, dimetilformamida y dimetilsulfoxido. La mezcla es preferentemente una mezcla de agua y dimetilsulfoxido. No se requiere ninguna base para esta realizacion.

[0041] En el presente documento se describe un segundo procedimiento, cuando la biomolecula usada como

25 material de partida lleva una funcion acido carboxflico o carboxilato (procedimiento 2). Por tanto, se describe un procedimiento de preparacion de una biomolecula sililada de formula (I) tal y como se ha definido anteriormente, que comprende las etapas que consisten en:

a) hacer reaccionar una biomolecula que lleva una funcion acido carboxflico o carboxilato, seleccionada

30 preferentemente de entre una protefna, pectina y acido hialuronico con clorhidrato de1-etil-3-(3-

7dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC.HCI) o con 1,1'- carbonildiimidazol (CDI) y, a continuacion,

b) anadir al medio de reaccion obtenido en la etapa a) un agente de sililacion que tiene la formula (III) siguiente:

35

imagen6

donde,

40

n es un numero entero que varfa de 1 a 6, p y q son independientemente 0 o 1 y

R1, R2 y R3 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6.

[0042] Las biomoleculas sililadas de formula (I), donde X es un grupo -CONH-, se obtienen mediante el

procedimiento 2. Durante el procedimiento 2, la funcion carboxflica de la biomolecula se activa con EDC.HCl en la 45 etapa a) y, a continuacion, reacciona con la funcion amina del agente de sililacion de formula (III), llevando a la formacion de un enlace amida (-CONH-) segun el esquema siguiente:

imagen7

[0043] Las biomoleculas preferidas para su uso como material de partida en la etapa a) del procedimiento 2 son un oligopeptido, una protelna, pectina y acido hialuronico.

5

[0044] La etapa a) del procedimiento 2 se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador, tal como N- hidroxisuccinimida.

[0045] El agente de sililacion usado en la etapa b) del procedimiento 2 es preferentemente (310 aminopropil)trietoxisilano.

[0046] Cuando se usa EDC.HCl, las etapas a) y b) del procedimiento 2 generalmente se llevan a cabo en una solucion acuosa, cuyo pH es preferentemente de 4 a 6, mas preferentemente de 4,7 a 5,3, preferentemente en agua. Cuando se usa CDI, las etapas a) y b) del procedimiento 2 generalmente se llevan a cabo en diclorometano o

15 acetonitrilo.

[0047] Las etapas a) y b) del procedimiento 2 generalmente se llevan a cabo a una temperatura de -15 °C a 40 °C, preferentemente de 0 °C a 30 °C, mas preferentemente de 15 °C a 25 °C, lo cual es ventajoso ya que no se produce desnaturalizacion de la biomolecula.

20

[0048] La etapa a) del procedimiento 2 normalmente dura de 4 h a 24 h, preferentemente de 12 h a 18 h, y la etapa b) del procedimiento 2 normalmente dura de 4 h a 24 h, preferentemente de 12 h a 18 h.

[0049] Ambos procedimientos 1 y 2 llevan a la formacion de un enlace covalente fuerte entre el agente de 25 sililacion y la biomolecula.

[0050] La concentration en peso de la biomolecula usada como material de partida en el solvente de los procedimientos 1 y 2 es generalmente del 0,01 al 30 %, preferentemente del 0,1 al 20 % y mas preferentemente del 0,5 al 15 %.

30

[0051] Ventajosamente, los procedimientos 1 y 2 se llevan a cabo sin catalizador metalico alguno, mas particularmente catalizador a base de estano.

[0052] Cuando se lleva a cabo el procedimiento 2, donde se usa EDC.HCl, el medio de reaction es 35 generalmente homogeneo. Cuando se llevan a cabo el procedimiento 1 o el procedimiento 2, donde se usa CDI, el

medio de reaccion es generalmente heterogeneo. Generalmente, se observa una suspension de la biomolecula en el solvente, la cual se puede aislar facilmente de la mezcla de reaccion, por ejemplo mediante sedimentation o centrifugation.

40 [0053] Segun un tercer aspecto, se describe el uso de dicha biomolecula sililada para funcionalizar la

superficie de un soporte.

[0054] Las funciones alcoxisilano OR1, OR2 y OR3 de la biomolecula sililada se pueden utilizar ventajosamente para anclar la biomolecula sililada a la superficie de un soporte. La superficie puede ser cualquier

45 superficie de un soporte capaz de reaccionar con una funcion alcoxisilano, por ejemplo una superficie metalica tal como una superficie de titanio o una superficie de vidrio.

[0055] Segun un cuarto aspecto, la invention se ocupa de un procedimiento de preparation de un hidrogel que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una biomolecula sililada tal y como se ha definido anteriormente con una base o un

acido en un medio acuoso;

b) ajustar el pH del medio acuoso de la etapa a) a un pH de entre 3,5 y 12,4, en el cual las biomoleculas sililadas autocondensan por formacion de enlaces covalentes -Si-O-Si- y, opcionalmente recuperar el hidrogel.

5

[0056] El medio acuoso de la etapa a) comprende una solucion acuosa y la biomolecula sililada, que puede ser soluble o no en la solucion acuosa.

[0057] Hay dos realizaciones posibles para la etapa a), dependiendo de si se usa un acido o una base.

10

[0058] Cuando la biomolecula sililada se pone en contacto con una base en un medio acuoso durante la etapa a), la funcion alcoxisilano de la biomolecula sililada se hidroliza y se convierte en una funcion silanolato. El ajuste del pH de la mezcla as! obtenida lleva a una protonacion de la funcion silanolato para dar una funcion silanol, que reacciona inherentemente con otra funcion silanol, llevando a la condensacion de las biomoleculas sililadas por

15 formacion de un enlace covalente -Si-O-Si y, por consiguiente, a la formacion del hidrogel. Preferentemente, en la etapa a) se utiliza una base inorganica, mas preferentemente un hidroxido de un metal alcalino o alcalinoterreo, tal como el hidroxido potasico o sodico. En una realizacion del procedimiento, el pH del medio acuoso durante la etapa a) es de 12 a 14, preferentemente de 12,3 a 12,9.

20 [0059] Segun una segunda realizacion, la biomolecula sililada se pone en contacto con un acido en un medio

acuoso durante la etapa a), habitualmente en un medio acuoso cuyo pH es de 1 a 3, preferentemente aproximadamente 2, por ejemplo en una solucion de HCl o en una solucion de HEPES. En estas condiciones, la funcion alcoxisilano de la biomolecula sililada se hidroliza y se convierte en una funcion silanol, que reaccionara inherentemente con otra funcion silanol, llevando a la condensacion de las biomoleculas sililadas por formacion de 25 un enlace covalente -Si-O-Si y, por consiguiente, a la formacion del hidrogel. Esta realizacion es particularmente adecuada para biomolecula sililada, donde la biomolecula es una protelna o acido hialuronico.

[0060] El procedimiento de preparacion de un hidrogel se basa, ventajosamente, en la autocondensacion de las funciones silanol simplemente mediante ajuste del pH, sin necesitar la adicion de reactivos toxicos.

30

[0061] Para llevar a cabo la etapa a) del procedimiento de preparacion de un hidrogel se prefieren las realizaciones siguientes.

[0062] Generalmente, la etapa a) dura de 10 minutos a tres dlas, preferentemente de 1 hora a 36 horas y 35 mas preferentemente de 12 horas a 24 horas. Normalmente, la etapa a) se lleva a cabo hasta que se obtiene un

medio de reaccion homogeneo.

[0063] En una realizacion, en la etapa a), la biomolecula sililada y la base o el acido se ponen ademas en contacto con una segunda biomolecula sililada de diferente naturaleza. Se produce condensacion entre dos

40 biomoleculas sililadas de diferente naturaleza, llevando a un hidrogel que comprende dos biomoleculas diferentes. Generalmente, dicha segunda biomolecula sililada lleva una funcion alcoxisilano. Habitualmente, dicha segunda biomolecula sililada tiene la formula (IV) siguiente:

OR4

M-Y-Si-ORg

OR

6 (IV)

45

donde:

M es una biomolecula,

Y es un grupo de enlace entre la biomolecula y el silano,

50 R4, R5 y r6 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6.

[0064] Preferentemente, la segunda biomolecula sililada es un polisacarido sililado, en particular un derivado de la celulosa sililado, tal como la celulosa sililada, la hidroxietilcelulosa (HEC) sililada o la HPMC sililada.

[0065] La proporcion de las dos biomoleculas sililadas puede variar en gran medida, por ejemplo, en la etapa a) se pueden usar 100 partes en peso de una primera biomolecula sililada por 1 parte en peso de una segunda biomolecula sililada o el mismo peso de ambas biomoleculas sililadas. Variando las proporciones y la naturaleza de las dos biomoleculas sililadas, la estructura y naturaleza del hidrogel se pueden modificar y adaptar facilmente

5 dependiendo del uso ulterior que se quiera dar al hidrogel y de las propiedades bioflsicas, biologicas, flsicas y qulmicas necesarias para ese uso.

[0066] En una realizacion, en la etapa a), la biomolecula sililada es una protelna sililada y la segunda biomolecula sililada esta basada en cualquier biomolecula. En una realizacion preferida, la biomolecula sililada es

10 una protelna sililada y la segunda biomolecula sililada es un polisacarido sililado, en particular un derivado de la celulosa sililado, tal como la celulosa sililada o la HPMC sililada.

[0067] En realizaciones preferidas, la etapa a) comprende la puesta en contacto de:

15 - colageno sililado con HPMC sililada (como segunda biomolecula sililada) (llevando a un hidrogel que

contiene HPMC y colageno),

- acido hialuronico sililado con HPMC sililada (como segunda biomolecula sililada) (llevando a un hidrogel que contiene HPMC y acido hialuronico),

- pectina sililada con acido hialuronico sililado (como segunda biomolecula sililada) (llevando a un

20 hidrogel que contiene pectina y acido hialuronico).

25

30

[0068] En una realizacion, la segunda biomolecula sililada se ha preparado segun el procedimiento 1 o 2,

donde la biomolecula de la segunda biomolecula sililada es de cualquier naturaleza (por ejemplo, la HPMC sililada puede ser la segunda biomolecula sililada, aunque se siga el metodo del procedimiento 1 o 2).

[0069] En otra realizacion, la segunda biomolecula sililada no se ha preparado segun los procedimientos

definidos anteriormente. Por ejemplo, la segunda biomolecula sililada se ha preparado a partir de 3- glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMS), tal y como se describe en Bourges et al. Advances in Colloid and Interface Science 99, 215-228, 2002, y la segunda biomolecula sililada tiene la formula (V) siguiente:

imagen8

donde M es una biomolecula e Y' es -O-, -NH- o -(CO)O-. Antes de su reaccion con el GPTMS, cuando la biomolecula llevaba una funcion alcohol, amina o acido carboxllico, Y' es -O-, -NH- o -(CO)O- respectivamente.

35

[0070] En una realizacion, en la etapa a), la biomolecula sililada y la base se ponen ademas en contacto con

otras dos o mas biomoleculas sililadas de diferente naturaleza. Asl, se obtiene un hidrogel que comprende al menos tres biomoleculas.

40 [0071] Para llevar a cabo la etapa b) del procedimiento de preparacion de un hidrogel se prefieren las

realizaciones siguientes.

[0072] Normalmente, la etapa b) dura de 1 min a 3 dlas, preferentemente de 20 min a 24 horas. Generalmente, la etapa b) se lleva a cabo hasta que el medio de reaccion es incapaz de fluir. Se pueden llevar a

45 cabo experimentos reologicos para determinar con exactitud el tiempo de gelificacion.

[0073] Preferentemente, durante la etapa b) se anade un agente tampon o una solucion isotonica, por ejemplo el acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico (HEPES). El uso del agente tampon o la solucion isotonica lleva a un medio de reaccion cuyo pH es de aproximadamente 7,4, es decir, el pH fisiologico.

50

[0074] En una realizacion, en la etapa b), el pH del medio acuoso se ajusta a un pH de entre 4 y 11, preferentemente de 5 a 10, mas preferentemente de 6 a 8 y mas preferentemente de 7 a 7,4.

[0075] Ademas, antes de que se produzca la gelificacion y mientras el medio es capaz de fluir (normalmente 55 en la primera hora de la etapa b)), se pueden incorporar celulas al medio. Por tanto, en una realizacion del

procedimiento, se anaden las celulas durante la etapa b). Ventajosamente, se puede obtener un hidrogel que comprende celulas.

[0076] Antes de que se produzca la gelificacion y mientras el medio es capaz de fluir, tambien se puede 5 incorporar al medio un principio activo. Por tanto, en una realizacion del procedimiento, se anade un principio activo

durante la etapa b). Ventajosamente, se puede obtener un hidrogel, que comprende un principio activo, que sera capaz de liberar dicho principio activo.

[0077] Preferentemente, las etapas a) y b) del procedimiento de preparacion de un hidrogel se llevan a cabo 10 en condiciones esteriles, en particular, cuando el uso ulterior que se pretende dar al hidrogel es para aplicaciones in

vivo o in vitro, en particular aplicaciones in vivo.

[0078] Segun un quinto aspecto, la invencion se refiere al hidrogel obtenible mediante el procedimiento descrito anteriormente.

15

[0079] Ventajosamente, las propiedades bioflsicas, biologicas, flsicas y qulmicas del hidrogel se pueden modular variando la proporcion y la naturaleza de la biomolecula sililada comprendida en el mismo.

[0080] Generalmente, resulta ventajoso que el hidrogel se pueda inyectar facilmente mediante jeringas.

20

[0081] Generalmente, el hidrogel es de autoendurecimiento. Preferentemente, el hidrogel reticula por si mismo al pH fisiologico y se puede usar, por lo tanto, en ingenierla de tejidos.

[0082] Con una eleccion sensata de la biomolecula en la que se basa el hidrogel, el hidrogel tambien es 25 biodegradable, en particular mediante metodos enzimaticos. Por ejemplo, un hidrogel que contiene acido hialuronico

se puede degradar mediante hialuronidasa y un hidrogel que contiene colageno se puede degradar mediante colagenasa.

[0083] Normalmente, el gel obtenido favorece a adhesion celular. Los hidrogeles que contienen HPMC y otra 30 biomolecula favorecen una mejor adhesion celular que un hidrogel a base de HPMC.

[0084] Se prefieren particularmente los hidrogeles que contienen dos biomoleculas diferentes. El hidrogel preferido son los que comprenden la asociacion de biomoleculas siguiente:

35

HPMC y colageno,

HPMC y acido hialuronico, HPMC y RGDS, pectina y acido hialuronico.

40 [0085] Segun un sexto aspecto, la invencion se ocupa del hidrogel como sustituto de un tejido biologico, por

ejemplo como sustituto de tejido cartilaginoso, sustituto oseo, sustituto de tejido del corazon o piel. Tambien son objeto de la presente invencion el hidrogel para su uso como sustituto de un tejido biologico, el uso del hidrogel para la preparacion de un sustituto de tejidos y el metodo de tratamiento terapeutico que comprende el uso del hidrogel como sustituto de tejidos.

45

[0086] Segun un septimo aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende un hidrogel tal y

como se ha descrito anteriormente en combinacion con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Adicionalmente, la composicion tambien puede comprender un principio activo.

50 [0087] Segun un octavo aspecto, la invencion se ocupa del uso de dicha composicion para la liberacion de un

principio activo. Tambien son objeto de la presente invencion la composicion para su uso en la liberacion de un principio activo, el uso de la composicion para la preparacion de un farmaco que libera un principio activo y el metodo de tratamiento terapeutico que comprende el uso de la liberacion del principio activo para liberar principios activos.

55

EJEMPLOS

Abreviaturas:

HPMC-Si: HPMC sililada Coll-Si: colageno sililado 5 HA-Si: acido hialuronico sililado Pec-Si: pectina sililada HBSS: solucion salina tamponada de Hank C: colagenasa H: hialuronidasa

10

EJEMPLO 1: Protocolo de silanizacion en condiciones anhidras y heterogeneas (procedimiento 1)

[0089] La poliosa, protelna o peptido liofilizado deseados se suspendieron en acetonitrilo anhidro con una proporcion en peso total del 10-15 %, 3-4 % y 0,5-1,5 % respectivamente. Se anadio a la suspension al 15 menos un equivalente de trietilamina por funcion que se debla modificar (OH o NH2). Se aplico agitacion

mecanica y burbujeo de nitrogeno (o argon) durante al menos 20 min antes de la adicion del reactivo sililado, que podia contener al menos un grupo alcoxisilano y una funcion isocianato (por ejemplo, 3- isocianatopropiltrietoxisilano). La circulacion de gas inerte y la agitacion se mantuvieron a temperatura ambiente (20-25 °C) durante varios dlas, dependiendo de la cantidad de los materiales de partida (por 20 ejemplo, 3 dlas para 8 g de biomolecula). Tras su sedimentacion o centrifugacion, se retiro el sobrenadante

y se lavo el solido o pasta residual al menos 3 veces con gran cantidad de etanol puro y, a continuacion, se seco a temperatura ambiente o bajo vaclo. Tambien se puedo recoger y lavar el solido mediante filtracion en una membrana de nylon de 0.2 pm.

25 [0090] La presencia del grupo alcoxisilano en la macromolecula modificada se detecto mediante RMN MAS

29Si en estado solido (2,5 kHz a 500 Mhz).

EJEMPLO 2: Preparacion de hidrogeles

30 Etapa 1: preparacion de la solucion basica

[0091]

Metodo A: se vertieron uno o mas de los compuestos sililados deseados obtenidos mediante el procedimiento 35 descrito anteriormente en una solucion de hidroxido sodico 0,2 M con un porcentaje total en peso de 1 a 6. Tras una noche de agitacion mecanica, las solucion o suspension viscosa resultante se transfirio a un tubo de dialisis de celulosa regenerada 6-8000 de MWCO previamente enjuagado con una solucion de hidroxido sodico 0,09 M. La solucion/suspension basica se lavo con 19 volumenes de una solucion de hidroxido sodico 0,09 M durante 18 horas y, a continuacion, con 20 volumenes de una nueva solucion de hidroxido sodico 0,09 M durante 2 horas. El pH final

40 de las soluciones de macromolecula sililada fue de 12,4. Tambien se pueden juntar una o mas de estas soluciones

en diferentes proporciones. Un ejemplo clasico fue el de mezclar 3 volumenes de una solucion de biomolecula sililada al 3 % en peso con 1 volumen de una solucion de una segunda biomolecula sililada del 1 al 6 % en peso.

Metodo B: El segundo y los compuestos sililados adicionales se anadieron directamente en estado solido a una 45 solucion basica de macromolecula preparada como se indico anteriormente (habitualmente 10-40 mg de una segunda macrobiomolecula sililada por ml de solucion de biomolecula sililada al 3 % en peso).

[0092] La solucion basica se puede esterilizar bajo radiacion UV de 254 nm durante 15min.

50 Etapa 2: adicion del tampon acido

[0093]

Se anadieron 0,5 volumenes de acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfonico (HEPES) de pH 3,6 esterilizado al 55 vapor a la solucion basica deseada preparada en la etapa 1. Se homogeneizo la mezcla usando jeringas Luer-Lock y

conectores Luer-Lock. El pH final de los hidrogeles fue de 7,4 y el tiempo de gelificacion vario entre 10 min y 24 h.

[0094] Las propiedades viscoelasticas de los hidrogeles se evaluaron mediante mediciones reologicas.

EJEMPLO 3: Ensayos de degradacion enzimatica de hidrogeles preparados a partir de biomoleculas sililadas obtenidas mediante el procedimiento descrito anteriormente.

[0095] A 1,5 ml del hidrogel preparado como se indica anteriormente se anadieron o 1,5 ml de HBSS

5 (solucion salina tamponada de Hank) por si sola, o 1,5 ml de HBSS que contenla 3 mg de colagenasa, o 1,5 ml de HBSS que contenla 1,5 mg de hialuronidasa. Las mezclas se incubaron a 37 °C.

[0096] La siguiente tabla muestra si se obtiene degradacion por adicion de colagenasa (C) o hialuronidasa

(H) al hidrogel.

Naturaleza del hidrogel: HPMC-Si 3 % en peso + Coll-Si 1 % en peso (3:1) + HEPES HPMC-Si 3 % en peso + HA- Si 6 % en peso (3:1) + HEPES HPMC-Si 3 % en peso + Pec- Si 4 % en peso (3:1) + HEPES Pec-Si 4 % en peso + HA-Si 6 % en peso (3:1) + HEPES Pec-Si 4 % en peso + HEPES

Solucion anadida: C H H H H

Degradacion enzimatica: si si si si si

EJEMPLO 4: Ensayos de degradacion enzimatica de hidrogeles preparados a partir de una biomolecula sililada obtenida mediante un procedimiento segun la bibliografia y, opcionalmente, a partir de otra biomolecula sililada 15 obtenida mediante el procedimiento descrito anteriormente.

[0097] Ejemplos de hidrogeles hechos con la HPMC sililada obtenida mediante un protocolo de silanizacion precedente (vease Bourges et al. (Advances in Colloid and Interface Science 99, 215-228, 2002) que fue basicamente como sigue: heptano/1-propanol, lentejas de NaOH, 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano, calentamiento a 80

20 °C durante 3 horas, enfriamiento rapido con acido acetico glacial, lavado con agua/acetona y liofilizacion. Se obtuvieron Coll-Si, HA-Si y Pec-Si mediante el procedimiento descrito anteriormente, tal y como se ilustra en el ejemplo 1.

[0098] La siguiente tabla muestra si se obtiene degradacion por adicion de colagenasa (C) o hialuronidasa 25 (H) al hidrogel.

Naturaleza del hidrogel: HPMC-Si 3 % en peso + HEPES (ejemplo comparativo) HPMC-Si 3 % en peso + HEPES (ejemplo comparativo) HPMC-Si 3 % en peso+ Coll-Si 1 % en peso (3:1) + HEPES HPMC-Si 3 % en peso + HA-Si 6 % en peso (3:1) + HEPES HPMC-Si 3 % en peso + Pec-Si 4 % en peso (3:1) + HEPES

Solucion anadida: C H C H H

Degradacion enzimatica: No No Si Si si

30 [0099] Los ejemplos 3 y 4 muestran que la presencia de biomoleculas tales como colageno, acido hialuronico

o pectina (enlace a 1-4 glicosldico) en hidrogeles a base de HPMC (enlace p 1-4 glicosldico) induce propiedades de degradacion enzimatica.

EJEMPLO 5: Ensayos in vitro: morfologia y adhesion celular 35

• Ejemplo de protocolo para un cultivo 2D:

[0100] Se prepararon los hidrogeles tal y como se ha descrito anteriormente y, antes de alcanzar su tiempo

de gelificacion, se vertieron 0,3 ml de cada mezcla directamente en un pocillo de una placa multipocillo de 24 40 pocillos con superficie de adherencia ultrabaja. Una vez que los hidrogeles estaban bien reticulados, se anadieron

0,5 ml de un medio de cultivo clasico a cada pocillo y se dejaron al menos una noche para que pudieran difundir al hidrogel. A continuacion, se sustituyo el medio de cultivo de cada pocillo por 0,5 ml de medio de cultivo que contenla aproximadamente 20 000 celulas (por ejemplo, MC3T3). Se evaluo la morfologla y viabilidad de las celulas mediante ensayos “live/dead” y analisis por microscopla optica (celulas vivas en verde y celulas muertas en rojo). El medio de 5 cultivo se cambio cada 2 dlas y las observaciones se produjeron, generalmente, a las 5 h, 24 h, 48 h, 7 dlas y a veces mas.

[0101] No se observo adhesion celular al hidrogel de HPMC sililado, independientemente del protocolo de silanizacion utilizado, el de Bourges et al. (Advances in Colloid and Interface Science 99, 215-228, 2002) o el

10 protocolo segun la invencion. Aunque la HPMC-Si obtenida con los dos procedimientos distintos presenta propiedades flsico-qulmicas diferentes, su respuesta biologica es similar.

[0102] Pero cuando el hidrogel se mezcla con algun colageno o acido hialuronico sililado, las celulas tienden a estirarse y pegarse a la superficie del hidrogel tras la renovacion del medio de cultivo. Al contrario que el hidrogel

15 de HPMC sililada, la pectina sililada favorecio la adhesion celular y, cuando se combinaba con algun acido hialuronico sililado, esta propiedad parecla aumentar.

• Ejemplos de protocolo para un cultivo 3D:

20 [0103] Se prepararon los hidrogeles tal y como se ha descrito previamente y, antes de alcanzar su tiempo de

gelificacion, la cantidad de hidrogel se dividio a partes iguales entre las 2 jeringas usadas para hacer la mezcla. Se introdujeron con una pipeta unos pocos pl del medio de cultivo que contenla las celulas en una de las jeringas. Las celulas se dispersaron al hidrogel mediante conexion de las 2 jeringas con un conector Luer-Lock. La concentracion final de celulas fue de aproximadamente 1.106 celulas por ml de hidrogel. Una vez homogeneizada, se vertieron 0,3 25 ml de la mezcla en un pocillo de un plato de 24 pocillos y, una o dos horas despues, se anadieron 0,5 ml de medio de cultivo. El medio de cultivo se cambio cada dos dlas y se evaluo la morfologla y viabilidad de las celulas del mismo modo que con los cultivos 2D.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de preparacion de un hidrogel que comprende las etapas de:

5 a) poner en contacto una biomolecula sililada que tiene la formula (I) siguiente:

imagen1

donde:

10

- A es una biomolecula seleccionada de entre una protelna, un acido desoxirribonucleico, un acido

ribonucleico, pectina, quitosano, acido hialuronico y un glicollpido,

- m es un numero entero que varla de 1 a 6,

- p y q son independientemente 0 o 1,

15 - X es un grupo seleccionado de entre -NHCONH-, -OCONH- y -CONH- y

- R1, R2 y R3 representan independientemente cada uno un grupo alquilo C1-C6 con una base o un acido en

un medio acuoso;

b) ajustar el pH del medio acuoso de la etapa a) a un pH de entre 3,5 y 12,4 en el cual las biomoleculas sililadas 20 autocondensan por formacion de enlaces covalentes -Si-O-Si-, y opcionalmente recuperar el hidrogel.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, donde A se selecciona de entre el grupo que consiste en

acido hialuronico, pectina, colageno, gelatina y quitosano.

25 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, donde en la etapa a), la biomolecula sililada y la base o el

acido se ponen ademas en contacto con una segunda biomolecula sililada de diferente naturaleza.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, donde la segunda biomolecula sililada es un polisacarido sililado.

30
5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, donde hidroxietilcelulosa sililada o hidroxipropilmetilcelulosa sililada.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 3, donde 35 sililada tal y como se define en la reivindicacion 1.
7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde se anaden celulas durante la etapa b).

40 8. Hidrogel obtenible mediante el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Hidrogel segun la reivindicacion 8 como substituto de un tejido biologico.
10. Composicion que comprende un hidrogel segun la reivindicacion 9 en combinacion con un vehlculo

45 farmaceuticamente aceptable.
11. Uso de una composicion segun la reivindicacion 10 para la liberation de un principio activo.

el segundo polisacarido sililado es celulosa sililada, la segunda biomolecula sililada es una biomolecula