ES2627671T3 - Promotores de Zymomonas de alta expresión - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en un promotor del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis que comprende la sustitución de una base en una posición seleccionada del grupo que consiste en una T reemplazando G en la posición 116, una T reemplazando C en la posición 217, o tanto una T reemplazando G en la posición 116 como una T reemplazando C en la posición 217; en donde los números de posición son con respecto a SEQ ID NO:1 y en donde el promotor resultante es un promotor mejorado que tiene una expresión aumentada.
Description
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DESCRIPCION
Promotores de Zymomonas de alta expresion Referencia cruzada a la solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente U.S. No. 61/039871 presentada el 27 de Marzo de 2008.
Declaracion de derechos del gobierno
Esta invencion se hizo con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo los Contratos Nos. 04-03-CA-70224 y DE-FC36-03GO13146 otorgados por el Departamento de Energfa. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invencion. Ademas, el gobierno de los Estados Unidos tiene derechos en esta invencion bajo el Contrato No. DE-AC36-99GO10337 entre el Departamento de Energfa de los Estados Unidos y el Laboratorio Nacional de Energfa Renovable, una division del Instituto de Investigacion del Medio Oeste.
Campo de la Invencion
La invencion se refiere a los campos de microbiologfa e ingeniena genetica. Mas espedficamente, se identificaron nuevos promotores para dirigir la expresion de genes quimericos en bacterias.
Antecedentes de la invencion
La produccion de etanol por microorganismos proporciona una fuente de energfa alternativa a los combustibles fosiles y es por lo tanto un area importante de investigacion actual. Se desea que los microorganismos que producen etanol, asf como otros productos utiles, sean capaces de utilizar xilosa como una fuente de carbono ya que la xilosa es la pentosa mayoritaria en materiales lignocelulosicos hidrolizados, y puede proporcionar por tanto un sustrato de carbono abundantemente disponible y de bajo costo. Zymomonas mobilis y otros etanologenos bacterianos que no utilizan naturalmente xilosa pueden ser modificados geneticamente para la utilizacion de xilosa mediante la introduccion de genes que codifican 1) xilosa isomerasa, que cataliza la conversion de xilosa a xilulosa; 2) xilulocinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa 5-fosfato; 3) transcetolasa; y 4) transaldolasa.
El gen que codifica la gliceraldetndo-3-fosfato dehidrogenasa se aislo a partir de una librena de fragmentos de DNA de Zymomonas mobilis al complementar una cepa deficiente de Escherichia coli. Contuvo promotores en tandem que fueron reconocidos por E. coli pero paredan funcionar menos eficazmente que el promotor enterico de lac en E. coli (Conway y colaboradores. Journal of Bacteriology, American Society for Microbiology, US, Vol. 169, no. 12, 1 Diciembre 1987). Ha habido exito en la ingeniena de cepas de Z. mobilis para el metabolismo de la xilosa (Documentos de Patente US 5514583, US 5712133, US 6566107, WO 95/28476, Feldmann y colaboradores. (1992) Appl Microbiol Biotechnol 38: 354-361, Zhang y colaboradores. (1995) Science 267: 240-243), asf como una cepa de Zymobacter palmae (Yanase y colaboradores. (2007) Appl. Environ. Microbiol. 73: 2592-2599). Sin embargo, tfpicamente las cepas modificadas no crecen y producen etanol tanto en xilosa como en glucosa. Para esta modificacion, los genes que codifican las protemas heterologas para el metabolismo de xilosa se han expresado a partir de promotores que son activos en celulas de Z. mobilis, tfpicamente el promotor del gen de la gliceraldetndo-3- fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis o el promotor del gen enolasa de Z. mobilis. Las cepas modificadas para la utilizacion de xilosa se han adaptado mediante un paso en serie sobre un medio de xilosa, dando como resultado cepas con utilizacion de xilosa mejorada como se describe en el Documento de Patente U.S.Pat. 7,223,575 y la solicitud de Patente de propiedad comun y en tramite U.S. No. US20080286870. Sin embargo las bases geneticas para la mejora no se han determinado.
Sigue existiendo la necesidad de cepas geneticamente modificadas de Zymomonas, y otros etanologenos bacterianos, que tengan una utilizacion de la xilosa mejorada. Los solicitantes han descubierto promotores mutantes que tienen una actividad aumentada que se pueden utilizar para expresar genes de utilizacion de xilosa, actividad que confiere a las cepas modificadas que comprenden estos promotores la utilizacion de xilosa mejorada. Los promotores se pueden utilizar para la expresion de otros genes.
Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a promotores mutantes aislados para la expresion de genes, es decir, genes quimericos en Zymomonas, Zymobacter, y bacterias relacionadas que dirigen niveles mas altos de expresion genica que los niveles dirigidos por el promotor natural del gen de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis (Pgap). Los promotores mutantes son derivados del promotor del gen de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa y tienen una actividad aumentada debido a la presencia de mutaciones espedficas. Los promotores se pueden utilizar en modificaciones geneticas para la expresion de una region codificante o de un RNA regulador. La expresion de una region codificante para la xilosa isomerasa dirigida por estos promotores condujo a un crecimiento mejorado de Zymomonas mobilis que utilizan xilosa en el medio que contiene xilosa.
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Se describe aqu una molecula de acido nucleico aislada que comprende un promotor del gen de la gliceraldehndo-3- fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis que tiene una sustitucion de nucleotidos en una posicion seleccionada de un grupo que consiste en la posicion -190, la posicion -89, o ambas posiciones -190 y -89; en donde los numeros de posicion son con respecto al codon de iniciacion de traduccion ATG natural para la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa en las cepas CP4 y ZM4 de Z. mobilis.
Tambien se describe aqu lo siguiente: un gen quimerico que comprende la molecula de acido nucleico aislada descrita anteriormente y unida operativamente a una molecula de acido nucleico heterologa; un vector que comprende la molecula de acido nucleico descrita anteriormente y un metodo de modificacion genetica de una celula bacteriana que comprende introducir en la celula la molecula de acido nucleico descrita anteriormente.
Breve descripcion de las figuras y descripciones de las secuencias
Las diversas realizaciones de la invencion se pueden entender mas plenamente a partir de la siguiente descripcion detallada, las figuras, y las descripciones de las secuencias adjuntas, que forman una parte de esta solicitud.
La Figura 1 muestra las estrategias para los ensayos enzimaticos de transcetolasa (A), transaldolasa (B), xilosa isomerasa (C), y xilulocinasa (D).
La Figura 2 muestra una grafica de las actividades de la xilosa isomerasa (XI) y xilulocinasa (XK) en las lmeas T2C, T3C, T4C, y T5C transformadas con PgapxylAB.
La Figura 3 muestra una grafica de las actividades de la transaldolasa (TAL) y transcetolasa (TKT) en las lmeas T2C, T3C, T4C y T5C transformadas con PgapxylAB.
La Figura 4 muestra una grafica del % de rendimiento teorico de etanol y del % de utilizacion de xilosa de colonias de cepas adaptadas seleccionadas que utilizan xilosa.
La Figura 5 muestra una grafica del crecimiento de cepas adaptadas que utilizan xilosa a 70 h en RM (medio rico) con un 5% de xilosa (RMX5%) antes y despues de crecer 50 generaciones en RM con 5% de glucosa (RMG).
La Figura 6 muestra los mapas de plasmidos de (A) pZB188; (B) pZB188/aadA; y (C) pZB188/aadA-GapXylA; asf como (D) una representacion esquematica del casete de expresion PgapXylA de la xilosa isomerasa de E. coli.
La Figura 7 muestra los mapas de plasmidos de (A) pMODTM-2-<MCS>; (B) pMOD- enlazador; y (C) pMOD- enlazador-Spec.
La Figura 8 muestra el mapa del plasmido de pLDHSp-9WW.
La Figura 9 muestra el mapa del plasmido del pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA.
La Figura 10 muestra los mapas de plasmidos (A) pMOD-enlazador-Spec-801 GapXylA; (B) pZB188/aadA-GapXylA; y (C) pZB188/aadA-801GapXylA.
La Figura 11 muestra una grafica de las curvas de crecimiento (OD600 frente al tiempo) en medios que contienen xilosa para las tres cepas que albergan el plasmido de expresion Pgap de la xilosa isomerasa de E. coli (X1, X2 y X2) y las tres cepas que albergan el plasmido de control (C1, C2 y C3).
La Figura 12 muestra la grafica de las curvas de crecimiento (OD600 versus tiempo) de las cepas ZW641, ZW658, X1 y C1 en medios que contienen xilosa sin espectinomicina trazada en (A) en una escala lineal, y en (B) en una escala logantmica.
La Figura 13 muestra las graficas de las curvas de crecimiento (OD600 versus tiempo) de tres cepas con 801Pgap- XylA integrado (#8-2, #8-4, #8-5) y de tres cepas con 641Pgap-XylA integrado (#6-1, #6-3, #6-5) comparado con la cepa ZW658, trazado en (A) en una escala lineal, y en (B) en una escala logantmica.
La Figura 14 muestra el mapa de un plasmido de pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL.
La Figura 15 muestra los mapas de plasmidos de (A) pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL; (B) pZB188aadA-641 GapRPI; y (C) pZB188aadA-801GapRPI.
La Figura 16 muestra un gel de protema tenido de las protemas de celulas enteras a partir de cepas con diferentes promotores que expresan RPI.
La invencion se puede comprender mas plenamente a partir de la siguiente descripcion detallada y de las descripciones de las secuencias adjuntas que forman parte de esta solicitud.
Las siguientes secuencias se ajustan a 37 C.F.R.1.821-1.825 (“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules”) y son consecuentes con la norma ST.25 (1998) de la Organizacion Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO) y los requisitos del listado de
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secuencias de la EPO y PCT (Normas 5.2 y 49.5 (a.bis), y la Seccion 208 y Anexo C de las instrucciones administrativas). Los sfmbolos y el formato utilizado para los datos de secuencias de nucleotidos y aminoacidos cumplen con las normas expuestas en 37 C.F.R. §1.822.
SEQ ID NO:1 es la secuencia de nucleotidos de la ZmPgap de la cepa CP4 de Z. mobilis.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de nucleotidos de la ZmPgap de la cepa ZM4 de Z. mobilis.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de nucleotidos de la ZmPgap de pZB4, que esta tambien en el operon PgapxylAB de las cepas ZW641 y 8XL4.
SEQ ID NO:4 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado de la cepa ZW658.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado de la cepa 8b.
SEQ ID NO:6 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con ambas mutaciones en -190 (ZW658) y -89 (8b) en la variante pZB4 de Pgap.
SEQ ID NO:7 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con la mutacion en -190 de ZW658 en la variante CP4 de Pgap.
SEQ ID NO:8 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con la mutacion en -89 de 8b en la variante CP4 de Pgap.
SEQ ID NO:9 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con ambas mutaciones en -190 (ZW658) y -89 (8b) en la variante CP4 de Pgap.
SEQ ID NO:10 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con la mutacion en -190 de ZW658 en la variante ZM4 de Pgap.
SEQ ID NO:11 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con la mutacion en -89 de 8b en la variante ZM4 de Pgap.
SEQ ID NO:12 es la secuencia de nucleotidos del Pgap mejorado con ambas mutaciones en -190 (ZW658) y -89 (8b) en la variante ZM4 de Pgap.
SEQ ID NOs:13 y 14 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene el promotor del gen de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (Pgap) del pZB4.
SEQ ID NOs:15 y 16 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene una region codificante tal del pZB4.
SEQ ID NOs:17 y 18 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene Pgaptal del Pgap y fragmentos tal.
SEQ ID NOs:19 y 20 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene loxP::Cm del pZB186.
SEQ ID NO:21 es la secuencia de nucleotidos completa para el plasmido pMODPgaptaltktCm.
SEQ ID NOs:22 y 23 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA de 3 kb que contiene las regiones codificantes tal y tkt en transformantes que reciben pMODPgaptaltktCm.
SEQ ID NO:24 es la secuencia de nucleotidos completa para el plasmido pMODPgapxylABC.
SEQ ID NOs:25 y 26 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento PgapxylA de DNA de 1,6 kb de los integrantes T2C, T3C, T4C y T5C con pMODPgapxylABCm.
SEQ ID NOs:27 y 28 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene la Pgap de ZW641 y ZW658.
SEQ ID NOs:29-31 son las secuencias de nucleotidos para los cebadores para secuenciar el Pgap de ZW641 y ZW658.
SEQ ID NOs:32 y 33 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene un casete Spec1".
SEQ ID NO:34 es la secuencia de nucleotidos completa del casete de expresion PgapXylA de la xilosa isomerasa.
SEQ ID NOs:35 y 36 son las secuencias de nucleotidos de oligonucleotidos utilizadas para sustituir un sitio de multi- clonacion diferente en pMOD2-<MCS>.
SEQ ID NOs:37 y 38 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de las regiones PgapXylA de las cepas ZW801-4 y ZW641 para la insercion en pMOD-enlazador-Spec para rendir plasmidos 5 PMOD-espaciador-Spec-801 GapXylA y pMOD-espaciador-Spec-641 GapXylA, respectivamente.
SEQ ID NOs:39 y 40 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de Pgap de pZB188/aadA-641 GapXylA y que incluyen las 15 primeras bp del marco de lectura abierto RpI de Z. mobilis.
SEQ ID NOs:41 y 42 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion del marco de lectura abierto RPI de Z. mobilis.
10 SEQ ID NO:43 es la secuencia de nucleotidos completa del casete de expresion RPI que esta en el plasmido pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL.
SEQ ID NOs:44 y 45 son las secuencias de nucleotidos de los cebadores para la amplificacion de un fragmento de DNA que contiene el Pgap de 8XL4 y 8b.
SEQ ID NO:46 es la secuencia de nucleotidos de un cebador para secuenciar el Pgap de 8XL4 y 8b.
15 SEQ ID NO:47 es la secuencia de nucleotidos de una parte de ZmPgap de CP4, ZM4, y pZB4 con SEQ ID Nos:1, 2, y 3, respectivamente, que contiene la posicion -190.
SEQ ID NO:48 es la secuencia de nucleotidos de una parte de ZmPgap de CP4, ZM4, y pZB4 con SEQ ID Nos:1, 2, y 3, respectivamente, que contiene la posicion -89.
Descripcion detallada de la invencion
20 Se describen aqrn nuevos promotores que se pueden utilizar par la expresion de genes quimericos en celulas bacterianas. Los solicitantes han descubierto que cada una de las dos mutaciones diferentes del promotor del gen de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis incrementan por separado el nivel de expresion dirigido por el promotor. Una mutacion esta en la posicion -190, y la segunda mutacion esta en la posicion -89, ambas con respecto al codon de iniciacion de traduccion ATG natural para la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa en las 25 cepas CP4 y ZM4 de Z. mobilis. Un promotor del gen de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis que contiene una o ambas de estas mutaciones se puede utilizar para la expresion de heterologos, operativamente unido a secuencias de DNA en celulas bacterianas.
Las siguientes abreviaciones y definiciones se utilizaran para la interpretacion de la especificacion y de las reivindicaciones.
30 Como se usa aqrn, los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “tiene”, “que tiene”, “contiene”, o “que contiene”, o cualquier otra variacion de los mismos, se destinan a cubrir una inclusion no exclusiva. Por ejemplo, una composicion, una mezcla, procedimiento, metodo, artfculo, o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente a esos elementos solamente sino que pueden incluir otros elementos no listados expresamente o inherentes a tal composicion, mezcla, procedimiento, metodo, artfculo, o 35 aparato. Ademas, a menos que se indique explfcitamente lo contrario, “o” se refiere a un inclusivo o y no un exclusivo o. Por ejemplo, una condicion A o B se satisface por una cualquiera de las siguientes: A es verdadera (o presente) y B es falsa (o no presente), A es falsa (o no presente) y B es verdadera (o presente), y ambos A y B son verdaderas (o presentes).
Ademas, los artfculos indefinidos “un” y “un” que preceden a un elemento o componente de la invencion estan 40 destinados a no ser restrictivos con respecto al numero de instancias (es decir, ocurrencias) del elemento o componente. Por tanto “un” o “un” se debena leer para incluir uno o al menos uno, y la forma de palabra singular del elemento o componente incluye tambien el plural a menos que el numero este, obviamente, destinado a ser singular.
“Gen” se refiere a un fragmento de acido nucleico que expresa una protema espedfica o una molecula de RNA funcional, que puede incluir secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y que siguen 45 (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. “Gen nativo” o “gen de tipo nativo” se refieren a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. “Gen quimerico” se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. De acuerdo con esto, un gen quimerico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la 50 misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. “Gen endogeno” se refiere a un gen nativo en su ubicacion natural en el genoma de un organismo. Un gen “extrano” se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huesped, pero que se introducen en el organismo huesped por transferencia genetica. Los genes extranos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quimericos.
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El termino “construccion genetica” se refiere a un fragmento de acido nucleico que codifica la expresion de una o mas protemas espedficas o moleculas de RNA funcionales. En la construccion genetica el gen puede ser nativo, quimerico, o de naturaleza extrana. ^picamente una construccion genetica comprendera una “secuencia codificante”. Una “secuencia codificante” se refiere a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoacidos espedfica.
“Promotor” o “regiones de control de la inciacion” se refieren a una secuencia de DNA capaz de controlar la expresion de una secuencia codificante o RNA funcional. En general, una secuencia codificante se localiza en 3' con respecto a la secuencia del promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de DNA sintetico. Los expertos en la tecnica entenderan que diferentes promotores pueden dirigir la expresion de un gen en diferentes tejidos o tipos de celulas, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayona de tipos de celulas en la mayona de los casos se denominan normalmente “promotores constitutivos”.
El termino “expresion”, como se utiliza aqm, se refiere a la transcripcion y acumulacion estable de RNA codificante (mRNA) o RNA funcional derivado de un gen. La expresion tambien puede referirse a la traduccion de mRNA en un polipeptido. La “inhibicion antisentido” se refiere a la produccion de transcritos de RNA antisentido capaces de suprimir la expresion de la protema objetivo. La “sobreexpresion” se refiere a la produccion de un producto genico en organismos transgenicos que excede los niveles de produccion en organismos normales o no transformados. La “co- supresion” se refiere a la produccion a la produccion de trascritos de RNA con sentido o fragmentos capaces de suprimir la expresion de genes extranos o endogenos identicos o sustancialmente similares (Documento de Patente U.S. 5,231,020).
El termino “RNA mensajero (mRNA)” como se utiliza aqm, se refiere al RNA que no tiene intrones y que puede traducirse en protema por la celula.
El termino “transformacion” como se utiliza aqm, se refiere a la transferencia de un fragmento de acido nucleico en un organismo huesped, dando como resultado una herencia geneticamente estable. El acido nucleico transferido puede estar en forma de un plasmido mantenido en la celula huesped, o algunos de los acido nucleicos transferidos pueden estar integrados en el genoma de la celula huesped. Los organismos huespedes que contienen los fragmentos de acido nucleico transformados se denominan organismos “transgenicos” o “recombinantes” o “transformados”.
Los terminos “plasmido” y “vector” como se utilizan aqm, se refieren a un elemento cromosomico adicional que lleva a menudo genes que no forman parte del metabolismo central de la celula, y normalmente en forma de moleculas circulares de DNA de doble cadena. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicacion automatica, secuencias de genomas de integracion, secuencias de fagos o nucleotidos, lineares o circulares, de DNA o RNA de cadena sencilla o doble cadena, derivados de cualquier fuente, en los que un numero de secuencias de nucleotidos se han unido o recombinado en una construccion unica que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de DNA para un producto genico seleccionado junto con una secuencia 3' no traducida apropiada dentro de una celula.
El termino “operativamente unido” se refiere a la asociacion de las secuencias de acidos nucleicos en un unico fragmento de acido nucleico de modo que la funcion de uno es afectada por la del otro. Por ejemplo, un promotor esta operativamente unido con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresion de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante esta bajo el control transcripcional del promotor). La secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a las secuencias reguladoras con orientacion con sentido o antisentido.
El termino “marcador seleccionable” significa un factor de identificacion, normalmente un antibiotico o un gen de resistencia qmmica, que puede seleccionarse basandose en el efecto del gen marcador, es decir, resistencia a un antibiotico, en donde el efecto se utiliza para rastrear la herencia de un acido nucleico de interes y/o para identificar una celula u organismo que ha heredado el acido nucleico de interes.
El termino “heterologo” significa que no se encuentra naturalmente en la ubicacion de interes. Por ejemplo, un gen heterologo se refiere a un gen que no se encuentra naturalmente en un organismo huesped, pero que se introduce en el organismo huesped por transferencia genica. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico heterologa que esta presente en un gen quimerico es una molecula de acido nucleico que no se encuentra naturalmente asociada con los otros segmentos del gen quimerico, tales como las moleculas de acido nucleico que tienen una region codificante y segmentos del promotor que no estan naturalmente asociados entre sf.
Como se usa aqm, una “molecula de acido nucleico aislada” es un polfmero de RNA o DNA que es de cadena sencilla o doble cadena, que contiene opcionalmente bases de nucleotidos sinteticos, no naturales o alterados. Una molecula de acido nucleico aislada en la forma de un polfmero de DNA puede comprender uno o mas segmentos de cDNA, DNA genomico o DNA sintetico.
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Los terminos “gen promotor de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenas de Z. mobilis" y “ZmPgap” se refieren a una molecula de acido nucleico con actividad promotora que tiene una secuencia de nucleotidos que ocurre naturalmente en la secuencia anterior a la region codificante de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa del genoma de Z. mobilis. Estos terminos se refieren a los promotores de las cepas de Z. mobilis tales como las cepas CP4 y ZM4 (SEQ ID NOs:1 y 2 respectivamente) y las variantes en la secuencia y/o longitud que dirigen la expresion a un nivel que no es sustancialmente diferente, tal como el ZmPgap de pZB4 (SEQ ID NO:3).
El DNA recombinante estandar y las tecnicas de clonacion molecular utilizadas aqrn son bien conocidas en la tecnica y estan descritas por Sambrock, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (en adelante “Maniatis”); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1984; y por Ausubel, F. M. y colaboradores, In Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing and Wiley Interscience, 1987.
Descubrimiento de los promotores del gen de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa mejorada
Un promotor natural del gen de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis (ZmPgap o Pgap) se ha utilizado para la expresion de genes quimericos en Zymomonas mobilis y Zymobacter palmae. Cuando se ha utilizado ZmPgap para expresar genes para el metabolismo de xilosa, la utilizacion de la xilosa resultante no ha sido tfpicamente tan eficaz como se deseaba. Una cepa de Z. mobilis recombinante modificada para expresar las cuatro enzimas del metabolismo de xilosa (xilosa isomerasa, xilulocinasa, transcetolasa, y transaldolasa) con capacidad limitada de utilizacion de xilosa se adapto ademas en un medio de xilosa para la utilizacion de xilosa mejorada (descrito en la solicitud de Patente de propiedad comun y en tramite U.S. No. US20080286870).
Los solicitantes han descubierto, como se describe aqrn en el ejemplo 3, que la cepa mejorada que utiliza xilosa llamada ZW658 (ATCC # PTA-7858) ha aumentado la expresion de los enzimas de la xilosa isomerasa y
xilulocinasa que estaban integrados en el genoma como un operon expresado a partir de ZmPgap (operon PgapxylAB). Los solicitantes han descubierto ademas que hay un unico cambio de un nuevo nucleotido en el promotor del operon PgapxylAB que es responsable de que el promotor dirija una expresion incrementada de las regiones codificantes unidas operativamente. El cambio de nucleotido es nuevo con respecto a la secuencia del Pgap del operon PgapxylAB en la cepa ZW658 en comparacion con la secuencia del ZmPgap del operon PgapxylAB en una cepa precursora de ZW658 que no tiene las actividades de la xilosa isomerasa y xilulicinasa incrementada. Asf el Pgap que tiene este unico cambio de nucleotido es un promotor mejorado.
Los solicitantes han descubierto ademas que la cepa de Z. mobilis que fue modificada por separado con los genes que codifican las cuatro enzimas de utilizacion de xilosa y adaptada por separado para la utilizacion de xilosa mejorada (cepa 8b, descrita en el Documento de Patente U.S. Pat. No. 7,223,575) tambien ha aumentado la expresion de los enzimas de xilosa isomerasa y xilulocinasa que estaban integradas en el genoma como un operon PgapxylAB. Los solicitantes han descubierto ademas que hay un unico cambio de un nuevo nucleotido en el Pgap del operon PgapxylAB_en la cepa 8b que esta en una posicion diferente que el cambio de nucleotido del Pgap del ZW658. Basandose en la expresion aumentada de las enzimas de xilosa isomerasa y xilulocinasa codificadas por el operon PgapxylAB, el mutante Pgap del operon PgapxylAB proporciona tambien un promotor mejorado.
Los cambios de nuevos nucleotidos identificados en el Pgap de los operones PgapxylAB de la cepa ZW658 y 8b estan en las posiciones -190 y -89, respectivamente, con respecto al codon de iniciacion de traduccion ATG natural para la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa en las cepas CP4 y ZM4 de Z. mobilis. El cambio de nucleotidos descubierto en la posicion -190 es de G a T, y en la posicion -89 es de C a T.
El contexto de la secuencia de los cambios de base es el factor importante, ya que el numero de posicion puede cambiar debido a las variaciones de la secuencia.
La posicion -190 esta en el contexto de la secuencia:
AACGGTATACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGATGTTTTT (SEQ ID NO:47)
donde la G negrita y subrayada es la base cambiada a T por la mutacion. Esta posicion es -190 en la secuencia de ZmPgap de las cepas CP4 y ZM4, pero la posicion -189 en pZB4 ya que en la secuencia del promotor en pZB4 hay una delecion de T en la posicion -21. La posicion -190 se refiere al nucleotido G en la posicion 116 en SEQ ID NO:1.
La posicion -89 esta en el contexto de la secuencia:
CGGCATCACGAACAAGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTCGGC (SEQ ID NO:48)
donde la C negrita y subrayada es la base cambiada a T por la mutacion. Esta posicion es -89 en la secuencia de ZmPgap de las cepas CP4 y ZM4, pero la posicion -88 en pZB4 ya que en la secuencia del promotor en pZB4 hay una delecion de T en la posicion -21. La posicion -89 se refiere al nucleotido C en la posicion 217 en SEQ ID NO:1. Los promotores de la presente invencion tienen un cambio de nucleotido en ZmPgap en la posicion -190, en la
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posicion -89, o en ambas de estas posiciones. Los cambios son un cambio de G a T en la posicion -190 y un cambio de C a T en la posicion -89. Los presentes promotores que comprenden estas modificaciones son Pgaps mejorados.
Los cambios de otros nucleotidos en las posiciones -190 y -89 pueden proporcionar una actividad mejorada de ZmPgap. Ademas, los cambios de nucleotidos en otras posiciones dentro de ZmPgap pueden proporcionar una actividad mejorada de promotores.
La secuencia que ocurre naturalmete de ZmPgap no es una secuencia unica, sino que puede tener alguna variacion en la secuencia que no tiene un efecto sustancial en la funcion del promotor. Que no tenga un efecto sustancial en la funcion del promotor significa que la secuencia del promotor dirige un nivel de expresion que es sustancialmente similar al nivel de expresion dirigido por un ZmPgap presente en una cepa natural de Zymomonas mobilis. La variacion en la secuencia puede ocurrir naturalmente entre diferentes aislamientos o cepas de Zymomonas mobilis, tales como la diferencia entre las cepas CP4 y ZM4 en la posicion -29 con respecto al codon de iniciacion de traduccion de ATG natural para la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (SEQ ID NOs:1 y 2, respectivamente), donde en CP4 hay una A y en ZM4 hay una G.
Ademas de las variaciones de la secuencia natural, los cambios de nucleotidos que no afectan sustancialmente a la funcion pueden ocurrir durante los procedimientos de manipulacion de rutina incluyendo PCR, clonacion, transformacion, y crecimiento de la cepa como es conocido por un experto en la tecnica. Un ejemplo es el ZmPgap de pZB4, que tiene una delecion de T en la posicion -21.
Cualquiera de los cambios de nucleotidos en la secuencia ZmPgap, que ocurren en diferentes cepas naturales o modificadas, que no afectan sustancialmente la funcion del promotor, pueden estar presentes en la secuencia de un promotor del gen de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis tal como la delecion de una T despues de la posicion -21 que esta en la ZmPgap de pZB4 (SEQ ID NO:3). Por lo tanto las mutaciones en las posiciones - 190 y -89 descritas anteriormente que afectan a la funcion del promotor, es decir, que mejoran sustancialmente la funcion del promotor, pueden realizarse en cualquiera de las secuencias de ZmPgap con actividad sustancialmente similar (nivel natural) y pueden coexistir con variaciones que no afectan a la funcion.
Ejemplos de secuencias de Pgap mejoradas con las mutaciones descritas en las posicions -189 y/o -88 incluyen la secuencia del promotor de la cepa ZW658 (SEQ ID NO:4), de la cepa 8b (SEQ ID NO:5), y una doble mutacion de la misma variante de ZmPgap que es de pZB4 (SEQ ID NO:6). Ejemplos adicionales de secuencias de Pgap mejoradas son las mutaciones en -190, -89, o doble mutacion en la variante ZmPgap de CP4 (SEQ ID NOs:7, 8, y 9, respectivamente) y las mutaciones en -190, -89, o doble mutacion en la variante ZmPgap de ZM4 (SEQ ID NOs:10, 11, y 12, respectivamente).
Ademas, se producen variaciones en la longitud de la ZmPgap que no afectan sustancialmente la funcion del promotor. La presente invencion incluye Pgaps mejorados que tienen las mutaciones descritas en la posicion -190 y/o -89 con respecto al codon de iniciacion de traduccion del ATG natural para la gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa en las cepas CP4 y ZM4 de Z. mobilis en ZmPgaps de longitud variable que no tienen un cambio sustancial en la actividad antes de la adicion de las mutaciones -190 y/o -89.
Preparacion de un Pgap mejorado
Las mutaciones descritas en las posiciones -190 y/o -89 se pueden introducir en ZmPgap de la molecula de acido nucleico por un metodo conocido por un experto en la tecnica. Por ejemplo, un oligonucleotido que tiene la mutacion y la secuencia de DNA circundante se puede sintetizar y clonar en un fragmento de DNA del promotor mas grande, sustituyendo un segmento sin la mutacion. Los cebadores que contienen la mutacion y alguna secuencia del promotor adyacente se pueden sintetizar y utilizar en PCR para preparar un fragmento del promotor. Un fragmento de DNA de promotor entero se puede sintetizar como oligonucleotidos multiples que se unen entre sf. La mutagenesis dirigida al sito se puede utilizar para introducir la mutacion (es). Ademas, los promotores mutantes se pueden preparar como fragmentos de DNA amplificados por PCR utilizando DNA de la cepa ZW658 o 8b como plantilla.
Pgap mejorado en genes quimericos y vectores, introduccion en las celulas bacterianas
Un promotor de la presente invencion puede estar unido operativamente a una molecula nucleica heterologa que se va a expresar en una celula bacteriana, formando una molecula de acido nucleico quimerico, o un gen quimerico de la presente invencion. El diseno y la construccion de los genes quimericos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Un gen quimerico incluye tipicamente un promotor, una molecula de acido nucleico heterologo para expresarse, y una region de control de terminacion 3'. Las regiones de control de terminacion pueden derivarse de diversos genes, y se toman a menudo de genes nativos a celulas huesped objetivo. La molecula de acido nucleico heterologo unida operativamente puede ser cualquier molecula de acido nucleico cuya expresion se desee en celulas bacterianas, incluyendo, por ejemplo, una region codificante para una protema o peptido, o un acido nucleico para la expresion de un RNA funcional. Los RNAs funcionales incluyen, por ejemplo, RNAs antisentido, ribozimas, y RNAs interferentes. Ademas se puede construir un operon que comprende el promotor descrito aqrn y regiones codificantes multiples expresadas a partir del promotor.
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Los promotores descritos aqrn se pueden utilizar en genes quimericos para la expresion en bacterias pertenecientes a Zymomonas o Zymobacter. Los genes quimericos pueden utilizarse para la expresion de cualquier protema implicada en la produccion de un producto de Zymomonas o Zymobacter. Por ejemplo, una o mas enzimas implicadas en la smtesis de un aminoacido tal como la alanina o de sorbitol o xilitol se pueden expresar a partir de un gen quimerico que tiene estos promotores. Los genes quimericos se pueden expresar en una cepa natural de Zymomonas o Zymobacter que no utiliza xilosa, o en una cepa que utiliza xilosa. Tambien los promotores descritos aqrn se pueden utilizar para la expresion de enzimas relacionadas con el metabolismo de la xilosa u otra ruta metabolica.
Los genes quimericos descritos aqrn se construyen tfpicamente en o se transfieren a un vector para manipulaciones adicionales. Los vectores son bien conocidos en la tecnica. Ciertos vectores son capaces de replicarse en un amplio intervalo de bacterias huespedes y pueden transferirse por conjugacion. La secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442, y pRK442(H) estan disponibles. Estos derivados han demostrado ser herramientas valiosas para manipulacion genetica en bacterias gram-negativas (Scott y colaboradores. Plasmid 50(1):74-79 (2003)).
Otros vectores bien conocidos se pueden utilizar en diferentes celulas huespedes objetivo. Ejemplos de vectores utiles para diferentes huespedes se describen en la solicitud de Patente de propiedad comun y en tramite US20070092957 A1, pp11 -13. Particularmente utiles para la expresion en Zymomonas son los vectores que pueden replicarse tanto en E. coli como Zymomonas, tales como pZB188 que esta descrito en el Documento de Patente US 5,514,583. Los vectores pueden incluir plasmidos para la replicacion autonoma en una celula, y plasmidos para transportar constructos que se integraran en genomas bacterianos. Los plasmidos para la integracion del DNA pueden incluir transposones, regiones de una secuencia homologa de acido nucleico al genoma bacteriano objetivo, u otras secuencias que apoyen la integracion. Un tipo adicional de vector puede ser un transposoma producido utilizando, por ejemplo, un sistema que esta comercialmente disponible en EPICENTRE®. Es bien sabido como elegir un vector apropiado para el huesped objetivo deseado y la funcion deseada.
Un promotor descrito aqrn se puede construir tambien en un vector sin una molecula de acido nucleico unida operativamente para expresion, e integrado adyacente a una region codificante endogena para sustituir un promotor endogeno en un genoma bacteriano o anadir un promotor, por ejemplo a una region codificante sin un operon. La sustitucion del promotor cromosomico se puede realizar utilizando metodos tales como los descritos por Yuan y colaboradores (Metab. Eng. (2006) 8:79-90), y White y colaboradores (Can. J. Microbiol. (2007) 53:56-62).
Los vectores que comprenden un promotor descrito aqrn pueden introducirse en una celula bacteriana por medios bien conocidos, tales como utilizando transformacion congelacion-descongelacion, transformacion mediada por calcio, electroporacion, o conjugacion.
Expresion de moleculas de acido nucleico heterologas utilizando Pgap mejorado
Los niveles aumentados de expresion de genes quimericos se pueden obtener utilizando un Pgap mejorado descrito aqrn. Un gen quimerico construido con un Pgap mejorado y una region codificante de xilosa isomerasa que se integro en el genoma se mostro aqrn en el Ejemplo 8 para permitir el crecimiento mejorado en medio de xilosa de celulas modificadas de Z. mobilis para expresar genes que codifican protemas para el metabolismo de la xilosa. El crecimiento mejorado en xilosa se mostro aqrn en los Ejemolos 3 y 10 en relacion con la expresion de los niveles mas altos de actividad de xilosa isomerasa y las actividades de xilulocinasa. Las cepas de Z. mobilis que utilizan xilosa adaptadas para un mejor crecimiento en xilosa y que tienen un Pgap mejorado que dirige la expresion de la xilosa isomerasa y xilulocinasa han mejorado la utilizacion de la xilosa. Las actividades de xilosa isomerasa y xilulocinasa fueron aproximadamente 4 a 5 veces mayores que en cepas sin un Pgap mejorado que dirija la expresion de xilosa isomerasa y xilulocinasa.
El nivel de expresion aumentado de un gen quimerico que contiene un Pgap mejorado de la presente invencion y localizado en un plasmido estable tambien se mostro aqrn, en el Ejemplo 9. Un gen quimerico que tiene un Pgap unido operativamente a una secuencia heterologa que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa (RPI) produjo una mayor cantidad de protema RPI en comparacion con la cantidad producida a partir del gen quimerico que contiene ZmPgap.
Ejemplos
Los ejemplos ilustran las invenciones descritas aqrn.
Metodos generales
El DNA recombinante estandar y las tecnicas de clonacion molecular utilizadas aqrn son bien conocidas en la tecnica y estan descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) (en adelante “Maniatis”); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987).
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El significado de las abreviaciones es el siguiente: “kb” significa kilobase(s), “bp” significa pares de bases, “nt” significa nucleotido(s), “h” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “s” significa segundo(s), “d” significa d^a(s), “L” significa litro(s), “ml” significa mililitro(s), “jL” significa microlitro(s), “|jg” significa microgramo(s), “ng” significa nanogramo(s), “mM” significa milimolar, “jM” significa micromolar, “nm” significa nanometro(s), “jmol” significa micromol(es), “pmol” significa picomol(es), “Cm” significa cloranfenicol, “Cmr” significa resistente al cloranfenicol, “Cms” significa sensible al cloranfenicol, “Spr” significa resistencia a la espectinomicina, “Sps” significa sensible a espectinomicina, “XI” es xilosa isomerasa, “XK” es xilulocinasa, “TAL” es transaldolasa, “TKT” es transcetolasa, “EFT” significa tiempo de fermentacion transcurrido, “RM” significa medio rico que contiene 10 g/L de extracto de levadura mas 2 g/L de KH2PO4, “MM” significa medio de acoplamiento que contiene 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de triptona, 2,5 g/L de (NH4)2SO4 y 0,2 g/L de KH2PO4.
Preparacion de extractos libres de celulas de Zymomonas para ensayos enzimaticos
Las celulas se hicieron crecer en 50 ml de RM + 2% de glucosa a 30°C durante una noche a un OD600 de 1,0-1,2. Las celulas se recogieron por centrifugacion a 4.500 rpm durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarto y el sedimento celular se lavo con 25 ml de tampon de sonicacion helado (Tris 10 mM, pH 7,6, MgCh 10 mM), seguido por centrifugacion a 4.500 rpm durante 10 minutos. El sedimento se resuspendio en 2,0-2,5 ml de tampon de sonicacion mas ditiotreitol 1mM. Una almuota de 500 jL se centrifugo durante 1 minuto en una centnfuga eppendorf a 4°C. La mayona del sobrenadante se descarto, dejando aproximadamente 10-20 jL atras para evitar que el sedimento se secara. Las celulas se congelaron y se almacenaron a aproximadamente a 80°C hasta que se ensayaron. Antes del ensayo, las celulas se descongelaron y se resuspendieron con 500 jL de tampon de sonicacion mas ditiotreitol 1 mM. La mezcla se sonico 2x durante 45 segundos a un ciclo de trabajo del 62% y un control de salida de 2 utilizando un sonicador 450 de Branson, dejando que las muestras se enfriaran aproximadamente 3-5 minutos entre sonicaciones. Las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 60 minutos en una microcentnfuga Beckman a 4°C. El sobrenadante se transfirio a un tubo nuevo y se mantuvo a 4°C. El ensayo Pierce BCA se utilizo para determinar las concentraciones de protemas.
El ensayo de trascetolasa (TKT) se realizo generalmente primero ya que esta enzima es mas labil que las otras. Un diagrama del ensayo de TKT se muestra en las Figura 1A.
En un ensayo de microplaca, 20 jL de extracto libre de celulas se anadieron a cada pocillo en una mezcla de reaccion, a 30°C, que incluia las siguientes concentraciones finales de componentes: NaDP 0,37 mM, TrisHCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 8,4 mM, TPP 0,1 mM (cloruro de pirofosfato de tiamina), E4P 0,6 mM (eritrosa-4-fosfato), BHP 4 mM (betahidroxipiruvato), PGI 4 U/ml (fosfoglucosa isomerasa), y G6PD 4 U/ml (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). La A340 se leyo en un lector de placas durante 3-5 minutos. La actividad de TKT se calculo como sigue:
1 unidad corresponde a la formacion de 1jmol de D-fructosa 6-fosfato / min a 30°C.
U (jmol / min) = pendiente (dA340 / min) * volumen de reaccion (jL) / 6.220 /0,55 cm
(Moles de NADP ^ NADPH es 6.220 A340 por mol por L en una cubeta de 1 cm) (longitud de la trayectoria de 200 jL por pocillo en microplaca = 0,55 cm
Actividad espedfica (jmol / min-mg) = jmol / min / concentracion de protema (mg)
La base del ensayo de transaldosa (TAL) se muestra en la Figura 1B. En un ensayo de microplato, 20 jL de extracto libre de celulas se anadio a cada pocillo en una mezcla de reaccion, a 30°C, que incluia las siguientes concentraciones finales de componentes: NADH 0,38 mM, trietanolamina 87 mM, eDtA 17 mM, F6P 33 mM (fructosa-6-fosfato), E4P 1,2 mM (eritrosa-4-fosfato), GDH 2,0 U/ml (glicerol-3-fosfato deshidrogenasa), y TPI 20 U/ml (triosa fosfato isomerasa). La placa se incubo durante 5 minutos, despues la A340 se leyo durante 3-5 minutos. La actividad de TAL se calculo como sigue:
1 unidad corresponde a la formacion de 1 jmol de D-gliceraldelddo por minuto a 30 ° C
U (jmol / min) = pendiente (dA 340 / min) * volumen de reaccion (jl) / 6.220 / 0,55 cm
(Moles de NADH ^ NAD es 6.220 A340 por mol por L en una cubeta de 1 cm) (longitud de la trayectoria de 200 jL por pocillo en microplaca = 0,55 cm)
Actividad espedfica (jmoles / min-mg) = mol / min / protema
La base del ensayo de xilosa isomerasa (XI) se muestra en la Figura 1C. En un ensayo de microplaca, 20 jL de extracto libre de celulas se anadio a cada pocillo en una mezcla de reaccion, a 30°C, que incluia las siguientes concentraciones finales de componentes; NADH 0,256 mM, xilosa 50 mM, MgSO4 10 mM, trietanolamina 10 mM, y SDH 1 U/ml (sorbitol deshidrogenasa). La A340 se leyo en un lector de placas durante 3-5 minutos. La actividad de XI se calculo como sigue:
1 unidad de XI corresponde a la formacion de 1 jmol de D-xilulosa por minuto a 30°C
U (pmol / min) = pendiente (dA340 / min) * volumen de reaccion (|jl) / 6.220 / 0,55 cm
(Moles de NADHP ^ NAD es 6.220 A340 por mol por L en una cubeta de 1 cm) (longitud de la trayectoria de 200 jL por pocillo en microplaca = 0,55 cm
Actividad espedfica (jmol / min-mg) = jmol / min / concentracion de protema (mg)
5 La base del ensayo de xilulocinasa (XK) se muestra en la Figura 1D.
En un ensayo de microplaca, 20 jL de extracto libre de celulas se anadieron a cada pocillo en una mezcla de reaccion, a 30°C, que incluia las siguientes concentraciones finales de componentes: nAdH 0,2 mM, Tris HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2-6H2O 2,0 mM, ATP 2,0M, PEP 0,2 M (fosfoenolpiruvato), D-xylulosa 8,5 mM, PK 5 U/ml (piruvato kinasa), y LDH 5 U/ml (lactato deshidrogenasa). La A340 se leyo en un lector de placas durante 3-5minutos. La 10 actividad de XI se calculo como sigue:
1 unidad corresponde a la formacion de 1 jmol de D-xilulosa a D-xilulosa-5-fosfato por minuto a 30°C
U (jmol/min) = pendiente (dA340/min) * volumen de reaccion (jL) / 6.220 / 0,55 cm
(Moles de NADHP ^ NAD es 6.220 A340 por mol por L en un cubeta de 1 cm) (longitud de la trayectoria de 200 jL por pocillo en microplaca = 0,55 cm
15 Actividad espedfica (jmol/min-mg) = jmol / min / concentracion de protema (mg)
Metodo de HPLC
El analisis se hizo con un HPLC Agilent serie 1100 y software ChemStation de Agilent para LC 3D. La columna fue Aminex HPX-87H de BioRad (HPLC Organic Analysis Column 125-0140) con un cartucho de cationes-H MicroGuard de BioRad (125-0129). Las condiciones de operacion fueron:
Flujo Disolvente Tiempo de parada Volumen de inyeccion Muestreador automatico Temperatura de la columna Detector
0,6 ml/min H2SO4 0,01N 25 min 5 jL
Control de Temperatura @ 10°C o 4°C 55°C
fndice de refraccion (40°C) con curvas de calibracion externas estandar
20 Ejemplo 1
Construccion de cepas de Zymomonas mobilis que fermentan xilosa
Como se describe en la solicitud de Patente de propiedad comun y en tramite U.S. No. US20080286870, las cepas de Zymomonas mobilis que fermetan xilosa se construyeron por integracion de dos operones, PgapxylAB y Pgaptaltkt, que contienen cuatro genes que utilizan xilosa que codifican xilosa isomerasa, xilulocinasa, transaldolasa 25 y transcetolas, en el genoma de ZW1 (ATCC #31821) via eventos secuenciales de transposicion, seguido de la adaptacion en un medio selectivo que contiene xilosa. Anteriormente, se construyo una cepa de Zymomonas mobilis que fermenta xilosa llamada 8b, como se describio en la Solicitud de Patente U.S. App. Pub. No. 20030162271, por integracion de dos operones PgapxylAxylB y Penotaltkt, junto con marcadores de antibioticos seleccionables, en el genoma de Zymomonas mobilis 5C a traves de una combinacion de la recombinacion homologa y enfoques del 30 transposon seguido por la adaptacion y mutagenesis NTG. En la preparacion de nuevas cepas, se utilizo la transposicion (EZ de Epicentro::Tn en el sistema de transposicon in vitro), en contraoposicion a la recombinacion homologa del sitio espedfico, ya que este enfoque ofrece las ventajas de multiples opciones de sitios de integracion y frecuencia de insercion relativamente alta. Los cuatro genes que codifican las enzimas que utilizan xilosa se dispusieron y clonaron como dos operones separados: PgapxylAB y Pgaptaltkt para la integracion. Un marcador de 35 resistencia a los antibioticos, un gen de resistencia al cloranfenicol (Cmr) flanqueado por dos secuencias de reconocimiento del fago P1 Cre-recombinasa (loxP), se unieron a cada operon para la seleccion de los integrantes. La integracion de los dos operones se llevo a cabo en una de dos etapas, de manera secuencial: Pgaptaltkt seguido por PgapxylAB. La seleccion de resistencia a Cm se utilizo en ambos eventos de integracion, ya que se elimino mediante la expresion de una Cre-recombinasa en un plasmido seguido del curado del plasmido despues de cada 40 integracion. Este proceso permitio la utilizacion del mismo marcador de antibiotico para la seleccion multiples veces. Mas importantemente, permitio separar el marcador del antibiotico introducido para la seleccion de la integracion de los operones. Este proceso elimino el impacto negativo del gen(es) de resistencia al antibiotico de la cepa de fermentacion para uso comercial.
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Construccion de pMODPgaptaltktCm para transposicion
Como se describio en la Solicitud de Patente U. S. App. Pub. No. 20030162271 (Ejemplo 9 allf), un fragmento de DNA de 2,2 kb que contiene trascetolasa (tkt) que codifica una region de E. coli se aislo de pUCaltkt (Solicitud de Patente U.S. App. Pub. No. 20030162271) mediante digestion y clonacion de BgIII/Xbal en un vector pMOD (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) digerido con BamHI/Xbal, que resulta en pMODtkt. Un fragmento PCR llamdo Pgaptal se genero por fusion de la region del promotor del gen gap del zymomonas mobilis (Pgap; gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa) a la region codificante de la transaldolasa (tal) de E. coli como sigue. Un fragmento de Pgap se amplifico a partir de pZB4, la construccion del cual se describe en el documento de Patente U. S. Pat. No. 5514583 (Ejemplo 3), utilizando cebadores con SEQ ID NOs:13 y 14. El pZB4 contiene un operon PgapxylA/xylB y un operon Peno-tal/tkt. Un fragmento de la region codificante tal se amplifico a partir de pZB4 utilizando cebadores con SEQ ID NOs:15 y 16. Un fragmento Pgaptal se amplifico utilizando los fragmentos Pgap y tal como plantilla utilizando cebadores con SEQ ID NOs:17 y 18. Este fragmento se digirio con Xbal y se clono en el plasmido pMODtkt, por encima de la region codificante de tkt. Un fragmento loxP::Cm se genero por PCR utilizando los cebadores Cmlox(F,sfi) y Cmlox(R,sfi) (SEQ ID NOs: 19 y 20) y pZB186 como la plantilla. El pZB186 es una combinacion de un plasmido nativo de Z. mobilis y pACYC184, descrito en el Documento de Patente US514583 (Ejemplo 3) y Zhang y colaboradores ((1995) Science 267:240-243). Finalmente, el fragmento de PCR loxP::Cm se inserto en el sitio Sfil del plasmido que contiene Pgaptaltkt para formar el plasmido integrativo pMODPgaptaltktCm. En este plasmido, el fragmento PgaptaltktloxP::Cm se inserto entre dos extremos de mosaico (sitios de union de transposasa) en el vector pMOD. La secuencia completa de nucleotidos para el plasmido pMODgaptaltktCm se da como SEQ iD NO:21.
Transposicion y transformacion de pMODPgaptaltktCm en ZW1
El plasmido pMOD es un vector basado en pUC, y por lo tanto es un vector no replicativo en Zymomonas. El plasmido pMOD-PgaptaltktCm se trato con transposasa en presencia de Mg2+ a temperatura ambiente durante una hora y se utilizo para transformar las celulas ZW1 por electroporacion (utilizando un Pulsador Genetico de BioRad fijado a 200 ohms, 25 pF y 16 Kv/cm). Las celulas electroporadas se incubaron en un medio de acoplamiento (MM), que consiste en 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de triptona, 2,5 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/L de K2HPO4) suplementado con 50 g/L de glucosa y MgSO41 mM durante 6 horas a 30°C. La mezcla de transformacion se coloco en placas de agar que conteman 15 g/L de agar Bacto en MM suplementado con 50 g/L de glucosa y 120 pg/ml de cloranfenicol y se incubaron anaerobicamente a 30°C. Los transformantes se hicieron visibles despues de aproximadamente 2 dfas. La frecuencia de transformacion/transposicion fue aproximadamente 3x101/pg de DNA.
Se obtuvieron un total de 39 colonias transformates Cmr. Veintiuna colonias se recogieron y se analizaron despues por PCR y ensayos de actividad enzimatica. El PCR que utiliza cebadores SEQ ID NOs:22 y 23 confirmo la presencia de un fragmento de DNA de 3 kb que contiene regiones codificantes tal y tkt en los transformantes. La transformacion de nuevo con DNA del plasmido a partir de las 21 colonias integrantes no generaron ningun transformante de nuevo en E. coli lo que sugiere que el tal y tkt se integraron en el genoma ZW1. Estos integrantes se probaron para las actividades de transaldolasa y transcetolasa utilizando procedimientos modificados para microplacas (Metodos Generales). El ensayo de protemas Pierce BCA se utilizo para la determinacion de las concentraciones de protemas. Los transformantes se hicieron crecer en un medio RM que contiene 2% (peso/volumen) de glucosa suplementado con 120 pg/ml de cloranfenicol en tubos de centnfuga conicos de 50 ml a 30°C. Las cepas de control 8b y ZW1 se hicieron crecer tambien (RM mas 2% de glucosa se utilizo para ZW1) para ensayos enzimaticos. Las celulas se recogieron cuando la OD600 alcanzo 1,0. Las celulas se lavaron una vez y se resuspendieron en tampon de sonicacion (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y MgCh 10 mM). Los ensayos enzimaticos se llevaron a cabo como se describe en la Solicitud de Patente U.S. App. Pub. No. 20030162271. Las unidades se dieron como pmoles/min-mg. Todas las muestras teman actividades de transaldolasa y transcetolasa excepto para una.
La hibridacion de Southern se llevo a cabo en DNA genomico y plasmido de los integrantes seleccionados digeridos con Pstl utilizando una sonda tkt. DNA de ZW1 no se hibrida con la sonda tkt. Una banda de 1,5 kb comun fue visible en todas las muestras de DNA genomico integrante, que es el fragmento de DNA esperado entre un sitio Pstl en tkt y un sitio Pstl en tal. Una segunda banda de peso molecular elevado visible (6 kb o mayor) era unica entre las lmeas independientes T2, T3, T4 y T5 indicando un sitio de integracion genomica separado en cada lmea. Curiosamente, ambos plasmido y DNA genomico de T5 hibridaron con la sonda tkt indicando que era probable que Pgaptaltkt estuviese tambien integrado en T5 en el plasmido nativo. Estas cuatro cepas (T2, T3, T4 y T5) se seleccionaron para el tratamiento adicional Cre para eliminar el marcador Cmr.
Tratamiento Cre para eliminar el marcador Cmr de los integrantes taltkt
Para eliminar el marcador Cmr del cromosoma, T2, T3, T4 y T5 se transformaron con pZB188/Spec-Cre. Este plasmido es un derivado del vector de desplazamiento pZB188 de Zymomonas-E. coli (Zhang y colaboradores. (1995) Science 267:240-243; Documento de Patente US 5514583) que contiene un casete de expresion para Cre Recombinasa. pZB188/Spec-Cre es identico al vector de Expresion Cre que esta descrito en el Ejemplo 10 (pZB188/kan-Cre), excepto que tiene un gen de resistencia a la espectinomicina en vez de un gen de resistencia a la kanamicina. Los transformantes se seleccionaron en placas de MM agar suplementadas con 2% de glucosa y 200
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|jg/ml de espectinomicina. Las colonias resistentes Spr se recogieron en placas de RM agar suplementado con 2% de glucosa y 200 jg/ml de espectinomicina y placas de RM agar suplementadas con 2% de glucosa y 120 jg/m de Cm. El cien por ciento de las colonias que se recogieron fueron Cms indicando la excision de alta eficacia de Cmr por Cre. Los transformantes SprCms se cultivaron en RM mas 2% de glucosa a 37°C durante 2 a 5 transferencias diarias para curar pZB188aadACreF. En cada transferencia, las celulas se diluyeron y colocaron en placas de agar en RM mas 2% de glucosa para recogerlas en placas adicionales del mismo medio con o sin 200 jg/mL de Sp. Las colonias Sps se analizaron por PCR para confirmar la perdida de pZB188aadACreF. Los descendientes plasmido-curado de los integrantes se nombraron T2C, T3C, T4C y T5C. Para examinar si estos integrantes de transposicion eran estables, estas 4 cepas se hicieron crecer en rM mas 2% de glucosa y despues se transfirieron a 10 ml del mismo medio y se hicieron crecer a 37°C en tubos de ensayo duplicados. Las celulas se transfirieron diariamente durante diez dfas, o aproximadamente 100 generaciones. Las colonias se diluyeron y se colocaron en placas RMG para el aislamiento de la colonia despues de la primera y decima transferencia. Doce colonias de cada transferencia de cada cepa dieron positivo a la presencia de Pgaptaltkt por PCR de las colonias utilizando los cebadores 5' Pgap y 3' tkt (SEQ ID NOs: 13 y 23). Las actividades de transaldolasa y transcetolasa se midieron tambien para los aislados despues de la primera y decima transferencia (como se describe en los Metodos Generales). Todos los 4 integrantes tuvieron niveles similares de ambas actividades TAL y TKT despues de 100 generaciones en medio no selectivo, lo que sugiere que estos integrantes eran geneticamente estables.
Construccion de pMODPgapxylABCm para transposicion
El siguiente paso fue integrar ademas el operon PgapxylAB loxP::Cm en los integrantes ZW1::P gaptaltkt (T2C, T3C, T4C y T5C). El plasmido integrativo pMODP gapxylABCm se construyo en base al plasmido pMODPgaptaltktCm (descrito anteriormente). El fragmento Pgaptaltkt de DNA se separo por digestion Sacl/Sfil. Un fragmento adaptador que contiene los sitios de restriccion Sacl, Notl, y Sfil se introdujo por ligacion. Un fragmento Notl de PgapxylAB, que se aislo de pZB4 (Documento de Patente US 5514583), se clono despues en el sitio Notl del adptador. La xilosa isomerasa (XI) esta codificada por xylA y xilulocinasa (XK) esta codificada por xylB. La secuencia de nucleotidos completa para el plasmido pMODP gapxylABCm se da como SEQ ID NO:24.
Transposicion y transformacion de pMODP gapxylABCm en T2C, T3C, T4C y T5C
Utilizando un enfoque similar a la integracion de PgaptaltktCm, T2C, T3C, T4C y T5C se transformaron/transpusieron con pMODP gapxylABCm (descrito anteriormente) tratado con transposasa. Se obtuvieron seis integrantes (T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1, T5CCmX2) en 2 experimentos transformacion/transposicion siguiendo la seleccion Cm. Todos se confirmaron por la presencia de xylAB por PCR utilizando dos conjuntos de cebadores: SEQ ID NOs: 25, y 26, y SEQ ID NOs: 15 y 16 excepto para T2CcmX1 y T2CcmX6 de los cuales ningun fragmento de PCR se detecto utilizando los cebadores SEQ ID NOs:25 y 26.
Los integrantes, incluyendo las 2 lmeas negativas de PCR, se ensayaron para las actividades de XI, XK, TAL y TKT (Metodos Generales). Los resultados mostrados en las Figuras 2 y 3 indicaron que los seis integrantes xylAB T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1, y T5CCmX2 todos teman actividades XI, XK, TAL y TKT. Las actividades de XI y XK se adquirieron nuevamente en comparacion con los controles parentales negativos (Figura 2). Las actividades de TAL y TKT se mantuvieron como en los controles parentales. Todos los resultados indicaban que las protemas eran hechas y funcionales. Los niveles de actividad enzimatica variaban, con actividades de TI y XK similares a aquellos integrantes de ZW1 transformados/transpuestos con el mismo plasmido. Los niveles de las actividades de XI, XK, TAL y TKT fueron mas bajos que los de la cepa 8b.
La integracion del operon xylAB se confirmo por la hibridacion de Southern. Ambos DNA genomico y plasmido de las 6 lmeas se digirieron con Sphl y se hibridaron a una sonda xylB etiquetada con digoxenina. Una banda comun de aproximadamente 3 kb, que se genera desde un sitio Sphl en xylB y otro sitio Sphl en los sitios de clonacion adyacentes en el vector pMOD, estaba presente en todas las muestras de DNA genomico, y ademas, bandas de hibridacion de peso molecular mas alto en las muestras de DNA genomico indicaban que habfa cuatro sitios de integracion para el operon PgapxylAB en el cromosoma. T3CCmX1 y T3CCmX2 parecen tener el mismo sitio de integracion, T3CCmX3 y T4CCmX1 pueden tener el mismo sitio de integracion, y T5CCmX1 y T5CCmX2 tiene cada uno un sitio de integracion separado. La digestion del mismo DNA con Pstl seguido por la hibridacion de Southern con la sonda tkt demostro que cada integrante tema el mismo patron de hibridacion que su cepa parental respectivo.
Adaptacion de los ZW1::Integrantes PgaptaltktPgapxylAB Cm en medio xilosa
A pesar de la presencia de las 4 actividades enzimaticas para la utilizacion de xilosa, observaciones previas (Solicitud de Patente U.S. App. Pub. No. 20030162271) indicaron que los integrantes podfan no crecer inmediatamente en xilosa. El crecimiento en xilosa puede ocurrir despues de una incubacion prolongada en medio xilosa (o en tubos de ensayo o en placas), un proceso llamado adaptacion.
Las cepas se adaptaron como sigue. Cepas integrantes ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm se inocularon en tubos de ensayo que contienen RMX (que contiene 10 g/L de extracto de levadura, 2 g/L de KH2PO4, 20 g/L o 2% (peso/volumen) de xilosa asf como en placas MMGX o placas MMX (10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de
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triptona, 2,5 g/L de (NH^SO4, 0,2 g/L de K2HPO4, MgSO4 1 mM, 1,5% (peso/volumen) de agar, 0,025% (peso/volumen) de glucosa y 4% (peso/volumen) de xilosa o solo 4% (peso/volumen) de xilosa). El bajo nivel de glucosa se utilizo para apoyar el crecimiento inicial para incrementar la probabilidad de mutacion durante la adaptacion. Uno de al menos cinco intentos de adaptacion en xilosa en ambos cultivos y placas fue exitoso. Despues de 10 dfas de incubacion anaerobica a 37°C, 17 y 19 colonias fueron visibles en placas MMGX con celulas T3CCmX1 y T3CCmX2, respectivamente. Las colonias eran pequenas y paredan poco saludables (transparentes) en las placas. Doce colonias (cuatro de la placa T3CCmX1: T3CCmX11, T3CCmx12, T3CCmX13 y T3CCmX110; ocho de la placa T3CCmX2; T3CCmX24, T3CCmX25, T3CCmX26, T3CCmX27, T3CCmX28, T3CCmX29, T3CCmX211 y T3CCmX212) se inocularon en RMGCm120 y se transfirieron en 3 ml RMX para la adaptacion adicional para obtener lmeas que puedan crecer mas rapido en xilosa.
La adaptacion de los integrantes en tubos de ensayo que contienen 3 ml de RMX se realizo a 30°C. La OD600 se monitorizo constantemente en un espectrofotometro Spectronic 601. Cuando el crecimiento alcanzo la fase semilogantmica, los cultivos se transfirieron a tubos nuevos de RMX. Este proceso se continuo durante 7 transferencias. Las velocidades de crecimiento y ODs finales (lecturas no lineales) se mejoraron sobre las transferencias.
Despues de la sexta transferencia, los cultivos se sembraron en estnas en placas de RMX para aislar colonias individuales. Tres integrantes crecieron mas rapido que los otros en las placas sembradas en estnas: T3CCmX13, T3CCmX26 y T3CCmX27, que se nombran como X13, X26 y X27 en las tablas y en la siguiente discusion. Para seleccionar los mejores cultivadores de xilosa, se seleccionaron cuatro colonias grandes (L1-4) y cuatro colonias pequenas (S1-4) cada uno para TX13, X26 y X27 y se cultivaron en tubos de ensayo de rMx para que el crecimiento, la utilizacion de azucar y la produccion de etanol se pudiesen monitorizar. Las colonias se dejaron crecer durante una noche a 30°C seguido por inoculacion de OD600=0,05 en 3 ml de RMX en tubos de ensayo por duplicado. X27 crecio mas lentamente en RMG que los otros cultivos y fue inoculado otra vez 6,5 horas mas tarde. Despues de 69 horas (62,5 horas para X27), se tomaron muestras para el analisis por HPLC (Metodos Generales). La Figura 4 muestra el promedio del rendimiento de etanol (% de rendimiento teorico) y utilizacion de xilosa (%) para cultivos a 69 horas (62,5 horas para todos los cultivos X27). No hubo diferencias significativas entre las colonias grandes y pequenas. Aunque el rendimiento de X27 fue mejor en comparacion con el X26 en xilosa, mostro un crecimiento mas lento en glucosa. Por lo tanto, se eligieron los mejores, colonias grandes de X13 (X13L3) y X26 (X26L1), para una evaluacion adicional en fermentaciones controladas por pH. Las fermentaciones se realizaron en RMG (6% de glucosa), RMX (6% de xilosa) y RMGX (8%:4%; glucosa:xilosa) a 37°C para cepas X13L3 y X26L1, asf como la cepa de control 8b. La fermentacion de glucosa por X13L3 y X26L1 crecida en RMG (6%) y RMGX (8%:4%) procedio con bastante rapidez. La fermentacion de xilosa en el RMGX (8%:4%) fue mas lenta tanto para X13L3 como X26L1 en comparacion con la de la cepa 8b. Ademas, el crecimiento en RMX (6%) a 37°C se produjo despues de un largo retraso tanto para el X13L3 como X26L1. Varios aislados, X13b, X13c y X13FL, se recuperaron de las fermentaciones en RMX (6%). Estos aislados junto con las cepas originales X13a (un aislado de X13L3) y X26 se sometieron a un tratamiento Cre, como se describio anteriormente en este ejemplo, para eliminar el marcador Cmr de las cepas ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm. Los integrantes resultantes libres de Cmr, tratados con Cre, se nombraron: X13aC, X13bC, X13cC, X13FLC y X26C.
Ejemplo 2
Adaptacion y seleccion de la cepa ZW658
Como se describio anteriormente, la adaptacion de las cepas iniciales ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm en RMX a 30°C mejoro mucho el crecimiento de las cepas en estas condiciones. Sin embargo, las cepas adaptadas sufrieron un retraso largo durante el crecimiento y fermentacion en RMX (6%) a 37°C. Para mejorar aun mas los integrantes para la fermentacion de xilosa en condiciones de procedimiento preferidas que incluyen una concentracion de azucar y temperatura mas altas, se siguio el proceso evolutivo o de adaptacion en RMX (5%) a 37°C. Se realizaron transferencias en serie y se seleccionaron los mejores cultivadores. Los integrantes utilizados en este proceso incluyeron X13aC, X13bC, X13cC, X26C y X13fLc. Estas 5 cepas se cultivaron en RMX a 30°C durante 6 transferencias antes de transferirse a RMX (5%) a 37°C durante otras 5 a 16 transferencias. Durante y despues todos los cultivos transferidos se sembraron en estnas en placas de RMX y se incubaron a 37°C para aislar las colonias individuales. Las colonias grandes se sembraron ademas en estnas en placas de RMX y se incubaron a 37°C durante 3 a 4 veces para purificar las colonias. Se seleccionaron las colonias grandes finales para ensayos de crecimiento en RMX (5%) a 37°C.
Evaluacion de cepas a partir de la adaptacion en medio RMX (5%) a 37°C
Dieciocho colonias aisladas despues de la adaptacion con transferencias en serie se ensayaron en tubos de ensayo en RMX (5%) a 37°C inicialmente. Se seleccionaron doce cepas para una segunda evaluacion en tubos de ensayo. La cepa 8b se incluyo se incluyo en todas las evoluciones para comparacion. Las 18 colonias se hicieron crecer en RMG a 37°C durante la noche, se centrifugaron y las celulas se inocularon en 4 ml de RMX (5%) a 37°C, de forma estatica en tubos de ensayo para la primera evaluacion. En base a los resultados del crecimiento (OD600, no lineales) y HPLC en el punto final (baja xilosa residual y alto etanol), se seleccionaron 12 cepas para la segunda evaluacion.
Uno de los propositos de la segunda evaluacion fue probar la estabilidad del crecimiento mejorado en xilosa y la capacidad de utilizacion de xilosa de las cepas. Todas las 12 cepas se sometieron a un estudio de estabilidad para ver si las cepas adaptadas eran estables despues de exponerlas a un medio no selectivo en el que se transfirieron en serie a 37°C durante 50 generaciones. Los cultivos antes y despues de las transferencias en RMG (5%) se 5 inocularon en tubos de ensayo en RMX (5%) y se hicieron crecer a 37°C para la evaluacion. Los ODs no lineales se monitorizaron mediante lectura directa de los tubos de ensayo en un espectrofotometro Spectronic 601. Los ODs a las 70 horas de crecimiento en RMX (5%) antes y despues de 50 generaciones de crecimiento en RMG se representaron en la Figura 5. Los resultados indicaban que la mayona de las cepas eran estables despues de 50 generaciones en RMG a 37°C. Los sobrenadantes del punto final (en fase estacionaria) se analizaron tambien por 10 HPLC para determinar concentraciones de xilosa y etanol. Las bajas concentraciones de xilosa residual y altas concentraciones de etanol en estos cultivos apoyaron el hecho de que la cepa crecfa y fermentaba bien la xilosa.
En base a los resultados de la evaluacion anterior de los tubos de ensayo (baja xilosa residual, alta concentracion de etanol y OD mas alto) y el subsecuente cribado del crecimiento de la placa de microtitulacion con altas concentraciones de glucosa y/o xilosa (hasta el 20%) y mezclas de glucosa y xilosa con acetato para seleccionar los 15 mejores cultivadores en altos contenidos de azucar y en presencia de acetato, tal como la cepa #26, denominada ZW658, que mostro el mejor rendimiento general.
Ejemplo 3
Ensayo de las actividades enzimaticas de la ruta pentosa fosfato
Las actividades de las cuatro enzimas que utilizan de xilosa codificadas por genes integrados (descritos en el 20 Ejemplo 1) se midieron como se describe en los Metodos Generales para tres de las cepas seleccionadas para la adaptacion a alto contenido de azucar y 37°C (del Ejemplo 1) y se compararon las actividades de los mismos enzimas en la cepa adaptada adicional ZW658 (del Ejemplo 2). Los resultados, expresados como pmoles producto/mg protema/minuto se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Actividades enzimaticas en diferentes cepas de Z. mobilis adaptadas que utilizan xilosa
- Cepa
- Xilosa isomerasa Xilulocinasa Transaldolasa Transcetolasa
- X13bC
- 0,033+/-0,013 1,15+/-0,13 1,66+/-0,5 0,22+/-0,02
- ZW658
- 0,25+/-0,033 4,41+/-0,21 2,67+/-1,0 0,19+/-0,05
25 Los niveles de actividad para ambos miembros del operon xylAB aumentaron en aproximadamente 4 a 8 veces en la cepa ZW658 adaptada adicionalmente en comparacion con los niveles de las cepas precursoras parcialmente adaptadas. Hubo poco o ningun cambio en el nivel de expresion de las enzimas del operon tal/tkt entre ZW658 y las cepas precursoras parcialmente adaptadas.
Ejemplo 4
30 Comparacion de las secuencias de las regiones promotoras de los operones xylAB en una cepa parcialmente adaptada y en ZW658
Dado que un claro cambio en los niveles de actividad enzimatica de los productos de ambos genes bajo el control del promotor GAP (Pgap) que dirige xylAB fue un resultado observado de la adaptacion que condujo a ZW658, la region promotora de ese operon a partir de una cepa parcialmente adaptada (del Ejemplo 1; posteriormente dado el 35 numero de cepa ZW641) y a partir de ZW658 se amplifico por PCR y se secuencio. Un fragmento de PCR se
preparo utilizando un cebador de PCR directo (PC11; SEQ ID NO:27) de la region codificante recG donde se integro el operon PgapxylAB y un cebador inverso de la region de codificacion xylA (PC12; SEQ ID NO:28). El producto resultante del PCR de 961 bp se secuencio utilizando los cebadores LM121, lM122, y LM123 (SEQ iD NOs:29, 30, y 31). La secuencia promotora de ZW641 se da en SEQ ID NO:3 y la de ZW658 en SEQ ID nO:4. Se encontro que 40 ambas secuencias promotoras difieren en una posicion de la secuencia publicada del Pgap en la cepa CP4 de Z.
mobilis (SEQ ID NO:1): una delecion de 1 base (de una T) despues de la posicion -21, contando hacia el extremo 5' y empezando desde el anterior codon de inicio ATG para la region de codificacion del GAP. Este cambio de secuencia no contribuye a ninguna diferencia en la expresion entre el Pgap de ZW641 y el Pgap de ZW658 ya que esta presente en ambas cepas. Ademas de este cambio comun hubo tambien una diferencia de un solo par de 45 bases entre las secuencias Pgap de ZW641 y ZW658. La G en la posicion -189 con respecto a la region de
codificacion del ATG de inicio para XylA en la secuencia de la cepa ZW641 se remplazo por una T en la secuencia de ZW658. No se observaron otros cambios entre las dos secuencias y parecfa posible que un cambio en el nivel de expresion debido a este unico cambio de base en la region promotora del GAP podna ser el responsable de las actividades enzimaticas aumentadas encontradas para ambas protemas codificadas por genes bajo el control de ese 50 promotor.
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Ejemplo 5
Construccion de un vector de expresion de la xilosa isomerasa para Z. mobilis que tiene el mismo Pgap que dirige el operon xylA/B en ZW641 de Z. mobilis
Se genero una construccion de plasmido que confiere resistencia a la spectinomicina y expresion de xilosa isomerasa de E. coli en Z. mobilis (pZB188/aada-GapXylA; donde Gap representa el promotor) como se describe a continuacion utilizando un vector de desplazamiento (pZB188) de E.coli/Z. mobilis como material de partida (Figura 6A). Las etapas involucradas en la construccion de pZB188 se describen en el documento de Patente US 5,514,583. Brevemente, este plasmido de 7008 bp es capaz de replicarse en E. coli y Z. mobilis porque tiene dos ongenes de replicacion diferentes, uno para cada especie bacteriana. pZB188 contiene tambien un fragmento de DNA que confiere resistencia a la tetraciclina (es decir, un casete Tcr). La primera etapa en la construccion de pZB188/aada- GapXylA, fue la eliminacion del casete Tcr del pZB188 y remplazarlo con un fragmento de DNA que confiere resistencia a espectinomicina (es decir, un casete Specr). Para eliminar el casete Tcr del pZB188, el plasmido se corto con Clal y BssHll y el fragmento grande del vector resultante se purifico por electroforesis en gel de agarosa como se describe a continuacion con mas detalle. El casete Specr se genero por PCR utilizando el plasmido pHP15578 (Cahoon y colaboradores, (2003) Nature Biotechnology 21: 1082-1087) como plantilla y los cebadores 1 (SEQ ID nO:32) y 2 (SEQ ID NO:33). El plasmido pHP15578 contiene la secuencia de nucleotidos completa para el casete Specr y su promotor, que se basa en la secuencia publicada del gen aadA del Tranposon Tn7 (numero de acceso GenBank X03043) que codifica la 3' (9)-O-nucleotidiltransferasa.
Cebador 1 (SEQ ID NO:32)
CTACTCATTTatcgatGGAGCACAGGATGACGCCT Cebador 2 (SEQ ID NO:33)
CATCTTACTacgcgtTGGCAGGTCAGCAAGTGCC
Las bases subrayadas del Cebador 1 (cebador delantero) se hibridan justo encima del promotor para el casete Specr (a los nucleotidos 4-22 del numero de acceso GenBank X03043), mientras que las letras minusculas corresponden al sito Clal que se anadio al extremo 5' del cebador. Las bases subrayadas del Cebador 2 (cebador inverso) se hibridan aproximadamente 130 base por debajo del codon de parada para el casete Specr (a los nucleotidos 10021020 del numero de acceso GenBank X03043), mientras que las letras minusculas corresponden al sitio Afllll que se anadio al extremo 5' del cebador. El casete Specr de 1048 bp generado por PCR se digirio doblemente con Clal y Afllll, y el fragmento de DNA resultante se purifico utilizando el kit de purificacion PCR QlAquick (Qiagen, Cat. No. 28104) y el protocolo recomendado por el proveedor. En la siguiente etapa, el plasmido pZB188 (aislado de E. coli SSC110 (dcm-, dam-) para obtener DNA de un plasmido no metilado para cortar con Clal (que es sensible a la metilacion dam) se digirio doblemente con Clal y BssHll para eliminar el casete Tcr, y el fragmento grande del vector resultante se purifico por electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento de DNA y el producto de PCR limpiado se unieron despues entre sf, y la mezcla de reaccion de transformacion se introdujo en E. coli JM110 utilizando celulas qmmicamente competentes que se obtuvieron a partir de Stratagene (Cat. No. 200239). Se observo que BssHll y Afllll generan “extremos cohesivos” compatibles, pero ambos sitios se destruyen cuando se unen entre sf. Los transformantes se depositaron en medio LB que contema espectinomicina (100 pg/ml) y se hicieron crecer a 37°C. Se identifico un transformante resistente a espectinomicina que contema un plasmido con el inserto de tamano correcto mediante analisis de digestion de restriccion con Notl, y el plasmido que se selecciono para una manipulacion adicional se hace referencia mas adelante como pZB188/aadA. Un diagrama circular de esta construccion se muestra en la Figura 6B.
En la siguiente etapa, se inserto un casete de expresion de xilosa isomerasa de E. coli entre los sitios Ncol y Acll de pZB188/aadA despues de cortar el ultimo con ambas enzimas, y purificar un fragmento grande del vector por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de DNA de ~ 2Kbp que sirvio como casete de expresion de xilosa isomerasa de E. coli se aislo del plasmido pZB4 cortando la ultima construccion con Ncol y Clal, y purificando el fragmento de DNA relevante por electroforesis en gel de agarosa. El plasmido pZB4 se describe con detalle en el documento de Patente US 5514583, y se muestra una representacion esquematica del casete de expresion PgapXylA (SEQ ID. NO:34) de xilosa isomerasa de E. coli en el diagrama de caja en la Figura 6D.
El fragmento que contiene el casete de expresion de xilosa isomerasa de E. coli tiene un sitio Ncol y un sitio Clal en sus extremos 5' y 3' respectivamente. Como se describe con mas detalle en el documento de Patente US 5514583, este fragmento contiene el promotor fuerte, constitutivo de la gliceraldetudo 3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de Z. mobilis (nts 316-619), que se une con precision al marco de lectura abierto completo del marco de lectura abierto xylA de E. coli (nts 620-1942) que codifica la xilosa isomerasa. Contiene tambien la pequena region tallo-lazo que sigue inmediatamente el codon de parada de xilosa isomerasa (nts 1965-1999). El casete de expresion de xilosa isomerasa de E. coli se inserto entre los sitios Ncol y Acll de pZB188/aadA en una reaccion de ligacion estandar. Se observa que Clal y Acll generan “extremos cohesivos” compatibles, pero ambos sitios se destruyen cuando se unen entre sf. La mezcla de reaccion de ligacion se electroporo despues en E. coli SSC110 (dcm-, dam-) para obtener DNA de plasmido no metilado para la posterior transformacion de Z. mobilis, y las celulas transformadas se
sembraron en medio LB que contema 100 |jg/ml de espectinomicina; el crecimiento fue a 37°C. Los transformantes resistentes a espectinomicina que teman un plasmido con un inserto de tamano correcto se identificaron por analisis de digestion de restriccion con Notl, Ncol y Acll. El plasmido que se selecciono para una manipulacion posterior y sobreexpresion de xilosa isomerasa de E. coli en la cepa ZW641 de Z. mobilis se nombrara a continuacion como 5 “pZB188/aadA-641GapXylA”; un diagrama circular de esta construccion de plasmido se muestra en la Figura 6C.
Es importante observar que la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:34 no es identica a la secuencia de nucleotidos que se describe en SEQ ID NO:34 en las solicitudes de Patente de propiedad comun y en tramite U.S. App. Pub. Nos. US20080286870 y US20080187973, incluso aunque corresponda al mismo casete de expresion (PgapXylA) de xilosa isomerasa de E. coli. La secuencia de DNA descrita en SEQ ID NO:34 en el presente trabajo 10 tiene una delecion de 1 bp en el Pgap que corresponde al nucleotido 599 de SEQ ID NO:34 en las solicitudes de Patente U.S. App. Pub. Nos. US20080286870 y US20080187973. La secuencia de nucleotidos que se recogio en solicitudes de Patentes anteriores se basa en la secuencia de DNA publicada del Pgap para la cepa CP4 de Z. mobilis (Conway y colaboradores. J. Bacteriol. 169 (12):5653-5662 (1987)) y el promotor no fue resecuenciado en ese momento. Recientemente, sin embargo, hemos descubierto que el Pgap en pZB4 esta perdiendo tambien el 15 mismo nucleotido, y el casete de expresion (PgapXylA) de xilosa isomerasa de E. coli que se utilizo para las tres solicitudes de Patente se derivo de este plasmido como se indico anteriormente.
Ejemplo 6
Generacion de un vector de expresion de xilosa isomerasa de E. coli que tiene el mismo Pgap que dirige el operon xylA/B en ZW658 y ZW801-4 de Z. mobilis
20 El plasmido pZB188/aadA-801GapXylA es identico al pZB188-aadA-641GapXylA (Figura 6C) pero tiene una sola sustitucion de bp en el Pgap que corresponde a la mutacion G->T que esta presente en la posicion -189 en la Pgap que dirige la expresion del operon XylA/B de E. coli en ZW658. La misma mutacion puntual esta tambien presente en las cepas ZW800 y ZW801-4, que se derivaron secuencialmente de ZW658 como se describe a continuacion. La construccion y caracterizacion de ZW800 y ZW801-4 se describe con gran detalle en la solicitud de Patente de 25 propiedad comun y en tramite U.S. App. Pub. No. US20080286870. ZW800 es un derivado de ZW658 que tiene una insercion de doble cruzamiento de un casete de resistencia a espectinomicina en la secuencia que codifica la enzima glucosa-fructosa oxidoreductasa (GFOR) que inactiva esta actividad. ZW801-4 es un derivado de ZW800 en el que el casete de resistencia a espectinomicina se elimino por recombinacion del sitio espedfico dejando un codon de parada en el marco que trunca prematuramente la protema. Ninguna de estas manipulaciones altero la secuencia 30 de nucleotidos del promotor Pgap mutante que dirige el operon XylA/B en ZW658. Por lo tanto, el “promotor 801 GAP” se refiere a la secuencia del promotor que esta presente en las siguientes cepas: ZW658, ZW800, y ZW801-4.
Las etapas y los intermedios del plasmido que se utilizaron para generar pZB188/aadA-801GapXylA se describen a continuacion en orden cronologico empezando con el plasmido pMOD-enlazador.
Construccion del pMOD-enlazador
35 El precursor para el plasmido pMOD-enlazador fue el Vector de Construccion de Transposon pMODTM-2<MCS> (Cat. No. MOD0602) que esta comercialmente disponible en EPICENTRE®. Como se muestra en la Figura 7A, pMODTM-2<MCS> tiene un gen de resistencia a ampicilina (ampR), un origen de replicacion de E. coli (ori), y un sitio de multiclonacion que esta situado entre las dos terminaciones del mosaico (ME) que interaccionan con la transposasa Tn5. La primera etapa en la construccion del pMOD-enlazador fue eliminar el sitio de multiclonacion 40 original en pMOD2-<MCS> y remplazarlo con un nuevo sitio de multiclonacion que tiene sitios de restriccion unicos para AsiSi, Fsel y Sbfl. Esto se realizo cortando el plasmido con EcoRI y Hindlll y purificando el fragmento grande del vector (aproximadamente 2,5 Kbp) por electroforesis en gel de agarosa. El nuevo sitio de multiclonacion se genero despues recociendo los dos oligonucleotidos sinteticos juntos, el Enlazador B (SEQ ID NO:35) y el Enlazador T (SEQ ID NO:36) que estaban ambos fosforilados en su extremo 5'.
45 Enlazador B (SEQ ID NO:35):
aattCTACCTGCAGGAGTAGGCCGGCCATGAGCGATCGCA
Enlazador T (SEQ ID NO:36)
agctT GCGATCGCTCAT GGCCGGCCTACTCCTGCAGGTAG
Estos oligonucleotidos son complementarios entre sf, y cuando se recuecen juntos forman un enlazador de doble 50 cadena que tiene salientes de una sola cadena a ambos extremos (letras minusculas), que permiten que el fragmento de DNA este ligado entre los sitios EcoRI y Hindlll del fragmento grande del vector pMODTM-2-<MCS> descrito anteriormente. Como se indico anteriormente este enlazador sintetico contiene tambien tres sitios de restriccion unicos (AsiSi, Fsel y Sbfl) que se pueden utilizar para las subsiguientes etapas de clonacion. El sitio Sbfl esta subrayado con una lmea fina, el sitio Fsel esta subrayado con una lmea gruesa y el sitio AsiSi esta subrayado 55 con dos lmeas finas. El enlazador B y el enlazador T se recocieron juntos y el fragmento de DNA resultante se inserto entre los sitios EcoRI y Hindlll de pMODTM-2-<MCS> en una reaccion de ligacion estandar. La mezcla de la
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reaccion de ligacion se utilizo para transformar DH10B de E. coli y las celulas transformadas se sembraron en medio LB que contema 100 pg/ml de ampicilina. El DNA del plasmido se aislo despues de una colonia representativa resistente a ampicilina que contema el nuevo sitio de multiclonacion. Un diagrama circular de la construccion del plasmido resultante (denominada a continuacion como “pMOD-enlazador”) se muestra en la Figura 7B.
Construccion de pMOD-enlazador-Spec
Un fragmento de DNA que confiere resistencia a espectinomicina (Spec1) y que tiene un sitio loxP de tipo nativo a ambos extremos se inserto entre los sitios AsiSI y Fsel de la construccion pMOD-enlazador descrita anteriormente. La fuente del casete Specr flanqueado con loxP fue el plasmido pLDHSp-9WW (Figura 8), que se describe con gran detalle en la solicitud de Patente U.S. App. No. 11/862566. En la primera etapa, el DNA del plasmido MOD- enlazador se digirio secuencialmente con Fsel y AsiSI, y el fragmento grande del vector se purifico utilizando un kit de columna de centrifugacion de DNA Clean & Concentrator TM-5 que se adquirio en Zymo Research Corporation (Cat. No. DO4003). Despues, el plasmido pLDHSp-9WW se digirio tambien dos veces con las mismas dos enzimas y el fragmento pequeno de DNA (aproximadamente 1,1 Kbp) que contema el casete Specr flanqueado con loxP se purifico por electroforesis en gel de agarosa. Los dos fragmentos de DNA de interes se unieron entre sf, y la mezcla de reaccion de la transformacion se introdujo en DH10B de E. coli utilizando electroporacion. Los transformantes se sembraron en medio LB que contema ampicilina (100 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml) y el crecimiento fue a 37°C. El DNA del plasmido se aislo despues de una de las colonias resistentes a ampicilina que contema un fragmento de DNA con el tamano correcto y este se utilizo para las subsiguientes manipulaciones. Un diagrama circular de esta construccion (denominada a continuacion como “pMOD-enlazador-Spec”) se muestra en la Figura 7C.
Construccion de pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA y pMOD-enlazador-Spec-641GapXylA
Un fragmento de DNA que contiene el Pgap completo, la region de codificacion XylA, y la region de tallo-lazo que esta entre los marcos de lectura abiertos XylA y XylB se amplifico por PCR a partir de ZW801-4 utilizando los cebadores 3 y 4 (SEQ ID NOs:37 y 38, respectivamente) y las celulas resuspendidas como una plantilla. Como ya se ha indicado, el analisis de la secuencia de DNA ha mostrado que ZW801-4 tiene la misma mutacion puntual G->T en la posicion -189 en el promotor Pgap que dirige la expresion del operon integrado XylA/B de E. coli como ZW658 y que las Pgap en ambas cepas son identicas.
Cebador 3 (SEQ ID NO:37)
TCACTCATggccggccGTTCGATCAACAACCCGAATCC Cebador 4 (SEQ ID NO:38)
CTACTCATcctgcaggCCGATATACTTATCGATCGTTCC
Las bases subrayadas del cebador 3 (cebador delantero) se hibridan con las 22 primeras bases de Pgap (y a los nts 316-337 de SEQ ID NO:34), mientras que las letras minusculas corresponden a un sito Fsel que se anadio al extremo 5' del cebador. Las bases subrayadas del cebador 4 (cebador inverso) se hibridan solo con las posteriores de la region tallo-lazo que esta despues del codon de parada XylA (y a los ultimos 12 nts de SEQ ID NO.34),
mientras que las letras minusculas corresponden a un sitio Sbfl que se anadio al extremo 5' del cebador.
El producto PCR se digirio doblemente con Fsel y Sbfl, y se purifico utilizando un kit de columna de centrifugacion de DNA Clean & Concentrator TM-5 que se adquirio en Zymo Research Corporation (Cat. No. DO4003). Despues, el plasmido de pMOD-enlazador-Spec se corto con las dos mismas enzimas y el fragmento grande del vector
resultante se purifico utilizando el mismo procedimiento. Los dos fragmentos de DNA de interes se unieron entre sf,
y la mezcla de reaccion de transformacion se introdujo en DH10B de E. coli utilizando electroporacion. Las celulas se sembraron en medio LB que contema ampicilina (100 pg/ml) y espectinomicina (100 pg/ml) y el crecimiento fue a 37°C. Los transformantes que contema un plasmido con un inserto del tamano correcto se identificaron por PCR utilizando los cebadores 3 y 4 y las colonias resuspendidas como plantilla (“colonia PCR”). El plasmido que se selecciono para una manipulacion posterior se nombra a continuacion como pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA, y un diagrama circular de esta construccion se muestra en la Figura 9.
Las mismas etapas descritas anteriormente se utilizaron para generar otro plasmido que se denominara a continuacion como “pMOD-enlazador-Spec-641GapXylA”, excepto que la plantilla que se utilizo para la amplificacion por PCR del fragmento de DNA del gen Pgap-XylA fue una suspension celular de ZW641. pMOD-enlazador-Spec- 641GapXylA y pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA son identicos excepto por la sustitucion G->T en el Pgap que distingue ZW658 (y Z801-4) de ZW641.
Construccion de pZB188-aad-a-801GapXylA
Como se describe en el primer parrafo del Ejemplo 6, pZB188-aadA-801GapXylA es un vector de expresion de xilosa isomerasa de E. coli para Z. mobilis que es identico a pZB188-aadA-641GapXylA, pero tiene la misma sustitucion G->T que dirige la expresion del operon integrado Pgap-XylA/B en ZW658 (y ZW801-4). Para construir
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este plasmido, pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA (Figura 10A) se digirio dos veces con Mlul y Sail y el fragmento mas pequeno de DNA (aproximadamente 1.l0o bp) se purifico utilizando electroforesis en gel de agarosa y el kit de recuperacion de DNA de Zymoclean Gel (catalogo #D4001, Zymo Research). Este fragmento contiene la sustitucion G->T del Pgap y parte del XylA ORF y se utilizo para remplazar el fragmento correspondiente en pZB188-aadA- 641GapXylA (Figura 10B), cortando despues la ultima construccion con las mismas dos enzimas y purificando el fragmento grande del vector por electroforesis en gel de agarosa. Los dos fragmentos de interes se unieron despues entre sf y la mezcla de reaccion de ligacion se introdujo en DH10B de E. coli utilizando electroporacion. Los transformantes se sembraron en medio LB que contema espectinomicina (100 pg/ml) y el crecimiento fue a 37°C. El DNA del plasmido se aislo de una colonia resistente a espectinomicina y la presencia de la sustitucion G->T del promotor Pgap se confirmo mediante el analisis de la secuencia de DNA. El plasmido utilizado para subsiguientes manipulaciones (“pZB188-aadA-801GapXylA”) se muestra en la Figura 10C.
Ejemplo 7
Sobreexpresion de xilosa isomerasa de E. coli en ZW641
Las medidas de actividad enzimatica en la Tabla 1 muestran que las actividades de la xilosa isomerasa y la xilulocinasa aumentaron dramaticamente durante la transicion de ZW641 a ZW658. Para probar la hipotesis de que la xilosa isomerasa es la enzima limitante de la velocidad para el crecimiento sobre xilosa en ZW641, la enzima se sobreexpreso en esta cepa utilizando un plasmido multicopia, pZB188/aadA-641GapXylA (Fig. 6C). El control para este experimento fue ZW641 transformado con el plasmido multicopia pZB188/aadA, que carece del casete de expresion Pgap de xilosa isomerasa de E. coli (Fig. 6B). La construccion de ambos de estos plasmidos se describe en el Ejemplo 5, y el protocolo de transformacion fue esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 de la solicitud de Patente de propiedad comun y en tramite U.S. App. Pub. No. US20080187973. Brevemente, el DNA del plasmido no metilado (aislado a partir de SSC110 de E. coli, que es una cepa dcm" y dam") se introdujo en ZW641 utilizando electroporacion, y las celulas transformadas se sembraron en medio LB que contema 200 pg/ml de espectinomicina. Despues de un periodo de crecimiento de 48 horas a 30°C bajo condiciones anaerobicas, se seleccionaron aleatoriamente tres transformantes primarios para cada plasmido, y estos se parchearon (transfirieron) a placas de agar que conteman el mismo medio de crecimiento para la caracterizacion adicional.
La Figura 11 muestra las curvas de crecimiento (OD600 versus tiempo) en medio que contiene xilosa para las tres cepas que albergan el plasmido de expresion 641 Pgap de xilosa isomerasa de E. coli (X1, X2 y X2) y las tres cepas que albergan el plasmido de control (C1, C2 y C3). Este experimento se realizo a 30°C en matraces de agitacion (5 ml de cultivos en tubos de 15 ml a 150 rpm), y el medio de crecimiento fue mRM3-X10 (10 g/L de extracto de levadura, 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgSO4 y 100 g/L de xilosa) que tambien contema espectinomicina (200 pg/ml). Los cultivos se iniciaron con un lazo de celulas a partir de la placa parcheada descrita en el parrafo anterior y la OD600 inicial en cada caso fue aproximadamente 0,13. Similar a ZW641, las tres cepas con el plasmido de control apenas crecieron en xilosa. En marcado contraste, tanto la velocidad como la extension del crecimiento (valores de OD600 final) en xilosa se mejoraron dramaticamente cuando ZW641 se transformo con plasmido de expresion 641 Pgap de xilosa isomerasa de E. coli, pZB188/aadA-641GapXylA. Dado que las tres cepas que teman este plasmido se comportaron igual en el experimento que se muestra en la Figura 11, solo la cepa X1 y la cepa C1 se sometieron a una caracterizacion adicional.
La Figura 12 muestra una comparacion directa de ZW641, ZW658 X1 y C1 en el mismo medio de crecimiento que contiene xilosa sin espectinomicina. Las condiciones para este experimento fueron identicas a las descritas anteriormente pero los 20 ml de cultivos se hicieron crecer en tubos de 50 ml y los OD600s iniciales fueron aproximadamente 4 veces mas bajos (0,035). Las curvas de crecimiento mostradas en la Figura 12A se trazaron en una escala lineal (OD600 versus Tiempo), mientras que la Figura 12B muestra los mismos datos experimentales trazados en una escala logantmica (logOD600 versus Tiempo) para comparar las velocidades de crecimiento exponenciales. Es evidente a partir de este experimento que la velocidad de crecimiento exponencial de X1 es casi tan rapida como la de la cepa ZW658 adaptada a xilosa, y que esta cepa crece mucho mejor sobre xilosa que la cepa parental ZW641 con o sin el plasmido de control. Por lo tanto, la alta expresion de xilosa isomerasa en ZW641 (dirigido por un promotor 641Pgap a partir de un plasmido multicopia) tiene un efecto similar en el crecimiento sobre xilosa como el aumento de la actividad de la xilosa isomerasa tema sobre ZW658 (mostrado en la Tabla 1). Aunque el rendimiento final de biomasa para X1 es aproximadamente 2 veces menor que el obtenido con ZW658, esta claro a partir de estos datos que la enzima limitante de la velocidad para el crecimiento sobre xilosa en ZW641 es la xilosa isomerasa. Los experimentos mostrados en las Figuras 11 y 12 sugieren ademas otras dos posibilidades interesantes: (1) que el gran aumento en la actividad de xilosa isomerasa que ocunia durante la transicion de ZW641 a ZW658 (Tabla 1) fue en gran parte responsable del mejor crecimiento en xilosa que ocurrio durante el proceso de “adaptacion en xilosa”; y (2) que el aumento en la actividad de la xilosa isomerasa podfa ser el resultado de la sustitucion G->T en el promotor Pgap que dirige la expresion del operon Pgap-XylA/B integrado cromosomicamente que esta presente en ZW658.
Ejemplo 8
Integracion mediada por trasposon de xilosa isomerasa de E. coli en ZW641
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ZW641 y dos construcciones de plasmidos (pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA y pMOD-enlazador-Spec- 641GapXylA) se utilizaron para probar la hipotesis de que el promotor Pgap con la sustitucion G->T que dirige la expresion del operon XylA/B integrado en ZW658 (denominado en lo sucesivo como el “promotor 801 GAP) es mas fuerte que el correspondiente promotor en ZW641 (denominado en lo sucesivo como el “promotor 641 GAP). ZW641 se selecciono para estos experimentos ya que apenas puede crecer en xilosa, y porque la sobreexpresion de xilosa isomerasa en esta cepa da como resultado un crecimiento mas rapido en xilosa (Ejemplo 7, Figs. 11 y 12). La idea basica era introducir una copia adicional del gen de xilosa isomerasa de E. coli (dirigido por el promotor 641 GAP o el promotor 801 GAP) en el cromosoma de ZW641 y ver que construccion dana como resultado el crecimiento mas rapido en xilosa. La integracion cromosomica de los dos genes quimericos se llevo a cabo utilizando la tecnologfa de transposoma de Epicentre.
Como ya se ha indicado, pMOD-enlazador-Spec-641GapXylA y pMOD-enlazador-Spec-801GapXylA son plasmidos identicos excepto por la mutacion puntual G->T que esta presente en el promotor Pgap en la ultima construccion. El elemento transponible utilizado para la insercion aleatoria en el DNA en ambos casos consistio en dos extremos de mosaico (MEs) de 19 bp y el fragmento de DNA completo que esta intercalado entre ellos. Como se muestra en la Fig. 9, este elemento, que se denomina como el transposon, contiene un casete de resistencia a espectinomicina (Spec1) y un casete de expresion posterior de Pgap de xilosa isomerasa de E. coli. El protocolo que se utilizo para formar los transposones fue esencialmente el mismo que se describe en el manual de instrucciones de Epicentre para el Vector de Construccion del Transposon EZ::TNTMpMODTM-2<MCS> (Cat. No. MOD0602). Los 8 |jL de reaccion conteman 1,5 jL de DNA del transposon de extremo romo, 5'-fosforilado que estaba libre de iones Mg++ (aproximadamente 250 ng/jL), 4 jL de Transposasa de Epicentre EZ::TN y 2,5 jL de glicerol al 80% (v/v). La mezcla de reaccion de transposoma de control fue identica pero 4 jL de agua esteril se sustituyeron por la transposasa. Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se transfirieron despues a 4°C durante un periodo de incubacion de 2 a 7 dfas que es necesario para la lenta etapa de isomerizacion, que da como resultado la formacion de un transposoma activo; utilizando este procedimiento los transposomas son estables durante al menos 3 meses a -20°C.
Los transposomas se electroporaron en ZW641 esencialmente utilizando el mismo protocolo de transformacion que se describe en el documento de Patente US 5,514,583. Brevemente, los 40 jL de las reacciones de transformacion conteman aproximadamente 1010 celulas/ml en glicerol al 10% (v/v), 1 jL de inhibidor de restriccion TypeOne™ de Epicentro (Cat. No. TYO261H) y 1 jL de la mezcla de reaccion de control o de transposoma. Los ajustes para el electroporador fueron 1,6 kv/cm, 200 Q, y 25 jF, y la anchura de la rendija de la cubeta fue 0,1 cm. Despues de la electroporacion, las reacciones de transformacion se diluyeron con 1,0 ml de medio de MMG (50 g/L de glucosa, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de triptona, 2,5 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/L de K2HPO4, y MgSO4 1 mM) y se dejo que las celulas se recuperaran durante aproximadamente 3 horas a 30 °C. Las celulas se recogieron despues por centrifugacion a temperatura ambiente (13.000 x g, 5 min) en tubos esteriles de microcentffuga de 1,5 ml y el sobrenadante se elimino cuidadosamente. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 200 jL de medio MMG lfquido y una alfcuota de 100 jL de cada suspension celular se sembro en medio MMG que contema 1,5% de agar y 200 jg/ml de espectinomicina. Despues de un periodo de incubacion de 72 horas a 30°C bajo condiciones anaerobicas, 3 colonias continuaron en la placa de control, 13 colonias continuaron en la placa del transposoma 641GapXylA y 18 colonias continuaron en la placa del transposoma 801GapXylA. Seis colonias de ambas placas de transposomas se seleccionaron aleatoriamente para una caracterizacion adicional, y estas se parchearon en placas de agar que conteman medio MMX y 200 jg/ml de espectinomicina; las condiciones de crecimiento fueron las descritas anteriormente. El medio MMX es el mismo que el medio MMG, pero contiene 50 g/L de xilosa en vez de glucosa. Despues de una segunda ronda de crecimiento en una placa de MMX nuevo mas espectomicina, las seis cepas que credan mejor en xilosa (tres para cada transposoma) se utilizaron para el experimento descrito a continuacion.
La Figura 13A muestra las curvas de crecimiento lineal para las tres cepas ZW641 que se obtuvieron con el transposoma 641Gap-XylA (#6-1, #6-3 y #6-5) y las tres que recibieron el transposoma 801 Gap XylA (#8-2, #8-4 y #8-5) en medio que contiene xilosa. Los mismos datos se trazaron en una escala logantmica en la Fig. 13B. Este experimento se realizo a 30°C en matraces de agitacion (7 ml de cultivos en tubos de 15 ml a 150 rpm), y mRM3- X10 (10 g/L de extracto de levadura, 2 g/L KH2PO4, 1 g/L de MgSO4 y 100 g/L de xilosa) fue el medio de crecimiento. Los cultivos se empezaron con un lazo de celulas a partir de la placa parcheada descrita anteriormente y los ODs iniciales fueron muy similares (aproximadamente 0,02-0,03). El control para este experimento fue la cepa ZW658 adaptada a xilosa, que tiene una sustitucion G->T en el Pgap que dirige el operon XylA/B integrado cromosomicamente de E. coli.
De manera similar a la cepa parental (ZW641) las tres cepas que teman una copia adicional integrada cromosomicamente del casete de expresion 641GapXylA crecieron muy pobremente en un medio que contema xilosa, aunque era evidente que habfa algunas pequenas mejoras tanto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento de biomasa (OD600), especialmente para la cepa #6-5 (comparar Fig. 12A y Fig. 13A). En contraste, las tres cepas que se obtuvieron con el transposon 801 GapXylA crecieron mucho mejor en xilosa que la cepa parental (Fig. 13a y Fig. 13B). De hecho, dos de los transformantes (#8-4 y #8-5) crecieron casi tan bien en este azucar como en ZW658 y los transformantes ZW641 que albergaban el plasmido multicopia pZB188/aadAGapXylA, que conteman el casete de expresion 641 GapXylA (comparar Fig. 12 y Fig. 13). Ya que la transposicion es un evento aleatorio y las seis cepas tienen el casete de expresion 641 GapXylA o 801 GapXylA insertado en diferentes
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localizaciones en el cromosoma, las diferencias en la expresion del gen extrano que se observaron en este experimento utilizando el mismo transposoma es posible que sean debidas a efectos posicionales. Por ejemplo, los efectos posicionales pueden explicar el mejor crecimiento de #6-5 que de #6-1 y #6-3, y el crecimiento mas pobre de #8-2 que de #8-4 y #8-5. Sin embargo, a pesar del pequeno tamano de la poblacion que se analizo, los resultados que se muestran en la Fig. 13 apoyan firmemente la idea de que la mutacion G->T que esta presente en el promotor Pgap que dirige el operon XylA/B de E. coli en ZW658 y ZW801-4 es la responsable de la mayor actividad de la xilosa isomerasa y el mejor crecimiento en xilosa que se observo con estas cepas, comparado con la cepa parental ZW641.
Ejemplo 9
El promotor 801 GAP dirige mas altos niveles de expresion de la ribosa 5-fosfato isomerasa en Z. mobilis que el promotor 641 GAP
Si el promotor 801 GAP es realmente mas fuerte que el promotor 641 GAP, su efecto estimulador en la expresion no debena limitarse al gen de la xilosa isomerasa de E. coli, y debena tambien esperarse la expresion mejorada de otras protemas con este promotor. Para hacer frente a esta importante cuestion, los genes de Z. mobilis que codifican la ribosa 5-fosfato isomerasa (RPI) se unieron a ambos promotores, y los genes quimericos se insertaron en un plasmido multicopia que se replica en Z. mobilis. Los plasmidos de expresion Pgap-RPI resultantes (pZB188/aadA-641GapRPl y pZB188/aadA-801GapRPI) se introdujeron en Z. mobilis y los niveles de expresion de RPI se analizaron por SDS-PAGE como se describe a continuacion.
Construccion de pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL
El plasmido pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL fue un importante intermedio en la construccion de los dos plasmidos de expresion Pgap-RPI que se utilizaron en la presente invencion. Como se muestra en la Fig. 14, este plasmido contiene un casete de expresion para el gen de la ribosa 5-fosfato isomerasa (RPI) de Z. mobilis que se localiza entre los sitios unicos Ncol y Xhol. Una tecnica de PCR de superposicion descrita a continuacion se utilizo para generar el casete de expresion RPI, que es un gen quimerico que contiene la secuencia del promotor de longitud completa 641 GAP (nts 316-619 de SEQ ID NO:34) y el marco de lectura abierto completo del gen RPI de Z. mobilis. El RPI ORF corresponde a los nts 1224730-1225203 del genoma de Z. mobilis (numero de acceso GenBank AE008692), y el codon de iniciacion de RPI esta directamente unido al extremo 3' del promotor 641 GAP.
La plantilla para el promotor 641 GAP fue pZB188/aadA-641GapXylA, y el fragmento de DNA de 320 bp se amplifico a partir de este plasmido utilizando los cebadores 5 y 6 (SEQ ID NOs:39 y 40, respectivamente) en una reaccion de PCR. El producto del PCR resultante contiene el promotor 641 GAP y las primeras 15 bp del RPI ORF de Z. mobilis que estan unidas a su extremo 3' empezando con el codon de iniciacion de GTG. Este fragmento tambien tiene un sitio unico Ncol en su extremo 5' (letras minusculas) que se anadio al extremo 5' del cebador 5 para fines de clonacion.
Cebador 5 (SEQ ID NO:39)
CATGccatggGAGCTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTA Cebador 6 (SEQ ID NO:40)
CACAGCAGAGGTCACGTTTATTCTCCTAACTTATTAAGTAGC
En una reaccion PCR independiente, los cebadores 7 y 8 (SEQ ID NOs:41 y 42, respectivamente) se utilizaron para generar un fragmento de 473 bp que contiene el ORF completo del gen RPI nativo de Z. mobilis. La plantilla que se utilizo para la amplificacion fue un DNA genomico que se aislo de la cepa ZW801-4 de Z. mobilis. Hay que tener en cuenta que el extremo 5' del cebador 7 tiene 15 bp de una secuencia de superposicion que se puede hibridar al extremo 3' del fragmento del promotor 641 GAP de 320 bp, y que se anadio un sitio Xhol (letras minusculas) al extremo 5' del cebador 8 para fines de clonacion.
Cebador 7 (SEQ ID NO:41)
GTTAGGAGAATAAACGTGACCTCTGCTGTGCCATCAAA Cebador 8 (SEQ ID NO:42)
CCGctcgagCTAGATATTGAACTGAGGATTCGAAA
Los dos fragmentos descritos anteriormente se sometieron despues a una reaccion PCR de superposicion utilizando los cebadores 5 y 8 (SEQ ID NOs:39 y 42, respectivamente), y su manipulacion dio como resultado la generacion del casete de expresion RPI. Este ultimo es un fragmento de 778 bp que contiene el promotor 641 GAP unido directamente al codon de inicio de RPI ORF de Z. mobilis. El producto de PCR se corto despues con Ncol y Xhol, y el fragmento resultante se inserto en los sitios Ncol y Xhol de un plasmido que se deriva en ultima instancia de pZB188/aada-641GapXylA (Fig. 6C) para rendir el producto final pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL (Fig. 14). Es
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importante senalar que este plasmido, que es un vector de expresion RPI para Z. mobilis, contiene tambien la region tallo-lazo que esta presente en la region intergenica del operon XylA/B de E. coli, y que este elemento estabilizante esta localizado entre los sitios Xhol y Notl justo encima del codon de parada de RPI. La secuencia de nucleotidos del casete de expresion de RPI que esta en el plasmido pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL (incluyendo la estructura tallo-lazo de XylA) se describe en SEQ ID NO:43. La secuencia de nucleotidos que se muestra corresponde al fragmento de DNA que se localiza entre los sitios Ncol y Notl, e incluye ambos sitios de restriccion.
Construccion de pZB188/aadA-641GapRPI y pZB188/aadA-801GapRPI
pZB188/aadA-641GapRPI y pZB188/aadA-801GapRPI son plasmidos de expresion de Pgap-RPI para Z. mobilis que son identicos, excepto que la ultima construccion tiene la sustitucion G->T que distingue el promotor 801 GAP del promotor 641 GAP. Un fragmento de DNA de 1.240 bp que se origino a partir de
pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL se utilizo para convertir pZB188/aadA-641GapXylA (Fig. 6C) a pZB188/aadA- 641GapRPI (Fig. 15B) y pZB188/aadA-801GapXylA (Fig. 10C) a pZB188/aadA-801GapRPI (Fig. 15C). Este fragmento de DNA se genera cortando pZBl88aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL con AsiSI y Nhel, y purificando el fragmento mas pequeno por electroforesis en gel de agarosa. Como se muestra en la Fig. 15A,
pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL tiene sitios de restriccion unicos AsiSI y Nhel, y los mismos sitios estan tambien presentes en pzBl88/aadA-641GapXylA y y pZB188/aadA-801GapXylA. Hay que hacer notar que AsiSI escinde los tres plasmidos en el Pgap posterior de la sustitucion G->T que distingue el promotor 801 gAp del promotor 641 GAP, y que Nhel corta el esqueleto del plasmido aproximadamente 700 bp posteriores a partir de los codones de parada XylA o RPI. El fragmento de DnA de 1.240 bp que se obtuvo a partir de pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL contiene, por tanto, un pequeno tramo de DNA que el promotor 641 GAP y el promotor 801 GAP tienen en comun, el marco de lectura abierto de RPI completo y la region tallo-lazo XylA estabilizante.
En la siguiente etapa en la construccion de pZB188/aadA-641GapRPI y pZB188/aadA-801GapRPI, el fragmento de DNA de 1.240 bp descrito anteriormente se inserto entre los sitios AsiSI y Nhel en pZB188/aadA-641GapXylA y pZB188/aadA-801GapXylA en dos reacciones de ligacion separadas, cortando despues ambos plasmidos con AsiSI y Nhel y purificando los fragmentos mas grandes del vector. Ambas mezclas de reaccion de ligacion se introdujeron en DH10B de E. coli utilizando electroporacion, y los transformantes se sembraron en medio LB que contema espectinomicina (100 pg/ml); el crecimiento fue a 37°C. Finalmente, El DNA de los plasmidos pZB188/aadA- 641GapRPI (Fig. 15B) y pZB188/aadA-801GapRPI (Fig. 15C) se aislo a partir de las colonias que conteman la construccion correcta (como se confirmo por el analisis de la secuencia de DNA), y ambos plasmidos se introdujeron en SCS110 de E. coli (dam-, dcm-) para generar DNA del plasmido no metilado para la transformacion de Z. mobilis.
Expresion de RPI con el promotor 641 GAP y el promotor 801 GAP
Los dos vectores de expresion Pgap-RPI descritos anteriormente (pZB188/aadA-641GapRPI y pZB188/aadA- 801GapRPI) se introdujeron en la cepa ZW1 de tipo nativo de Z. mobilis utilizando electroporacion y el DNA del plasmido no metilado. Las celulas transformadas se hicieron crecer anaerobicamente a 30°C en placas con 1,5% de agar que conteman medio MMG (50 g/L de glucosa, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de triptona, 2,5 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 gL de K2HPO4, y MgSO4 1mM) y 200 pg/ml de espectinomicina. Dos colonias seleccionadas aleatoriamente que conteman el plasmido 641 GAP-RPI (641gapRpi#1 y 641gapRpi#2) y dos que albergaban el plasmido 801 gAp-RPI (801gapRpi#1 y 801gapRpi#2) se parchearon en una placa con 1,5% de agar que contema el mismo medio de crecimiento, y la placa se incubo durante aproximadamente 24 horas a 30°C bajo condiciones anaerobicas. Esta placa se utilizo para iniciar los cultivos de siembra para el experimento de expresion de RPI.
Los cultivos de siembra se empezaron con un lazo de celulas y se hicieron crecer a 30°C (150 rpm) en tubos tapados de 15 ml que conteman 5ml de medio MMG y espectinomicina (200 pg/ml). El control para este experimento (la cepa parental, ZW1) se hizo crecer bajo las mismas condiciones, pero el medio de crecimiento careda de espectinomicina. Se dejo que los cultivos de siembra alcanzaran la saturacion, y se utilizaron despues para iniciar cultivos de 20 ml en tubos tapados de 50 ml, utilizando el mismo medio de crecimiento y condiciones descritas anteriormente. Los valores iniciales de OD600 fueron aproximadamente 0,12 en todos los casos. Alicuotas de los cultivos (500 pL) se recogieron durante la fase exponencial (OD600 aproximadamente 1,1) por centrifugacion (15.000 x g, 10 min), y el sedimento celular se resuspendio en 250 pL de muestra tampon 1x SDS-PAGE. Todos los reactivos para electroforesis se obtuvieron de Invitrogen. Un mililitro de de muestra tampon 1x SDS-PAGE contiene 250 pL de muestra tampon NuPAGE™ LDS 4X (Cat. No. N0007), 100 pL de muestra de agente reductor NuPAGE™ (Cat. No. NP0004), y 650 pL de agua destilada. Las muestras se calentaron durante 10 minutos a 80°C, y los restos de partrnulas se separaron por centrifugacion (15.000 x g, 10 min). Alicuotas de las muestras clarificadas (20 pL) se sometieron despues a un protocolo SDS-PAGE, utilizando un gel NuPAGE™ 12% Bis-Tris (Cat. No. NP0341) y un tampon de ejecucion NuPAGE™ MES SDS (Cat. No. NP0002) para muestras reducidas segun recomienda el vendedor. El gel se ejecuto a temperatura constante a voltaje constante (180V) durante aproximadamente 1 hora y se tino con SimplyBlue SafeStain de Invitrogen (Cat. No. LC6060) como lo recomienda el fabricante.
La masa molecular de la protema RPI de Z. mobilis es 16.927,37 Da basado en la secuencia de DNA del marco de lectura abierto. Como se muestra en la Figura 16, varias bandas de protema ligeramente tenidas migraron en el gel de poliacrilamida en esta region (es decir, entre los estandares de pesos moleculares 17 kDa y 19 kDa) para la cepa parental, ZW1 (Lmeas 2 y 7). La inspeccion visual del gel revelo que la intensidad de una de las bandas tenida
(indicada con una flecha) aumento al menos 2 veces cuando el plasmido de expresion 641GAP-RPI se introdujo en ZW1 (Lmeas 3 y 5), lo que indica que esta es la protema RPI. Ademas, es bastante evidente en la Figura 12 que la intensidad de la banda RPI en Z. mobilis aumento mucho mas dramaticamente para las dos cepas que albergaban el plasmido de expresion 801GAP-RPI (Lmeas 4 y 6). Estos datos proporcionaron una evidencia convincente de que 5 el promotor 801 GAP es un promotor mas fuerte que el promotor 648 GAP, y que este ultimo es una herramienta util para expresar genes extranos a niveles muy altos.
Ejemplo 10
Actividad enzimatica y comparacion de secuencias de las regiones promotoras del GAP transgenico de cepas adaptadas independientemente de Z. mobilis utilizando xilosa
10 Dado que la cepa 8b (Ejemplo 1 y Solicitud de Patente US App. Pub. No. 20030162271) se obtuvo utilizando un curso similar de introduccion de genes y adaptacion de cepas como ZW658, se compararon tambien las actividades transgenicas de la ruta de pentosa fosfato y la secuencia del operon PgapxylAB en cepas adaptadas parcialmente y mas completamente de esta produccion de cepas independientes. Las actividades enzimaticas para productos del operon PgapxylAB en una cepa 8XL4 adaptada parcialmente y la cepa 8b adaptada final se midieron utilizando las 15 tecnicas descritas en Metodos Generales y los resultados se expresan como pmoles producto/mg protema/minuto como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividades enzimaticas en diferentes cepas adaptadas utilizando xilosa de Z. mobilis
- Cepa
- Xilosa isomerasa xilulosa quinasa
- 8XL4
- 0,027+/-0,004 1,10+/-0,41
- 8b
- 0,142+/-0,057 5,76+/-0,43
Como con la adaptacion que ocurrio cuando las cepas que preceden a ZW658 recogio mutaciones que permitieron un crecimiento mejorado en xilosa, la cepa 8b tuvo una actividad aumentada para productos de ambos genes en el 20 operon xylAB sobre su cepa predecesora 8XL4. Una vez mas el aumento en la medida de la actividad enzimatica fue aproximadamente 5 veces mayor que la cepa menos adaptada.
La expresion dirigente del Pgap del operon xylAB se secuencio en las cepas 8b y 8XL4. Un fragmento de PCR se preparo utilizando un cebador de PCR delantero (GAP-F8; SEQ ID NO:44) a partir del extremo 5' del promotor y un cebador inverso a partir de la region codificante xylA (XylAB851R; SEQ ID nO:5). El producto de PCR resultante se 25 secuencio utilizando los cebadores GAP-F8, XylAB449R, y XylAB851R (SEQ ID NOs:44, 46 y 45). La secuencia del promotor a partir de ZW8XL4 se dio en SEQ ID NO:3 y de 8b en SEQ ID NO:5. Estas secuencias de promotores teman tambien ambas una diferencia con la secuencia publicada de Pgap de la cepa CP4 como en el Pgap del operon xylAB en ZW641 y ZW658. Ademas de estos cambios comunes hubo tambien una diferencia de par de bases unica entre las secuencias de Pgap de ZW641 y ZW658. Mientras el cambio de G a T en la posicion -189 en 30 el ATG de inicio no estaba presente en la comparacion de 8XL4 y 8b, un cambio de C a T ocurrio en la posicion -89 con respecto al ATG de inicio.
Como con la secuencia del promotor del operon PgapxylAB en la cepa ZW658, la secuencia del promotor del operon PgapxylAB en la cepa 8b cambio durante la adaptacion a una nueva secuencia que permitio la produccion de mas protema a partir de las regiones codificantes bajo su control que la secuencia del mismo promotor de la cepa 35 parcialmente adaptada.
Listado de secuencias
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<110> Viitanen, Paul Caimi, Perry Tao, Luan Zhang, Yuying McCutchen, Carol McCole, Laura <120> Promotores de Zymomonas de alta expresion <130> CL4236 <160> 46
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1 <211> 305 <212> DNA
45 <213> Zymomonas mobilis
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gttcgatcaa caacccgaat cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac
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taagtcggca cgttaaaaaa tagctatgga atataatagc tacttaataa gttaggagaa 300
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<210> 2 <211> 305 <212> DNA
<213> Zymomonas mobilis <400> 2
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<210> 3 <211> 304 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> ZmPgap clonada con mutacion <400> 3
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<210> 4 <211> 304 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> promotor mutado
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<210> 5 <211> 304 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Promotor mutante <400> 5
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<210> 6 <211> 304 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> promotor con doble mutacion <400> 6
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<210> 7 <211> 305 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Promotor con mutacion
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<210> 8 <211> 305 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Promotor con mutacion <400> 8
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<223> Promotor con mutaciones <400> 9
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<223> Promotor con mutacion
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- gacaattggc
- tgggaacggt atactggaat 120
- tggtgcatcg
- gccccggcga atgatctata 180
- cacgaataag
- gtgttggccg cgatcgccgg 240
- atataatagc
- tacttaataa gttaggagaa 300 305
- cctatcgtaa
- tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac 60
- aagcagggac
- gacaattggc tgggaacggt atacttgaat 120
- ttgatgtttt
- tggtgcatcg gccccggcga atgatctata 180
- cagtcggcat
- cacgaataag gtgttggccg cgatcgccgg 240
- tagctatgga
- atataatagc tacttaataa gttaggagaa 300
- 305
5
10
15
20
25
- caacccgaat
- cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac 60
- gtttcgatcg
- aagcagggac gacaattggc tgggaacggt atacttgaat 120
- cgttatggta
- ttgatgtttt tggtgcatcg gccccggcga atgatctata 180
- ggcttgaccg
- cagtcggcat cacgaacaag gtgttggccg cgatcgccgg 240
- cgttaaaaaa
- tagctatgga atatagtagc tacttaataa gttaggagaa 300
- 305
gttcgatcaa aattttacgc aaatggtctt tgctcatttc taagtcggca
taaac
<210> 11 <211> 305 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Promotor con mutacion <400> 11
gttcgatcaa caacccgaat cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac
aattttacgc gtttcgatcg aagcagggac gacaattggc tgggaacggt atactggaat aaatggtctt cgttatggta ttgatgtttt tggtgcatcg gccccggcga atgatctata
tgctcatttc ggcttgaccg cagtcggcat cacgaataag gtgttggccg cgatcgccgg
taagtcggca cgttaaaaaa tagctatgga atatagtagc tacttaataa gttaggagaa
taaac
<210> 12 <211> 305 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Promotor con mutaciones
60
120
180
240
300
305
<400> 12
gttcgatcaa
aattttacgc
aaatggtctt
tgctcatttc
taagtcggca
taaac
- caacccgaat
- cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac 60
- gtttcgatcg
- aagcagggac gacaattggc tgggaacggt atacttgaat 120
- cgttatggta
- ttgatgtttt tggtgcatcg gccccggcga atgatctata 180
- ggcttgaccg
- cagtcggcat cacgaataag gtgttggccg cgatcgccgg 240
- cgttaaaaaa
- tagctatgga atatagtagc tacttaataa gttaggagaa 300
- 305
<210> 13
<211> 24 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 13
cgatcaacaa cccgaatcct atcg 24
<210> 14
<211> 26 <212> DNA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 14
gccgttattt gtcgaacaga taatgg 26
<210> 15
<211> 20 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 15
tatgggttca gcggcatgag 20
<210> 16 <211> 21 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 16
atgggcatga gatccatagc c 21
<210> 17
<211> 38 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 17
ctactcattt cctgcaggtg gtaactcatt gcgcgctc 38
<210> 18 <211> 38 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 18
catcttactg gcgcgccaaa aatctgcggc tgacatac 38
<210> 19
<211> 56 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 19
actcatttcc atggcgatcg cactatgcgg ccgcaatgta gcacctgaag tcagcc 56
- <210>
- 20
- <211 >
- 56
- <212>
- DNA
- <213>
- Secuencia artificial
- <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<223> cebador <400> 20
atctcactcc atggccggcc aactattaat taagaattga ttggctccaa ttcttg 56
<210> 21 <211> 39 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Oligonucleotido de sitio LoxP <400> 21
cgcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgc 39
- <210>
- 22
- <211 >
- 45
- <212>
- DNA
- <213>
- Secuencia artificial
- <220>
- <223>
- Oligonucleotido de sitio loxP
- <400>
- 22
ggccgcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gcgat 45
<210> 23 <211> 43 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Oligonucleotido de sitio loxP <400> 23
taaataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggc cgg 43
<210> 24 <211> 41 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Oligonucleotido de sitio loxP <400> 24
ccataacttc gtatagcata cattatacga agttatttaa t 41
<210> 25 <211> 26 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 25
ataaaagcgg ccgcagcaca ggatga 26
<210> 26 <211> 26 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ggcgttaatt aaggcaggtc agcaag 26
<210> 27 <211> 15
<212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 27
gcgtcagctg acgcg 15
<210> 28 <211> 18 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 28
cacatcgtgg aagcaata 18
<210> 29 <211> 17
<212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 29
gccgaaatga gcatata 17
<210> 30 <211> 15
<212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 30
gtgccgactt accgg 15
<210> 31 <211> 16 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 31
tgacggaatg ctaacg 16
<210> 32 <211> 35 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 32
ctactcattt atcgatggag cacaggatga cgcct 35 <210> 33
10
15
<211> 34 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 33
catcttacta cgcgttggca ggtcagcaag tgcc 34
<210> 34 <211> 2013 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Gen quimerico construido <400> 34
tcaaaactgg 60
cctttaggga 120
agaaactgcc 180
tcatggaaaa 240
attgccatac 300
ttttgcccga 360
ttggctggga 420
- ccatggtgaa
- aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa
- tgaaactcac
- ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac
- aataggccag
- gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt
- ggaaatcgtc
- gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc
- cggtgtaaca
- agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc
- ggaattagcg
- gccgcgttcg atcaacaacc cgaatcctat cgtaatgatg
- tcagcctcaa
- tcgacaattt tacgcgtttc gatcgaagca gggacgacaa
- ggaataaatg
- gtcttcgtta tggtattgat gtttttggtg catcggcccc 480
- ctatatgctc
- atttcggctt gaccgcagtc ggcatcacga acaaggtgtt 540
- gccggtaagt
- cggcacgtta aaaaatagct atggaatata atagctacta 600
- agaataaaca
- tgcaagccta ttttgaccag ctcgatcgcg ttcgttatga 660
- tcctcaaacc
- cgttagcatt ccgtcactac aatcccgacg aactggtgtt 720
- atggaagagc
- acttgcgttt tgccgcctgc tactggcaca ccttctgctg 780
- gatatgtttg
- gtgtgggggc gtttaatcgt ccgtggcagc agcctggtga 840
- ttggcgaagc
- gtaaagcaga tgtcgcattt gagtttttcc acaagttaca 900
- tattgcttcc
- acgatgtgga tgtttcccct gagggcgcgt cgttaaaaga 960
- aattttgcgc
- aaatggttga tgtcctggca ggcaagcaag aagagagcgg 1020
- ctgtggggaa
- cggccaactg ctttacaaac cctcgctacg gcgcgggtgc 1080
- ccagatcctg
- aagtcttcag ctgggcggca acgcaagttg ttacagcgat 1140
- cataaattgg
- gcggtgaaaa ctatgtcctg tggggcggtc gtgaaggtta 1200
- ttaaataccg
- acttgcgtca ggagcgtgaa caactgggcc gctttatgca 1260
- gagcataaac
- ataaaatcgg tttccagggc acgttgctta tcgaaccgaa 1320
- ccgaccaaac
- atcaatatga ttacgatgcc gcgacggtct atggcttcct 1380
- ggtctggaaa
- aagagattaa actgaacatt gaagctaacc acgcgacgct 1440
- tctttccatc
- atgaaatagc caccgccatt gcgcttggcc tgttcggttc 1500
- aaccgtggcg
- atgcgcaact gggctgggac accgaccagt tcccgaacag 1560
- aatgcgctgg
- tgatgtatga aattctcaaa gcaggcggtt tcaccaccgg 1620
- ttcgatgcca
- aagtacgtcg tcaaagtact gataaatatg atctgtttta 1680
- ggcgcgatgg
- atacgatggc actggcgctg aaaattgcag cgcgcatgat 1740
- gagctggata
- aacgcatcgc gcagcgttat tccggctgga atagcgaatt 1800
- atcctgaaag
- gccaaatgtc actggcagat ttagccaaat atgctcagga 1860
- tctccggtgc
- atcagagtgg tcgccaggaa caactggaaa atctggtaaa 1920
- ttcgacaaat
- aacggctaac tgtgcagtcc gttggcccgg ttatcggtag 1980
- cattttttta
- aggaacgatc gat 2013
<210> 35 <211> 40 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligo del sitio de multi-clonacion <400> 35
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
aattctacct gcaggagtag gccggccatg agcgatcgca 40
<210> 36 <211> 40 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> oligo del sitio de multi-clonacion <400> 36
agcttgcgat cgctcatggc cggcctactc ctgcaggtag 40
<210> 37 <211> 38 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 37
tcactcatgg ccggccgttc gatcaacaac ccgaatcc 38
<210> 38 <211> 39 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 38
ctactcatcc tgcaggccga tatacttatc gatcgttcc 39
<210> 39 <211> 40 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 39
catgccatgg gagctcgttc gatcaacaac ccgaatccta 40
<210> 40 <211> 42 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 40
cacagcagag gtcacgttta ttctcctaac ttattaagta gc 42
<210> 41 <211> 38 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 41
gttaggagaa taaacgtgac ctctgctgtg ccatcaaa 38 <210> 42
5
10
15
20
25
<211> 35 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 42
ccgctcgagc tagatattga actgaggatt cgaaa 35
<210> 43 <211> 903 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Gen quimerico construido <400> 43
ccatggcgag ctcgttcgat caacaacccg aatcctatcg taatgatgtt
agcctcaatc gacaatttta cgcgtttcga tcgaagcagg gacgacaatt
ggtatactgg aataaatggt cttcgttatg gtattgatgt ttttggtgca
cgaatgatct atatgctcat ttcggcttga ccgcagtcgg catcacgaac
ccgcgatcgc cggtaagtcg gcacgttaaa aaatagctat ggaatataat
taagttagga gaataaacgt gacctctgct gtgccatcaa atacgaaaaa
attgcttccg atcacgcagc atttgagttg aaatcaacct tgattacttg
cttggtcatg aggtcgaaga ccttggccct catgaaaacc attcagtcga
tacggttata agctggctgt cgctatcgca gaaaaaaccg ctgatttcgg
tgtggctcgg gaatcggtat ctcgatcgct gtcaatcgcc atccggctgc
ttgattacgg ataaccttac cgcccgtttg gcaagagaac ataacaatgc gctatgggtg cgagattgat cggcattgaa accgctaagg attgtatttc
gcaacgccgt ttggaggtga acgtcatgtt cgccgtatcg ataaactttc ttcaatatct agctcgaggc ggcctgaacg tactgcaagt cctgacgtca cgttggcccg gttatcggta gcgataccgg gcattttttt aaggaacgat
cgc
<210> 44 <211> 22 <212> DNA
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 44
atcaacaacc cgaatcctat cg 22
<210> 45 <211> 20 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
ttgcccgatc
ggctgggaac
tcggccccgg
aaggtgttgg
agctacttaa
aaagctggtg
gctgaaagag
ttatcccgat
tattgcttta
ccgttgcgct
caatgttatc
agctttcctt
gaatcctcag
ctgtgcagtc
cgatagcggc
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
903
<220>
<223> cebador <400> 45
tatgctcaac caccatctgc 20
5 <210> 46
<211> 20 <212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
10 <223> cebador
<400> 46
cgacatctgc tttacgcttc 20
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Una molecula de acido nucleico aislada que consiste en un promotor del gen de gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa de Z. mobilis que comprende la sustitucion de una base en una posicion seleccionada del grupo que consiste en una T reemplazando G en la posicion 116, una T reemplazando C en la posicion 217, o tanto una T5 reemplazando G en la posicion 116 como una T reemplazando C en la posicion 217; en donde los numeros de posicion son con respecto a SEQ ID NO:1 y en donde el promotor resultante es un promotor mejorado que tiene una expresion aumentada.
- 2. La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1 que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.10 3. Un gen quimerico que comprende la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1 operativamenteunida a una molecula de acido nucleico heterologa.
- 4. El gen quimerico de la reivindicacion 3 en donde la molecula de acido nucleico heterologa codifica una protema o peptido.
- 5. El gen quimerico de la reivindicacion 3 en donde la molecula de acido nucleico heterologa codifica una molecula 15 de RNA reguladora seleccionada del grupo que consiste en un RNA antisentido, un ribozima, y un RNA deinterferencia.
- 6. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1 o 2.
- 7. Un metodo para transformar una celula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en celulas Zymomonas y celulas Zymobacter que comprende introducir en la celula la molecula de acido nucleico aislada de la20 reivindicacion 1 o 2.
- 8. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 en donde introducir comprende integrar la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1 en el genoma de la celula o mantener en un plasmido de replicacion estable dentro de la celula.FIG. 1FIG. 1
- Ensayo de transcetolasa
- Beta hidroxipiruvato
- T D-Eritrosa-4-P TKT/CC
- D-glucono-5- -A. D-Fructosa-6-P
- lactona PGI
D-Glucosa-6-P- NADP NADPH
- G6PD
- Fosfoglucono-lactona
imagen1 FIG. 1CEnsayo de xilosa isomerasaxilosaxilulosaNADH NAD*xilitolSDHEnsayo de xilulocinasaFIG. 1D- D-xilulosa
- v*A1H
- D-xilulosa -5-P
- Y XK ^^ADP
- ATP
'V'PEPX mp;PKPiruvatoLDHL" NADHS NAD*Lactato - 0.00(6iu-u!iu/s0|oiurl)ixtoQdX^ E2poCmpooo-&ZZZZZZZZZZZZZZZZZh■1WW///////777?iI-W////////77.-1ICMXEPi*-| un■ Jr:(Jx cjE £(J■T)HIAn^-WJ///////77777>zzzzzzzzzzm■Ih@VM-V////Z7.-32 TZZZZZZZZZZZZZZZZk Z///7777}XE Ox , E I cj cm y X 'O £ HoPihEl*l£iJ—_ 1 __— CJ >£ rnO CJ IT)U, Er | CJI 1^1 ^toXEox CM« cm■1CMX1It 5o:An-g *CO fjolTJPOop“"iU'lCMOCMClOdr-jCMo(6uj-U!LU/S0|OLUii) xx(6iu-u!iu/s0|oiurl) j_>|j.<NOi£2oino•(-4W///////77)wzzzzzzzzvWZZZZZZZZZZZZZl-WZZZZZZZZZA\-YY/////////////////'vWZZZZZZZZZZZZZZlhI-&ZZZZZZZZZZZZZ2.\w/////////////////I—VrV///////////// j«fOVW777777777777777.\W//////7//////roO■1+¥//////////////////////////////.1 <5-T—m-T—O“I—inoofOinCvjocsi(6uj-U!LU/S0|OLUii) "ivi% xilosa utilizada o % rendimiento teorico de etanol
imagen2 ZI.02-90-Z09Z6SZZ603-fc.I\JCOa)coooCOOo - 0.90,8
- 0.7
- 0.6
- 0.5
- 0.4
- 0.3
- 0.2
- 0.10
imagen3 XI3FLC44^COAcII (6917) Ncol (6701)Natl (1)Zymo DNAimagen4 E. Coli de origenCloI (1526)TcrAcII (2403) BssHII (3095)FIG6Aimagen5 FIG. 6BContinua en la Fig. 6CContinua desde la Fig. 6BCIOI/Acll Am bos sitios destruidosSoli (7656>-v E. COli Xyl AAsiSI (67025 Pgap-^Mlu (6535)Ncol <615^>! ,-NotI (1)imagen6 Nhel (590)E. Coli de origenrClal (1526)SpecR^-BssHJI (2328) Zymo DNA■2.0 Kbp-Ncol PgapXylAClalpZB64 E- coli XylA Ncol/Clol FragmentoFIG. 6DFIG. 6CrMEimagen7 FIG. 7AAmpimagen8 MEEcoRI(375) ■Sbfl (388) fsel (400)—Asisr (4)1) HirdlH (415) MEE. Coli de origenContinua en la Fig. 7CFIG. 7BCT>imagen9 FIG.7CrAscI (420)OriSbfl (3817) pgmPromotor Idh LDH (extremo 5’)imagen10 Promotor odh ILDH (3'end)Ncol (1578) Fsel (1587) IokPLPocI (1628) Specr——Noll (2647) loxPI -AsiSI (2692)-Ncol(2695)FIG. 8imagen11 FIG. 9/ MEimagen12 Continua en la Fig. 10Cimagen13 imagen14 imagen15 - —i CNJ
- rO ,—. OJ
- X X
- X O £J>
- H
- '3 jit { T
imagen16 009GOimagen17 ZW641ZW658XIClTiempo (hr)FIG. 12Aimagen18 —ZW641 ZW658 i ■ XI —*- Cl00900 00900 6oiimagen19 Tiempo (hr)FIG. 13A- ♦
- •6-1
- •
- *6-3
- A
- •6-5
- —it—
- •8-2
- --1--
- •
- •8-5
- +
- ZW658
imagen20 0 10 20 JO 40 50 60 70 80 90 100Tiempo (hr)FIG. 13B‘6-1
• ‘6-3
* *6-5X *8-2
* *S-4
• *8-5+ ZW658Zymo RPI 'AsiSJ, {6J99J- ^Pqop -Mlul (6232) -Ncol (6154),-XhoI (6945) Not! (1)imagen21 Nhel (590)E. Coli de origen'-Spec1' BssHlI (2328)Zymo DNAFIG. 14Xhol(6945) ■imagen22 FIG. 15AContinua en la Fig. 15BContinua en la Fig. 15Cimagen23 FIG. 15CkDa9 3 4 5 6 7 89B- 5231 —.11*1 ■£ mpm .IrC, ""m mmW*# & wj85$w%: ?imagen24 >: f-Jii * z'J'z ' : § ■:.........| ■;.. ■■.■--!: i .iTy ,-^r v.£r 4hjy.-o.-,v4mm —isr Ir ■-■ :. <■.■■,: :>1917■■ v,i- *>,fEfff HI■i # if iilltif $|jp|p SBI : ' ♦«««. P' P' |ii'W*Ilft «» m m: dm. §S ' :I Marcadores MW2; ZWI3 641gapRpi#1 4. SQIgapRpi 5: 641 gapRf) #2 6: SGIgapRpi #27: ZWI6 Marcadores MWFIG. 16
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