ES2554805T3

ES2554805T3 - Mutante de síntesis de xilitol de Zymomonas que utiliza xilosa para la producción de etanol

Info

Publication number: ES2554805T3
Application number: ES07874067.7T
Authority: ES
Inventors: Paul V. Viitanen; Carol M. Mccutchen; Yat-Chen Chou; Min Zhang
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Alliance for Sustainable Energy LLC
Current assignee: Alliance for Sustainable Energy LLC; EIDP Inc
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP2010504758A; EP2066784A2; PL2066784T3; WO2008133638A9; US20080286870A1; CN101861385A; CA2661512C; WO2008133638A3; CA2661512A1; WO2008133638A2; EP2066784B1; JP5346808B2; CN101861385B; US7741119B2; HUE026720T2; BRPI0715282A2

Abstract

Una cepa de Zymomonas recombinante modificada por ingeniería para utilizar xilosa para producir etanol mediante la introducción de genes de xilosa de xilosa isomerasa, xiluloquinasa, transcetolasa y transaldolasa de utilización, en donde dicha cepa comprende al menos una modificación genética al gen de la glucosa-fructosa oxidorreductasa que reduce la actividad de la glucosa-fructosa oxidorreductasa, o en la cual la expresión del gen de la glucosa-fructosa oxidorreductasa está reducida mediante la cosupresión, o la supresión de ARN antisentido o interferente del gen de la glucosa-fructosa oxidorreductasa.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

sustituir por o combinar con sorbitol o manitol. La Z. mobilis crece en el medio donde ocurre la fermentación y se produce etanol. La fermentación se lleva a cabo sin aire, oxígeno y otros gases complementados (que puede incluir condiciones tales como fermentación anaeróbica, microaeróbica o microaerofílica), durante al menos aproximadamente 24 horas, y se puede llevar a cabo durante 30 o más horas. El tiempo para alcanzar la máxima producción de etanol es variable, dependiendo de las condiciones de fermentación. Generalmente, si los inhibidores están presentes en el medio, se requiere un periodo de fermentación más largo. Las fermentaciones se pueden llevar a cabo a temperaturas que están entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 37ºC, a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5.

Se puede cultivar Z. mobilis que utiliza xilosa modificada en GFOR en medio que contiene azúcares mezclados incluyendo xilosa en los fermentadores a escala de laboratorio, y en fermentación a gran escala donde se producen cantidades comerciales de etanol. Donde se desee producción comercial de etanol, se aplica una diversidad de metodologías de cultivo. Por ejemplo, la producción a gran escala a partir de Z. mobilis que utiliza xilosa modificada en GFOR se puede producir mediante metodologías de cultivo tanto discontinuo como continuo. Un método de cultivo discontinuo clásico es un sistema cerrado donde la composición del medio se fija al principio del cultivo y no se somete a alteraciones artificiales durante el proceso de cultivo. Por tanto, al principio del proceso de cultivo se inocula el medio con el organismo deseado y se permite que ocurra el crecimiento o la actividad metabólica sin añadir nada al sistema. Generalmente, sin embargo, un cultivo “discontinuo” es discontinuo con respecto a la adición de la fuente de carbono y los intentos con frecuencia se hacen en los factores controladores tales como pH y concentración de oxígeno. En los sistemas discontinuos el metabolito y las composiciones de biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se termina el cultivo. Dentro de los cultivos discontinuos las células se moderan a través de una fase de latencia estática a una fase logarítmica de crecimiento alto y finalmente a una fase estacionaria donde el índice de crecimiento disminuye o se para. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente morirán. Las células en la fase logarítmica con frecuencia son responsables del volumen de producción del producto final o intermediario en algunos sistemas. La producción en la fase estacionaria o postexponencial se puede obtener en otros sistemas.

Una variación sobre el sistema discontinuo estándar es el sistema discontinuo alimentado (“Fed-Batch”). Los procesos del cultivo discontinuo alimentado también son adecuados para el crecimiento de Z. mobilis que utiliza xilosa modificada en GFOR y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que el sustrato se añade en aumentos a medida que progresa el cultivo. Los sistemas discontinuos alimentados son útiles cuando la represión del catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración de sustrato actual en los sistemas discontinuos alimentados es difícil y por lo tanto se estima en base a los cambios de los factores medibles tales como pH y la presión parcial de los gases residuales tales como CO2. Los métodos de cultivo discontinuos y discontinuos alimentados son comunes y bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger y Brock, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992).

La producción comercial de etanol también se puede conseguir con un cultivo continuo. Los cultivos continuos son sistemas abiertos donde continuamente se añade un medio de cultivo definido a un biorreactor y se separa simultáneamente una cantidad igual de medio condicionado durante el proceso. Los cultivos continuos generalmente mantienen las células a una alta densidad de fase líquida constante donde las células principalmente están en crecimiento en fase logarítmica. Alternativamente, el cultivo continuo puede ser práctico con células inmovilizadas donde el carbono y los nutrientes se añaden continuamente, y se separan continuamente los productos valiosos, subproductos y productos residuales de la masa celular. La inmovilización celular se realiza usando un amplio rango de soportes sólidos compuestos de materiales naturales y/o sintéticos como los conocidos por los expertos en la técnica.

El cultivo continuo o semi-continuo permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentración de producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno en un índice fijado y permitirá moderar todos los otros parámetros. En otros sistemas un número de factores que afectan al crecimiento se pueden alterar continuamente mientras que la concentración celular, medida mediante la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos procuran mantener las condiciones de crecimiento en estado estable y así la pérdida celular debida al medio que se está apartando debe equilibrarse frente al índice de crecimiento celular en el cultivo. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de cultivo continuos así como técnicas para maximizar el índice de formación de producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una diversidad de métodos están detallados por Brock, supra.

Particularmente adecuado para la producción de etanol es un régimen de fermentación como el que sigue. La cepa deseada de Z. mobilis que utiliza xilosa modificada en GFOR se cultiva en matraces de agitación en medio semicomplejo a de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 37ºC con agitación a aproximadamente 150 rpm en un agitadores orbitales y a continuación se transfiere a un fermentado de siembra de 10 l que contiene medio similar. El cultivo de siembra se cultiva en el fermentador de siembra anaeróbicamente hasta que DO600 es entre 3 y 6, cuando se transfiere al fermentador de producción donde los parámetros de fermentación están optimizados para la

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

producción de etanol. Los volúmenes de inoculación típicos transferidos desde el tanque de siembra al tanque de producción oscilan entre aproximadamente 2% y aproximadamente 20% v/v. El medio de fermentación típico contiene componentes de medio mínimos tales como fosfato de potasio (1,0-10,0 g/l), sulfato de amonio (0-2,0 g/l), sulfato de magnesio (0-5,0 g/l), una fuente de nitrógeno compleja tal como extracto de levadura o productos basados en soja (0-10 g/l). Una concentración final de aproximadamente sorbitol o manitol 5 mM está presente en el medio. Los azúcares mezclados que incluyen xilosa y al menos un azúcar adicional tal como glucosa (o sacarosa), que proporcionan una fuente de carbono, se añaden continuamente al recipiente de fermentación sobre la reducción de la fuente de carbono discontinua inicial (50-200 g/l) para maximizar el índice y el título de etanol. Los índices de alimentación de la fuente de carbono se ajustan dinámicamente para asegurar que el cultivo no está acumulando glucosa en exceso, lo cual podría conducir a aumentar los subproductos tóxicos tales como el ácido acético. Para maximizar el rendimiento del etanol producido a partir del sustrato utilizado, el crecimiento de biomasa está restringido por la cantidad de fosfato que o bien es inicialmente discontinuo o que se alimenta durante el transcurso de la fermentación. La fermentación está controlada a pH 5,0-6,0 usando disolución caústica (tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio) y o bien ácido sulfúrico o fosfórico. La temperatura del fermentador está controlada a 30ºC-35ºC. Para minimizar la formación de espuma, se añaden agentes antiespumantes (basado en silicona de cualquier clase, basado en compuestos orgánicos, etc.) al recipiente según se necesite. Un antibiótico, para el cual hay un marcador resistente a antibiótico en la cepa, tal como kanamicina, se puede usar opcionalmente para minimizar la contaminación.

Cualquier fijación de las condiciones anteriormente descritas, y variaciones adicionales en estas condiciones que son bien conocidas por los expertos en la técnica, son condiciones adecuadas para la producción de etanol mediante una cepa recombinante de Zymomonas que utiliza xilosa.

Ejemplos

La presente invención se define más en los siguientes Ejemplos. Se debería entender que estos Ejemplos, aunque indiquen realizaciones preferidas de la invención, se dan solamente a modo de ilustración. A partir de la anterior discusión y estos Ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención y puede hacer diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones.

Métodos generales

El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular usados en la presente memoria son bien conocidos en la técnica y están descritos por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) (más adelante “Maniatis”); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987).

El significado de las abreviaturas es el que sigue: “kb” significa kilobase(s), “pb” significa pares de bases, “nt” significa nucleótido(s), “hr” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “seg” significa segundo(s), “d” significa día(s), “l” significa litro(s), “ml” significa mililitro(s), “µl” significa microlitro(s), “µg” significa microgramo(s), “ng” significa nanogramo(s), “mM” significa milimolar, “µM” significa micromolar, “nm” significa nanómetro(s), “µmol” significa micromol(es), “µmol” significa picomol(es), “Cm” significa cloramfenicol, “Cmr” significa resistente a cloramfenicol, “Cms” significa sensible a cloramfenicol, “Spr” significa resistencia a espectinomicina, “Sps” significa sensible a espectinomicina, “XI” es xilosa isomerasa, “XK” es xiluloquinasa, “TAL” es transaldolasa, “TKT” es transcetolasa, “EFT” (del Inglés “Elapsed Fermentation Time”) significa tiempo de fermentación transcurrido, “RM” significa medio rico que contiene 10 g/l de extracto de levadura más 2 g/l de KH2PO4, “MM” (del Inglés “mating médium”) significa medio de unión que contiene 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4 y 0,2 g/l de KH2PO4.

Preparación de extractos libres de célula de Zymomonas para los ensayos enzimáticos

Se cultivan células en 50 ml de RM + glucosa al 2% a 30ºC durante la noche a una DO600 de 1,0-1,2. Las células se recogieron mediante centrifugación a 4.500 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante se descargó y se lavó el precipitado celular con 25 ml de tampón de sonicación extremadamente frío. (Tris 10 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM), seguido de centrifugación a 4.500 rpm durante 10 min. El precipitado se resuspendió en 2,0-2,5 ml de tampón de sonicación más ditiotreitol 1 mM. Se centrifugó una alícuota de 500 µl durante 1 min en una centrífuga eppendorf a 4ºC. La mayoría del sobrenadante se descargó, dejando 10-20 µl para proteger al precipitado del secado. Se congelaron las células y se almacenaron a -80ºC hasta que se ensayaron. Antes del ensayo, se descongelaron las células y se resuspendieron con 500 µl de tampón de sonicación más ditiotreitol 1 mM. La mezcla se sometió a sonicación 2x durante 45 segundos en ciclo de trabajo al 62% y un control de salida de 2 usando un sonicador Branson 450, dejando las muestras enfriar 3-5 min entre sonicaciones. Las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 60 min en un microfuga Beckman a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se mantuvo a 4ºC. El ensayo Pierce BCA se usó para determinar las concentraciones de proteína.

13

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

5

10

15

20

25

30

35

purgó a través de los medios en los fermentadores durante la noche y se paró justo antes de la inoculación. Durante la fermentación no se purgó nitrógeno. Los inóculos para la fermentación se prepararon con RMGX(10%,4%) a 37ºC en matraces de agitación (150 rpm) después de la recuperación de los cultivos de trabajo en RMG5%. La cepa 8b se usó como control bajo las mismas condiciones. Tal como se muestra en la Figura 10, ZW658 creció más lentamente sobre RMG10% en comparación con 8b (A y B), y creció a un índice similar a 8b sobre RMX8% (C y D). A pesar del índice de crecimiento más lento, la Figura 10 muestra que el rendimiento de etanol de ZW658 (93%) era similar al del 8b al final de la fermentación en el medio con glucosa. En el medio RMX8%, el rendimiento de etanol era mayor para ZW658 (0,46 g etanol/g azúcar) en comparación con 8b (0,44 g etanol/g azúcar). ZW658 produjo aproximadamente 4 g/l más de etanol en comparación con 8b en RMX8%. Curiosamente, ZW658 no produjo ningún xilitol mientras que 8b produjo un nivel bajo de xilitol (0,7 g/l) al final de la fermentación en RMX8%. Los datos mostrados en la Figura 11 muestran que ZW658 funciona mejor en comparación con 8b en fermentar glucosa al 10%+xilosa al 8% con (C, D) o sin (A, B) acetato, indicado mediante más consumo de glucosa y xilosa, menos producción de xilitol y más producción de etanol. Se usó la mayoría de la glucosa y quedó xilosa residual sustancial al final de la fermentación para ambas cepas en RMG10%8%, a 37ºC y pH 5,5, aunque ZW658 usó aproximadamente 8 g/l más de xilosa que 8b. La producción de xilitol (4,9 g/l) en ZW658 en RMG10%8% a 37ºC y pH 5,5 al final de la fermentación era significativamente más baja que la de 8b (8,2 g/l). En presencia de acetato (6 g/l), se redujo significativamente el crecimiento celular de ambas cepas dando como resultado malo rendimiento de fermentación de tanto glucosa como xilosa, aunque ZW658 mostró ligeramente mejor rendimiento de fermentación en términos de más consumo de glucosa y xilosa, menos producción de xilitol y más producción de etanol. A diferencia en el RMX8%, ambas cepas produjeron el xilitol subproducto en RMG10%8% con o sin acetato, aunque se produjo menos xilitol mediante ZW658 en comparación con 8b. El rendimiento de fermentación de las dos cepas se resume en la Tabla 1. En general, ZW658 funcionó mejor que 8b en fermentaciones de azúcar pura. Tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, ZW658 está libre de marcadores de selección antibióticos, que es una propiedad valiosa para los organismos de fermentación en aplicaciones comerciales.

Tabla 1. Compendio del rendimiento de fermentación de ZW658 y 8b para la producción de etanol.

Rendimiento de etanol g de etanol/g de azúcar Vol. Prod. g/l/h Etanol g/l: CPI g/g

8b (Glu) 0,47 5,15 52: 21

ZW658 (Glu) 0,48 4,13 52: 15

8b (Xyl) 0,44 1,66 37: 24

ZW658 (Xyl) 0,46 1,83 41: 23

8b (Glu Xyl) 0,43 1,80 58: 52

ZW658 (Glu Xyl) 0,45 2,03 65: 35

8b (Glu Xyl Ac) 0,46 0,67 48: 136

ZW658 (Glu Xyl Ac) 0,47 1,04 50: 90

CPI(del Inglés “Cell Productivity Index”) es el Índice de Producción Celular: g etanol/g peso celular seco

Ejemplo 3

Preparación de una construcción suicida para la inactivación por inserción del gen de la glucosa-fructosa oxidorredutasa (GFOR) en ZW1 y ZW658

La construcción suicida usada para bloquear el gen que codifica la glucosa-fructosa oxidorreductasa en ZW1 y ZW658 (“GFORSp-9WW”) se derivaba de otra construcción suicida (“pLDHSp-9WW”) que se usó previamente para inactivar por inserción el gen para la D-lactato deshidrogenasa en Z. mobilis usando recombinación homóloga, de doble cruce, mediada por hospedante y resistencia a espectinomicina como marcador de selección. pLDHSp-9WW también se derivaba de un número de otras construcciones que previamente se generaron. El precursor inicial para todas estas construcciones era el vector plásmido pNEB183 (NEB NºN3051S; New England Biolabs). Este plásmido fue elegido debido a que puede replicarse en E. coli pero no se puede replicar en Z. mobilis. Todas las etapas e intermediarios que estaban implicados en la generación de la construcción knockout de GFOR están descritos a continuación en orden cronológico empezando con el plásmido pNEB193.

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Construcción de pLDH193

El pNEB193 fue doblemente digerido con Sbfl y Ascl para la inserción del fragmento de ADN que está descrito a continuación. Ambos sitios de restricción son únicos y están localizados en la región de multiclonación del plásmido. El fragmento de ADN del plásmido pNEB193 linealizado con Sbfl/Ascl se purificó usando el kit de purificación QIAQuick de Qiagen (catálogo Nº 28104) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El fragmento de ADN que se clonó en pNEB193 era un fragmento de 2.268 pb que se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Z. mobilis, que se aisló de la cepa ZW1 usando el kit Maxi de Cultivo de Sangre y Célula de Qiagen (catálogo Nº 13.362). Los oligonucleótidos sintéticos que se usaron para la amplificación por PCR de este fragmento eran los Cebadores 1 y 2:

Cebador 1 (SEQ ID NO:17)

imagen16

Cebador 2 (SEQ ID NO:18)

imagen17

Las bases subrayadas del Cebador 1 (cebador directo) hibridan con los nucleótidos 1262739-1262720 del número de acceso del GenBank AE008692 en el extremo 3’ de la pauta de lectura abierta que codifica para fosfogliceromutasa (pgm), mientras que las letras minúsculas corresponden a un sitio Sbfl que se añadió al extremo 5’ del cebador. Las bases subrayadas del Cebador 2 (cebador inverso) hibridan con los nucleótidos 12604901260472 del número de acceso de GenBank AE008692, los cuales están justo en dirección 5’ a partir de la pauta de abierta que codifica para alcohol deshidrogenasa I (adhl), mientras que las letras minúsculas corresponden a un sitio Ascl que se añadió al extremo 5’ del cebador. Por lo tanto, el fragmento de ADN de 2.268 pb que era el objetivo para la amplificación por PCR consiste en los siguientes elementos empezando a partir del sitio Sbfl y finalizando en el sitio Ascl: (a) el extremo 3’ del gen pgm, (b) el gen ldh entero que codifica para D-lactato deshidrogenasa, y (c) una región no traducida 5’ del gen adhl. El producto de PCR se cortó con Sbfl y Ascl, y el fragmento de ADN resultante se ligó en el vector pNEB193 linealizado con Sbfl/Ascl que se ha descrito anteriormente. La mezcla de reacción de ligación se usó para transforma E. coli JM110 y las células transformadas se sembraron en placa sobre medio LB que contenía ampicilina (100 µg/ml). Los transformantes resistentes a ampicilina que contenían plásmidos con el inserto de tamaño correcto inicialmente se identificaron mediante PCR usando colonias resuspendidas (“PCR de colonia”) y Cebadores 1 y 2. La posterior confirmación de clones positivos viene a partir del análisis de digestión por restricción del plásmido de ADN con Sbfl y Ascl, y el análisis de la secuencia de ADN del fragmento de 2.268 pb que se generaron mediante la PCR de colonia con los transformantes resistentes a ampicilina. El plásmido que se seleccionó para manipulación adicional está referido a continuación como pLDH193.

Construcción de pLDHTc139Nº7

El plásmido pLDH193 tiene un único sitio Ncol que se localiza cerca del centro de la pauta de lectura abierta de ldh. Este sitio se usó para insertar un fragmento de ADN que confiere resistencia a tetraciclina. El casete de resistencia a tetraciclina (Tcr-casete) que se usó para esta manipulación se generó mediante PCR usando el plásmido pACYC184 (número de acceso del GenBank X06403) como plantilla de ADN y los Cebadores 3 y 4 como cebadores de la PCR.

Cebador 3 (SEQ ID NO:19)

imagen18

Cebador 4 (SEQ ID NO:20)

imagen19

Las bases subrayadas en negrita del Cebador 3 (cebador directo) hibridan justo en dirección 5’ a partir del promotor para el gen de resistencia a tetraciclina. El cebador 3 también tiene tres sitios de restricción (Ncol, AsiSI y Notl) que se añadieron a su extremo 5’. El sitio Ncol está en letras minúsculas. El sitio AsiSI está subrayado con una línea fina. El sitio Not I está en letras minúsculas en cursiva. Las bases subrayadas en negrita del Cebador 4 (cebador inverso) hibridan justo en dirección 3’ (“downstream”) a partir del codón de parada para el gen de resistencia a tetraciclina, y este cebador también tiene tres sitios de restricción (Ncol, Fsel y Pacl) que se añadieron a su extremo 5’. Similar al etiquetado anterior, el sitio Ncol está en letras minúsculas, el sitio Fsel está subrayado con una línea fina, y el sito Pacl está en letras minúsculas en cursiva. El Tcr-casete de 1.448 pb que se generó con los Cebadores 3 y 4 se cortó con Ncol y se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa. A continuación, el fragmento de ADN resultante se ligó al único sitio Ncol que está presente en la pauta de lectura abierta de ldh del plásmido, pLDH193. Para minimizar la posibilidad de recirculación del vector sin un inserto, se sometió a desfosforización al pNEB193 digerido con Ncol con fosfatasa alcalina intestinal de ternera antes de la ligación. La mezcla de reacción de ligación

20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

se introdujo en Escherichia coli JM110 y las células transformadas se sembraron en placa sobre medio LB que contenía 20 µg/ml de tetraciclina. Los transformantes resistentes a tetraciclina que contenían plásmidos con el inserto correcto se identificaron mediante el análisis de digestión por restricción con Ncol, AsiSI, Notl, Fsel y Pacl, y la orientación del Tcr-casete se confirmó mediante el análisis de PCR usando cebadores apropiados. En la Figura 12 se muestra un diagrama circular del plásmido que se seleccionó para manipulación adicional. En los experimentos no descritos en la presente memoria, esta construcción suicida se usó para inactivar por inserción (es decir, “alterar”

o “bloquear”) el gen de la D-lactato deshidrogenasa en ZW1 usando recombinación homóloga, de doble cruce y mediada por hospedante y el crecimiento sobre tetraciclina como selección.

Construcción de pLDHTc139Nº7-9WW

Habiendo demostrado que pLDHTc139Nº7 se podía usar para “bloquear” el gen de la D-lactato deshidrogenasa en ZW1, la próxima etapa era modificar esta construcción para que fuera posible separar el marcador de selección del cromosoma después de la alteración del gen, usando recombinasa Cre. Para conseguir este objetivo, dos sitios loxP silvestres (Lee y Saito, 1998) se añadieron a pLDHTc139Nº7 tomando ventaja de los cuatro únicos sitios de restricción que flanquean el Tcr-casete, principalmente, AsiSI y Notl en el extremo 5’ y Pacl y Fsel en el extremo 3’. El primer sitio loxP se insertó entre los sitios AsiSI y Notl del plásmido pLDHTc139Nº7 después de cortar la construcción con ambas enzimas y purificar el largo fragmento de ADN resultante. El sitio loxP que se insertó en esta localización se generó a partir de dos oligonucleótidos sintéticos 5 y 6 (SEQ ID NOs:21 y 22) que estaban ambos fosforilados en el extremo 5’.

Oligonucleótido 5 (SEQ ID NO:21):

imagen20

Oligonucleótido 6 (SEQ ID NO:22):

imagen21

Estos oligonucleótidos son complementarios uno a otro, y cuando se alinean juntos forman un sitio loxP silvestre de doble cadena de longitud completa que tiene salientes (“overhangs”) de cadena sencilla en ambos extremos, lo cual permite que el fragmento de ADN esté ligado entre los sitios AsiSI y Notl de pLDHTc139Nº7.

Las letras mayúsculas en los oligonucleótidos corresponden al sitio loxP silvestre de longitud completa, mientras que las letras minúsculas indican los nucleótidos que se usan para ligar el fragmento de ADN de doble cadena a los sitios AsiSI y Notl de pLDHTc139Nº7.

La mezcla de reacción de ligación se usó para transformar E. coli DH10B y las células transformadas se sembraron en placa sobre medio LB que contenía 20 µg/ml de tetraciclina. Los transformantes resistentes a tetraciclina que contenían plásmidos con el sitio loxP correctamente insertado en los sitos AsiSI y Notl de pLDHTc139Nº7 se identificaron mediante análisis de digestión por restricción, PCR de colonia, y análisis de secuencia de ADN de las regiones relevantes. El plásmido que se seleccionó para la manipulación adicional se refiere a continuación como pLDHTc139Nº7-9W.

Después, se insertó un segundo sitio loxP silvestre entre los sitios Pacl y Fsel en el otro extremo del Tcr-casete en pLDHTc139Nº7-9W, después de cortar el plásmido con ambas enzimas y purificar el fragmento largo vector resultante. El sitio loxP que se insertó en esta localización también se generó con dos oligonucleótidos sintéticos 7 y 8 (SEQ ID NOs:23 y 24) que estaban ambos fosforilados en el extremo 5’.

Oligonucleótido 7 (SEQ ID NO:23):

imagen22

Oligonucleótido 8 (SEQ ID NO:24):

imagen23

Los oligonucleótidos 7 y 8 son complementarios uno a otro, y cuando hibridan forman un sitio loxP silvestre de doble cadena, de longitud completa que tiene salientes de cadena sencilla en ambos extremos que permite que el fragmento de ADN esté ligado entre los sitios Pacl y Fsel de pLDHTc139Nº7-9W. Las letras mayúsculas en los oligonucleótidos corresponden al sitio loxP de longitud completa, y las letras minúsculas indican los oligonucleótidos que se usaron para ligar el fragmento de ADN de doble cadena en los sitios Pacl y Fsel de pLDHTc139Nº7-9W.

Se usó la mezcla de reacción de ligación para transformar E. coli DH10B y las células transformadas se sembraron en placa sobre medio LB que contenía 20 µg/ml de tetraciclina. Los transformantes resistentes a tetraciclina que contenían plásmidos con el sitio loxP silvestre insertado correctamente en los sitios Pacl y Fsel de pLDHTc139Nº79W se identificaron mediante análisis de digestión por restricción, PCR de colonia, y análisis de secuencia de ADN

21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de las regiones relevantes. El plásmido que se seleccionó para manipulación adicional se refiere a continuación como pLDHTc139Nº7-9WW, y en la Figura 12 se muestra un diagrama circular de esta construcción.

Construcción de pLDHSp-9WW

pLDHSp-9WW es idéntico a pLDHTc139Nº7-9WW, pero el casete de resistencia a tetraciclina en la última construcción estaba sustituido por un fragmento de ADN que confiere resistencia a espectinomicina (es decir, Specrcasete). Éste se generó mediante PCR usando el plásmido pHP15578 (Cahoon et al., 2003) como plantilla y los Cebadores 9 y 10. pHP15578 contiene la secuencia de nucleótidos completa para el Specr-casete y su promotor, el cual se basa en la secuencia publicada del gen Tranposon Tn7 aadA (número de acceso de GenBank X03403) que codifica para (9)-O-nucleotidil-transferasa 3’.

Cebador 9 (SEQ ID NO:25):

imagen24

Cebador 10 (SEQ ID NO:26):

imagen25

Las bases subrayadas del Cebador 9 (cebador directo) hibridan justo en dirección 5’ a partir del promotor para el Specr-casete (con los nts 6-17 del número de acceso de GenBank X03043), mientras que las letras minúsculas corresponden a un sitio Notl que se añadió al extremo 5’ del cebador. Las bases subrayadas del Cebador 10 (cebador inverso) hibridan aproximadamente 130 bases en dirección 3’ a partir del codón de parada para el Specrcasete (con los nts 1.006-1.019 del número de acceso de GenBank X03043), mientras que las letras minúsculas corresponden a un sitio Pacl que se añadió al extremo 5’ del cebador. El Specr-casete generado por PCR de 1.040 pb era doble digerido con Notl y Pacl, y el fragmento de ADN resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. El plásmido pLDHTc139Nº7-9WW también se cortó con las mismas dos enzimas de restricción para separar el Tcr-casete, y el largo fragmento vector resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se ligaron juntos los dos fragmentos de ADN de interés, y se introdujo la mezcla de reacción de transformación en E. coli DH10B usando electroporación. Los transformantes se sembraron en placa sobre medio LB que contenía espectinomicina (200 µg/ml) y se cultivaron a 37ºC. Los transformantes resistentes a espectinomicina que contenían plásmidos con el inserto de tamaño correcto se identificaron mediante análisis de digestión por restricción con Notl y Pacl, y el plásmido que se seleccionó para manipulación adicional está referido a continuación como pLDHSp-9WW; en la Figura 12 se muestra un diagrama circular de esta construcción. En los experimentos no descritos en la presente memoria, pLDHSp-9WW se usó para bloquear el gen para D-lactato deshidrogenasa en ZW1 usando resistencia a espectinomicina como marcador de selección. La inactivación del gen con la construcción suicida ocurrió vía recombinación homóloga, de doble cruce, mediada por hospedante, (documento WO 01/83784 A2), la cual dio como resultado la inserción del marcador de selección (el Specr-casete) que está flanqueado por dos sitios loxP silvestres en el centro de la pauta de lectura abierta de ldh. El suceso de doble cruce estaba dirigido hacia el gen ldh mediante dos fragmentos de ADN que flanquean el Specr-casete en pLDHSp-9WW. Uno de estos fragmentos (referido más adelante como ADN flanqueante 5’) está justo en dirección 5’ a patir del Specr-casete y está localizado entre los sitios Sbfl y AsiSI. La secuencia de nucleótidos de este fragmento de ADN de 1.100 pb es idéntica al ADN cromosómico de ZW1 que codifica para el extremo 3’ del gen pgm y aproximadamente la primera mitad de la pauta de lectura abierta de ldh. El otro fragmento de ADN (referido a continuación como el ADN flanqueante de ldh 3’) está localizado en el extremo opuesto del Specr-casete entre los sitios Fsel y Ascl. La secuencia de nucleótidos del ADN flanqueante de ldh 3’ (que también es 1.100 pb) es idéntico al ADN cromosómico que codifica para la otra mitad del gen ldh y parte de la región no traducida 5’ del gen adhl. Un evento de doble cruce ocurre cuando ambos fragmentos de ADN flanqueante de ldh 5’ y 3’ interactúan con sus complementarios cromosómicos y sufren recombinación homóloga. Este fenómeno, el cual es básicamente irreversible y está completamente mediado por la maquinaria enzimática del hospedante, inactiva el gen ldh cromosómico al insertar el Specr-casete en el centro de la pauta de lectura abierta. Puesto que la construcción no puede replicarse en Z. mobilis, haciéndola una construcción suicida, el único modo de generar colonias resistentes a espectinomicina estables con pLDHSp-9WW (aparte de los mutantes espontáneos resistentes a fármaco que se dan en una muy baja frecuencia) es un evento de doble cruce a través de la recombinación homóloga. Es importante indicar que el Specr-casete que consigue insertarse en el cromosoma mediante el evento de doble cruce incluso está intercalado entre los dos sitios loxP silvestres que están presentes en la construcción suicida. Debido a esta disposición es fácil separar el marcador de selección del gen de la D-lactato deshidrogenasa sin reactivarlo mediante el uso del vector de expresión de Cre que está descrito en el Ejemplo 10.

Construcción de pGFORSp-9WW

pLDHSp-9WW se convirtió en una construcción suicida por la inactivación del gen de la glucosa-fructosa oxidorreductasa (GFOR) de Z. mobilis en un procedimiento de 2 etapas como el descrito a continuación. Esta primera etapa era para separar el ADN flanqueante de ldh 3’ y sustituirlo por un fragmento de ADN análogo que dirigirá la construcción de plásmido al gen cromosómico que codifica para GFOR. Este fragmento de ADN (referido a

22

imagen26

imagen27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 5

Generación del mutante knockout de GFOR de ZW1

Para eliminar la actividad de la enzima GFOR en ZW1 (la cepa silvestre de la que originalmente se derivó ZW658) se usó la construcción suicida pGFORSp-9WW, que estaba descrita en detalle en el Ejemplo 3. Se introdujo ADN plásmido no replicante en el hospedante bacteriano usando electroporación, básicamente tal como se describe en el documento US 5514583. En resumen, las reacciones de transformación de 50 µl contenían 1010 células/ml en glicerol al 10% (v/v) y 0,9 µg de ADN plásmido no metilado que se aisló de E. coli SSC110 tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La reacción control se trató idénticamente, pero no recibió ningún ADN plásmido. Los ajustes para el electroporador eran 16 kv/cm, 200 Ω, y 25 µF, y el ancho de ranura de la cubeta era de 0,1 cm. Después de la electroporación, se diluyeron las reacciones de transformación con 1,0 ml de medios MMG (50 g/l de glucosa, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de triptona, 2,5/l de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de K2HPO4, y MgSO4 1 mM) y se dejó que se recuperaran las células durante 5 horas a 30ºC. A continuación, se recogieron las células mediante centrifugación a temperatura ambiente (13.000 X g, 5 min) en tubos de microfuga de 1,5 ml estériles y se separaron los sobrenadantes con cuidado. Los precipitados celulares se resuspendieron en 150 µl de medios MMG líquidos, y alícuotas de 50 a 100 µl de la suspensión celular se sembraron en placa sobre medio MMG que contenía agar al 1,5% y 200 µg/ml de espectinomicina. Las placas se incubaron en una cámara anaeróbica a 30ºC, y aparecieron 50 a 150 colonias sobre las placas experimentales después de 2 a 3 días. Las colonias resistentes a espectinomicina no estaban sobre las placas control en este momento, aunque unas pocas aparecieron después de otro periodo de incubación de 48 horas. Se seleccionaron dos de las colonias resistentes a espectinomicina que resultaron de la transformación con la construcción knockout de GFOR para manipulación adicional tal como se describe más adelante.

Los experimentos previos con Z. mobilis y construcciones suicidas que son similares a pGFORSp-9WW han revelado que la interacción inicial entre el cromosoma y el ADN plásmido es un evento de cruce sencillo en uno de los dos loci diana, y que los eventos de cruce sencillo finalmente dan lugar a eventos de doble cruce. La transición al evento de doble cruce normalmente ocurre muy rápidamente después unas pocas transferencias seriales en medio líquido que contiene el agente selectivo para la construcción suicida. Para facilitar el evento de doble cruce para los dos transformantes de ZW1 seleccionados que resultaron de la construcción knockout de GFOR, las células se incubaron en 10 ml de medios RM (10 g/l de extracto de levadura y 2 g/l de KH2PO4) que contenían 100 g/l de glucosa y 200 µg/ml de espectinomicina. Ambos cultivos alcanzaron la fase estacionaria después de un periodo de incubación de 24 horas a 30ºC. Después, se usaron alícuotas de 10 µl de los cultivos del 1º pase para inocular 10 ml del mismo medio de crecimiento, y ambos de estos cultivos también alcanzaron la fase estacionaria después de 24 horas a 30ºC. Finalmente, se inocularon alícuotas de 10 µl de los cultivos del 2º pase en 10 ml del mismo medio de crecimiento y se permitió que se desarrollara el crecimiento durante otras 24 horas a 30ºC. Después de la última transferencia en medio líquido, se diluyeron alícuotas de los cultivos del 3º pase y se sembraron en placa sobre medio MMG que contenía espectinomicina (200 µg/ml) para obtener colonias sencillas, y se incubaron las placas a 30ºC durante 48 horas bajo condiciones anaeróbicas.

La confirmación de que el evento de doble cruce en verdad había ocurrido se obtuvo a partir de los experimentos de PCR de colonia usando tres pares diferentes de cebadores. El primer par de cebadores de PCR solamente puede generar un fragmento de ADN del tamaño correcto si el ADN flanqueante de GFOR 5’ en la construcción suicida ha experimentado un evento de cruce sencillo con su complementario cromosómico. Similarmente, el segundo par de cebadores PCR solamente puede generar un fragmento de ADN del tamaño correcto si el ADN flanqueante de GFOR 3’ en la construcción suicida ha experimentado un evento de cruce sencillo con su complementario cromosómico. Finalmente, el tercer par de cebadores de PCR solamente puede generar un fragmento de ADN del tamaño correcto si ha ocurrido un evento de doble cruce y además descarta la posibilidad de una población mezclada de eventos de cruce doble y sencillo. Las dos colonias resistentes a espectinomicina que se usaron para este análisis se derivaban de dos transformantes principales diferentes a partir de la reacción de electroporación de ZW1 con la construcción suicida que se transfirieron tres veces en medio líquido y se sembraron en placa para obtener colonias sencillas tal como se ha descrito anteriormente, y el control para este experimento era la cepa parental, ZW1. Puesto que ambos transformantes produjeron resultados positivos con los tres conjuntos diferentes de cebadores de PCR, solamente uno de ellos se seleccionó para análisis adicional. Esta cepa (el mutante knockout de GFOR de ZW1) se refirió a continuación como ZW1-∆GFOR.

Ejemplo 6

La glucosa-fructosa oxidorreductasa puede ser un colaborador principal para la formación de xilitol bajo condiciones fisiológicas

Se usó el mutante knockout de GFOR de ZW1 (ZW1-∆GFOR) para ensayar la hipótesis de que la formación de xilitol en cepas recombinantes de Z. mobilis que utilizan xilosa está al menos parcialmente mediada por la enzima GFOR periplásmica, o su precursor citosólico de mayor peso molecular que también es enzimáticamente activo (Loos et al., supra). Tal como se muestra en el Ejemplo 2 (Figura 11), el xilitol es un subproducto principal de las cepas 8b que utilizan xilosa y ZW658, pero solamente se forma cuando la xilosa está presente en el medio de crecimiento. Aunque

25

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

Cepa: Horas Glucosa Xilosa Xilitol Etanol

ZW800: 15,5 30,64 81,36 0 36,05

ZW800: 38 0 37,29 0 69,82

ZW800: 62 0 32,34 0 70,47

ZW801-4: 0 95,7 89,3 0 3,2

ZW801-4: 15,5 28,04 80,82 0 37,75

ZW801-4: 38 0 36,13 0 70,54

ZW801-4: 62 0 30,28 0 71,25

ZW801-5: 0 95,7 89,3 0 3,2

ZW801-5: 15,5 55,61 85,62 0 21,86

ZW801-5: 38 0 46,83 0 64,92

ZW801-5: 62 0 39,54 0 66,19

ZW801-6: 0 95,7 89,3 0 3,2

ZW801-6: 15,5 32,34 82,02 0 34,89

ZW801-6: 38 0 36,39 0 70,64

ZW801-6: 62 0 29,55 0 71,74

Para confirmar los resultados de los experimentos en matraz de agitación que sugirieron que ZW801-4 actuó al menos tan bien como ZW800, estas dos cepas se compararon bajo condiciones controladas por pH. Los cultivos de siembra se cultivaron a 30ºC en medios que contenían 75 g/l de glucosa, 25 g/l de xilosa, 10 g/l de extracto de levadura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4. Cuando la DO600 alcanzó 4,6, se usaron alícuotas de 17 ml de los 5 cultivos de siembra para inocular los biorreactores controlados por pH que contenían 153 ml de medio de crecimiento. Los cultivos finales de 170 ml contenían 105 g/l de glucosa, 100 g/l de xilosa, 10 g/l de extracto de levadura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, sorbitol 5 mM y 7,2 g/l de acetato. El crecimiento era a 33ºC y el pH se mantuvo a 5,5 mediante adición automatizada de KOH 4N; la velocidad de mezclado era de 150 rpm. A diversos tiempos, se separaron alícuotas de los cultivos de los biorreactores para el análisis por HPLC del caldo de 10 fermentación tal como se ha descrito anteriormente, y también se hizo un seguimiento de la DO600. Bajo estas condiciones experimentales, las curvas de crecimiento para ZW800 y ZW801-4 estaban casi superpuestas (Figura 23A). Los transcursos de tiempo para el consumo de glucosa y xilosa también eran virtualmente idénticos, y ambas cepas producían la misma cantidad de etanol con cinéticas similares (Figura 23B). Además, ninguna de estas cepas producía ningún xilitol detectable. En base a estas observaciones, concluimos que la separación del Specr-casete de

15 la pauta de lectura abierta de GFOR no restauró o restauró parcialmente la actividad de la enzima GFOR, y que esta manipulación no afectó de manera adversa al rendimiento de la fermentación. Aunque ZW800 y ZW801-4 ambas funcionaban mejor que la cepa parental (ZW658), que tiene una enzima GFOR funcional, la cepa preferida para las aplicaciones comerciales es ZW801-4 puesto que no contiene un gen extraño que confiera resistencia a un antibiótico.

20 El análisis de secuencia del ADN genómico de ZW801-4 proporcionó prueba inequívoca de que en realidad había ocurrido el evento de escisión correcta con Cre. La secuencia de nucleótidos completa de la lectura abierta de GFOR alterada en ZW801-4 (a partir del codón de inicio original hasta el codón de parada original) se da en la SEQ ID NO:37, y la Figura 24 muestra un alineamiento de la secuencia mutante traducida con la proteína GFOR silvestre; ésta se codifica para el complemento inverso de nt 683751-685052 del número de acceso de GenBank AE008692.

25 Tal como se anticipó, la escisión con Cre del Specr-casete dejó un sitio loxP silvestre sencillo en el centro de la pauta de lectura abierta GFOR, y este evento de inserción dio como resultado un codón de parada en el marco que truncó prematuramente la proteína; la localización del “lox scar” está indicada mediante residuos resaltados en gris. La secuencia de nucleótidos mutantes también está perdiendo 72 pb de la secuencia de nucleótidos de GFOR silvestre original en la misma localización como resultado del diseño de la construcción suicida.

30

33

Claims

imagen1