ES2629332T3

ES2629332T3 - Variantes de lipasa

Info

Publication number: ES2629332T3
Application number: ES10180288.2T
Authority: ES
Inventors: Jesper Vind; Jürgen Carsten Franz KNÖTZEL; Kim Borch; Allan Svendsen; Thomas Honger Callisen; Debbie Yaver; Mads Eskelund Bjoernvad; Peter Kamp Hansen; Haiyan Ge; Michael Lamsa
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2027-01-22
Also published as: US20090029440A1; WO2007087508A2; EP2371948A1; EP1979477B1; CN105296445A; JP5133899B2; EP1979477A2; WO2007087508A8; BRPI0707202A2; JP2009523455A; CN105296445B; US8187854B2; DK2371949T3; CN101370933A; CN101370933B; WO2007087508A3; DK1979477T3; EP2371949A1; EP2371948B1; DK2371948T5

Abstract

Variante de una lipasa progenitora, donde la variante tiene actividad de lipasa, es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, y comprende las sustituciones S58N +V60S +I86V +A150G +L227G +T231 R +N233R +P256K (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Description

Variantes de lipasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a variantes de lipasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las lipasas son útiles, por ejemplo, como enzimas detergentes para eliminar manchas lipídicas o grasas de ropa y otros tejidos, como aditivos para masa de pan y otros productos horneados. De este modo, una lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus (sinónimo Humicola lanuginosa, EP 258 068 y EP 305 216) se vende para usar en detergente con el nombre comercial de Lipolase® (producto de Novo Nordisk A/S). WO 0060063 (US6939702B1) describe variantes de la lipasa de T. lanuginosus con un rendimiento de primer lavado particularmente bueno en una solución detergente. WO 9704079, WO 9707202 y WO 0032758 también revelan variantes de la lipasa de T. Lanuginosus.

[0003] En algunas aplicaciones, interesa minimizar la formación de ácidos grasos de cadena corta que generan olor. Así, se sabe que los detergentes para ropa con lipasas a veces pueden dejar olores residuales fijados a telas manchadas con leche (EP 430315). WO 02062973 divulga variantes de lipasa en las que la generación de olor se ha reducido por la unión de una extensión en el extremo C-terminal.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0004] Los inventores han descubierto que, mediante la introducción de mutaciones en ciertas regiones/posiciones de una lipasa, es posible mejorar las propiedades o características de la lipasa.

[0005] En un aspecto, la presente invención se refiere a una variante de una lipasa progenitora, en la que la variante tiene actividad de lipasa, es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y comprende las sustituciones S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

[0006] En otro aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de la invención, un vector de expresión que alberga dicha secuencia de ADN y una célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN o el vector de expresión.

[0007] En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la variante de lipasa de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0008] La Figura 1 muestra el alineamiento de lipasas.

LISTADOS DE SECUENCIAS

[0009]

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN que codifica la lipasa de Thermomyces lanoginosus. SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Thermomyces lanoginosus. SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia reflexa. SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Absidia corymbifera. SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizomucor miehei. SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Rhizopus oryzae. SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger. SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus tubingensis. SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium oxysporrum. SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Fusarium heterosporum. SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae. SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Penicillium camemberti. SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus foetidus. SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus niger. SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Aspergillus oryzae. SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Landerina penisapora.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Lipasas progenitoras

[0010] Se puede utilizar cualquier lipasa progenitora adecuada. En una forma de realización preferida, la lipasa progenitora puede ser una lipasa fúngica. En otra forma de realización preferida, la lipasa progenitora puede ser una lipasa con una secuencia de aminoácidos con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % de homología tal y como se define en la sección "Homología y alineamiento" con la secuencia de la lipasa de T. Lanuginosus mostrada en la SEQ ID NO: 2.

[0011] La lipasa progenitora puede ser un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o de Yarrowia; o más preferiblemente un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.

[0012] En un aspecto preferido, la lipasa progenitora es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis con actividad de lipasa.

[0013] En otro aspecto preferido, la lipasa progenitora es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0014] En otro aspecto preferido, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces.

[0015] En un aspecto más preferido, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En una forma de realización aún más preferida, la lipasa progenitora es la lipasa de la SEQ ID NO: 2.

Lipasas variantes

[0016] Las variantes de lipasa de la presente invención divulgación comprenden, en comparación con la lipasa progenitora, al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo consistente en:

a) al menos dos sustituciones en la región I, y

b) al menos una sustitución en la región II, y

c) al menos una sustitución en la región III, y

d) al menos una sustitución en la región IV,

y donde la variante tiene actividad de lipasa.

[0017] En consecuencia, la invención proporciona una variante de una lipasa progenitora, en la que la variante tiene actividad de lipasa, es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y comprende las sustituciones S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231 R+N233R+P256K (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

[0018] En una forma de realización preferida, la lipasa variante es una variante de una lipasa de Thermomyces, más preferiblemente, una lipasa de T. Lanuginosus, e incluso más preferiblemente la lipasa de T. Lanuginosus mostrada en la SEQ ID NO: 2. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

[0019] La lipasa variante puede ser una variante de una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.

[0020] En un aspecto preferido, la lipasa variante es una Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis variante. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.

[0021] La lipasa variante puede ser una variante de una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene además al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una lipasa progenitora codificada por un gen derivado/obtenido de uno de los siguientes organismos progenitores: Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose), Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0022] En otra forma de realización preferida, la variante es una variante de una lipasa de Thermomyces.

[0023] En una forma de realización más preferida, la lipasa progenitora es una lipasa de Thermomyces lanuginosus. En una forma de realización aún más preferida, la lipasa progenitora es la lipasa de la SEQ ID NO:

2.

Identificación de regiones y sustituciones

[0024] Las posiciones a las que se hace referencia en la Región I hasta la Región IV a continuación son las posiciones de los residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2. Para encontrar las posiciones correspondientes (u homólogas) en una lipasa distinta, se usa el procedimiento descrito en "Homología and alineamiento".

Sustituciones en la Región I

[0025] La Región I consiste en residuos de aminoácidos que rodean el residuo de E1 en el extremo N-terminal. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo. La variante de lipasa puede comprender al menos dos sustituciones en la Región I, tal como tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región I e incluir L227G T231R y N233R.

[0026] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la región I: 1, 2 a 11 y 223-239. Las siguientes posiciones son de interés particular: 1, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234, 236.

[0027] En particular se han identificado las siguientes sustituciones adicionales: X1N/* X4V.

[0028] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0029] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región II [0030] La Región II consiste en residuos de aminoácidos en contacto con sustrato en un lado de la cadena de acilo y un lado de la parte de alcohol. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo o con un aminoácido menos hidrofóbico.

[0031] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región II, tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región II e incluir P256K.

[0032] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región II: 202 a 211 y 249 a 269. Las siguientes posiciones son de interés particular: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256.

[0033] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones adicionales: X202G, X210K/W/A, y X255Y/V/A y X259G/M/Q/V.

[0034] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0035] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región III

[0036] La Región III consiste en residuos de aminoácidos que forman una estructura flexible y, por lo tanto, permiten que el sustrato entre en el sitio activo. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo o un aminoácido menos hidrofóbico.

[0037] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región III, tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región III e incluir I86V.

[0038] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región II 82 a 102. Las siguientes posiciones son de interés particular: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99.

[0039] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones adicionales: X83T y X90A/R.

[0040] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0041] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones en la Región IV

[0042] La Región IV consiste en residuos de aminoácidos que se unen electrostáticamente a una superficie. En esta región se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa progenitora con un aminoácido más positivo.

[0043] La variante de lipasa puede comprender al menos una sustitución en la Región IV, tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones en la Región IV e incluir S58N y V60S.

[0044] Los residuos de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región IV: 27 y 54 a 62. Las siguientes posiciones son de interés particular: 27, 56, 57, 58, 60.

[0045] En particular, se han identificado las siguientes sustituciones adicionales: X27R.

[0046] En una forma de realización preferida, la lipasa variante tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2

[0047] En una forma de realización más preferida, la lipasa variante es una variante de la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Aminoácidos en otras posiciones

[0048] La lipasa progenitora opcionalmente puede comprender alteraciones adicionales, por ejemplo sustitución de otros aminoácidos, particularmente menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5 alteraciones en comparación con una lipasa progenitora. Algunos ejemplos son sustituciones correspondientes a una o más de las posiciones 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 y 269 de la lipasa progenitora. En una forma de realización particular, hay una sustitución en al menos una de las posiciones correspondientes a la posición 81, 147, 150, 227 y 249. En una forma de realización preferida, al menos una sustitución se selecciona del grupo consistente en X38R, X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K, X227G y X249R/I/L.

5 [0049] La variante puede comprender sustituciones fuera de la Región I a IV definida; el número de sustituciones fuera de la región I a IV definida es preferiblemente menos de seis, por ejemplo cinco, cuatro, tres, dos o una sustitución.

10 [0050] Otras sustituciones, por ejemplo, se pueden hacer según principios conocidos en la técnica, por ejemplo las sustituciones descritas en WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Variantes de lipasa

15 [0051] Las lipasas variantes incluyen lipasas progenitoras idénticas a la SEQ ID NO: 2 que tienen las sustituciones enumeradas en la siguiente tabla (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Región I: Región II Región III Región IV Regiones exteriores

L227G + T231 R + N233R: P256K I86V S58N + V60S A150G

L227G + T231R + N233R: P256K I86V S58N + V60S A150G

Nomenclatura para modificaciones de aminoácidos

20 [0052] Al describir variantes de lipasa según la invención, se usa la nomenclatura siguiente para facilitar la referencia:

Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminácido(s) sustituído(s)

25 [0053] Según esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de ácido glutámico por glicina en la posición 195 se muestra como G195E. Una deleción de glicina en la misma posición se muestra como G195*, y la inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como la lisina se muestra como G195GK.

30 [0054] Cuando una lipasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras lipasas y se hace una inserción en esa posición, esto se indica como *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.

[0055] Las mutaciones múltiples se separan por el signo más, por ejemplo: R170Y+G195E, que representa mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, 35 respectivamente.

[0056] X231 indica el aminoácido en un polipéptido progenitor que corresponde con la posición 231, cuando se aplica el procedimiento de alineamiento descrito. X231R indica que el aminoácido se sustituye con R. Para la SEQ ID NO: 2, X es T, y X231 R indica de este modo una sustitución de T en la posición 231 con R. Cuando el

40 aminoácido que está en una posición (por ejemplo 231) se puede sustituir por otro aminoácido seleccionado de un grupo de aminoácidos, por ejemplo el grupo consistente en R y P e Y, esto será indicado por X231R/P/Y.

[0057] En cualquier caso, se emplea la abreviatura de aminoácidos de una letra o de tres letras aceptada por la IUPAC. 45 Agrupamiento de los aminoácidos

[0058] En esta especificación, los aminoácidos se clasifican como cargados negativamente, cargados positivamente o eléctricamente neutros según su carga eléctrica a pH 10. De este modo, los aminoácidos 50 negativos son E, D, C (cisteína) e Y, particularmente E y D. Los aminoácidos positivos son R, K y H, particularmente R y K. Los aminoácidos neutros son G, A, V, L, I, P, F, W, S, T, M, N, Q y C cuando forman parte de un puente disulfuro. Una sustitución con otro aminoácido del mismo grupo, (negativo, positivo o neutro) se

denomina sustitución conservadora.

[0059] Los aminoácidos neutros se pueden dividir en hidrofóbicos o no polares (G, A, V, L, I, P, F, W y C como parte de un puente disulfuro) e hidrofílicos o polares (S, T, M, N, Q).

Identidad de los aminoácidos

[0060] La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".

[0061] Para los fines de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización por apertura de gap es 10, y la penalización por extensión de gap es 0,5.

[0062] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención"; por ejemplo, los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 2) y una secuencia de aminoácidos diferente ("secuencia extraña") se calcula como el número de coincidencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", la que sea más corta. El resultado se expresa en identidad porcentual.

[0063] Una correspondencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la "secuencia extraña" tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de la superposición. La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos de la secuencia (por ejemplo, la longitud de la SEQ ID NO: 2 es 269).

[0064] El procedimiento anterior se puede utilizar para el cálculo de la identidad, así como de la homología y para el alineamiento. En el contexto de la presente invención, la homología y el alineamiento se han calculado como se describe a continuación.

Homología y alineamiento

[0065] Para los fines de la presente invención, el grado de homología se puede determinar adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), usando GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de gap de 3,0 y penalización por extensión de gap de 0,1.

[0066] En la presente invención, las posiciones correspondientes (u homólogas) en las secuencias de lipasa de

Absidia reflexa, Absidia corymbefera, Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Penicilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (sinónimo: Humicola lanuginose) y Landerina penisapora se definen por el alineamiento mostrado en la figura 1.

[0067] Par encontrar las posiciones homólogas en secuencias de lipasa no mostradas en el alineamiento, la secuencia de interés se alinea con las secuencias mostradas en la figura 1. La nueva secuencia se alinea con el presente alineamiento de la figura 1 usando el alineamiento de gaps con la secuencia más homóloga encontrada por el programa GAP. GAP se encuentra en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45) Los siguientes ajustes se usan para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de gap de 3,0 y penalización por extensión de gap de 0,1.

Hibridación

[0068] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lipasa que son codificados por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia preferiblemente baja, más preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, aún más preferiblemente condiciones de astringencia alta, y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy alta con (i) los nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 178 a 660 de la SEQ ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, Nueva York). Una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o, preferiblemente, al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene actividad de lipasa.

[0069] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia muy baja a muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3 %, 200 ug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y o bien formamida al 25 % para astringencias muy baja y baja, o bien formamida al 35 % para astringencias media y media-alta, o bien formamida al 50 % para astringencias alta y muy alta, siguiendo procedimientos Southern blot estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.

[0070] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2 % preferiblemente a al menos 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente a al menos 50°C (astringencia baja), más preferiblemente a al menos 55°C (astringencia media), más preferiblemente a al menos 60°C (astringencia media-alta), aún más preferiblemente a al menos 65°C (astringencia alta), y de la forma más preferible a al menos 70°C (astringencia muy alta).

Secuencia de ADN, vector de expresión, célula huésped, producción de lipasa

[0071] La invención proporciona una secuencia de ADN que codifica la lipasa de la invención, un vector de expresión que alberga la secuencia de ADN y una célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN o el vector de expresión. Estos se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica.

[0072] La invención también proporciona un método para producir la lipasa mediante el cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones propicias para la producción de la lipasa y la recuperación de la lipasa del caldo resultante. El método se puede practicar según principios conocidos en la técnica.

Actividad de lipasa

Actividad de lipasa en tributirina a pH neutro (LU)

[0073] Se prepara un sustrato para lipasa emulsionando tributirina (tributirato de glicerina) utilizando goma arábiga como emulsionante. La hidrólisis de tributirina a 30 °C a pH 7 o 9 se observa en un análisis volumétrico pH-stat. Una unidad de actividad de lipasa (1 LU) es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micromol de ácido butírico/min a pH 7.

Riesgo Beneficio

[0074] El factor de ries-beneficio que describe el rendimiento en comparación con el riesgo reducido de olor se define como: BR = RPmedio / R, como se describe a continuación.

Usos

[0075] Las enzimas de la presente invención pueden tener un uso industrial, por ejemplo incluirse en composiciones detergentes para eliminar materia grasa.

[0076] Elementos descritos en la solicitud.

Elemento 1. Una variante de una lipasa progenitora, donde la variante comprende al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo consistente en (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración):

a) al menos dos sustituciones en la Región I, y b) al menos una sustitución en la Región II, y c) al menos una sustitución en la Región III, y d) al menos una sustitución en la Región IV;

y donde la variante tiene actividad de lipasa.

Elemento 2. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde al menos dos sustituciones en la Región I de la lipasa progenitora comprenden sustituciones de los aminoácidos en las posiciones que corresponden con las posiciones 231 y 233 (usando la SEQ ID NO:2 para la numeración).

Elemento 3. Una variante de lipasa según el elemento 2, donde al menos dos sustituciones en la Región I de la lipasa progenitora comprende sustituciones de un R de los aminoácidos en las posiciones que corresponden con las posiciones 231 y 233 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 4. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde la lipasa variante es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 9 8%, 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.

Elemento 5. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde la lipasa progenitora es la lipasa con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Elemento 6. Una variante de lipasa según el elemento 2, donde la lipasa comprende otra sustitución en la posición que corresponde con la posición 4 y/o posición 227 de la SEQ ID NO: 2.

Elemento 7. Una variante de lipasa según el elemento 6, donde la lipasa tiene una sustitución que corresponde con X4V y X227G (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 8. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde al menos una sustitución en la Región II de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 202, 210, 211, 255 y 256 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 9. Una variante de lipasa según el elemento 8, donde al menos una sustitución en la lipasa progenitora se selecciona del grupo consistente en X202G, X210K, X211 L, X255Y/V y X256K (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 10. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde al menos una sustitución en la Región III de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 83, 86 y 90 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 11. Una variante de lipasa según el elemento 10, donde al menos una sustitución en la lipasa progenitora se selecciona del grupo consistente en X83T, X86V y X90A/R (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 12. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde al menos una sustitución en la Región IV de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 27, 58 y 60 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 13. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde al menos una sustitución en la región IV de la lipasa progenitora comprende sustituciones seleccionadas del grupo consistente en X27R, X58N/A/G/P/T y X60S/V/G/N/R/K/A/L (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 14. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde la variante de lipasa comprende además al menos una sustitución en la lipasa progenitora que se selecciona del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con la posición 81, 147, 150, 227 y 249 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 15. Una variante de lipasa según el elemento 1, donde la variante de lipasa comprende además al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en X81Q/E, X147M/Y, X150G y X249R/I/L (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).

Elemento 16. Una variante de lipasa del elemento 1, donde la lipasa comprende una sustitución seleccionada del grupo siguiente de sustituciones:

a) T231R + N233R + I255Y

b) I202G + T231R + N233R

c) I86V + L227G + T231R + N233R + P256K

d) Q4V + S58N + V60S + T231R + N233R

e) S58N + V60S + I90R + T231R + N233R

f) I90A + T231R + N233R + I255V

g) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R + P256K

h) S58N + V60S + L147M + F211 L + T231 R + N233R

i) Q4V + S58A + V60S + S83T + I86V + A150G + E210K + L227G + T231R + N233R + P256K

j) S58N + V60S + I86V + A150G + L227G + T231R + N233R + P256K

Elemento 17. Una secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de los elementos 1-16.

Elemento18. Un vector de expresión que alberga la secuencia de ADN del elemento 17.

Elemento 19. Una célula huésped transformada con la secuencia de ADN del elemento 17.

Elemento 20. Un método para producir una variante de lipasa, método que comprende el cultivo de la célula huésped transformada del elemento 19 bajo condiciones propicias para la producción de la variante de lipasa y la recuperación de la variante de lipasa del caldo resultante.

Elemento 21. Una variante de SEQ ID NO: 2 que comprende al menos una de las mutaciones Q4V, S58N/A/G/P/T, I90R o Q249I/L.

EJEMPLOS

[0077] Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

Medios y soluciones

[0078]

Producto: Nombre comercial

LAS:: Surfac PS

Zeolite A: Wessalith P

Otros ingredientes usados son reactivos estándar de laboratorio.

Materiales

Proveedor del producto

[0079] EMPA221 EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Switzerland

Ejemplo 1

Producción de la enzima

[0080] Un plásmido que contiene el gen que codifica la lipasa se construye y se transforma en una célula huésped adecuada usando métodos estándar de la técnica.

[0081] La fermentación se realiza como una fermentación por lote alimentado utilizando una temperatura de medio constante de 34°C y un volumen inicial de 1,2 litros. El pH inicial del medio se fija a 6.5. Una vez el pH ha aumentado hasta 7.0, este valor se mantiene a través de la adición de H3PO4 al 10 %. El nivel de oxígeno disuelto en el medio se controla variando el índice de agitación y utilizando un índice de aireación fijo de 1,0 litro de aire por litro de medio por minuto. El ritmo de adición de la alimentación se mantiene a un nivel constante durante toda la fase de lote alimentado.

[0082] El medio de lote contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono, urea y extracto de levadura como fuentes de nitrógeno y una mezcla de sales y trazas metálicas. La alimentación añadida continuamente durante la fase de lote alimentado contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono, mientras que se añade extracto de levadura y urea para asegurar un suministro suficiente de nitrógeno.

[0083] La purificación de la lipasa puede realizarse usando métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo mediante filtración del sobrenadante de fermentación y, posteriormente, cromatografía hidrofóbica y cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo como se describe en EP 0 851 913 EP, ejemplo 3.

Ejemplo 2

AMSA - ensayo de esfuerzo mecánico automatizado - para el cálculo del rendimiento relativo (RP)

[0084] Las variantes de enzimas de la presente aplicación se evalúan utilizando el ensayo de esfuerzo mecánico automatizado (AMSA). Con la prueba AMSA se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones de detergente enzimático de pequeño volumen. La placa del AMSA tiene varias ranuras para soluciones de prueba y una tapa que comprime firmemente la muestra de textil que se ha de lavar contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de prueba, el textil y la tapa se agitan enérgicamente para poner la solución de prueba en contacto con el textil y aplicar tensión mecánica. Para una mayor descripción, véase WO02/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24. Los contenedores, que contienen la solución detergente de prueba, consisten en agujeros cilíndricos (6 mmv de diámetro, 10 mm de profundidad) en una placa metálica. El tejido manchado (material de prueba) descansa sobre la placa metálica y se usa como tapa y sello en los contenedores.Otra placa metálica descansa sobre el tejido manchado para evitar cualquier vertido de cada contenedor.Las dos placas metálicas

con el tejido manchado se someten a vibración vertical a una frecuencia de 30 Hz con una amplitud de 2 mm. [0081] El ensayo se lleva a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas a continuación:

Tabla 3

Solución de prueba: 0,5 g/l de LAS 0,52 g/l de Na2CO3 1,07 g/l de Zeolite A 0,52 g/l Citrato de Na3

Volumen de la solución de prueba: 160 micro l

pH: Sin alterar (≈9.9)

Tiempo de lavado: 20 minutos

Temperatura: 30 °C

Dureza del agua: 15°dH Proporción de Ca2+/Mg2+/NaHCO3: 4:1:7,5

Concentración enzimática en la solución de prueba: 0,125, 0,25, 0,50,1,0 mg ep / l

Secado: Rendimiento: Después del lavado, la pieza de textil se enjuaga inmediatamente en agua del grifo y se seca al aire a 85C en 5 min Olor: después del lavado, la pieza de textil se enjuaga inmediatamente en agua de grifo y se seca a temperatura ambiente (20°C) durante 2 horas

Material de prueba: Muestra de cúrcuma-nata como se describe a continuación (EM-PA221 usado como textil de algodón)

[0086] Se prepararon muestras de cúrcuma-nata mezclando 5 g de cúrcuma (Santa Maria, Dinamarca) con 100 g de nata (38 % de grasa, Aria, Dinamarca) a 50 °C, la mezcla se dejó a esta temperatura durante

10 aproximadamente 20 minutos y se filtró (50°C) para eliminar cualquier partícula no disuelta. La mezcla se enfrió hasta 20°C. Se sumergieron muestras de tejido de algodón, EMPA221, en la mezcla de nata-cúrcuma y después se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche y se congelaron hasta su uso. La preparación de las muestras de nata-cúrcuma se describe en la solicitud de patente WO 2006/125437.

15 [0087] El rendimiento de la variante de la enzima se mide como el brillo del color de las muestras de textil lavadas con esa variante de enzima específica. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada desde la muestra cuando se la ilumina con luz blanca. Cuando el textil está manchado, la intensidad de la luz reflejada es menor que en un textil limpio. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede utilizarse para medir el rendimiento de lavado de una variante de una enzima.

20 [0088] Las mediciones de color se hacen con un escáner profesional de superficie plana (PFU DL2400pro), que se usa para capturar una imagen de las muestras de textil lavadas. La toma de imágenes se realiza con una resolución de 200 dpi y con una intensidad del color resultante de 24 bits. Para obtener resultados precisos, a menudo el escáner se calibra con una carta IT8 reflectante de Kodak.

25 [0089] Para extraer un valor para la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, se usa una aplicación de software especialmente diseñada (Novozymes Color Vector Analyzer). El programa recupera los valores de 24 bits por píxel de la imagen y los convierte en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula sumando los valores RGB entre sí como vectores y luego tomando la longitud del vector resultante:

[0090] El rendimiento de lavado (P) de las variantes se calcula de acuerdo con la fórmula siguiente:

35 donde

Int(v) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del textil lavada con enzimas, y Int(r) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del textil lavada sin enzimas.

40 Una puntuación de rendimiento relativo se da como el resultado del lavado AMSA conforme a la definición: Las puntuaciones de rendimiento relativo (RP) recogen los rendimientos (P) de las variantes de enzima de prueba respecto a la enzima de referencia:

RP = P(enzima de prueba) / P(enzima de referencia)

RPmedio indica el rendimiento relativo medio en comparación con la enzima de referencia en las cuatro concentraciones enzimáticas (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 mg de ep/l) RPmedio = medio(RP(0,125), RP(0,25) RP(0,5), RP(1,0))

[0091] Se considera que una variante muestra un rendimiento del lavado mejorado si tiene un rendimiento mejor que la referencia. En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R.

Ejemplo 3

GC - Cromatógrafo de gases - para el cálculo del factor de riesgo

[0092] La liberación de ácido butírico de las muestras lavadas con lipasa se midió por microextracción en fase sólida - cromatografía de gases (SPME-GC) utilizando el método siguiente. Cuatro piezas de textil (5 mm de diámetro), lavadas en la solución especificada en la Tabla 3 que contiene 1 mg/l de lipasa, se transfirieron a un vial de un cromatógrafo de gases (GC). Las muestras se analizaron en un Varian 3800 GC equipado con un Stabilwax- DA con columna Integra-Guard (30 m, 0,32 mm de ID y 0,25 micro-m de df) y una fibra Carboxen MEFS PDMS (75 micro-m). Cada muestra se preincubó durante 10 min a 40°C seguidos de 20 min de muestreo con la fibra MEFS en el espacio por encima de las piezas de textil. La muestra se inyectó posteriormente sobre la columna (temperatura de inyector = 250°C). Flujo de columna = 2 ml de helio/min. Gradiente de temperatura de horno de columna: 0 min = 40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. El ácido butírico se detectó con un detector de ionización de llama (FID) y la cantidad de ácido butírico se calculó en función de una curva estándar de ácido butírico.

[0093] El riesgo de rendimiento de olor, R, de una variante de lipasa es la proporción entre la cantidad de ácido butírico liberado desde la muestra lavada de variante de lipasa y la cantidad de ácido butírico liberado desde una muestra lavada con la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231R + N233R (enzima de referencia), después de que ambos valores hayan sido corregidos para la cantidad de ácido butírico liberado desde una muestra lavada sin lipasa. El riesgo (R) de las variantes se calcula según la fórmula siguiente:

Olor = medido en micro g de ácido butírico desarrollado en 1 mg de proteína enzimática / l corregido en blanco

Alfa enzima de prueba = Olor enzima de prueba - Blanco

Alfa enzima de referencia = Olor enzima de referencia - Blanco

R = Alfa enzima de prueba / Alfa enzima de referencia

Se considera que una variante muestra un olor reducido en comparación con la referencia si el R factor es inferior a 1.

Ejemplo 4

Actividad (LU) con respecto a la absorbancia a 280 nm

[0094] La actividad de una lipasa respecto a la absorbancia a 280 nm se determina mediante el ensayo siguiente:

LU/A280:

[0095] La actividad de la lipasa se determina como se ha descrito anteriormente en la sección Actividad de lipasa. Se mide la absorbancia de la lipasa a 280 nm (A280) y se calcula la proporción LU/A280. La relación LU/A280 se calcula como la LU/A280 de la variante dividida por la LU/A280 de una enzima de referencia. En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la lipasa de la SEQ ID NO: 2 con las sustituciones T231 R + N233R.

Ejemplo 5

BR - Riesgo Beneficio

[0096] El factor de Riesgo-Beneficio que describe el rendimiento en comparación con el riesgo reducido de olor se define como:

BR = RPmedio / R

Se considera que una variante muestra un rendimiento de lavado mejorado y un olor reducido si el factor BR es superior a 1. [0097] Al aplicar los métodos anteriores, se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 4

Variante: Mutaciones en la SEQ ID NO: 2 RP medio (RPmedio) BR LU/A280

1: I202G + T231 R + N233R 0,84 1,41 no determinado

2: I86V + L227G + T231 R + N233R + P256K 1,08 1,52 1700

3: Q4V + S58N + V60S + T231 R + N233R 0,87 1,73 1950

4: S58N + V60S + I90R + T231 R + N233R 1,06 1,27 2250

5: I255Y + T231 R + N233R 1,19 1,17 3600

6: I90A + T231 R + N233R + I255V 1,13 1,14 2700

Referencia: T231 R + N233R 1,00 1,00 3650

7: G91A + E99K + T231R+N233R + Q249R + 270H + 271T + 272P + 273S + 274S + 275G + 276R + 277G + 278G + 279H + 280R 0,43 no determinado 850

8: G91A + E99K + T231 R, N233R + 249R + 270H + 271T + 272P + 273S + 274S + 275G + 276R + 277G + 278G 0,13 no determinado 500

10 [0098] La lipasa de referencia y las variantes 7 y 8 de la Tabla 4 se describen en WO 2000/060063.

Ejemplo 6

15 BR - Riesgo Beneficio

[0099] Se midió el Riesgo-Beneficio para las variantes enumeradas en la Tabla 5. El factor de Riesgo-Beneficio se midió de la misma manera que se describe en el Ejemplo 5 y estuvo por encima de 1 para todas las variantes enumeradas.

Tabla 5

Variante: Mutaciones en la SEQ ID NO: 2

Referencia: T231R + N233R

9: L97V+ T231R+N233R

10: A150G+T231R+N233R

11: I90R+T231R+N233R

12: I202V+T231R+N233R

13: L227G+ T231R+ N233R+ P256K

14: I90A+ T231R+ N233R

15: T231R+N233R+ I255P

16: I90V+I255V+T231R+N233R

17: F211L+ L227G+ T231R+ N233R+ I255L+ P256K

18: S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L

19: S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249I

20: A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

21: K46L+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

22: Q4L+ E43T+ K46I+ S58N+ V60S+ T231 R+ N233R+ Q249L+ D254I

23: Q4L+ S58N+ V60S+ T231 R+ N233R+ Q249L+ D254I

24: K46I+ S58N+ V60S+ T231 R+ N233R+ Q249L+ D254L

25: K46L+ S58N+ V60S+ K223I+ T231R+ N233R+ D254I

26: E43T+ K46I+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ Q249L+ D254I

27: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

28: K24R+ K46R+ K74R+ I86V+ K98R+ K127R+ D137K+ A150G+ K223R+ T231R+ N233R

29: S58A+V60A+ I86V+T231R+N233R

30: K24R+ K46R+ S58N+ V60S+ K74R+ I86V+ K98R+ K127R+ D137K+ K223R+ T231R+ N233R

31: S58A+ V60A+ I86V+ A150G+ T231 R+ N233R

32: S58N+ V60V+ D62G+ T231 R+ N233R

33: Q4V+ S58N+ V60S+ I86V+ T231 R+ N233R+ Q249L

34: Q4V+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ T231R+ N233R+ I255V

35: Q4V+ S58N+ V60S+ I90A+ A150G+ T231R+ N233R+ I255V

36: Y53A+ S58N+ V60S+ T231R+ N233R+ P256L

37: I202L+ T231R+ N233R+ I255A

38: S58A+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231 R+ N233R+ P256K

39: D27R+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231 R+ N233R+ P256K

40: V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

41: Q4V+ S58A+ V60S+ S83T+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

42: Q4V+ V60K+ S83T+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

43: D27R+ V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

44: Q4N+ L6S+ S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ L227G+ T231 R+ N233R+ P256K

45: E1N+ V60K+ I86V+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

46: V60K+ I86V+ A150G+ K223N+ G225S+ T231 R+ N233R+ P256K

47: E210V+ T231R+ N233R+ Q249R

48: S58N+ V60S+ E210V+ T231R+ N233R+ Q249R

49: Q4V+ V60K+ I90R+ T231R+ N233R+ I255V

50: Q4V+ V60K+ A150G+ T231R+ N233R

51: V60K+ S83T+ T231R+ N233R

52: V60K+ A150G+ T231 R+ N233R+ I255V

53: T231 R+ N233G+ D234G

54: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ Q249R+ P256K

55: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

56: S58N+ V60S+ I86V+ A150G+ G156R+ E210K+ L227G+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

57: S58T+ V60K+ I86V+ N94K+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

58: S58T+ V60K+ I86V+ D102A+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

59: S58T+ V60K+ I86V+ D102A+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

60: S58T+ V60K+ S83T+ I86V+ N94K+ A150G+ E210V+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

61: S58A+ V60S+ I86V+ T143S+ A150G+ L227G+ T231R+ N233R+ P256K

62: G91S+ D96V+ D254R

63: V60L+ G91M+ T231W+ Q249L

64: T37A+ D96A+ T231R+ N233R+ Q249G

65: E56G+E87D+T231R+N233R+D254A

66: E210K+T231R+N233R

67: D27H+E87Q+D96N+T231R+N233R+D254V

68: F181L+E210V+T231R+N233R

69: D27N+ D96G+ T231R+ N233R

70: D96N+ T231R+ N233R

71: T231 R+ N233I+ D234G

72: S58K+ V60L+ E210V+ Q249R

73: S58H+ V60L+ E210V+ Q249R

74: Q4V+ F55V+ I86V+ T231R+ N233R+ I255V

75: Q4V+ S58T+ V60K+ T199L+ N200A+ E210K+ T231 R+ N233R+ I255A+ P256K

76: Q4V+ D27N+ V60K+ T231 R+ N233R

77: I90F+ I202P+ T231R+ N233R+ I255L

78: S58N+ V60S+ D158N+ T231R+ N233R

79: S58N+ V60S+ S115K+ T231R+ N233R

80: S58N+ V60S+ L147M+ A150G+ F211L+ T231 R+ N233R

81: V60K+ A150G+ T231R+ N233R

82: I90V+L227G+T231R+N233R+ P256K

83: T231R+N233R+ I255S

84: I86G+ T231R+ N233R

85: V60K+ I202V+ E210K+ T231R+ N233R+ I255A+ P256K

86: I90G+ I202L+ T231R+ N233R+ I255S

87: S58G+ V60G+ T231R+ N233R

[0100] La lipasa de referencia se describe en WO 2000/060063.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0101]

<110> Novozymes A/S

10 Novozymes North America, Inc. Vind, Jesper Knotzel, Jurgen Carsten Franz Borch, Kim

Svendsen, Allan Callisen, Thomas Honger Yaver, Debbie Bjornvad, Mads Eskelund Hansen, Peter Kamp Ge, Haiyan Lamsa, Michael

<120> Variantes de lipasa

<130> 10928-EP-ETD

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<400> 1 gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat

48 Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192 Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc

240 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 65 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288 Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336 Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384 Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432 Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140

cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt

480 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528 Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576 Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr 180 185 190

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624 Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro 195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gag tac tgg atc aaa tct 672 Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser 210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat atc gtg aag ata gaa ggc

720 Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly 225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768 Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro 245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807 Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu 260 265

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr 20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe 65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly 100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly 130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr 180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro 195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser 210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly 225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro 245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu 260 265

<210> 3

<211> 265

<212> PRT

<213> Absidia reflexa

<400> 3

Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile 1 5 10 15

Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg 20 25 30

Thr Val Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala 35 40 45

Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr 50 55 60

Asn Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val 65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe 85 90 95

Val Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly 100 105 110

Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val 115 120 125

Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly 130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr 145 150 155 160

His His Gly His Ala Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg 165 170 175

Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro 180 185 190

Tyr Gln Arg Leu Val His Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro 195 200 205

Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys 210 215 220

Asp Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys 225 230 235 240

Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr 245 250 255

Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu 260 265

<210> 4

<211> 264

<212> PRT

<213> Absidia corymbifera

<400> 4

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys

1 5 10 15

Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr 20 25 30

Val Ile Pro Gly Gly Gln Trp Ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro 35 40 45

Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn 50 55 60

Val Leu Val Ala Val Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe 65 70 75 80

Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe Val 85 90 95

Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe 100 105 110

Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys 115 120 125

Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His 130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His 145 150 155 160

His Gly His Asp Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile 165 170 175

Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr 180 185 190

Gln Arg Leu Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly 195 200 205

Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp 210 215 220

Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser 225 230 235 240

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu 245 250 255

Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu 260

<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<400> 5

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu 1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val 20 25 30

Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp 35 40 45

Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala 50 55 60

Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg 65 70 75 80

Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro 85 90 95

Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu 100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp 115 120 125

Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser 130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg 145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln 165 170 175

Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly 180 185 190

Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu 195 200 205

Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile 210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu 225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp 245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr 260 265

<210> 6

<211> 271

<212> PRT

<213> Rhizopus oryzae

<400> 6

Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile 1 5 10 15

Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg 20 25 30

Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp 35 40 45

Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp 50 55 60

Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80

Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val 85 90 95

Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala 100 105 110

Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val 115 120 125

Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr 130 135 140

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu 145 150 155 160

Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr 165 170 175

Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu 180 185 190

Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val 195 200 205

Pro His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu 210 215 220

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu 225 230 235 240

Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile 245 250 255

Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu 260 265 270

<210> 7

<211> 267

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 7

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp 1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr 20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile 35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser 50 55 60

Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro 85 90 95

Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val 100 105 110

Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln 115 120 125

Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser 130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile 145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala 165 170 175

Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln 180 185 190

Tyr Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro 195 200 205

Val Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp 210 215 220

Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln 225 230 235 240

Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr 245 250 255

Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp 260 265

<210> 8

<211> 266

<212> PRT

<213> Aspergillus tubingensis

<400> 8

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp 1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr 20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile 35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser 50 55 60

Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro 85 90 95

Gln Cys Asn Ser Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile 100 105 110

Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Gln Gln Gln Val Ser Gln 115 120 125

Phe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser 130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile 145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Asn Gln Ala Phe Ala Ser

165 170 175

Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr 180 185 190

Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala 195 200 205

Asp Glu Gly Tyr Ala His Gly Val Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp Pro 210 215 220

Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys 225 230 235 240

Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr 245 250 255

Phe Gly Met Thr Ser Gly His Cys Thr Trp 260 265

<210> 9

<211> 276

<212> PRT

<213> Fusarium oxysporum

<400> 9

Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile 1 5 10 15

Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser 20 25 30

Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly 35 40 45

Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly 50 55 60

Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg 65 70 75 80

Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln 85 90 95

Glu Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln 100 105 110

Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser 115 120 125

Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser 130 135 140

Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly 145 150 155 160

Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn 165 170 175

Ala Gln Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg 180 185 190

Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe 195 200 205

Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220

Asp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala 225 230 235 240

Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala 245 250 255

His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe 260 265 270

Ser Trp Arg Arg 275

<210> 10

<211> 273

<212> PRT

<213> Fusarium heterosporum

<400> 10

Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu Ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Gln His 1 5 10 15

Ala Asp Ala Ala Tyr Cys Asn Phe Asn Thr Ala Val Gly Lys Pro Val 20 25 30

His Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Asp Ile Glu Lys Asp Ala Ala Ile 35 40 45

Val Val Gly Ser Val Val Gly Thr Lys Thr Gly Ile Gly Ala Tyr Val 50 55 60

Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Val Arg Gly Ser 65 70 75 80

Ile Asn Val Arg Asn Trp Ile Thr Asn Phe Asn Phe Gly Gln Lys Thr 85 90 95

Cys Asp Leu Val Ala Gly Cys Gly Val His Thr Gly Phe Leu Asp Ala

100 105 110

Trp Glu Glu Val Ala Ala Asn Val Lys Ala Ala Val Ser Ala Ala Lys 115 120 125

Thr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly 130 135 140

Gly Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe 145 150 155 160

Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Asp Phe 165 170 175

Phe Ala Asn Phe Val Thr Gln Gln Thr Gly Ala Glu Tyr Arg Val Thr 180 185 190

His Gly Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr 195 200 205

Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Gly Gly Pro Leu Asp Lys 210 215 220

Asp Tyr Thr Val Thr Glu Ile Lys Val Cys Glu Gly Ile Ala Asn Val 225 230 235 240

Met Cys Asn Gly Gly Thr Ile Gly Leu Asp Ile Leu Ala His Ile Thr 245 250 255

Tyr Phe Gln Ser Met Ala Thr Cys Ala Pro Ile Ala Ile Pro Trp Lys 260 265 270

Arg

<210> 11

<211> 278

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 11

Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr 1 5 10 15

Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu 20 25 30

Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly 35 40 45

Ser Thr Val Lys Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala 50 55 60

Gly Phe Val Ala Val Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe 65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro 85 90 95

Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe 100 105 110

Trp Thr Ala Trp Lys Val Val Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp 115 120 125

Glu Leu Lys Pro Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His 130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr 145 150 155 160

Lys Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala 165 170 175

Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg 180 185 190

Phe Thr His Asn Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met 195 200 205

Gly Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn 210 215 220

Thr Thr Val Thr Asp Asn Gln Val Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn 225 230 235 240

Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala 245 250 255

Phe His Ser His Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly 260 265 270

Pro Gly Leu Pro Leu Arg 275

<210> 12

<211> 278

<212> PRT

<213> Penicillium camemberti

<400> 12

Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr

1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp 20 25 30 Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly 35 40 45 Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala 50 55 60

Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe 65 70 75 80 Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val

85 90 95 His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe 100 105 110 Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys 115 120 125 Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His 130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly 145 150 155 160 Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val

165 170 175 Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe 180 185 190 Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser 195 200 205 Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn 210 215 220

Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val 225 230 235 240 Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe

245 250 255 Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro 260 265 270 Gly Leu Pro Phe Lys Arg

275

<210> 13

<211> 270

<212> PRT

<213> Aspergillus foetidus

<400> 13

Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp 1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn 20 25 30

Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr 35 40 45

Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala 50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile 85 90 95

Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly 100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile 115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly 130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg 145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile 165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190

Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro 195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser 210 215 220

Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly 225 230 235 240

Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Leu 245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 260 265 270

<210> 14

<211> 270

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 14

Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp 1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn 20 25 30

Val Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr 35 40 45

Lys Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala 50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile 85 90 95

Leu Gln Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly 100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile 115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly 130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg 145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val 165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190

Asn Phe Pro Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro 195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser 210 215 220

Gly Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly 225 230 235 240

Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu 245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 260 265 270

<210> 15

<211> 269

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 15

Asp Val Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys 20 25 30

Leu Thr Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr 35 40 45

Gln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala 50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Asp Leu Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly 85 90 95

Leu Glu Asp Ala Ser Asp Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly 100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Ser Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val 115 120 125

Glu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly 130 135 140

His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg 145 150 155 160

Asn Ser Gly His Ser Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu 165 170 175

Gly Asn Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly 180 185 190

Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro 195 200 205

Thr Leu Leu Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser 210 215 220

Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly 225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp 245 250 255

Ala His Arg Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser 260 265

<210> 16

<211> 251

<212> PRT

<213> Landerina penisapora

<400> 16

Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu Val Lys Tyr Ala 1 5 10 15

Thr Tyr Ala Gly Leu Ala Tyr Gln Thr Thr Asp Ala Trp Pro Ala Ser 20 25 30

Arg Thr Val Pro Lys Asp Thr Thr Leu Ile Ser Ser Phe Asp His Thr 35 40 45

Leu Lys Gly Ser Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Asn Glu Pro Cys Lys Glu 50 55 60

Ile Ile Val Ala Tyr Arg Gly Thr Asp Ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr 65 70 75 80

Asn Leu Asn Phe Asp Lys Thr Ala Trp Pro Ala Asn Ile Ser Asn Ser 85 90 95

Leu Val His Glu Gly Phe Leu Asn Ala Tyr Leu Val Ser Met Gln Gln 100 105 110

Val Gln Glu Ala Val Asp Ser Leu Leu Ala Lys Cys Pro Asp Ala Thr 115 120 125

Ile Ser Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile Ser 130 135 140

Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val 165 170 175

Glu Asn Leu Gly His Pro Val Phe Arg Val Val Tyr Arg His Asp Ile 180 185 190

Val Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln 195 200 205

Glu Val Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Asn Ile Lys Phe Cys Lys Gly Glu 210 215 220

Gly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly Val Pro Phe Ser Glu Leu Asn 225 230 235 240

Ala Lys Asp His Ser Glu Tyr Pro Gly Met His 245 250

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence used in the alignment example

<400> 17

Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu 1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence used in the alignment example

<400> 18

His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser 1 5 10

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Variante de una lipasa progenitora, donde la variante tiene actividad de lipasa, es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, y comprende las sustituciones S58N +V60S +I86V +A150G +L227G +T231 R +N233R +P256K (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
2.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la lipasa progenitora es la lipasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
3.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la lipasa comprende otra sustitución en la posición que corresponde a la posición 4 de la SEQ ID NO: 2.
4.

Variante de lipasa de la reivindicación 3, donde la sustitución es X4V.
5.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la variante de lipasa comprende además sustituciones seleccionadas del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con las posiciones 202, 210, 211, y 225 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
6.

Variante de lipasa de la reivindicación 5, donde las sustituciones son X202G, X210K, X211 L, y X255Y/V.
7.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la variante de lipasa comprende además una sustitución en una posición que corresponde con la posición 90 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
8.

Variante de lipasa de la reivindicación 7, donde la sustitución es X90A/R.
9.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la variante de lipasa comprende además una sustitución en una posición que corresponde con la posición 27 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
10.

Variante de lipasa de la reivindicación 9, donde la sustitución es X27R.
11.

Variante de lipasa según la reivindicación 1, donde la variante de lipasa comprende además al menos una sustitución en la lipasa progenitora seleccionada del grupo consistente en sustituciones en posiciones que corresponden con la posición 81, 147, y 249 (usando la SEQ ID NO: 2 para la numeración).
12.

Variante de lipasa de la reivindicación 11, donde las mutaciones son X81Q/E, X147M/Y, y X249R/I/L.
13.

Variante de lipasa de la reivindicación 1-2, donde la lipasa tiene las siguientes sustituciones:

(a)

D27R +S58N +V60S +I86V +A150G +L227G +T231R +N233R +P256K;

(b)

Q4N +L6S +S58N +V60S +I86V +A150G +L227G +T231R +N233R +P256K;

(c)

S58N +V60S +I86V +A150G +E210K +L227G +T231R +N233R +Q249R +P256K;

(d)

S58N +V60S +I86V +A150G +E210K +L227G +T231 R +N233R +I255A +P256K; o

(e)

S58N +V60S +I86V +A150G +G156R +E210K +L227G +T231R +N233R +I255A +P256K
14.

Secuencia de ADN que codifica la variante de lipasa de las reivindicaciones 1-13.
15.

Vector de expresión que alberga la secuencia de ADN de la reivindicación 14.
16.

Célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN de la reivindicación 14.
17.

Método para producir una variante de lipasa, método el cual comprende cultivar la célula huésped transformada de la reivindicación 16 bajo condiciones propicias para la producción de la variante de lipasa y recuperar la variante de lipasa del caldo resultante.