ES2631030T3 - Péptido bifuncional - Google Patents
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Abstract
Péptido bifuncional capaz de activar la síntesis de colágeno y de inhibir la producción de metaloproteinasas de matriz, caracterizado por que presenta una secuencia que contiene tres partes peptídicas A, B y C: - correspondiendo la primera parte peptídica A a un hexapéptido repetido al menos tres veces, siendo capaz dicha parte A de unirse a una proteína receptora que enlaza la elastina para estimular la síntesis de colágeno, y presentando la secuencia X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly, donde: o X1 corresponde a un aminoácido cualquiera, o X2 corresponde a un aminoácido elegido entre Val, Thr, Gln, Ala, Leu, o X3 corresponde a un aminoácido elegido entre Ala, Leu, Ile, - correspondiendo la segunda parte peptídica B a un tetrapéptido capaz de actuar como inhibidor competitivo de la proteasa uroquinasa y de ser escindido por dicha proteasa, y presentando la secuencia Arg-Y1-Arg-Y2, donde Y1 e Y2 corresponden cada uno a un aminoácido elegido entre Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu, y - correspondiendo la tercera parte peptídica C a un tripéptido que ocupa al menos un sitio activo de las metaloproteinasas de matriz para permitir una inhibición de dichas proteinasas, y presentando la secuencia Z1-Ile-Z2, donde: o Z1 corresponde a un aminoácido elegido entre Gly, Ile, Leu y o Z2 corresponde a un aminoácido elegido entre Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
Description
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DESCRIPCION
Peptido bifuncional
[0001] La presente invencion se refiere a un peptido que se aplicara especialmente en los ambitos cosmeticos y farmaceuticos.
[0002] La presente invencion se aplicara principalmente en el ambito de la reparacion o de la regeneracion del tejido dermico afectado especialmente por el envejecimiento de la piel.
[0003] El envejecimiento de la piel se debe a un desequilibrio mas o menos importante de los mecanismos de control de la smtesis y de la degradacion de los componentes de la matriz extracelular de la dermis, constituyendo esta ultima la capa mas interna de la piel. Asf, durante el envejecimiento de la piel, se observa, dentro de la matriz extracelular de la dermis, por una parte, una disminucion de la smtesis de ciertas macromoleculas, especialmente el colageno y la elastina, y por otra parte, un aumento de la expresion de ciertas enzimas como las metaloproteinasas de matriz o MMP. Estas ultimas presentan especialmente una actividad colagenolftica y elastolftica, y contribuyen, por tanto, a la degradacion de las macromoleculas de la matriz de la dermis. En consecuencia, la dermis pierde su tono, la piel se distiende, lo que da lugar a la aparicion de arrugas. Igualmente, este fenomeno puede verse intensificado por factores externos, como una exposicion a radiacion utlravioleta, a la polucion, al estres, o incluso al tabaco.
[0004] Tradicionalmente, en el estado de la tecnica se conocen estrategias destinadas a ralentizar la aparicion de arrugas. Estas estrategias consisten especialmente en:
- una descamacion, o dermoabrasion, que corresponde a un tratamiento agresivo de la piel con el fin de reducir del espesor de esta ultima;
- las inyecciones antiarrugas de acido hialuronico o de toxina botulmica que presentan respectivamente un efecto de relleno de las arrugas y una paralisis muscular focalizada que atenuan temporalmente las arrugas; no obstante, estas tecnicas son costosas y muestran efectos unicamente a corto plazo;
- la aplicacion de tratamientos superficiales, tales como productos hidratantes, cremas antiarrugas o alisadoras, que ralentizan la aparicion de las arrugas, pero sin corregir las que ya se han formado;
-terapias basadas en celulas madre autologas, que todavfa estan poco desarrolladas.
[0005] Desde hace algunos anos, los laboratorios han puesto en practica otras estrategias con el fin de luchar contra los efectos del envejecimiento de la piel.
[0006] En concreto, en la solicitud de patente europea EP 1 275 372 se propone la utilizacion de compuestos qmmicos, como los derivados N-acilaminoamidas. Mas concretamente, este documento describe una composicion en la que se incorpora, ademas del derivado N-acilaminoamida mencionado, una protema inhibidora de las metaloproteinasas, estando implicadas estas ultimas en la degradacion del colageno.
[0007] No obstante, dicha solucion no es optima, en concreto porque necesita, por una parte, una combinacion de varios compuestos y, por otra parte, porque no permite actuar de forma positiva sobre la smtesis del colageno.
[0008] Igualmente, se ha desarrollado la utilizacion de ciertos derivados peptfdicos para prevenir especialmente los smtomas del envejecimiento de la piel.
[0009] En consecuencia, en el documento de la patente FR 285489, se conocen por ejemplo composiciones cosmeticas que contienen derivados peptfdicos, procedentes estos ultimos de la protema elastina. Mas concretamente, el derivado peptfdico puede presentar la secuencia siguiente R1-(AA)n-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly- OR2, donde
- R1 corresponde a H o a una cadena alqmlica que comprende entre 2 y 22 carbonos,
- (AA)n corresponde a una cadena peptfdica en la que AA consiste en un aminoacido cualquiera o un derivado de aminoacido y o n esta comprendido entre 0 y 3,
- R2 corresponde a H o a una cadena alqmlica que comprende entre 1 y 24 carbonos.
[0010] Una composicion cosmetica que incorpora tal derivado peptfdico permite principalmente un efecto reafirmante y reestructurante.
[0011] Sin embargo, tal derivado peptfdico o una composicion que incorpore ese derivado no permite inhibir la actividad y/o la expresion de las proteinasas MMP que estan implicadas en la degradacion de los colagenos, constituyendo estos ultimos las principales protemas de la matriz extracelular de los tejidos del organismo, y en concreto de la dermis. El colageno permite principalmente conferir a los tejidos su resistencia a las fuerzas de tension. Asf, el peptido descrito en el documento mencionado anteriormente no permite evitar la degradacion de esta protema esencial para preservar el tono dermico.
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[0012] Tambien se conoce, por el documento de patente WO 2006053688, una combinacion que incorpora varios peptidos y se utiliza en el tratamiento antiarrugas. En concreto, los peptidos de esta combinacion intervienen a varios niveles del proceso de la smtesis del colageno y/o de la fibronectina, principalmente estimulando esta smtesis.
[0013] El documento de patente DE 10 2004 055 541 describe una composicion que contiene una combinacion de peptidos con el objetivo de estimular la liberacion del factor de crecimiento TGF-p, pudiendo inducir este ultimo la smtesis de colageno.
[0014] No obstante, los peptidos descritos en estos documentos de patentes presentan los mismos inconvenientes que los citados con anterioridad, especialmente el hecho de que la secuencia aqu propuesta no permite disminuir la expresion de las enzimas responsables de la degradacion de las protemas de la matriz extracelular, y en concreto del colageno.
[0015] La invencion ofrece la posibilidad de paliar los diversos inconvenientes del estado de la tecnica proponiendo un peptido bifuncional que presenta a la vez la propiedad de estimular la smtesis de los colagenos y la de inhibir las proteinasas que entran en la cascada de degradacion de estos ultimos.
[0016] A estos efectos, la presente invencion se refiere a una peptido bifuncional capaz de activar la smtesis de colageno y de inhibir la produccion de metaloproteinasas de matriz, presentando dicho peptido una secuencia que contiene tres partes peptfdicas A, B y C,
- correspondiendo la primera parte peptfdica A a un hexapeptido repetido al menos tres veces, siendo capaz dicha parte A de unirse a una protema receptora que enlaza la elastina para estimular la smtesis de colageno,
- correspondiendo la segunda parte peptfdica B a un tetrapeptido capaz de actuar como inhibidor competitivo de la proteasa uroquinasa y de ser escindido por dicha proteasa, y
- correspondiendo la tercera parte peptfdica C a un tripeptido que ocupa al menos un sitio activo de las metaloproteinasas de matriz para permitir una inhibicion de dichas proteinasas.
[0017] La primera parte peptfdica A que estimula la smtesis de colageno presenta la secuencia X1-Gly-X2-X3- Pro-Gly, estando repetida esta secuencia al menos tres veces, donde:
-X1 corresponde a un aminoacido cualquiera,
-X2 corresponde a un aminoacido elegido entre Val, Thr, Gln, Ala, Leu,
-X3 corresponde a un aminoacido elegido entre Ala, Leu, Ile.
[0018] De forma ventajosa, la primera parte peptfdica A de dicho peptido presenta la secuencia Val-Gly-Val-Ala- Pro-Gly.
[0019] La segunda parte peptfdica B, escindible por una proteasa, presenta la secuencia Arg-Y1-Arg-Y2, donde Y1 e Y2 corresponden cada uno a un aminoacido elegido entre Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu.
[0020] Preferiblemente, la segunda parte peptfdica B de dicho peptido presenta la secuencia la Arg-Val-Arg-Leu.
[0021] La tercera parte C, que permite una inhibicion de las metaloproteinasas de matriz, presenta la secuencia Z1-Ile-Z2, donde:
- Z1 corresponde a un aminoacido elegido entre Gly, Ile, Leu y
- Z2 corresponde a un aminoacido elegido entre Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
[0022] De forma ventajosa, la tercera parte peptfdica C de dicho peptido presenta la secuencia Gly-Ile-Leu.
[0023] Segun un ejemplo de realizacion preferible, el peptido segun la invencion presenta la siguiente secuencia Si, correspondiente a la secuencia SEQ ID n°1:
Si: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH
donde N y OH corresponden respectivamente a los extremos N-terminal y C-terminal de dicho peptido y donde n=3
[0024] No obstante, la secuencia del peptido bifuncional segun la invencion puede corresponder igualmente a una de las secuencias SEQ ID n°2 a SEQ ID n°26.
[0025] Preferiblemente, el peptido bifuncional segun la invencion se obtiene mediante smtesis qmmica. Ademas, de forma ventajosa el peptido puede conservarse en forma liofilizada.
[0026] De forma ventajosa, el peptido bifuncional segun la invencion puede utilizarse para el tratamiento de las enfermedades de cicatrizacion cronicas, especialmente el tratamiento de las escaras o de las ulceras.
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[0027] Igualmente, el peptido bifuncional segun la invencion puede utilizarse para la reparacion y/o la regeneracion del tejido dermico, especialmente para el tratamiento del envejecimiento de la piel.
[0028] La invencion se refiere igualmente a una composicion cosmetica y/o farmaceutica que incorpora el peptido bifuncional segun la invencion.
[0029] Preferiblemente, la composicion cosmetica comprende la concentracion de peptido bifuncional en una cantidad entre 10 pg/mL y 1 mg/mL, y de forma preferible casi igual a 100 pg/mL.
[0030] El peptido bifuncional segun la presente invencion presenta numerosas ventajas. Por una parte, permite una estimulacion de la smtesis de protemas de colageno, y especialmente de los colagenos de tipo I y de tipo III. El aumento de la produccion de este ultimo tipo de colageno es especialmente interesante; en efecto, este tipo de colageno se denomina colageno de tipo "fetal", puesto que es sintetizado principalmente por el feto y durante la infancia. Este tipo de colageno permite una cicatrizacion especialmente optima de los tejidos, llamada cicatrizacion “perfecta". Por otra parte, dicho peptido permite disminuir la colagenolisis por las proteasas. Asimismo, la estimulacion de la smtesis de colageno y la inhibicion de las metaloproteinasas se obtienen de forma simultanea gracias a las partes peptfdicas A y C respectivamente del peptido bifuncional, que contiene ademas una parte peptfdica B que enlaza las otras dos partes y es capaz de ser escindida por la uroquinasa. Por tanto, el peptido segun la invencion puede presentar una secuencia corta, del orden de 25 aminoacidos, lo que facilita su smtesis por via qrnmica.
[0031] Otras caractensticas y ventajas de la invencion surgiran de la siguiente descripcion detallada de los modos de realizacion no limitativos de la invencion, en referencia a las figuras adjuntas en las que:
- la figura 1 es una representacion esquematica del mecanismo de accion del peptido segun la invencion.
- la figura 2 corresponde a una representacion esquematica de la cascada enzimatica del sistema plasminogeno/plasmina.
- las figuras 3A y 3B corresponden a histogramas que ilustran respectivamente la smtesis de colageno de tipo I y de tipo III por fibroblastos tratados por el peptido segun la invencion en una concentracion de 100 pg/ml o por fragmentos de este mismo peptido.
- la figura 4 muestra en forma de histogramas la expresion genica de los genes COL1A1 y COL3A1 que codifican respectivamente los colagenos de tipo I y III en cultivos de fibroblastos dermicos tratados por el peptido segun la invencion o por fragmentos del este mismo peptido.
- la figura 5 ilustra, en funcion de la edad de los pacientes (35, 42 y 53 anos), el efecto del peptido bifuncional segun la invencion sobre la expresion proteica de los colagenos de tipo I y III por los fibroblastos dermicos procedentes respectivamente de estos pacientes.
- las figuras 6A y 6B ilustran el efecto del peptido bifuncional sobre la actividad de la uroquinasa con respecto a un sustrato sintetico.
- la figura 7A y 7B ilustran el efecto del peptido bifuncional sobre la actividad de la MMP-1 con respecto a un sustrato sintetico.
- las figuras 8A y 8B representan el perfil de elucion del peptido segun la invencion respectivamente sin tratamiento y con tratamiento mediante la uroquinasa.
[0032] A tftulo preliminar e informativo, la presente descripcion utiliza el codigo internacional de tres letras para designar los aminoacidos. Asf, Ala corresponde a la alanina (A), Cys a la cistema (C), Asp al acido aspartico (D), Glu al acido glutammico (E), Phe a la fenilalanina (F), Gly a la glicina (G), His a la histidina (H), Ile a la isoleucina (I), Lys a la lisina (K), Leu a la leucina (L), Met a la metionina (M), Asn a la asparagina (N), Pro a la prolina (P), Gln a la glutamina (Q), Arg a la arginina (R), Ser a la serina (S), Thr a la treonina (T), Val a la valina (V), Trp al triptofano (W) y Tyr a la tirosina (Y).
[0033] El envejecimiento de la piel y la consiguiente aparicion de arrugas se caracterizan, a nivel celular y molecular, por una disminucion de la expresion de los genes responsables de la smtesis de las macromoleculas que entran en la composicion de la matriz extracelular, como los colagenos o la elastina. Ademas, el descenso de la produccion de estas protemas de matriz viene acompanado generalmente de una sobreexpresion de las enzimas que son responsables de la degradacion de dichas protemas de matriz; en consecuencia, estas enzimas, las metaloproteinasas de matriz o MMP, son en parte la causa del descenso de tono a nivel de la dermis, de la distension de la piel y, con el tiempo, de la aparicion de arrugas.
[0034] Las protemas de colageno son las protemas preponderantes en la constitucion de la matriz extracelular de los tejidos del organismo. En concreto, los colagenos estan presentes en un 90 % a nivel de la dermis, constituyendo esta ultima el soporte solido de la piel y desempenando una funcion a la par nutritiva, termoreguladora y de defensa contra los microorganismos patogenos. La dermis esta constituida principalmente por celulas denominadas fibroblastos, que participan en la smtesis especialmente de los colagenos, asf como en la organizacion de la matriz extracelular.
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[0035] As^ la estructura de la matriz extracelular esta constituida por colageno, pero igualmente de elastina, de glicoprotemas estructurales y de proteoglicanos. Mas concretamente, la matriz dermica contiene fibrillas de colageno de tipo I y III, y un nucleo de colageno de tipo V.
[0036] Estos ultimos son susceptibles de ser degradados por protemas denominadas MMP, cuya familia tiene no menos de 26 miembros. Mas concretamente, estas protemas corresponden a endopeptidasas, es decir, que rompen los enlaces peptfdicos en el interior de la protema.
[0037] Los trabajos realizados por cientificos (Voorhes et al., Hornebeck et al., 2009) han permitido evidenciar que la senescencia de las celulas dermicas, los fibroblastos, se caracteriza por un aumento de la expresion de estas endopeptidasas, especialmente en lo que se refiere a la MMP-1. Esta ultima pertenece al grupo de las colagenasas intersticiales, y es responsable de la escision de las protemas de colageno de tipo I y III. La MMP-1 se considera la principal colagenasa implicada en el envejecimiento de la piel, ya sea cronologico o fotoinducido.
[0038] Asf, la disminucion de las protemas de matriz dermicas, y especialmente los colagenos, asociada a un aumento de las enzimas de degradacion, especialmente las MMP-1, son elementos importantes que intervienen en el envejecimiento de la piel, que se traduce en una disminucion del tono de la piel y una aparicion de arrugas visibles.
[0039] Entonces, en el marco de un procedimiento inventivo, los inventores han desarrollado un peptido que presenta varias funciones y que permite a la vez actuar al nivel de los procesos de smtesis de las moleculas de colageno, asf como a diferentes niveles de cascadas de degradacion de estas mismas moleculas.
[0040] Asf, de forma especialmente ventajosa, el peptido bifuncional segun la presente invencion presenta la particularidad de favorecer el restablecimiento de un equilibrio entre los procesos anabolicos (smtesis) y catabolicos (degradacion) de la matriz extracelular especialmente dermica.
[0041] De forma especialmente preferible, el peptido segun la invencion es bifuncional y contiene una secuencia que puede dividirse en tres partes:
- una primera parte peptfdica, denominada parte A, que presenta de forma ventajosa la capacidad de aumentar la smtesis de colageno;
- una segunda parte peptfdica, denominada parte B, que presenta de forma preferible una secuencia reconocida por una proteasa, la uroquinasa, pudiendo ser escindida dicha parte peptfdica B por esta proteasa;
- una tercera parte peptfdica, denominada parte C, siendo capaz esta ultima de inhibir las MMP.
[0042] En consecuencia, el peptido segun la presente invencion permite, por una parte, estimular la smtesis de colageno y, por otra parte, reducir la degradacion de dicho colageno mediante la inhibicion de la uroquinasa y las proteasas MMP, especialmente la MMP-1.
[0043] Mas concretamente, la parte peptfdica A, que permite un aumento de la smtesis de colageno, consiste en un hexapeptido, es decir, una sucesion de 6 residuos de aminoacidos. De forma ventajosa, este hexapeptido se repite al menos 3 veces en el peptido bifuncional segun la presente invencion.
[0044] Preferiblemente, la parte peptfdica A del peptido bifuncional presenta la secuencia siguiente X1-Gly-X2- X3-Pro-Gly, donde X1, X2 y X3 corresponden a aminoacidos. Como se ha indicado anteriormente, esta secuencia hexapeptidica X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly se repite al menos tres veces en el peptido segun la invencion. En efecto, ciertos trabajos han mostrado que una repeticion de tres veces de dicha secuencia conllevaba resultados diferentes, incluso mas interesantes, en terminos de actividad de la secuencia (Alix 2001).
[0045] Segun un modo de realizacion interesante, el residuo X1 de la parte peptfdica A corresponde a cualquiera de los aminoacidos. El residuo X2, por su parte corresponde de forma ventajosa a un aminoacido elegido entre Val, Thr, Gln, Ala y Leu. Finalmente, el residuo X3 corresponde preferiblemente a un aminoacido elegido entre Ala, Leu et Ile.
[0046] De forma aun mas preferible, X1 y X2 corresponden a Val y X3 a Ala. Asf, el hexapeptido que corresponde a la parte A del peptido bifuncional presenta preferiblemente la secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly.
[0047] Tal secuencia, repetida al menos tres veces y asociada con las partes peptfdicas B y C, permite una estimulacion significativa de la expresion proteica de los colagenos, especialmente en lo que respecta al colageno de tipo III, como se ilustra y se explica en las figuras 3A y 3B adjuntas y en el ejemplo 1 a continuacion.
[0048] El peptido segun la invencion permite igualmente un aumento de la expresion genica de los genes COL1A1 y COL3A1, como se ilustra en la figura 4, codificando respectivamente el colageno de tipo I y el colageno de tipo III. La accion del peptido bifuncional sobre la smtesis del colageno tipo III es especialmente interesante; en efecto, se sabe que este ultimo es el colageno mayoritario a nivel fetal y su produccion disminuye progresivamente durante la infancia hasta alcanzar un nivel de produccion muy debil en el adulto. A tftulo de ejemplo, el colageno tipo III es 6 veces menos abundante en el adulto que el colageno de tipo I (Melissopoulos,
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1998; Herbage, 1997). El colageno de tipo III es sintetizado mayoritariamente por los miofibroblastos en el transcurso de la cicatrizacion con el fin de reemplazar los tejidos danados. A nivel fetal, el colageno tipo III permite una cicatrizacion llamada "perfecta" (Lorena et al., 2002; Ferguson & O'Kane, 2004).
[0049] La secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly del peptido bifuncional segun la invencion ha sido conceptualizado a partir de los peptidos de elastina o elastokinas (elastokines, segun el termino frances) que se derivan de la degradacion de las fibras elasticas. Tal secuencia adopta una conformacion en giro p de tipo VIII debido a la presencia de los residuos prolina y glicina en dicha secuencia X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly (Floquet et al., 2004). Este motivo estructural es reconocido por una protema receptora de elastina, tradicionalmente citada segun su denominacion en ingles elastin binding protein y abreviada como EBP. Esta ultima esta inmovilizada en la superficie celular en asociacion con otras dos subunidades: una protema protectora o catepsina A (PPCA) y una neuraminidasa (Neu-1), que estan enlazadas a la membrana celular. La ocupacion de la protema receptora EBP por la parte peptfdica A del peptido bifuncional, representado en la figura 1, conlleva una activacion del conjunto molecular, lo que conduce principalmente a la smtesis de colageno de tipo I y de tipo III.
[0050] Tal activacion del conjunto molecular tambien puede actuar sobre la quimiotaxia, la proliferacion, la adhesion y la supervivencia de los fibroblastos e igualmente sobre la angiogenesis, siendo esencial esta ultima en el proceso de revascularizacion de las heridas cronicas, como las escaras o las ulceras.
[0051] En lo que respecta a la parte peptfdica B, esta consiste preferiblemente en un tetrapeptido, es decir, una secuencia que contiene 4 aminoacidos.
[0052] Mas concretamente, este tetrapeptido representa un brazo que puede interactuar, como sustrato o inhibidor competitivo, con una serm proteasa, la uroquinasa. Asf, esto permite liberar las otras dos partes peptfdicas A y C, en las proximidades de la celula.
[0053] La uroquinasa escinde preferiblemente una secuencia que presenta dos aminoacidos Arg. En consecuencia, la parte peptfdica B presenta de forma ventajosa la secuencia Arg-Y1-Arg-Y2, donde Y1 y Y2 corresponden a aminoacidos.
[0054] Segun un ejemplo de realizacion concreto, Y1 y Y2 corresponden cada uno a un aminoacido elegido entre Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val y Leu. Estos aminoacidos, asociados a un sitio escindible Arg, son escindidos preferiblemente por la proteasa uroquinasa.
[0055] De forma aun mas preferible, la parte peptfdica B del peptido bifuncional segun la invencion contiene la secuencia Arg-Val-Arg-Leu.
[0056] La proteasa uroquinasa es uno de los activadores del sistema plasminogeno-plasmina. El plasminogeno es el sustrato fisiologico de la uroquinasa, que va a permitir activarla en forma de plasmina. Esta activacion desencadena una cascada proteolttica que da lugar especialmente a la activacion de las MMP-1 y de las MMP-3. La cascada enzimatica del sistema plasminogeno/plasmina desencadenada por la proteasa uroquinasa esta representada en la figura 2 adjunta.
[0057] Asf, la actividad uroquinasa sobre el plasminogeno es responsable indirectamente de la degradacion del colageno, y especialmente del colageno de tipo I y de tipo III. Por tanto, la presencia de la parte peptfdica B en el peptido bifuncional segun la invencion actuara como sustrato o inhibidor competitivo de la uroquinasa. En consecuencia, esta ultima escindira los sitios Arg presentes en la parte peptfdica B y estara menos disponible para provocar la inhibicion del plasminogeno en plasmina; entonces, la degradacion de las moleculas de colageno sera reducida. El efecto del peptido segun la invencion sobre la actividad de la uroquinasa se ilustra concretamente en las figuras 6A y 6B.
[0058] En lo que respecta a la parte peptfdica C del peptido bifuncional, esta consiste de forma ventajosa en un tripeptido, es decir, una secuencia que contiene 3 aminoacidos.
[0059] De forma preferible, la parte peptfdica C presenta la secuencia Z1-Ile-Z2, donde Z1 y Z2 corresponden cada uno a un residuo de aminoacido.
[0060] Segun un ejemplo de realizacion interesante, Z1 es un aminoacido elegido entre Gly, Ile y Leu mientras que Z2 se elige entre Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
[0061] De forma aun mas preferible, Z1 corresponde a Gly y Z2 corresponde a Leu. Asf, la parte peptfdica C del peptido bifuncional presenta de forma ventajosa la secuencia Gly-Ile-Leu. El tripeptido Gly-Ile-Leu es, en efecto, susceptible de ocupar una parte del sitio activo de la MMP-1 y actuar como inhibidor competitivo de la enzima.
[0062] En efecto, estos aminoacidos presentan un interes particular, dado que son susceptibles de ocupar tres de los huecos de la MMP de tipo I, los huecos P'1, P'2 y P'3. En consecuencia, el sitio activo de la colagenasa de tipo I ya no podra quelar los iones Zn2+, siendo esenciales estos ultimos para la actividad de dicha colagenasa. Entonces, la degradacion de las moleculas de colageno por las MMP-1 disminuye gracias al peptido bifuncional segun la invencion. Esto se ilustra de forma concreta en las figuras 7A y 7B adjuntas.
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[0063] As^ segun un modo de realizacion preferible, que permite obtener resultados interesantes en terminos de smtesis de colageno y de inhibicion de las MMP, especialmente de la MMP-1, el peptido bifuncional segun la presente invencion presenta la secuencia siguiente, denominada secuencia S1, y correspondiente a la SEQ ID n°1:
S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH
[0064] Preferiblemente, la secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly se repite 3 veces; en otras palabras, de forma ventajosa n es igual a 3. No obstante, la secuencia tambien puede repetirse un numero superior a 3.
[0065] El peptido segun la invencion tambien puede presentar, por ejemplo, las secuencias identificadas SEQ ID n°2 a SEQ ID n°26. No obstante, esta lista de secuencias no es exhaustiva y, por tanto, no es limitativa de la invencion.
[0066] Especialmente, los aminoacidos de las secuencias SEQ ID n°1 a 26 pueden, por ejemplo, ser sustituidos por aminoacidos que sean qmmicamente equivalentes, es decir, que presenten caractensticas fisicoqmmicas equivalentes; las sustituciones entre aminoacidos equivalentes se realizan, por ejemplo, entre los aminoacidos apolares alifaticos Ala, Val, Ile, Leu, o entre los aminoacidos polares que portan un grupo hidroxilo Ser y Thr, entre los aminoacidos Asn y Gln, entre los aminoacidos que portan dos funciones acido Asp y Glu, etc. Esta informacion esta registrada en la base de datos de proteasas, MEROPS (
http://merops.sanger.ac.uk/).
http://merops.sanger.ac.uk/).
[0067] El peptido bifuncional segun la presente invencion se obtiene preferiblemente mediante smtesis qmmica.
[0068] De forma ventajosa, la tecnica del fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc)/ter-butil (tBu) es la que se pone en practica para obtener la elongacion de las cadenas peptfdicas, en resinas Fmoc-Leu-Wang PS.
[0069] No obstante, tal modo de realizacion no es limitativo de la invencion y la smtesis qmmica del peptido bifuncional puede obtenerse mediante cualquier otra tecnica adaptada a estos efectos y conocida por el experto en la materia.
[0070] De forma ventajosa, el peptido segun la invencion esta liofilizado con el fin de asegurar una conservacion optima del mismo.
[0071] El peptido bifuncional segun la presente invencion es especialmente interesante para su utilizacion en la fabricacion de composiciones cosmeticas destinadas a favorecer la reparacion y/o la regeneracion del tejido dermico. En efecto, debido a su accion sobre la produccion de colageno, dicho peptido permite especialmente una limitacion de la aparicion de arrugas.
[0072] Ademas, los inventores han demostrado que los efectos del peptido bifuncional segun la invencion sobre la produccion de colageno paredan depender de la edad de los pacientes. En efecto, los resultados mostrados en el ejemplo 3 mas abajo, en relacion con la figura 5, muestran que la expresion del colageno de tipo I, y sobre todo, la expresion de colageno de tipo III, es mas importante en los pacientes de mayor edad. Por ello, tales resultados confirman el interes de dicho peptido para su utilizacion en el marco de las composiciones cosmeticas destinadas a combatir el envejecimiento de la piel.
[0073] Sin embargo, tal modo de realizacion no es limitativo de la invencion. Por ejemplo, el peptido bifuncional segun la invencion tambien puede servir para la preparacion de composiciones farmaceuticas.
[0074] En efecto, se demuestra que una ruptura del equilibrio entre la smtesis de protemas de matriz, como el colageno, y la degradacion de estas mismas protemas, puede provocar la aparicion de heridas cronicas, tambien llamadas enfermedades de cicatrizacion cronicas, como las escaras, las ulceras o incluso las grandes quemaduras. Estas enfermedades se caracterizan concretamente por una sobreexpresion de las proteinasas de matriz MMPs y estan asociadas en general a patologfas como la diabetes o las enfermedades vasculares.
[0075] Estas enfermedades de cicatrizacion cronicas aumentan constantemente en los pafses desarrollados, especialmente a causa del envejecimiento de la poblacion. Por tanto, el tratamiento y la atencion de estas enfermedades representan un coste significativo.
[0076] A nivel celular, se ha demostrado que se liberaba una gran cantidad de proteasas, y especialmente de metaloproteinasas de tipo MMP-1, en las proximidades de estas heridas cronicas de tipo escara. Algunos estudios han permitido demostrar tambien que la actividad de la colagenasa de tipo I, o MMP-1, aumentaba considerablemente en el exudado de heridas cronicas. Tal aumento es responsable de la degradacion de las moleculas de colageno de tipo I y de tipo III que se encuentran presentes en las proximidades de dicha herida (Barone et al., 1998; Shi et al., 2006).
[0077] En lo que respecta de forma mas concreta a las ulceras, tambien se ha demostrado que se encontraban grandes cantidades de proteasas en las proximidades de estas heridas. En concreto, algunos estudios han permitido identificar un mdice de MMP-1 65 veces mas elevado que el normal, provocando estas MMPs una
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degradacion excesiva y prolongada de las protemas de la matriz extracelular y tambien de los factores de crecimiento, lo que conlleva un retraso en la cicatrizacion (Fischer et al., 2009).
[0078] Finalmente, se ha demostrado que la concentracion de uroquinasa, activador del sistema plasminogeno/plasmina como se puede apreciar en la figura 2, y responsable de forma indirecta de la activacion de ciertas MMP, aumentaba fuertemente en especial en las ulceras de las piernas, asf como al nivel de las escaras (Werckroth et al., 2004).
[0079] Asf, parece que el peptido segun la invencion, que permite a la vez una disminucion de la actividad de las proteasas MMP y un aumento de la smtesis de las protemas de matriz, contribuina a facilitar un tratamiento de estas heridas cronicas y permitina sustituir los tratamientos medicos actuales, que son pesados, costosos y poco eficaces.
[0080] Segun un modo de realizacion concreto, el peptido bifuncional segun la invencion esta integrado en un aposito destinado a colocarse sobre la zona del cuerpo afectada por una herida cronica.
[0081] No obstante, tal modo de realizacion no es en ningun caso limitativo de la invencion y puede incorporar facilmente el peptido bifuncional segun la invencion en una preparacion como una crema, un unguento, un gel, pudiendo aplicarse sobre la herida que se ha de tratar.
[0082] Segun un ejemplo de realizacion, el peptido bifuncional se utiliza preferiblemente en una concentracion aproximadamente entre 10|g/ml y lmg/ml. En efecto, no se ha constatado ninguna toxicidad del peptido segun la invencion en los fibroblastos dermicos tratados con concentraciones del peptido de hasta 1 mg/ml. Ademas, algunos estudios realizados para investigar los genes de toxicidad mediante el enfoque estadfstico SAM (Signifiance Analysis of Microarrays) han demostrado que la muerte celular, la desorganizacion del tejido conjuntivo y la invasion tumoral solamente son inducidos a partir de una fuerte concentracion de peptido bifuncional, superior a 1 mg/ml.
[0083] De forma aun mas preferible, la concentracion preconizada para la utilizacion del peptido, especialmente en las composiciones farmaceuticas y/o cosmeticas, es casi igual a 100 pg/ml.
[0084] Con la lectura de los ejemplos siguientes, que se proporcionan a tttulo ilustrativo y no limitativo, surgiran otras ventajas y caractensticas de la invencion.
Ejemplo 1: Efecto del peptido bifuncional sobre la smtesis de colageno - analisis proteico
[0085] Los fibroblastos dermicos se afslan a partir de biopsias de piel del abdomen obtenidas durante el transcurso de operaciones quirurgicas practicadas en pacientes sanos con edades entre los 35 y los 75 anos.
[0086] Despues de haber retirado la epidermis, los fibroblastos se recuperan mediante digestion enzimatica y despues se cultivan a 37 °C en un medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y con un 1 % de penicilina/estreptomicina.
[0087] Despues, los fibroblastos se tratan con el peptido que presenta la secuencia S1 o con distintos fragmentos de esta secuencia, en una concentracion de 100 pg/ml. Los distintos fragmentos probados son los siguientes:
- peptido 1 (pept 1): peptido que presenta la secuencia S1
- peptido 2 (pept 2): secuencia N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3-Arg-Val-Arg-Leu-OH
- peptido 3 (pept 3): N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3-OH
- peptido 4 (pept 4): N-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH
- peptido 5 (pept 5): N-Gly-Ile-Leu-OH
[0088] La expresion proteica del colageno de tipo I y del colageno de tipo III se ha mostrado mediante Western Blot y se ha cuantificado mediante ImageJ. Los resultados se presentan respectivamente en las figuras 3A y 3B adjuntas. El control (Ctrl) corresponde a la expresion de colageno de tipo I y III a nivel de las celulas no tratadas con los peptidos. Los experimentos se han realizado por triplicado.
[0089] Los resultados visibles en la figura 3A muestran que el peptido segun la invencion (pept 1), asf como los fragmentos (pept 2 y pept 3) que incorporan la secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly que corresponde a la parte A del peptido segun la invencion estimulan un 30 % la expresion proteica del colageno de tipo I. Los fragmentos peptfdicos (pept 4 y pept 5) que no contienen la parte A del peptido segun la invencion no permiten la estimulacion de la smtesis de colageno de tipo I; al contrario, la proporcion de colageno sintetizado cuando los fibroblastos estan en contacto con pept 4 y pept 5 parece mas debil. Entonces, la secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro- Gly es responsable de la estimulacion de la smtesis de colageno de tipo I.
[0090] La figura 3B muestra que el peptido segun la invencion que presenta la secuencia S1 permite un aumento de la smtesis de colageno de tipo III; en efecto, como puede apreciarse en el histograma, la produccion
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de colageno de tipo III es mas del doble cuando los fibroblastos se tratan con el peptido que presenta la secuencia S1.
[0091] Tambien es interesante senalar que un tratamiento de los fibroblastos con el peptido que presenta la secuencia S1 (pept 1) permite un aumento de la smtesis de colageno de tipo III del 36 % en comparacion con los fibroblastos tratados con el peptido que presenta unicamente la secuencia (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 (pept 3). Por tanto, las otras partes del peptido segun la invencion tambien desempenan una funcion en el aumento de la smtesis de colageno de tipo III.
[0092] Asf pues, el peptido segun la invencion es especialmente interesante; en efecto, ademas de permitir un aumento de la smtesis de colageno de tipo I, favorece tambien la produccion de colageno de tipo III.
Ejemplo 2: Efecto del peptido bifuncional sobre la smtesis de colageno - analisis de la expresion genica
[0093] La expresion genica de los colagenos de tipo I y III en los cultivos de fibroblastos tambien se ha probado en presencia de distintos peptidos (pept 1 a pept 5) en una concentracion de 100 pg/ml.
[0094] Despues de 24 horas de tratamiento con los distintos peptidos, los ARNs se han extrafdo de los cultivos con la ayuda de un kit RNeasy® (QIAGEN), y despues se retrotranscriben en ADN complementarios (ADNc) con la ayuda del kit RT2 First Strand Kit de SABiosciences™.
[0095] Despues, se efectuan analisis PCR en tiempo real con la ayuda del termociclador Mx3000p de Stratagene en placa de 96 pocillos. Cada muestra se analiza por triplicado. Los ADNc sirven de matrices en una mezcla de reaccion que contiene los reactivos RT2 SYBR® Green/ ROX™ qPCR Master Mix (SABiosciences™) y los cebadores directos e inversos espedficos del gen que se ha de amplificar. La lectura de la fluorescencia se efectua al fin de cada ciclo y se analiza mediante el programa MxPro (Stratagene). La expresion relativa de los genes de interes COL1A1 y COL3A1 que codifican respectivamente el colageno de tipo I y de tipo III se obtiene normalizando la cantidad de productos de amplificacion del gen estudiado por la cantidad de ADN amplificado a partir de un gen "domestico", en este caso, el ARN del gen que codifica la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). A partir del numero de ciclos que corresponden a una amplificacion que posee una eficacia del 100 %, se calcula la cantidad relativa de ADNc con la ayuda del metodo de 2-aaCT (Livak & Schmittgen, 2001).
[0096] Los resultados, que pueden apreciarse en la figura 4, confirman los obtenidos durante el estudio de la expresion proteica. El peptido bifuncional segun la invencion, asf como los fragmentos peptfdicos pept 2 y pept 3 que comprenden la secuencia (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3, estimulan la expresion genica de los colagenos de tipo I y III. Se constata igualmente un aumento de la smtesis de colageno de tipo III cuando los fibroblastos se tratan con el peptido que presenta la secuencia S1 (pept 1) en comparacion con las celulas puestas en presencia del peptido 3 que contiene la secuencia (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 solamente.
[0097] Los peptidos derivados pept 4 y pept 5 que contienen la secuencia Gly-Ile-Leu no tienen ningun efecto sobre la expresion de los genes que codifican los colagenos de tipo I y III.
[0098] El control (Ctrl) corresponde a la expresion de los genes que codifican los dos tipos de colageno cuando los fibroblastos no son tratados.
Ejemplo 3: Efecto del peptido bifuncional sobre la smtesis de colageno - pruebas de la expresion proteica y genica en funcion de la edad de los pacientes
[0099] Algunos fibroblastos dermicos procedentes de pacientes de mayor o menor edad (35, 42 y 53 anos) se han cultivado y el peptido bifuncional segun la invencion que presenta la secuencia S1 se ha probado en lo que respecta a la expresion proteica y genica del colageno de tipo I y de tipo III. Los resultados obtenidos en lo que se refiere a la expresion proteica de los dos tipos de colageno pueden observarse en la figura 5. Parece que la accion del peptido segun la invencion sobre la smtesis de colageno es mas importante cuando los fibroblastos proceden de pacientes de mayor edad.
Ejemplo 4: Inhibicion competitiva de la uroquinasa por el peptido bifuncional
[0100] Se ha evaluado la accion del peptido bifuncional segun la invencion sobre la uroquinasa, una enzima en la direccion 5' de la cascada de activacion de la proteinasa MMP-1.
[0101] Se ha probado la actividad de la uroquinasa sobre su sustrato sintetico, el D-Glu-Gly-Arg+NHPhNO2 (S2444), en presencia y en ausencia del peptido segun la invencion en distintas concentraciones.
[0102] Los resultados se presentan en las figuras 6A y 6B adjuntas.
[0103] Se ha realizado una cinetica de hidrolisis del sustrato S2444 (0,3 mM) mediante la uroquinasa (9,25*10'® mM) en presencia del peptido bifuncional que presenta la secuencia S1 y concentrado a 10'3, 10'4 y 10'5 M durante lh. El testigo corresponde a la cinetica en ausencia de peptido. La actividad enzimatica se evalua
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mediante una medida de la absorbancia (DO) a 405 nm cada 5 minutos durante un penodo de 35 min. Los resultados pueden observarse en la figura 6A.
[0104] La figura 6B constituye una representacion grafica de la relacion efecto/dosis entre la actividad de la uroquinasa y la concentracion de peptido bifuncional utilizada a los 15 minutos. La raya de trazo discontinuo en la figura permite determinar el IC50, es decir, la concentracion de peptido necesario para disminuir un 50 % la actividad de la uroquinasa. El IC50 corresponde a 0,83*10-5 M de peptido, esto es, una concentracion masica de peptido de 19 pg/ml.
[0105] En consecuencia, parece que el peptido bifuncional segun la invencion se comporta como un inhibidor competitivo de la uroquinasa.
Ejemplo 5: Efecto del peptido bifuncional sobre la actividad de la proteasa MMP-1
[0106] Despues, se ha evaluado directamente el efecto del peptido bifuncional segun la invencion sobre la actividad de la MMP-1, que es una enzima en la direccion 3' de la cascada activada por la uroquinasa.
[0107] El sustrato de la MMP-1 que se ha utilizado para probar su actividad en presencia del peptido es un sustrato sintetico, el DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2.
[0108] Una concentracion de 80 ng/pl de MMP-1 se ha puesto en presencia de 0,4 ng/pl de sustrato sintetico, en presencia o no de peptido bifuncional concentrado a 10-3, 10'4 y 10'5 M durante lh. Los resultados se presentan en las figuras 7A y 7B.
[0109] Mas concretamente, la figura 7A representa una cinetica de hidrolisis del sustrato sintetico de la MMP-1 en presencia o no (testigo) del peptido en distintas concentraciones. La actividad enzimatica de la MMP-1 se evalua mediante una medida de la absorbancia (DO) a 465 nm cada 5 minutos durante un penodo de 35 min.
[0110] La figura 7B es una representacion grafica de la relacion dosis-efecto entre la actividad de la MMP-1 y la concentracion de peptido bifuncional utilizada a los 15 min. La raya de trazo discontinuo en la figura permite determinar el IC50, que aqu corresponde a 0,4*10-4 M, es decir, una concentracion de peptido bifuncional igual a 91 pg/ml.
[0111] Tambien se han probado los efectos del peptido segun la invencion sobre la actividad de la MMP-1 en presencia de su sustrato natural, esto es, las fibras de colageno de la dermis humana.
[0112] Para ello, se ha activado previamente la MMP-1 mediante APMA (acetato 4-aminofenil mercurico) a 20 mM durante 1 hora y 30 minutos a 37 °C. Despues, la MMP-1 activada de esta manera se deposita sobre cortes de piel de 5 p de grosor en presencia o no del peptido segun la invencion (100 pg/ml). Despues de 3 h, los cortes de piel son inmunomarcados con el fin de revelar la presencia de colageno de tipo I y III, y son observados en un microscopio confocal. Los resultados, no representados, muestran que, al nivel del corte que no se ha tratado con el peptido, los colagenos I y III han sido totalmente degradados por la MMP-1. Por el contrario, en presencia del peptido bifuncional, la accion de dicha MMP-1 se inhibe; en efecto, se detectan los colagenos I y III.
[0113] El peptido bifuncional segun la invencion inhibe la degradacion de los colagenos mediante la inhibicion in situ de la actividad de las MMP-1.
Ejemplo 6: Escision del peptido bifuncional por la uroquinasa
[0114] A nivel pericelular, se observa un exceso de uroquinasa del orden de 10'4 M. Entonces, el peptido puede ser escindido por la uroquinasa, actuando esta ultima en concreto al nivel de los residuos arginina (Arg) de la parte B del peptido segun la invencion.
[0115] Se han realizado estudios mediante HPLC en columna Chromolith Jupiter C18 (50 x 4,6 mm) aplicando un gradiente lineal de 0,1 % de TFA acetonitrilo en 0,1 % de TFA agua, de 0 a 100 % durante 100 min. Los resultados muestran la presencia de un pico espectral a 11,75 min caractenstico del peptido bifuncional (figura 8A). No obstante, tras la accion de un exceso de uroquinasa en el peptido bifuncional (0,45 mM), el pico espectral es diferente; en efecto, el nuevo pico se eluye a 20 min caracterizando asf una escision del peptido bifuncional por la uroquinasa (figura 8B).
[0116] Asf, en condiciones de envejecimiento de la piel, en presencia de cantidades importantes de uroquinasa, se escinde el peptido bifuncional segun la invencion, liberando asf la parte C-terminal de dicho peptido que incorpora la secuencia Gly-Ile-Leu.
Ejemplo 7: Efectos de la secuencia Gly-Ile-Leu sobre la actividad de la MMP-1
[0117] Los inventores han elegido la secuencia Gly-Ile-Leu por su capacidad de ocupar los huecos P'1, P'2 y P'3 de la colagenasa de tipo I, la MMP-1. Se ha probado la actividad de esta ultima en su sustrato sintetico, el DNP-
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Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2, en presencia o en ausencia del peptido 5 que presenta la secuencia Gly-Ile-Leu a concentracion 10'5, 10-4 y 10-3 M.
[0118] Los resultados (no representados) muestran que el peptido 5 disminuye de forma dosis-dependiente la actividad de la MMP-1 sobre su sustrato sintetico. Se ha medido el IC 50 del peptido Gly-Ile-Leu; es de 0,71*10-4 M, es decir, una concentracion de peptido de 21,3 |jg/ml.
[0119] Entonces, puede generarse la parte C terminal Gly-Ile-Leu del peptido bifuncional segun la invencion en caso de exceso de uroquinasa y provocar una inhibicion de la actividad de la MMP-1. Estos datos confirman el interes del peptido para combatir el envejecimiento de la piel y/o la cicatrizacion de las heridas cronicas.
[0120] Tambien se han realizado estudios con un modelo de estudio mas completo: los modelos de piel ex vivo, que permiten imitar el envejecimiento de la piel, asf como ciertas patologfas asociadas. Los resultados obtenidos no estan ilustrados, pero confirman los resultados obtenidos in vitro.
[0121] Por supuesto, la invencion no se limita a los ejemplos ilustrados y descritos con anterioridad, que pueden presentar variantes y modificaciones sin que ello se aparte del marco de la invencion.
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Claims (14)
- 510152025303540455055REIVINDICACIONES1. Peptido bifuncional capaz de activar la smtesis de colageno y de inhibir la produccion de metaloproteinasas de matriz, caracterizado por que presenta una secuencia que contiene tres partes peptidicas A, B y C:- correspondiendo la primera parte peptidica A a un hexapeptido repetido al menos tres veces, siendo capaz dicha parte A de unirse a una protema receptora que enlaza la elastina para estimular la smtesis de colageno, y presentando la secuencia X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly, donde:o X1 corresponde a un aminoacido cualquiera,o X2 corresponde a un aminoacido elegido entre Val, Thr, Gln, Ala, Leu, o X3 corresponde a un aminoacido elegido entre Ala, Leu, Ile,- correspondiendo la segunda parte peptfdica B a un tetrapeptido capaz de actuar como inhibidor competitivo de la proteasa uroquinasa y de ser escindido por dicha proteasa, y presentando la secuencia Arg-Y1-Arg-Y2, donde Y1 e y2 corresponden cada uno a un aminoacido elegido entre Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu, y- correspondiendo la tercera parte peptfdica C a un tripeptido que ocupa al menos un sitio activo de las metaloproteinasas de matriz para permitir una inhibicion de dichas proteinasas, y presentando la secuencia Z1-Ile-Z2, donde:o Z1 corresponde a un aminoacido elegido entre Gly, Ile, Leu y o Z2 corresponde a un aminoacido elegido entre Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
- 2. El peptido bifuncional segun la reivindicacion 1 caracterizado por que la primera parte peptfdica A de dicho peptido presenta la secuencia Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly.
- 3. El peptido bifuncional segun la reivindicacion 1 o 2 caracterizado por que la segunda parte peptfdica B de dicho peptido presenta la secuencia Arg-Val-Arg-Leu.
- 4. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la tercera parte peptfdica C de dicho peptido presenta la secuencia Gly-Ile-Leu.
- 5. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que presenta la siguiente secuencia S1, que corresponde a la secuencia SEQ ID n°1:S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OHdonde N y OH corresponden respectivamente a los extremos N-terminal y C-terminal de dicho peptido y donde n=3
- 6. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que corresponde a una de las secuencias SEQ ID n°2 a SEQ ID n°26.
- 7. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que se obtiene por smtesis qmmica.
- 8. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que se conserva en forma liofilizada.
- 9. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su utilizacion para el tratamiento de las enfermedades de cicatrizacion cronicas.
- 10. El peptido bifuncional para su utilizacion segun la reivindicacion 9 para el tratamiento de las escaras o de las ulceras.
- 11. El peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su utilizacion para la reparacion y/o la regeneracion del tejido dermico.
- 12. El peptido bifuncional para su utilizacion segun la reivindicacion 11 para el tratamiento del envejecimiento de la piel.
- 13. Composicion cosmetica y/o farmaceutica que incorpora el peptido bifuncional segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
- 14. La composicion cosmetica y/o farmaceutica segun la reivindicacion 13 que comprende la concentracion de peptido bifuncional en una cantidad entre 10 pg/mL y 1 mg/mL, y de forma preferible casi igual a 100 pg/mL.% relativo (en comparacion con el control)
imagen1 Sintesis de colagenos de tipo I y de tipo III- \
- : Activacion
- : Inhibicion
- : Escision
Fig. Ij Plasminogeno {imagen2 oimagen3 imagen4 Fig. 3A Fig. 3BNJCOUDgi3~GOBD-MS nmS C* * M t■D TJ TJ H mn>> n>> n>> n> _■o -o -o w a>~ ~ ~ -■ 3Q. Q. Q. CQ Oo O O o oimagen5 —131■pCT’, Actividad de la uroquinasa (%)= a a a 8imagen6 Fig, 5% relativo (en comparacion con el control)imagen7 o mIVE103H IV11CJQ■uu s»oaimagen8 BlancoTestigoPeptido1_10-5 M Peptido1_10-4 M Peptido1_10-3 Mimagen9 i in-1 yr*[Peptido 1] (M)Fig.7AFig.7Bimagen10
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