ES2632007T3 - Promotor específico para semillas en algodón - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de (a) SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo, en donde dicho fragmento comprende al menos 600 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, comprendiendo el fragmento, además, un motivo caja T/G que tiene la secuencia de nucleótidos desde la posición de nucleótidos 298 a 303 de SEQ ID NO: 1 y un motivo de unión MYB que tiene la secuencia de nucleótidos desde la posición de nucleótidos 846 a 851 de SEQ ID NO: 1 y en donde dicho fragmento, cuando se introduce en algodón, tiene actividad del promotor específica para la semilla con altos niveles de expresión en fibras desde el día 5 post-antesis hasta el día 30 postantesis; (b) una secuencia de nucleótidos con al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de (a), comprendiendo dicho fragmento, además, un motivo caja T/G que tiene la secuencia de nucleótidos desde la posición de nucleótidos 298 a 303 de SEQ ID NO: 1 y un motivo de unión MYB que tiene la secuencia de nucleótidos desde la posición 846 a 851 de SEQ ID NO: 1 y que tiene actividad del promotor específica para la semilla con altos niveles de expresión en fibras desde el día 5 post-antesis hasta el día 30 post-antesis cuando se introduce en algodón; (c) una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) o (b).
Description
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tricomas en Arabidopsis, y en los promotores GL1 (que controla el gen myb en Arabidopsis) y GaMyb2 (que controla el gen MYB en algodón). Se ha demostrado anteriormente que la interrupción del motivo de unión MYB conduce a una reducción en la producción de tricomas.
Variantes del promotor descritas en esta memoria incluyen las que comprenden ambos elementos identificados, pero por lo demás se han modificado para eliminar tramos de nucleótidos dentro de la secuencia que no son necesarios para que el promotor sea funcional de una manera específica para la semilla, específica para la envuelta de la semilla o incluso específica para tricomas o fibras, Por ejemplo, cualquier tramo de nucleótidos situado entre los dos motivos identificados y/o entre el inicio de la transcripción y el primer motivo puede ser al menos parcialmente eliminado para dar lugar a una secuencia de nucleótidos más corta que la secuencia de aproximadamente 1,5 Kb representada en SEQ ID NO: 1.
Se espera que la secuencia de nucleótidos del presente promotor, así como fragmentos y variantes del mismo tal como se define anteriormente, ejerza una actividad específica para la semilla, específica para la envuelta de la semilla o incluso específica para tricomas o fibras.
En un ejemplo, la actividad del promotor específica para la semilla está en algodón. Otros ejemplos para los que se pueden tratar el promotor, fragmentos y variantes de los mismos incluyen otras plantas productoras de tricomas o de fibras tales como cáñamo, yute, lino y plantas leñosas, incluyendo, pero no limitadas a Pinus spp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp. etc.
En un ejemplo de la secuencia de ácido nucleico descrita en esta memoria, la actividad del promotor específica para la semilla es específica para tricomas o específica para fibras.
En otro aspecto, la presente solicitud describe un gen quimérico que comprende el ácido nucleico (aislado) descrito en esta memoria, enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un producto de expresión de interés y, opcionalmente, una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación funcional en células vegetales.
Un gen quimérico es un gen artificial construido enlazando operativamente fragmentos de genes no relacionados u otras secuencias de ácidos nucleicos. En otras palabras "gen quimérico" designa un gen que no se encuentra normalmente en una especie vegetal o se refiere a cualquier gen en el que el promotor, partes adjuntas del promotor
- o una o más de otras regiones reguladoras del gen no están asociados en la naturaleza con una parte o la totalidad del ácido nucleico transcrito enlazado operativamente con el mismo, es decir, son heterólogos con respecto al ácido nucleico transcrito. Más particularmente, un gen quimérico que es un gen artificial, es decir, que no se produce de forma natural, el gen producido por un enlace operativo de la secuencia de ácido nucleico de la invención tal como,
- p.
- ej. el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, un fragmento de 600 nt del mismo o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la misma, todos ellos capaces de dirigir una expresión específica para la semilla, específica para la envuelta de la semilla o específica para tricomas-fibras de un producto de expresión de interés como se describe anteriormente, con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica dicho producto de expresión de interés que no está enlazado operativamente de forma natural a dicha secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente de forma natural a dicha secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificante del gen MADS6 de algodón. El término "heterólogo" se refiere a la relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína que se derivan de diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es heterólogo con respecto a una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente, tal como una secuencia codificante, si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además, una secuencia particular puede ser "heteróloga" con respecto a una célula u organismo en el que se inserta (es decir, no se produce de forma natural en esa célula u organismo particular). Por ejemplo, el gen quimérico descrito en esta memoria es un ácido nucleico heterólogo.
La expresión "enlazada operativamente" se refiere a la disposición espacial funcional de dos o más regiones de ácido nucleico o secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, una región del promotor puede estar situada con relación a una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto de expresión de interés, de manera que la transcripción de dicha secuencia de ácido nucleico está dirigida por la región del promotor. Por lo tanto, una región del promotor está "enlazada operativamente" a la secuencia de ácido nucleico.
El promotor, fragmento o variante del mismo tal como se describe arriba pueden ser enlazados operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto de expresión de interés que es heterólogo con respecto al promotor. Generalmente, la secuencia de ácido nucleico puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico para la que se desea un nivel alterado tal como un nivel de transcripción incrementado. La secuencia de ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, un polipéptido que es capaz de modificar propiedades de la fibra en algodón o que está implicado en la biosíntesis de auxinas.
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El término "proteína", tal como se utiliza en esta memoria, describe un grupo de moléculas que consiste en más de 30 aminoácidos, mientras que el término "péptido" describe moléculas que consisten en hasta 30 aminoácidos. Las proteínas y los péptidos pueden formar, además, dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, consisten en más de una molécula (poli)peptídica. Moléculas de proteínas o péptidos que forman tales dímeros, trímeros, etc., pueden ser idénticos o no idénticos. Las correspondientes estructuras de orden superior se denominan, por consiguiente, homodímeros o heterodímeros, homotrímeros o heterotrímeros, etc. Los términos "proteína" y "péptido" también se refieren a proteínas o péptidos modificados de forma natural en los que la modificación se efectúa, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica.
Proteínas a modo de ejemplo, adecuadas como productos de expresión, incluyen proteínas implicadas en la modificación de propiedades de la fibra tales como las que median en un aumento en la longitud de la fibra, una alteración en la resistencia de la fibra o una alteración en las propiedades de la pared celular resultante, p. ej., en una carga alterada de dichas paredes celulares, una alteración en la capacidad de tinción, una producción de fibra de pelusa disminuida, una alteración en la relación de madurez de la fibra, una disminución en el contenido de fibra inmadura o un aumento en la uniformidad de la fibra y micronaire.
Dicho producto de expresión de interés también puede ser una molécula de ARN capaz de modular la expresión de un gen endógeno a dicha planta de algodón.
Ejemplos de genes diana adecuados para los productos de expresión de ARN a este respecto incluyen los implicados en la modificación de propiedades de la fibra, tales como los que median en un incremento en la longitud de la fibra, una alteración en la resistencia de la fibra o una alteración en las propiedades de la pared celular resultante, p. ej., en una carga alterada de dichas paredes celulares, una alteración en la capacidad de tinción, producción de fibra de pelusa disminuida, una alteración en la relación de madurez de la fibra, una disminución en el contenido de fibra inmadura o un incremento en la uniformidad de la fibra y micronaire.
Para el caso de moléculas de ARN, resultará claro que siempre que las secuencias de nucleótidos de las moléculas de ARN se definan con referencia a la secuencia de nucleótidos de moléculas de ADN correspondiente, la timina (T) en la secuencia de nucleótidos debe ser sustituida por uracilo (U). El que se haga referencia a moléculas de ARN o ADN resultará claro por el contexto de la solicitud.
La expresión "capaz de modular la expresión de un gen" se refiere a la acción de una molécula de ARN, tal como una molécula de ARN inhibidora tal como se describe en esta memoria, para influir sobre el nivel de expresión de genes diana de diferentes maneras. Esto puede efectuarse, p. ej., mediante la inhibición de la expresión de un gen diana mediante la interacción directa con los componentes que impulsan dicha expresión tal como el gen propiamente dicho o el ARNm transcrito que resulta en una disminución de la expresión, o mediante la inhibición de otro gen implicado en la activación de la expresión de un gen diana, aboliendo de este modo dicha activación, o inhibiendo otro gen implicado en la inhibición de la expresión de un gen diana que resulta en un aumento de la expresión. La inhibición de un gen implicado en la inhibición de la expresión de un gen diana utilizando ARN inhibidor puede resultar, por el contrario, en una activación de la expresión de dicho gen diana.
Moléculas de ARN inhibidoras disminuyen los niveles de ARNms de sus proteínas diana disponibles para la traducción a dicha proteína diana. De esta manera, se puede inhibir la expresión de proteínas implicadas en las respuestas no deseadas a condiciones de estrés. Esto se puede lograr a través de técnicas bien establecidas, incluyendo la co-supresión (supresión de ARN sentido), ARN antisentido, ARN de doble cadena (ARNds), ARNsi o microARN (miARN).
Una molécula de ARN como producto de expresión tal como se describe en esta memoria comprende una parte de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana o una secuencia homóloga para regular a la baja la expresión de dicha proteína diana. Otro ejemplo de una molécula de ARN como producto de expresión para uso en la expresión de regulación a la baja son moléculas de ARN antisentido que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria a al menos una parte de un nucleótido que codifica una proteína de interés o una secuencia homóloga. Aquí, la regulación a la baja puede efectuarse, p. ej., introduciendo este ARN antisentido o un ADN quimérico que codifica dicha molécula de ARN. Todavía en otro ejemplo, la expresión de una proteína de interés se regula a la baja introduciendo una molécula de ARN de doble cadena que comprende una región de ARN sentido y una región de ARN antisentido correspondiente a y respectivamente complementaria a al menos parte de una secuencia génica que codifica dicha proteína de interés, región de ARN sentido y antisentido que son capaces de formar una región de ARN de doble cadena entre sí. Una molécula de ARN de doble cadena de este tipo puede ser codificada tanto por moléculas sentido como antisentido tal como se describe anteriormente y por una molécula de una sola cadena que es procesada para formar ARNsi o ARNmi.
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En un ejemplo, la expresión de una proteína diana puede ser regulada a la baja introduciendo una construcción de ADN quimérico que proporciona una molécula de ARN sentido capaz de regular a la baja la expresión mediante la co-supresión. La región de ADN transcrita proporcionará, después de la transcripción, una denominada molécula de ARN sentido capaz de reducir la expresión de un gen que codifica una proteína diana en la planta o célula vegetal diana de una manera transcripcional o post-transcripcional. La región de ADN transcrito (y la molécula de ARN resultante) comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la porción correspondiente de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína diana presente en la planta o célula vegetal.
Alternativamente, un producto de expresión para regular a la baja la expresión de una proteína diana es una molécula de ARN antisentido. Regular a la bajo o reducir la expresión de una proteína de interés en la planta de algodón o célula vegetal diana se efectúa de nuevo de una manera transcripcional o post-transcripcional. La región de ADN transcrita (y la molécula de ARN resultante) comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos que tienen al menos 95% de identidad de la secuencia con el complemento de la parte correspondiente de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína diana presente en la planta o célula vegetal.
Sin embargo, la secuencia de nucleótidos mínima de la región de ARN antisentido o sentido de aproximadamente 20 nt de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína diana puede estar comprendida dentro de una molécula de ARN mayor, variando en tamaño de 20 nt a una longitud igual al tamaño del gen diana. Las regiones de nucleótidos antisentido o sentido mencionados pueden ser, por lo tanto, de aproximadamente 21 nt a aproximadamente 5000 nt de longitud tal como 21 nt, 40 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 300 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt o incluso aproximadamente 5000 nt o mayores en longitud. Además de ello, no se requiere para el propósito de la invención que la secuencia de nucleótidos de la molécula de ARN inhibidora utilizada o la región codificante del transgen, sea completamente idéntica o complementaria al gen endógeno que codifica la proteína diana, cuya expresión está dirigida a ser reducida en la célula vegetal. Cuanto más larga sea la secuencia, menos riguroso será el requisito para la identidad de secuencia global. Por lo tanto, las regiones sentido o antisentido pueden tener una identidad de secuencia global de aproximadamente 40% o 50% o 60% o 70% u 80% o 90% o 100% a la secuencia de nucleótidos de un gen endógeno o el complemento de la misma. Sin embargo, tal como se menciona, las regiones antisentido o sentido deben comprender una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos consecutivos que tiene de aproximadamente 95 a aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del gen endógeno que codifica el gen diana. El tramo de aproximadamente 95 a aproximadamente 100% de identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 50, 75 o 100 nt.
La eficiencia de los genes quiméricos mencionados anteriormente para la regulación a la baja del nivel de expresión génica mediada por ARN antisentido o ARN sentido puede potenciarse adicionalmente por la inclusión de elementos de ADN que resulta en la expresión de moléculas de ARN inhibidoras aberrantes, no poliadeniladas. Un elemento de ADN de este tipo, adecuado para ese propósito, es una región de ADN que codifica una ribozima de auto-corte y empalme. La eficiencia puede potenciarse también proporcionando las moléculas de ARN generadas con señales de localización o retención nuclear.
Además, un producto de expresión tal como se describe en esta memoria puede ser una secuencia de ácido nucleico que proporciona una molécula de ARN de doble cadena, capaz de regular a la baja la expresión de un gen que codifica una proteína diana. Tras la transcripción de la región de ADN, el ARN es capaz de formar una molécula de ARNds a través de apareamiento convencional de bases entre una región sentido y antisentido, en que la región sentido y antisentido son secuencias de nucleótidos tal como se describe anteriormente en esta memoria. Los productos de expresión, que son ARNds de acuerdo con la invención pueden comprender, además, un intrón tal como un intrón heterólogo, situado, p. ej., en la secuencia de espaciador entre las regiones de ARN sentido y antisentido de acuerdo con la divulgación del documento WO 99/53050. Para lograr la construcción de un transgen de este tipo, se puede hacer uso de los vectores descritos en el documento WO 02/059294 A1. En un ejemplo, dicha molécula de ARN comprende una primera y una segunda región de ARN, en donde 1. dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno; 2. dicha segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera región de ARN; 3. dicha primera y segunda región de ARN son capaces de apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre al menos dichos 19 nucleótidos consecutivos de dichas primera y segunda región. En otros ejemplos, se aplican las mismas consideraciones que se ha descrito anteriormente para el ARN sentido y antisentido.
Otro producto de expresión a modo de ejemplo es una molécula de microARN (mirARN, que puede ser procesado a partir de una molécula de pre-microARN) capaz de guiar la escisión del ARNm transcrito a partir del ADN que codifica la proteína diana que ha de ser traducido a dicha proteína diana. Moléculas de miARN se pueden introducir convenientemente en células vegetales a través de la expresión de un gen quimérico tal como se describe en esta
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memoria que comprende una (segunda) secuencia de ácido nucleico que codifica, como producto de expresión de interés dicha transcripción de miARN, pre-miARN o miARN primaria.
Las miARNs son pequeños ARNs endógenos que regulan la expresión génica en plantas, pero también en otros eucariotas. Tal como se utiliza en esta memoria, un "miARN" es una molécula de ARN de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos (Siomi y Siomi, 2009) de longitud, que se pueden cargar en un complejo RISC y dirigir la escisión de una molécula de ARN diana, en donde la molécula de ARN diana comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de miARN. En el ejemplo de miARNs, se pueden producir uno o más de los siguientes apareamientos erróneos en el miARN esencialmente complementarios con el ARN diana:
-Un apareamiento erróneo entre el nucleótido en el extremo 5' de dicho miARN y la secuencia de nucleótidos correspondiente en la molécula de ARN diana;
-Un apareamiento erróneo entre uno cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 a la posición 9 de dicho miARN y la secuencia de nucleótidos correspondiente en la molécula de ARN diana;
-Tres apareamientos erróneos entre uno cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 a la posición 21 de
dicho miARN y la secuencia de nucleótidos correspondiente en la molécula de ARN diana siempre que no
haya más de dos apareamientos erróneos consecutivos;
-No se permite un apareamiento erróneo en las posiciones 10 y 11 del miARN (todas las posiciones del miARN se indican a partir del extremo 5' de la molécula de miARN).
Un ejemplo adicional de un producto de expresión capaz de regular a la baja la expresión de una proteína diana es codificado por una secuencia de ácido nucleico que produce una molécula de ARN pre-miARN que se procesa en un miARN capaz de guiar la escisión del ARNm que codifica dicha proteína diana. En las plantas, miARNs son procesados a partir de las regiones de tallo-bucle de largos pre-miARNs endógenos por la actividad de escisión de DICERLIKE1 (DCL1). miARNs de plantas son altamente complementarios a ARNms diana conservados, y guían la escisión de sus dianas. Los miRNAs parecen ser componentes clave en la regulación de la expresión génica de redes complejas de las vías implicadas, entre otras cosas, en el desarrollo. Tal como se utiliza en esta memoria, una molécula de "pre-miARN" es una molécula de ARN de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 nucleótidos, que puede adoptar una estructura secundaria que comprende un tallo de ARNds y un bucle de ARN de cadena sencilla y que comprende, además, la secuencia de nucleótidos del miARN y su secuencia de complemento del miARN* en el tallo de ARN de doble cadena. Preferiblemente, el miARN y su complemento se encuentran a una distancia de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleótidos de los extremos libres del tallo de miARN ARNds. La longitud y la secuencia de la región de bucle de cadena sencilla no son críticas y pueden variar considerablemente, p. ej., entre 30 y 50 nt de longitud. Preferiblemente, la diferencia en la energía libre entre la estructura del ARN no apareado y apareado es de entre -20 y -60 kcal/mol, p. ej., alrededor de -40 kcal/mol. La complementariedad entre el miARN y el miARN* no tiene por qué ser perfecta y se pueden tolerar alrededor de 1 a 3 engrosamientos de nucleótidos no apareados. La estructura secundaria adoptada por una molécula de ARN puede predecirse mediante algoritmos informáticos convencionales en la técnica tales como mFold, UNAFold y RNAfold. La cadena particular del tallo de ARNds desde el pre-miARN que se libera por la actividad DCL y se carga en el complejo RISC se determina por el grado de complementariedad en el extremo 5', con lo que la cadena que en su extremo 5' es la menos implicada en el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos de las diferentes cadenas del tallo de ARNds escindido se carga en el complejo RISC y determinará la especificidad de secuencia de la degradación de la molécula de ARN diana. Sin embargo, si empíricamente la molécula de miARN de una molécula de pre-miARN sintética particular no es funcional debido a que se carga la cadena "equivocada" en el complejo RISC, resultará inmediatamente evidente que este problema puede ser resuelto mediante el intercambio de la posición de la molécula de miARN y su complemento en las respectivas cadenas del tallo de ARNds de la molécula de pre-miARN. Tal como se sabe en la técnica, la unión entre A y U que implican dos uniones hidrógeno, o G y U que implican dos uniones hidrógeno es menos fuerte que entre G y C que implica tres uniones hidrógeno.
Moléculas de miARN pueden estar comprendidos dentro de sus moléculas de pre-miARN que se producen de forma natural, pero también pueden ser introducidas en armazones de moléculas pre-miARN existentes mediante el intercambio de la secuencia de nucleótidos de la molécula de miARN normalmente procesada a partir de dicha molécula de pre-miARN existente para la secuencia de nucleótidos de otro miARN de interés. El armazón del premiARN también puede ser completamente sintético. Del mismo modo, moléculas de miARN sintéticas pueden estar comprendidas dentro y procesadas de armazones de moléculas de pre-miARN existentes o armazones de premiARN sintéticos.
Productos de expresión a modo de ejemplo también pueden ser ribozimas que catalizan su propio escisión o la escisión de otros ARN.
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a la disposición de información genética en una planta o célula vegetal por medios artificiales. Esto puede efectuarse por cualquier método conocido en la técnica para la introducción de ARN o ADN en células vegetales, protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones, polen y microesporas, otros tejidos vegetales
o plantas enteras. Más particularmente, "introducción" significa la integración de forma estable en el genoma de la planta. A las plantas que contienen la secuencia de ácido nucleico transformadas se las alude como "plantas transgénicas". Transgénico y recombinante se refieren a un organismo huésped tal como una planta en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo (p. ej., la secuencia de ácido nucleico, el gen quimérico o el vector tal como se describe en esta memoria). El ácido nucleico puede ser integrado de forma estable en el genoma de la planta. Métodos específicos para la introducción se describen en relación con los métodos descritos en esta memoria.
"Algodón" o "planta de algodón", tal como se utiliza en esta memoria, puede ser cualquier variedad útil para el cultivo de algodón. Las variedades de algodón más comúnmente utilizadas son Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum y G. herbaceum. Variedades adicionales incluyen G. africanum y G. raimondii. También se incluye la progenie de los cruces de cualquiera de las especies anteriores con otras especies o cruces entre tales especies.
Una célula de planta de algodón puede ser cualquier célula que comprende esencialmente la información genética necesaria para definir una planta de algodón, que puede, aparte del gen quimérico descrito en esta memoria, ser complementada con uno o más transgenes. Las células pueden derivar de los distintos órganos y/o tejidos que forman una planta de algodón, incluyendo pero no limitados a frutos, semillas, embriones, tejido reproductor, regiones meristémicas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, flores, tejido vascular, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas.
La presente solicitud también describe una planta transgénica que consiste en la célula de la planta de algodón transgénica descrita anteriormente en esta memoria, o que comprende el gen quimérico o el vector descrito en esta memoria integrado de manera estable en el genoma de la planta. Esto puede efectuarse por protocolos de transformación descritos en otra parte en esta solicitud.
En otra realización, la presente invención se refiere a una semilla generada a partir de una planta de algodón transgénica descrita en esta memoria, en donde dicha semilla comprende el gen quimérico descrito en esta memoria.
La semilla se forma por una planta embrionaria encerrada junto con nutrientes almacenados por una envuelta de la semilla. Es el producto del óvulo maduro de las plantas gimnospermas y angiospermas, a la última de las cuales pertenece el algodón, que se produce después de la fertilización y en cierta medida crece dentro de la planta madre.
En esta memoria se describen, además, fibras de algodón y aceite de semilla de algodón obtenibles u obtenidos de las plantas descritas en esta memoria. Las fibras de algodón descritas en esta memoria pueden distinguirse de otras fibras mediante la aplicación del método de detección descrito en el documento WO2010/015423 y la comprobación de la presencia del ácido nucleico de (a) o gen quimérico de (b) en las fibras. Por consiguiente, el ácido nucleico de
(a) también se puede utilizar para el seguimiento de paredes celulares, en particular fibras de algodón de acuerdo con la invención. También se describen en esta memoria hilos y materiales textiles hechos a partir de las fibras descritas en esta memoria, así como los productos alimenticios y piensos que comprenden o están hechos del aceite de semilla de algodón descrito en esta memoria. También se describe un método para obtener el aceite de semilla de algodón, que comprende recolectar las semillas de algodón de la planta de algodón descrita en esta memoria y extraer dicho aceite de dichas semillas. Además, también se describe un método para producir fibras de algodón, que comprende cultivar la planta de algodón descrita en esta memoria y recolectar el algodón a partir de dichas plantas de algodón.
Está disponible un cierto número de métodos para introducir ADN en células vegetales o plantas, ya sea por transformación o introgresión. La transformación mediada por Agrobacterium de algodón se ha descrito, p. ej., en la patente de EE.UU. 5.004.863, en la patente de EE.UU. 6.483.013 y en el documento WO2000/71733.
Las plantas también pueden ser transformadas por bombardeo de partículas: partículas de oro o wolframio se recubren con ADN y luego se disparan en células de plantas jóvenes o embriones de plantas. Este método también permite la transformación de plastidios de plantas. La transformación del algodón mediante bombardeo de partículas se reseña, p. ej., en el documento WO 92/15675.
La transformación (transducción) viral se puede utilizar para la expresión transitoria o estable de un gen, dependiendo de la naturaleza del genoma del virus. El material genético deseado se empaqueta en un virus de
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Productos de expresión de interés adicionales confieren resistencia a los insectos a una planta de algodón, es decir, resistencia al ataque por ciertos insectos diana, o la tolerancia a estreses abióticos.
Las células vegetales y plantas transformadas descritas en esta memoria tales como las obtenidas por los métodos descritos en esta memoria se pueden utilizar adicionalmente en los procedimientos de reproducción bien conocidos en la técnica tales como cruce, autofecundación y retrocruzamiento. Los programas de reproducción pueden implicar el cruce para generar una generación F1 (primera filial), seguido de varias generaciones de autopolinización (generando F2, F3, etc.). El programa de cultivo también puede implicar etapas de retrocruzamiento (BC), con lo que la descendencia se retro-cruza a una de las líneas parentales, denominada el parental recurrente. Por consiguiente, también se describe en esta memoria un método para producir plantas que comprenden el gen quimérico descrito en esta memoria, que comprende la etapa de cruzar la planta de algodón descrita en esta memoria con otra planta o consigo misma y seleccionar la descendencia que comprende dicho gen quimérico.
Las células de plantas transgénicas y plantas obtenidas por los métodos descritos en esta memoria también se pueden utilizar adicionalmente en procedimientos de transformación posteriores, p. ej., para introducir un gen quimérico adicional.
Las figuras muestran:
Figura 1: Gel de agarosa que presenta los resultados de la reacción PCR para amplificar la secuencia de ADN de cuatro genes MADS.
Figura 2: Esquema del procedimiento de PCR inversa.
Figura 3: Etapas de clonación para recuperar el promotor MADS6 (PMADS6) tal como se describe en el Ejemplo 1. Esquema 3a/3b de la recuperación de la secuencia genómica y enfoque de la PCR inversa; 3c. Fragmentos recuperados de la PCR inversa; 3d a f: creación de vectores que comprenden el promotor MADS6 completo. Abreviaturas: bla: gen de resistencia a ampicilina; ORI ColE1: origen de replicación de plásmido procedente de pMB1; lacZ: secuencia codificante que codifica el péptido beta-galactosidasa alfa de Escherichia coli; MCS: sitio de multi-clonación; 5’ UTR: región 5’ no traducida; Plac: Promotor del operón lac de Escherichia coli; Pmads6: promotor MADS6; Phis: secuencia que incluye la región del promotor del gen histona H4 de Arabidopsis thaliana y el primer intrón del gen II de la variante de histona H3.III de Arabidopsis thaliana; 2mepsps: secuencia codificante del gen doble mutante 5-enol piruvilshikimate-3-fosfato sintasa de Zea mays (maíz); (Lebrun et al., 1997) TPotp C: secuencia codificante del péptido de tránsito optimizado, que contiene la secuencia de los genes de la subunidad pequeña RuBisCO de Zea mays (maíz) y Helianthus annuus (girasol); aadA: estreptomicina y resistencia a espectinomicina; la secuencia codificante del gen aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) del transposón Tn7 de Escherichia coli (Fling et al., 1985); bar: secuencia codificante del gen fosfinotricina acetiltransferasa (= gen de resistencia bialafos) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al, 1987); 3'nos: fragmento del extremo 3' no traducido del gen nopalina sintasa del ADN-T de pTiT37 y que contiene señales de poliadenilación de plantas; ori pVS1: origen de replicación de plásmido procedente de pVS1 para el mantenimiento estable en Agrobacterium; P35S3: fragmento de la región del promotor de la transcripción de virus del mosaico de la coliflor 35S; GUS: secuencia codificante del gen beta-glucuronidasa de Escherichia coli, incluyendo el segundo intrón del gen ST-LS1 de Solanum tuberosum (patata).
Figura 4: Producción del vector de la transformación de algodón pTTS108 que comprende el promotor MADS6 putativo, la secuencia codificante de GUS y el marcador de selección bar.
Figura 5: Óvulos transformadas con el gen informador GUS controlado por PMADS6 (Figura 5a) y un gen informador GUS controlado por PFBP7 (Figura 5b) 6 dap. Los círculos indican manchas azules que se encuentran en los óvulos que corresponde a la expresión de GUS.
Los ejemplos ilustran la invención.
Materiales
A menos que se indique lo contrario, los productos químicos y reactivos en los ejemplos se obtuvieron de Sigma Chemical Company, las endonucleasas de restricción eran de Fermentas o Roche-Boehringer, y otras enzimas modificadoras o kits con respecto a productos bioquímicos y ensayos biológicos moleculares eran de Qiagen, Invitrogen y Q-BIOgene. Las cepas bacterianas eran de Invitrogen. Las etapas de clonación llevadas a cabo tales como, p. ej., escisiones por restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, enlace de fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli, bacterias en crecimiento, fagos que se multiplican y
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Para todos los cuatro genes, se amplificó un único fragmento mayor que el fragmento esperado, en base a secuencias de ADNc (véase la Figura 1). Esto indica que los cuatro genes contienen intrones dentro de la región codificante amplificada.
Los fragmentos de PCR obtenidos para MADS 4, MADS5 y MADS7 se almacenaron a -20° C. El fragmento de PCR obtenido para MADS6 se clonó en un vector de clonación.
Para comparación, se realizó una reacción PCR adicional sobre el ADN genómico para MADS6 utilizando los cebadores reseñados en Lightfoot et al. (2007). Una vez más, el fragmento obtenido (1040 pb) era mayor que el fragmento de ADNc correspondiente (394 pb). El fragmento obtenido se clonó y secuenció y se alineó con un fragmento genómico obtenido con cebadores específicos para el extremo 3' de MADS6, con la secuencia de ADNc de MADS6 y con los fragmentos obtenidos a partir de ADNc utilizando cebadores específicos para el extremo 3' de MADS6. Se pudieron confirmar intrones dentro de la secuencia codificante.
El fragmento de 1040 pares de bases obtenido, correspondiente a la parte 3' del gen MADS6, se tomó entonces como base para la amplificación de la secuencia 5' genómica que comprende el promotor.
Se juzgó el enfoque de la PCR inversa. Un esquema de las etapas a realizar se representa en la figura 2. Un buen candidato para la enzima A se podría definir como NheI. Ensayos con esta enzima resultaron en fragmentos que se hibridan con fragmentos genómicos de más de 5 kb.
Después se diseñaron cebadores anidados para la PCT inversa que fijan como objetivo el extremo 3' de la secuencia codificante MADS6 que se encontró que era al menos idéntica de los cuatro genes MADS identificados en
G. hirsutum.
Las reacciones PCR se establecieron con estos cebadores y algunos de los candidatos para la enzima A.
Sólo podían obtenerse múltiples bandas no específicas utilizando los cebadores anteriores dirigidos específicamente a MADS6 en la región 3' del gen, y no pudo determinarse la secuencia 5' aguas arriba del gen MADS6.
Se realizó un intento adicional con la secuencia 5’ menos específica del gen MADS6. En primer lugar, secuencias 5’genómicas de MADS6 se amplificaron utilizando cebadores directos TSOL472 (5' -GGTACAAGTGATCAAAGAG 3'; SEQ ID NO: 10) resp. TSOL473 (5' -ATTGGCCGGAACTCTTACCA -3'; SEQ ID NO: 11), la unión a la región 5' no traducida (UTR) y cebador inverso TSOL465 que tiene la secuencia 5' -GGACCTGATCCTAGTAATTCC -3' (SEQ ID NO: 12) y la unión al ADNc de MADS6. Aunque la distancia entre TSOL472 y TSOL473 en la 5'UTR de la secuencia de ADNc es solamente 30 pb, los fragmentos amplificados (2500 pb, resp. 3250 pb) difieren en 750 pb de longitud; lo que indica una secuencia de intrón de 750 pb en la 5'UTR del gen MADS6. La clonación y secuenciación de ambos fragmentos confirmaron esta hipótesis. El fragmento más largo de 3251 pares de bases se tomó como base para la amplificación de la secuencia 5' que comprende el promotor (véase la figura 3a).
En un enfoque de PCR inversa adicional, un buen candidato para la enzima B se definió por hibridación de ADN Coker genómico digerido a una sonda 5'UTR de MADS6 (fragmento de 540 pb obtenido mediante amplificación por PCR con los cebadores TSOL473 (SEQ ID NO: 11) y TSOL512 (5' -AGCCATTCCTATTCCCATAC -3'; SEQ ID NO: 13). Para todas las enzimas de restricción testadas se obtuvieron al menos 2 fragmentos de hibridación, lo que indica una hibridación cruzada con al menos otro miembro de la familia MADS. De todas las enzimas, Bcll, NdeI y HindIII fueron consideradas como las más prometedoras. Todas estas enzimas proporcionaron 2 bandas de hibridación de entre 3,5 y 0,8 kb.
A continuación, el ADN Coker genómico se digirió en tres viales de reacción con Bcll, NdeI y HindIII. 10 µg de ADN genómico digerido, limpiado por precipitación y resuspendido en 85 μΙ de tampón TE se autoligó (en un volumen de reacción de 100 μΙ) para obtener fragmentos circulares (fig.3 b), adecuados para el análisis por PCR anidada.
Se realizó una PCR anidada utilizando cebadores TSOL502 (5'-CTGTTCTATCTTTCCCTTCTTG -3', SEQ ID NO: 14) y TSOL503 (5' -AGAAAGAAAGCATGCATTTAGG -3'; SEQ ID NO: 15) para la primera reacción PCR y los cebadores TSOL500 (5' -ATACATGATGGGTTCTCTTC -3'; SEQ ID NO: 16) y TSOL501 (5'-AAGCATGCATTTAGGTAAAG -3'; SEQ ID NO: 17) para la segunda reacción PCR. La PCR anidada dio como resultado la amplificación de una banda que tiene un tamaño correspondiente a la banda de hibridación para dos de las tres enzimas ensayadas: amplificación de un fragmento de 850 pb en HindIII resp. un fragmento de 1,7 kb en
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