ES2703169T3 - Expresión selectiva mejorada de transgenes en plantas productoras de fibra - Google Patents

Abstract

Un gen recombinante para la expresión espacialmente selectiva en una planta de algodón que comprende los siguientes elementos enlazados operativamente: (a) un promotor expresable en plantas; (b) una región que codifica una molécula de ARN que puede traducirse en un polipéptido o proteína; (c) opcionalmente una región de terminación de la transcripción 3' y de poliadenilación caracterizada porque dicho gen recombinante comprende además una secuencia objetivo heteróloga reconocida por un miARN endógeno, expresándose dicho miARN de manera menos abundante en las células que conducen a fibras en dicha planta de algodón en comparación con las células de dicha planta de algodón diferente de dichas células que conducen a dichas fibras y en donde dicho miARN tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 22.

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión selectiva mejorada de transgenes en plantas productoras de fibra

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de biotecnología agrícola, más específicamente al uso de técnicas de biología molecular para alterar el patrón de expresión de transgenes en plantas productoras de fibra tales como algodón. Se proporcionan microARN de origen natural con un perfil de expresión específico, particularmente con un perfil de expresión diferencial entre las células que conducen a las fibras y otras células de la planta productora de fibra. Mediante ingeniería e inclusión de sitios objetivo para dichos microARN en genes, particularmente en transgenes, el perfil de expresión del gen que comprende dicho sitio objetivo de microARN reflejará (espejo) el perfil de expresión del microARN en plantas. Dichos microARN y los sitios objetivo correspondientes pueden usarse para potenciar la expresión selectiva de transgenes bajo el control de un promotor selectivo de fibra, en fibras, particularmente fibras de algodón.

Antecedentes de la invención

El algodón (Gossypium spp.) es la fibra textil natural más importante del mundo y también es un importante cultivo de semillas oleaginosas. La producción de algodón proporciona ingresos para aproximadamente 100 millones de familias, y aproximadamente 150 países participan en la importación y exportación de algodón. Su impacto económico se estima en aproximadamente $ 500 mil millones/año en todo el mundo. El consumo mundial de fibra de algodón es de aproximadamente 115 millones de balas o aproximadamente 27 millones de toneladas métricas por año (National Cotton Council, http://www.cotton.org/, 2006). El género Gossypium es relativamente complejo e incluye aproximadamente 45 especies diploides (2n = 2x = 26) y cinco tetraploides (2n = 4x = 52), todas exhibiendo patrones de herencia disómicos. Las especies diploides (2n = 26) se dividen en ocho grupos genómicos (A-G y K). El clado africano, que comprende los genomas A, B, E y F, se encuentra naturalmente en África y Asia, mientras que el clado del genoma D es originario de las Américas. Un tercer clado diploide, incluyendo C, G y K, se encuentra en Australia. Las 52 especies de cromosomas, incluyendo Gossypium hirsutum y Gossypium barbadense, son alotetraploides naturales clásicos que surgieron en el Nuevo Mundo a partir de la hibridación interespecífica entre una especie africana ancestral tipo genoma A y una especie americana tipo genoma D. Los parientes existentes más cercanos de los progenitores tetraploides originales son las especies del genoma A, Gossypium herbaceum (A1) y Gossypium arboreum (A2) y las especies del genoma D, Gossypium raimondii (D5) 'Ulbrich'. Se estima que la poliploidización ocurrió de 1 a 2 millones de años, dando lugar a cinco especies alotetraploides existentes. Curiosamente, las especies del genoma A producen fibra hilable y se cultivan en una escala limitada, mientras que las especies del genoma D no lo hacen. Más del 95% de la cosecha anual de algodón a nivel mundial es algodón G. hirsutum, Upland o americano, y el algodón extra largo o Pima (G. barbadense) representa menos del 2% (National Cotton Council, http://www.cotton.org, 2006).

Cada fibra de algodón es una célula epidérmica única diferenciada del óvulo. Aproximadamente medio millón de fibras se producen por cápsula de algodón, algunas forman pelusa y otras forman hilas. El inicio de una célula epidérmica en fibra requiere un cambio en el destino celular, que es un proceso biológico fundamental que involucra "interruptores" genéticos, fisiológicos y de desarrollo. Las mutaciones genéticas, la poliploidía, la polinización/fertilización y la regulación hormonal pueden afectar el número de células que se convierten en fibras o alterar las propiedades de las células de la fibra (pelusas frente a hilas). Sin embargo, no está claro cómo estos factores controlan los cambios en la expresión génica que organizan el patrón y el ritmo en las primeras etapas del desarrollo de la fibra.

Por el contrario, el desarrollo morfológico de las fibras de algodón está bien documentado en la técnica. Las fibras de algodón se someten a cuatro etapas de desarrollo superpuestas: inicio de células de fibra, alargamiento, biosíntesis de la pared secundaria y maduración. La iniciación de la fibra es un proceso rápido. Las fibras esponjosas blancas comienzan a desarrollarse inmediatamente después de la antesis y continúan hasta 3 días después de la antesis (DPA), lo que es seguido por el alargamiento de las células de la fibra (hasta 20 DPA). La biosíntesis de la pared secundaria inicia alrededor de 15 DPA y continúa hasta 45 DPA, seguido de un proceso de maduración hasta 45-60 DPA. Las fibras de algodón se derivan de células epidérmicas ovulares (tejidos maternos). Sin embargo, solo ~25-30% de las células epidérmicas se diferencian en las fibras de hilas comercialmente importantes. La mayoría de las células no se diferencian en fibras ni se desarrollan en fibras cortas o pelusas. Para las células comprometidas con el desarrollo de la fibra, el inicio y el alargamiento de las células son casi sincrónicos en cada óvulo, lo que indica que los cambios en la expresión génica se orquestan durante la diferenciación y el desarrollo de la fibra a través de la señalización intercelular y/o los mecanismos de sincronización.

En muchos casos, puede ser ventajoso expresar de manera preferencial, selectiva o específicamente genes en células o fibras que desarrollan fibra. Dicha expresión puede influir en el desarrollo de la fibra y dar como resultado fibras más largas o más fuertes. El documento WO 98/00549 describe la expresión del gen de celulosa sintasa en células que desarrollan fibra. Los documentos WO 08/012058 y WO02/45485 describen la expresión de genes de sacarosa sintasa en células que desarrollan fibra de algodón. El documento WO05/017157 describe la reducción de la expresión de p-1,3-glucanasa en células que desarrollan fibra.

La fibra de algodón consiste en celulosa, un polímero natural compuesto de muchas moléculas del azúcar glucosa. Su estructura única es ideal para la producción textil. Cada fibra es básicamente un tubo hueco de unos pocos centímetros de longitud que, cuando se hila y se teje, proporciona el "tacto" característica muy especial del algodón. Sin embargo, las fibras que contienen celulosa natural no poseen la versatilidad química de las fibras sintéticas, debido a la naturaleza relativamente inerte de la celulosa que consiste en monómeros de glucosa unidos de forma p-1-4.

Los documentos WO06/136351, WO11/089021 y WO12/048807 describen procedimientos y medios para alterar la reactividad de la pared celular en fibras de plantas productoras de fibra tales como algodón, mediante la inclusión de oligosacáridos o polisacáridos cargados positivamente en la pared celular. Con este fin, las N-acetilglucosamina transferasas, incluidas las quitina sintasas, se expresan en las fibras de las plantas y, opcionalmente, también glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa. Aunque la quitina podría producirse eficientemente en las paredes celulares de las plantas de algodón, también se observó que las plantas transgénicas usualmente exhibían un crecimiento reducido que puede atribuirse a un efecto negativo de la expresión del transgén en el algodón fuera de las fibras de algodón.

Por lo tanto, sería ventajoso poder aumentar la selectividad tisular de la expresión de transgenes en plantas productoras de fibra, en particular poder aumentar la selectividad de expresión en fibras y/o células que desarrollan fibra, mientras que la expresión en otras células de la planta productora de fibra se reduce o elimina sustancialmente. Esto podría lograrse convenientemente mediante la inclusión en el constructo de ADN recombinante de interés, un sitio objetivo para un microARN, preferiblemente un miARN endógeno, expresado diferencialmente entre las fibras y el resto de la planta, preferiblemente ausente en las fibras y células que desarrollan fibras y expresado de manera ubicua en todas las demás partes de la planta, de modo que la expresión del miARN en células distintas de la fibra o en células que desarrollan fibra dirige la escisión postranscripcional de cualquier ARN mensajero originado por la transcripción adventicia del constructo de ADN recombinante de interés que incorpora el sitio objetivo del miARN, en células fuera de las células que desarrollan fibra o las fibras. También se puede prever un perfil de selectividad de reflejo (es decir, expresión limitada a células fuera de las células que desarrollan fibra).

La incorporación de secuencias objetivo de miARN en constructos quiméricos también se ha descrito como un desencadenante para la producción de los llamados ARNpiat (ARNpi que actúa en forma trans), por ejemplo, véase los documentos WO 2006/138638 o WO2007/039454.

El documento WO2006/111512 describe procedimientos mejorados que controlan la expresión génica en el campo de la genética, especialmente la genética de plantas, y proporciona agentes capaces de controlar la expresión génica. El documento proporciona específicamente secuencias de microARN de origen natural expresados específicamente en tejidos. La solicitud de patente proporciona además constructos de expresión transgénica que comprenden secuencias que interactúan con dichos microARN. Mediante la incorporación de la secuencia codificante de microARN, la expresión de dicho constructo de expresión se silencia específicamente en el tejido donde el microARN natural se expresa naturalmente. De este modo, el perfil de expresión resultante del promotor se modula y se reduce la fuga. El documento proporciona además un procedimiento para modular la expresión transgénica incorporando secuencias que codifican dichos microARN en constructos de expresión transgénica. Las composiciones y procedimientos de la invención se pueden usar para mejorar el rendimiento de cultivos relevantes para la agricultura y para terapia, profilaxis, investigación y diagnóstico en enfermedades y trastornos que afectan a las especies de mamíferos.

El documento WO2007/047016 describe procedimientos para producir semillas híbridas no naturales. También se divulgan miARN y sitios de reconocimiento de miARN útiles para conferir esterilidad inducible en una planta de cultivo, y constructos de ADN recombinante que incluyen dichos sitios de reconocimiento de miARN exógeno.

El documento WO2008/133643 divulga nuevos microARN y sus precursores, y constructos de ADN recombinante que incluyen tales miARN nuevos, precursores de miARN, promotores de miARN y sitios de reconocimiento de miARN correspondientes a los miARN. Se incluyen nuevos miARN y precursores de miARN que exhiben una expresión que responde a los nutrientes. También se divulgan secuencias señuelo de miARN. Además, se proporcionan células de plantas transgénicas no naturales, plantas y semillas que contienen en su genoma un constructo de ADN recombinante como se describe en la solicitud de patente y procedimientos para controlar la expresión génica usando dichos constructos de ADN recombinante.

El documento WO2009/003078 proporciona constructos moleculares y procedimientos para el control temporalmente específico de la expresión génica en plantas o en plagas o patógenos de plantas. Más específicamente, esta solicitud de patente proporciona genes de miARN de plantas que tienen nuevos patrones de expresión circadianos que son útiles para modificar constructos de ADN recombinante para la expresión temporalmente específica de al menos un gen. También se proporcionan células, plantas y semillas de plantas transgénicas no naturales que contienen en su genoma un constructo de ADN recombinante de esta invención.

Kwak et al. (BMC Genomics 2009, 10: 457, titulado "Enrichment of a set of microRNAs during the cotton fiber development", describe un enfoque de secuenciación profunda para investigar la expresión global y la complejidad de los ARN pequeños durante el inicio y el desarrollo de la fibra de algodón. Se prepararon dos bibliotecas de ARN pequeño y se analizaron a partir de óvulos de algodón de tipo silvestre y pelusa/sin hilas. El estudio demostró diferencias significativas en la abundancia de expresión de miARN entre el tipo silvestre y el mutante y sugiere que estos miARN diferencialmente expresados regulan potencialmente los transcriptos claramente involucrados en el desarrollo de la fibra de algodón.

Wang et al., (Molecular Plant 2012, Volumen 5, Número 4, páginas 889-900, titulado A comparative miRNAome analysis reveals seven fiber initiation-related and 36 novel miRNAs in developing cotton ovules" describe una secuenciación de alto rendimiento combinada con el análisis computacional para caracterizar los miARNomas de los óvulos de Algodón de tierras altas de tipo silvestre y un mutante sin fibra durante la iniciación de la fibra.

La técnica sigue siendo deficiente en la descripción de moléculas de microARN con el perfil de expresión apropiado, en particular microARN que se expresan y procesan en algunas o en todas las partes de plantas productoras de fibra, particularmente plantas de algodón, excepto fibras o células que desarrollan fibra, y cuyas secuencias objetivo podrían usarse para aumentar la especificidad de la expresión de transgenes (incluida la N-acetilglucosamina transferasa y/o glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa) en fibras o células que desarrollan fibra (en comparación con el resto de la planta). Estos y otros problemas se resuelven como se describe a continuación en las diferentes realizaciones, ejemplos y reivindicaciones.

Sumario de la invención

En una realización de la invención, se proporciona un gen recombinante para expresión espacialmente selectiva en una planta de algodón que comprende los siguientes elementos operativamente enlazados:

(a) un promotor expresable en plantas, tal como un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, un promotor regulado por desarrollo o tal como un promotor preferencial de fibra o selectivo de fibra;

(b) una región que codifica una molécula de ARN que puede traducirse en un polipéptido o proteína;

(c) opcionalmente una terminación de transcripción 3' y una región de poliadenilación

caracterizados porque el gen recombinante comprende además una secuencia objetivo heteróloga reconocida por un miARN endógeno, siendo el miARN expresado en forma menos abundantemente en células que conducen a fibras en la planta de algodón en comparación con las células de las plantas de algodón distintas de las células que conducen a las fibras. El miARN además tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 o SEQ. ID NO. 22.

La secuencia objetivo reconocida por el miARN puede por lo tanto tener la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.

5, la SEQ ID NO. 5 desde la posición del nucleótido 4 hasta la posición del nucleótido 24, la SEQ ID NO. 6, la SEQ ID NO. 6 desde la posición del nucleótido. 4 hasta la posición del nucleótido 24, la SEQ ID NO. 7 o la SEQ ID NO. 8, la SEQ ID NO. 23, la SEQ ID NO. 23 desde la posición del nucleótido 4 hasta 24, la SEQ ID NO. 23 desde la posición del nucleótido 11 hasta 32, la SEQ ID NO. 23 de las posiciones de nucleótidos 4 hasta 32 o puede tener una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de Ghi_miR403, Ghi_miR408, Ghi_miRcan1230, Ghi_miR398, SEQ ID NO.1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, o SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 22, por lo que pueden ocurrir uno o más de las siguientes faltas de coincidencia:

(a) una falta de coincidencia entre el nucleótido en el extremo 5' del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(b) una falta de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 hasta la posición 9 del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(c) tres faltas de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 hasta la posición 21 del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo siempre que no haya más de dos faltas de coincidencia consecutivas; y

(d) no se permite una falta de coincidencia en las posiciones 10 y 11 del miARN.

El gen recombinante de acuerdo con la invención puede codificar cualquier proteína o polipéptido que incluya un polipéptido con actividad de N-acetilglucosamina transferasa tal como una N-acetilglucosamina transferasa de tipo NODC, una actividad de N-acetilglucosamina transferasa que comprende una secuencia de anclaje de señal seleccionada de la secuencia de anclaje de señal de una sialil transferasa de rata, la secuencia de anclaje de señal de una galactosil transferasa humana, la secuencia de anclaje de señal del homólogo de Arabidopsis del receptor HDEL de levadura (AtERD2), la secuencia de anclaje de señal de la a-2,6-sialiltransferasa, la secuencia de anclaje de señal de la p1,2-xilosiltransferasa de Arabidopsis thaliana, la secuencia de anclaje de señal de N-acetilglucosaminil transferasa I de tabaco o la secuencia de aminoácidos YYHDL o LKLEI, o quitina sintasa 2 de Saprolegnia monoica. El polipéptido también puede ser glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa.

La invención también proporciona células de plantas de algodón, particularmente células de plantas de algodón capaces de desarrollarse en una célula de fibra, así como plantas de algodón, partes o tejido de las mismas o semillas de una planta de algodón, que comprenden un gen o constructo recombinante de acuerdo con la invención. .

La invención se refiere además a un procedimiento para producir una planta de algodón con expresión espacialmente selectiva de un gen recombinante, que comprende las etapas de

(a) Introducción de un gen recombinante de acuerdo con la invención en al menos una célula de la planta productora de fibra; y

(b) Opcionalmente, regenerar una planta productora de fibra a partir de al menos una célula que comprende el gen recombinante.

En otra realización más de la invención, se proporciona el uso de un microARN y/o un sitio objetivo como se describe en este documento para aumentar la selectividad de la expresión selectiva de fibra de un gen recombinante en una célula productora de fibra de una planta de algodón.

La invención también proporciona un procedimiento para producir fibras a partir de una planta de algodón que comprende las etapas de cultivar una planta de algodón que comprende un gen recombinante de acuerdo con la invención y recoger fibras de plantas de algodón cultivadas así como fibras de la planta.

Breve descripción de las figuras.

Los siguientes Ejemplos, que no pretenden limitar la invención a realizaciones específicas descritas, pueden entenderse junto con las Figuras adjuntas.

Figura 1. Validación experimental del patrón de expresión espacial y temporal para varios miARN en algodón (Gossypium hirsutum L. var. FM958) que muestra un patrón diferencial entre fibras y otras partes de la planta. Los siguientes números de muestra se aplican a todos los paneles: 1) Raíz muestreada en la etapa de 2 hojas; 2) cotiledón muestreado en etapa de plántula; 3) Hoja muestreada en la etapa de 2 hojas; 4) Hoja muestreada en etapa de floración; 5) Tallo muestreado en la etapa de 2 hojas; 6) Tallo muestreado en etapa de floración; 7) brote de meristemos apicales (SAM) muestreados durante el crecimiento vegetativo; 8) Desarrollo de fibra de 8 días después de la antesis (dpa); 9) Desarrollo fibra 15 dpa; 10) Desarrollando fibra 20 dpa; 11) Desarrollo de fibra 25 dpa; 12) Desarrollo de fibra 30 dpa.

Panel A. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miR403 determinado por secuenciación profunda de ARN pequeño. Eje Y: abundancia de miARN (lecturas/millón). Eje X: Número de muestra.

Panel B. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miR403 de acuerdo con lo determinado por ensayos de transferencia Northern. Se muestra en el panel superior una transferencia Northern examinada para miR403. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, de 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños endógenos. La flecha indica miR403 maduro. El panel inferior muestra la sección del gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S de ARNr y ARNt. Los números de la muestra se indican debajo de los paneles.

Panel C. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miR408 de acuerdo con lo determinado por secuenciación profunda de ARN pequeño. Eje Y: abundancia de miARN (lecturas/millón). Eje X: Número de muestra.

Panel D. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miR408 de acuerdo con lo determinado por ensayos de transferencia Northern. Se muestra en el panel superior una transferencia Northern examinada para miR408. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, de 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños endógenos. La flecha indica miR408 maduro. El panel inferior muestra la sección del gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S de ARNr y ARNt. Los números de la muestra se indican debajo de los paneles.

Panel E. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miR398 de acuerdo con lo determinado por ensayos de transferencia Northern. Se muestra en el panel superior una transferencia Northern examinada para miR398. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, de 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños endógenos. La flecha indica miR398 maduro. El panel inferior muestra la sección del gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S de ARNr y ARNt. Los números de la muestra se indican debajo de los paneles.

Panel F. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miRcan1230 como se determina por secuenciación profunda de ARN pequeño. Eje Y: abundancia de miARN (lecturas/millón). Eje X: Número de muestra.

Panel G. Patrón de expresión espacial y temporal para Ghi_miRcan1230 de acuerdo con lo determinado por ensayos de transferencia Northern. Se muestra en el panel superior una transferencia Northern examinada para miR1230. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, de 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños endógenos. La flecha indica miRcan1230. El panel inferior muestra la sección del gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S de ARNr y ARNt. Los números de la muestra se indican debajo de los paneles.

Figura 2. Validación de la represión mediada por miR403 de la expresión del gen informador LUC en un sistema de ensayo transitorio mediado por Agrobacterium en Nicotiana benthamiana. Los números se refieren a la siguiente configuración experimental: 1) inyección de Agrobacterium que contiene solo el vector de control; 2) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador basado en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S; 3) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo miR403 en su 3'UTR; 4) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio que interactúa con miR403 mutado en su 3'UTR; 5) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo miR403 en su 3'UTR y Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN de control; 6) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo miR403 en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa pre-miARN de miR403 bajo el control de un promotor de CaMV35S; 7) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio que interactúa con miR403 mutado en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN de control; 8) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio mutado que interactúa con miR403 en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa pre-miARN de miR403 bajo el control de un promotor de CaMV35S.

El panel A y el panel H. La actividad LUC se detectó en los tejidos de las hojas de Nicotiana benthamiana muestreados 2 días después de la inyección (dpi) (panel A) o 3 dpi (panel H). Eje Y: actividad relativa de LUC (x 107 unidades/mg de peso fresco); Eje X: número de muestra.

Panel B y Panel I. Acumulación de miR403 en tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados en (B) 2 e (I) 3 días después de la inyección de acuerdo con lo detectado por transferencias Northern. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños.

Panel C y Panel J. Transferencias Northern de los paneles B e I, sondeados con U6 ARN nuclear pequeño como control.

Panel D y Panel K. Sección de gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S ARNr y ARNt de los tejidos de la hoja de Nicotiana benthamiana muestreados 2 días después de la inyección (dpi) (panel D) o 3 dpi (panel K).

Panel E y Panel L. Detección de la proteína luciferasa mediante ensayo de inmunotransferencia de tejidos de la hoja de Nicotiana benthamiana muestreados 2 días después de la inyección (panel E) o 3 dpi (panel L) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-luciferasa producido en ratón.

Panel F y Panel M. Detección de la proteína del factor de elongación 1a mediante el ensayo de inmunotransferencia de los tejidos de la hoja de Nicotiana benthamiana muestreados 2 días después de la inyección (panel F) o 3 dpi (panel M) utilizando un anticuerpo policlonal anti-ElF en suero producido en conejo.

Panel G y Panel N. Acumulación de miR168 en tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados en (G) 2 y (N) 3 días después de la inyección de acuerdo a lo detectado por transferencias Northern.

Panel O y Panel P. Acumulación de ARNm de LUC detectada a partir de tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados 3 días después de la inyección. En el panel O se muestran los productos de RT-PCR resueltos en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La intensidad de banda relativa refleja el nivel de ARNm de LUC intacto que no se sometieron a escisión dirigida por miR403. El panel P muestra los productos de las reacciones de control RT-PCR para ARNm que codifica una proteína similar a la proteína 70 de choque térmico de N. benthamiana. Los números debajo del panel O indican la intensidad relativa de la señal medida por Image Quant.

Figura 3. Secuencia de nucleótidos miR403 y del sitio que interactúa con miR403 (sitio objetivo) (las secuencias se incluyen en el listado de secuencias como la SEQ ID NO 1 para Ghi_miR403 y Ath_miR403; como SEQ ID No. 18 para la secuencia de nucleótidos objetivo en el ARNm de Arabidopsis AGO2; como la SEQ ID No. 19 para el miR403 forma reproducida bajo el sitio objetivo, como la SEQ ID No. 5 para el sitio objetivo modificado para miR403, como la SEQ ID NO 5 para Ath_miR403_R y como la SEQ ID No. 1 para Ghi_miR403_R).

Figura 4. Secuencia de nucleótidos de las formas mayor y menor de miR408 madura detectada en algodón y de una secuencia objetivo de miR408. (Las secuencias se incluyen en el listado de secuencias como SEQ ID NO. 2 para ghimiR408.1; como la SEQ ID NO. 20 para ghi-miR408.2; como la SEQ ID No. 6 para miR408 objetivo y como la SEQ ID No. 2 para ath-MiR408_R).

Figura 5. Secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo (arriba) y secuencia de miARN para el siguiente miARN detectado en el algodón: (A) Ghi_miRcan1230, tres formas; (B) Ghi_miR398. (Las secuencias se incluyen en el listado de secuencias como SEQ ID No. 10 y 23 para la secuencia objetivo de miRcan1230 (1) y se combinan para miRcan1230 (2) (3) respectivamente; como la SEQ ID No. 3 para miRcan1230 (1) como SEQ ID 21 para miRcan1230 (2), como la SeQ ID 22 para miRcan1230 (3), como la SeQ ID No. 4 para miR398 y como la SeQ ID No. 8 para la secuencia objetivo de miR398. La secuencia objetivo para miRcan1230 (3) corresponde a SEQ ID No. 23 del nucleótido 11 al 35, precedida por 5'-a g a-3'.

Figura 6. Validación de la represión mediada por miRcan1230 de la expresión del gen informador LUC en un sistema de ensayo transitorio mediado por Agrobacterium en Nicotiana benthamiana. Los números se refieren a la siguiente configuración experimental: 1): inyección de Agrobacterium que contiene solo el vector de control; 2) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un pre-microARN miRcan1230 bajo el control de un promotor de CaMV35S; 3) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S; 4) inyección de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR; 5) inyección de Agrobacterium que contiene el vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio interactivo miRcan1230 mutado en su 3'UTR; 6) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo de miRcan1230get en su 3'UTR y Agrobacterium que contiene un vector T-ADN de control; 7) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa pre-miARN de miRcan1230 bajo el control de un promotor de CaMV35S; 8) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informados con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio de interacción miRcan1230 mutado en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN de control; 8) inyección conjunta de Agrobacterium que contiene un vector de T-ADN que expresa un informador con base en luciferasa de luciérnaga (LUC) bajo el control de un promotor de CaMV35S modificado con un sitio que interactúa con miRcan1230 mutado en su 3'UTR y un Agrobacterium que contiene un vector T-ADN que expresa pre-miARN de miRcan1230 bajo el control de un promotor de CaMV35S.

Panel A. Actividad de LUC detectada a partir de tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados a los 3 días posteriores a la inyección (dpi). Eje Y: actividad relativa de LUC (x 107 unidades/mg de peso fresco); Eje X: número de muestra.

Panel B. Acumulación de miRcan1230 en tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados a los 3 días después de la inyección de acuerdo a lo detectado por transferencias Northern. Se utilizaron oligos de ARN sintéticos derivados de GFP, 21 y 24 nt como marcadores de tamaño para los ARN pequeños.

Panel C. Transferencias Northern del panel B, sondeado con ARN U6 nuclear pequeño como control.

Panel D. Sección de gel teñido con bromuro de etidio correspondiente a la zona 5S de ARNr y ARNt de tejidos de hoja de Nicotiana benthamiana muestreados a los 3 días después a la inyección (dpi).

Panel E y Panel F. Acumulación de ARNm de LUC detectada a partir de tejidos de hojas de Nicotiana benthamiana muestreados a los 3 días después de la inyección. En el panel E y F se muestran los productos de RT-PCR resueltos en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La intensidad relativa de la banda refleja el nivel de la región 5' de los ARNm de LUC que no se sometieron a escisión dirigida por miRcan1230 (panel E) o la región 3' de los ARNm de LUC (panel F).

Panel G muestra los productos de las reacciones de control de RT-PCR para los ARNm que codifican proteína similar a la 70 de choque térmico de N. Benthamiana. Los números debajo del panel E y F indican la intensidad relativa de la señal medida por Image Quant.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La presente invención se basa en la identificación fortuita de moléculas de miARN (y moléculas de pre-miARN así como sitios de reconocimiento objetivo) de algodón (Gossypium hirsutum) que no se expresan en el desarrollo de células de fibra de algodón mientras están presentes en la mayoría, si no en todas las otras partes de la planta de algodón. Dichos miARN, y/o sus sitios objetivo pueden usarse convenientemente para mejorar la selectividad tisular de la expresión en una planta productora de fibra, tal como algodón.

De este modo, en una realización, la invención proporciona un procedimiento para la expresión espacialmente selectiva en una planta productora de fibra, tal como algodón, que comprende las etapas de introducir un gen recombinante en al menos una célula de la planta productora de fibra, tal como algodón, y opcionalmente regenerar una planta a partir de dicha al menos una célula que comprende el constructo o gen recombinante, por lo que el constructo o gen recombinante comprende los siguientes elementos unidos operativamente (tal como los elementos de ADN):

(a) un promotor expresable en plantas;

(b) una región que codifica una molécula de ARN que puede traducirse en un polipéptido o proteína;

(c) opcionalmente, una terminación de transcripción 3' y una región de poliadenilación y

en la que el constructo o gen recombinante comprende además una secuencia objetivo heteróloga reconocida por un miARN endógeno que se expresa menos abundantemente en células que conducen a fibras en la planta de algodón en comparación con las células de las plantas de algodón diferente de dichas células que conducen a dichas fibras y que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21 o SEQ ID No. 22.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" denota cualquier ADN que se reconoce y se une (directa o indirectamente) por una ARN-polimerasa dependiente de ADN durante el inicio de la transcripción. Un promotor incluye el sitio de iniciación de la transcripción y los sitios de unión para los factores de iniciación de la transcripción y la a Rn polimerasa, y puede comprender varios otros sitios (por ejemplo, potenciadores), a los que se pueden unir las proteínas reguladoras de la expresión génica.

Como se usa en este documento, el término "promotor expresable en plantas" significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano, como el CaMV35S, el promotor del virus del trébol subterráneo No 4 o No 7, o promotores del gen T-ADN y similares.

Quedará claro que los promotores constitutivos expresables en plantas pueden ser adecuados para la invención. En tales casos, la selectividad espacial o especificidad de tejido será proporcionada por el perfil de expresión del microARN, que a su vez determinará en qué tejidos o plantas de las partes, los productos de transcripción del gen recombinante incorporarán una secuencia objetivo para el miARN, será procesado post-transcripcionalmente por el miARN (y las proteínas asociadas) para escindir esa transcripción y así suprimir o prevenir la actividad adicional del ARN biológicamente activo (por ejemplo, prevenir la traducción de un péptido o proteína codificada por el ARN biológicamente activo).

También está claro que pueden usarse promotores inducibles, tales como un promotor inducible por temperatura o un promotor inducible químicamente o un promotor que responde a señales de desarrollo, de acuerdo con la invención. El perfil de expresión resultante del gen recombinante será un perfil de expresión combinado, que reflejará la distribución espacial del miARN en la planta y la respuesta a los factores de inducción o represión del promotor utilizado.

También se pueden usar promotores selectivos de tejidos. En una realización preferida de la invención, se usa un promotor preferente de fibra o selectivo de fibra.

El término "específico de fibra" o "específico de célula de fibra " o "selectivo de fibra", con respecto a la expresión de un gen o con respecto a un promotor, se refiere, para fines prácticos, a la expresión altamente específica de un gen o expresión dirigida por un promotor, en células de fibra de plantas, tales como plantas de algodón. En otras palabras, los niveles de transcripción de un ADN en tejidos diferentes de células fibrosas están por debajo del límite de detección 0 muy por debajo (menos de aproximadamente 0,2 picogramos por microgramo de ARN total).

El término "preferencial de fibra" o "preferencial de célula de fibra" con respecto a la expresión de un ADN de acuerdo con esta invención, se refiere a un patrón de expresión por el cual el ADN se expresa predominantemente en células de fibra o fibras, pero la expresión se puede identificar en otros tejidos de la planta. Preferiblemente, la expresión en células de fibra es de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces mayor en las células de fibra que en otros tejidos.

Tales promotores incluyen el promotor de algodón de un gen de p-tubulina específico de fibra (como se describe en el documento WO0210377), el promotor de algodón de un gen de actina específico de fibra (como se describe en el documento WO0210413), el promotor de un gen de proteína de transferencia lipídica específica de fibra de algodón (como se describe en el documento US5792933), un promotor de un gen de expansina de algodón (documento WO9830698) o un promotor de un gen de quitinasa en algodón (documento US2003106097) o los promotores de los genes específicos de fibra descritos en los documentos US6259003 o US6166294. Los promotores selectivos de fibra como se describe en el documento WO08/083969 (de los genes de la glucanasa del algodón), documento WO12/093032 (del gen del algodón FS18 o SCW-PRP) o en la solicitud de los estadounidenses 13/630,119 (de genes similares FB8 de algodón) también son promotores adecuados expresables en plantas. También es adecuado para la invención el promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 13 desde la posición del nucleótido 61 hasta la posición del nucleótido 1499.

Como se usa en este documento, un "miARN" es una molécula de ARN de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos de longitud que se puede cargar en un complejo RISC y dirigir la escisión de otra molécula de ARN, en la que la otra molécula de ARN comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de miARN, por lo que pueden ocurrir uno o más de los siguientes faltas de coincidencia: una falta de coincidencia entre el nucleótido en el extremo 5' de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la molécula de ARN objetivo; una falta de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 a la posición 9 de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la molécula de ARN objetivo; tres faltas de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 a la posición 21 de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la molécula de ARN objetivo siempre que no haya más de dos faltas de coincidencia consecutivas. No se permite una falta de coincidencia en las posiciones 10 y 11 del miARN (todas las posiciones del miARN se indican a partir del extremo 5' de la molécula del miARN).

Un miARN se procesa a partir de una molécula "pre-miARN" por proteínas, tales como las proteínas DCL, presentes en cualquier célula vegetal y cargadas en un complejo RISC donde puede guiar la escisión de las moléculas de ARN objetivo.

Como se usa en el presente documento, una molécula "pre-miARN" es una molécula de ARN de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 nucleótidos, que puede adoptar una estructura secundaria que comprende un tallo de ARN bicatenario y un bucle de ARN monocatenario y además comprende la secuencia de nucleótidos del miARN (y su secuencia complementaria) en el tallo de ARN bicatenario. Preferiblemente, el miARN y su complemento están localizados entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de los extremos libres del tallo de ARN bicatenario del miARN. La longitud y la secuencia de la región de bucle monocatenaria no son críticas y pueden variar considerablemente, por ejemplo, entre 30 y 50 nt de longitud. Preferiblemente, la diferencia en la energía libre entre la estructura de ARN no apareada y apareada es entre -20 y -60 kcal/mol, particularmente alrededor de -40 kcal/mol. La complementariedad entre el miARN y el miARN* no necesita ser perfecta y se pueden tolerar de 1 a 3 protuberancias de nucleótidos no apareados. La estructura secundaria adoptada por una molécula de ARN puede predecirse mediante algoritmos informáticos convencionales en la técnica, tales como mFOLD. La cadena particular del tallo ARN bicatenario proviene del premiARN que se libera por la actividad DCL y se carga en el complejo RISC se determina por el grado de complementariedad en el extremo 5', por lo que la cadena que en su extremo 5' esta al menos involucrada en el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos de las diferentes cadenas del tallo de ARNbc escindido se carga en el complejo RISC y determinará la especificidad de secuencia de la degradación de la molécula de ARN objetivo. Sin embargo, si empíricamente la molécula de miARN de una molécula de pre-miARN sintética particular no es funcional (debido a que la cadena "incorrecta" está cargada en el complejo RISC, será inmediatamente evidente que este problema puede resolverse intercambiando la posición de la molécula de miARN y su complemento en las cadenas respectivas del tallo de ARNbc de la molécula pre-miARN. Como se conoce en la técnica, la unión entre A y U que involucra dos enlaces de hidrógeno, o G y U que involucra dos enlaces de hidrógeno es menos fuerte que entre G y C que involucra tres enlaces de hidrógeno.

Un conjunto de miARN adecuado para los procedimientos de acuerdo con la invención incluye los miARN que se expresan menos abundantemente en células que conducen a fibras en plantas productoras de fibra en comparación con células de aquellas plantas productoras de fibras distintas de las células que conducen a dichas fibras. Son especialmente adecuados los miARN que no se expresan sustancialmente en las células que conducen a las fibras en una planta productora de fibra, sino que se expresan de forma ubicua en otras células distintas de dichas células que conducen a las fibras.

Tales miARN incluyen los siguientes microARN aislados de Gossypium hirsutum: Ghi_miR403, Ghi_miR408, Ghi_miRcan1230 y Ghi_miR398. Estos microARN comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la SEQ ID NO.1, la SEQ ID NO.2, la SEQ ID NO.3 o la SEQ ID NO.4 (véase también las Figuras 3, 4 y 5). Se procesan en Gossypium hirsutum de pre-miARN que comprenden la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos. 9, 10, 11 o 12, o una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a las mismas.

La indicación miRcanXXXX se refiere a la asignación de números provisionales para nuevos microARN, en correspondencia con las convenciones de nomenclatura para microARN.

Quedará claro que los ortólogos de estos miARN o pre-miARN pueden aislarse, o identificarse y usarse, también en otras plantas, particularmente en plantas productoras de fibra.

"Una secuencia objetivo reconocida por un miARN" se refiere a la secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ARN hacia la cual el miARN guía el complejo RISC con el que está asociada, de modo que la molécula de ARN es escindida por la actividad ribonucleasa de una proteína Argonauta (AGO) central para el complejo RISC. La secuencia objetivo es esencialmente complementaria o complementaria a la secuencia de nucleótidos de miARN. Como se usa en este documento, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos con polaridad opuesta en la cadena principal de fosforribosa como la otra secuencia y que tiene una secuencia de nucleótidos que permite el emparejamiento de bases entre las bases de la secuencia y otra secuencia. El emparejamiento de bases en este contexto incluye los pares de bases G:U, así como el emparejamiento de bases estándar de Watson-Crick. También estará claro que cuando las secuencias de ARN son las secuencias de nucleótidos que son esencialmente complementarias con las secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.

Se ha observado que uno o más de las siguientes faltas de coincidencia pueden ocurrir en el emparejamiento de bases entre los nucleótidos del sitio objetivo y los nucleótidos del miARN:

(a) una falta de coincidencia entre el nucleótido en el extremo 5' de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(b) una falta de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 a la posición 9 de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(c) tres faltas de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 y la posición 21 del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo siempre que no haya más de dos faltas de coincidencia consecutivas; y

(d) no se permite una falta de coincidencia en las posiciones 10 y 11 del miARN.

Por lo tanto, los sitios objetivo adecuados para la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOS. 1 a 4 o que es esencialmente similar a esas secuencias de nucleótidos, y en la que se presenta una o más de las faltas de coincidencia anteriormente mencionados. Se pueden encontrar ejemplos de sitios objetivo reconocidos por miARN adecuados para la invención en las Figuras 3, 4 y 5 y en el listado de secuencias en las entradas SEQ ID NOS. 5 a 8 y la SEQ ID NO. 23 para una secuencia objetivo modificada reconocida por los microARN Ghi_miRcan1230 (2) y (3) respectivamente. La secuencia objetivo central reconocida por el microARN Ghi_miRcan1230 (2) corresponde a la SEQ ID NO. 23 del nucleótido 4 al 24. La secuencia objetivo central reconocida por el microARN Ghi_miRcan1230 (3) corresponde a la SEQ ID NO. 23 desde el nucleótido 11 al 32.

El uso de un sitio objetivo o secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de miARN (denominado sitio objetivo central) generalmente será suficiente, pero puede ser ventajoso incluir uno, dos, tres o más nucleótidos que flanquean el sitio objetivo central en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ARN objetivo natural. Un ejemplo del mismo puede encontrarse en la SEQ ID NO. 5, en la que la secuencia de nucleótidos desde la posición del nucleótido 4 a la posición del nucleótido 24 corresponde a la secuencia objetivo central de miR403, mientras que la secuencia de nucleótido adicional 1 a 3 y 25-27 corresponde a las secuencias que flanquean la secuencia objetivo central en la molécula de ARN objetivo natural. De manera similar, un ejemplo de la misma se puede encontrar en la SEQ ID NO. 6, en la que la secuencia de nucleótidos desde la posición del nucleótido 4 a la posición del nucleótido 24 corresponde a la secuencia objetivo central de miR408, mientras que la secuencia de nucleótido adicional 1 a 3 y 25-27 corresponde a las secuencias que flanquean la secuencia objetivo central en la molécula de ARN objetivo natural.

Se puede introducir un sitio objetivo exógeno para miARN en el constructo recombinante de interés de diversas maneras. La secuencia de nucleótidos del sitio objetivo puede insertarse como secuencia de nucleótidos adicional. Como se describe en el presente documento, el sitio objetivo de miARN puede modificarse modificando una secuencia de origen natural con un grado suficiente de similitud con el sitio objetivo, de acuerdo con las reglas mencionadas en otros lugares, para que llegue una secuencia de nucleótidos reconocida por los miARN descritos en este documento.

Los sitios objetivo exógenos para miARN pueden introducirse en cualquier lugar de la región transcrita del constructo recombinante. Sin embargo, si la molécula de ARN biológicamente activa transcrita codifica un polipéptido, se debe tener cuidado de que la introducción potencial del sitio objetivo para miARN en la región de codificación, preferiblemente no interrumpa el marco de lectura abierto o altere de otro modo la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Los sitios objetivo para miARN pueden incluirse convenientemente en las regiones no traducidas del transcrito, tales como la región no traducida 5' o la región no traducida 3'.

El experto en la materia tendrá claro que los procedimientos y medios descritos en el presente documento se pueden usar para obtener una expresión espacialmente selectiva de cualquier gen de interés. Sin embargo, los procedimientos de la invención se pueden usar para mejorar la especificidad de la expresión de genes que codifican productos potencialmente perjudiciales si y cuando se expresan en células distintas de las células de fibra (y limitan dicha expresión sustancialmente a células de fibra en plantas productoras de fibra).

Se han descrito ejemplos de tales secuencias de nucleótidos e incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de N-acetilglucosamina transferasa que puede ser una N-acetilglucosamina transferasa del tipo NODC, tal como una N-acetilglucosamina transferasa de tipo NODC obtenible a partir de una especie Rhizobium, una especie Azorhizobium, una especie Bradyrhizobium, una especie Mesorhizobium, una especie Ralstonia, una especie Streptomyces, una especie Burkholderia, una especie Cupriavidus o una especie Sinorhizobium. El ácido nucleico también puede codificar la actividad de N-acetilglucosamina transferasa, incluida la quitina sintasa, que comprende además una secuencia de anclaje de señal seleccionada de la secuencia de anclaje de señal de una sialil transferasa de rata, la secuencia de anclaje de señal de una galactosil transferasa humana, la secuencia de anclaje de señal de el homólogo de Arabidopsis del receptor HDEL de levadura (AtERD2), la secuencia de anclaje de señal de la a-2,6-sialiltransferasa, la secuencia de anclaje de señal de p1,2-xilosiltransferasa de Arabidopsis thaliana, la secuencia de anclaje de señal de N-acetilglucosaminil transferasa I de tabaco o la secuencia de aminoácidos YYHDL o LKLEI. La N-acetilglucosamina transferasa puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 13 desde la posición del nucleótido 1503 hasta la posición del nucleótido 4439 (también se describe en el documento WO 06/136351). La N-acetilglucosamina transferasa también puede ser quitina sintasa, preferiblemente quitina sintasa 2 de Saprolegnia monoica como se describe en el documento WO11/089021.

El ARN biológicamente activo transcrito del ADN recombinante, gen o constructo de acuerdo con la invención también puede codificar una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa, tal como una glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del nucleótidos de la SEQ ID NO. 13 desde la posición del nucleótido 6202 a la posición del nucleótido 8031 o una glutamina: fructosasfosfato amidotransferasa de Volvariella volvacea que comprende una secuencia de aminoácidos como la representa en la entrada de GenBank AAT75220.

La invención también está dirigida hacia constructos o genes recombinantes como se describe en este documento en particular hacia un gen recombinante para expresión espacialmente selectiva en una planta de algodón que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

(a) un promotor expresable en plantas;

(b) una región que codifica una molécula de ARN que puede traducirse en un polipéptido o proteína;

(c) opcionalmente una terminación de transcripción 3' y una región de poliadenilación

caracterizados porque el gen recombinante comprende además una secuencia objetivo heteróloga reconocida por un miARN endógeno que se expresa menos abundantemente en células que conducen a fibras en dicha planta de algodón en comparación con otras células de plantas de algodón y que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.1, SEQ iD No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21 o SEQ ID No 22.

Una "fibra", tal como una "fibra de algodón", como se usa en el presente documento, se refiere a un tricoma de semilla, más específicamente a una sola célula de una planta productora de fibra, como el algodón, que se inicia desde la epidermis del integumento exterior de los óvulos, en o justo antes de la antesis. El desarrollo morfológico de las fibras de algodón ha sido bien documentado (Basra y Malik, 1984, Int Rev of Cytology 89: 65-113; Graves y Stewart, 1988, citado anteriormente; Ramsey y Berlin, 1976, American Journal of Botany 63 (6): 868-876; Ruan y Chourey, 1998, Plant Physiology 118: 399-406; Ruan et al., 2000, Aust. J. Plant Physiol. 27: 795-800; Stewart, 1975, Am. J. Bot. 62, 723-730). Las fibras de algodón, en particular de Gossypium hirsutum, se someten a cuatro etapas de desarrollo superpuestas: iniciación de las células de las fibras, elongación, biosíntesis de la pared celular secundaria y maduración. La iniciación de las células de la fibra es un proceso rápido. Las fibras blancas vellosas comienzan a desarrollarse inmediatamente después de la antesis y continúan hasta aproximadamente 3 días después de la antesis (DPA), lo que es seguido por el alargamiento de las células de la fibra (hasta aproximadamente 10 a aproximadamente 17 DPA). Dependiendo de las condiciones de crecimiento, la biosíntesis de la pared celular secundaria se inicia y continúa hasta aproximadamente 25 a aproximadamente 45 DPA, seguida de un proceso de maduración de aproximadamente 45 a aproximadamente 60 DPA. Las fases secundarias de síntesis y maduración de la pared celular se denominan aquí comúnmente "fase de construcción de resistencia de la fibra". Solo alrededor del 25 al 30% de las células epidérmicas se diferencian en las fibras de hilas comercialmente importantes (Kim y T riplett, 2001). La mayoría de las células no se diferencian en fibras ni se desarrollan en fibras cortas o pelusa. Durante la elongación de la fibra y el metabolismo de la pared secundaria, las células de la fibra se alargan rápidamente, sintetizan componentes de la pared secundaria y muestran cambios celulares, moleculares y fisiológicos dramáticos. El alargamiento de la fibra se combina con un rápido crecimiento y expansión celular (Seagull, 1991. En Biosynthesis and biodegradation of cellulose (Haigler, CH & Weimer, PJ, editores) páginas 1432163, Marcel Dekker, Nueva York) y una síntesis constante de una gran cantidad de metabolitos celulares y componentes de la pared celular tal como la celulosa. Alrededor del 95% del peso seco en las fibras de algodón maduras es celulosa (Pfluger y Zambryski, 2001, Curr Biol 11: R436-R439; Ruan et al., 2001, Plant Cell 13: 47-63). Los componentes no celulósicos también son importantes para el desarrollo de las células de la fibra (Hayashi y Delmer, 1988, Carbohydr. Res. 181: 273-277; Huwyler et al., 1979, Planta 146: 635-642; Meinert y Delmer, 1977, Plant Physiol 59: 1088-1097; Peng et al., 2002, Science 295: 147-150). En comparación con otras células vegetales, las fibras de algodón no contienen lignina en las paredes secundarias, pero tienen vacuolas grandes que probablemente están relacionadas con el rápido crecimiento y expansión celular (Basora y Malik, 1984, citado anteriormente; Kim y Triplett, 2001, Plant Physiology 127: 1361). 1366; Mauney, 1984, citado anteriormente; Ruan y Chourey, 1998, citado anteriormente; Ruan et al., 2000, citado anteriormente; Van't Hof, 1999, American Journal of Botany 86: 776-779).

Una "planta productora de fibra" se refiere a una especie de planta que produce fibras tal como se definió anteriormente, tal como una planta de algodón. De las especies de Gossypium, se sabe que el genoma A de la especie Gossypium diploide y el genoma AD de la especie Gossypium alotetraploides producen fibras hilables. Botánicamente, hay tres grupos principales de algodón que son de importancia comercial. El primero, Gossypium hirsutum (AADD), es originario de México y América Central y se ha desarrollado para un uso extensivo en los Estados Unidos, representando más del 95% de la producción de los Estados Unidos. Este grupo se conoce en los Estados Unidos como el algodón Upland americano y sus fibras varían en longitud desde aproximadamente 7/8 a aproximadamente 1 5/16 pulgadas (aproximadamente 22 - aproximadamente 33 mm). En todo el mundo representa alrededor del 90% de la producción de algodón. Un segundo grupo botánico, G. barbadense (AADD), que representa alrededor del 5% de la producción de los Estados Unidos y alrededor del 8% de la producción mundial, es de origen Sur Americano con fibras que varían en longitud desde aproximadamente 11/4 a aproximadamente 19/16 pulgadas (aproximadamente 32 - aproximadamente 40 mm), se conoce en los Estados Unidos como Pima Americana, pero también se le conoce comúnmente como algodón grapa extra largo (ELS). Un tercer grupo, G. herbaceum (AA) y G. arboreum (AA), abarca plantas de algodón con fibras de longitud más corta, de aproximadamente 1/2 hasta aproximadamente 1 pulgada (aproximadamente 13 - aproximadamente 25 mm), que son nativas de la India y del Este de Asia. Ninguno de estos grupos se cultiva en los Estados Unidos.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, en un pre-ARNm, que comprende secuencias de intrones, que luego se empalma en un ARNm maduro, o directamente en un ARNm sin secuencias de intrones) en una célula, operativamente enlazadas a regiones reguladoras (por ejemplo, un promotor). Por lo tanto, un gen (ADN genómico) puede comprender varias secuencias unidas operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende, por ejemplo, secuencias involucradas en el inicio de la traducción, una región codificante de (proteína) (con intrones) y una secuencia no traducida 3' que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción. "secuencia de ADNc" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende la región no traducida 5', la región codificante sin intrones y la región no traducida 3' y una cola poliA. El "gen endógeno" se usa para diferenciarse de un "gen foráneo", "transgén" o "gen quimérico", y se refiere a un gen de una planta de un determinado género, especie o variedad de planta, que no se ha introducido en esa planta por transformación (es decir, no es un "transgén"), pero que normalmente está presente en las plantas de ese género, especie o variedad, o que se introduce en esa planta a partir de plantas de otro género, especie o variedad de plantas, en la que se encuentra normalmente presente, por técnicas normales de fitomejoramiento o por hibridación somática, por ejemplo, por fusión de protoplastos. De manera similar, un "alelo endógeno" de un gen no se introduce en una planta o tejido vegetal por transformación de la planta, sino que, por ejemplo, se genera por mutagénesis y/o selección de la planta, se introgresa de otras especies de plantas mediante, por ejemplo, ayuda de marcadores, selección, u obtenida por cribado de poblaciones naturales de plantas.

La "expresión de un gen" o "expresión génica" se refiere al proceso en el que una región de ADN, que está unida operativamente a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en una molécula de ARN. Luego, la molécula de ARN se procesa más (mediante procesos postranscripcionales) dentro de la célula, por ejemplo, por empalme de ARN e inicio de la traducción y traducción a una cadena de aminoácidos (polipéptido), y terminación de la traducción por codones de parada de la traducción. El término "expresado funcionalmente" se usa en el presente documento para indicar que se produce una proteína funcional, es decir, biológicamente activa; el término "no expresado funcionalmente" para indicar que se produce una proteína con una funcionalidad significativamente reducida o nula (actividad biológica) o que se produce una cantidad de proteína nula o una cantidad significativamente reducida.

Los procedimientos para transformar plantas son bien conocidos en la técnica y tienen una importancia menor para la presente invención. Los procedimientos para transformar plantas de algodón también son bien conocidos en la técnica. La transformación del algodón mediada por Agrobacterium se ha descrito, por ejemplo en la patente de Estados Unidos No. 5.004.863 o en la patente de Estados Unidos No. 6.483.013 y se informa de la transformación de algodón por bombardeo de partículas, por ejemplo, en el documento WO 92/15675.

Los genes quiméricos de acuerdo con la invención pueden introducirse en plantas de manera estable o de manera transitoria usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los genes quiméricos pueden introducirse en plantas, o pueden generarse dentro de la célula vegetal como se describe, por ejemplo, en el documento EP 1339859.

La invención también está dirigida a plantas de algodón que comprenden un constructo recombinante de acuerdo con la invención.

"Algodón" tal como se usa en el presente documento incluye Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium arboreum y Gossypium herbaceum. "Plantas progenitoras de algodón" incluyen Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium raimondii, Gossypium longicalyx y Gossypium kirkii.

Las plantas de acuerdo con la invención se pueden usar en un esquema de fitomejoramiento convencional para producir más plantas con las mismas características o para introducir el gen quimérico de acuerdo con la invención en otras variedades de la misma especie de plantas o en especies relacionadas, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas contienen los genes quiméricos de la invención como un inserto genómico estable y también están abarcadas por la invención.

La invención también está dirigida hacia un procedimiento para producir fibras a partir de plantas de algodón que comprende las etapas de a) cultivar una planta de algodón que comprende un constructo recombinante de acuerdo con la invención y b) recoger fibras de las plantas de algodón cultivadas. Las fibras de algodón, obtenidas de estas plantas también están dentro del alcance de la invención.

También se divulgan en este documento nuevos pre-miARN de algodón, en particular pre-microARN de algodón que tienen una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs.: 9, 10, 11 o 12. Tales pre-miARN se pueden usar para pre-miARN de cualquier propósito en la técnica, incluyendo reemplazar o adaptar la región del microARN y microARN* para obtener un pre-miARN con una secuencia de nucleótidos esencialmente similar o idéntica a la misma en la región del microARN y opcionalmente la región complementaria a la región del microARN (región de microARN*) han sido alterados y reconocen nuevos sitios objetivo. Dichos pre-miARN modificados pueden expresarse desde su región promotora asociada de forma natural, y el miARN modificado puede ganar un perfil de expresión similar al de los miARN (por ejemplo, específico de la fibra o expresión en todas las partes de la planta excepto las fibras).

Como se usa en este documento, "que comprende" se debe interpretar como que especifica la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por lo tanto, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, estar incrustados en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, que se define funcional o estructuralmente, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.

Los siguientes ejemplos no limitativos describen la identificación de microARN de algodón que tienen una expresión baja o nula en fibras en diferentes etapas de desarrollo y el uso de sitios objetivo correspondientes a estos microARN en transgenes.

A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas recombinantes se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos estándar descritos en "Sambrook J y Russell DW (editores.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York "y en" Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith j A y Struhl K (editores) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".

Los materiales y referencias estándar se describen en "Croy RDD (editores) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" y en "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2a Edición, Academic Press, San Diego". Los materiales y procedimientos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden encontrar en "McPherson MJ y Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" y en "PCR Applications Manual, 3a edición (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim o www.roche-applied-science.com".

En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEQ ID NO. 1: secuencia de nucleótidos del microARN Ghi_miR403

SEQ ID NO. 2: secuencia de nucleótidos del microARN Ghi_miR408

SEQ ID NO. 3: secuencia de nucleótidos del microARN Ghi_miRcan1230 (1)

SEQ ID NO. 4: secuencia de nucleótidos del microARN Ghi_miR398

SEQ ID NO. 5: secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo modificada por ingeniería genética reconocida por microARN Ghi_miR403

SEQ ID NO. 6: secuencia de nucleótidos de secuencia objetivo modificada por ingeniería genética reconocida por microARN Ghi_miR408

SEQ ID NO. 7: secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo reconocida por el microARN Ghi_miRcan1230 (1) o (2)

SEQ ID NO. 8: secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo reconocida por el microARN Ghi_miR398 SEQ ID NO. 9: secuencia de nucleótidos de pre-microARN Ghi_miR403

SEQ ID NO. 10: secuencia de nucleótidos de pre-microARN Ghi_miR408

SEQ ID NO. 11: secuencia de nucleótidos de pre-microARN Ghi_miRcan1230

SEQ ID No. 12: secuencia de nucleótidos de pre-microARN Ghi_miR398

SEQ ID NO. 13: secuencia de nucleótidos de pTBI312

SEQ ID NO. 14: secuencia de nucleótidos de pTEA1_v2

SEQ ID NO. 15: secuencia de nucleótidos de pEA2

SEQ ID NO. 16: secuencia de nucleótidos de pTEA3

SEQ ID NO. 17: secuencia de nucleótidos de pTEA6

SEQ ID NO. 18: secuencia objetivo del sitio que interactúa con miR403 en el ARNm de Arabidopsis AGO2 SEQ ID NO. 19: miR403 de A. thaliana

SEQ ID NO. 20: forma menor de Ghi_miR408

SEQ ID NO. 21: secuencia de nucleótidos de la forma alternativa microARN Ghi_miRcan1230 (2)

SEQ ID NO. 22: secuencia de nucleótidos de la forma alternativa microARN Ghi_miRcan1230 (3)

SEQ ID NO. 23: secuencia de nucleótidos de la secuencia objetivo modificada por ingeniería genética reconocida por el microARN Ghi_miRcan1230 (2) y (3)

SEQ ID NO. 24: secuencia de nucleótidos de pTEA9

SEQ ID NO. 25: secuencia de nucleótidos de pTEA10

Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y procedimientos.

Extracción de ARN total y fraccionamiento de ARN pequeño. Los ARN totales, incluida la fracción de ARN de bajo peso molecular (LMW), se extrajeron de los materiales vegetales y los ARNp se aislaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 17% (PAGE) esencialmente como se describió anteriormente [Qi, X., Bao, FS y Xie, Z. 2009). La secuenciación profunda de ARN pequeño revela el papel de las ARN polimerasas dependientes de ARN de Arabidopsis thaliana en la biogénesis de ARNpi viral. PLoS One 4, e4971].

Construcción de biblioteca de ARN pequeño y secuenciación de Illumina. Los ARN pequeños purificados con PAGE se utilizaron para la construcción de bibliotecas de ARN pequeños personalizadas esencialmente como se describió previamente [Qi et al. citado anteriormente], excepto que el adaptador de ARN 5' no incluye ninguna secuencia de índice personalizada. Se enviaron ADNc purificados por PAGE para cada biblioteca de ARN pequeño para su secuenciación en el instrumento Hi-Seq2000 de Illumina.

Constructos de plásmidos y ensayo de expresión transitoria. Todos los vectores binarios se construyeron utilizando la cadena principal de pCB302 [Xiang, C., Han, P., Lutziger, I., Wang, K. y Oliver, D.J. (1999). A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol Biol 40, 711 -717]. La cepa GV2260 de Agrobacterium transformada con los vectores binarios deseados se usó para el ensayo de expresión transitoria siguiendo el procedimiento establecido [Johans en, L.K., y Carrington, J.C. (2001). Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacteriummediated transient expression system. Plant Physiol 126, 930-938].

Ensayo de actividad de luciferasa. La actividad de la luciferasa se midió utilizando Sistemas de Ensayo de Luciferasa (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Detección de ARN pequeño por transferencia Northern. La transferencia de ARN de LMW se realizó como se describió previamente [Xie, Z., Allen, E., Wilken, A. y Carrington, J.C. (2005). DICER-LIKE 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 102, 12984­ 12989]. Se usó una sonda de ácido nucleico bloqueada (LNA) (Exiqon) para la detección de miR403 con sensibilidad mejorada [Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., y Havelda, Z. (2004). Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res 32, e175].

Análisis de los niveles de ARNm de luciferasa mediante transcripción inversa acoplada con reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los extractos de ARN total se enriquecieron para los ARNm de poli(A)+ usando el procedimiento Oligotex (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARN enriquecidos con poli(A)+ (~125ng) se usaron luego para la transcripción inversa con Superscript III (Invitrogen), seguido por PCR utilizando cebadores específicos de genes.

Detección de proteína luciferasa mediante ensayo de inmunotransferencia. Los ensayos de inmunotransferencia se realizaron esencialmente como se describió anteriormente [Kasschau, K.D., Xie, Z., Allen, E., Llave, C., Chapman, E.J., Krizan, K.A. y Carrington, J.C. (2003). P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with Arabidopsis development and miRNA function. Dev Cell 4, 205-217] utilizando un anticuerpo monoclonal anti-luciferasa producido en ratón (Sigma). La transferencia de control para el factor de elongación 1 -alfa se realizó con suero policlonal anti-EF1A preparado en conejo (Agrisera).

Ejemplo 2. Identificación y validación experimental de miARN con patrones de expresión deseados

La utilización de los "promotores específicos de tejido" actualmente disponibles en la ingeniería genética de plantas no siempre conduce a resultados satisfactorios debido a la expresión "defectuosa" de transgenes fuera de los dominios de expresión deseados. Para lograr una expresión mejorada específica del tejido y estado de desarrollo de transgenes para la ingeniería genética de la fibra de algodón, se utilizó una estrategia basada en microARN endógeno (miARN) para eliminar la expresión no deseada del transgén fuera de la fibra de algodón en desarrollo. Específicamente, cuando un transgén de interés se modifica con un sitio de interacción para un miARN endógeno, la expresión del transgén sería reprimida por dicho miARN cuando sus dominios de expresión se superponen espacial o temporalmente. Los miARN endógenos que están ausentes en la fibra en desarrollo pero que se expresan en otros tejidos podrían, por lo tanto, usarse como agentes naturales para inactivar la expresión no deseada del transgén fuera de la fibra.

La tecnología de secuenciación de ADN de próxima generación surgida recientemente (NGS), permite un perfil de expresión de ARN pequeños utilizando plataformas de alto rendimiento de una manera relativamente rentable. Se utilizó la plataforma de síntesis por secuenciación (SBS) de Illumina para obtener el perfil de expresión de los miARN de algodón entre los diferentes tipos de tejidos, así como las etapas de desarrollo. Se incluyeron un total de 12 puntos de muestreo para los perfiles de expresión de ARN pequeños mediante secuenciación profunda (secuencia de ARNp; Tabla 1). Se obtuvieron más de 100 millones (M) de lecturas de alta calidad de cada biblioteca de ARN pequeño. Usando una fuente informática propia, se identificaron por primera vez los miARN putativos que se conservan en múltiples especies de plantas. Luego se desarrolló un enfoque informático para la nueva identificación de los miARN que no se reportaron en ninguna otra especie de planta.

Tabla 1. Muestreo de tejido para perfiles de expresión de ARN pequeño

Muestra No. Tipo de tejido Etapa de desarrollo Designación de la muestra

Raíz Etapa de 2 hojas Raíz

2 Cotiledones Planta de semillero Cotiledones

3 Hoja Etapa de 2 hojas Hoja (1)

4 Hoja Etapa de floración Hoja (2)

5 Tallo Etapa de 2 hojas Tallo (1)

6 Tallo Etapa de floración Tallo (2)

7 brote meristemos apicales Crecimiento vegetativo SAM

8 Fibra en desarrollo 8 dpa Fibra (8 dpa)

9 Fibra en desarrollo 15 dpa Fibra (15 dpa)

10 Fibra en desarrollo 20 dpa Fibra (20 dpa)

11 Fibra en desarrollo 25 dpa Fibra (25 dpa)

12 Fibra en desarrollo 30 dpa Fibra (30 dpa)

Los conjuntos de datos exhaustivos de ARN pequeño que se han generado permitieron un extenso y significativo perfil de expresión utilizando un enfoque informático. Se identificaron varios miARN de plantas en algodón que exhiben un patrón de expresión interesante y que de otro modo podrían considerarse candidatos con el fin de aumentar la expresión selectiva de tejidos.

Sin embargo, la mayoría de estos miARN resultó que solo representan miARN maduros que surgen de un subconjunto de loci MIARN parálogos que forman familias de miARN de varios miembros. Estos miARN fueron eliminados de la lista porque ciertos loci MIARN parálogos parecen exhibir patrones de expresión bastante diferentes, mientras que los miARN maduros que surgen de estos loci pueden ser casi idénticos en secuencia y, por lo tanto, pueden compartir objetivos reguladores.

Los candidatos restantes son aquellos miARN que probablemente surjan de solo uno o muy pocos loci parálogos. miR403 estaba presente en baja abundancia en muestras sin fibra, pero estaba casi ausente en las fibras en desarrollo. miR408, que está profundamente conservado en plantas terrestres, exhibió un perfil similar. Otros incluyen Ghi_miRcan1230 y Ghi_miR398.

Estos patrones de expresión se validaron experimentalmente y se confirmaron mediante ensayos basados en transferencia Northern (Figura 1).

Ejemplo 3. Validación de la represión mediada por miR403 del informador de LUC en un sistema de ensayo transitorio

Aunque se pueden considerar múltiples miARN para su uso como un agente natural para la eliminación de la expresión de transgenes no deseados en tejidos no fibrosos en algodón, se ha elegido miR403 como el primer sujeto para una validación experimental adicional debido a su naturaleza conservada e interacciones bien establecidas con su objetivo en Arabidopsis. En resumen, miR403 es un miARN de planta semiconservado que se ha encontrado solo en las especies dicotiledóneas [Cuperus, J.T., Fahlgren, N. y Carrington, J.C. (2011). Evolution and functional diversification of MIRNA genes. Plant Cell 23, 431-442]. En Arabidopsis, se ha demostrado que miR403 se dirige a la región 3' no traducida (3' UTR) de mRNA para ARGONAUTE2 (AGO2), una de las 10 proteínas de la familia AGO en esta especie de planta de referencia [Jones-Rhoades, MW, Bartel, DP, y Bartel, B. (2006). MicroRNAs and their regulatory roles in plants.. Annu Rev Plant Biol 57, 19-53; Vaucheret, H. (2008). Plant ARGOn Au TES. Trends Plant Sci 13, 350-358]. El resultado de la interacción entre miR403 y su objetivo implica la escisión del ARNm de AGO2 [Allen, E.,Xie, Z., Gustafson, A.M. y Carrington, J.C. (2005). microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121, 207-221; Xie, Z., Allen, E., Fahlgren, N., Calamar, A., Givan, S.A., y Carrington, J.C. (2005). Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiol 138, 2145-2154]. Se cree que AGO2 de Arabidopsis desempeña un papel en la defensa contra ciertos patógenos virales [Harvey, JJ, Lewsey, MG, Patel, K., Westwood, J., Heimstadt, S., Carr, JP y Baulcombe, DC (2011). An antiviral defense role of AGO2 in plants. PLoS One 6, e14639; Jaubert, M., Bhattacharjee, S., Mello, A.F., Perry, K.L., and Moffett, P. (2011). ARGONAUTE2 mediates RNA-silencing antiviral defenses against Potato virus X in Arabidopsis. Plant Physiol 156, 1556-1564; Wang, X.B., Jovel, J., Udomporn, P., Wang, Y., Wu, Q., Li, W.X., Gasciolli, V., Vaucheret, H., and Ding, S.W. (2011). The 21-nucleotide, but not 22-nucleotide, viral secondary small interfering RNAs direct potent antiviral defense by two cooperative argonautes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 23, 1625-1638]. Sin embargo, la AGO2 no parece desempeñar un papel esencial para el crecimiento y desarrollo normal, ya que las mutaciones de pérdida de función en la AGO2 no parecen producir ningún defecto notable [Vaucheret, H. (2008). Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci 13, 350-358; Mallory, A., y Vaucheret, H. (2010). Form, function, and Regulation of ARGONAUTE proteins. Plant Cell 22, 3879-3889].

Aprovechando las secuencias bien caracterizadas involucradas en la interacción objetivo con miR403 en Arabidopsis, se ha modificado un informador basado en luciferasa de luciérnaga (LUC) [Xiong, L., David, L., Stevenson, B. y Zhu , J. (1999). High throughput screening of signal transduction mutant with luciferase imaging. Plant Molecular Biology Reporter 17, 159-170] modificado con un sitio objetivo miR403 en su 3'UTR (designado como 35S::LUC-TARmiR403). La eficacia de la subregulación mediada por miR403 de la expresión del informador de LUC se evaluó mediante la expresión del 35S::LUC-TARmiR403, ya sea solo o expresado conjuntamente con el constructo que produce MIR403 impulsado por el promotor 35S (designado 35S::miR403) en un sistema de ensayo transitorio mediado por Agrobacterium en Nicotiana benthamina [Johansen, LK, y Carrington, JC (2001). Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol 126, 930­ 938]. Los constructos informadores de LUC que carecen del sitio objetivo miR403 (designado 35S::LUC) o que albergan un sitio de interacción de miR403 mutado (designado como 35S::LUC-TARmiR403m) también se hicieron para servir como controles.

Se usó el siguiente esquema para la inyección conjunta.

1. Control de vector solamente

2. 35S::LUC solamente

3. 35S::LUC-TARmiR403 solamente

4. 35S::LUC-TARmiR403m solamente

5. 35S::LUC-TARmiR403 vector de control

6. 35S::LUC-TARmiR403 35S::miR403

7. 35S::LUC-TARmiR403m vector de control

8. 35S::LUC-TARmiR403m 35S::miR403

Dos días después de la inyección (2 dpi), las actividades de luciferasa eran fácilmente detectables en hojas infiltradas con 35S::LUC, pero no en aquellas infiltradas con el control de vector (Figura 2A). En hojas infiltradas con una versión objetivo miR403 del constructo LUC (35S::LUC-TARmiR403), sin embargo, se detectaron actividades luciferasas sustancialmente más bajas cuando se compararon con las 35S::LUC (Figura 2A), probablemente debido a una represión causada por el miR403 endógeno expresado naturalmente en las hojas de N. benthamiana. Los análisis de transferencia Northern de ARN pequeño confirmaron que este era el caso, ya que se detectaron niveles bajos de acumulación de miR403 en las hojas infiltradas con el control del vector (Figura 2B e I). Consistente con una "inactivación" postranscripcional eficiente de la expresión 35S::LUC-TARmiR403 por el miR403 endógeno de las hojas de N. benthamiana mutaciones que interrumpen el sitio de interacción de miR403 en el informador de LUC modificado restauraron la actividad de la luciferasa a un nivel comparable al detectado en el 35S::LUC (Figura 2A; véase la muestra marcada con 35S::LUC-TARmiR403m). Tal tendencia general en la actividad de la luciferasa también se observó en muestras tomadas a los 3dpi (Figura 2B). Para examinar el efecto de miR403 exógeno en la expresión del informador de LUC, también se incluyó en el experimento los tratamientos de inyección de Agrobacterium "de dos componentes" en los que el informador de LUC se expresa conjuntamente con el miR403 transgénico. Como se muestra en la Figura 2, se observaron niveles sustancialmente elevados de acumulación de miR403 cuando se incluyó el constructo 35S::MIR403 en la infiltración conjunta (Figura 2B e I). Cuando la versión objetivo miR403 del constructo LUC (35S::LUC-TARmiR403) se inyectó conjuntamente con 35S::MIR403, se observó una reducción adicional en la actividad de la luciferasa en comparación con la inyección conjunta del control con el vector. (Figura 2A y H), una indicación de que miR403 expresado de forma transgénica reforzó aún más el efecto de silenciamiento de miR403 endógeno sobre sus objetivos. Como era de esperar, independientemente de la inyección conjunta ya sea con 35S::MIR403 o con el control del vector, el informador de LUC que alberga un sitio de interacción de miR403 mutado (35S::LUC-TARmiR403m) exhibió una elevada actividad de luciferasas cuando se comparó con su contraparte objetivo miR403 (Figura 2A y H). Estos datos fueron consistentes con y además avalados por los niveles de ARNm de LUC de longitud completa detectados mediante ensayos basados en RT-PCR (Figura 2O y P).

En resumen, se obtuvieron resultados consistentes que muestran que la expresión de 35S::LUC-TARmiR403 pueden ser eficazmente representados por miR403 endógeno de N. benthamiana, mientras que la expresión de un LUC no objetivo (35S::LUC) o la LUC con un objetivo miR403 mutado (35S::LUC-TARmiR403m) no se vio afectada. La expresión de 35S::LUC-TARmiR403 puede ser además subregulada cuando se expresa conjuntamente con 35S::MIR403, que proporciona un miR403 maduro adicional.

Ejemplo 4. Validación de la represión mediada por miRcan1230 del informador de LUC en un sistema de ensayo transitorio

Utilizando las secuencias objetivo candidatas involucradas en la interacción objetivo de miRcan1230 en Arabidopsis, se ha designado un informador basado en luciferasa de luciérnaga (LUC) [Xiong, L., David, L., Stevenson, B. y Zhu, J. (1999). High Throughput screening of signal transduction mutant with luciferase imaging. Plant Molecular Biology Reporter 17, 159-170] modificado con un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR (designado como 35S::LUC-TARmiRcan1230). La eficacia de miRcan1230 mediada por la disminución de la expresión del indicador LUC se evaluó mediante la expresión de 35S::LUC-TARmiRcan1230, ya sea solo o expresado conjuntamente con un constructo productor de MIRcan1230 impulsado por el promotor 35S (designado 35S::miRcan1230) en un sistema de ensayo transitorio mediado por Agrobacterium en Nicotiana benthamiana [Johansen, LK, y Carrington, JC (2001). Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol 126, 930-938]. Los constructos del informador de LUC que carecen del sitio objetivo miRcan1230 (designado 35S::LUC) o que albergan un sitio que interactúa con miRcan1230 mutado (designado como 35S::LUC-TARmiRcan1230m) también se elaboraron para servir como controles.

Se usó el siguiente esquema para inyección conjunta.

1. Control de vector solamente

2. 35S::LUC-TARmiRcan1230 solamente

3. 35S::LUC solamente

4. 35S::LUC-TARmiRcan1230 solamente

5. 35S::LUC-TARmiRcan1230m solamente

6. 35S::LUC-TARmiRcan1230 vector de control

7. 35S::LUC-TARmiRcan1230 35S::miRcan1230

8. 35S::LUC-TARmiRcan1230m vector de control

9. 35S::LUC-TARmiRcan1230m 35S::miRcan1230

A los tres días posteriores a la inyección (3 dpi), las actividades de luciferasa fueron fácilmente detectables a partir de las hojas infiltradas con 35S::LUC, pero no a partir de aquellas infiltradas con el control del vector (Figura 6A, carriles 3 y 1). En las hojas infiltradas con una versión objetivo miRcan1230 del constructo de LUC solamente (carril 4) (35S::LUC-TARmiRcan1230), se detectaron actividades de luciferasa comparables con las 35S::LUC (Figura 6A, carril 3), como parece que no hay represión que puede ser causada por miRcan1230 endógeno en las hojas de N. Benthamiana, como el algodón miRcan1230 no se conserva en otras especies. Los ensayos de transferencia Northern de RNA pequeño indicaron que se detectó acumulación de miRcan1230 solamente a partir de las hojas infiltradas con el constructo 35S:: miRcan1230 solamente (Figuras 6B, carriles 2, 7 y 9).

Para examinar el efecto de miRcan1230 expresado exógenamente en la expresión del informador de LUC, se incluyó en el experimento los tratamientos de inyección de Agrobacterium "de dos componentes" en los que el informador de LUC se expresa conjuntamente con miRcan1203 transgénico. Como se muestra en la Figura 6, se observaron niveles sustancialmente elevados de acumulación de miRcan1230 cuando se incluyó el constructo 35S::MIRcan1230 en la infiltración conjunta y solo entonces (Figura 6B). Cuando la versión objetivo miRcan1230 del constructo de LUC (35S::LUC-TARmiRcan1230) se inyectó conjuntamente con 35S::MIRcan1230, se observó una reducción significativa en la actividad de la luciferasa cuando se comparó con el control de la inyección conjunta con el vector (Figura 6A), una indicación de que miRcan1230 expresado de forma transgénica ejerció el efecto silenciador de miRcan1230 sobre sus objetivos. Como era de esperar, independientemente de la inyección conjunta ya sea con 35S::MIRcan1230 o el control del vector, el informador de LUC que alberga un sitio de interacción de miRcan1230 mutado (35S::LUC-TARmiRcan1230m) exhibió una actividad elevada de luciferasa cuando se compara con su contraparte objetivo miRcan1203 (Figura 6A).

Estos datos fueron consistentes con, y además avalados por, los niveles de ARNm de LUC detectados mediante los ensayos basados en RT-PCR (Figura 6E y F). Los ensayos basados en RT-PCR distinguieron entre la detección de la parte 5' del ARNm de LUC (región A) secuencia arriba del sitio objetivo miRcan1230 o la parte 3' del ARNm de LUC (región B), secuencia abajo del sitio objetivo miRcan1230. La Región A no se puede detectar cuando no se ha inyectado el vector 35S::LUC (con o sin el sitio objetivo) (carriles 1 y 2), pero también se reduce significativamente cuando el 35S::LUC-TARmiRcan1230 se expresa conjuntamente con 35S::MIRcan1230. La región B siempre se puede detectar, excepto cuando no se ha inyectado el vector 35S::LUC (con o sin el sitio objetivo).

En resumen, se obtuvieron resultados consistentes que muestran que la expresión de 35S::LUC-TARmiRcan1230 puede ser reprimida efectivamente por N. Benthamiana solamente cuando se expresa conjuntamente con 35S::MIRcan1230 que proporciona miRcan1230 maduro.

Ejemplo 5: Represión mediada por miR403 o mediada por miR408 de quitina sintasa y/o glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa en fibras de algodón

Usando técnicas de ADN recombinante, se construyeron los siguientes genes recombinantes enlazando operativamente los siguientes elementos de ADN:

Construcción de quitina sintasa recombinante sitio de unión de miR408

• El promotor Pscw-prpr

• Una región de ADN que codifica para la señal de direccionamiento a golgi de XylT35 fusionada con la secuencia de codificación de quitina sintasa de Neurospora crassa

• Una secuencia que incluye el sitio de unión de microARN408

• El fragmento 3'UTR del gen 35S de CaMV.

Más detalles se incluyen en la Tabla 2 con referencia a la SEQ ID NO. 15.

Glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante sitio de unión de miR408

• El promotor Pscw-prpr

• Una región de ADN que codifica para la glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa de Escherichia coli.

• Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNA408

• Región 3' no traducida del gen H4 de histona de Arabidopsis thaliana.

Más detalles se incluyen en la Tabla 3 con referencia a la SEQ ID NO. 14.

Constructo recombinante de quitina sintasa sitio de unión de miR403

El promotor Pscw-prpr

Una región de ADN que codifica la señal de orientación de golgi de XylT35 fusionada a la secuencia de codificación de quitina sintasa de Neurospora crassa

Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNA403

El fragmento 3'UTR del gen 35S de CaMV.

Más detalles se incluyen en la Tabla 4 con referencia a la SEQ ID NO. 13.

Glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante sitio de unión de miR403

• El promotor Pscw-prpr

• Una región de ADN que codifica para la glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa de Escherichia coli. • Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNA403

• región 3' no traducida del gen H4 de histona de Arabidopsis thaliana.

Más detalles se incluyen en la Tabla 4 con referencia a la SEQ ID NO. 13.

Loas constructos recombinantes se insertaron en diversas combinaciones en vectores de T-ADN junto con un marcador seleccionable, tal como un gen de tolerancia al glifosato expresable en plantas. Los ejemplos de tales vectores de T-ADN incluyen pTEA1 (que comprende glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante seguida por el sitio de unión de miARN408; SEQ ID No. 14) y pTDBI312 (que comprende glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante seguida por el sitio de unión de miARN403y quitina sintetasa recombinante seguida por el sitio de unión de miARN403; SEQ ID No. 13) pTEA6 (que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa con un sitio objetivo de miR403 en su 3'UTR y quitina sintasa con un sitio objetivo miR408 en su 3'UTR; Tabla 6 y SEQ ID NO. 17) o pTEA3 (que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa y quitina sintasa, ambas con un sitio objetivo miR408 en su 3'UTR; Tabla 5 y SEQ ID NO. 16).

Estos vectores de T-ADN se introdujeron en cepas de Agrobacterium que contenían un plásmido de Ti auxiliar y se usaron en la transformación de algodón esencialmente como se describe en el documento WO00/71733.

Se regeneraron plantas de algodón transgénicas y se determinó la expresión de glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa y quitina sintetasa en fibras de algodón. Las plantas de algodón transgénicas que comprenden constructos recombinantes con sitios objetivo de miARN en su 3'UTR muestran fenotipos menos desventajosos (plantas pequeñas, etc.) que las plantas de algodón transgénicas que comprenden constructos recombinantes sin sitios objetivo de miARN en su 3'UTR.

Ejemplo 6: represión mediada por miRcan1230 o mediada por miR398 de quitina sintasa y/o glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa en fibras de algodón

Utilizando técnicas de ADN recombinante, se construyeron los siguientes genes recombinantes enlazando operativamente los siguientes elementos de ADN:

Constructo recombinante de quitina sintasa sitio de unión de miR398

• El promotor Pscw-prp

• Una región de ADN que codifica para la señal de direccionamiento a golgi de XylT35 fusionada con la secuencia de codificación de quitina sintasa de Neurospora crassa

• Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNA398

• El fragmento de 3'UTR del gen 35S de CaMV.

Más detalles se incluyen en la Tabla 7 con referencia a la SEQ ID NO. 24.

Glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante sitio de unión de miRcan1230

• El promotor Pscw-prp

• Una región de ADN que codifica para la glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa de Escherichia coli. • Una secuencia que incluye el sitio de unión de microARN398

• 3 'región no traducida del gen H4 de histona de Arabidopsis thaliana.

Más detalles se incluyen en la Tabla 7 con referencia a la SEQ ID NO. 24.

Constructo de quitina sintasa recombinante sitio de unión de miRcan1230

• El promotor Pscw-prp

• Una región de ADN que codifica la señal de direccionamiento a golgi de XylT35 fusionada a la secuencia de codificación de quitina sintasa de Neurospora crassa

• Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNAcan1230

• El fragmento 3'UTR del gen 35S CaMV.

Más detalles se incluyen en la Tabla 8 con referencia a la SEQ ID NO. 25.

Glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante sitio de unión de miRcan1230

• El promotor Pscw-prp

• Una región de ADN que codifica para la glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa de Escherichia coli. • Una secuencia que incluye el sitio de unión de microRNAcan1230

• región 3' no traducida del gen H4 de histona de Arabidopsis thaliana.

Más detalles se incluyen en la Tabla 8 con referencia a la SEQ ID NO. 25.

Los constructos recombinantes se insertaron en diversas combinaciones en vectores de T-ADN junto con un marcador seleccionable, tal como un gen de tolerancia al glifosato expresable en plantas. Los ejemplos de dichos vectores de T-ADN incluyen pTEA9 (que comprende glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa recombinante seguido de un sitio de unión de miARN398 y quitina sintetasa recombinante seguido de un sitio de unión de miARN398, SEQ ID NO.

24) y pTEA10 (que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa con un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR y quitina sintasa con un sitio objetivo miRcan1230 en su 3' UTR; SEQ ID No. 25).

Estos vectores de T-ADN se introdujeron en cepas de Agrobacterium que contenían un plásmido Ti auxiliar y se usaron en la transformación de algodón esencialmente como se describe en el documento WO00/71733.

Se regeneraron plantas de algodón transgénicas y se determinó la expresión de glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa y quitina sintetasa en fibras de algodón. Las plantas de algodón transgénicas que comprenden constructos recombinantes con sitios objetivo de miARN en su 3'UTR muestran fenotipos menos desventajosos (plantas pequeñas, etc.) que las plantas de algodón transgénicas que comprenden constructos recombinantes sin sitios objetivo de miARN en su 3'UTR.

Tabla 2: elementos genéticos del constructo de ADN recombinante pEA2 que comprende quitina sintasa y el sitio objetivo de miR408. La referencia de secuencia de nucleótidos en la SEQ ID NO. 15

Tabla 3: elementos genéticos de T-ADN del vector pTEA1 que comprende el constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa y el sitio objetivo de miR408. La referencia es la SEQ ID NO. 14

Tabla 4: elementos genéticos de T-ADN del vector pTBDI312 que comprende un constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa y quitina sintasa, ambas contienen un sitio objetivo de miR403 en su 3'UTR - la referencia es la SEQ ID NO. 13

Tabla 5: elementos genéticos del T-ADN del vector pTEA3 que comprende un constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa y quitina sintasa, ambos contienen un sitio objetivo de miR408 en su 3' UTR; la referencia es la SEQ ID NO. 16

Tabla 6: elementos genéticos de T-ADN del vector pTEA6 que comprende un constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa que contiene un sitio objetivo miR403 en su 3'UTR y quitina sintasa que contiene un sitio objetivo miR408 en su 3'UTR - la referencia es la SEQ ID No. 17

Tabla 7: elementos genéticos de T-ADN del vector pTEA9 que comprende un constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa que contiene un sitio objetivo miR398 en su 3'UTR y quitina sintasa que contiene un sitio objetivo miR398 en su 3'UTR - la referencia es la SEQ ID No. 24

Tabla 8: elementos genéticos de T-ADN del vector pTEA10 que comprende un constructo recombinante que contiene glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa que contiene un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR y quitina sintasa que contiene un sitio objetivo miRcan1230 en su 3'UTR. La referencia es la SEQ ID No. 25

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un gen recombinante para la expresión espacialmente selectiva en una planta de algodón que comprende los siguientes elementos enlazados operativamente:

(a) un promotor expresable en plantas;

(b) una región que codifica una molécula de ARN que puede traducirse en un polipéptido o proteína;

(c) opcionalmente una región de terminación de la transcripción 3' y de poliadenilación

caracterizada porque dicho gen recombinante comprende además una secuencia objetivo heteróloga reconocida por un miARN endógeno, expresándose dicho miARN de manera menos abundante en las células que conducen a fibras en dicha planta de algodón en comparación con las células de dicha planta de algodón diferente de dichas células que conducen a dichas fibras y en donde dicho miARN tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 22.

2. El gen recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho gen recombinante comprende una región 3’ no traducida que comprende dicha secuencia objetivo.

3. El gen recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho promotor expresable de la planta se selecciona de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, un promotor regulado por el desarrollo.

4. El gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho promotor expresable en plantas es un promotor preferente de fibra o selectivo de fibra.

5. El gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia objetivo tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 5, la SEQ ID NO. 5 desde la posición del nucleótido 4 hasta la posición del nucleótido 24, la SEQ ID NO. 6, la SEQ ID NO. 6 desde la posición del nucleótido 4 hasta la posición del nucleótido 24, la SEQ ID n O. 7, la SEQ ID n O. 8, la SEQ ID NO. 23, la SEQ ID NO. 23 desde la posición del nucleótido 4 hasta 24, la SEQ ID NO. 23 desde la posición del nucleótido 11 hasta 32, o la SEQ ID n O. 23 desde las posiciones de nucleótidos 4 hasta 32 o donde dicha secuencia objetivo tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.1, la SEQ ID NO. 2, la SEQ ID NO. 3, o la SEQ ID NO. 4, la SEQ ID NO. 20, la SEQ ID NO. 21 o la SEQ ID NO. 22, por lo que pueden ocurrir uno o más de las siguientes faltas de coincidencia:

(a) una falta de coincidencia entre el nucleótido en el extremo 5' del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(b) una falta de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 hasta la posición 9 del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(c) tres faltas de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 hasta la posición 21 del miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo siempre que no haya más de dos faltas de coincidencia consecutivas; y

(d) no se permite una falta de coincidencia en las posiciones 10 y 11 del miARN.

6. El gen recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ARN codifica (a) un polipéptido con actividad de N-acetilglucosamina transferasa, preferiblemente una N-acetilglucosamina transferasa de tipo NODC, tal como una N-acetilglucosamina transferasa de tipo NODC obtenible de una especie de Rhizobium, una especie de Azorhizobium, una especie de Bradyrhizobium, una especies de Mesorhizobium, una especies de Ralstonia, una especie de Streptomyces, una especies de Buríkholderia, una especie de Cupriavidus o una especie de Sinorhizobium o N-acetilglucosamina transferasa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 desde la posición del nucleótido 1503 a la posición del nucleótido 4439 o (b) una quitina sintasa, preferiblemente quitina sintasa 2 de Saprolegnia monoica o (c) una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa, que comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la s Eq ID NO: 13 desde la posición del nucleótido 6202 a la posición del nucleótido 8031.

7. Una célula vegetal de algodón que comprende un gen recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una planta, parte, tejido o semilla de algodón de una planta de algodón que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 7, o que consiste esencialmente en células de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para producir una planta de algodón con expresión espacialmente selectiva de un gen recombinante, que comprende la etapa de

(a) introducción de un gen recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en al menos una célula de dicha planta de algodón;

(b) Opcionalmente, regenerar una planta de algodón a partir de dicha al menos una célula de algodón que comprende dicho gen recombinante.

10. Uso de un microARN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1, la SEQ ID n O. 2, la SEQ ID NO. 3 o la SEQ ID NO. 4 y/o un sitio objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ iD No. 5, la SEQ iD No. 5 desde la posición del nucleótido 4 a la posición del nucleótido 24, la SEQ ID No. 6, la SEQ ID No. 6 desde la posición del nucleótido 4 a la posición del nucleótido 24, la SEQ ID No. 7, la SEQ ID No. 8, la SEQ ID No. 8 desde la posición del nucleótido 4 a la 24, la SEQ ID No. 23, la SEQ ID No. 23 desde la posición del nucleótido 4 a la 24, la SEQ ID No. 23 desde la posición del nucleótido 11 a la 32, o la SEQ ID No. 23 desde la posición del nucleótido 4 a la 32 o una secuencia objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de miARN seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 3, las SEQ ID No. 4, la SEQ ID No. 20, la SEQ ID No. 21 o la SEQ ID No. 22, por lo que pueden ocurrir uno o más de las siguientes faltas de coincidencia

(a) una falta de coincidencia entre el nucleótido en el extremo 5' de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(b) una falta de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 1 hasta la posición 9 de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo;

(c) tres faltas de coincidencia entre cualquiera de los nucleótidos en la posición 12 hasta la posición 21 de dicho miARN y la correspondiente secuencia de nucleótidos en la secuencia de ARN objetivo siempre que no haya más de dos faltas de coincidencia consecutivas; y

(d) no se permite una falta de coincidencia en las posiciones 10 y 11 del miARN;

para aumentar la selectividad de la expresión selectiva de la fibra de un gen recombinante en una célula productora de fibra de una planta de algodón.

11. Un procedimiento para aumentar la expresión selectiva de tejidos en una planta de algodón que comprende la etapa de usar un gen recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Un procedimiento para producir fibras a partir de una planta de algodón que comprende las etapas de

(a) cultivar una planta de algodón de acuerdo con la reivindicación 8 o una planta de algodón obtenida por el proceso de la reivindicación 9;

(b) cosechar fibras de dichas plantas de algodón cultivadas.

13. Fibras de algodón obtenidas por el procedimiento de la reivindicación 12 y que comprenden el gen recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.