ES2632123T3 - Péptido CDH3 y agente medicinal que comprende el mismo - Google Patents

Péptido CDH3 y agente medicinal que comprende el mismo Download PDF

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Abstract

Un péptido de los siguientes (A) o (B): (A) un péptido de menos de 15 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2; (B) un péptido de menos de 15 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2, en que uno o dos aminoácido(s) están sustituidos, suprimidos, insertados y/o añadidos, y en donde el péptido tiene actividad para inducir una célula T citotóxica (asesina).

Description

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tienen un gen que codifica el péptido de la divulgación se pueden producir introduciendo el vector de expresión anteriormente mencionado en el huésped. El huésped puede ser cualquier de bacterias, levaduras, células animales y células de insectos, y la introducción del vector de expresión para el huésped puede llevarse a cabo utilizando cualesquiera técnicas conocidas, dependiendo del huésped.
En la presente divulgación, el péptido recombinante descrito en esta memoria puede aislarse cultivando el transformante producido tal como se describe anteriormente, produciendo y acumulando el péptido en el cultivo y recogiendo el péptido del cultivo.
Cuando el transformante es un procariota tal como E. coli o un eucariota tal como una levadura, el medio de cultivo para cultivar estos microorganismos puede ser un medio natural o un medio sintético, siempre que contenga una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, minerales y similares que pueden ser utilizados por los microorganismos y permite el cultivo eficiente del transformante. Las condiciones de cultivo pueden ser las habitualmente utilizadas para el cultivo de microorganismos. Después del cultivo, el péptido de la presente invención puede ser aislado y purificado a partir del cultivo del transformante utilizando métodos convencionales para el aislamiento y la purificación de péptidos.
Péptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos en la que uno o dos aminoácidos están sustituidos o añadidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2 se pueden producir u obtener de manera apropiada por una persona experta en la técnica basándose en la información en la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2. Específicamente, el gen que codifica un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos en la que se sustituyen, suprimen, insertan y/o añaden uno o dos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2 y tiene actividad inductora de células T asesinas, también puede ser producido por cualquier método conocido para una persona experta en la técnica tal como síntesis química, técnicas de ingeniería genética o mutagénesis. Por ejemplo, el método de mutagénesis dirigida al sitio, una de las técnicas de ingeniería genética, es útil porque puede introducir una mutación específica en una posición específica. Se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en adelante abreviado como. Molecular Cloning 2ª Ed), Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (en adelante abreviado como Current Protocols in Molecular Biology), y similares.
Los péptidos descritos anteriormente pueden inducir inmunidad contra el cáncer, como también se muestra más adelante en los Ejemplos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, se proporcionan agentes para inducir inmunidad contra el cáncer que contiene los péptidos descritos en esta memoria. Los agentes para inducir inmunidad de la presente invención también se pueden preparar como una formulación mixta combinando dos o más péptidos de epítopos. Agentes para inducir inmunidad, formulados mediante la combinación de múltiples tipos de péptidos, puede ser un cóctel, o pueden estar mutuamente enlazados utilizando técnicas estándares. Los péptidos de epítopo a ser combinados pueden ser péptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos derivadas del mismo gen, o pueden ser péptidos que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de diferentes genes. Cuando los péptidos descritos en esta memoria se administran a un sujeto, los péptidos administrados están densamente presentes sobre antígenos HLA de células presentadoras de antígenos y, posteriormente, las células T asesinas, que reaccionan específicamente con los complejos formados entre los péptidos administrados y son inducidos los antígenos HLA. Alternativamente, poniendo en contacto células dendríticas recogidas de un sujeto con los péptidos descritos en esta memoria (o pulsando con los péptidos descritos en esta memoria células dendríticas recogidas de un sujeto), se pueden obtener células presentadoras de antígenos que presentan los péptidos descritos en esta memoria en sus superficies celulares. Mediante la administración de estos células presentadoras de antígenos de nuevo a cada uno de los sujetos, se pueden mejorar las células T asesinas se inducen en el cuerpo del sujeto, y como resultado, las respuestas de inmunidad a las células diana que presentan los péptidos de la presente invención.
Cuando se utilizan in vitro o in vivo, preferiblemente in vitro, los agentes para la inducción de inmunidad contra el cáncer de acuerdo con la presente invención pueden inducir a células T auxiliares, células T asesinas o grupos de inmunocitos que incluyen estas células, confiriendo con ello inmunidad contra el cáncer.
(2) Agentes farmacéuticos para tratar y/o prevenir el cáncer de acuerdo con la presente invención (vacunas contra el cáncer)
Se ha demostrado en los Ejemplos que los péptidos de la invención pueden inducir células T asesinas específicas para las células cancerosas in vivo. Además de ello, se ha demostrado que CDH3 fue altamente expresado en la mayoría de los casos tales como el cáncer de páncreas, carcinoma colangiocelular, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer testicular, cáncer cervical, osteosarcoma, sarcoma de tejido blando, o similares. Por consiguiente, se espera que los agentes para inducir inmunidad incluyan los péptidos descritos en esta memoria sean eficaces como agentes para tratar y/o prevenir el cáncer. Es decir, inyectando los péptidos de la invención, junto con un adyuvante adecuado en el cuerpo, o después de pulsar con los péptidos las
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La inducción de inmunidad antitumoral por parte de péptidos también puede evaluarse observando la inducción de la producción de anticuerpos contra los tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos contra péptidos en animales de laboratorio inmunizados con los péptidos, y cuando el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de células tumorales son suprimidas por estos anticuerpos, se determina que los péptidos inducen inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral puede ser inducida al administrar una vacuna de la presente invención, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y la prevención del cáncer. Efectos del tratamiento del cáncer o la prevención de la incidencia de cáncer pueden incluir la inhibición de crecimiento de células cancerosas, la regresión de las células cancerosas y la supresión del desarrollo de células cancerosas. La disminución de la tasa de mortalidad de individuos que tienen cáncer, la disminución en los marcadores tumorales en la sangre y la reducción de los síntomas detectables que acompañan al cáncer también se incluyen en los efectos del tratamiento o prevención del cáncer. Tales efectos terapéuticos o preventivos de la vacuna contra el cáncer son preferiblemente estadísticamente significativos en comparación con los de un control sin administración de la vacuna. Por ejemplo, se observan los efectos a un nivel de significancia del 5% o menos. Métodos estadísticos que pueden ser utilizados para determinar la significancia estadística son, por ejemplo, del ensayo t de Student, ensayo U de Mann-Whitney o ANOVA.
En la divulgación, el sujeto es preferiblemente un mamífero. Ejemplos incluyen seres humanos, primates no humanos, ratones, ratas, perros, gatos, caballos o ganado, pero no se limitan a los mismos.
Péptidos de la presente invención se pueden administrar a un sujeto in vivo o ex vivo. Además, para producir una composición inmunogénica para el tratamiento o la prevención del cáncer, se puede utilizar un péptido inmunogénico de la invención, es decir, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2, o nonapéptidos seleccionados de péptidos variantes de los mismos.
Más específicamente, la invención proporciona agentes farmacéuticos para el tratamiento de tumores o para prevenir el crecimiento, la metástasis y similares de tumores, que incluyen uno o más péptidos de la presente invención como ingredientes activos. Péptidos de la invención son particularmente útiles para tratar el cáncer de páncreas, carcinoma colangiocelular, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer testicular, cáncer cervical y tumores tales como osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos.
Péptidos descritos en esta memoria se pueden administrar directamente a un sujeto como un agente farmacéutico formulado por métodos de formulación ordinarios. Tal formulación puede incluir, además de los péptidos descritos en esta memoria, vehículos, excipientes y similares farmacéuticamente aceptables según sea necesario. Agentes farmacéuticos descritos en esta memoria se pueden utilizar para tratar y prevenir diversos tumores.
Además, para establecer eficazmente la inmunidad celular, adyuvantes se pueden mezclar en agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o la prevención de tumores que incluyen uno o más péptidos de la presente invención como ingredientes activos. Alternativamente, esta composición puede ser co-administrada con otros ingredientes activos tales como agentes antitumorales. Formulaciones apropiadas también incluyen gránulos. Adyuvantes apropiados se describen en la bibliografía (Johnson AG, (1994) Clin Microbiol Rev., 7:277-89). Ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante incompleto de Freund, BCG, dimicolato de trehalosa (TDM), lipopolisacárido (LPS), adyuvante de alumbre, adyuvante de sílice, fosfato de aluminio, hidróxido de alumbre y sulfato de aluminio y potasio, pero no se limitan a los mismos. Además, se pueden utilizar convenientemente formulaciones liposomales, formulaciones granulares en las que un fármaco está unido a perlas que tienen un diámetro de varios µm, y formulaciones en las que los lípidos están unidos a los péptidos antes mencionados. Métodos de administración pueden ser administración oral, inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intravenosa, o similares, y pueden incluir la administración sistémica o la administración local cerca del tumor diana.
La dosis de los péptidos descritos en esta memoria se puede ajustar apropiadamente de acuerdo con la enfermedad a tratar, la edad y el peso corporal del paciente, el método de administración, y similares. La dosis es habitualmente de 0,001 mg a 1.000 mg, preferiblemente de 0,01 mg a 100 mg, y más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg. Preferiblemente, ésta se administra una vez en unos pocos días a una vez en unos pocos meses, pero los expertos en la técnica puede seleccionar fácilmente las dosis y los métodos de administración apropiados, y la selección y optimización de estos parámetros están completamente dentro del alcance de la técnica convencional. La forma de la formulación tampoco está particularmente limitada, y puede ser secada por congelación, o granulada mediante la adición de excipientes tales como el azúcar.
Adyuvantes para aumentar la actividad inductora de células T que responden a tumores que se pueden añadir a los agentes farmacéuticos de la presente invención incluyen componentes bacterianos de bacterias BCG y tales, incluyendo dipéptido muramílico (MDP), ISCOM al que se hace referencia en Nature, vol. 344, p. 873 (1990), QS-21 de la serie de saponina descrito en, J. Immunol. vol. 148, p. 1438 (1992) de liposomas, e hidróxido de aluminio. Además, inmunoestimulantes tales como lentinan, sizofirán y Picibanil también se pueden utilizar como adyuvantes.
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Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden obtener inmunizando mamíferos o especies aviares con un péptido de la presente invención como un antígeno, recogiendo sangre de los mamíferos o las especies aviares, y separando y purificando anticuerpos de la sangre recogida. Por ejemplo, se pueden inmunizar mamíferos tales como ratón, hámster, conejillo de indias, pollo, rata, conejo, perro, cabra, oveja y ganado, o especies aviares. Métodos de inmunización son conocidos por los expertos en la técnica, y el antígeno se puede administrar, por ejemplo, dos o tres veces a intervalos de 7 a 30 días. La dosis puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg a 2 mg de antígeno por administración. La vía de administración puede seleccionarse adecuadamente a partir de administración subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular y similares, pero no se limita a una cualquiera de ellas. Además, el antígeno puede ser utilizado después de su disolución en un tampón adecuado, por ejemplo, un tampón que contiene un adyuvante convencional tal como adyuvante completo de Freund o hidróxido de aluminio.
Mamíferos o especies aviares inmunizados se crían durante un cierto período de tiempo, y cuando se ha incrementado el título de anticuerpos, pueden inmunizarse, además, con, por ejemplo, 100 µg a 1.000 µg del antígeno. Se recoge sangre de los mamíferos o especies aviares inmunizados de uno a dos meses después de la última administración y la sangre se puede separar y purificar por métodos convencionales tales como centrifugación, precipitación utilizando sulfato de amonio o polietilenglicol, y cromatografía tal como cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad para obtener los anticuerpos policlonales que reconocen los péptidos de la presente invención como un antisuero policlonal.
Anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la preparación de hibridomas. Por ejemplo, los hibridomas se pueden obtener por fusión celular de células productoras de anticuerpos con líneas celulares de mieloma. Hibridomas que producen anticuerpos monoclonales descritos en esta memoria pueden obtenerse por métodos de fusión de células tales como los indicados más adelante.
Las células del bazo, células de ganglios linfáticos, linfocitos B, y similares de los animales inmunizados se utilizan como células productoras de anticuerpos. Los péptidos de la presente invención se utilizan como un antígeno. Animales tales como ratones y ratas pueden ser utilizados como animales inmunizados, y la administración de antígenos a estos animales se puede llevar a cabo por métodos convencionales. Por ejemplo, los animales son inmunizados mediante la administración de varias veces por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal y similar con una suspensión o emulsión de un péptido de la presente invención, que es un antígeno, y de un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. Células productoras de anticuerpos tales como células de bazo se obtienen a partir de animales inmunizados y se pueden fusionar con células de mieloma por métodos conocidos (G. Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)) para generar hibridomas.
P3X63Ag8, P3U1, SP2/0 y similares de ratón se pueden ejemplificar como líneas celulares de mieloma utilizadas para la fusión celular. Se utiliza un agente fomentador de la fusión tal como polietilenglicol y virus Sendai para la fusión celular, y se utiliza hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT) para seleccionar los hibridomas por un método convencional después de la fusión celular. Los hibridomas obtenidos mediante fusión celular se clonan mediante un método tal como el método de dilución limitante. Según sea necesario, líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente los péptidos de la presente invención se pueden obtener mediante rastreo mediante un método de inmunoensayo enzimático utilizando los péptidos de la presente invención.
Además de los métodos anteriores, las células inmunizados se pueden preparar mediante la estimulación de linfocitos humanos tales como los linfocitos infectados por el virus EB in vitro, utilizando los péptidos descritos en esta memoria, células que expresan los péptidos o lisados de los mismos. Los anticuerpos humanos que se unen a los péptidos de la presente invención también pueden obtenerse por fusión de linfocitos inmunizados de este tipo con células de la médula ósea derivadas de ser humano tales como U266 (Solicitud de Patente Japonesa Kokai Nº de Publicación (JP-A) S63-17688 (solicitud de patente japonesa publicada, no examinada)).
Con el fin de producir anticuerpos monoclonales deseados a partir de los hibridomas así obtenidos, los hibridomas pueden cultivarse mediante métodos convencionales de cultivo o procedimientos de formación de ascitis, y los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados a partir de los sobrenadantes de cultivo o la ascitis. La purificación de los anticuerpos monoclonales a partir de los sobrenadantes de cultivo o la ascitis se puede realizar por los métodos convencionales. Por ejemplo, fraccionamiento con sulfato amónico, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares se puede utilizar en combinación, según sea necesario.
Además, animales transgénicos que tienen un grupo de genes de anticuerpos humanos también pueden ser inmunizados utilizando los péptidos descritos en esta memoria, células que expresan los péptidos o lisados de los mismos. Células productoras de anticuerpos se pueden recoger de los animales transgénicos inmunizados para obtener hibridomas mediante la fusión con las líneas celulares de mieloma anteriormente descritas. Anticuerpos monoclonales deseados se pueden producir a partir de los hibridomas (documentos WO92-03918; WO94-02602; WO94-25585; WO94-33735; WO96-34096).
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anticuerpo secundario y se determina la absorbancia o similares. Por ejemplo, enzimas tales como fosfatasa alcalina se pueden utilizar como una etiqueta para el anticuerpo secundario, y sustratos de enzimas tales como fosfato de pnitrofenilo se pueden utilizar como un reactivo para la detección. BIAcore (Pharmacia) también se puede utilizar para evaluar la actividad de los anticuerpos.
Los anticuerpos descritos en esta memoria pueden detectar péptidos tal como se describe en esta memoria contenidos en las muestras. A saber, la presencia de péptidos descritos en esta memoria en tejidos de cáncer puede ser confirmada, por ejemplo, mediante la exposición de muestras de biopsia de tejido de cáncer a los anticuerpos de la divulgación.
Antes de la etapa de tratar y/o prevenir el cáncer utilizando los péptidos descritos en esta memoria, los sujetos a ser tratados eficazmente se pueden predecir antes de iniciar el tratamiento mediante la confirmación de la expresión de los péptidos descritos en esta memoria en el cáncer a tratar utilizando los anticuerpos descritos en esta memoria.
Además, puesto que los anticuerpos de la presente divulgación reconocen fragmentos de péptido CDH3 cuya expresión está aumentado en diversas células cancerosas, se espera que sean aplicables no sólo para el diagnóstico, sino también para el tratamiento.
(4) Células T Auxiliares, Células T Asesinas, o grupo de inmunocitos que las incluyen
La invención también está dirigida a células T auxiliares, células T asesinas o a un grupo de inmunocitos que las incluyen inducida por la estimulación in vitro utilizando péptidos de la presente invención. Por ejemplo, las células T activadas reactivas al tumor son inducidas cuando linfocitos de la sangre periférica o linfocitos infiltrantes de tumores se estimulan in vitro utilizando los péptidos de la presente invención, y estas células T activadas pueden ser utilizadas eficazmente para la inmunoterapia adoptiva. También, las células dendríticas que son potentes células presentadoras de antígenos pueden ser pulsadas con los péptidos de la presente invención o pueden ser transformadas genéticamente para expresar los mismos, que luego se pueden utilizar para estimular células T in vivo o in vitro para inducir respuestas inmunes anti-tumorales.
Preferiblemente, las células T auxiliares, células T asesinas o grupo de inmunocitos que las incluye pueden ser inducidas por la estimulación in vitro utilizando los péptidos descritos en esta memoria y un inmunoestimulante. El inmunoestimulante en esta memoria incluye factores de crecimiento celular o citoquinas.
Los tumores pueden ser suprimidos y los cánceres se pueden prevenir y/o tratar mediante transfusión de células T auxiliares, células T asesinas o grupo de inmunocitos que las incluyen obtenidos tal como se describió anteriormente en el cuerpo.
Células T auxiliares, células T asesinas o grupo de inmunocitos que las incluyen, que pueden suprimir tumores tal como se describió anteriormente, también se pueden preparar utilizando los péptidos descritos en esta memoria.
Por lo tanto, la divulgación describe medios de cultivo celular que contiene los péptidos descritos en esta memoria. Las células T auxiliares, células T asesinas o grupo de inmunocitos que las incluyen, que pueden suprimir tumores, se pueden preparar utilizando tales medios de cultivo celular. Además, la divulgación describe un kit de cultivo celular que contiene un medio de cultivo celular descrito anteriormente y un recipiente de cultivo celular para producir células T auxiliares, células T asesinas o un grupo de inmunocitos que las incluyen.
(5) Exosomas Presentadores de Antígenos
La invención proporciona, además, vesículas endocíticas denominadas "exosomas", que presentan en su superficie un complejo formado entre un péptido descrito en esta memoria y un antígeno HLA. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, por métodos descritos en detalle en la traducción japonesa de la Solicitud de Patente Japonesa Kohyo Nº de Publicación (JP-A) H11-510507 (publicación japonesa en fase nacional no examinada correspondiente a una publicación internacional no japonesa) y JP-A (Kohyo) 2000-512161. Preferiblemente, se puede preparar utilizando células presentadoras de antígenos obtenidas de un sujeto diana para el tratamiento y/o la prevención. Los exosomas de la presente invención pueden ser inyectados como una vacuna contra el cáncer de una manera similar a los péptidos de la presente invención.
El tipo antigénico HLA utilizado en la presente invención debe coincidir con el tipo antigénico HLA del sujeto que necesita el tratamiento y/o la prevención. Un ejemplo es HLA-A2, y preferiblemente, HLA-A2 (HLA-A*0201). "HLA-A2" significa una proteína, mientras que "HLA-A*0201" significa un gen correspondiente a un segmento de la proteína (este término se utiliza porque no hay términos disponibles en la actualidad que representen segmentos de la proteína).
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Métodos para Inducir Células Presentadoras de Antígenos y Células T Asesinas
La invención proporciona métodos para inducir células presentadoras de antígenos utilizando uno o más péptidos descritos en esta memoria. Células presentadoras de antígenos pueden ser inducidas por células dendríticas pulsantes inducidas a partir de monocitos de la sangre periférica con uno o más péptidos de la presente invención para estimular las células. Cuando los péptidos tal como se describen en esta memoria se administran a un sujeto, células presentadoras de antígenos que presentan los péptidos descritos en esta memoria en sus superficies pueden ser inducidos en el cuerpo del sujeto. Alternativamente, después de poner en contacto las células presentadoras de antígenos con péptidos descritos en esta memoria (o después de pulsar células presentadoras de antígenos con péptidos descritos en esta memoria), las células se pueden administrar al sujeto como una vacuna utilizando un método ex vivo. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
(1)
recoger células presentadoras de antígenos de un sujeto; y
(2)
poner en contacto células presentadoras de antígenos de la etapa (1) con péptidos de la presente invención (o pulsar células presentadoras de antígenos de la etapa (1) con péptidos de la presente invención).
Las células presentadoras de antígenos obtenidas en la etapa (2) se pueden administrar a un sujeto como una vacuna.
La invención también proporciona métodos para inducir células presentadoras de antígenos que tienen un alto nivel de actividad de inducción de células T asesinas. Los métodos incluyen una etapa de transfectar in vitro un gen que incluye un polinucleótido que codifica uno o más péptidos descritos en esta memoria en células presentadoras de antígenos. El gen a transfectar puede ser ADN o ARN. Como un método para la transfección, se pueden utilizar de manera adecuada diversos métodos, que se utilizan convencionalmente en la técnica, tales como lipofección, electroporación y un método de fosfato de calcio, pero no se limitan a los mismos. Más específicamente, la transfección puede llevarse a cabo tal como se describe en Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56: 5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161: 5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med, 184: 465-72; y en la traducción japonesa publicada del documento WO2000-509281. Cuando los genes se transfectaron en células presentadoras de antígenos, éstos se transcriben y se traducen en las células. Las proteínas así obtenidas se procesan posteriormente a lo largo de las vías de MHC clase I o clase II y se presentan, a través de la vía presentadora de antígenos, en la superficie de células presentadoras de antígenos como péptidos parciales.
La presente invención proporciona, además, métodos para la inducción de células T asesinas utilizando uno o más péptidos descritos en esta memoria. Mediante la administración de uno o más péptidos descritos en esta memoria al sujeto, las células T asesinas pueden ser inducidas en el cuerpo del sujeto, mejorando así el sistema inmunológico que fija como objetivo las células cancerosas que presentan CDH3 en los tejidos tumorales. Alternativamente, las células T asesinas activadas pueden ser inducidas por contacto con células presentadoras de antígenos de un sujeto y células CD8 positivas con uno o más péptidos de la presente invención in vitro y mediante el contacto adicional de leucocitos mononucleares de la sangre periférica con células presentadoras de antígenos in vitro para estimular las células. En métodos de tratamiento ex vivo, el sistema inmunológico que fija como objetivo células cancerosas que presentan CDH3 en tejidos tumorales en el sujeto puede ser mejorado mediante la devolución al sujeto de las células T asesinas activadas. Por ejemplo, los métodos incluyen las etapas de:
(1)
recoger células presentadoras de antígeno de un sujeto;
(2)
poner en contacto células presentadoras de antígeno de la etapa (1) con los péptidos descritos en esta memoria (o pulsar células presentadoras de antígenos de la etapa (1) con los péptidos descritos en esta memoria);
(3)
mezclar y co-cultivar células presentadoras de antígenos de la etapa (2) con células T CD8+ para inducir células T citotóxicas;y
(4)
recoger células T CD8+ del co-cultivo de la etapa (3).
Células T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenidas en la etapa (4) se pueden administrar a un sujeto como una vacuna.
La divulgación también describe células T asesinas aisladas que son inducidas utilizando uno o más péptidos de la presente invención. Preferiblemente, las células T asesinas inducidas por el método descrito en esta memoria se derivan del sujeto a tratar y/o prevenir. Se pueden administrar en combinación con otros agentes, incluyendo células presentadoras de antígenos o exosomas que presentan uno o más péptidos descritos en esta memoria. Las células T asesinas obtenidas son específicas para células diana que presentan un péptido que es el mismo que el utilizado para la inducción. Las células diana son las que expresan CDH3 endógenamente, o las transfectadas con el gen CDH3. Las células que presentan los péptidos de la presente invención en sus superficies por estimulación con los péptidos de la presente invención, tales como células cancerosas de cáncer de páncreas, carcinoma colangiocelular, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer testicular, cáncer cervical, osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos pueden ser objeto de ataque.
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La divulgación describe células presentadoras de antígenos que presentan un complejo formado entre el antígeno HLA y uno o más péptidos descritos en esta memoria. Las células presentadoras de antígenos que expresan uno o más péptidos descritos en esta memoria o nucleótidos que codifican tales péptidos se recogen preferiblemente del sujeto a tratar y/o prevenir. Los péptidos descritos en esta memoria, las células presentadoras de antígenos que presentan los péptidos, exosomas o células T asesinas activadas pueden administrarse como una vacuna en combinación con otros agentes.
La invención se explica más detalladamente en los Ejemplos descritos a continuación.
Ejemplos
[Ejemplo 1]
Expresión de CDH3 en tumores malignos
De acuerdo con análisis del chip de ADNc del pasado, la expresión de CDH3 se incrementó en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer gástrico, cáncer intestinal grande, y similares, en comparación con la expresión en tejidos adyacentes normales (Tabla 1) (Nakamura T, et al., Oncogene 2004; 23.: 2385-2400; Kitahara O, Cancer Res 2001; 61: 3544-3549, Obama K, et al., Hepatology 2005; 41:1339-1348).
[Tabla 1] n Tasa positiva* (%)
Relación de la expresión relativa (media) Cáncer de páncreas 16/16 100 1,900,000 Cancer testicular 10/10 100 396.000 Tumor de tejido blando 21/21 100 248.000 Carcinoma colangiocelular 19/19 100 3600 Cáncer de pulmón de células no pequeñas 35/37 95 73.000 Cáncer colorrectal 31/34 91 84.000 Cáncer cervical 14/19 74 1500 Cáncer gástrico 20/28 71 35000 Cáncer de vejiga urinaria 24/34 71 30 Cáncer de pulmón de células pequeñas 3/14 21 7 Cáncer de mama 5/81 6 1 Cancer de próstata 2/57 4 1500 Carcinoma de células renales 0/20 0 0 Cáncer de esófago 0/19 0 2
* "Positivo" significa cuando la relación expresión relativa (tejido canceroso/normal) es > 5. [Ejemplo 2] Selección de un repertorio de péptidos CDH3 que tiene afinidad de unión a HLA-A2
La secuencia de aminoácidos CDH3 humano fue rastreada utilizando el sistema BIMAS, y 18 péptidos fueron seleccionados con el fin de afinidad de unión esperada para HLA-A2 (Tabla 2)
[Tabla 2] péptidos posiciones
secuencias de aminoácidos péptidos
Encuadernación puntuaciones de afinidad CDH3-1 659-677 VLGAVLALL (SEQ ID NO: 3) 84 CDH3-2 629-637 QLTVIRATV (SEQ ID NO: 4) 70 CDH3-3 602-610 VVLSLKKFL (SEQ ID NO: 5) 65 CDH3-4 655-663 FILPVLGAV (SEQ ID NO: 1) 49 CDH3-5 419-427 KLPTSTATI (SEQ ID NO: 6) 37 CDH3-6 564-572 VLNITDKDL (SEQ ID NO: 7) 36 CDH3-7 757-765 FIIENLKAA (SEQ ID NO: 2) 30 CDH3-8 187-195 AVSENGASV (SEQ ID NO: 8) 25 CDH3-9 152-160 SPPEGVFAV (SEQ ID NO: 9) 25 CDH3-10 228-237 VLPGTSVMQV (SEQ ID NO: 10) 272 CDH3-11 500-509 TLDREDEQFV (SEQ ID NO: 11) 153 CDH3-12 419-428 KLPTSTATIV (SEQ ID NO: 12) 100 CDH3-13 440-449 FVPPSKVVEV (SEQ ID NO: 13) 64 CDH3-14 66-75 FSTDNDDFTV (SEQ ID NO: 14) 50 CDH3-15 2-11 GLPRGPLASL (SEQ ID NO: 15) 49 CDH3-16 101-110 ILRRHKRDWV (SEQ ID NO: 16) 24 CDH3-17 223-232 SVLEGVLPGT (SEQ ID NO: 17) 23 CDH3-18 655-664 FILPVLGAVL (SEQ ID NO: 18) 20
Los epítopos de células T asesinas restringidos por HLA-A2 identificados en la presente invención se muestran mediante subrayado.
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[Ejemplo 3]
En primer lugar, se indujeron células dendríticas (DC) procedentes de células de la médula ósea de ratones transgénicos HLA-A2 utilizando el método descrito previamente (Komori H et al Clinical Cancer Research 12: 26892697, 2006). Posteriormente, BM-DCs obtenidas de este modo se pulsaron con péptidos CDH3 (10 µM), y luego se administraron por vía intraperitoneal a ratones transgénicos HLA-A2 a razón de 5 x 105 células/ratón. Después de la inmunización mediante la administración durante dos veces a intervalos semanales, se recogieron células de bazo de ratón y se utilizaron para la detección de las células T asesinas. Con el fin de detectar exactamente la inducción de células T asesinas derivadas de células T CD8+, se utilizaron las células de bazo que se prepararon mediante la eliminación de células T CD4+ mediante el uso de perlas de MACS después de la separación del bazo.
La Figura 1 representa el protocolo para la determinación de péptidos CDH3 reconocidos por células T asesinas restringidas por HLA-A2 en ratones transgénicos HLA-A2. El día en el que se recogieron células del bazo de ratones inmunizados se establece como "Día 0".
Día -21: (1) La inducción de células dendríticas derivadas de la médula ósea (en los que sigue en esta memoria, denominadas "BM-DC") fue iniciada por la adición de GM-CSF a las células de la médula ósea de ratones transgénicos HLA-A2.
Día -14: (2) se añadió una mezcla de tres tipos de péptidos CDH3 a las BM-DCs inducidas. Después de dos horas, BM-DCs se administraron por vía intraperitoneal a razón de 5 x 105 células/ratón.
(1) y (2) se repitieron dos veces a intervalos semanales.
Día 0: Se recogieron células de bazo de ratones transgénicos HLA-A2 inmunizados y se co-cultivaron con BM-DCs, que se incubaron de nuevo con el péptido CDH3 durante dos horas, y se cultivaron durante seis días.
Día 6: Para detectar células T asesinas que reconocen específicamente los péptidos CDH3, las células T productoras de interferón gamma (IFN-γ) se cuantificaron mediante el ensayo ELISPOT después de la estimulación antigénica. BM-DCs pulsadas con péptido CDH3 y BM-DCs no pulsadas se utilizaron como células diana.
Investigación de la actividad de células T asesinas específicas para CDH3 mediante ensayo ELISPOT:
Para confirmar que las células T asesinas reaccionan específicamente con CDH3 para producir IFN-γ que en realidad existe entre estas células, se llevó a cabo una investigación mediante el ensayo ELISPOT. IFN-γ se detectó utilizando el Set Mouse IFN-γ ELISPOT (BD Biosciences). Cuando células T asesinas (efectoras) responden a células estimuladoras (diana) y producen IFN-γ, IFN-γ será detectado como puntos rojos. BM-DCs o BM-DCs pulsadas con péptido CDH3 se utilizan como células diana. En primer lugar, una placa ELISPOT (BD Biosciences) se revistió con anticuerpo IFN-γ anti-ratón durante 18 horas, y después se bloqueó mediante el uso de FCS al 10%/RPMI durante dos horas. Las células efectoras (100 µL/pocillo) y células diana (100 µL/pocillo) se mezclaron y se cultivaron durante 22 horas a 37°C. El experimento se llevó a cabo a la relación efectora/diana (relación E/T) de
10:1. La placa se lavó después mediante agua esterilizada, se hizo reaccionar con anticuerpo IFN-γ anti-ratón biotinilado durante dos horas, y se hizo reaccionar adicionalmente con estreptavidina-HRP durante una hora. Puntos IFN-γ positivos se detectaron en la disolución de sustrato. Se utilizó el software Autoanalysis de MINERVA TECH para contar los puntos. Como resultado, no se observó respuesta inmunológica de células T asesinas específica para CDH3 para células T asesinas inducidas con péptido CDH3-4 o CDH3-7, mientras que no se observó respuesta inmunológica específica para CDH3 para células T asesinas inducidas con otros péptidos (Figuras 2 y 3).
Los resultados del ensayo ELISPOT en células T asesinas inducidas con péptido CDR3-4 (SEQ ID NO: 1) y péptido CDH3-7 (SEQ ID NO: 2) se muestran en la Figura 3.
Las células T asesinas mostraron 283,7 ± 40,0 puntos/pocillo en respuesta a BM-DCs pulsadas con el péptido CDH3-4 (SEQ ID NO: 1), mientras que mostraban 48,7 ± 11,9 puntos/pocillo en presencia de BM-DCs sin pulsación con péptidos ( P <0,05). Del mismo modo, células T asesinas mostraron 79,3 ± 3,2 puntos/pocillo en respuesta a las BM-DCs pulsadas con el péptido CDH3-7 (SEQ ID NO: 2), mientras que mostraron 42,7 puntos/pocillo en presencia de BM-DCs sin pulsación con péptidos (P <0,05).
Análisis estadístico:
Se utilizó el test t de Student de dos colas para evaluar la significancia estadística en los datos obtenidos por el ensayo ELISPOT y en el tamaño del tumor entre los grupos de tratamiento. Un valor de P <0,05 se consideró
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A continuación, se testó la actividad citotóxica de estos CTLs contra líneas celulares de cáncer humano que expresan CDH3 y HLA-A2. Tal como se muestra en la Figura 4B, CTLs reactivos con CDH3 estimulados con el péptido CDH3-4655-663 exhibían en donantes sanos citotoxicidad para HCT116 (CDH3 +, HLA-A2 +), HSC3 (CDH3 +, HLA-A2 +) y PANC1/CDH3 (CDH3 +, HLA-A2 +), en las que se transfectó el gen CDH3 en células PANC1; sin embargo, no exhibían el mismo efecto hacia PANC1 (CDH3-, HLA-A2 +), SKHep1 (CDH23-, HLA-A2 +) y PK8 (CDH3 +, HLA-A2-). De manera similar, los CTLs estimulados con el péptido CDH3-7757-765 exhibían citotoxicidad hacia HSC3, pero no hacia PANC1, PK8 y SKHep1. Se observaron estas actividades citotóxicas para los CTLs derivados de diversos pacientes de cáncer (Figura 4C).
Con el fin de confirmar si estos péptidos podrían ser procesadas a partir de la proteína CDH3 en condiciones naturales, se utilizaron como células diana PANC1/CDH3 y SKHep1/CDH3 (CDH3 +, HLA-A2 +), en las que el gen CDH3 se transfectó en células SKHep1. Tal como se muestra en la Figura 4C, CTL inducidas por estimulación con péptido CDH3-4655-663 o con CDH3-7757-765 exhibían citotoxicidad contra HCT116, PANC1/CDH3 y SKHep1/CDH3, pero no contra PANC1, SKHep1 y PK8. Los resultados anteriores sugieren que estos péptidos se procesan y se presentan en la superficie de células cancerosas con las moléculas HLA-A2 en condiciones naturales. CTLs reactivos con CDH3 tenían citotoxicidad específica para las células cancerosas que expresan moléculas endógenas tanto CDH3 como HLA-A2.
Confirmación de restricción de HLA clase I:
Para confirmar si los CTLs inducidos podrían reconocer células diana de una manera restringida a la HLA clase I, células cancerosas diana se incubaron con 10 µg/mL de mAb anti-HLA clase I (W6/32) o con 10 µg/mL de mAb antiHLA-DR (H-DR-1) durante una hora antes del co-cultivo de CTLs y una línea celular cancerosa para el ensayo de liberación de 51Cr o el ensayo ELISPOT, y los efectos de los mAbs sobre la actividad citotóxica de CTLs o la producción de IFN-γ fueron examinados por un método conocido (Gomi S, et al., J Immunol 1999; 163: 4994-5004). Como resultado, el anticuerpo anti-HLA clase I podría inhibir la producción de IFN-γ con significancia estadística en el ensayo de ELISPOT para CTLs generados por estimulación con péptido CDH3-4655-663 contra SKHep1/CDH3 (Figura 4D, izquierda, P <0,01). También podría inhibir la actividad citotóxica contra HCT116 en el ensayo de liberación de 51Cr (Figura 4D, centro). De manera similar, el anticuerpo anti-clase I podría inhibir la producción de IFN-γ con significancia estadística en el ensayo de ELISPOT para los CTLs generados por estimulación con el péptido CDH3-7757-765 contra células HSC3 (Figura 4D, derecha, P <0,01). Estos resultados indican que los CTLs inducidos reconocen células diana que expresan CDH3 de una forma restringida a HLA clase-I.
[Ejemplo 5]
Inmunoterapia adoptiva
Actividad anti-cáncer in vivo de CTLs humanos inducidos con CDH3 utilizados para la inmunización adoptiva de ratones NOD/SCID:
Con el fin de evaluar el efecto terapéutico de la administración de CTL CDH3 reactiva a ratones a los que se había trasplantado células de cáncer humanas CDH3 positivas, se realizó una inmunoterapia adoptiva experimental tal como se ha descrito previamente (Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:) 2689-2697. En síntesis, células HCT116 (4 x 106 células) positivos tanto para HLA-A2 como CDH3 endógeno se inocularon a ratones NOD/SCID mediante inyección hipodérmica en el flanco derecho. Cuando el tamaño del tumor se convirtió en 25 mm2 el día 7 después de la inoculación del tumor en ratones, una línea de CTLs específicas para el péptido CDH3-4655-663 o el péptido CDH3-7757-765 o, como control negativo, una línea de células T CD8+ estimuladas con el péptido VIH restringido para HLA-A2 (SLYNTYATL, SEQ ID NO: 19) derivado de cinco donantes sanos y suspendidas en 100 µL de PBS se inyectó por vía intravenosa (4 x 106). Las células T fueron inyectadas por vía intravenosa de nuevo el día
14. Los tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana, y se evaluaron midiendo dos diámetros perpendiculares entre sí utilizando calibres. Se utilizó el test t de Student de dos colas para evaluar la significancia estadística en el tamaño de los tumores. Un valor de P <0,05 se consideró significativo. El análisis estadístico se realizó utilizando un paquete de software estadístico comercialmente disponible (SPSS para Windows (TM), versión
11.0.
Células T CD8 + control estimuladas con péptidos de VIH control no exhibieron citotoxicidad contra células HCT116 in vitro. Se evaluaron los tamaños de los tumores de siete ratones individuales en cada uno de los grupos (Figura 5A) y la media ± desviación estándar de tamaños de tumor en cada uno de los grupos (Figura 5B). La línea de células T control y PBS solo no exhibían un efecto inhibidor sobre el crecimiento del tumor. El tamaño del tumor en ratones inoculados con los CTLs estimulados con CDH3 fue significativamente menor que en los ratones inoculados con células T CD8 + inducida por el péptido de control VIH o con PBS solo (P <0,001). Estos resultados indican la
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eficacia de la terapia de transferencia adoptiva de CTLs humanos CDH3 reactivos contra tumor humano CDH3+ en ratones NOD/SCID.
Discusión:
En el estudio actual, los autores de la presente invención identificaron Cadherina 3 (CDH3)/P-cadherina como una nueva TAA a través de análisis del chip de ADNc de cáncer de páncreas. CDH3 se expresaba fuertemente en células de cáncer pancreático y se expresaba débilmente en el ovario y la glándula mamaria en base al análisis del chip de ADNc. La expresión de CDH3 fue apenas detectable en otros órganos vitales. Además, los datos de chips y RT-PCR demostraron que CDH3 se expresaba en los cánceres gástricos y colorrectales, así como en el cáncer de páncreas, pero apenas se expresaba en sus tejidos homólogos normales. Ya se informó que CDH3 se sobreexpresaba en la mayoría de tejido de cáncer de páncreas, mientras que las células del conducto y acinares normales en páncreas casi no mostraron expresión de CDH3 por tinción inmunohistoquímica (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65: 3092-3099). Estos resultados sugieren que CDH3 podría ser una nueva diana de la inmunoterapia para los cánceres anteriores, cuya diana conlleva un bajo riesgo de inducir una respuesta autoinmune.
La familia de las cadherinas se clasifica en diversas subfamilias, incluyendo Cadherina 1 (CDH1)/E-cadherina, Cadherina 2 (CDH2)/N-cadherina y Cadherina 3 (CDH3)/P-cadherina, de acuerdo con su distribución en los tejidos. CDH1 es el miembro de la familia cadherina predominante que se expresa en todos los tejidos epiteliales. Se supone que CDH1 actúa como un factor supresor de tumores que regula negativamente la invasión y metástasis de células cancerosas (Frixen U H, et al. J Cell Biol 1991; 113: 173-185, Berx G, et al. Genomics 1995; 26: 281-289, Oka H, et al. Cancer Res 1993; 53: 1696-1701). La expresión de CDH2 está aumentada en cánceres invasivos y CDH2 contribuye en los fenómenos invasivos mediante la interacción con el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y a través de la señalización aguas abajo (Suyama K, et al. Cancer Cell 2002; 2: 301-314). La expresión y el papel de CDH3 en los cánceres son poco conocidos. En un estudio anterior, Taniuchi et al. sugirieron que el aumento de expresión de CDH3 es probable que sea un factor que refuerza la invasividad del cáncer de páncreas mediante la interacción con p120ctn y la familia Rho GTPasa, Rac1 y Cdc42 (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65: 3092-3099). Otros estudios previos sugirieron que CDH3 es también un factor de aumento de la capacidad de invasión y de mal pronóstico en el cáncer de mama (Palacios J, et al. Am J Pathol 1995; 146: 605-612, Paredes J, et al. Clin Cancer Res 2005; 11: 5869-5877, Peralta Soler A, et al. Cancer 1999; 86: 1263-1272) y cáncer de endometrio (Stefansson I M, et al. J Clin Oncol 2004; 22: 1242-1252).
Cuando los informes anteriores se toman juntos, la tasa de respuesta objetiva de vacunas contra el cáncer en los ensayos clínicos era tan baja como 2,6% (Rosenberg S A, et al. Nat Med 2004; 10: 909-915). Una posibilidad es que las células cancerosas expulsan inmunidad debido a la deleción, mutación o regulación a la baja de TAA como consecuencia de la terapia de inducción inmunológica. En base al punto de vista de que las células tumorales no pueden perder antígenos que son necesarios para la tumorigénesis, CDH3 sería un candidato de TAA útil para la inmunoterapia contra el cáncer.
En la presente invención, sus autores identificaron, entre los 18 péptidos candidatos seleccionados por el algoritmo BIMAS, dos péptidos de epítopos CDH3 restringidos por HLA-A2 que se confirmó inducen CTLs de ratón restringidos por HLA-A2 en ratones transgénicos HLA-A2.1 (HHD). Además, los autores de la presente invención confirmaron que CTLs CDH3 reactivos se generaron a partir de PBMCs derivadas de donantes sanos y pacientes de cáncer mediante el uso de estos péptidos (Figura 4). Estos CTLs exhibían un efecto citocida no sólo hacia las células T2 pulsadas con su péptido correspondiente, sino también hacia las líneas de células cancerosas que expresan CDH3 y HLA-A2. De lo anterior, se sugiere que los presentes péptidos CDH3 (CDH3-4655-663 y CDH3-7757765) son producidos de forma natural por el procesamiento de la proteína CDH3 en células cancerosas, presentada sobre la superficie celular junto con moléculas HLA-A2 , y luego son reconocidos por CTLs.
La citotoxicidad de los CTLs CDH3 reactivos de la presente invención se confirmó no sólo in vitro por el ensayo de liberación de 51Cr, sino también in vivo por inmunoterapia adoptiva de CTL. Tal como se muestra en la Figura 5, la inyección intravenosa de células CD8+ inducida por los péptidos de la presente invención inhibía significativamente el crecimiento de tumores injertados en ratones NOD/SCID, en comparación con células CD8+ control y similares.
HLA-A2 (A*0201) es uno de los alelos de HLA más comunes en diversos grupos étnicos incluyendo asiáticos, africanos, afro-americanos y caucasianos (Browning M. et al. Immunol Today 1996; 17: 165-170). Por lo tanto, los péptidos identificados en la presente invención que son presentados a células T asesinas a través de HLA-A2 tienen una potencial aplicación clínica en todo el mundo, si su seguridad y eficacia en la inmunoterapia del cáncer se muestran en la medicina exploratoria. Además, la identificación de péptidos presentados a células T asesinas a través de HLA-A2, portadores de las cuales son frecuentes no sólo en personas japonesas, sino también en personas de todo el mundo, es probable que conduzca al desarrollo de productos farmacéuticos para la
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