ES2633295T3

ES2633295T3 - Combinaciones y métodos para la administración subcutánea de inmunoglobulina e hialuronidasa

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Publication number: ES2633295T3
Application number: ES09721669.1T
Authority: ES
Inventors: Richard Schiff; Heinz Leibl; Gregory I. Frost
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2009-03-16
Publication date: 2017-09-20
Anticipated expiration: 2029-03-16
Also published as: WO2009117085A1; CA2714708C; SG10201503296QA; TW201408320A; AR074968A1; CO6331301A2; MX339658B; HRP20171068T1; KR101275949B1; TWI489994B; EP2271363A1; AU2009226141B2; USRE49967E1; JP2015028050A; CN105816876A; CA2714708A1; TW200950803A; PT2271363T; MX2010009478A; US10301376B2

Abstract

Una combinación de composiciones de inmunoglobulina (IG) y una hialuronidasa soluble para su uso para tratar una enfermedad o afección tratables con IG en un sujeto, en donde: la IG y la hialuronidasa soluble se formulan por separado para la administración subcutánea; la IG y la hialuronidasa soluble se formulan para administración de dosificación única una vez al mes; la hialuronidasa soluble se administra por separado de la IG antes de la administración de la IG y en el mismo sitio que la IG; la concentración de IG es de 5 a 15% p/v y la cantidad de IG en la composición es de 0,5 gramos (g) a 70 g; la IG se formula en un volumen de líquido que es de 50 mL a 700 mL; la hialuronidasa soluble se formula para administración como una razón de hialuronidasa a IG de 10 U/gramo (g) a 500 U/g de IG, con lo que la cantidad de hialuronidasa en la composición es suficiente para efectuar el aumento de biodisponibilidad de la IG cuando se administra combinada con la IG hasta al menos 90% de la biodisponibilidad de la misma dosificación única de IG administrada a través de administración intravenosa para el tratamiento de la misma enfermedad o afección tratable con IG; la hialuronidasa soluble se formula en un volumen de líquido que es de 5 a 30 mL; y la enfermedad o afección tratables con IG se seleccionan entre inmunodeficiencia; hipogammaglobulinemia adquirida secundaria a neoplasias hematológicas; enfermedad de Kawasaki; polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC); Síndrome de Guillain-Barré; Púrpura trombocitopénica idiopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multifocal; Miastenia Gravis; síndrome de Moersch-Woltmann; hipogammaglobulinemia secundaria, incluyendo inmunodeficiencia iatrogénica; deficiencia de anticuerpos específicos; Encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrotizante sistémica positiva para ANCA; Anemia hemolítica autoinmunitaria; Penfigoide bulloso; Penfigoide cicatricial; Síndrome de Evans, incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria con trombocitopenia inmunitaria; Trombocitopenia aloinmunitaria feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT); Síndrome hemofagocítico; Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de alto riesgo; neuropatía paraproteinémica de tipo IgM; trasplante de riñón; esclerosis múltiple; Síndrome opsoclono mioclono atáxico; Pénfigo foliáceo; Pénfigo vulgar; Púrpura post-transfusión; Necrólisis epidérmica tóxica/Síndrome de Steven Johnson (TEN/SJS); Síndrome de choque tóxico; Enfermedad de Alzheimer; Lupus eritematoso generalizado; mieloma múltiple; septicemia; tumores de células B; trauma; y una infección bacteriana, viral o fúngica.

Description

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mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo aminoterminal al extremo carboxilo-terminal. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los mencionados en el 37 CFR §§ 1821-1822. Además, se debe observar que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.

Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácidos de origen natural" se refieren a los 20 L-aminoácidos que aparecen en los polipéptidos.

Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural, pero que ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen de este modo, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los isostereómeros D de los aminoácidos. Los aminoácidos no naturales se describen ejemplos de la presente memoria y son conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, un constructo de ADN es una molécula de ADN monocatenario o bicatenario, lineal o circular que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no encontrada en la naturaleza. existen constructos de ADN como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Según se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee en dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.

Según se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizar in vitro, o preparar a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares de bases (abreviado "pb"). El término nucleótidos se utiliza para las moléculas de cadena sencilla o doble, donde el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas de cadena doble se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término pares de bases. Los expertos en la técnica reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados; así todos los nucleótidos dentro de una molécula de doble cadena de polinucleótidos pueden no estar emparejados. Tales extremos desemparejados tendrán, en general, una longitud no superior a 20 nucleótidos.

Según se utiliza en la presente memoria, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y de los residuos contenidos en las mismas. Los métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado al cual las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son invariantes. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, y hasta cierto punto de las secuencias de nucleótidos, también puede tomar en consideración las diferencias conservativas y/o las sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que preservan las propiedades físicoquímicas de los residuos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas en toda la longitud de las secuencias y que incluye todos los residuos) o locales (alineamiento de una porción de las secuencias que incluye sólo la región o regiones más similares).

"Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse utilizando técnicas publicadas. (Véanse, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Si bien existen diversos métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por expertos en la técnica (Carillo,

H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).

Según se utiliza en la presente memoria, homólogo (con respecto al ácido nucleico y/o a las secuencias de

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potencial y/o una prevención del empeoramiento de los síntomas o de la progresión de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de una preparación de inmunoglobulina y composiciones proporcionadas en la presente memoria.

Según se utiliza en la presente memoria, un agente farmacéuticamente eficaz, incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de molécula pequeña y proteínas terapéuticas.

Según se utiliza en la presente memoria, tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otra indicación, se mejoran o alteran beneficiosamente de otra manera.

Según se utiliza en la presente memoria efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, típicamente mejora o alivia los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, molécula

o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano.

Según se utiliza en la presente memoria, un paciente se refiere a un sujeto humano.

Según se utiliza en la presente memoria, alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno concreto por medio de un tratamiento, tal como mediante la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que se pueden atribuir a o asociar con la administración de la composición o del agente terapéutico.

Según se utiliza en la presente memoria, la prevención o la profilaxis se refiere a métodos en los que se reduce el riesgo de desarrollar la enfermedad o afección.

Según se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.

Según se utiliza en la presente memoria, forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y embaladas individualmente como se conoce en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, una formulación de dosificación única se refiere a una formulación para administración directa.

Según se utiliza en la presente memoria, un "artículo de fabricación" es un producto que se fabrica y se vende. Según se utiliza en toda esta solicitud, se pretende que el término englobe composiciones de IG e hialuronidasa contenidas en los artículos de embalaje.

Según se utiliza en la presente memoria, fluido se refiere a cualquier composición que puede fluir. Así, los fluidos abarcan composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones semejantes.

Según se utiliza en la presente memoria, un "kit" se refiere a una combinación de composiciones proporcionadas en la presente memoria y otro elemento para un propósito incluyendo, pero sin limitarse a, la activación, la administración, el diagnóstico y la evaluación de una actividad biológica o propiedad. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para su uso.

Según se utiliza en la presente memoria, un extracto celular o producto lisado se refiere a una preparación o fracción que se prepara a partir de una célula lisada o rota.

En la presente memoria, animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitarse a primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ganado ovino, cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen los seres humanos como animal contemplado. Las enzimas proporcionadas en la presente memoria son de cualquier origen, animal, vegetal, procariótico y fúngico. La mayoría de las enzimas son de origen animal, incluyendo origen de mamífero.

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combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria.

Es ilustrativa de una preparación de IG Inmunoglobulina intravenosa (humana), 10% (IGIV, 10%, comercializada como Gammagard® líquida, Baxter Healthcare Corporation), que es una preparación de IgG sin modificar líquida con una distribución de subclases de IgG similar a la del plasma normal. La preparación contiene el fragmento cristalizable intacto (Fc) y las regiones Fab. La preparación contiene 100 mg/ml de proteínas, siendo al menos 98% IgG; la IgA está presente a una concentración de 37 µg/ml, y la IgM está presente únicamente en cantidades traza. Tiene una osmolalidad que es similar a la osmolalidad fisiológica y no contiene azúcares, sodio o conservantes. añadidos Se formula con glicina para la estabilización a un pH de 4,6 a 5,1. El procedimiento de fabricación emplea un procedimiento de fraccionamiento con alcohol frío de Cohn-Oncley modificado y purificaciones adicionales mediante un procedimiento continuo a través del uso de cromatografía de intercambio catiónico débil y cromatografía de intercambio aniónico débil. El procedimiento de fabricación también incluye 3 etapas de inactivación o eliminación viral independientes: tratamiento con disolvente/detergente (S/D), nanofiltración e incubación a un pH bajo y temperatura elevada.

D. Hialuronidasa

En la presente memoria se proporcionan combinaciones que contienen inmunoglobulina y una hialuronidasa soluble, y métodos de uso de tales combinaciones para la administración subcutánea para el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por IG. Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Mediante la catálisis de la hidrólisis del ácido hialurónico, un constituyente principal de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del ácido hialurónico, lo que aumenta la permeabilidad del tejido. Como tales, las hialuronidasas se han utilizado, por ejemplo, como un agente de propagación o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para mejorar su dispersión y suministro. Son hialuronidasas ilustrativas en las combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria las hialuronidasas solubles.

Existen tres clases generales de hialuronidasas; hialuronidasa de mamífero, hialuronidasa bacteriana y hialuronidasa de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son endo-ß-N-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace glicosídico β1 → 4 del hialuronano para proporcionar varias longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar hialuronano y sulfatos de condroitina (SC), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vacas (bovina) (SEQ ID NO: 10 y 11), de ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32), de cerdo (SEQ ID NO: 20-21), de rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), de conejo (SEQ ID NO: 25), de oveja (ovina) (SEQ ID NO: 26 y 27), de orangután (SEC ID NO: 28), de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), de cobaya (SEQ ID NO: 30), e hialuronidasas humanas.

Las hialuronidasas de mamífero pueden subdividirse adicionalmente en las que son activa en condiciones neutras, encontradas predominantemente en extractos de testículos, y activa en condiciones ácidas, encontradas predominantemente en órganos tales como el hígado. Las hialuronidasas activa en condiciones neutras ilustrativas incluyen PH20, incluyendo, pero sin limitarse a, PH20 derivada de diferentes especies tales como ovina (SEQ ID NO: 27), bovina (SEQ ID NO: 11) y humana (SEQ ID NO: 1). La PH20 humana (también conocida como SPAM1 o proteína de la superficie de espermatozoides PH20), es generalmente bloqueada en la membrana plasmática a través de un anclaje de glicosilfosfatidil inositol (GPI). Está implicada de forma natural en la adhesión de espermaóvulo y coadyuva a la penetración por el esperma de la capa de células del cúmulo por digestión de ácido hialurónico. El transcrito de ARNm de PH20 se traduce normalmente para generar un polipéptido precursor de 509 aminoácido (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N-terminal (posiciones de residuos de aminoácidos 1-35) y un ancla de GPI de 19 aminoácidos en el extremo C-terminal (posiciones de residuos de aminoácidos 491-509). La PH20 madura es, por lo tanto, un polipéptido de 474 aminoácidos expuesto en el SEQ ID NO: 2). La PH20 bovina es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). El alineamiento de la PH20 bovina con la PH20 humana muestra únicamente una débil homología, existiendo múltiples huecos desde el aminoácido 470 hasta el respectivo extremo carboxi terminal debido a la ausencia de un ancla de GPI en el polipéptido bovino (véase, p.ej., Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427440). De hecho, no se prevé ningún ancla de GPI clara en ninguna otra especie de PH20 aparte de la humana. Por lo tanto, los polipéptidos producidos a partir de PH20 ovina y bovina existen como formas solubles. Aunque existe PH20 bovina unida muy laxamente a la membrana plasmática, ésta no está anclada a través de un ancla sensible a fosfolipasa (Lalancette et al., Biol Reprod 2001 Agosto;65(2):628-36). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa soluble de testículos bovinos como un extracto para uso clínico (Wydase™, Hyalase™).

Además de PH20 humana (también denominada SPAM1), se han identificado cinco genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALP1. HYALP1 es un pseudogen, y no se ha demostrado que HYAL3 (SEQ ID NO: 38) posea actividad enzimática frente ningún sustrato conocido. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en el SEQ ID NO: 39) es una condroitinasa y exhibe poca actividad frente al hialuronano. HYAL1

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ColE1, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta 6xHis en el extremo N o C-terminal de la proteína recombinante. Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que proporcionan sitios de clonación múltiple para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de las proteínas etiquetados con 6xHis N-terminalmente. Otros vectores plasmídicos ilustrativos para la transformación de células E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, la Patente de Estados Unidos Núm. 4.952.496; disponible de Novagen, Madison, WI; véase, también la bibliografía publicada por Novagen describiendo el sistema). Tales plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor lac de T7, el terminador de T7, el operador lac inducible en E. coli, y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor de T7, el terminador de T7, y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para su uso en la purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región del promotor T7lac y el terminador de T7.

Un vector ilustrativo para la expresión de células de mamíferos es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 se obtuvo de la cadena principal del vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica el gen de resistencia a Beta-lactamasa (AmpR), un origen de replicación F1, una región del intensificador/promotor inmediatotemprano de citomegalovirus (CMV), y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El vector de expresión también tiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR).

2. Expresión

Los Polipéptidos hialuronidasa solubles se pueden producir por medio de cualquier método conocido por los expertos en la técnica incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, por ejemplo, necesarios para la administración y el tratamiento. Los anfitriones de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas, células de insectos, células de mamíferos, incluidas las líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los anfitriones de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones post-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del anfitrión de expresión se puede hacer sobre la base de estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos para la purificación.

Muchos vectores de expresión están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden utilizar para la expresión de proteínas. La elección del vector de expresión se verá influido por la elección del sistema de expresión del anfitrión. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores y opcionalmente potenciadores de la transcripción, señales de traducción, y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicación para amplificar el número de copias del vector.

También se pueden utilizar polipéptidos de hialuronidasa solubles o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, se puede generar una fusión de la enzima para añadir funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de proteínas de fusión de enzimas incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta tal como para la localización, p.ej. una etiqueta his6 o una etiqueta myc o una etiqueta para la purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación a la membrana.

a. Células procariotas

Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. Transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida para los expertos en la técnica. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de la proteína y para expresar proteínas que exhiben cierta toxicidad para las células anfitrionas. Los ejemplos de los promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN de T7 y SP6 y el promotor λpL regulado por temperatura.

Se pueden expresar proteínas, tales como cualquiera proporcionada en la presente memoria, en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores tales como ditiotreitol y β-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea para resolubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de las bacterias que proporciona un entorno oxidante e isomerasas de tipo chaperonina y disulfuro y puede conducir a la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína que se debe expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder se elimina a continuación mediante peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias

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inyectable; c) si el volumen de la solución de rHuPH20 concentrada (1500 U/mL) necesaria era de 15 mL o superior, ésta se utilizó sin diluir.

Inmediatamente después de la infusión de rHuPH20 (y en el plazo de 5 minutos), la GGL se infundió a través de la misma aguja SC de calibre 24 partiendo de una dosis que era ¼ de la dosis de 4 semanas (es decir, dosis de 1 semana) para determinar la cantidad de rHuPH20 necesaria para proporcionar una cuarta parte de la dosis de 4 semanas en un solo sitio. Cada paciente se evaluó para determinar si la infusión era tolerada; se consideró que la infusión no era tolerada si había reacciones locales moderadas o graves que requerían más de un sitio de administración o una incapacidad para completar la infusión en menos de 3 horas. Si se toleraba la dosis semanal de GGL, se administró media dosis (dosis de dos semanas) utilizando rHuPH20 a 100 U/g de GGL, y la dosis de rHuPH20 se redujo adicionalmente a 66 U/g de GGL, a continuación, 50 U/g de GGL. Se repitió la dosis de rHuPH20, sobre una base de GGL por gramo, con mayores cantidades de GGL hasta que se toleró una dosis de 4 semanas completa de GGL en un solo sitio. Si la cantidad de rHuPH20 no era tolerada en cualquier punto, esa dosis semanal de GGL se repitió en el siguiente intervalo y la cantidad de rHuPH20 se incrementó hasta que se toleraba la dosis. Si un sujeto no toleraba una dosis durante 2 incrementos sucesivos de dosis de rHuPH20 (es decir, 3 intentos a una dosis distinta de GGL), se determinó que la dosis previamente tolerada era la dosis máxima tolerada.

Los primeros 4 pacientes fueron evaluados para determinar únicamente la tolerabilidad; los últimos 7 pacientes tenían una infusión IV, seguido de un estudio farmacocinético (FC) para comparar la infusión IV con las infusiones SC posteriores. Para las infusiones SC, después de que se completó una administración de una dosis mensual de GGL, se repitió la misma dosis mensual y se realizó un estudio FC para evaluar el T1/2, Tmax, y AUC. Si AUC (SC) no estaba dentro de 90% del AUC (IV), la dosis de rHuPH20 se aumentó de 4 veces en la siguiente infusión, y se repitió la evaluación de FC.

Diez de los 11 pacientes alcanzaron dosis mensuales de 25,5 a 61,2 gramos de GGL (255 a 612 mL) en un solo sitio SC, a velocidades de 120 a 300 mL/hora. El undécimo paciente se retiró después de la infusión de 1 semana alegando molestias locales. Para el primer paciente (39001), las infusiones iniciales se realizaron por gravedad, sin embargo, las tasas no fueron aceptables a pesar de aumentar la dosis de rHuPH20 de 150 a 300 U/g de GGL. Por lo tanto, todas las infusiones posteriores se realizaron utilizando una bomba IV peristáltica. Los 9 pacientes restantes alcanzaron la dosis mensual de GGL sin la necesidad de repetir las dosis o aumentar la concentración de rHuPH20. Por lo tanto, los 9 pacientes en los que se realizó un intento de reducir la dosis de rHuPH20 completaron el estudio y fueron capaces de tolerar las infusiones utilizando 50 U/g de GGL. Para determinar si 50 U/g de GGL fue la rHuPH20 mínima que se podría administrar, se intentó una dosis de 25 U/g GGL en dos pacientes sin éxito: uno tuvo molestias y el otro redujo la tolerabilidad y requirió las administración en dos sitios. Por lo tanto, la cantidad mínima de rHuPH20 que permitía una administración de una dosis mensual de GGL SC fue de 50 U/g de GGL. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación. Los resultados muestran que todos menos los dos primeros pacientes se sometieron a infusión a velocidades de hasta 300 mL/h con tiempos de infusión de 1,64 h (270 mL) a 3,55 h (537 mL). La tasa de administración era limitada principalmente por el tipo de bomba utilizada. A tasas de infusión rápida saltaba con frecuencia la alarma de la bomba IV. Una infusión se ralentizó y uno fue interrumpida debido a un leve dolor de perfusión in situ. Ambas infusiones se reanudaron y se completaron.

Tabla 3: Parámetros de Infusión para Pacientes que Completan Satisfactoriamente las Infusiones SC Mensuales

Sujetos (N=10): Número de infusiones de dosis mensual Dosis de IgG (g) infundida (media) Volumen (mL) de IgG infundida(media) Conc. final de rHuPH20 (U/g) Tasa de infusión max (ml/hr) Tiempo (hrs) de infusión (media)

390001: 1 25,5 255 305,9 175 2,13

390003: 1 30,1 301 46,9 200 2,38

400001: 1 44,5 445 49,8 300 3,05

340001: 3 30,3 303 52,5 300 3,02

340002: 4 39,9 399 50,0 300 3,20

390004: 4 29,3 293 50,8 300 1,92

390005: 3 27,2 272 50,6 300 1,64

390006: 3 61,4 614 50,0 300 2,75

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400002: 3 53,7 537 51,5 300 3,55

400003: 3 42,1 421 48,8 300 2,29

1. Evaluación de latolerabilidad

5 Los sujetos fueron evaluados para determinar su tolerabilidad a las infusiones SC. La mayoría de las infusiones se asociaron con reacciones leves relacionadas con la infusión (Tabla 4). Las reacciones leves más comunes fueron eritema, dolor, hinchazón, calor y prurito en el sitio de infusión. Las reacciones moderadas en el sitio de infusión incluyeron tres casos de dolor, y un caso de cada uno de prurito, hinchazón y calor. No se informó sobre reacciones graves. Hubo quejas de intenso ardor pasajero durante la infusión de la rHuPH20 en 10 de las infusiones, ocurriendo

10 cinco en un paciente.

Eventos adversos, independientemente de la causalidad, por períodos correspondientes a las categorías de dosis

Clase de Órgano del Sistema MeDRA: ¼ dosis SC ½ dosis SC ¾ dosis SC dosis SC completa

Trastornos del oído y del laberinto: 0 0 0 1

Trastornos del ojo: 0 1 0 3

Trastornos gastrointestinales: 0 1 0 2

Trastornos generales y afecciones en el sitio de administración: 26 15 20 29

Trastornos del sistema inmunitario: 0 0 0 1

Infecciones e infestaciones: 1 1 1 3

Trastornos del tejido musculoesquelético y conectivo: 1 1 1 0

Trastornos del sistema nervioso: 2 1 0 0

Trastornos respiratorios, torácicos e mediastinales: 0 0 0 4

Trastornos de la piel y del tejido subcutáneo: 0 0 3 1

Total: 30 20 25 44

Los eventos adversos sistémicos considerados posiblemente o probablemente relacionadas con las infusiones seenumeran en la Tabla 5. Tres fueron moderados y ninguno fue grave. Únicamente el episodio de dolor torácico leve

15 se asoció con la interrupción de la infusión, pero la infusión se completó y las infusiones subsiguientes fueron bien toleradas. La Tabla 6 representa la proporción de infusiones subcutáneas que se completaron sin interrupción durante un evento adverso.

Un evento adverso grave, una reacción anafiláctica, se produjo en un paciente, sin relación con la terapia en estudio.

20 El paciente, que tenía un historial de reacciones alérgicas previas a los antibióticos, recibió un antibiótico al día siguiente de su infusión con GGL/rHuPH20 y desarrolló anafilaxia posteriormente. Este paciente se recuperó por completo y fue capaz de completar con éxito el estudio.

No hubo infecciones bacterianas documentadas durante esta prueba de pacientes con PDI. Se informó sobre 9

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casos de infecciones virales, considerados todos no relacionados con el estudio de terapia: 2 casos de gastroenteritis viral, 1 caso de queratitis herpética, 2 casos de sinusitis, 1 caso de conjuntivitis, y 3 casos (en un paciente) de enfermedad de tipo influenza.

Tabla 5: Eventos adversos sistémicos no graves, relacionados

Eventos adversos en términos MEDRA: Leves Mod Graves Total

Ojo seco: 1 0 0 1

Sudores nocturnos: 1 0 0 1

Malestar muculoesquelético: 0 1 0 1

Cefalea: 1 2 0 3

Letargo: 1 0 0 1

Dolor de pecho: 1 0 0 1

Edema periférico: 1 0 0 1

Dolor: 1 0 0 1

Dolor dorsolumbar: 2 0 0 2

Eventos adversos relacionados totales: 9 3 0 12

Tabla 6: Proporción de infusiones SC completadas sin interrupción para un efecto adverso

Paciente: Sin interrupción Porcentaje (%) Interrumpido Detenido Porcentaje % Infusiones totales

390001: 4 80 1* 0 20 5

390002: 2 100 0 0 0 2

390003: 4 100 0 0 0 4

400001: 4 100 0 0 0 4

340001: 6 100 0 0 0 6

340002: 6 86 1† 0 14 7

390004: 7 100 0 0 0 7

390005: 7 100. 0 0 0 7

390006: 6 100. 0 0 0 6

400002: 6 100. 0 0 0 6

400003: 7 100. 0 0 0 7

Total: 59 N/A 2 0 N/A 61

* interrumpida debido a dolor leve en el sitio de infusión † interrumpida debido a leve dolor transitorio de pecho

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2. Evaluación farmacocinética

Se realizó el análisis farmacocinético0 (FC) sobre los niveles de IgG en suero. Los 7 pacientes que participaron en la

fase de evaluación FC de este estudio alcanzaron dosis mensuales de 27 a 61 gramos de GGL en un solo sitio

5 utilizando 50 U de rHuPH20 por gramo de GGL (véase la Tabla 3). El estudio FC se llevó a cabo después de recibir

una segunda infusión de dosis mensual de GGL. Las muestras de suero se recogieron antes de la infusión, 1 h

después de la infusión y los días 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 21 y 28 (si hubiera programa de 28 días) después de la infusión.

Los parámetros farmacocinéticos de los 7 pacientes se representan en la Tabla 7. La razón de AUC (SC) a AUC (IV)

para los 7 pacientes se muestra en la Tabla 8. Los resultados muestran que cinco de los 7 pacientes tenían AUC 10 (SC) dentro de 90% de AUC (IV). El aumento de la dosis o rHuPH20 de cuatro veces en los 2 sujetos con una

proporción inferior al 90% no mejoró adicionalmente la biodisponibilidad.

Tabla 7: Parámetros farmacocinéticos de los sujetos individuales

Pacientes: AUC (días*g/L) T½ (días) Tmax (días) Cmin (g/L)

34001: 461,2 61,3 3,0 12,9

34002*: 387,1 114,1 4,9 11,3

356,7: 43,9 4,0 11,3

39004*: 256,9 113,8 5,0 7,9

264,2: 44,3 6,9 7,7

39005: 369,6 59,3 3,1 10,9

39006: 368,9 40,3 4,8 10,8

40002: 375,2 33,7 6,8 10,6

40003: 356,2 37,9 4,9 9,7

Median: 368,9 43,93 4,8 10,8

* Pacientes con evaluaciones FC repetidas después de la administración de una dosis creciente de rHuPH20.

Tabla 8: Razón de AUC(SQ) a AUC(IV) (%)

imagen37: Concentración de rHuPH20

Paciente: 50 U/g 200 U/g

34001: 101,0 N/A

34002: 86,5 79,6

39004: 75,8 77,8

39005: 102,7 N/A

39006: 94,7 N/A

40002: 97,3 N/A

40003: 90,5 N/A

Mean: 92,6 N/A

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almacenamiento estéril de 20 L. Se tomaron muestras de proteína y se sometió a ensayo para determinar los perfiles de concentración de proteínas, actividad enzimática, grupos sulfhidrilo libres, oligosacáridos y la osmolaridad.

A continuación se dispensaron asépticamente 20 mL de la proteína en masa filtrada en condiciones estériles a viales 5 de 30 mL de Teflón estéril (Nalgene). Los viales se congelaron rápidamente y se almacenaron a 20 ± 5°C.

C. Comparación de la producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen1 y rHuPH20 soluble deGen2

La producción y purificación de rHuPH20 soluble de Gen2 en un cultivo celular en biorreactor de 300L contenían

10 algunos cambios en los protocolos en comparación con la producción y purificación rHuPH20 soluble de Gen1 en un cultivo celular en biorreactor 100L (que se describe en el ejemplo 4.B). La Tabla 19 expone diferencias ilustrativas, además de simples cambios de aumento de escala, entre los métodos.

Tabla 19

Diferencia de procedimiento: rHuPH20 Soluble de Gen1 rHuPH20 soluble de Gen2

Línea celular: 3D35M 2B2

Medios utilizados para expandir inóculo celular: Contiene metotrexato 0,10 µM (0,045 mg/L) Contiene metotrexato 20 µM (9 mg/L)

Medios en cultivos de 6L en curso: Contiene metotrexato 0,10 µM No contiene metotrexato

Matraz de agitación de 36 L: sin instrumentación volumen de operación 20 L. Equipado con la instrumentación que supervisa y controla el pH, oxígeno disuelto, burbujeo y la velocidad de flujo de gas de superposición. volumen operativo de 32 L

Volumen final de operación en biorreactor: Aprox. 100 L en un biorreactor de 125 L (volumen de cultivo inicial + 65 L) Aprox. 300L en un biorreactor de 400L (volumen de cultivo inicial + 260L)

Medio de cultivo en el biorreactor final: sin rHuInsulina 5,0 mg/L rHuInsulina

Volumen de alimentación de medios: Aumento a escala en 4% del volumen del cultivo celular del biorreactor es decir, 3,4, 3,5 y 3,7 L, lo que da como resultado un volumen diana del biorreactor de ~92 L. Aumento a escalado en 4% del volumen del cultivo celular del biorreactor es decir, 10,4, 10,8, 11,2 y 11,7 L, lo que da como resultado un volumen diana del biorreactor de ~303L.

Alimentación de medios: Medio de Alimentación Núm. 1: CD CHO + 50 g/L de Glucosa + GlutaMAX™-1 8 mM Alimentación Núm. 2 (CD CHO + 50 g/L de Glucosa + GlutaMAX 8 mM + 1,1 g/L de butirato de sodio Alimentación Núm. 3: CD CHO + 50 g/L de Glucosa + GlutaMAX 8 mM + 1,1 g/L de Butirato de Sodio Medio de Alimentación Núm. 1: 4x CD CHO + 33 g/L de Glucosa + Glutamax 32 mM + 16,6 g/L de Yeastolato + 33 mg/L rHuInsulina Alimentación Núm. 2: 2x CD CHO + 33 g/L de Glucosa + Glutamax 16 mM + 33,4 g/L de Yeastolato + 0,92 g/L butirato de sodio Alimentación Núm. 3: 1 × CD CHO + 50 g/L de Glucosa + Glutamax 10 mM + 50 g/L

Yeastolato + 1,80 g/L de Butirato de Sodio Alimentación Núm. 4: 1 x CD CHO + 33 g/L de Glucosa + Glutamax 6,6 mM + 50 g/L de Yeastolato + 0,92 g/L de Butirato de Sodio

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Claims

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